KR100810169B1 - 아스파르테이트를 사용하여 효소적 아미노기 전달반응에의해 엘-포스피노트리신을 제조하는 방법 - Google Patents

아스파르테이트를 사용하여 효소적 아미노기 전달반응에의해 엘-포스피노트리신을 제조하는 방법 Download PDF

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    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids

Abstract

본 발명은 아미노기 공여체로서 아스파르테이트를 사용하여 상응하는 케토산 PPO로부터 아미노기 전달반응에 의해 L-포스피노트리신을 효소적으로 키랄 합성하는 방법에 관한 것이다. 거의 등몰량의 아미노기 공여체 및 아미노기 수용체를 사용하여 적합한 반응 공학에 의해 정량적인 전환을 수득할 수 있고, 이때 공여체 아미노산인 아스파르테이트는 완전히 소모된다. 열 안정성의 트랜스아미나제를 사용하면, 높은 반응 속도를 가능하게 하고, 따라서 높은 공간/시간 효율을 얻을 수 있다.

Description

아스파르테이트를 사용하여 효소적 아미노기 전달반응에 의해 엘-포스피노트리신을 제조하는 방법{METHOD FOR PRODUCING L-PHOSPHINOTHRICINE BY ENZYMATIC TRANSAMINATION WITH ASPARTATE}
본 발명은 농작물 보호제의 합성, 특히 아스파르테이트 및 4-(하이드록시메틸포스피닐)-2-옥소부티르산(HMPB, PPO)-특이적 아스파르테이트 트랜스아미나제(Asp-TA)의 존재하에 효소적 아미노기 전달반응에 의해 PPO로부터 L-2-아미노-4-(하이드록시메틸포스피닐)부티르산(L-포스피노트리신, L-PPT)을 합성하는 기술적 분야에 관한 것이다.
화합물 L-PPT, 그의 염 및 이들의 몇 가지 유도체는 제초제 반응성 비-단백질계 아미노산 또는 이들의 염 및 유도체이다(독일 특허원 제 DE-A-2 717 440 호). 각각의 경우 D형이 실질적으로 불활성인 반면에, 각각의 경우 L-형은 생물학적으로 활성이다(독일 특허원 제 DE-A-2 856 260 호).
트랜스아미나제는, 특히 이들의 상응하는 케토산 전구체로부터의 아미노산의 효소적 키랄 합성에 대한 입체선택성(stereoselectivity)이 높고 기질 특이성이 비교적 높기 때문에 특히 적합한 것으로 개시된 바 있다. 그러나, 트랜스아미나제를 산업적으로 이용하는데 있어서 하나의 단점은 평형상수가 약 1이므로 목적하는 생성물이 일반적으로 단지 50%의 수율로 수득될 수 있다는 것이다(미국 특허 제 4,826,766 호). 유럽 특허원 제 EP-A-0 344 683 호 및 미국 특허 제 5,221,737 호에는 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)로부터의 4-아미노-부티레이트:2-케토글루타레이트 트랜스아미나제(GABA 트랜스아미나제, EC 2.6.1.19)를 사용하여 상응하는 케토산[(2-옥소-4-(하이드록시)(메틸)포스피노일)부티르산, PPO]으로부터 아미노기 전달반응에 의해 비-단백질계 아미노산인 제초제 L-포스피노트리신[L-호모알라닌-4-일(메틸)포스핀산, L-2-아미노-4-(하이드록시메틸포스피닐)부티르산, L-PPT)]의 제조 방법이 기재되어 있다. 정량적 전환을 위해서는 아미노기 공여체인 글루타메이트가 과몰량 필요로 하므로, 반응 생성물의 정제가 어려워진다.
이러한 문제를 해결하는 한가지 방법은 아미노기 공여체로서 아스파르테이트를 사용하는 것인데, 이는 상응하는 케토산 옥살로아세테이트가 수성 매질에서 불안정하여 자발적으로 피루베이트로 탈카복실화되기 때문이다. 평형상태에서 하나의 반응 생성물이 제거됨에 따라 역반응이 불가능해므로, 케토산 및 공여체 아미노산을 동일한 몰량으로 사용하여도 정량적 전환이 가능해진다. 이러한 유형의 방법은, 예를 들어 유럽 특허원 제 EP-A-0 135 846 호에 기재되어 있다.
그러나, 전술한 GABA 트랜스아미나제는 아미노기 공여체로서의 아스파르테이트를 수용하지 않거나, L-포스피노트리신 및 공지의 아스파르테이트에 대한 연결 부위 특이성을 갖는 임의의 다른 트랜스아미나제도 아니기 때문에, 상기 원리를 L-포스피노트리신의 효소적 합성에 적용하는 것이 최근까지 불가능하였다.
여러 가지 중 하나에 있어서, PPT-특이적 트랜스아미나제 및 글루타메이트:옥살로아세테이트 트랜스아미나제(GOT, EC 2.6.1.1)로 구성된 커플링된 2개의 효소계가 제안되었다(유럽 특허원 제 EP-A-0 249 188 호 및 제 EP-A-0 477 902 호). 이 반응 절차에서는, L-PPT의 합성에 사용되는 글루타메이트가 GOT에 의해 아스파르테이트로부터 재생된다. 아스파르테이트 트랜스아미나제는 그 자체로서 L-PPT/PPO에 대한 특이성을 갖지 않는다. 옥살로아세테이트가 자발적으로 피루베이트로 전환되면, 전체 반응 동안 L-PPT 합성의 방향으로 평형이 이동된다. 이 경우, 등몰량 이하의 글루타메이트와 함께, 등몰의 PPO 및 아스파르테이트를 사용함으로써 생성물을 정량적 수율로 수득할 수 있다.
이러한 커플링된 효소 방법을 사용하는 경우, 기질 용액 중에 존재하는 과투여량의 공여체 아미노산이 수용체 케토산 PPO와 비교하여 뚜렷하게 감소하므로, 생성물 용액의 후처리가 단순화될 수 있다. 그러나, 이러한 커플링된 반응 절차에서는 글루타메이트를 사용하는 것이 여전히 요구되는데, 이는 케토글루타레이트와의 평형상태에서 반응 생성물 중에 잔류하거나 구조적으로 매우 유사한 아미노산 L-PPT로부터 정교한 정제 방법에 의해 제거되어야 한다. 또한, 반응 절차의 최적화는 상이한 동력학적 파라미터로 인해 1개의 효소를 사용하는 경우보다 2개의 효소를 사용하는 경우 보다 어렵다.
이미 개시된 아스파르테이트 트랜스아미나제(예를 들어, GOT)는 PPO를 전환시키지 않는 반면, 놀랍게도 기질로서 높은 특이성을 갖고 L-PPT/PPO 또한 수용하는 미생물로부터의 아스파르테이트 트랜스아미나제가 발견되었다. 이러한 효소는 아스파르테이트의 α-아미노기의 PPO로의 직접적인 전달을 촉진시킨다.
따라서, 본 발명은,
공여체로서 아스파르테이트 및 하나 이상의 수용체-특이적, 바람직하게는 PPO-특이적 아스파르테이트 트랜스아미나제(Asp-TA)의 존재하에, 바람직하게는 하나 이상의 열에 안정하고/하거나 단리된 아스파르테이트 트랜스아미나제, 매우 특히 바람직하게는 피루베이트에 대한 최소 기질 특이성을 갖는 하나 이상의 아스파르테이트 트랜스아미나제의 존재하에, 부산물인 알라닌의 형성을 감소시키거나 실질적으로 피할 수 있도록 효소적 아미노기 전달반응을 수행하여, 옥살로아세테이트, 및 하기 화학식 I의 L-2-아미노-4-(하이드록시메틸포스피닐)부티르산 (L-포스피노트리신, L-PPT), 그의 유도체 및/또는 염을 생성하는,
수용체로서 하기 화학식 II의 4-(하이드록시메틸포스피닐)-2-옥소부티르산(HMPB, PPO), 그의 유도체 및/또는 염으로부터 상기 화학식 I의 화합물, 그의 유도체 및/또는 염을 제조하는 방법에 관한 것이다:
Figure 112001028076660-pct00001
Figure 112001028076660-pct00002
L-PPT의 염은 무기산 및/또는 유기산과의 염, 또는 무기 염기 및/또는 유기 염기와의 일염 및 이염이 일반적이다. 산과의 염(산 부가 염)으로는 무기산 염(예를 들면, 염화수소산(염산염) 또는 황산(황산염)), 또는 탄산(탄산염 및 수소탄산염) 또는 유기산 염(예를 들면, 아세테이트(아세테이트), 포름산(포름산염), 프로피온산(프로피온산염) 또는 타르타르산(타르타르산염))이 있다. 염기와의 염으로는, 예를 들어 알칼리 금속 및 알칼리 토 금속 염, 암모늄염, 유기 아민(예를 들면, 1급, 2급 또는 3급 아민) 염 및 4급 암모늄염이 있다.
유도체는, 예를 들어 포스핀산기에서 에스테르화된 L-PPT의 에스테르(예를 들어, 메탄올, 에탄올, n-프로판올, i-프로판올, n-부탄올, i-부탄올, 2급-부탄올 및 3급-부탄올과 같은 C1-C12-알칸올, 및 사이클로헥산올과 같은 C3-C6-사이클로알칸올로 에스테르화됨)이다. 또한, 유도체는 카복실산기에서 선택적 또는 추가적으로 에스테르화된 L-PPT의 에스테르(예를 들어 상기 언급된 알콜로 에스테르화됨)이다. 또한, 유도체는 L-PPT의 카복스아미도 및 그의 유도체, 경우에 따라 바람직하게는 알킬 잔기 중의 탄소수가 1 내지 4인 N-알킬 또는 N,N-디알킬아미드이다.
PPO의 유도체는, 예를 들어 무기 염기 및/또는 유기 염기와의 염이고, 이에 적합한 염기는 L-PPT와 관련하여 전술한 바와 같다. 또한, 유도체는, 예를 들어 카복실산기, 포스핀산기 또는 둘 모두에서 에스테르화된 PPO의 에스테르이다. 에스테르기에 적합한 알콜은 공식적으로 L-PPT, 바람직하게는 상기 언급된 알칸올의 에스테르에 적합한 알콜이다. 또한, 유도체는 PPO의 카복스아미드, 및 포스핀산기에서 에스테르화된 그의 유도체, 및 경우에 따라 상응하는 N-알킬 또는 N,N-디알킬아미드이다.
아스파르테이트는 L-아스파르트산 또는 그의 염, 바람직하게는 알칼리 금속 염을 나타낸다. 그러나, 아스파르테이트로서 L-아스파르트산과 D-아스파르트산의 혼합물(예를 들어 D, L-아스파르트산 라세미체)을 사용할 수도 있다.
본 발명의 방법 중에서 하나의 가능성은, 반응 혼합물 중에 존재하는 피루베이트를, 경우에 따라 물리적, 화학적 및/또는 효소적인 수단, 바람직하게는 효소적 촉매반응에 의한 전환(예를 들어, 아세토락테이트 신타제(ALS), 피루베이트 데카복실라제, 피루베이트 옥시다제, 특히 아세토락테이트 신타제), 매우 특히 바람직하게는 비교적 열에 안정한 효소의 존재하에 수행되는 피루베이트의 전환을 통해 제거하는 것이다. 따라서, 사용된 효소는 경우에 따라 고정화 형태일 수 있다.
두 기질(공여체 및 수용체)은, 예를 들어 몰비 0.5 내지 2:1(L-아스파르트산: PPO를 기준), 바람직하게는 0.75 내지 1.5:1, 특히 대략 등몰로 사용된다. L- 및 D-아스파르트산(염)의 혼합물을 사용하는 경우, L-아스파르트산(염)의 몰량이 중요하다. PPO 유도체는 PPO와 등가의 몰량으로 사용되어야 한다. 기질 용액 중 글루타메이트가 반드시 존재할 필요는 없다. 몇몇 효소는 우수한 열 안정성을 나타내는 것으로 밝혀졌다. 그러므로 상기 방법은 넓은 온도 범위, 예를 들어 10 내지 95℃, 바람직하게는 40 내지 90℃, 특히 60 내지 85℃의 온도에서 수행될 수 있다. 특별한 열 안정성을 나타내지 않는 효소의 바람직한 온도 범위는 20 내지 70℃, 특히 30 내지 40℃이다.
비교적 고온에서 반응 속도를 상당히 높일 수 있고 더욱 농축된 기질 용액(10% 농도)을 높은 공간/시간 수율로 전환시킬 수 있다. 상기 반응은 바람직하게는 pKa 7 내지 9의 범위를 갖는 거의 적합한 완충계, 특히 인산염 또는 트리스 완충액 중에서 pH 6.5 내지 10, 바람직하게는 pH 7 내지 9, 특히 7.5 내지 8.5의 범위에서 수행된다. 놀랍게도, 앞서 상세히 전술한 바와 같은 생화학적 특징을 갖는 상기 효소는 GABA에 대한 특이성을 갖지 않으므로, 이미 개시된 L-PPT/PPO-특이적 트랜스아미나제와는 명백하게 상이하다.
아미노기 전달반응 동안 알라닌이 형성되지 않거나 최소화되는 경우 특히 높은 반응 전환율이 달성될 수 있다. 경우에 따라 상기 목적을 위해 피루베이트에 대한 기질 특이성을 갖지 않는 최적화된 Asp-TA 변형체를 사용할 수 있다. 사용가능한 방법중 하나로서, 물리적으로, 예를 들어 선택적 투과성 막을 사용하고/하거나 화학적 또는 효소적으로, 예를 들어 피루베이트 데카복실라제, 피루베이트 옥시다제 또는 아세토락테이트 신타제를 사용한 전환에 의해 피루베이트를 반응 혼합물로부터 제거할 수 있다(예를 들면, [Taylor et al., TIBTECH, vol. 16, 412-418, 1998]; [Fotheringham et al., CHIMICA OGGI/chemistry today, 9/10, 33-38, 1997]; 및 국제특허 공개공보 제 WO 98/53088 호 참조).
반응 용액으로부터 생성물 L-PPT의 정제는 공지되고 통상적인 방법, 예를 들어 메틸 이소부틸 케톤으로 추출하거나 양이온 교환 크로마토그래피(예를 들어, 앰버라이트(Amberlite, 등록상표) IR 120(시그마(Sigma)사 제품) 사용)에 의해 적절하게 수행될 수 있다.
본 발명의 방법을 하기 실시예에서 추가로 설명하고, 청구의 범위에서 본 발명을 정의한다. 하기 실시예는 제한의 의미로 이해되어서는 안된다.
(1) L-PPT-특이적 아스파르테이트 트랜스아미나제 활성을 갖는 토양 미생물의 단리:
각각의 다양한 토양 시료(부식토, 양토, 사토/슈반하이머 뒤네, 프랑크푸르트) 1g을 10mM 인산 나트륨 완충액(pH 7.0) 10ml로 실온에서 1 시간 동안 추출하였다. 추출물로부터 하기 배지에서의 강화 배양에 접종하였다:
5mM 글루코스
5mM 숙시네이트
10mM 글리세롤
10mM PPO
10mM L-아스파르트산
50 ml/l 용액 A
25 ml/l 용액 B
용액 A K2HPO4 50 g/l
용액 B MgSO4 2.5 g/l
NaCl 0.5 g/l
원액 25 ml/l FeSO4 x 7H2O 1 g/l
MnSO4 x H2O 0.22 g/l
H3BO3 0.1 g/l
Na2MoO4 x 2H20 0.1 g/l
ZnSO4 x 7H2O 0.18 g/l
CuSO4 x 5H2O 0.16 g/l
CoCl2 x 6H2O 0.1 g/l
1N HCl 1 ml/l
상기 배양균을 28℃에서 진탕기에서 200 rpm으로 3 내지 5일 동안 배양하였다. 유일한 질소원으로서 L-아스파르트산으로 성장 가능한 미생물의 강화 배양은 시험을 거친 토양 시료중의 하나(부식토)로부터 가능하였다. 배양균을 동일한 배지에서 수회 추가로 접종한 다음, 단일 클론을 단리하기 위해 동일한 조성의 아가 배지 상에 도포하였다. 28℃에서 3 내지 5일 동안 항온처리한 후, 총 100 개의 단일 콜로니(colony)를 단리하고 다시 액체 배지에 접종하였다(상기 참조). 순수 배양액을 수득하기 위해 아가 플레이트(plate)에서의 단리를 2회 이상 반복하였다. 이러한 선택 주기 이후, 유일한 질소원으로서 L-아스파르트산으로 성장 가능한 20 개의 개별적인 균주를 수득하였다.
PPO/Asp 트랜스아미나제 활성을 시험하기 위해서, 균주 각각의 배양액 2ml을 전술한 바와 같이 성장시켰다. 각각의 배양액 400㎕를 37℃에서 30분 동안 톨루엔 0.5%, 에탄올 0.5%에 침투시켰다. 50mM PPO, 50mM L-아스파르트산, 50mM 트리스/HCl(pH 8.0) 및 10μM 피리독살 포스페이트로 구성된 반응 혼합물 50㎕ 중에 세포 펠렛을 각각 재현탁시키고 28℃에서 밤새 항온처리하였다.
생성된 PPT를 정량하기 위해서, 반응 상청액을 물 중에 1:5로 희석시키고 이중 50㎕를 이동상으로서 n-부탄올:빙초산:물(60:15:25)을 사용한 셀룰로스 HPTLC 플레이트(머크(Merck)사 제품)상의 박층 크로마토그래피로 분석하였다. 닌히드린 염색으로 아미노산을 시각화하였다. 포스피노트리신의 형성을 4개의 균주(DSM 13353, DSM 13354, DSM 13355 및 DSM 13356; 이들 균주는 모두 "도이체 잠룽 폰 미크로오르가니즈멘 운트 첼쿨투렌 게엠베하(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH)에 기탁되었다)에서 검출할 수 있었다. 반응 생성물의 에난티오머(enantiomer)성 순도는 키랄 HPLC[매트릭스(페노메넥스 (Phenomenex)사 제품)로서 페니실아민을 갖는 분리 칼럼 키렉스(등록상표, Chirex)(D)로 조사됨](이동상: 2mM CuSO4, 10% 메탄올, 유속: 0.5 ml/분, 자외선 검출: 254nm, 체류 시간: L-PPT: 약 17분, D-PPT: 약 21분)로 측정하였다. 이로써, 4개의 모든 시험 시료에서, 반응 생성물로서 L-PPT는 검출할 수 있고 D-PPT는 검출할 수 없었다.
생체내 변환에 의해 L-PPT를 제조하고 반응 과정을 정량 분석하기 위해, 토양 세균성 균주 DSM 13354, DSM 13355 및 DSM 13356의 각각 11개 배양균을 28℃에서 48 시간 동안 상기 표에 기재된 배지 중에서 성장시켰다. 원심 분리시켜 세포를 수거하고, pH 7.5의 10mM 염화나트륨 및 10mM 인산나트륨으로 1회 세척한 다음, 밤새 동결 건조시켰다.
생체내 변환을 수행하기 위해, 상기 확인된 토양 세균성 균주 각각의 건조 생체량 200mg을 하기 기질 용액 10ml 중에 현탁시켰다:
100mM PPO
200mM L-아스파르트산
100 mM 트리스/HCl, pH 8.0
1 mM 피리독살 포스페이트

상기 혼합물을 항온 진탕기에서 200rpm 및 37℃로 배양시켰다. 1, 2, 4, 8, 24 및 30 시간 후에 시료를 200㎕씩 채취하여 전술한 바와 같이 HPLC로 분석하였다. L-PPT 및 L-아스파르트산에 대하여 측정된 결과를 하기 표 1에 요약한다. 달성된 최대 전환율[기질 x 100 중의 생성된 L-PPT/PPO]은 약 59%이었다(DSM 13355):
토양 단리물을 사용하여 생체내 변환에 의한 PPO/아스파르테이트 아미노기 전달반응의 과정
균주 반응 시간 [h]* L-PPT [mM] 아스파르트산 [mM]
DSM 13354 1 3.9 174.0
2 5.7 150.0
4 10.3 100.0
8 23.8 30.3
24 38.3 0
30 48.4 0
DSM 13355 1 4.5 143.1
2 7.7 122.7
4 11.1 98.8
8 24.8 76.4
24 44.9 17.2
30 59.1 9.8
DSM 13356 1 5.7 138.1
2 8.4 124.4
4 12.5 95.9
8 27.5 58.8
24 51.3 14.3
30 49.6 7.2
*: 반응 온도: 37℃

(2) 트랜스아미나제 효소 제제를 사용한 직접 PPO/아스파르테이트 아미노기 전달반응의 검출:
총 7종의 시판중인 트랜스아미나제에 대하여 PPO/아스파르테이트 아미노기 전달반응을 시험하였다. 상기 트랜스아미나제(아미노트랜스퍼라제 시험용 키트(Diversa CAT# AMN-001, 1998) 내에 포함된 열에 안정한 트랜스아미나제 AMN-001-01, -001-02, -001-03, -001-04 및 -001-05; 글루타메이트-옥살아세테이트 트랜스아미나제(GOT, 시그마(Sigma)사 제품) 및 글루타메이트-피루베이트 트랜스아미나제(GPT, 시그마(Sigma)사 제품)는 미생물로부터 유래한다. 효소 제제를 pH 8.0의 50mM 트리스/HCl 완충액 중에 단백질 농도 5 mg/ml로 용해시킨 후, 4℃에서 밤새 동일한 완충액으로 투석시켰다. 이는 효소 제제 중에 존재하여 아미노기 전달반응 중에 중간 담체로서 작용할 수 있는 아미노기 공여체 및 수용체의 제거하기 위함이다. 이어서, 효소 용액을 1 mg/ml로 조정하고, 50mM PPO, 50mM L-아스파르트산, 50mM 트리스/HCl(pH 8.0) 및 10μM 피리독살 포스페이트로 구성된 반응 완충액을 갖는 혼합물 50㎕로 특정 효소에 대한 최적 온도에서 1 시간 동안 항온처리하였다.
실시예 1에 기재된 바와 같이 박층 크로마토그래피 및 키랄 HPLC로 효소 시험을 분석하였다. L-아스파르트산으로부터 아미노기 전달반응에 의해 L-PPT의 에난티오머의 선택적 형성을 열에 안정한 2개의 효소, 즉 AMN-001-03 및 AMN-001-04에서 검출할 수 있었다(반응 온도: 80℃). 시험된 다른 효소는 모두 어떠한 반응성도 나타내지 않았다.
(3) 열에 안정한 트랜스아미나제 AMN-001-03을 사용한 PPO/아스파르테이트 아미노기 전달반응의 정량적 연구:
L-PPT 합성 반응의 보다 정확한 특징화를 위해 특이적 활성이 비교적 높은 트랜스아미나제 AMN-001-03을 선택하였다. 40mM PPO, 48mM L-아스파르트산, 50mM 트리스/HCl(pH 8.0) 및 0.1mM 피리독살 포스페이트로 구성된 기질 용액 1ml을 80℃에서 AMN-001-03 트랜스아미나제 1mg으로 항온처리하였다. 반응 과정을 분석하기 위해, 분취량 50㎕를 24 시간 후에 취하여 -20℃에서 동결시켰다. PPT 및 아스파르테이트를 아미노산 분석기(바이오트로닉(Biotronic) LC 5001)로 측정하였다. 결과를 하기 표 2 중에 나타냈다. 선택된 조건하에서, L-PPT 합성 반응은 2 내지 4 시간 후 평형 상태에 도달하였다. 사용된 아미노기 공여체인 L-아스파르트산은 7 시간 후 완전히 소모되었다. 약 75%의 전환율(기질 중의 생성된 L-PPT/PPO x 100)을 달성하였다.
트랜스아미나제 AMN-001-03을 사용한 PPO/아스파르테이트 아미노기 전달반응의 과정
반응 시간 [h]* L-PPT [mM] 아스파르트산염 [mM]
0 0 53.4
1 9.5 47.8
2 20.8 33.8
4 25.7 12.5
7 29.7 0
24 28.1 0.4
*: 반응 온도: 80℃

(4) 부분 정제된 열에 안정한 트랜스아미나제 AMN-001-03을 사용하여 PPO 및 아스파르테이트로부터 L-PPT를 효소적 키랄 합성하는 방법:
특이성 활성을 갖는 부분 정제된 트랜스아미나제 AMN-001-03을 단백질 mg당 107 nkat(1 nkat= 아스파르테이트 1 nmol/초)의 양으로 합성 실험에 사용하였다. 552mM PPO(10%), 700mM L-아스파르트산 및 0.1mM 피리독살 포스페이트(pH 8.0)를 포함한 부피 1ml의 반응 용액을 KHCO3 및 효소 11.5mg으로 조정하였다. 이 혼합물을 80℃에서 항온처리하였다.
시료채취 및 분석은 실시예 3에서 기재된 바와 같이 하였다.
하기 표 3에 결과를 기재한다. 이 실험에서, 단지 1 시간후에 반응의 평형 상태에 도달하였다. 아미노 공여체인 L-아스파르트산은 4 시간 후 거의 완전히 소모되었다. 전환율은 약 52%이고, 공간/시간 수율은 4.5[L-PPT g/생체촉매 g/h]이었다. 기질 용액 및 효소 농도가 동일하나 반응 온도가 60℃인 유사한 실험에서, 반응 속도는 뚜렷하게 감소되었지만 유사한 전환율이 수득되었다. 공간/시간 수율은 단지 0.95[L-PPT g/생체촉매 g/h]이었다. 이는 전환율 및 효율적인 반응 절차를 위해 트랜스아미나제의 높은 열 안정성이 매우 중요함을 입증하는 결과이다.
단지 52%의 중간 정도의 전환율은 피루베이트의 아미노기 전달반응에 의해 부산물인 알라닌을 형성하는 데에 주로 기인한다. 반응하는 동안에 알라닌의 형성이 방지된다면 상당히 높은 전환율이 수득될 수 있다.
부분 정제된 열에 안정한 트랜스아미나제 AMN-001-03을 사용한 아미노기 전달반응에 의한 L-PPT의 제조
반응 시간 [h]* L-PPT [mM] 아스파르트산염 [mM] 알라닌 [mM]
0 0 700.0 0
0.5 155.3 405.8 0
1 286.4 193.1 98.7
2 288.5 15.2 181.5
4 284.0 1.9 284.1
8 251.9 1.3 234.5
*: 반응 온도: 80℃

Claims (13)

  1. 공여체로서 아스파르테이트 및 하나 이상의 열에 안정한 수용체-특이적 아스파르테이트 트랜스아미나제(Asp-TA)의 존재하에 효소적 아미노기 전달반응을 수행하여 옥살로아세테이트 및 하기 화학식 I의 L-2-아미노-4-(하이드록시메틸포스피닐)부티르산 (L-포스피노트리신, L-PPT) 및/또는 그의 염을 수득함을 포함하는,
    수용체로서 하기 화학식 II의 4-(하이드록시메틸포스피닐)-2-옥소부티르산(HMPB, PPO) 및/또는 그의 염으로부터 상기 화학식 I의 화합물 및/또는 그의 염을 제조하는 방법:
    화학식 I
    Figure 112007036639536-pct00003
    화학식 II
    Figure 112007036639536-pct00004
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제 1 항에 있어서,
    선택적 투과성 막의 사용, 또는 피루베이트 데카복실라제, 피루베이트 옥시다제 또는 아세토락테이트 신타제를 사용한 전환에 의해 반응 혼합물로부터 존재하는 피루베이트를 제거함을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 4 항에 있어서,
    하나 이상의 아세토락테이트 신타제(ALS)의 존재하에 피루베이트의 전환을 수행하여 아세토락테이트를 생성함을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 4 항에 있어서,
    피루베이트 데카복실라제의 존재하에 피루베이트의 전환을 수행하여 아세트알데하이드를 생성함을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 4 항에 있어서,
    피루베이트 옥시다제의 존재하에 피루베이트의 전환을 수행하여 아세틸 포스페이트를 생성함을 특징으로 하는 방법.
  8. 삭제
  9. 제 1 항에 있어서,
    하나 이상의 열에 안정한 수용체-특이적 아스파르테이트 트랜스아미나제가 고정화 형태임을 특징으로 하는 방법.
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 삭제
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