JP2003528572A - アスパルテートでの酵素トランスアミノ化によるｌ−ホスフィノトリシンの製造方法 - Google Patents

アスパルテートでの酵素トランスアミノ化によるｌ−ホスフィノトリシンの製造方法

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JP2003528572A
JP2003528572A JP2000615782A JP2000615782A JP2003528572A JP 2003528572 A JP2003528572 A JP 2003528572A JP 2000615782 A JP2000615782 A JP 2000615782A JP 2000615782 A JP2000615782 A JP 2000615782A JP 2003528572 A JP2003528572 A JP 2003528572A
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クラウス・バールトシュ
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バイエル クロップサイエンス ゲーエムベーハー
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids

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Abstract

(57)【要約】 本特許出願には、アミノ供与体としてのアスパルテートでの対応するケト酸ＰＰＯからのトランスアミノ化によってＬ−ホスフィノトリシンをを酵素的にキラル合成する方法が記載されている。大体等モル量のアミノ供与体およびアミノ受容体を使用する好適な反応技術によって定量的転化を行うことができ、これによって供与体アミノ酸アスパルテートが完全に使用される。熱安定性のトランスアミナーゼの使用によって、大きな反応速度および対応する大きな空間／時間効率が可能になる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本発明は、作物保護剤の合成の技術領域、殊にＰＰＯ−特異性アスパルテート
トランスアミナーゼ（Ａｓｐ−ＴＡ）の存在とアスパルテートの存在で、酵素ト
ランスアミノ化によって、４−（ヒドロキシメチルホスフィニル）−２−オキソ
酪酸（ＨＭＰＢ、ＰＰＯ）からＬ−２−アミノ−４−（ヒドロキシメチルホスフ
ィニル）酪酸（Ｌ−ホスフィノトリシン、Ｌ−ＰＰＴ）を合成する技術領域に関
する。化合物Ｌ−ＰＰＴ、その塩およびそのいくつかの誘導体は除草活性のある
非タンパク質生成性のアミノ酸またはその塩および誘導体（DE-A-2717440）であ
る。各々の場合、Ｌ型が生物学的活性があるが、各々の場合、Ｄ型は事実上不活
性である（DE-A-2856260）。
【０００２】 トランスアミナーゼは、その対応するケト酸前駆体からのアミノ酸のキラル酵
素合成に関して、その立体選択性が大きくまた基質特異性が比較的広いので、特
に好適であることがすでに開示されている。しかしながら、トランスアミナーゼ
を工業的に使用することの１つの欠点は、その平衡定数が約１であることであり
、従って、必要な生成物はただの５０％の収率でしか一般に得ることができない
（US-A4,826,766）。EP-A-0344683およびUS-A-5,221,737には、Escherichia coi
lからの４−アミノ−ブチレート：２−ケトグルタレートトランスアミナーゼ（
ＧＡＢＡトランスアミナーゼ、EC 2.6.1.19）による対応するケト酸［（２−オ
キソ−４−（ヒドロキシ）（メチル）ホスフィノイル酪酸、ＰＰＯ）］からのト
ランスアミノ化によって除草剤Ｌ−ホスフィノトリシン［Ｌ−ホモアラニン−４
−イル（メチル）ホスフィン酸、Ｌ−２−アミノ−４−（ヒドロキシメチルホス
フィニル）酪酸、Ｌ−ＰＰＴ）］、非タンパク質生成性のアミノ酸の製造が記載
されている。定量的な転化では、モル大過剰のアミノ供与体グルタメートを必要
とし、これは反応生成物の精製を困難にする。
【０００３】 対応するケト酸オキサロアセテートは水性媒体中で不安定でありまたピルベー
トへと自然的に脱カルボキシル化するので、この問題の１つの解決はアスパルテ
ートをアミノ供与体として使用することにより可能である。１つの反応生成物を
平衡から除去すると、逆反応が不可能になり、また定量的転化はケト酸と供与体
アミノ酸とを等モルで使用する際でさえ可能である。この種の方法は例えばEP-A
-0135846中に記載されている。
【０００４】 しかしながら、上記のＧＡＢＡトランスアミナーゼはアミノ供与体としてアス
パルテートを受容せず、またＬ−ホスフィノトリシンおよび既知のアスパルテー
トに対する共同特異性を有する他の任意のトランスアミナーゼも受容しないので
、Ｌ−ホスフィノトリシンの酵素合成に本発明の原理を適用することは今日まで
不可能であった。
【０００５】 別法として、ＰＰＴ−特異性のトランスアミナーゼおよびグルタメート：オキ
サロアセテートトランスアミナーゼ（GOT、EC 2.6.1.1）からなる連結した二酵
素系が提案されている（EP-A-0249188およびEP-A-0477902）。この反応方式では
、Ｌ−ＰＰＴの合成で使用されるグルタメートはＧＯＴによってアスパルテート
から再生される。アスパルテートトランスアミナーゼそのものは、Ｌ−ＰＰＴ／
ＰＰＯに対する特異性はない。オキサロアセテートのピルベートへの自発的な転
化もまた、総体的な反応に関してＬ−ＰＰＴ合成の方向に平衡の移動をもたらす
。この場合、等モル量より著しく少ないグルタメートともにＰＰＯとアスパルテ
ートとを等モルで使用すると定量的な生成物収率が可能である。
【０００６】 この連結酵素法は、基質溶液中に存在する供与体アミノ酸の過剰投与が、受容
体ケト酸ＰＰＯと比較して顕著に減少することを可能にし、これは生成物溶液の
仕上げ操作を簡単にする。しかしながら、この連結反応方式においてグルタメー
トを使用すくことがやはり必要であり、ケトグルタメートとの平衡にあるこのグ
ルタメートは反応生成物中に残存しあるいは構造的に極めて似たアミノ酸Ｌ−Ｐ
ＰＴから精妙な精製工程によって除去されねばならない。加えて、動力学的パラ
メータが異なるため、反応方式の最適化は２つの酵素では１つの酵素より一層困
難である。
【０００７】 例えばＧＯＴのようなこれまでに開示されたアスパルテートトランスアミナー
ゼはＰＰＯの転化をなんら示さないが、基質として大きな特異性を有するＬ−Ｐ
ＰＴ／ＰＰＯを基質として同様に受容する微生物からのアスパルテートトランス
アミナーゼが驚くべきことに現在見いだされている。この酵素は、アスパルテー
トのアルファ−アミノ基のＰＰＯへの直接的な転換を触媒する。
【０００８】 本発明は従って、式（Ｉ）
【化３】 のＬ−２−アミノ−４−（ヒドロキシメチルホスフィニル）酪酸（Ｌ−ホスフィ
ノトリシン、Ｌ−ＰＰＴ）、その誘導体および／または塩を、受容体としての式
（II）
【化４】 の４−（ヒドロキシメチルホスフィニル）−２−オキソ酪酸（ＨＭＰＢ、ＰＰＯ
）、その誘導体および／または塩から、供与体としてのアスパルテートの存在で
酵素トランスアミノ化によって製造する方法に関し、トランスアミノ化は、１つ
またはそれ以上の受容体特異性の、好ましくはＰＰＯ−特異性のアスパルテート
トランスアミナーゼ（Ａｓｐ−ＴＡ）の存在で行われ、オキサロアセテートおよ
び式（Ｉ）の化合物、その誘導体および／または塩が、１つまたはそれ以上の熱
安定性のおよび／または単離されたアスパルテートトランスアミナーゼの存在で
、また特に極めて好ましくはピルベートに対する基質特異性が最小である１つま
たはそれ以上のアスパルテートトランスアミナーゼの存在で生成され、従って、
副生物アラニンの生成が減少しあるいは実質的に回避することができる。
【０００９】 Ｌ−ＰＰＴの塩は一般に、無機および／または有機の酸または無機および／ま
たは有機の塩基との一塩基性塩および二塩基性塩である。酸との塩（酸付加塩）
は例えば、塩酸（塩化水素）または硫酸（硫酸塩）のような鉱酸との、または炭
酸（炭酸塩、炭酸水素塩）との、または酢酸（酢酸塩）、ギ酸（ギ酸塩）、プロ
ピオン酸（プロピオネート）または酒石酸（酒石酸塩）との塩である。塩基との
塩は例えば、アルカリ金属塩およびアルカリ土類金属塩、アンモニウム塩、第１
級、第２級または第３級アミンのような有機アミンとの塩、ならびに第４級アン
モニウム塩である。
【００１０】 誘導体は例えば、ホスフィン酸基上で例えばメタノール、エタノール、ｎ−プ
ロパノール、ｉ−プロパノール、ｎ−、ｉ−および第２級または第３級ブタノー
ルのようなＣ1〜Ｃ12のアルカノールならびにシクロアルカノールのようなＣ3〜
Ｃ6のシクロアルカノールによってエステル化されたＬ−ＰＰＴのエステルであ
る。誘導体はカルボン酸基上で例えば上記のアルコールによって別途あるいは追
加的にエステル化されたＬ−ＰＰＴのエステルでもある。誘導体はまたＬ−ＰＰ
Ｔのカルボキサミドおよびその誘導体、および適切なら、アルキル部分に炭素原
子を好ましくは１〜４個有するＮ−アルキルアミドまたはＮ,Ｎ−ジアルキルア
ミドでもある。
【００１１】 ＰＰＯの誘導体は例えば、その無機および／または有機の塩基との塩であり、
このために好適な塩基はＬ−ＰＰＴとの関連ですでに述べて来た。誘導体は例え
ばカルボン酸基もしくはホスフィン酸基またはこれら双方上でエステル化された
ＰＰＯのエステルでもある。エステル基にとって好適なアルコールは公式的には
Ｌ−ＰＰＴのエステルにとって好適なアルコール、好ましくは上記に述べたアル
カノールである。誘導体はまたＰＰＯのカルボキサミドおよびそのホスフィン酸
基上でエステル化された誘導体、そして適切なら対応するＮ−アルキルアミドま
たはＮ,Ｎ−ジアルキルアミドでもある。
【００１２】 アスパルテートはＬ−アスパラギン酸またはその塩、好ましくはアルカリ金属
塩をさすのが好ましい。しかしながら、Ｌ−アスパラギン酸とＤ−アスパラギン
酸との混合物、例えばＤ,Ｌ−アスパラギン酸をアスパルテートとして使用する
ことも可能である。
【００１３】 本発明の方法における別な可能性は、反応媒体中に妥当なら存在するピルベー
トを、物理的、化学的および／または酵素的手段によって、好ましくは酵素触媒
作用による転化によって、例えばアセトラクテートシンターゼ、ピルベートデカ
ルボキシラーゼ、ピルベートオキシダーゼ、特にアセトラクテートシンターゼに
よって除去することであり、比較的熱安定性である酵素の存在でピルベートの転
化を行うのが特に極めて好ましい。使用される酵素は、妥当ならこのようにして
固定されることができる。
【００１４】 両方の基質（供与体および受容体）は例えば０.５：１〜２：１のモル比（Ｌ
−アスパラギン酸：ＰＰＯに基づく）、好ましくは０.７５：１〜１.５：１で、
殊に大体等モルで使用される。Ｌ−アスパラギン酸（塩）とＤ−アスパラギン酸
（塩）との混合物を使用する際、Ｌ−アスパラギン酸（塩）のモル量は決定的で
ある。ＰＰＯ誘導体はＰＰＯに等しいモル量で使用せねばならない。基質溶液中
にグルタメートが存在することは必要でない。見いだされた酵素のいくつかは優
れた熱安定性を示す。従って、本発明は広い温度範囲例えば１０〜９５℃、好ま
しくは４０〜９０℃、特に６０〜８５℃で実施することができる。熱安定性を特
に示さない酵素の好ましい温度範囲は２０〜７０℃、特に３０〜４０℃である。
【００１５】 比較的高い温度は反応速度をかなり加速するのを可能にし、これはまた、一層
濃厚な基質溶液（濃度１０％）が大きな空間／時間収率で転化するのを可能にす
る。反応は６.５〜１０、好ましくは７.５〜８.５の範囲のｐＨで、７〜９のｐ
Ｋａを有する妥当に適切な緩衝系、特に燐酸塩またはトリス緩衝剤中で行われる
のが好ましい。生化学的に詳細に特徴把握されている酵素がＧＡＢＡに対する特
異性をもたず、従って、すでに開示したＬ−ＰＰＴ／ＰＰＯ−特異性トランスア
ミナーゼとは異なることは驚くべきことである。
【００１６】 トランスアミノ化に際してアラニンの生成が回避されあるいは最小化されるな
ら、反応において特に大きな転化率を得ることができる。適当ならば、ピルベー
トに関する基質特異性をもたない最適化されたＡＳＰ−ＴＡ変異体を使用するこ
とができる。別な可能性は、物理的に、例えば選択的に透過可能な膜の使用によ
り、そして／または化学的もしくは酵素的に、例えばピルベートデカルボキシラ
ーゼ、ピルベートオキシダーゼまたはアセトラクテートシンターゼによル転化に
よって反応混合物からピルベートから除去することである（例えば、Taylorら、
TIBTECH（1998）、16巻、412〜418；Fotheringhamら、CHIMICA OGGI／chemistry
today（1997）、9／10、33〜38；WO 98／53088を参照）。
【００１７】 反応溶液からの生成物、Ｌ−ＰＰＴの精製は適切なら既知のおよび慣用の方法
によって、例えばメチルイソブチルケトンでの抽出によってまたは、例えばAmbe
rlite（登録商標）IR 120（Ｓｉｇｍａによって製造される）による陽イオン交
換クロマトグラフィーによって行うことができる。 本発明の方法は以下の実施例によってさらに説明されまた本発明は特許請求の
範囲に規定される。以下の実施例はこの点で限定的であると解すべきでない。
【００１８】 実施例： １） Ｌ−ＰＰＴ特異性アスパルテートトランスアミナーゼ活性を有する土壌微
生物の単離 それぞれ１ｇのいろいろな土壌試料（腐食土、ローム、砂／Schwanheimer Due
ne Frankfurt）をｐＨ＝７.０の１０mMの燐酸ナトリウム緩衝液１０mlによって
室温で１時間抽出した。以下の媒体中の富化培養基に抽出物から接種した。 ５mMのグルコース ５mMのスクシネート １０mMのグリセロール １０mMのＰＰＯ １０mMのＬ−アスパラギン酸 ５０ml／Ｌの溶液Ａ ２５ml／Ｌに溶液Ｂ
【００１９】 溶液Ａ：５０ｇ／ＬのＫ2ＨＰＯ4 溶液Ｂ：２.５ｇ／ＬのＭｇＳＯ4 ０.５ｇ／ＬのＮａＣｌ 以下を含有するストック溶液からの２５ml／Ｌ １ｇ／ＬのＦｅＳＯ4×７Ｈ2Ｏ ０.２２ｇ／ＬのＭｎＳＯ4×Ｈ2Ｏ ０.１ｇ／ＬのＨ3ＢＯ3 ０.１ｇ／ＬのＮａ2ＭｏＯ4×２Ｈ2Ｏ ０.１８ｇ／ＬのＺｎＳＯ4×７Ｈ2Ｏ ０.１６ｇ／ＬのＣｕＳＯ4×５Ｈ2Ｏ ０.１ｇ／ＬのＣｏＣｌ2×６Ｈ2Ｏ １ml／Ｌの１ＮのＨＣｌ
【００２０】 培養基を震盪機上で２８℃および２００rpmで３〜５日培養した。唯一のＮ源
としてのＬ−アスパラギン酸によって増殖することができる微生物の富化は、試
験した試料（腐食土）の１つから可能であった。培養基を同じ媒体中でさらに数
回継代し、次いで同じ組成の寒天媒体上に薄く乗せて、単一のコロニーを分離し
た。２８℃で３〜５日間培養の後、全部で１００の単一コロニーを分離しそれぞ
れ再び液体媒体（上記を参照）中に接種した。純粋な培養基を得るために、寒天
プレート上での分離を２回以上反復した。 これらの淘汰サイクルの後、唯一のＮ源としてのＬ−アスパラギン酸によって
増殖することができる個々の２０の株を入手した。
【００２１】 ＰＰＯ／Ａｓｐトランスアミナーゼ活性について試験するために、各々の株の
２mlの培養基を上記のように増殖した。次いで、各々の培養基４００μlを０.５
％トルエン、０.５％エタノールを用いて３０分浸透性化した。各々の細胞ペレ
ットをＰＰＯ ５０mM、Ｌ−アスパラギン酸５０mM、ｐＨ＝８.０のＴｒｉｓ／Ｈ
Ｃｌ ５０mM、ピリドキサルホスフェート１０μMからなる反応混合物５０μl中
に再び懸濁しそして２８℃で一晩培養した。
【００２２】 生成したＰＰＴの定性的決定のために、反応の上澄み液を水中で１：５に希釈
しそしてその５μlの部分を、移動相としてのｎ−ブタノール：氷酢酸：水＝６
０：１５：２５によるセルロースＨＰＴＬＣプレート（Ｍｅｒｃｋ）上の薄層ク
ロマトグラフィーによって分析した。ニンヒドリン染色によってアミノ酸を可視
化した。４つの株（ＤＳＭ １３３５３、ＤＳＭ １３３５４、ＤＳＭ １３３５
５、ＤＳＭ １３３５６；すべての株は“Deutsch Sammlung von Mikroorganisme
n und Zellkulturen GmbH”に寄託されている）でホスフィノトリシンの生成を
検出することができた。反応生成物の鏡像異性体純度はキラルＨＰＬＣ［基質と
してペニシラミン（Phenomenoxによって製造）を用いて分離カラム Chirex(登録
商標)（Ｄ）によって調べられる］（移動層：２mMのＣｕＳＯ4、１０％メタノー
ル、流速：０.５ml／分、紫外線の検出：２５４nm、保持時間：Ｌ−ＰＰＴ：約
１７分、Ｄ−ＰＰＴ：約２１分）によった。従って、調べた４つの試験試料にお
いて反応生成物としてＬ−ＰＰＴを検出できまたＤ−ＰＰＴは検出できなかった
。
【００２３】 生物学的形質転換によるＬ−ＰＰＴの調製および反応の進行の定量的分析のた
めに、土壌バクテリア株ＤＳＭ １３３５４、ＤＳＭ １３３５５およびＤＳＭ
１３３５６のそれぞれの１１の培養基を７ページに記載した媒体中で２８℃で４
８時間増殖した。細胞を遠心分離によって収得し、１０mMのＮａＣｌ、１０mMの
燐酸ナトリウム（ｐＨ＝７．５）中で１回洗浄し、次いで１晩凍結乾燥した。
【００２４】 生物学的形質転換を実施するために、上記で同定した土壌バクテリア株を以下
の基質溶液１０ml中に再度懸濁した。 １００mMのＰＰＯ ２００mMのＬ−アスパラギン酸 １００mMのＴｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ＝８.０ １mMのピリドキサルホスフェート
【００２５】 培養震盪機上で混合物を２００rpmおよび３７℃で培養した。１、２、４、８
および３０時間後に試料２００μlをとりそして８ページで説明したようにＨＰ
ＬＣで分析した。Ｌ−ＰＰＴおよびＬ−アスパラギン酸に関する測定結果を表１
に要約した。達成された最大の転化率［基質中の生成されたＬ−ＰＰＴ／ＰＰＯ
×１００］は約５９％であった（ＤＳＭ）。
【００２６】
【表１】
【００２７】 ２） トランスアミナーゼ酵素調合物を用いる直接ＰＰＯ／アスパルテートトラ
ンスアミノ化の検出 市販で入手できる全部で７つの異なるトランスアミナーゼをＰＰＯ／アスパル
テートトランスアミノ化に関して試験した。微生物誘導から（Diversa CAT＃ AM
N-001（１９９８）からのアミノトランスフェラーゼ試験キット中に含まれる熱
安定性トランスアミナーゼＡＭＮ−００１−０１、−００１−０２、−００１−
０３、−００１−０４、−００１−０５；グルタメート−オキサルアセテートト
ランスアミナーゼ（ＧＯＴ）、グルタメート−ピルベートトランスアミナーゼ（
ＧＰＴ）、Sigma）。酵素調合物をｐＨ＝８.０のTris／ＨＣｌ緩衝剤５０mM中の
蛋白濃厚液５mg／mlによって溶解し、次いで同じ緩衝剤に対して４℃で一晩透析
した。これは、酵素調合物中に存在するおそれがありまたトランスアミノ化で中
間的担体として働くであろうアミノ供与体および受容体を除去することを意図す
る。次いで、酵素溶液を１mg／mlに調整し、そしてＰＰＯ ５０mM、Ｌ−アスパ
ラギン酸５０mM、ｐＨ＝８.０のTris／ＨＣｌ ５０mM、ピリドキサルフォスフェ
ート１０μMからなる反応緩衝剤によって、特定の酵素にとって最適な温度で混
合物５０μl中で１時間培養した。
【００２８】 薄層クロマトグラフィー酵素試験および実施例１の記載のキラルＨＰＬＣによ
って酵素試験を解析した。Ｌ−アスパラギン酸からトランスアミノ化によるＬ−
ＰＰＴの鏡像選択的生成は熱安定性酵素の２つ、ＡＭＮ−００１−０３およびＡ
ＭＮ−００１−０４によって検出できた（反応温度：８０℃）。他の酵素はいず
れも反応性を示さなかった。
【００２９】 ３） 熱安定性トランスアミナーゼＡＭＮ−００１−０３によるＰＰＯ／アスパ
ルテートトランスアミノ化の定量的測定 特異的活性が比較的高いので、Ｌ−ＰＰＴ合成反応を一層正確に特徴把握する
ためにトランスアミナーゼＡＭＮ−００１−０３を選定した。ＰＰＯ４０mM、Ｌ
−アスパラギン酸４８mM、ｐＨ＝８.０のTris／ＨＣｌ ５０mM、ピリドキサルホ
スフェート０.１mMからなる基質溶液１mlをＡＭＮ−００１−０３トランスアミ
ナーゼ１mgによって培養した。反応の進行を解析するために、５０μlの分取物
を２４時間にわたって採取しそして−２０℃で凍結した。ＰＰＴおよびアスパル
テートをアミノ酸分析機（Biotronic LC 5001）中で測定した。結果を表２に示
す。選定した条件の下で、Ｌ−ＰＰＴ合成反応は２〜４時間後に平衡に達した。
使用したアミノ供与体、Ｌ−アスパラギン酸は７時間後に完全に消費された。転
化率［基質中で生成したＬ−ＰＰＴ／ＰＰＯ×１００］約７５％を得た。
【００３０】
【表２】
【００３１】 ４） 部分的に精製された熱安定性のトランスアミナーゼＡＭＮ−００１−０３
によるＰＰＯとアスパルテートからのＬ−ＰＰＴの酵素キラル合成 合成実験のために、１０７nkat／タンパク質mg（１nkat＝アスパルテート１ｎ
モル／秒）の特異的活性を有する部分的に精製されたトランスアミナーゼＡＭＮ
−００１−０３を使用した。体積１mlの反応溶液は、ＰＰＯ（１０％）５５２ｍ
Ｍ、Ｌ−アスパラギン酸７００mM、ＫＨＣＯ3によってｐＨ＝８.０に調整された
ピリドキサルホスフェート、および酵素１１.５mgを含有した。混合物を８０℃
で培養した。実施例３に記載したように試料採取および分析を行った。
【００３２】 結果を表３にまとめた。この実験では、ただの１時間後に反応平衡に達した。
４時間後、アミノ供与体Ｌ−アスパラギン酸はほとんど完全に消費された。転化
率は約５２％でありまた空間／時間収率［Ｌ−ＰＰＴｇ／生体触媒ｇ／時間］は
４.５であった。同一基質溶液および酵素濃度を用いるが反応温度が６０℃であ
る並行する実験においては、反応速度が顕著に低下したが類似する転化率が得ら
れた。空間／時間収率［Ｌ−ＰＰＴｇ／生体触媒ｇ／時間］はただの０.９５で
あった。これらの結果は、転化率および効率的な反応方式に対するトランスアミ
ナーゼの高い熱安定性の著しい重要性を例証する。転化率が５２％というほんの
中程度であるのは、ピルベートのトランスアミノ化によって副生物アラニンが生
成することに主として帰せられる。反応に際してアラニンの生成が回避されるな
ら、かなりより大きい転化率を得ることができる。
【００３３】
【表３】
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１３年４月２７日（２００１．４．２７）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【化１】 のＬ−２−アミノ−４−（ヒドロキシメチルホスフィニル）酪酸（Ｌ−ホスフィ
ノトリシン、Ｌ−ＰＰＴ）、カルボン酸エステルおよびカルボキサミドおよびホ
スフィン酸エステルからなる群から選択されるその誘導体ならびに／またはその
対応する塩を、受容体としての式（II）
【化２】 の４−（ヒドロキシメチルホスフィニル）−２−オキソ酪酸（ＨＭＰＢ、ＰＰＯ
）、そのカルボン酸エステルおよびカルボキサミドおよびホスフィン酸エステル
からなる群から選択されるその誘導体ならびに／またはその対応する塩から、供
与体としてのアスパルテートの存在で酵素トランスアミノ化によって製造する方
法であって、１つまたはそれ以上の受容体特異性アスパルテートトランスアミナ
ーゼ（Ａｓｐ−ＴＡ）の存在でトランスアミノ化が行われ、オキサロアセテート
および式（Ｉ）の化合物、その誘導体および／または塩が生成される上記の方法
。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｒ 1:00） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＲ，Ｃ Ｕ，ＣＺ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＧＤ，ＧＥ，ＨＲ，ＨＵ ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ， ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，Ｍ Ｇ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ， ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ

Claims (13)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 式（Ｉ） 【化１】 のＬ−２−アミノ−４−（ヒドロキシメチルホスフィニル）酪酸（Ｌ−ホスフィ
    ノトリシン、Ｌ−ＰＰＴ）、その誘導体および／または塩を、受容体としての式
    （II） 【化２】 の４−（ヒドロキシメチルホスフィニル）−２−オキソ酪酸（ＨＭＰＢ、ＰＰＯ
    ）、その誘導体および／または塩から、供与体としてのアスパルテートの存在で
    酵素トランスアミノ化によって製造する方法であって、１つまたはそれ以上の受
    容体特異性アスパルテートトランスアミナーゼ（Ａｓｐ−ＴＡ）の存在でトラン
    スアミノ化が行われ、オキサロアセテートおよび式（Ｉ）の化合物、その誘導体
    および／または塩が生成される上記の方法。
  2. 【請求項２】 供与体としてのアスパルテートと受容体としての式IIの化合
    物、その誘導体および／または塩との反応が熱的に安定な受容体特異性アスパル
    テートトランスアミナーゼの存在で行われる請求項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】 受容体特異性アスパルテートトランスアミナーゼのピルベー
    トに対する基質特異性が低く、副生物アラニンの生成ができるだけ回避される請
    求項１または２に記載の方法。
  4. 【請求項４】 存在するピルベートが物理的、化学的および／または酵素的
    方法によって反応混合物から除去される請求項１〜３のいずれか一項に記載の方
    法。
  5. 【請求項５】 １つまたはそれ以上のアセトラクテートシンターゼ（ＡＬＳ
    ）の存在でピルベートの転化が行われアセトラクテートが生成される請求項４に
    記載の方法。
  6. 【請求項６】 ピルベートデカルボキシラーゼの存在でピルベートの転化が
    行われアセトアルデヒドが生成される請求項４に記載の方法。
  7. 【請求項７】 ピルベートオキシダーゼの存在でピルベートの転化が行われ
    アセチルホスフェートが生成される請求項４に記載の方法。
  8. 【請求項８】 熱安定性の酵素の存在でピルベートの転化が行われる請求項
    ５〜７のいずれか一項に記載の方法。
  9. 【請求項９】 １つまたはそれ以上のトランスアミナーゼが固定化された形
    である請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
  10. 【請求項１０】 寄託番号ＤＳＭ １３３５３の微生物。
  11. 【請求項１１】 寄託番号ＤＳＭ １３３５４の微生物。
  12. 【請求項１２】 寄託番号ＤＳＭ １３３５５の微生物。
  13. 【請求項１３】 寄託番号ＤＳＭ １３３５６の微生物。
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