SK280218B6 - Spôsob enantiomérneho obohacovania a stereoselektí - Google Patents

Description

Oblasť techniky

Vynález sa týka spôsobu obohacovania zmesi dvoch enantiomémych chirálnych amínov jedným z týchto enantiomérov a tiež spôsobu stereoselektívnej syntézy chirálnych amínov.

Doterajší stav techniky

Nositeľom biologickej aktivity chemických zlúčenín, ako sú farmaceutické produkty a produkty aplikovateľné v poľnohospodárstve, ktoré obsahujú centrum chirality, je často prevažne jedna z možných chirálnych foriem. Vzhľadom na to, že väčšina chemických syntéz nie je v svojej podstate stereoselektívna, spôsobuje tento jav vážny problém z hľadiska chemickej výroby. V niektorom stupni výroby, buď až po získaní výsledných chirálnych zlúčenín alebo po pripravení ich chemických prekurzorov s rovnakým centrom chirality je potrebné vykonávať obohatenie produktu v prospech jednej chirálnej formy. Nech už sa zvolí na obohacovanie ktorýkoľvek stupeň reakcie, je tento postup svojou vlastnou podstatou obmedzený tým, že sa pri ňom môže dosiahnuť maximálny teoretický výťažok 50 % požadovaného enantioméru (pokiaľ nie je k dispozícii spôsob recyklovania nežiaduceho enantioméru).

Veľa z chirálnych zlúčenín tohto typu sú amíny. Okrem toho, vzhľadom na všestrannosť ich reakcií sú dobrými kandidátmi na štepenie na enantioméry, po ktorom je možné vykonať stereoselektívnu konverziu na chirálne zlúčeniny. Chemická výroba chirálnych amínov neobsahujúcich druhý enantiomér sa až dosiaľ spoliehala najmä na štiepenie zmesi dvoch chirálnych foriem prostredníctvom vytvorenia diasteromerických derivátov, ako sú soli s chirálnou kyselinou, stereoselektívne syntetické postupy a použitie chirálnych chromatografických kolón (pozri napríklad US patent č. 3 944 608 a EP A 36 265).

Niektoré štruktúrne typy amínov je možné štiepiť na enantioméry enzymaticky. Sú dobre známe enzymatické reakcie zahŕňajúce α-aminokyseliny a ich použitie bolo navrhnuté pre stereošpecifické preparácie. Tak napríklad v US patente č. 3 871 958 je opísaná enzymatická príprava derivátov α-aminokyseliny serínu kopuláciou aldehydu s glycinom v prítomnosti treonínaldolázy odvodenej od druhu E. coli a príbuzná syntéza seronilu pri použití etanolamínu.

Pomerne málo bolo publikované o enzymatických reakciách aminokyselín, pri ktorých aminoskupina nie je vo vicinálnej polohe k skupine karboxylovej kyseliny. Yonaha a ďalšie Agric. Biol. Chem. 42, (12), 2363 - 2367 (1978) opisujú omega-aminokyselina: pyruvát transaminázu z druhu Pseudomonas, pre ktorú je pyruvát výlučným aminoakceptorom. Tento enzým, ktorý bol nedávno pred tým vyrobený v kryštalickej forme a charakterizovaný (pozri Yonaha a ďalšie, Agric. Biol. Chem., 41 (9), 1701 - 1706 (1977)), mal nízku substrátovú špecifickosť pre omega-aminokyseliny, ako je hypotaurín, 3-aminopropánsulfonát, R-alanin, 4-aminobutyrát a 8-aminooktanoát a katalyzoval transaminácie medzi primárnymi aminoalkánmi a pyruvátom.

Nakano a ďalšie, J. Biochem., 81 1375 - 1381 (1977) identifikovali dve omega-aminokyselinové transaminázy v

B. cereus: B-alanín transaminázu, ktorá zodpovedá Yonahovej omega-aminokyselina pyruvát transamináze a -aminobutyrát transaminázu. Tieto dve transaminázy je možné rozlíšiť na základe výrazne odlišnej aktivity' proti B

-alanínu (100 : 3) -aminobutyrátu (43 : 100) a na základe ich odlišných požiadaviek na aminoakceptory.

Burnett a ďalšie, J. C. S. Chem. Comm., 1979, 826-828, uviedli, že omega-aminokyselina:pyruvát transamináza a -aminobutyrát tramsamináza majú odlišné preferencie proti dvom terminálnym atómom vodíka v trítiom značenom -aminobutyráte.

Tanizawa a ďalšie, Biochem. 21, 1104 - 1108 (1982) skúmali bakteriálny L-lyzín-e-aminotransferázu a L-omitín-b-aminotransferázu a uviedli, že aj keď sú obidva tieto enzýmy špecifické pre L-aminokyseliny, pôsobia distálne a s rovnakou stereošpecifickosťou ako -aminobutyrát transamináza študovaná Bumettom a ďalšími.

Yonaha a ďalšie, Agric. Biol. Chem., 47 (10), 2257-2265 (10g83) dodatočne charakterizovali omega-aminokyselina: pyruvát transaminázu a -aminobutyrát transaminázu (EC 2.6.1.18 a EC 2.6.1.19) a dokumentovali ich distribúciu v rôznych organizmoch.

Waters a ďalšie, FEMS Micro. Lett., 34 (1986) 279-282, v správe o úplnom katabolizme p-alanínu a B-aminoizo- butyrátu pôsobením P. aeruginosa, uviedli, že prvý stupeň zahŕňa transamináciu B-alanín:pyruvát aminotransferázou.

Enzymatické metódy sú až dosiaľ považované za metódy na delenie zmesí chirálnych amínov, ktoré nie sú aminokyselinami, ako napríklad 2-aminobutanolu. Väčšina z týchto metód zahŕňa derivatizáciu, najmä aminoskupiny a využitie tejto chránenej skupiny alebo inej skupiny v molekule na vlastnú separáciu. Tak napríklad v EP-A 222 561 je opísaný postup, pri ktorom sa racemický 2-aminobutanol premení na N-karbamoylderivát, ktorý sa potom uvedie do styku s alkylalkanoátom v prítomnosti enzýmu lipázy. Esterifikácia voľnej hydroxyskupiny je zrejme obmedzená na S-enantiomér H-karbamoylderivátu, ktorý sa potom hydrolyzuje. Tento postup je samozrejme obmedzený na amíny, nesúce esterifikovateľnú hydroxyskupinu a okrem toho špecificky vyžaduje predchádzajúce chránenie aminoskupiny vytvorením karbamoylskupiny (-NH-CO-) kvôli dosiahnutiu stereošpecifickosti pri enzymatickej reakcii.

EP-A 239 122 opisuje podobný postup aplikovateľný na širšiu triedu 2-amino-l-alkanolov.

Japonská publikácia Kokai JP 55-138 389 opisuje prípravu viciálnych aminoalkoholov tak, že sa na alkyl-alebo aralkyl substituovaný etylénimín pôsobí mikroorganizmami rodu Bacillus, Proteus, Erwinia alebo Klebsiella.

Japonská patentová publikácia Kokai JP 58-198 296 uvádza postup, pri ktorom sa d, 1 N-acyl-2-aminobutanol podrobí pôsobeniu aminoacylázy odvodenej od rôznych druhov Aspergillus, Penicillium a Streptomyces, ktorá hydrolyzuje len d-N-acyl-2-aminobutanol.

Japonská patentová publikácia Kokai 59-39 294 opisuje spôsob štiepenia racemického 2-aminobutanolu tak, že sa táto látka premení na N-acetylderivát, na ktorý sa pôsobí Micrococcus acylázou za vzniku 1-2-aminobutanolu a d-N-acetyl-2-aminobutanolu, pričom d-N-acetyl-2-aminobutanol sa chemicky hydrolyzuje na d-2-aminobutanol.

Japonská patentová publikácia Kokai JP 63-237 796 opisuje spôsob, pri ktorom sa R,S-l-metyl-3-fcnylpropylamín spracováva za aeróbných podmienok kultiváciou špecifických mikroorganizmov. Pritom sa prednostne metabolizuje S-forma. Najvyššie výťažky a optická čistota sa dosahuje pri použití kvasiniek druhu Candida humicola a Trichosporon melibiosaceum. Neuvádza sa tu enzymatická povaha metabolizmu S-formy, ku ktorej dochádza v týchto aeróbných kultúrach, napríklad oxidáza, dehydrogenáza, amoniak lyzáza a pod.

V abstrakte japonskej patentovej publikácie Kokai JP 63-273486 je zverejnená mikrobiálna syntéza l-(4-metoxyfenyl)-2-aminopropánu s R-konfiguráciou na jednom z dvoch chirálnych center z l-(4-metoxyfenyl)-2-propánu pri použití Sarcina Zutea.

Podstata vynálezu

V najširšom zmysle zahŕňa vynález použitie omegaaminokyselina transaminázy v prítomnosti aminoakceptoru na enantiomerické obohacovanie zmesi chirálnych amínov o jeden z enantiomérov alebo na stereoselektívnu syntézu chirálnych amínov, v ktorých je aminoskupina viazaná k neterminálnemu chirálne substituovanému atómu uhlíka. Vynález je teda založený na objave, že omegaaminokyselina transaminázy pôsobí stereoselektívne na aminoskupiny, ktoré nie sú v polohe omega a že toto pôsobenie je možné použiť jednak na obohacovanie zmesi chirálnych amínov jedným enantiomérom a tiež na stereoselektívnu syntézu chirálneho amínu v len jednej konfigurácii.

Pod pojmom omega-aminokyselina transaminázy sa rozumejú akékoľvek enzýmy, ktoré sú schopné premieňať terminálnu skupinu vzorca -CH₂-NH₂ omega-aminokyseliny na skupinu vzorca -CH=O.

Enzymatickú rovnovážnu reakciu, ktorá sa využíva pri spôsobu podľa vynálezu, je možné znázorniť takto:

NHg omega-aninokyselina O | amino transamináza II

R^X-CH- R² + akceptor -----------------—> R¹-c- r² + amino kde každý zo symbolov

R¹ a R² jednotlivo predstavuje alkyl- alebo arylskupinu, prípadne substituovanú jednou alebo viacerými enzymaticky neinhibujúcimi skupinami a R¹ sa líši od R² buď štruktúrou alebo chiralitou alebo

R'a R² dohromady predstavujú uhľovodíkový reťazec s 4 alebo viacerými atómami uhlíka obsahujúci centrum chirality.

Pod výrazom aminoakceptor sa v tomto opise rozumejú rôzne karbonylové zlúčeniny podrobnejšie charakterizované ďalej, ktoré sú schopné prijať aminoskupinu zo znázorneného amínu pôsobením omega-aminokyselina transaminázy. Pod označením aminodonor sa rozumejú rôzne aminozlúčeniny podrobnejšie charakterizované ďalej, ktoré sú schopné poskytnúť aminoskupinu znázornenému ketónu, čím sa z nich stanú karbonylové zlúčeniny, rovnako pôsobením rovnakej omega-aminokyselina transaminázy.

Enzymatickú reakcia, už znázornená, je charakteristická predovšetkým tým, že omega-aminokyselina transamináza pôsobí na primárny amín, v ktorom aminoskupina nie je v terminálnej (omega) polohe. Po druhé, transamináza pôsobí na amín, ktorý- nemusí byť aminokyselinou. Po tretie, amínový produkt spotrebovaný pri enzymatickej transformácii nie je nezvratné metabolizovaný, aleje možné ho stereoselektivne opäť premeniť na východiskový amín s jednotnou chiralitou.

Podľa prvého rozpracovania sa spôsob podľa vynálezu týka enantiomerického obohacovania zmesi chirálnych amínov všeobecného vzorca (IA) a (IB) nh₂ NH₂

R¹*·!*»?² a R²t»Č-«R¹

H H <IA) (IB) kde R¹ a R² majú uvedený význam, pôsobení omega-aminokyselina transaminázy v prítomnosti aminoakceptoru. Ako je zrejmé, sú zlúčeniny všeobecného vzorca (IA) a (IB) enantioméry (alebo diastereoméry, pokiaľ buď R¹ alebo R² obsahuje druhé chirálne centrum) a sú chirálne v dôsledku toho, že R¹ sa líši v štruktúre alebo chiralite od R².

Podľa druhého rozpracovania sa spôsob podľa vynálezu týka spôsobu stereoselektívnej syntézy jednej chirálnej formy amínu všeobecného vzorca (IA) alebo (IB) v množstve podstatne prevyšujúcom množstvo druhej chirálnej formy, pri ktorom sa ketón všeobecného vzorca (11), í (m

R¹ - C - R² kde R¹ a R² majú uvedený význam, podrobí pôsobeniu omega-aminokyselina transaminázy v prítomnosti aminodonora.

Obidve tieto rozpracovania sú založené na objave, že omega-aminokyselina transamináza sa v svojom pôsobení neobmedzuje na omega-aminoskupiny a okrem toho je značne alebo výlučne stereoselektívna pokiaľ sa týka amínov, ktoré patria do definovanej triedy, a premieňa iba jednu chirálnu formu amínu na zodpovedajúci ketón, ktorý· už nie je chirálny (prinajmenšom s ohľadom na karbonylový atóm uhlíka) a potom tento ketón premieňa na iba jedinú chirálnu formu amínu.

Pod pojmom enantiomerické obohacovanie sa tu rozumie zvyšovanie množstva jedného enantioméru vzhľadom na množstvo druhého enantioméru. Pri enantiomerickom obohacovaní môže dochádzať 1) k poklesu množstva jednej chirálnej formy v porovnaní s druhou, 2) k zvýšeniu množstva jednej chirálnej formy v porovnaní s druhou 3) k poklesu množstva jednej chirálnej formy a k zvýšeniu množstva druhej chirálnej formy. Účelným pojmom na vyjadrenie enantiomerického obohatenia je pojem nadbytku enantioméru (ee), ktorý je definovaný rovnicou ee = --------- x 100

E¹ + E² kde

E¹ predstavuje množstvo prvej chirálnej formy amínu a E² predstavuje množstvo druhej chirálnej formy rovnakého amínu.

Keď je teda počiatočný pomer obidvoch chirálnych foriem 50 : 50 a dosiahne sa enantiomerické obohatenie poskytujúce výsledný pomer 50 : 30, je hodnota nadbytku enantioméru ee vzhľadom na prvú chirálnu formu 25 %, zatiaľ čo keď sa dosiahne výsledný pomer enantioméru 70 : : 30, je hodnota ee vzhľadom na prvú chirálnu formu 40 %. Pri použití spôsobu podľa tohto vynálezu sa obyčajne môžu dosiahnuť hodnoty ee 90 % alebo vyššie.

Pod výrazom podstatne vyšší, ako sa používa v tomto opise v súvislosti s vyjadrením množstva jednej chirálnej formy amínu vzhľadom na množstvo druhej chirálnej formy amínu pri stereoselektívnej syntéze tohto amínu, sa rozumie množstvo vyjadrené pomerom obidvoch chirálnych foriem aspoň asi 3 : 1, čo zodpovedá hodnote ee aspoň asi 50 %.

Chirálne amíny všeobecného vzorca (IA) a (IB) používané pri spôsoboch podľa vynálezu, majú niekoľko štruktúrnych obmedzení. Po prvé, aminoskupina v nich obsiahnutá je primárna, ale musí byť viazaná k sekundárnemu atómu uhlíka, tzn. k atómu uhlíka nesúcemu jeden atóm vodíka a dva substituenty, ktoré sú odlišné od vodíka (R¹ a R²). Po druhé, R¹ a R² sa síce volia zo štruktúr rovnakého typu, ale tieto skupiny musia dodávať molekule chiralitu, tzn. R¹ sa nutne musí líšiť od R² v štruktúre alebo chiralite alebo R¹ a R² musia dohromady predstavovať chirálnu skupinu. Pokiaľ sú R¹ a R² nezávislé skupiny, ide obyčajne o alkyl-, aralkyl alebo arylskupiny, prednostne alkylskupiny s priamym alebo rozvetveným reťazcom obsahujúcim 1 až 6 atómov uhlíka, fcnylalkylskupiny s priamym alebo rozvetveným reťazcom obsahujúcim 7 až 12 atómov uhlíka alebo o fenyl alebo naftylskupinu. Ako príklady týchto skupín je možné uviesť metyl-, etyl-, η-propyl-, izopropyl-, n-butyl-, izobutyl-, sek. butyl-, fenyl-, benzyl-, fenetyl-, 1-fenetyl-, 2-fenylpropylskupinu, a pod. Okrem toho, pretože enzymatické reakcie podľa vynálezu zasahujú znázornenú aminoskupinu a priľahlý atóm uhlíka, môže byť každá zo skupín R¹ a R² prípadne substituovaná jednou alebo viacerými skupinami, za predpokladu, že nejde o skupiny inhibujúce enzýmy, tzn. skupiny, ktoré by významnejšie ovplyvňovali účinok transaminázy alebo s nim súťažili, keď sa chirálne amíny alebo ketóny, ktoré tieto skupiny nesú, používajú v praktických koncentráciách. To sa môže ľahko určiť jednoduchou skúškou inhibície. Keď sa zistí inhibícia, môže sa často minimalizovať vykonávaním reakcie pri nízkych koncentráciách reakčného činidla. Ako typické substituenty, na ktoré sa však navrhované riešenie neobmedzuje, je možné uviesť halogény, ako je chlór, fluór, bróm a jód, hydroxy-, nižší alkyl-, nižší alkoxy-, nižší alkyltio-, cykloalkyl-, karbamoylskupina, mono- a di-(nižší alkyl)substituovaná karbamoylskupina, trifluómetyl-, fenyl-, nitro-, aminoskupina, a di-(nižší alkyl)substituovaná aminoskupina, alkylsulfonyl-, arylsulfonyl-, alkylkarboxamido-, arylkarboxamidoskupina a pod.

Ako typické skupiny vo význame R¹ a R² dohromady, je možné uviesť metylbután-l,4-diyl-, pentán- 1,4-diyl-, hexán-1,4-diyl-, hexán-l,5-diyl- a 2-metylpentán-l,5-diylskupinu.

Ako neobmedzujúce príklady typických amínov, ktoré sú vhodné na spôsob podľa vynálezu, je možné uviesť 2-aminobután, 2-amino-l-butanol, 1-amino-l-fenyletán, 1-amino-l-(2-metoxy-5-fluórfenyl)etán, 1-amino-l-fenylpropán, l-amino-l-(4-hydroxyfenyl)propán, l-amino-l-(4-brómfenyl)propán, l-amino-l-(4-nitrofenyl)propán, 1-fenyl-2-aminopropán, l-(3-trifluórmetylfenyl)-2-amino-propán, 2-aminopropanol, 1-amino-l-fenylbután, 1-fenyl-2-aminobután, 1 -(2,5-dimetoxy-4-metyl-fenyl)-2-aminobután, l-fenyl-3-aminobután, l-(4-hydroxyfenyl)-3-aminobután, 1 -amino-2-metylcyklopentán, l-amino-3-metylcyklopentán, l-amino-2-metylcyklohexán a 1-amino-1-(2-naftyl)-etán.

Spôsob podľa prvého rozpracovania vynálezu v najširšom zmysle zahŕňa postup, pri ktorom sa zmes chirálnych amínov podrobuje pôsobeniu omega-aminokyselina transaminázy, ktorá je enzymaticky aktívna (vzhľadom na zná zornenú aminoskupinu aspoň jedného z uvedených chirálnych amínov) v prítomnosti aminoakceptoru.

NKj KHj

H H (IA) (IB)

BQinO akceptor otnege-atuino kyselina transexlnéza

0	NH2
RX-C-R2 '	* R3ŕC4R4
	H
(II)	(III}

kde R¹ a R² majú definovaný význam a vo všeobecnom vzorci (III), R³ buď predstavuje R¹, zatiaľ čo R⁴ znamená R² alebo R³ predstavuje R², zatiaľ čo R⁴ znamená R¹.

Enzymatický proces obyčajne prebieha len pri jednej chirálnej forme alebo prebieha pri jednej chirálnej forme v oveľa väčšom rozsahu ako pri druhej. Tak napríklad v prípade R,S-l-amino-l-fenyletánu (R¹ = fenyl, R² = metyl), iba S-forma sa premieňa na zodpovedajúci nechirálny ketón, acetofenón, pričom R-1-amino-1-fenyletán zostáva nezmenený. Podobne pri R,S-1-amino-l-(4-brómfenyl)etánu (R¹ = 4-brómfenyl, R² = metyl), sa S-forma konvertuje na nechirálny ketón, 4-bróm-acetofenón, zatiaľ čo R-l-amino-l-(4-brómfenyl)etán zostáva nezmenený. Pri R,S-l-fenyl-3-aminobutánu (R¹ = fenetyl, R²- metyl), sa S-forma ľahko konvertuje na nechirálny l-fenylbután-3-on, zatiaľ čo R-forma l-fenyl-3-aminobutánu sa konvertuje na 1-fenylbután-3-on v rozsahu 0,05 násobnom alebo ešte nižšom vzhľadom na S-formu.

V niektorých prípadoch je možné prideliť chirálnym amínom R- a S-konfiguráciu a identifikovať, ktorý sa premení na ketón a ktorý nie. Označenie R- a S-konfigurácií sa však vykonáva podľa Cahn-Ingold-Prelogovej metódy a závisí od vopred pridelených hodnôt pre R¹ a R² podľa určenia postupnosti substituentov (sekvenčného pravidla). V dôsledku toho nie je vždy možné u chirálneho amínu, na ktorý enzým pôsobí, označiť a priori chiralitu pomocou konfigurácie R a S. Pridelenie R- a S-konfigurácie chirálnemu amínu všeobecného vzorca (III) bude teda síce závislé od nadradenosti substituentov R³ a R⁴ podľa pravidla postupnosti, ale konfigurácia chirálneho amínu všeobecného vzorca III bude totožná s jedným a len s jedným z enantiomérov (IA) a (IB). Tak napríklad, ako už bolo uvedené , S-forma 1-amino-1-fenyletánu sa premení na nechirálny ketón, acetofenón, pričom R-enantiomér zostane nezmenený. V prípade R,S-1-amino-l-fenyl-2-hydroxyetánu (fenylglycinolu) dôjde ku konverzii enantioméru s rovnakou absolútnou konfiguráciou, akú má 1-amino-l-fenyletán, ale v dôsledku použitia pravidla postupnosti substituentov, je tento izomér označený písmenom R.

S ohľadom na to, že reakcia je rovnovážna, môže postupovať obidvoma smermi. Povzbudenie reakcie v žiaducom smere je možné urobiť prídavkom ďalších východiskových látok alebo odstraňovaním reakčných produktov. Tak napríklad, keď sa má obohatiť zmes dvoch chirálnych foriem amínu o jeden z enantiomérov, môže sa pridávať ďalšie množstvo akceptoru amínu (až do nasýtenia) a/alebo sa môže vytvorený ketón kontinuálne odvádzať z reakčnej zmesi. Keď sa naproti tomu stereoselektívne syntetizuje jedna chirálna forma amínu, môže sa pridávať ďalší ketón (až do nasýtenia) a/alebo sa môže odstraňovať vytvorený amín.

Keď sa nežiaduca chirálna ťorma amínu konvertuje na ketón a požadovaná chirálna forma nie, môže sa požadovaná chirálna forma ľahko izolovať konvenčnými postupmi.

Čiastočnú separáciu je možné vykonať tak, že sa zmes okyslí, extrahuje uhľovodíkom, ako heptánom, aby sa od

SK 280218 Β6 stránil ketón, vodná fáza sa zalkalizuje a reextrahuje uhľovodíkom, ako je heptán.

Vedľajšie produkty, ktoré sa pritom izolujú sú často samotné cennými komoditami. Keď sa napríklad postup vykonáva tak, aby sa enantioméricky obohatila zmes R-2-aminobutánu a S-2-aminobutánu (R¹ = etyl, R² = metyl) o R-chirálnu formu, premení sa S-chirálna forma na metyletylketón, čo je samotné užitočné organické rozpúšťadlo.

Keď sú naproti tomu žiaduce obidve formy amínu, môže sa tá forma, ktorá sa premení na ketón, odstraňovať z reakčnej zmesi (alebo z vodnej fázy v dvojfázovej zmesi) a nezávisle podrobovať účinku omega-aminokyselina transaminázy v prítomnosti aminodonora, aby vznikla rovnaká chirálna forma, ktorá bola pôvodne premieňaná na ketón. Tak napríklad, keď sa vychádza zo zmesi R,S-l-amino-l-fenyletánu (R¹ = fenyl, R² = metyl), S-forma sa konvertuje omega-aminokyselina transaminázou na zodpovedajúci nechirálny ketón, acetofenón, pričom R-l-amino-i-fenyletán zostáva nezmenený. R-l-amino-1-fenyletán sa ľahko izoluje z reakčnej zmesi opísaným spôsobom a acetofenónový vedľajší produkt sa potom podrobí pôsobeniu transaminázy v prítomnosti aminodonora za vzniku S-l-amino-l-fenyletánu v podstate vyššom percentuálnom množstve v porovnaní s R-formou.

Druhé rozpracovanie vynálezu sa môže uskutočňovať nezávisle od prvého. Stereoselektívna syntéza jednej z chirálnych ľoriem amínov všeobecného vzorca (IA) a (IB)

ΝΉ2		nh2
	a	R2b’Č-**R1
H		H

(IA) (13) v množstve podstatne vyššom ako je množstvo druhej chirálnej formy, sa môže vykonávať tak, že sa na ketón všeobecného vzorca (II) o

II

R¹ - C - R^{2 (II)} , kde R¹ a R² majú uvedený význam, pôsobí omega-aminokyselina transaminázou v prítomnosti aminodonora, kým sa nevytvorí podstatné množstvo jednej z chirálnych foriem amínu. Keď sa použije uvedený príklad, môže sa napríklad na acetofenón pôsobiť transaminázou v prítomnosti aminodonora za vzniku S-l-amino-l-fenyletánu, ktorý neobsahuje R-l-amino-1-fényletán, alebo ktorý ho obsahuje len vo veľmi malom množstve.

Aminoakceptory sú ketokarboxylové kyseliny, alkanóny alebo látky, z ktorých sa tieto zlúčeniny vytvárajú in situ. Ako typické príklady ketokarboxylových kyselín je možné uviesť α-ketokarboxylové kyseliny, ako je kyselina glyoxalová, kyselina pyrohroznová, kyselina oxaloctová a pod. a ich soli. Typickým alkanónom je bután-2-on.

Používať je možné tiež iné látky, ktoré je možné premieňať na aminoakceptory inými postupmi pri použití enzýmov alebo celých buniek. Ako príklady látok, ktoré je možné konvertovať na tieto aminoakceptory, je možné uviesť kyselinu fumarovú (ktorá sa rýchlo premieňa in situ na kyselinu oxaloctovú), glukózu (ktorá sa konvertuje ny pyruvát), laktát, kyselinu maleínovou a pod,

Aminodonory sú amíny zahŕňajúce nechirálnu aminokyselinu glycín a chirálne aminokyseliny majúce S

-konfiguráciu, ako je L-alanín alebo kyselina L-aspartová. Môžu sa tiež použiť amíny, tak chirálne ako i nechirálne, ako je S-2-aminobutánu, propylamín, benzylamín, a pod.

Omega-aminokyselina transaminázy, užitočné pri spôsoboch podľa vynálezu, sú známe enzýmy závislé od pyridoxalfosfátu, ktoré sú prítomné v rôznych mikroorganizmoch, ako je Pseudorrronas, Escherichia, Bacillus, Saccharomyces, Hansenula, Candida, Streptomyces, Aspergillus a Neurospora. Dve omega-aminokyselina transaminázy, ktoré sú osobitne užitočné pri spôsoboch podľa vynálezu, EC 2.6.1.18 a EC 2.6.1.19, boli pripravené v kryštalickom stave a charakterizované Yonahou a ďalšími (pozri Agric. Biol. Chem., 47 (10), 2257 - 2265, 1983).

Mikroorganizmy, ktoré majú požadovanú aktivitu, je možné ľahko izolovať pomocou chemostatovej kultúry, tzn. kultiváciou v konštantnom, ale obmedzenom chemickom prostredí s aminoakceptorom a s amínom, ako jediným zdrojom dusíka. Amínom môže byť, ale nemusí, chirálny arnín, pretože v normálnom prostredí omega-aminokyselina transaminázy metabolizujú primárne amíny. Z nechirálnych amínov, ktoré boli s úspechom použité na tvorbu omegaaminokyselina transamináz, je možné uviesť n-oktylamín, cyklohexylamín, 1,4-butándiamín, 1,6-hexán-diamín, 6-aminohexánovú kyselinu, 4-aminomaslovú kyselinu, tyramin a benzylamín. Úspešne boli použité aj chirálne amíny, ako 2-aminobután, α-fenetylamín a 2-amino-4-fenylbután, rovnako tak ako aminokyseliny, ako je L-lyzín, Z-omitín, β-alanín a taurin.

Takými postupmi sa kultúra obohatí o mikroorganizmy produkujúce požadované omega-aminokyselina transaminázy. Tak napríklad jedna taká chemostatová kultivácia pri použití náhodných vzoriek pôdy, ktoré nemali žiadnu osobitnú históriu, pokiaľ sa týka expozície amínom, bola vykonávaná počas približne jedného mesiaca. Ako dominantný mikroorganizmus bol potom nezávisle identifikovaný v Američan Typ Culture Collection Bacillus megaterium, ktorý sa podstatne neodlišoval od známych kmeňov a bol s nimi podobný pokiaľ sa týka fenotypu.

Takto izolované organizmy sa môžu nechať rásť rôznymi spôsobmi. Predne sa môže použiť štandardné soľné médium doplnené fosfátovým tlmivým roztokom, octanom sodným, ako zdrojom uhlíka, 2-ketoglutarátom, ako aminoakceptorom a zlúčeninou obsahujúcou dusík, ako je n-propylamín, n-oktylamín, 2-aminobután, 2-aminoheptán, cyklohexylamín, 1,6-hexándiamín putrescín, 6-aminohexánová kyselina, 4-aminomaslová kyselina, L-lyzín, L-omitín, β-alanín, a-fenetylamín, l-fenyl-3-aminobután, benzylamín, tyramín, taurin, a pod.

Alternatívne sa môže mikroorganizmus nechať rásť pri použití amínu ako jediného zdroja uhlíka, čím sa rast obmedzí na tie organizmy, ktoré sú schopné pre získanie uhlíka katabolizovať arnín.

Po tretie, mikroorganizmus sa môže nechať rásť v prostredí obsahujúcom jantaran sodný, octan sodný alebo akýkoľvek iný zdroj uhlíka a amónnu soľ alebo proteínový hydrolyzát, ako hlavný zdroj dusíka, ku ktorému sa potom pridá, buď na začiatku rastu alebo v jeho priebehu, arnín. ako 2-aminobután, 1 -fény 1-3-aminobután, α-fenetylamín a pod., na indukciu produkcie požadovanej transaminázovej aktivity.

Skutočná enzymatická konverzia sa môže vykonávať konvenčnými kultivačnými postupmi, v prítomnosti chirálneho amínu, pri použití izolovaných, ale nerastúcich buniek alebo tak, že sa chirálne amíny uvedú do styku s rozpustným omega-aminokyselina transaminázovým prípravkom.

Omega-aminokyselina transamináza môže byť vo voľnej forme, buď ako extrakt neobsahujúci bunky alebo uve dený prípravok obsahujúci celé bunky, alebo vo forme imobilizovanej na vhodnom nosiči či matrici, ako je zasieťovaný dextrán alebo agaróza, oxid kremičitý, polyamid alebo celulóza. Môže byť tiež zapuzdrená v polyakrylamide, alginátoch, vláknach a pod. Spôsoby imobilizácie sú opísané v literatúre (pozri napríklad Methods of Enzymology, 44, 1976). Metódam pri použití imobilizovaného enzýmu sa venuje prednosť, pretože po imobilizácii enzýmu stačí už len cez tento enzým viesť aminoakceptor a zmes chirálnych amínov, aby došlo k požadovanému obohateniu a odvádzať vytvorený ketón opísaným spôsobom.

I keď to nie je nevyhnutne nutné, je často výhodné zvyšovať rýchlosť konverzie prídavkom zdroja pyridoxamínu, ako pyridoxalfosfátu k reakčnej zmesi.

Použité postupy a materiály sú ďalej ilustrované typickými príkladmi.

Aktivita enzýmu

Aktivita enzýmu sa vyjadruje v jednotkách/mg. Jednotka aktivity enzýmu je definovaná ako aktivita, ktorá je schopná vyprodukovať l/pmol ketónu za minútu. Kvôli dosiahnutiu jednotnosti sa aktivita meria ako počet μπιοί 1-fenylbután-3-onu vyrobených z R,S-l-fenyl-3-aminobutánu. Na meranie hodnôt aktivity omega-aminokyselina transamináz uvedených v nasledujúcich príkladoch sa používa nasledujúci štandardizovaný test.

Známy objem skúšaného enzymatického prípravku sa inkubuje pri 37 °C a pH 7 v roztoku nasledujúceho zloženia:

pyruvát sodný 100 mM

R,S-1 -feny 1-3 -aminobután 3 0 mM pyridoxalfosfát 0,5 mM

Odoberie sa vzorka a pridá sa k nej v množstve 20 jej objemu 12% vodná kyselina trichlóroctová. Vyzrážaný proteín sa oddelí odstredenim a koncentrácia 1-fenylbután-3-onu v supernatante sa stanoví kvapalinovou chromatografiou na 100 x 8 mm 4 pm Novopak fenyl stĺpci. Elúcia sa vykonáva v 40 % izopropanole a 0,09 % kyseline fosforečnej vo vode. Za týchto podmienok sa l-fenylbután-3-on eluuje za 5,3 minút.

Čistota amínov

Čistota vyrobených amínov sa stanovuje plynovou chromatografiou na 1,83 x 2 mm chróm Q stĺpci 10 % SE-30 na nosiči 100/120 mesh (125 až 150/im) pri 210 °C pri prietoku nosného plynu 10 ml/min.

Stanovenie enantiomerického obohatenia

Hodnota ee daného produktu sa stanoví reakciou s (-) a-(trifluórmetylfenyl)metoxyacetylchloridom (pozri Gal,

J. Pharm. Sci., 66, 169, 1977 a Mosher a ďalšie, J. Org. Chem., 34, 25430, 1969) nasledovanou kapilárnou plynovou chromatografiou derivatizovaného produktu na kolóne Chrompack z taveného kremeňa.

Štandardné soľné médium

Vhodné soľné médium na mikrobiálne transformácie
opísané v nasledujúcich príkladoch má toto zloženie:
MgSO4	1,00 g/1
CaCl,	0,021 g/1
ZnSÓ4.7H2O	0,20 mg/1
MnSO4.4H2O	0,10 mg/1
H3BO3	0,02 mg/1
CuSO4,5H2O	0,10 mg/1
CoC12.6H2O	0,05 mg/1
NíC12.6H2O	0,01 mg/1

FeSO₄ 1,50 mg/1

NaMoO₄ 2,00 mg/1

Fe EDTA 5,00 mg/1

KH₂PO 20,00 mM

NaOH do pH 7

Zloženie soľného média nemá rozhodujúcu dôležitosť, ale bolo štandardizované, aby bolo eliminované ako premenná hodnota.

Mikroorganizmy

Kultúry boli buď získané z označenej zbierky alebo boli izolované opísaným spôsobom a potom nezávisle identifikované.

Obohacovanie mikroorganizmov produkujúcich omega-aminokyselina transaminázu

V štandardnom soľnom médiu sa udržuje chemostat s 5 g/1 R,S-2-aminobutánu a 10 mM 2-ketoglutarátu pri rýchlosti riedenia 0,03/h. Chemostat sa naočkuje a udržuje v prevádzke asi 1 mesiac pri 37 °C a pH 6,8 až 7,0. Kmene, ktoré sa vyvinú, sa izolujú a nechajú rásť na minimálnom agare obsahujúcom soľné médium doplnené 10 mM 2-ketoglutarátu a 5 mM R,S-l-fenyl-3-aminobutánu.

Izolácia enzýmu

Pokiaľ to nie j c uvedené inak, bunky z kultúry sa 10 minút odstreďujú pri 10 000 otáčkach za minútu, resuspendujú sa v 10 mM fosfátovom tlmivom roztoku s pH 7 a 0,5 mM pyridoxalfosfátu a rozdrvia sa dvoma priechodmi chladeným francúzskym lisom pracujúcim pri 103 MPa. Rozdrvené bunky sa oddelia jednohodinovým odstreďovaním pri 10 000 otáčkach za minútu a supemantant obsahujúci enzým sa uloží.

Vynález je bližšie objasnený v nasledujúcich príkladoch rozpracovania. Príklady majú výhradne ilustratívny charakter a rozsah vynálezu v žiadnom ohľade neobmedzujú.

Pre rozsah vynálezu sú určujúce len definície patentových nárokov.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Rast mikroorganizmov produkujúcich omega-aminokyselina transaminázu pri použití aminodonora ako jediného zdroja dusíka je ilustrovaný nasledujúcim príkladom.

Bacillus megaterium sa nechá rásť v 3 litrovej trepanej fľaše (200 otáčok za minútu) počas 17 hodín pri 30 °C pri použití 1 litra uvedeného soľného roztoku, 60 mM octanu sodného, 30 mM fosfátového tlmivého roztoku, 30 mM 2ketoglutarátu dvojsodného a 100 mM n-propyl-amínu ako zdroja dusíka. Keď kultúra dosiahne hustotu 0,6 g sušiny na liter, oddelia sa bunky a uvedeným spôsobom sa z nich izoluje enzým. Špecifická aktivita omega-aminokyselina transaminázy, ktorá sa takto získa je vyššia ako 0,49 jednotky/mg.

Kmeň Bacillus megaterium použitý v predchádzajúcom postupe bol získaný zo vzorky pôdy s žiadnou osobitnou históriou, pokiaľ sa týka expozície amínom, naočkovaním opísaného chemostatu a izoláciou dominantných organizmov (tých, ktoré sú schopné rásť na R,S-l-fenyl-3-aminobutánu). Kmeň bol nezávisle identifikovaný v Američan Type Culturc Collcction ako Bacillus megaterium, ktorý' sa významne nelíši od známeho kmeňa ATCC č. 14581 a ktorý je fenotypovo podobný ATCC 49097B.

Príklad 2

V tomto príklade je ilustrovaný rast mikroorganizmov produkujúcich omcga-aminokyselina transaminázu pri použití aminodonora, ako jediného zdroja uhlíka.

Pseudomonas aeuruginosa ATCC 15692 sa nechá rásť na β-alanine ako jedinom zdroji uhlíka spôsobom, ktorý opísali Way a ďalšie vo FEMS Micro. Lett., 34, 279 (1986). Bunkové extrakty obsahujúce omega-amino-kyselina transaminázu sa získajú opísaným spôsobom. Pri skúšaní vykonávanom opísaným spôsobom sa zistí, že špecifická aktivita omega-aminokyselina transaminázy je 0,040 jednotky/mg.

Príklad 3

Pseudomonas putida ATCC 39213 sa kultivuje spôsobom opísaným v príklade 1 a podľa tohto príkladu sa postupuje aj pri získavaní extraktu z buniek. Špecifická aktivita omega-aminokyselina transaminázy je 0,045 jednotky/mg.

Príklad 4

V tomto príkladu jc demonštrovaná potreba aminoakceptoru.

Enzýmové extrakty z Pseudomonas putida, Bacillus megaterium a Pseudomonas aeruginosa získané uvedeným spôsobom sa skúšajú pri pH 9 v 50 mM TRIS/HC1 pri použití 30 mM R,S-l-fenyl-3-aminobutánu buď v prítomnosti alebo v neprítomnosti 100 mM pyruvátu sodného. Dosiahnu sa nasledujúce relatívne rýchlosti premeny.

relatívna rýchlosť premeň/

p.putida E.megateriun P. aeruginosa

v prítomnosti pyruvátu	100	100	100
v neprítomnosti pyruvátu	0	0	0
Transaminázová	povaha	enzymatického	účinku

zrejmá z pôsobenia samovražedných inaktivátorov, o ktorých je známe, že sú pre transaminázy špecifické (pozri napríklad Bumett a ďalšie, J. Bio. Chem. 225, 428 až 432, 1980). Inaktivátor (0,5 mM) sa predbežne inkubuje so skúšobným médiom pred pridaním R,S-l-fenyl-3-aminobutánu.

relatívna rýchlosť premeny

Inaktivátor P.putida B.megaterium P.aeruginosa

žiadny	100	100	100
gabakulín	0	13	0
hydroxylamin	3	10	0
Stereoselektivita omega-aminokyselina transaminázy je zrejmá z výsledkov nasledujúcej skúšky pri použití 15 mM

R-l-fenyl-3-aminobutánu (s pyruvátom).

	relatívna rýchlosť premeny
p.pu tida	B. aega téri ujo	P. aeruginosa
R,S-l-fenyl-3aninobután	100	100	1OO
R-l-fenyl-3anlnobután	3	15	4

Príklad 5

V tomto príklade je ilustrovaný rast mikroorganizmov pri použití amónia ako jediného zdroja dusíka, pričom sa indukcia produkcie omega-aminokyselina transaminázy výkon prídavkom amínu.

Bacillus megaterium sa nechá rásť v 1 litrových kultúrach v štandardnom soľnom médiu doplnenom 40 mM zdroja uhlíka, uvedeného v nasledujúcej tabuľke, 5 mM chloridu amónneho, 80 mM fosfátového tlmivého roztoku a 2 mM amínu ako indukčného činidla uvedeného v nasledujúcej tabuľke. Po 30 až 40 hodinách sa enzým izoluje a skúša opísaným spôsobom.

špecifická aktivita (jednotky/mg)

zdroj uhlíka	sukcinát	acetát	glukonát	glukóza
R,S-l-fenyl-laninoetán	0,27	0,39	n. t.	n. t.
R-l-fenyl-1aminoetán	0,27	0,36	n. t.	n.t.
R,S-i-fenyl-3aminobután	0,28	0,33	0,26	0,62
R-l-fenyl-3aninobután	0,21	0,26	n. t.	n. t.
R,S-2-aminobután	0,13	0,14	n. t.	n.t.
R-2-aminobután	0,06	0,13	n. t.	n.t.
tyraniu	n. t.	0,24	n.t.	n.t.

Príklad 6

V nasledujúcom príklade je ilustrovaný rast mikroorganizmov pri použití zdroja bohatého na proteíny a nasledujúcej indukcie produkcie omega-aminokyselina transaminázy prídavkom amínu.

Bacillus megaterium sa nechá rásť v 12 1 litrovom fermentore pri pH 7 a teplote 30 °C a uvedenom soľnom médiu doplnenom 10 g/1 kasaminokyselín.

Obsah fermentoru sa mieša a prevzdušňuje. K zmesi sa postupne pridá octan sodný až do výslednej koncentrácie 120 mM. V tomto okamihu je hustota buniek 3 g sušiny na 1 liter, l-fenyl-3-aminobután sa pridáva až do celkovej koncentrácie 10 mM. Po 12 hodinách sa enzým oddelí a skúša opísaným spôsobom. Jeho špecifická aktivita je 0,49 jednotiek/mg.

Príklad 7

V tomto príklade je ilustrované použitie rozpustného enzýmového prípravku na enantiomerické obohacovanie racemátu chirálneho amínu.

Omega-aminokyselina transaminázový prípravok sa získa spôsobom opísaným v príklade 1 z Bacillus megaterium. Jeho špecifická aktivite zistená opísaným skúšaním robí 0,375 jednotky/mg. K 25 ml roztoku 26,4 mg tohto enzýmového prípravku, ktorý navyše obsahuje 0,4 mM pyri doxalfosfátu a 40 mM fosforečnanu sodného, sa pridá 20 mM R, S-1-amino-1-fény letánu a 100 mM pyruvátu sodného ako aminoakceptoru. Roztok sa inkubuje 150 minút pri pH 7 a 30°C a potom sa zalkalizuje (pH >12) prídavkom

2,5 ml 2N hydroxidu sodného. Roztok sa extrahuje nheptánom a extrakty sa odparia. Získa sa 30,8 mg (49 % konverzie) R-1-amino-1-fényletánu s hodnotou ee 96,4 %. V tomto príklade je ilustrované použitie rozpustného enzýmového prípravku na enantiomerické obohacovanie racemátu chirálneho aminu.

Postupuje sa spôsobom podľa príkladu 7 s tým rozdielom, že sa miesto R, S-1-amino-1-fényletánu použije niektorý z uvedených racemátov:

Východisková látka

a) R,S-l-fenyl-l-aminobután

b) R, S-1 -amino-1 -(4-brómfenyl)etán

c) R,S-l-fenyl-2-aminopropán

d) R,S-l-amino-l-fenyletán

e) R, S-4-(4-metoxy fenyl)-2-aminobután í) R,S-5-(3-pyridyl)-2-aminopentán

Produkt ee % konverzie

a) R-l-fenyl-3-aminobután	98,4	60
b) R-1 -amino-1 -(4-brómľenyl)etán	97,6	49
c) R-l-fenyl-2-aminopropán	98,6	49
d) R-1 -amino-1 -fenyletán	99,0	52
e) R-4-(4-metoxyfenyl)-2-	99,0	58
-aminobután
f) R-5-(3-pyridyl)-2-	99,0	49

-aminopentán

Príklad 9

V tomto príklade je ilustrované použitie nerastúcich buniek na enantiomerické obohacovanie racemátu chirálneho aminu.

Bunky z troch jednolitrových kultúr Bacillus megaterium, ktoré boli ponechané rásť 33 hodín spôsobom opísaným v príklade 1 na 6 mM R,S-l-fenyl-3-aminobutánu, ako jedinom zdroji dusíka sa oddelia odstredením a premyjú resuspendovaním v 250 ml 10 mM fosfátového tlmivého roztoku (pH 6,8) a odstredením.

Bunková peleta sa resuspenduje v 0,6 litra 10 mM fosfátového tlmivého roztoku (pH 6,8) obsahujúceho 10 mM R,S-l-fenyl-3-aminobutánu a 50 mM oxaloctovej kyseliny ako aminoakceptor. Po inkubácii v obehovom (orbitálnom) inkubátore pri 30 °C počas 4 hodín sa roztok zalkalizuje a extrahuje extrahuje heptánom spôsobom opísaným v príklade 7. Získa sa R-l-fenyl-3-aminobután s optickou čistotou 97,9 %, čo zodpovedá hodnote ee 95,8.

Príklad 10

V nasledujúcom príklade je ilustrované použitie rastúcich buniek na enantiomerické obohacovanie recemátu chirálneho aminu a použitie aminoakceptorového prekurzoru.

Sesťlitrové inokulum Bacillus megaterium vyrobené v podstate spôsobom opísaným v príklade 1, ale pri použití 10 mM R,S-l-fenyl-3-aminobutánu ako jediného zdroja dusíka, sa kultivuje v 120 1 uvedeného soľného média doplneného 3 mM fumarátu ako aminoakceptorového prekurzoru. 22 hodín po inokulácii sa pridá ďalších 30 mM fumarátu a po 6 hodinách sa kultúra zoberie odstránením buniek ultrafiltráciou na membráne Romicon PM100. Roztok sa zalkalizuje a extrahuje heptánom spôsobom opísaným v príklade 7. Získa sa tak R-l-fenyl-3-aminobután v čistote

99,5 %, čo zodpovedá hodnote ee 96,4 %.

Príklad 11

Nasledujúci príklad ilustruje relatívne rýchlosti premeny, stanovené priamo alebo vypočítané z kinetických údajov rôznych chirálnych amínov pri použití rozpustných enzymatických prípravkov. Skúšanie sa vykonáva opísaným spôsobom, pri ktorom sa len mení chirálny amín. Výsledky sú uvedené v nasledujúcej tabuľke.

anin (R,S)	kone.(nM)	relatívna rýchlosť premeny
R-enantiomér	R-enantiomér
1-fenyl-laminoetán	10	□	100
l-fenyl-3aninobután	30	5	100
1-(4-brónfenyl)- 1-aroinoetán	30	0	100
l-(a-naftyl)-laminoetán	10	100	0
fenylglycinol	10	100	0
2-aninooktán	5	0	100
5-(3-pyrLdyl)-2aniriopentďn	5	u	LOQ
1- (4-nitrofenyl)- 2- aninopropán	5	0	100
3-fenyl-2~ amincpropán	15	7	100
1-fenyl-laminopropán	20	11	100
3-fer.yl-2aminopropán	10	100	0

Príklad 12

V tomto príklade sú ilustrované relatívne rýchlosti premeny l-fenyl-3-aminobutánu pri použití rôznych aminoakceptorov miesto pyruvátu pri skúšaní vykonávanom opísaným spôsobom. Výsledky sú uvedené v nasledujúcej tabuľke:

akceptor	koncentrácia (mM)	relatívna rýchlosť premeny
pyruvát	20	100
oxaloacetát	20	100
heptaldehyd	25	80
glyoxalát	20	50
2-ketobutyrát	25	21
bután-2-on	20	20
acetaldehyd	20	50
propiónaldehyd	20	100
butyraldehyd	20	90
benzaldehyd	25	17
2-pentanón	25	33
cyklopentanón	25	12
cyklchexanón	25	23
hydroxypyruvát	25	18

Ako aminoakceptor je tiež účinný acetofenón, i keď jeho účinnosť je podstatne nižšia (relatívna rýchlosť < 10).

SK 280218 Β6

Príklad 13

V tomto príklade je ilustrované enantiomerické obohacovanie pri použití rozpustného enzymatického prípravku s kontinuálnou extrakciou obohateného produktu.

Rozpustný enzymatický prípravok sa získa z Bacillus megaterium spôsobom opísaným v príklade 1. Jeho špecifická aktivita určená uvedenou skúškou je 0,70 jednotky/mg. Vyrobí sa vodná fáza obsahujúca 450 mg tohto extraktu, 0,12M Pyruvátu sodného, 0,2M R,S-l-fenyl-3-aminobutánu, 1 mM pyridoxalfosfátu a 0,5M fosfátu (pH 7,5). Pridá sa 500 ml n-heptánu a dvojfázová zmes sa mieša počas 7 hodín pri 22 °C. Hodnota sa nastaví na 4,5 prídavkom kyseliny chlorovodíkovej a vodná vrstva sa oddelí od organickej vrstvy. Vodná vrstva sa alkalizuje prídavkom hydroxidu sodného a extrahuje heptánom. Po odstránení heptánu sa analýzou zistí, že zvyšok obsahuje 96 % R-l-fenyl-3-aminobutánu.

Príklad 14

Tento príklad ilustruje typickú syntézu chirálneho amínu.

Spôsobom opísaným v príklade 1 sa z Bacillus megaterium vyrobí rozpustný enzymatický prípravok. Jeho špecifická aktivita stanovená uvedeným spôsobom je 0,58 jednotky/mg. K 200 ml vodného roztoku 350 mg tohto prípravku, 0,4 mg pyridoxalfosfátu a 40 mM fosforečnanu sodného sa pridá 4,2 mM 1 -fenylbután-3-onu a 100 ml 2-aminobutánu ako aminodonora. Zmes sa inkubuje pri pH 7 a 30 °C počas 4 hodín, po tomto čase je v reakčnej zmesi prítomný R-l-fenyl-3-aminobután v koncentrácii 3,35 mM čo zodpovedá 80 % konverzii. Produkt sa izoluje prídavkom 40 ml 10 N hydroxidu sodného a extrakciou alkalického vodného roztoku 250 ml n-heptánu. Odparením heptánových extraktov sa získa 100,5 g produktu, ktorý bol analyzovaný opísanou derivatizáciou. Produkt obsahuje 96,4 % S-l-fenyl-3-aminobutánu.

Podobne bol S-l-fenyl-2-aminopropán pripravený z 1-fenylpropán-2-onu pri ee 96,4 a vo výťažku 94 8 %. S-l-amino-l-fenyletán bol pripravený z acetofenónu pri ee 100 a vo výťažku 44 %.

Príklad 15

V tomto príklade je ilustrovaná enzymatická separácia a izolácia R- a S-enantiomérov.

Pri použití inkubácie sa opakuje postup prípravy R-enantioméru R,S-1-amino-1-fenyletánu opísaný v príklade 7. Pred alkalizáciou inkubačného roztoku sa však tento roztok extrahuje n-heptánom a extrakty sa uschovajú. Vodná fáza sa potom spracováva spôsobom opísaným v príklade 7, aby sa izoloval R-l-amino-l-fenyletán.

Z heptánových extraktov sa odparením získa acetofenón. Keď sa v podstate reprodukuje postup uvedený v príklade 14, s výnimkou použitia 2,3 mM acetofenónu miesto l-fenylbután-3-onu, získa sa 56 mg S-l-amino-l-fenylctánu (100 %).

Príklad 16

Tento príklad ilustruje použitie imobilizovaného enzýmu.

Imobilizácia sa vykonáva takto: Nosičova matrica (0,4 g) vo forme kotúča s priemerom 47 mm Actidisk CFMC Corp.) sa umiestni v zariadení Millipore Sweenex opatrenom prívodnou a odvodnou rúrou, peristaltickým čerpadlom a zásobníkom. Matrica sa po sebe premýva teplote okolia rýchlosťou 3 ml/min 1) 200 ml 50 mM fosfátového tlmivého roztoku (pH 7) obsahujúceho 0,5 mM pyridoxalfosfátu počas 20 minút, 2) 11 ml 4,6 mg/ml roztoku enzýmu získaného spôsobom podľa príkladu 1, počas 120 mi nút, 3) 150 ml 0,3M chloridu sodného v 50 mM fosfátového tlmivého roztoku (pH 7), obsahujúcim 0,5 mM pyridoxalfosfátu, počas 30 minút a 4) 200 ml 50 mM fosfátového tlmivého roztoku (pH 7) obsahujúceho 0,5 mM pyridoxalfosfátu, počas 20 minút.

Obohacovanie sa vykonáva takto: 140 ml roztoku 10 mM R,S-l-fenyl-3-aminobutánu, 100 M pyruvátu sodného, 0,1 mM pyridoxalfosfátu a 25 mM fosforečnanu draselného (pH 7) sa cirkuluje cez uvedenú matricu pri teplote miestnosti rýchlosťou 5 ml/minútu. Po dvoch hodinách sa cirkulujúca kvapalina z prístroja vypustí. Koncentrácia vzniknutého l-fenylbután-3-onu je 5,2 mM, zatiaľ čo koncentrácia R-l-fenyl-3-aminobutánu je 4,8 mM. Hodnota pH sa nastaví na 12,5 a R-l-fenyl-3-aminobután sa kvantitatívne izoluje extrakciou heptánom. Po odstránení heptánu odparením sa produkt analyzuje. Obsah R-l-fenyl-3-aminobutánu v produkte je 92,8 %.

Claims (15)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Spôsob enantiomémeho obohacovania zmesi dvoch enantiomerických chirálnych amínov všeobecného vzorca “z“>2

   R^Ô—B² s •· •*

   HH kde

   R¹ a R² predstavujú alkyl alebo arylskupiny, prípadne substituované enzymatický neinhibujúcou skupinou, pričom R¹ sa odlišuje od R² štruktúrou alebo chiralitou, vyznačujúci sa tým, že sa zmes chirálnych amínov uvádza vo vodnom prostredí a v prítomnosti aminoakceptoru do styku s omega-aminokyselina transaminázou, ktorá je enzymatický aktívna proti znázornenej aminoskupine jedného z uvedených chirálnych amínov tak dlho, kým sa podstatné množstvo jedného z týchto chirálnych amínov nepremení na ketón všeobecného vzorca

   O

   R¹ - C - R² kde R¹ a R² majú rovnaký význam ako pri východiskovom amíne.
2. 2. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že sa kontakt udržiava prinajmenšom tak dlho, kým nie je enantiomerický nadbytok chirálneho amínu, ktorý nie je premenený na ketón aspoň 90 % relatívne k zvyšnému chirálnemu amínu.
3. 3. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že sa chirálny amín, ktorý nie je premenený na ketón, izoluje z reakčnej zmesi.
4. 4. Spôsob podľa nároku (vyznačujúci sa t ý m , že sa z vodného média izoluje podstatné množstvo ketónu.
5. 5. Spôsob podľa nároku 4, vyznačujúci sa t ý m , že sa ketón izolovaný z vodného prostredia nezávisle uvádza do styku s omega-aminokyselina transaminázou v prítomnosti aminodonora prinajmenšom tak dlho, kým sa nevytvorí rovnaká chirálna forma, ako bola forma na počiatku premieňania na ketón, v množstve podstatne prevyšujúcom množstvo druhej chirálnej formy.
6. 6. Spôsob podľa nároku 1,vyznačujúci sa tým, že sa ako aminoakceptor použije a-ketokarboxylová kyselina, alifatický alebo cykloalifatický ketón, alifatický alebo cykloalifatický aldehyd alebo látka, ktorá sa biochemický premieňa na α-ketokarboxylovú kyselinu in situ v reakčnom prostredí.
7. 7. Spôsob podľa nároku 6, vyznačujúci sa t ý m , že sa ako aminoakceptor použije kyselina glyoxalová, kyselina pyrohroznová, kyseliny oxalooctová, jej soli alebo heptaldchyd.
8. 8. Spôsob podľa nároku 1,v y značujúci sa tým, že každý zo symbolov R¹ a R² nezávisle predstavuje priamu alebo rozvetvenú alkylskupinu s 1 až 6 atómami uhlíka, priamu alebo rozvetvenú fenylalkylskupinu obsahujúcu 7 až 12 atómov uhlíka alebo fenyl alebo naftylskupinu, pričom každá z týchto skupín je nesubstituovaná alebo substituovaná enzymaticky neinhibujúcou skupinou.
9. 9. Spôsob podľa nároku 8, vyznačujúci sa t ý m , že každý zo symbolov R¹ a R² nezávisle predstavuje metyl-, etyl-, η-propyl-, izopropyl-, η-butyl-, izobutyl-, sek. butyl-, fenyl-, benzyl- alebo fenetylskupinu.
10. 10. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa t ý m , že sa zmes chirálnych amínov a aminoakceptoru uvádza do styku s celými bunkami mikroorganizmu, ktorý produkuje omega-aminokyselina transaminázu.
11. 11. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa t ý m , že sa zmes chirálnych amínov a aminoakceptoru uvádza do styku s vodným prípravkom omega-aminokyselina transaminázy, ktorý neobsahuje bunky.
12. 12. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa t ý m , že sa zmes chirálnych amínov a aminoskceptoru uvádza do styku s omega-aminokyselina transaminázou imobilizovanou na nosiči.
13. 13. Spôsob stereoselektivnej syntézy jednej chirálnej formy amínu všeobecného vzorca

    HH₂ nh₂

    R¹* Č-«R² alebo R²»-C-o R¹

    H H

    R¹ a R² predstavujú alkyl alebo arylskupiny, prípadne substituované enzymaticky neinhibujúcou skupinou, pričom R¹ sa odlišuje od R² štruktúrou alebo chiralitou, v množstve podstatne prevyšujúcom množstvo druhej chirálnej formy, vyznačujúci sa tým, že sa ketón všeobecného vzorca stavuje priamu alebo rozvetvenú alkylskupinu s 1 až 6 atómami uhlíka, priamu alebo rozvetvenú fenylalkylskupinu obsahujúcu 7 až 12 atómov uhlíka alebo fenyl alebo naftylskupinu, pričom každá z týchto skupín je nesubstituovaná alebo substituovaná enzymaticky neinhibujúcou skupinou.

    16. Spôsob podľa nároku 15, vyznačujúci sa t ý m , že každý zo symbolov R¹ a R² nezávisle predstavuje metyl-, etyl-, η-propyl-, izopropyl-, η-butyl-, izobutyl-, sek. butyl-, fenyl-, benzyl- alebo fenetylskupinu.

    17. Spôsob podľa nároku 13, vyznačujúci sa t ý m , že sa ketón a aminodonor uvádzajú do styku s celými bunkami mikroorganizmu, ktorý produkuje omegaaminokyselina transaminázu.

    18. Spôsob podľa nároku 13, vyznačujúci sa t ý m , že sa ketón a aminodonor uvádzajú do styku s vodným prípravkom omega-aminokyselina transaminázy, ktorý neobsahuje bunky.

    19. Spôsob podľa nároku 13, vyznačujúci sa t ý m , že sa ketón a aminodonor uvádzajú do styku s omega-aminokyselina transaminázou imobilizovanou na nosiči.

    20. Spôsob podľa nároku 13, vyznačujúci sa t ý m , že sa používa veľký molámy nadbytok aminodonora.

    Koniec dokumentu

    O

    R¹ - C - R² kde R'a R² majú rovnaký význam ako pri pripravovanom amíne, uvádza do styku s omega-aminokyselina transaminázou v prítomnosti aminodonora prinajmenšom tak dlho, kým sa nevytvorí podstatné množstvo jedného z uvedených chirálnych amínov.
14. 14. Spôsob podľa nároku 13, vyznačujúci sa t ý m , že aminodonorom je 2-aminobután, glycín, alanín alebo kyselina aspartová.
15. 15. Spôsob podľa nároku 13, vyznačujúci sa t ý m , že každý zo symbolov R¹ a R² nezávisle pred-