SK15622001A3 - Spôsob výroby L-fosfinotricínu enzymatickou transamináciou s aspartátom - Google Patents
Spôsob výroby L-fosfinotricínu enzymatickou transamináciou s aspartátom Download PDFInfo
- Publication number
- SK15622001A3 SK15622001A3 SK1562-2001A SK15622001A SK15622001A3 SK 15622001 A3 SK15622001 A3 SK 15622001A3 SK 15622001 A SK15622001 A SK 15622001A SK 15622001 A3 SK15622001 A3 SK 15622001A3
- Authority
- SK
- Slovakia
- Prior art keywords
- reaction
- aspartate
- pyruvate
- salts
- ppt
- Prior art date
Links
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 title claims abstract description 21
- 229940009098 aspartate Drugs 0.000 title claims abstract description 20
- 238000005891 transamination reaction Methods 0.000 title claims abstract description 18
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 title claims abstract description 9
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 47
- 102000003929 Transaminases Human genes 0.000 claims abstract description 21
- 108090000340 Transaminases Proteins 0.000 claims abstract description 21
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims abstract description 17
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 15
- IAJOBQBIJHVGMQ-BYPYZUCNSA-N glufosinate-P Chemical compound CP(O)(=O)CC[C@H](N)C(O)=O IAJOBQBIJHVGMQ-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 36
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 19
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 18
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 18
- 102000004625 Aspartate Aminotransferases Human genes 0.000 claims description 14
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M Pyruvate Chemical compound CC(=O)C([O-])=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 14
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 14
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 8
- 108010000700 Acetolactate synthase Proteins 0.000 claims description 6
- 108030002081 Aspartate transaminases Proteins 0.000 claims description 6
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 6
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 claims description 6
- ACVYVLVWPXVTIT-UHFFFAOYSA-N phosphinic acid Chemical class O[PH2]=O ACVYVLVWPXVTIT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- KHPXUQMNIQBQEV-UHFFFAOYSA-N oxaloacetic acid Chemical compound OC(=O)CC(=O)C(O)=O KHPXUQMNIQBQEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- YJTNHDYMQPHXFO-UHFFFAOYSA-N 4-(hydroxymethylphosphinyl)-2-oxobutyric acid Chemical compound CP(O)(=O)CCC(=O)C(O)=O YJTNHDYMQPHXFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 claims description 4
- HXOYWJCDYVODON-UHFFFAOYSA-N 4-[4-(hydroxymethyl)-3-methoxyphenoxy]butanoic acid Chemical compound COC1=CC(OCCCC(O)=O)=CC=C1CO HXOYWJCDYVODON-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- FNJQGUKETYGBGL-BYPYZUCNSA-N OC(=O)[C@@H](N)CCP(=O)CO Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCP(=O)CO FNJQGUKETYGBGL-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 3
- 108010011939 Pyruvate Decarboxylase Proteins 0.000 claims description 3
- 108010042687 Pyruvate Oxidase Proteins 0.000 claims description 3
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 claims description 3
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 claims description 3
- 150000001732 carboxylic acid derivatives Chemical class 0.000 claims description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 2
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 claims 3
- IKHGUXGNUITLKF-UHFFFAOYSA-N Acetaldehyde Chemical compound CC=O IKHGUXGNUITLKF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- 150000001733 carboxylic acid esters Chemical class 0.000 claims 2
- WTLNOANVTIKPEE-UHFFFAOYSA-N 2-acetyloxypropanoic acid Chemical compound OC(=O)C(C)OC(C)=O WTLNOANVTIKPEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- LIPOUNRJVLNBCD-UHFFFAOYSA-N acetyl dihydrogen phosphate Chemical compound CC(=O)OP(O)(O)=O LIPOUNRJVLNBCD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- LMBFAGIMSUYTBN-MPZNNTNKSA-N teixobactin Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H]1C(N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C[C@@H]2NC(=N)NC2)C(=O)N[C@H](C(=O)O[C@H]1C)[C@@H](C)CC)=O)NC)C1=CC=CC=C1 LMBFAGIMSUYTBN-MPZNNTNKSA-N 0.000 claims 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 abstract description 11
- 239000002253 acid Substances 0.000 abstract description 5
- 150000004715 keto acids Chemical class 0.000 abstract description 5
- CKLJMWTZIZZHCS-UWTATZPHSA-N D-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-UWTATZPHSA-N 0.000 description 32
- CKLJMWTZIZZHCS-UHFFFAOYSA-N D-OH-Asp Natural products OC(=O)C(N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 229960005261 aspartic acid Drugs 0.000 description 15
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 15
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 15
- NGVDGCNFYWLIFO-UHFFFAOYSA-N pyridoxal 5'-phosphate Chemical compound CC1=NC=C(COP(O)(O)=O)C(C=O)=C1O NGVDGCNFYWLIFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 108010003415 Aspartate Aminotransferases Proteins 0.000 description 9
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 8
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 8
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 8
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 7
- 229930195712 glutamate Natural products 0.000 description 7
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 6
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 6
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000000370 acceptor Substances 0.000 description 5
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 5
- -1 hydroxymethylphosphinyl Chemical group 0.000 description 5
- 235000007682 pyridoxal 5'-phosphate Nutrition 0.000 description 5
- 239000011589 pyridoxal 5'-phosphate Substances 0.000 description 5
- 229960001327 pyridoxal phosphate Drugs 0.000 description 5
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N N-Butanol Chemical compound CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- DKGAVHZHDRPRBM-UHFFFAOYSA-N Tert-Butanol Chemical compound CC(C)(C)O DKGAVHZHDRPRBM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 4
- 102100035923 4-aminobutyrate aminotransferase, mitochondrial Human genes 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N Toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000002585 base Substances 0.000 description 3
- 230000036983 biotransformation Effects 0.000 description 3
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 3
- 229940079919 digestives enzyme preparation Drugs 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 3
- 108010060511 4-Aminobutyrate Transaminase Proteins 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 101710098398 Probable alanine aminotransferase, mitochondrial Proteins 0.000 description 2
- 229960000583 acetic acid Drugs 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 229910052783 alkali metal Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011942 biocatalyst Substances 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 125000005521 carbonamide group Chemical group 0.000 description 2
- 238000004296 chiral HPLC Methods 0.000 description 2
- BTCSSZJGUNDROE-UHFFFAOYSA-N gamma-aminobutyric acid Chemical compound NCCCC(O)=O BTCSSZJGUNDROE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940093915 gynecological organic acid Drugs 0.000 description 2
- 239000003864 humus Substances 0.000 description 2
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 2
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N propan-1-ol Chemical compound CCCO BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 244000000000 soil microbiome Species 0.000 description 2
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LJRDOKAZOAKLDU-UDXJMMFXSA-N (2s,3s,4r,5r,6r)-5-amino-2-(aminomethyl)-6-[(2r,3s,4r,5s)-5-[(1r,2r,3s,5r,6s)-3,5-diamino-2-[(2s,3r,4r,5s,6r)-3-amino-4,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy-6-hydroxycyclohexyl]oxy-4-hydroxy-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl]oxyoxane-3,4-diol;sulfuric ac Chemical compound OS(O)(=O)=O.N[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](N)C[C@@H](N)[C@@H]2O)O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)N)O[C@@H]1CO LJRDOKAZOAKLDU-UDXJMMFXSA-N 0.000 description 1
- KPGXRSRHYNQIFN-UHFFFAOYSA-L 2-oxoglutarate(2-) Chemical compound [O-]C(=O)CCC(=O)C([O-])=O KPGXRSRHYNQIFN-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- KPGXRSRHYNQIFN-UHFFFAOYSA-N 2-oxoglutaric acid Chemical compound OC(=O)CCC(=O)C(O)=O KPGXRSRHYNQIFN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108030000921 4-aminobutyrate-2-oxoglutarate transaminases Proteins 0.000 description 1
- HBAQYPYDRFILMT-UHFFFAOYSA-N 8-[3-(1-cyclopropylpyrazol-4-yl)-1H-pyrazolo[4,3-d]pyrimidin-5-yl]-3-methyl-3,8-diazabicyclo[3.2.1]octan-2-one Chemical class C1(CC1)N1N=CC(=C1)C1=NNC2=C1N=C(N=C2)N1C2C(N(CC1CC2)C)=O HBAQYPYDRFILMT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102100036608 Aspartate aminotransferase, cytoplasmic Human genes 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M Bicarbonate Chemical compound OC([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- FEWJPZIEWOKRBE-JCYAYHJZSA-N Dextrotartaric acid Chemical compound OC(=O)[C@H](O)[C@@H](O)C(O)=O FEWJPZIEWOKRBE-JCYAYHJZSA-N 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-M Formate Chemical compound [O-]C=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NTIZESTWPVYFNL-UHFFFAOYSA-N Methyl isobutyl ketone Chemical compound CC(C)CC(C)=O NTIZESTWPVYFNL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UIHCLUNTQKBZGK-UHFFFAOYSA-N Methyl isobutyl ketone Natural products CCC(C)C(C)=O UIHCLUNTQKBZGK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- IAJOBQBIJHVGMQ-UHFFFAOYSA-N Phosphinothricin Natural products CP(O)(=O)CCC(N)C(O)=O IAJOBQBIJHVGMQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FEWJPZIEWOKRBE-UHFFFAOYSA-N Tartaric acid Natural products [H+].[H+].[O-]C(=O)C(O)C(O)C([O-])=O FEWJPZIEWOKRBE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 150000001340 alkali metals Chemical class 0.000 description 1
- 229910052784 alkaline earth metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 150000003863 ammonium salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 description 1
- KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N boric acid Chemical compound OB(O)O KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-N carbonic acid Chemical compound OC(O)=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000002843 carboxylic acid group Chemical group 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 229920001429 chelating resin Polymers 0.000 description 1
- 239000004927 clay Substances 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- HPXRVTGHNJAIIH-UHFFFAOYSA-N cyclohexanol Chemical compound OC1CCCCC1 HPXRVTGHNJAIIH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001952 enzyme assay Methods 0.000 description 1
- 125000004185 ester group Chemical group 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229960003692 gamma aminobutyric acid Drugs 0.000 description 1
- 239000012362 glacial acetic acid Substances 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- IXCSERBJSXMMFS-UHFFFAOYSA-N hcl hcl Chemical compound Cl.Cl IXCSERBJSXMMFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002363 herbicidal effect Effects 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 150000007529 inorganic bases Chemical class 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 1
- ZXEKIIBDNHEJCQ-UHFFFAOYSA-N isobutanol Chemical compound CC(C)CO ZXEKIIBDNHEJCQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 235000010755 mineral Nutrition 0.000 description 1
- 150000007522 mineralic acids Chemical class 0.000 description 1
- FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N ninhydrin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C(O)(O)C(=O)C2=C1 FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000007530 organic bases Chemical class 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 229960001639 penicillamine Drugs 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 150000003141 primary amines Chemical class 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- SXBRULKJHUOQCD-UHFFFAOYSA-N propanoic acid Chemical compound CCC(O)=O.CCC(O)=O SXBRULKJHUOQCD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011814 protection agent Substances 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000012207 quantitative assay Methods 0.000 description 1
- 150000003242 quaternary ammonium salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 239000004576 sand Substances 0.000 description 1
- 150000003335 secondary amines Chemical class 0.000 description 1
- UQDJGEHQDNVPGU-UHFFFAOYSA-N serine phosphoethanolamine Chemical compound [NH3+]CCOP([O-])(=O)OCC([NH3+])C([O-])=O UQDJGEHQDNVPGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CBXWGGFGZDVPNV-UHFFFAOYSA-N so4-so4 Chemical compound OS(O)(=O)=O.OS(O)(=O)=O CBXWGGFGZDVPNV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L succinate(2-) Chemical compound [O-]C(=O)CCC([O-])=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 235000002906 tartaric acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011975 tartaric acid Substances 0.000 description 1
- 150000003512 tertiary amines Chemical class 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 238000000825 ultraviolet detection Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
Landscapes
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
Vynález sa týka technickej oblasti syntézy účinných látok prostriedkov na ochranu rastlín, obzvlášť syntézy kyseliny L-2-amino-4(hydroxymetylfosfinyl)maslovej (L-fosfinotricín, L-PPT) z kyseliny 4(hydroxymetylfosfinyl)-2-oxo-maslovej (HMPB, PPO) enzymatickou transamináciou za prítomnosti aspartátu a za prítomnosti PPO-špecifickej aspartát-transaminázy (ASP-TA). Zlúčenina L-PPT, jej soli a niektoré jej deriváty sú herbicídne účinné neproteinogénne aminokyseliny, prípadne ich soli a deriváty (DE-A-2 717 440). Zodpovedajúca L-forma je pritom biologicky aktívna, zatiaľ čo zodpovedajúca D-forma je prakticky neúčinná (DE-A-2 856 260).
Doterajší stav techniky
Je už známe, že sa transaminázy na základe svojej vysokej stereoselektivity a relatívne širokej substrátovej špecifičnosti hodia najmä na chirálnu enzymatickú syntézu aminokyselín z ich korešpondujúcich predstupňov ketokyselín. Nevýhodou pre technické použitie transamináz je však ich rovnovážna konštanta ca. 1, takže požadovaný produkt môže vznikať všeobecne len v 50 % výťažku (US-A-4 826 766). V EP-A-0 344 683 a v US-A5 221 737 je opísaná výroba herbicídnej účinnej látky L-fosfinotricín u (kyselina L-homoalanín-4-yl-(metyl)fosfínová, kyselina L-2-amino-4-(hydroxymetylfosfinyl)maslová, L-PPT), neproteinogénnej aminokyseliny, transamináciou z korešpondujúcej ketokyseliny (kyselina (2-oxo-4-((hydroxy)(metyl)-fosfinoyl)maslová, PPO) so 4-aminobutyrát: 2-ketoglutarát-transaminázou (GABAtransamináza, EC 2.6.1.19) z Escheríchia coli. Pre kvantitatívnu reakciu je potrebný vysoký molárny prebytok aminodonoru glutamátu, čo sťažuje čistenie reakčného produktu.
31820/H
Riešenie tohto problému je možné použitím aspartátu ako aminodonoru, lebo korešpondujúca ketokyselina oxalacetát je vo vodnom prostredí nestabilná a spontánne dekarboxyluje na pyruvát. Odstránením reakčného produktu z rovnováhy nemôže dochádzať k žiadnej spätnej reakcii a je možná kvantitatívna reakcia tiež pri ekvimolárnom použití ketokyseliny a donorovej aminokyseliny. Takýto spôsob je opísaný napríklad v EP-A-0 135 846.
Použitie tohto princípu na enzymatickú syntézu L-fosfinotricínu však doteraz nebolo možné, lebo opísaná GABA-transamináza aspartát ako aminodonor nebola akceptovaná a tiež neboli známe žiadne iné transaminázy so spoločnou špecifitou pre L-fosfinotricín a aspartát.
Ako pomoc sa navrhol zdvojený dvojenzýmový systém, pozostávajúci z PPT-špecifickej transaminázy a glutamát: oxalacetát-transaminázy (GOT, EC 2.6.1.1) (EP-A-0 249 188 a EP-A-0 477 902). Pri tomto vedení reakcie sa glutamát, spotrebovávaný pri syntéze L-PPT, regeneruje pomocou GOT z aspartátu. Aspartát-transamináza samotná nemá žiadnu špecifičnosť pre LPPT/PPO. Spontánna premena oxalacetátu na pyruvát vedie tiež pre celkovú reakciu k posunutiu rovnováhy v smere syntézy L-PPT. Pritom sú možné kvantitatívne výťažky produktu pri ekvimolárnom použití PPO a aspartátu a podstatnom nadbytku glutamátu.
Týmto zdvojeným enzýmovým procesom možno podstatne znížiť predávkovanie donorových aminokyselín, prítomných v roztoku substrátu, voči akceptorovej ketokyseline PPO, čo zjednodušuje spracovanie roztoku produktu. Pri zdvojenom vedení reakcie je však ďalej potrebné použitie glutamátu, ktorý v rovnováhe s ketoglutarátom - zostáva v reakčnom produkte alebo sa musí nákladnými čistiacimi postupmi zo štruktúrne podobnej aminokyseliny L-PPT oddeľovať. Okrem toho je optimalizácia vedenia reakcie s dvoma enzýmami na základe rozdielnych kinetických parametrov ťažia ako pri použití jedného enzýmu.
31820/H
Podstata vynálezu
Hoci doteraz známe aspartát-transaminázy, ako je napríklad GOT, nevykazujú žiadnu reakciu u PPO, v súčasnosti sa prekvapujúco zistili aspartát -transaminázy z mikroorganizmov, ktoré rovnako akceptujú L-PPT/PPO s vysokou špecífitou ako substrát. Tieto enzýmy katalyzujú priame prenesenie α-aminoskupiny aspartátu na PPO.
Predmetom predloženého vynálezu teda je spôsob výroby kyseliny L-2amino-4-(hydroxymetylfosfinyl)maslovej (L-fosfinotricín, L-PPT) vzorca I:
.CO-OH
H3Cp—CH2—CH2—C
OH nh2, (i) a jej derivátov a/alebo solí z kyseliny 4-(hydroxymetylfosfinyl)-2-oxo-maslovej (HMPB, PPO) vzorca II:
O 0 0 h3C4-ch2-chU-Loh
OH (II) a jej derivátov a/alebo solí ako akceptora enzymatickou transamináciou za prítomnosti aspartátu ako donoru, pričom transaminácia sa vykonáva za prítomnosti jednej alebo viacerých akceptor-špecifickej, výhodne PPOšpecifickej, aspartát-transaminázy (Asp-TA) na oxalacetát a zlúčeninu vzorca I, jej deriváty a/alebo soli, výhodne za prítomnosti jednej alebo viacerých termostabilnej a/alebo izolovanej aspartát-transaminázy a celkom obzvlášť výhodne za prítomnosti jednej alebo viacerých aspartát-transaminázy s pokiaľ možno nepatrnou substrátovou špecifitou pre pyruvát tak, aby sa mohla redukovať tvorba vedľajšieho produktu alanínu alebo prakticky celkom potlačiť.
Soli L-PPT sú všeobecne soli s anorganickými a/alebo organickými kyselinami alebo mono- alebo di-soli s anorganickými a/alebo organickými
31820/H bázami. Soli s kyselinami (adičné soli s kyselinami) sú napríklad soli s minerálnymi kyselinami, ako je kyselina chlorovodíková (hydrochlorid) alebo kyselina sírová (sulfát) alebo kyselina uhličitá (karbonát, hydrogénkarbonát) alebo s organickými kyselinami, ako je kyselina octová (acetát), kyselina mravčia (formiát), kyselina propiónová (propionát) alebo kyselina vínna (tartát). Soli s bázami sú napríklad soli s alkalickými kovmi alebo kovmi alkalických zemín, amónne soli, soli s organickými amínmi, ako sú primárne, sekundárne alebo terciárne amíny a kvartérne amóniové soli.
Derivátmi sú napríklad estery L-PPT, ktoré sú esterifikované na skupine kyseliny fosfínovej, napríklad sú esterifikované alkanoly s 1 až 12 uhlíkovými atómami, ako je metanol, etanol, n-propanol, i-propanol, n-butanol, i-butanol, se/r-butanol alebo ferc-butanol a cykloalkanoly s 3 až 6 uhlíkovými atómami, ako je cyklohexanol. Derivátmi sú tiež estery L-PPTm, ktoré sú alternatívne alebo prídavné esterifikované na skupine karboxylovej kyseliny, napríklad už vyššie uvedenými alkoholmi. Derivátmi sú rovnako karbónamid LO-PPT a jeho deriváty, prípadne N-alkyl alebo Ν,Ν-dialkylamidy s výhodne 1 až 4 uhlíkovými atómami v alkylovej časti.
Derivátmi PPO sú napríklad jeho soli s anorganickými a/alebo organickými bázami, pričom na to vhodné bázy boli už uvedené v súvislosti s LPPT. Derivátmi sú napríklad tiež estery PPO, ktoré sú esterifikované na skupine karboxylovej kyseliny alebo kyseliny fosfínovej alebo na oboch. Ako alkoholy pre esterové skupiny sú formálne vhodné alkoholy, vhodné pre estery L-PPT, výhodne tam uvedené alkoholy. Derivátmi sú tiež karbónamid PPO a jeho deriváty, ktoré sú na skupine kyseliny fosfínovej esterifikované, ako i prípadne zodpovedajúce N-alkylamidy alebo Ν,Ν-dialkylamidy.
Aspartát označuje výhodne kyselinu L-asparágovú alebo jej soli, výhodne soli s alkalickými kovmi. Ako aspartát sa môže použiť tiež kyselina Lasparágová v zmesi s kyselinou D-asparágovou, napríklad ako racemické kyselina D,L-asparágová.
Alternatívne sa môže pri spôsobe podľa predloženého vynálezu prípadne prítomný pyruvát z reakčnej zmesi fyzikálne, chemicky a/alebo
31820/H enzymaticky odstraňovať, výhodne reakciou pomocou enzymatickej katalýzy, napríklad pomocou acetolaktát-syntázy (ALS), pyruvát-dekarboxylázy a pyruvát-oxidázy, obzvlášť acetolaktát-syntázy. Celkom obzvlášť výhodná je reakcia pyruvátu za prítomnosti relatívne termostabilného enzýmu. Takto používané enzýmy sa môžu prípadne vyskytovať v imobilizovanej forme.
Oba substráty (donor a akceptor) sa používajú napríklad v molárnom pomere 0,5 až 2 : 1 (vztiahnuté na kyselinu L-asparágovú : PPO), výhodne v pomere 0,75 až 1,5 : 1, obzvlášť asi ekvimolárne. Pri použití zmesí kyseliny La D-asparágovej (solí) je rozhodujúce množstvo kyseliny L-asparágovej (soli). PPO-deriváty sa používajú v molárnych množstvách, zodpovedajúcich PPO. Prítomnosť glutamátu v roztoku substrátov nie je nutná. Niektoré zo zistených enzýmov majú výbornú termostabilitu. Vedenie procesu je preto možné v širokom teplotnom rozmedzí, napríklad pri teplote v rozmedzí 10 °C až 95 °C, výhodne 40 °C až 90 °C a obzvlášť 60 °C až 85 °C. U enzýmov, ktoré nemajú zvláštnu termostabilitu, je výhodné teplotné rozmedzie 20 °C až 70 °C, obzvlášť 30 °C až 40 °C.
Relatívne vysokými teplotami sa dá rýchlosť reakcie výrazne urýchliť, čo umožňuje tiež reakciu koncentrovaných roztokov substrátov (10 %) s vysokými výťažkami za jednotku času na jednotku priestoru. Reakcia sa vykonáva výhodne pri hodnote pH v rozmedzí 6,5 až 10, výhodne 7 až 9 a obzvlášť 7,5 až 8,5 v zodpovedajúcom vhodnom pufrovacom systéme s hodnotou pKa v rozmedzí 7 až 9, okrem iného vo fosfátovom pufre alebo Tris-pufre. Prekvapujúco nemajú biochemický bližšie charakterizované enzýmy žiadnu špecifičnosť pre GABA a odlišujú sa tým zreteľne od doteraz známych LPPO/PPO-špecifických transamináz.
Obzvlášť vysoké hodnoty konverzie sa dajú dosiahnuť v reakcii, keď sa môže vylúčiť, prípadne minimalizovať vznik alanínu v priebehu transaminácie. Na tento účel sa môžu prípadne použiť optimalizované ASP-TA-varianty bez substrátovej špecifity pre pyruvát. Alternatívne sa môže pyruvát z reakčnej vsádzky odstraňovať fyzikálne, napríklad použitím selektívne permeabilných membrán a/alebo chemicky, pripadne enzymaticky, napríklad reakciou
31820/H s pyruvát-dekarboxylázou, pyruvát-oxidázou alebo acetolaktát-syntázou (pozri napríklad Taylora kol., TIBTECH (1998), vol. 16, 412 -418; Fotherigham a kol.,
CHIMICA OGGI/Chemistry Today (1997), 9/10, 33 - 38; WO 98/53088).
Čistenie produktu, L-PPT, z reakčného roztoku sa môže vykonávať prípadne pomocou známych a bežných postupov, napríklad extrakciou metylizobutylketónom alebo pomocou katiónmeničovej chromatografie, napríklad na Amberlite® IR 120 (výrobca Sigma).
Spôsob podľa predloženého vynálezu je bližšie objasnený pomocou nasledujúcich príkladov vyhotovenia a je definovaný v patentových nárokoch. Nasledujúce príklady však vynález nijako neobmedzujú.
Príklady uskutočnenia vynálezu
Príklad 1
Izolácia pôdnych mikroorganizmov s L-PPT-špecifickou aktivitou aspartáttransaminázy
Vždy 1 g rôznych pôdnych vzoriek (humus, íl, piesok/Schwanheimská duna, Frankfurt) sa extrahuje 10 ml 10 mM Na-fosfátového pufra, pH = 7,0 počas 1 hodiny pri teplote miestnosti. Z extraktu sa naočkujú obohacovacie kultúry v nasledujúcom médiu:
mM glukóza mM sukcinát mM glycerol mM PPO mM kyselina L-asparágová ml/I roztok A ml/l roztok B.
Roztok A: 50 g/l K2HPO4
Roztok B: 2,5 g/l MgSO4
0,5 g/l NaCl
31820/H ml/l základného roztoku obsahujúceho 1 g/l FeSO4 x 7 H2O 0,22 g/l MnSO4 x H2O 0,1 g/l H3BO3 0,1 g/l Na2MoO4 x 2 H2O 0,18 g/l ZnSO4 x 7 H2O 0,16 g/l CuSO4 x 5 H2O 0,1 g/l CoCI2 x 6 H2O 1 ml/l 1 N HCI.
Kultúry sa inkubujú na trepačke počas 3 až 5 dní pri 200 otáčkach za minútu. Z jednej z testovaných vzoriek pôdy (humus) sa dali obohatiť mikroorganizmy, ktoré mohli rásť s kyselinou L-asparágovou ako jediným zdrojom dusíka. Kultúra sa ďalej pasážovala niekoľkokrát v rovnakom médiu a potom sa kvôli izolácii jednotlivých klonov naočkovala na agarové médium rovnakého zloženia. Po inkubácii počas 3 až 5 dní pri teplote 28 °C sa izolovalo celkovo 100 jednotlivých kolónií a opäť sa naočkovali do kvapalného média (pozri vyššie). Zaočkovanie na agarové platne sa ešte dvakrát opakovalo, aby sa zaistilo získanie čistých kultúr.
Po tomto selekčnom cykle bolo prítomných 20 jednotlivých kmeňov, ktoré mohli rásť s kyselinou L-asparágovou ako jediným zdrojom dusíka.
Kvôli testovaniu na aktivitu PPO/Asp-transaminázy sa odoberú vždy 2 ml kultúry kmeňa uvedenej vyššie. Potom sa vždy 400 μΙ kultúry permeabilizuje 0,5 % toluénu a 0,5 % etylalkoholu počas 30 minút pri teplote 37 °C. Bunkové pelety sa resuspendujú vždy v 50 μΙ reakčnej zmesi, pozostávajúcej z 50 mM PPO, 50 mM kyseliny L-asparágovej, 50 mM Tris/HCI, pH = 8,0 a 10 μΜ pyridoxalfosfátu a inkubujú sa cez noc pri teplote 28 °C.
Kvôli kvantitatívnemu stanoveniu vytvoreného PPT sa supernatant zriedi vodou 1 : 5 a z toho sa analyzuje vždy 5 μΙ pomocou chromatografie na tenkej vrstve na doštičkách HPTLC - celulózy (Merck) zmesou n-butanol : ľadová kyselina octová : voda = 60 : 15 : 25 ako pohyblivou fázou. Aminokyseliny sa
31820/H zviditeľnia farbením ninhydrínom. U štyroch kmeňov (DSM 13353, DSM 13354, DSM 13355, DSM 13356; všetky kmene sa uložili v zbierke DSM („Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH,,)) možno preukázať tvorbu fosfinotricínu. Čistota enantiomérov reakčného produktu sa skúšala pomocou chirálnej HPLC (deliacim stĺpcom Chirex® (D) s penicillamínom ako matricou (výrobca Phenomenex)) (pohyblivá fáza: 2 mM CuSO4, 10 % metylalkohol, tok: 0,5 ml/min., UV-detekcia: 254 nm, retenčné časy: L-PPT: asi 17 min, D-PPT: asi 21 min). Vo všetkých štyroch testovaných vzorkách sa mohol dokázať L-PPT a žiaden D-PPT ako reakčný produkt.
Kvôli výrobe L-PPT biotransformáciou, ako i kvantitatívnej analýze priebehu reakcie sa kultivuje 1 I kultúr kmeňov pôdnych baktérií DSM 13354, DSM 13355 a DSM 13356 v médiu, opísanom vyššie, počas 48 hodín pri teplote 28 °C. Bunky sa získajú odstredením, premyjú sa 1 x 10 mM NaCl, 10 mM Na-fosfátu, pH = 7,5 a potom sa cez noc lyofilizujú.
Kvôli vykonaniu biotransformácie sa 200 mg suchej hmoty buniek vyššie uvedených kmeňov pôdnych baktérií resuspenduje v 10 ml nasledujúceho roztoku substrátu:
100 mM PPO
200 mM kyselina L-asparágová
100 mM Tris/HCI, pH = 8,0 mM pyridoxalfosfát.
Vsádzky sa inkubujú na inkubačnej trepačke pri 200 otáčkach za minútu pri teplote 37 °C. Po 1, 2, 4, 6, 24 a 30 hodinách sa odoberie vždy 200 μΙ vzoriek a analyzuje sa pomocou HPLC, ako je opísané vyššie. Získané výsledky pre L-PPT a kyselinu L-asparágovú sú zhrnuté v tabuľke 1. Maximálna dosiahnutá hodnota konverzie (produkovaný L-PPT/PPO v substráte x 100) je okolo asi 59 % (DSM 13355).
31820/H
Tabuľka 1 - Priebeh reakcie PPO/aspartát-transaminácia biotransformáciou s izolátmi z pôdy
| Kmeň | Reakčný čas (h)* | L-PPT (mM) | Kys. asparágová (mM) |
| DSM 13354 | 1 | 3,9 | 174,0 |
| 2 | 5,7 | 150,0 | |
| 4 | 10,3 | 100,0 | |
| 8 | 23,8 | 30,3 | |
| 24 | 38,3 | 0 | |
| 30 | 48,4 | 0 | |
| DSM 13355 | 1 | 4,5 | 143,1 |
| 2 | 7,7 | 122,7 | |
| 4 | 11,1 | 98,8 | |
| 8 | 24,8 | 76,4 | |
| 24 | 44,9 | 17,2 | |
| 30 | 59,1 | 9,8 | |
| DSM 13356 | 1 | 5,7 | 138,1 |
| 2 | 8,4 | 124,4 | |
| 4 | 12,5 | 95,9 | |
| 8 | 27,5 | 58,8 | |
| 24 | 51,3 | 14,3 | |
| 30 | 49,6 | 7,2 |
* Reakčná teplota: 37 °C
Príklad 2
Dôkaz priamej PPO/aspartát-transaminácie s enzýmovými preparátmi transaminázy
Testuje sa celkovo 7 rôznych komerčne dostupných transamináz na PPO/aspartát-transamináciu. Z mikroorganizmov pochádzajúcej (termostabilnej) transaminázy AMN-001-01, -001-02, -001-03, -001-04 a -00131820/H obsahujú v Aminotransferase-Testkit Diversa CAT# AMN-001 (1998); glutamát-oxalacetát-transaminázu (GOT) a glutamát-pyruvát-transaminázu (GPT) (Sigma). Enzýmové preparáty sa rozpustili pri koncentrácii proteínu 5 mg/ml v 50 mM Tris/HCI pufre, pH = 8,0 a potom sa dialyzovali cez noc pri teplote 4 °C proti rovnakému pufru. Tým by sa mali odstrániť v enzýmových preparátoch prípadne prítomné donory a akceptory amínov, ktoré by mohli fungovať ako medziprenášače pri transaminácii. Enzýmové roztoky sa potom upravia na koncentráciu 1 mg/ml a v 50 μΙ vsádzky sa inkubujú s reakčným pufrom, pozostávajúcim z 50 mM PPO, 50 mM kyseliny L-asparágovej, 50 mM Tris/HCI, pH = 8,0 a 10 μΜ pyridoxalfosfátu počas 1 hodinu pri teplotách optimálnych pre daný enzým.
Enzýmový test sa analyzoval pomocou chromatografie na tenkej vrstve a chirálnej HPLC, ako je opísané v príklade 1. U dvoch termostabilných enzýmov, AMN-001-03 a AMN-001-04 (reakčná teplota: 80 °C) možno dokázať enantioselektívnu tvorbu L-PPT transamináciou z kyseliny L-asparágovej. Všetky ostatné testované enzýmy nevykazujú žiadnu reaktivitu.
Príklad 3
Kvantitatívna skúška PPO/aspartát-transaminácie s termostabilnou transaminázou AMN-001-03
Na základe vyššej špecifickej aktivity sa zvolila pre presnejšiu charakterizáciu reakcie L-PPT-syntézy transamináza AMN-001-03. 1 ml roztoku substrátu, pozostávajúceho zo 40 mM PPO, 48 mM kyseliny L-asparágovej, 50 mM Tris/HCI, pH = 8,0 a 0,1 mM pyridoxalfosfátu sa inkubuje s 1 mg transaminázy AMN-001-03 pri teplote 80 °C. Kvôli analýze priebehu reakcie sa v časovom období 24 hodín odoberie vždy 50 μΙ alikvótu a zmrazí sa pri teplote -20 °C. PPT a aspartát sa stanovujú v analyzátore aminokyselín (Biotronic LC 5001). Výsledky sú uvedené v tabuľke 2. Za zvolených podmienok sa dosiahne reakčná rovnováha syntézy L-PPT po 2 až 4 hodinách. Použitý aminodonor kyselina L-asparágová sa úplne spotrebuje po 7 hodinách. Dosiahne sa
31820/H hodnota konverzie (produkovaný L-PPT/PPO v substráte x 100) asi 75 %.
Tabuľka 2 - Priebeh reakcie PPO/aspartát-transaminácia s transaminázou AMN-001-03
| Reakčný čas (h)* | L-PPT (mM) | Aspartát (mM) |
| 0 | 0 | 53,4 |
| 1 | 9,5 | 47,8 |
| 2 | 20,8 | 33,8 |
| 4 | 25,7 | 12,5 |
| 7 | 29,7 | 0 |
| 24 | 28,1 | 0,4 |
* reakčná teplota: 80 °C
Príklad 4
Enzymatické chirálna syntéza L-PPT z PPO a aspartátu s parciálne vyčistenou termostabilnou transaminázou AMN-001-02
Pre pokusy syntézy sa použije parciálne vyčistená transamináza AMN001-03 so špecifickou aktivitou 107 nkat/mg proteínu (1 nkat = 1 nmol aspartát/s). Reakčný roztok s objemom 1 ml obsahuje 552 mM PPO (10 %), 700 mM kyseliny L-asparágovej, 0,1 mM pyridoxalfosfátu, pH = 8,0, nastavené pomocou KHCO3 a 11,5 mg enzýmu. Vsádzka sa inkubuje pri teplote 80 °C. Odoberanie vzoriek a analytika sa vykonáva rovnako ako je opísané v príklade
3.
Získané výsledky sú uvedené v tabuľke 3. V tomto pokuse sa dosiahla reakčná rovnováha už po 1 hodine. Aminodonor kyselina L-asparágová sa prakticky spotrebovala po 4 hodinách. Hodnota konverzie je asi 52 % a výťažok za jednotku času na jednotku priestoru je 4,5 (g L-PPT/g biokatalyzátor/h). V paralelnom pokuse s rovnakým roztokom substrátu a koncentráciou enzýmu, ale pri reakčnej teplote 60 °C, sa dosiahne podobná hodnota konverzie, avšak
31820/H pri podstatne zníženej reakčnej rýchlosti. Výťažok za jednotku času na jednotku priestoru je len 0,95 (g L-PPT/g biokatalyzátor/h). Tieto výsledky dokladajú veľký význam vysokej tepelnej stability transaminázy pre hodnoty konverzie a efektívne vedenie reakcie.
Priemerné hodnoty konverzie 52 % sú prevažne spôsobené tvorbou vedľajšieho produktu alanínu transamináciou pyruvátu. Podstatne vyššie hodnoty konverzie sa dajú dosiahnuť, keď sa vznik alanínu v priebehu reakcie vylúči.
Tabuľka 3 - Výroba L-PPT transamináciou s parciálne vyčistenou termostabilnou transaminázou AMN-001-03
| Reakčný čas (h)* | L-PPT (mM) | Aspartát (mM) | Alanín (mM) |
| 0 | 0 | 700,0 | 0 |
| 0,5 | 155,3 | 405,8 | 0 |
| 1 | 286,4 | 193,1 | 98,7 |
| 2 | 288,5 | 15,2 | 181,5 |
| 4 | 284,0 | 1,9 | 284,1 |
| 8 | 251,9 | 1,3 | 234,5 |
31820/H
Claims (13)
1. Spôsob výroby kyseliny L-2-amino-4-(hydroxymetylfosfinyl)-maslovej (L-fosfinotricín, L-PPT) vzorca I:
C O-OH h3cOH
CH2—CH2—C K nh2 (i) a jej derivátov, zvolených zo skupiny zahrňujúcej estery a amidy karboxylovej kyseliny a estery kyseliny fosfínovej, a/alebo ich solí, z kyseliny 4(hydroxymetylfosfinyl)-2-oxo-maslovej (HMPB, PPO) vzorca II
H3C—
P—CH2—CH2—C C—OH
OH (II) a jej derivátov zvolených zo skupiny zahrňujúcej estery a amidy karboxylovej kyseliny a estery kyseliny fosfínovej a/alebo ich solí ako akceptora enzymatickou transamináciou za prítomnosti aspartátu ako donoru, pričom transaminácia sa uskutočňuje za prítomnosti jednej alebo viacerých akceptoršpecifických aspartát-transamináz (Asp-TA) na oxalacetát a zlúčeninu vzorca I, jej deriváty a/alebo soli.
2. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že sa reakcia aspartátu ako donoru a zlúčeniny vzorca II, ich derivátov zvolených zo skupiny zahrňujúcej estery a amidy karboxylovej kyseliny a estery kyseliny fosfínovej a/alebo ich solí, ako akceptora, uskutočňuje za prítomnosti jednej alebo viacerých termostabilných akceptor-špecifických aspartát-transamináz.
3. Spôsob podľa jedného alebo viacerých z nárokov 1 až 2, vyznačujúci sa tým, že akceptor-špecifické aspartát-transaminázy majú nepatrnú substrátovú špecifičnosť pre pyruvát, takže je pokiaľ možno potlačená tvorba
31820/H vedľajšieho produktu alanínu.
4. Spôsob podľa jedného alebo viacerých z nárokov 1 až 3, vyznačujúci sa tým, že sa prítomný pyruvát z reakčnej zmesi fyzikálne, chemicky a/alebo enzymaticky odstraňuje.
5. Spôsob podľa nároku 4, vyznačujúci sa tým, že sa reakcia pyruvátu uskutočňuje za prítomnosti jednej alebo viacerých acetolaktát-syntáz (ALS) na acetolaktát.
6. Spôsob podľa nároku 4, vyznačujúci sa tým, že sa reakcia pyruvátu uskutočňuje za prítomnosti pyruvát-dekarboxylázy na acetaldehyd.
7. Spôsob podľa nároku 4, vyznačujúci sa tým, že sa reakcia pyruvátu uskutočňuje za prítomnosti pyruvát-oxidázy na acetylfosfát.
8. Spôsob podľa jedného alebo viacerých z nárokov 5 až 7, vyznačujúci sa tým, že sa reakcia pyruvátu uskutočňuje za prítomnosti termostabilného enzýmu.
9. Spôsob podľa jedného alebo viacerých z nárokov 1 až 8, vyznačujúci sa tým, že sa použije jedna alebo viacero transamináz v imobilizovanej forme.
10. Mikroorganizmus s číslom uloženia DSM 13353.
11. Mikroorganizmus s číslom uloženia DSM 13354.
12. Mikroorganizmus s číslom uloženia DSM 13355.
13. Mikroorganizmus s číslom uloženia DSM 13356.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19919848A DE19919848A1 (de) | 1999-04-30 | 1999-04-30 | Verfahren zur Herstellung von L-Phosphinothricin durch enzymatische Transaminierung mit Aspartat |
| PCT/EP2000/002809 WO2000066760A1 (de) | 1999-04-30 | 2000-03-30 | Verfahren zur herstellung von l-phosphinothricin durch enzymatische transaminierung mit aspartat |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| SK15622001A3 true SK15622001A3 (sk) | 2002-06-04 |
| SK286456B6 SK286456B6 (sk) | 2008-10-07 |
Family
ID=7906505
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SK1562-2001A SK286456B6 (sk) | 1999-04-30 | 2000-03-30 | Spôsob výroby L-fosfinotricínu enzymatickou transamináciou s aspartátom |
Country Status (22)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6936444B1 (sk) |
| EP (1) | EP1177310B1 (sk) |
| JP (1) | JP2003528572A (sk) |
| KR (1) | KR100810169B1 (sk) |
| CN (1) | CN1284858C (sk) |
| AT (1) | ATE287965T1 (sk) |
| AU (1) | AU768315B2 (sk) |
| BR (1) | BR0010199A (sk) |
| CA (1) | CA2370109C (sk) |
| CZ (1) | CZ20013901A3 (sk) |
| DE (2) | DE19919848A1 (sk) |
| DK (1) | DK1177310T3 (sk) |
| ES (1) | ES2235865T3 (sk) |
| HU (1) | HU228395B1 (sk) |
| IL (2) | IL145925A0 (sk) |
| MX (1) | MXPA01011016A (sk) |
| NZ (1) | NZ515088A (sk) |
| PL (1) | PL202575B1 (sk) |
| RU (1) | RU2275428C2 (sk) |
| SK (1) | SK286456B6 (sk) |
| UA (1) | UA75331C2 (sk) |
| WO (1) | WO2000066760A1 (sk) |
Families Citing this family (22)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1864989B1 (en) | 2005-03-29 | 2012-07-18 | Meiji Seika Pharma Co., Ltd. | Method for producing l-2-amino-4-(hydroxymethylphosphinyl)- butanoic acid |
| EP1818411A1 (en) * | 2006-02-13 | 2007-08-15 | Lonza AG | Process for the preparation of optically active chiral amines |
| CN101395271B (zh) * | 2006-03-02 | 2013-02-27 | 明治制果株式会社 | 天冬氨酸转氨酶基因和l-膦丝菌素的制备方法 |
| TWI412533B (zh) | 2006-09-04 | 2013-10-21 | Meiji Seika Pharma Co Ltd | 光學活性胺基氧膦基丁酸類之製造方法 |
| TWI397380B (zh) | 2006-09-20 | 2013-06-01 | Meiji Seika Kaisha | 含磷之α胺基酸之製造方法及其製造中間體 |
| US8017797B2 (en) | 2007-03-23 | 2011-09-13 | Meiji Seika Kaisha Ltd. | Method for producing phosphorus-containing α-keto acid |
| DK3354727T3 (da) | 2009-01-08 | 2020-11-16 | Codexis Inc | Transaminasepolypeptider |
| EP2401366B1 (en) | 2009-02-26 | 2013-12-18 | Codexis, Inc. | Transaminase biocatalysts |
| WO2011005477A1 (en) | 2009-06-22 | 2011-01-13 | Codexis, Inc. | Transaminase reactions |
| CA2796158C (en) | 2010-04-14 | 2022-06-14 | Strategic Enzyme Applications, Inc. | Process for producing phosphinothricin employing nitrilases |
| US8852900B2 (en) | 2010-06-17 | 2014-10-07 | Codexis, Inc. | Biocatalysts and methods for the synthesis of (S)-3-(1-aminoethyl)-phenol |
| WO2012024104A2 (en) | 2010-08-16 | 2012-02-23 | Codexis, Inc. | Biocatalysts and methods for the synthesis of (1r,2r)-2-(3,4-dimethoxyphenethoxy)cyclohexanamine |
| CN105603015B (zh) * | 2016-01-22 | 2018-12-11 | 浙江大学 | 一种l-草铵膦的生产方法 |
| EP3423585A1 (en) | 2016-03-02 | 2019-01-09 | Agrimetis, LLC | Methods for making l-glufosinate |
| CN106916857B (zh) * | 2017-03-09 | 2019-08-27 | 浙江大学 | 一种生产l-草铵膦的方法 |
| CN107119084B (zh) * | 2017-03-23 | 2019-12-17 | 浙江大学 | 一种利用转氨酶和乙烯合成酶生产l-草铵膦的方法 |
| CN110343676B (zh) | 2018-04-03 | 2020-06-23 | 上海弈柯莱生物医药科技有限公司 | 一种l-谷氨酸脱氢酶突变体及其应用 |
| US20210214754A1 (en) | 2018-09-05 | 2021-07-15 | Basf Se | Methods for improving yields of l-glufosinate |
| CN109369711A (zh) * | 2018-10-26 | 2019-02-22 | 洪湖市泰科技有限公司 | 一种l-草胺膦关键中间体的合成新方法 |
| CN111019916B (zh) | 2018-11-23 | 2020-12-08 | 弈柯莱生物科技(上海)股份有限公司 | 一种d-氨基酸氧化酶突变体及其应用 |
| CN111979208B (zh) | 2019-05-23 | 2023-01-10 | 弈柯莱生物科技(上海)股份有限公司 | 一种l-谷氨酸脱氢酶突变体及其应用 |
| CN112725298B (zh) | 2020-12-31 | 2022-12-06 | 浙江工业大学 | 一种机器学习基因挖掘方法及氨基转位用草铵膦脱氢酶突变体 |
Family Cites Families (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE2717440C2 (de) | 1976-05-17 | 1984-04-05 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | Unkrautbekämpfung mit [(3-Amino-3-carboxy)-propyl-1]-methylphosphinsäure-Derivaten |
| US4265654A (en) | 1977-12-28 | 1981-05-05 | Meiji Seika Kaisha Ltd. | Herbicidal compositions |
| HU193902B (en) * | 1983-09-01 | 1987-12-28 | Genetics Inst | Process for preparing l-amino acids by means of transamination |
| US4826766A (en) | 1985-09-23 | 1989-05-02 | Genetics Institute, Inc. | Production of amino acids using coupled aminotransferases |
| DE3786707D1 (de) * | 1986-06-04 | 1993-09-02 | Hoechst Ag | Verfahren zur herstellung von l-phosphinothricin durch transaminierung. |
| AU599985B2 (en) * | 1986-06-09 | 1990-08-02 | Meiji Seika Kaisha Ltd. | New process for the production of L-2-amino-4- (hydroxymethyl-phosphinyl)-butyric acid |
| DE3818851A1 (de) | 1988-06-03 | 1989-12-14 | Hoechst Ag | Neue transaminase, ihre herstellung und ihre verwendung |
| EP0349965A3 (en) * | 1988-07-04 | 1990-06-13 | Meiji Seika Kaisha Ltd. | Novel genes encoding transaminase |
| DE3932015A1 (de) | 1988-12-15 | 1991-04-04 | Hoechst Ag | Gen und genstruktur, codierend fuer eine aminotransferase, mikroorganismen, die dieses gen exprimieren, und transaminierungsverfahren unter verwendung des expressionsprodukts |
| DE4030578A1 (de) * | 1990-09-27 | 1992-04-16 | Hoechst Ag | Verfahren zur herstellung von l-phosphinothricin durch eine gekoppelte enzymatische reaktion |
| US5962283A (en) | 1995-12-07 | 1999-10-05 | Diversa Corporation | Transminases and amnotransferases |
| US6197558B1 (en) * | 1997-05-19 | 2001-03-06 | Nsc Technologies | Transaminase biotransformation process |
-
1999
- 1999-04-30 DE DE19919848A patent/DE19919848A1/de not_active Withdrawn
-
2000
- 2000-03-30 BR BR0010199-0A patent/BR0010199A/pt not_active Application Discontinuation
- 2000-03-30 DE DE50009364T patent/DE50009364D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2000-03-30 EP EP00926778A patent/EP1177310B1/de not_active Expired - Lifetime
- 2000-03-30 UA UA2001118183A patent/UA75331C2/uk unknown
- 2000-03-30 HU HU0200948A patent/HU228395B1/hu unknown
- 2000-03-30 WO PCT/EP2000/002809 patent/WO2000066760A1/de active IP Right Grant
- 2000-03-30 KR KR1020017013902A patent/KR100810169B1/ko not_active IP Right Cessation
- 2000-03-30 ES ES00926778T patent/ES2235865T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2000-03-30 IL IL14592500A patent/IL145925A0/xx active IP Right Grant
- 2000-03-30 SK SK1562-2001A patent/SK286456B6/sk not_active IP Right Cessation
- 2000-03-30 NZ NZ515088A patent/NZ515088A/xx unknown
- 2000-03-30 PL PL353460A patent/PL202575B1/pl not_active IP Right Cessation
- 2000-03-30 AU AU45408/00A patent/AU768315B2/en not_active Ceased
- 2000-03-30 RU RU2001132581/13A patent/RU2275428C2/ru active
- 2000-03-30 CZ CZ20013901A patent/CZ20013901A3/cs unknown
- 2000-03-30 DK DK00926778T patent/DK1177310T3/da active
- 2000-03-30 JP JP2000615782A patent/JP2003528572A/ja active Pending
- 2000-03-30 MX MXPA01011016A patent/MXPA01011016A/es active IP Right Grant
- 2000-03-30 CA CA002370109A patent/CA2370109C/en not_active Expired - Fee Related
- 2000-03-30 CN CNB008069735A patent/CN1284858C/zh not_active Expired - Lifetime
- 2000-03-30 AT AT00926778T patent/ATE287965T1/de not_active IP Right Cessation
- 2000-06-30 US US10/018,331 patent/US6936444B1/en not_active Expired - Lifetime
-
2001
- 2001-10-14 IL IL145925A patent/IL145925A/en not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ATE287965T1 (de) | 2005-02-15 |
| KR100810169B1 (ko) | 2008-03-06 |
| HU228395B1 (en) | 2013-03-28 |
| IL145925A (en) | 2007-05-15 |
| HUP0200948A3 (en) | 2010-01-28 |
| CZ20013901A3 (cs) | 2002-02-13 |
| HUP0200948A2 (hu) | 2002-07-29 |
| CN1349561A (zh) | 2002-05-15 |
| DE19919848A1 (de) | 2000-11-02 |
| ES2235865T3 (es) | 2005-07-16 |
| EP1177310B1 (de) | 2005-01-26 |
| CN1284858C (zh) | 2006-11-15 |
| MXPA01011016A (es) | 2002-05-06 |
| US6936444B1 (en) | 2005-08-30 |
| JP2003528572A (ja) | 2003-09-30 |
| EP1177310A1 (de) | 2002-02-06 |
| AU768315B2 (en) | 2003-12-11 |
| PL202575B1 (pl) | 2009-07-31 |
| UA75331C2 (en) | 2006-04-17 |
| PL353460A1 (en) | 2003-11-17 |
| RU2275428C2 (ru) | 2006-04-27 |
| CA2370109C (en) | 2009-07-07 |
| WO2000066760A1 (de) | 2000-11-09 |
| BR0010199A (pt) | 2002-01-08 |
| AU4540800A (en) | 2000-11-17 |
| IL145925A0 (en) | 2002-07-25 |
| SK286456B6 (sk) | 2008-10-07 |
| KR20010112473A (ko) | 2001-12-20 |
| DK1177310T3 (da) | 2005-04-11 |
| CA2370109A1 (en) | 2000-11-09 |
| NZ515088A (en) | 2003-06-30 |
| DE50009364D1 (de) | 2005-03-03 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| SK15622001A3 (sk) | Spôsob výroby L-fosfinotricínu enzymatickou transamináciou s aspartátom | |
| AU2007294090B2 (en) | Process for preparation of optically active N-protected 3 -aminopyrrolidine or optically active N-protected 3-aminopiperidine and the corresponding ketones by optical resolution of the racemic amine mixtures employing a bacterial omega-transaminase | |
| US5962281A (en) | Process for preparing L-tertiary-leucine and L-phosphinothricine by transamination | |
| Kamphuis et al. | New developments in the chemo-enzymatic production of amino acids | |
| IL94694A (en) | Enantiomeric enrichment and straoselective synthesis of chiral amines | |
| US5981239A (en) | Synthesis of optically active phenylalanine analogs using Rhodotorula graminis | |
| US5516660A (en) | Microorganisms, their use and method of producing L-α-amino acids | |
| UA64784C2 (en) | Improvements in enzymatic synthesis of chiral amines | |
| US5714355A (en) | Microorganism, use thereof and process for the production of L-α-amino acids | |
| JPH0785718B2 (ja) | Ｄ−アミノ酸の製造方法 | |
| US5108914A (en) | Process for the synthesis of l-alpha-amino acids | |
| US4745059A (en) | Process for the preparation of L-phenylalanine | |
| Sudge et al. | Production of D-hydantoinase by halophilic Pseudomonas sp. NCIM 5109 | |
| Walker et al. | Biosynthetic preparation of L-[13C]-and [15N] glutamate by Brevibacterium flavum | |
| JP2505466B2 (ja) | Ｄ−セリンの製造法 | |
| WO2024201519A1 (en) | A process for preparation of l-glufosinate or salts thereof | |
| JPS62205781A (ja) | シユ−ドモナス属菌株の培養方法 | |
| JPH02124087A (ja) | シユードモナス属細菌の培養方法 | |
| JP2001314197A (ja) | 光学活性なヒドロキシアルキル−α−アミノカルボン酸の製造方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of maintenance fees |
Effective date: 20100330 |