CZ283867B6 - Způsob enantiomerického obohacování a stereoselektivní syntézy chirálních aminů - Google Patents

Abstract

Aminy, v nichž je aminoskupina umístěna na sekundárním atomu uhlíku, který je chirálně substituován zbytky R.sup.1 .n.a R.sup.2.n., kde R.sup.1 .n.a R.sup.2.n. představují alkyl nebo arylskupiny, popřípadě substituované enzymaticky neinhibující skupinou, přičemž R.sup.1 .n.se odlišuje od R.sup.2.n. strukturou nebo chiralitou, je možno enantiomericky obohatit, tj. obohatit o jeden z enantiomerů působením omega-aminokyseliny transaminázy, která má tu vlastnost,že přednostně převádí jeden z těchto dvou chirálních aminů na keton. Transformace se provádí v přítomnosti aminoakceptoru. Vzhledem k tomu, že reakce je rovnovážná, lze ji provádět i obráceně, přičemž v tomto případě může sloužit ke stereoselektivní syntéze jedné chirální formy aminu působením citované transaminázy na příslušný keton v přítomnosti aminodonoru.ŕ

Description

Způsob enantiomerického obohacování směsi dvou enantiomerických chirálních aminů

Oblast techniky

Vynález se týká způsobu obohacování směsi dvou enantiomerických chirálních aminů jedním z enantiomerů.

Dosavadní stav techniky

Nositelem biologické aktivity chemických sloučenin, jako jsou farmaceutické produkty a produkty aplikovatelné v zemědělství, které obsahují centrum chirality, je často převážně jedna zmožných chirálních forem. Vzhledem ktomu, že většina chemických syntéz není ve své podstatě stereoselektivní, způsobuje tento jev vážný problém z hlediska chemické výroby. V některém stupni výroby, buď až po získání výsledných chirálních sloučenin, nebo po připravení jejich chemických prekurzorů se stejným centrem chirality je zapotřebí provádět obohacení produktu ve prospěch jedné chirální formy. Ať již se zvolí pro obohacování kterýkoliv stupeň reakce, je tento postup svou vlastní podstatou omezen tím, že se při něm může dosáhnout maximálního teoretického výtěžku 50 % požadovaného enantiomerů (pokud není k dispozici způsob recyklování nežádoucího enantiomerů).

Mnohé z chirálních sloučenin tohoto typu jsou aminy. Kromě toho, vzhledem k všestrannosti jejich reakcí jsou dobrými kandidáty pro štěpení na enantiomery, po němž lze provést stereoselektivní konverzi na chirální sloučeniny. Chemická výroba chirálních aminů neobsahujících druhý enantiomer se až dosud spoléhá zejména na štěpení směsi dvou chirálních forem prostřednictvím vytvoření diasteromerických derivátů, jako jsou soli s chirální kyselinou, stereoselektivní syntetické postupy a použití chirálních chromatografických kolon (viz například US patent č. 3 944 608 a EP A 36 265).

Některé strukturní typy aminů je možno štěpit na enantiomery enzymaticky. Jsou dobře známy enzymatické reakce zahrnující α-aminokyseliny a jejich použití bylo navrženo pro stereospecifické preparace. Tak například v US patentu č. 3 871 958 je popsána enzymatická příprava derivátů α-aminokyseliny šeřinu kopulací aldehydu s glycinem v přítomnosti threoninaldolázy odvozené od druhu E. coli a příbuzná syntéza seronilu za použití ethanolaminu.

Poměrně málo bylo publikováno o enzymatických reakcích aminokyselin, u nichž aminoskupina není ve vicinální poloze vůči skupině karboxylové kyseliny. Yonaha a další, Agric. Biol. Chem. 42, (12), 2363-2367 (1978) popisují omega-aminokyselina: pyruvát transaminázu z druhu Pseudomonas, pro níž je puryvát výlučným aminoakceptorem. Tento enzym, který byl nedávno před tím vyroben v krystalické formě a charakterizován (viz Yonaha a další, Agric. Biol. Chem., 41 (9), 1701 - 1706 (1977)), měl nízkou substrátovou specificitu pro omega-amino kyseliny, jako je hypotaurin, 3-aminopropansulfonát, β-alanin, 4—aminobutyrát a 8-aminooktanoát a katalyzoval transaminace mezi primárními aminoalkany a pyruvátem.

Nakano a další, J. Biochem., 81, 1375 - 1381 (1977) identifikovali dvě omega-amino kyselinové transaminázy v B. cereus: β-alanin transaminázu, která odpovídá Yonahově omega-amino kyše lina: pyruvát transamináze a -aminobutyrát transaminázu. Tyto dvě transaminázy je možno rozlišit na základě výrazně odlišné aktivity vůči β-alaninu (100 : 3) -aminobutyrátu (43 : 100) a na základě jejich odlišných požadavků na aminoakceptory.

- 1 CZ 283867 B6

Bumett a další, J. C. S. Chem. Comm., 1979, 826 - 828, uvedli, že omega-amino kyselina:pyruvát transamináza a -aminobutyrát transamináza vykazují odlišné preference vůči dvěma terminálním atomům vodíku v tritiem značeném -aminobutyrátu.

Tanizawa a další, Biochem. 21, 1104 - 1108 (1982) zkoumali bakteriální L-lysin-e-aminotransferázu a L-omithin-£-aminotransferázu a uvedli, že i když jsou oba tyto enzymy specifické pro L-amino kyseliny, působí distálně a se stejnou stereospecifitou jako -aminobutyrát transamináza studovaná Bumettem a dalšími, viz shora.

Yonaha a další, Agric. Biol. Chem., 47 (10), 2257-2265 (1983) dodatečně charakterizovali omega-amino kyselinaipyruvát transaminázu a -aminobutyrát transaminázu (EC 2.6.1.18 a EC 2.6.1.19) a dokumentovali jejich distribuci v různých organismech.

Waters a další, FEMS Micro, Lett., 34 (1986) 279-282, ve zprávě o úplném katabolismu βalaninu a β-aminoisobutyrátu působením P-aeruginosa, uvedli, že první stupeň zahrnuje transaminaci β-alanin-pyruvát aminotransferázou.

Enzymatické metody jsou až dosud považovány za metody pro dělení směsí chirálních aminů, které nejsou aminokyselinami, jako například 2-aminobutanolu. Většina z těchto metod zahrnuje derivatizaci, zejména aminoskupiny a využití této chráněné skupiny nebo jiné skupiny v molekule pro vlastní separaci. Tak například v EP-A 222561 je popsán postup, při němž se racemický

2- aminobutanol převede na N-karbamoylderivát, který se pak uvede do styku s alkylalkanoátem v přítomnosti enzymu lipázy. Esterifikace volné hydroxyskupiny je zřejmě omezena na Senantiomer N-karbamoylderivátu, který se potom hydrolýzuje. Tento postup je samozřejmě omezen na aminy, nesoucí esterifikovatelnou hydroxyskupinu a kromě toho specificky vyžaduje předchozí chránění aminoskupiny vytvořením karbamoylskupiny (-NH-CO-) za účelem dosažení stereospecificity při enzymatické reakci.

EP-A 239 122 popisuje podobný postup aplikovatelný na širší třídu 2-amino-l-alkanolů.

Japonská publikace Kokai JP 55-138 389 popisuje přípravu viciálních aminoalkoholů tak, že se na alkyl- nebo aralkyl substituovaný ethylenimin působí mikroorganismy rodu Bacillus, Próteus, Erwinia nebo Klebsiella.

Japonská patentová publikace Kokai JP 58-198 296 uvádí postup, při němž se d,l N-acyl-2aminobutanol podrobí působení aminocylázy odvozené od různých druhů Asperigillus, Penicillium a Streptomyces, která hydrolýzuje pouze d-N-acyl-2-aminobutanol.

Japonská patentová publikace Kokai JP 59-39 294 popisuje způsob štěpení racemického 2aminobutanolu tak, že se tato látka převede na N-acetylderivát, na který se působí Micrococcus acylázou za vzniku 1-2-aminobutanolu a d-N-acetyl-2-aminobutanolu, přičemž d-N-acetyl-2aminobutanol se chemicky hydrolýzuje na d-2-aminobutanol.

Japonská patentová publikace Kokai JP 63-237796 popisuje způsob, při němž se R,S-l-methyl-

3- fenylpropylamin zpracovává za aerobních podmínek kultivací specifických mikroorganismů. Přitom se přednostně metabolizuje S-forma. Nejvyšších výtěžků a optické čistoty se dosahuje za použití kvasinek druhu Candida humicola a Trichosporon melibiosaceum. Neuvádí se zde enzymatické povaha metabolismu S-formy, k níž dochází v těchto aerobních kulturách, například oxidáza, dehydrogenáza, amoniak lysáza atd., není uvedena.

V abstraktu japonské patentové publikace Kokai JP 63-273486 je zveřejněna mikrobiální syntéza l-(4-methoxyfenyl)-2-aminopropanu s R-konfigurací na jednom ze dvou chirálních center z l-(4-methoxyfenyl)-2-propanu za použití Sarcina lutea.

-2CZ 283867 B6

Podstata vynálezu

V nejširším smyslu zahrnuje vynález použití omega-aminokyselina transaminázy v přítomnosti aminoakceptoru pro enantiomerické obohacování směsi chirálních aminů, v nichž je aminoskupina vázána k neterminálnímu chirálně substituovanému atomu uhlíku, o jeden z enantiomerů. Vynález je tedy založen na objevu, že omega-aminokyselina transaminázy působí stereoselektivně na aminoskupiny, které nejsou v poloze omega a že tohoto působení je možno použít pro obohacování směsi chirálních aminů jedním enantiomerem, popřípadě s následnou stereoselektivní vratnou syntézou chirálního aminu v pouze jedné konfiguraci.

Pod pojmem omega-aminokyselina transaminázy se rozumějí jakékoliv enzymy, které jsou schopné převádět terminální skupinu vzorce -CHr-NH₂ omega-aminokyseliny na skupinu vzorce -CH=O.

Enzymatickou rovnovážnou reakci, které se využívá při způsobu podle vynálezu, je možno znázornit takto:

nh2	omega-aminokyselina	O
1 amino	transmináza	II
R1 - CH - R2 + akceptor	->	R1 - C - R2 + amino
	<—	donor

kde každý ze symbolů

R¹ a R² jednotlivě představuje alkyl- nebo arylskupinu popřípadě substituovanou jednou nebo více enzymaticky neinhibujícími skupinami a R¹ se liší od R² buď strukturou, nebo chiralitou nebo

R¹ a R² dohromady představují uhlovodíkový řetězec se 4 nebo více atomy uhlíku obsahující centrum chirality.

Pod výrazem „aminoakceptor“ se v tomto popisu rozumějí různé karbonylové sloučeniny podrobněji charakterizované dále, které jsou schopny přijmout aminoskupinu ze znázorněného aminu působením omega-aminokyselina trans-aminázy. Pod označením „aminodonor“ se rozumějí různé aminosloučeniny podrobněji charakterizované dále, které jsou schopny poskytnout aminoskupinu znázorněnému ketonu, čímž se z nich stanou karbonylové sloučeniny, rovněž působením stejné omega-aminokyselina transaminázy.

Enzymatická reakce, znázorněná shora, je charakteristická především tím, že omega-aminokyselina transamináza působí na primární amin, v němž aminoskupina není v terminální (omega) poloze. Za druhé, transamináza působí na amin, který nemusí být aminokyselinou. Za třetí, aminový produkt spotřebovaný při enzymatické transformaci není nevratně metabolizován, nýbrž je možno ho stereoselektivně znovu převést na výchozí amin s jednotnou chiralitou.

Předmětem vynálezu je způsob enantiomerického obohacování směsi dvou enantiomerických chirálních aminů obecných vzorců IA a IB

NH_O • c.

R¹ R²

(IA) (IB) kde

R¹ a R² představují alkyl- nebo arylskupiny, popřípadě substituované enzymaticky neinhibující skupinou, přičemž R¹ se odlišuje od R² strukturou nebo chiralitou, ve prospěch jednoho z těchto chirálních aminů, jehož podstata spočívá v tom, že se výše uvedená směs chirálních aminů uvádí ve vodném prostředí a v přítomnosti aminoakceptoru do styku s omega-aminokyselina transaminázou, která je enzymaticky aktivní vůči znázorněné aminoskupině jednoho z uvedených chirálních aminů, tak dlouho, dokud se podstatné množství jednoho z těchto chirálních aminů nepřevede na keton obecného vzorce II (Π) kde R¹ a R² mají stejný význam jako u výchozího aminu; a potom se popřípadě keton vzorce II izolovaný z vodného prostředí nezávisle uvádí do styku s omega-aminokyselina transaminázou v přítomnosti aminodonoru přinejmenším tak dlouho, dokud se nevytvoří stejná chirální forma, jako byla forma na počátku převáděná na keton, v množství podstatně převyšujícím množství druhé chirální formy.

Vynález je založen na objevu, že omega-aminokyselina transamináza se ve svém působení neomezuje na omega-aminoskupiny a kromě toho je značně nebo výlučně stereoselektivní pokud se týče aminů, které patří do shora definované třídy, a převádí pouze jednu chirální formu aminu na odpovídající keton, který již není chirální (přinejmenším s ohledem na karbonylový atom uhlíku) a potom tento keton převádí na pouze jedinou chirální formu aminu.

Pod pojmem „enantiomerické obohacování“ se zde rozumí zvyšování množství jednoho enantiomeru vzhledem k množství druhého enantiomerů. Při enantiomerickém obohacování může docházet 1) k poklesu množství jedné chirální formy ve srovnání s druhou, 2) ke zvýšení množství jedné chirální formy ve srovnání s druhou nebo 3) k poklesu množství jedné chirální formy a ke zvýšení množství druhé chirální formy. Účelným pojmem pro vyjádření enantiomerického obohacení je pojem nadbytku enantiomerů (ee), který je definován rovnicí kde

E¹ představuje množství první chirální formy aminu a

E² představuje množství druhé chirální formy stejného aminu.

Je-li tedy počáteční poměr obou chirálních forem 50 : 50 a dosáhne se enantiomerického obohacení poskytujícího výsledný poměr 50 : 30, je hodnota nadbytku enantiomerů ee vzhledem

-4 CZ 283867 B6 k první chirální formě 25 %, zatímco když se dosáhne výsledného poměru enantiomerů 70 : 30, je hodnota ee vzhledem k první chirální formě 40 %. Za použití způsobu podle tohoto vynálezu se obvykle může dosáhnout hodnot ee 90 % nebo vyšších.

Pod výrazem „podstatně vyšší“, jak se ho používá v tomto popisu v souvislosti s vyjádřením množství jedné chirální formy aminu vzhledem k množství druhé chirální formy aminu při stereoselektivní syntéze tohoto aminu, se rozumí množství vyjádřené poměrem obou chirálních forem alespoň asi 3 : 1, což odpovídá hodnotě ee alespoň asi 50 %.

Chirální aminy obecného vzorce IA a IB používané při způsobech podle vynálezu, mají několik strukturních omezení. Za prvé, aminoskupina v nich obsažená je primární, ale musí být vázána k sekundárnímu atomu uhlíku, tj. k atomu uhlíku nesoucímu jeden atom vodíku a dva substituenty, které jsou odlišné od vodíku (R¹ a R²). Za druhé, R¹ a R² se sice volí ze struktur stejného typu, ale tyto skupiny musí dodávat molekule chiralitu, tj. R¹ se nutně musí lišit od R“ ve struktuře nebo chiralitě nebo R¹ a R² musejí dohromady představovat chirální skupinu. Pokud jsou R¹ a R² nezávislé skupiny, jedná se obvykle o alkyl-, aralkyl- nebo arylskupiny, přednostně alkylskupiny s přímým nebo rozvětveným řetězcem obsahujícím 1 až 6 atomů uhlíku, fenylalkylskupiny s přímým nebo rozvětveným řetězcem obsahujícím 7 až 12 atomů uhlíku nebo o fenyl nebo nafitylskupinu. Jako příklady těchto skupin je možno uvést methyl-, ethyl-, npropyl-, isopropyl-, η-butyl-, isobutyl-, sek.-butyl-, fenyl-, benzyl-, fenethyl-, 1-fenethyl2-fenylpropylskupinu, atd. Kromě toho, poněvadž enzymatické reakce pole vynálezu zasahuje znázorněnou aminoskupinu a přilehlý atom uhlíku, může být každá ze skupin R¹ a R popřípadě substituována jednou nebo více skupinami, za předpokladu, že se nejedná o skupiny inhibující enzymy, tj. skupiny, které by významněji ovlivňovaly účinek transaminázy nebo s ním soutěžily, když se chirálních aminů nebo ketonů, které tyto skupiny nesou, používá v praktických koncentracích. To se může snadno určit jednoduchou zkouškou inhibice. Když se zjistí inhibice, může se často minimalizovat prováděním reakce při nízkých koncentracích reakčního činidla. Jako typické substituenty, na něž se však navrhované řešení neomezuje, je možno uvést halogeny, jako je chlor, fluor, brom a jod, hydroxy-, nižší alkyl-, nižší alkoxy-, nižší alkylthio-, cykloalkyl-, karbamoylskupina, mono- a di-(nižšíalkyl)substituované karbamoylskupina, trifluormethyl-, fenyl-, nitro-, aminoskupina, a di-(nižšíalkyl)substituovaná aminoskupina, alkylsulfonyl-, arylsulfonyl-, alkylkarboxamido-, arylkarboxamidoskupina, atd.

Jako typické skupiny ve významu R¹ a R² dohromady, je možno uvést methylbutan-l,4-diyl-, pentan-l,4-diyl-, hexan-1,4-diyl-, hexan-l,5-diyl- a 2-methylpentan-l,5-diylskupinu.

Jako neomezující příklady typických aminů, které jsou vhodné pro způsob pole vynálezu, je možno uvést 2-aminobutan, 2-am i no-1 -butanol, 1-amino-l-fenylethan, l-amino-l-(2methoxy-5-fluorfenyl)ethan, 1-amino-l-fenylpropan, l-amino-l-(4-hydroxyfenyl)propan, 1amino-l-(4-bromfenyl)propan, l-amino-l-(4-nitrofenyl)propan, l-fenyl-2-aminopropan, 1(3-trifluormethylfenyl)-2-aminopropan, 2-aminopropanol, 1-amino-l-fenylbutan, l-fenyl-2aminobutan, l-(2,5-dimethoxy-4-methylfenyl)-2-aminobutan, l-fenyl-3-aminobutan, 1—(4— hydroxyfenyl)-3-aminobutan, l-amino-2-methylcyklopentan, l-amino-3-methylcyklopentan, l-amino-2-methylcyklohexan a l-amino-l-(2-naftyl)ethan.

Způsob podle vynálezu v nejširším smyslu zahrnuje postup, při němž se směs chirálních aminů podrobuje působení omega-aminokyselina transaminázy, která je enzymaticky aktivní (vzhledem ke znázorněné aminoskupině alespoň jednoho z uvedených chirálních aminů) v přítomnosti aminoakceptoru.

kh₂ nh₂ , Κ²Ρ·0 —R¹ •· •·

ΗH (ΙΑ)(IB) atnino akceptor_____ omega-amino kyselina transaminéza

O NH₂

R^-C-K² + R^c^R⁴

H (II) (III1 kde R¹ a R² mají shora definovaný význam a ve vzorci obecného vzorce III, R³ buď představuje R¹, zatímco R⁴ znamení R² nebo R³ představuje R², zatímco R⁴ znamená R¹.

Enzymatický proces obvykle probíhá pouze u jedné chirální formy nebo probíhá u jedné chirální formy v mnohem větším rozsahu než u druhé. Tak například v případě R,S-l-amino-lfenylethanu (R¹ = fenyl, R² = methyl), pouze S-forma přechází na odpovídající nechirální keton, acetofenon, přičemž R-l-amino-l-fenylethan zůstává nezměněn. Podobně u R,S-l-amino-l(4-bromfenyl)ethanu (R¹ = 4-bromfenyl, R² = methyl), se S-forma konvertuje na nechirální keton, 4-bromacetofenon, zatímco R-l-amino-l-(4-bromfenyl)ethan zůstává nezměněn. U R,S-l-fenyl-3-aminobutanu (R¹ = fenethyl, R² = methyl), se S-forma snadno konvertuje na nechirální l-fenylbutan-3-on, zatímco R-forma l-fenyl-3-aminobutanu se konvertuje na 1fenylbutan-3-on v rozsahu 0,05 násobném nebo ještě nižším vzhledem k S-formě.

V některých případech je možno přidělit chirálním aminům R- a S-konfiguraci a identifikovat, který se převede na keton a který ne. Označení R- a S-konfigurací se však provádí podle CahnIngoid-Prelogovy methody a závisí na předem přidělených hodnotách pro R¹ a R² podle určení posloupnosti substituentů (sekvenčního pravidla). V důsledku toho není vždy možné u chirálního aminu, na který enzym působí, označit a priori chiralitu pomocí konfigurace R a S. Přidělení Ra S-konfigurace chirálnímu aminu obecného vzorce III bude tedy sice závislá na nadřazenosti substituentů R³ a R⁴ podle pravidla posloupnosti, ale konfigurace chirálního aminu obecného vzorce III bude totožná s jedním a pouze s jedním zenantiomerů IA a IB. Tak například, jak již bylo uvedeno výše, S-forma 1-amino-l-fenylethanu se převede na nechirální keton, acetofenon, přičemž R-enantiomer zůstane nezměněn. V případě R,S-l-amino-l-fenyl-2-hydroxyethanu (fenylglycinolu) dojde ke konverzi enantiomeru se stejnou absolutní konfigurací, jako má 1amino-2-fenylethan, ale v důsledku použití pravidla posloupnosti substituentů, je tento isomer označen písmenem R.

Vzhledem k tomu, že reakce je rovnovážná, může postupovat oběma směry. Povzbuzení reakce v žádoucím směru je provést přídavkem dalších výchozích látek nebo odstraňováním reakčních produktů. Tak například, má-li se obohatit směs dvou chirálních forem aminu o jeden z enantiomerů, může se přidávat další množství akceptoru aminu (až do nasycení) a/nebo se může vytvořený keton kontinuálně odvádět z reakční směsi. Když se naproti tomu stereoselektivně syntetizuje jedna chirální forma aminu, může se přidávat další keton (až do nasycení) a/nebo se může odstraňovat vytvořený amin.

Když se nežádoucí chirální forma aminu konvertuje na keton a požadovaná chirální forma nikoliv, může se požadovaná chirální forma snadno izolovat konvenčními postupy.

Částečnou separaci je možno provést tak, že se směs okyselí, extrahuje uhlovodíkem, jako heptanem, by se odstranil keton, vodná fáze se zalkalizuje a reextrahuje uhlovodíkem, jako heptanem.

-6CZ 283867 B6

Vedlejší produkty, které se přitom izolují jsou často samy o sobě cennými komoditami. Když se například postup provádí tak, aby se enantiomericky obohatila směs R-2-aminubutanu a S-2aminobutanu (R¹ = ethyl, R² = methyl) o R-chirální formu, převede se S—chirální forma na methylethylketon, což je samo o sobě užitečné organické rozpouštědlo.

Když jsou naproti tomu žádoucí obě formy aminu, může se ta forma, která se převede na keton, odstraňovat z reakční směsi (nebo z vodné fáze ve dvoufázové směsi) a nezávisle podrobovat účinku omega-aminokyselina transaminázy v přítomnosti aminodonoru, aby vznikla stejná chirální forma, která byla původně převáděna na keton. Tak například, když se vychází ze směsi R,S-l-amino-l-fenylethanu (R¹ = fenyl, R² = methyl), S-forma se konvertuje omega-amino kyselina transaminázou na odpovídající nechirální keton, acetofenon, přičemž R-l-amino-1fenylethan zůstává nezměněn. R-l-amino-l-fenylethan se snadno izoluje z reakční směsi shora popsaným způsobem a acetofenonový vedlejší produkt se potom podrobí působení transaminázy v přítomnosti aminodonoru za vzniku S-l-amino-l-fenylethanu v podstatě vyšším procentickém množství ve srovnání s R-formou.

Aminoakceptory jsou ketokarboxylové kyseliny, alkanony nebo látky, z nichž se tyto sloučeniny vytvářejí in šitu. Jako typické příklady ketokarboxylových kyselin je možno uvést a-ketokarboxylové kyseliny, jako je kyselina glyoxalová, kyselina pyrohroznová, kyselina oxaloctová apod. ajejich soli. Typickým alkanonem je butan-2-on.

Používat je možno také jiných látek, které lze převádět na aminoakceptory jinými postupy za použití enzymů nebo celých buněk. Jako příklady látek, které je možno konvertovat na tyto aminoakceptory, je možno uvést kyselinu fumarovou (která rychle přechází in šitu na kyselinu oxalooctovou), glukózu (která se konvertuje na pyruvát), laktát, kyselinu maleinovou atd.

Aminodonory jsou aminy zahrnující nechirální aminokyselinu glycin a chirální aminokyseliny mající S-konfiguraci, jako je L-alanin nebo kyselina L-aspartová. Může se také použít aminů, jak chirálních tak nechirálních, které nejsou aminokyselinami, jako S-2-aminobutanu, propylaminu, benzylaminu, atd.

Omega-aminokyselina transaminázy, užitečné při způsobech podle vynálezu, jsou známé enzymy závislé na pyridoxalfosfátu, které jsou přítomny v různých mikroorganismech, jako je Pseudomonas, Escherichia, Bacillus, Saccaromyces, Hansenula, Candida, Streptomyces, Aspergillus a Neurospora. Dvě omega-iminokyselina transaminázy, které jsou obzvláště užitečné při způsobech podle vynálezu, EC 2.6.1.18 a EC 2.6.1.19, byly připraveny v krystalickém stavu a charakterizovány Yonahou a dalšími, viz Agric. Biol. Chem., 47 (10), 2257 - 2265 (1983).

Mikroorganismy, které mají požadovanou aktivitu, je možno snadno izolovat pomocí chemostatové kultury, tj. kultivací v konstantním, ale omezeném chemickém prostředí s aminoakceptorem a s aminem, jako jediným zdrojem dusíku. Aminem může být, ale nemusí chirální amin, poněvadž v normálním prostředí omega-aminokyselina transaminázy metabolizují primární aminy. Z nechirálních aminů, kterých bylo s úspěchem použito pro tvorbu omegaaminokyselina transamináz, je možno uvést n-oktylamin, cyklohexylamin, 1,4-butandiamin,

1,6-hexandiamin, 6-aminohexanovou kyselinu, 4-aminomáselnou kyselinu, tyramin a benzylamin. Úspěšné bylo použito i chirálních aminů, jako 2-aminobutanu, α-fenethylaminu a 2amino-4-fenylbutanu, stejně tak jako aminokyselin, jako je L-lysin, L-omithin, β-alanin a taurin.

Takovými postupy se kultura obohatí o mikroorganismy produkující požadované omega-aminokyselina transaminázy. Tak například jedna taková chemostatová kultivace za použití náhodných vzorků půdy, které neměly žádnou zvláštní historii, pokud se týče expozici aminům, byla prováděna po dobu přibližně jednoho měsíce. Jako dominantní mikroorganismus byl potom

-7CZ 283867 B6 nezávisle identifikován v Američan Type Culture Collection Bacillus megaterium, který se podstatně neodlišoval od známých kmenů a byl jim podobný, pokud se týče fenotypu.

Takto izolované organismy se mohou nechat růst různými způsoby. Předně se může použít standardního solného média doplněného fosfátovým pufrem, octanem sodným, jako zdrojem uhlíku, 2-ketoglutarátem, jako aminoakceptorem a sloučeninou obsahující dusík, jako je npropylamin, n-oktylamin, 2-aminobutan, 2-aminoheptan, cyklohexylamin, 1,6-hexandiamin putrescin, 6-aminohexanová kyselina, 4—aminomáselná kyselina, L-lysin, L-omithin, β-alanin, a-fenethylamin, l-fenyl-3-aminobutan, benzylamin, tyramin, taurin, atd.

Alternativně se může mikroorganismus nechat růst za použití aminu, jako jediného zdroje uhlíku, čímž se růst omezí na ty organismy, které jsou schopny pro získání uhlíku katabolizovat amin.

Za třetí, mikroorganismus se může nechat růst v prostředí obsahujícím jantaran sodný, octan sodný nebo jakýkoliv jiný zdroj uhlíku a amonnou sůl nebo proteinový hydrolyzát, jako hlavní zdroj dusíku, k němuž se potom přidá, buď na začátku růstu, nebo v jeho průběhu, amin, jako 2aminobutan, l-fenyl-3-aminobutan, α-fenethylamin, atd., pro indukci produkce požadované transaminázové aktivity.

Skutečná enzymatická konverze se může provádět konvenčními kultivačními postupy v přítomnosti chirálního aminu, za použití izolovaných, ale nerostoucích buněk, nebo tak, že se chirální aminy uvedou do styku s rozpustným omega-aminokyselinatransaminázovým přípravkem.

Omega-aminokyselina transamináza může být ve volné formě, buď jako extrakt neobsahující buňky, nebo přípravek obsahující celé buňky, uvedený shora, nebo ve formě immobilizované na vhodném nosiči či matrici, jako je zesíťovaný dextran nebo agaróza, oxid křemičitý, polyamid nebo celulóza. Může být také zapouzdřena v polyakrylamidu, alginátech, vláknech apod. Způsoby immobilizace jsou popsány v literatuře (viz například Mathods of Enzymology, 44, 1976). Metodám za použití immobilizovaného enzymu se dává přednost, poněvadž po immobilizaci enzymu stačí již jen přes tento enzym vést aminoakceptor a směs chirálních aminů, aby došlo k požadovanému obohacení a odvádět vytvořený keton, způsobem popsaným shora.

I když to není nezbytně nutné, je často výhodné zvyšovat rychlost konverze přídavkem zdroje pyridoxaminu, jako pyridoxalfosfátu k reakční směsi.

Použité postupy a materiály jsou dále ilustrovány typickými příklady.

Aktivita enzymu: Aktivita enzymu se vyjadřuje v jednotkách/mg. Jednotka aktivity enzymu je definována jako aktivita, která je schopna vyprodukovat 1 μηιοί ketonu za minutu. Za účelem dosažení jednotnosti se aktivita měří, jakožto počet pmol l-fenylbutan-3-onu vyrobených z R,S-l-fenyl-3-aminobutanu. Pro měření hodnot aktivity omega-aminoky selina transamináz uvedených v následujících příkladech se používá následujícího standardizovaného testu.

Známý objem zkoušeného enzymatického přípravku se inkubuje při 37 °C a pH 7 v roztoku následujícího složení:

pyruvát sodný 100 mM

R,S-l-fenyl-3-aminobutan 30 mM pyridoxalfosfát 0,5 mM

Odebere se vzorek a přidá se k němu v množství 20 % jeho objemu 12% vodná kyselina trichloroctová. Vysrážený protein se oddělí odstředěním a koncentrace l-fenylbutan-3-onu v supematantu se stanová kapalinovou chromatografií na 100 x 8 mm 4 pm Novopak fenyl sloupci. Eluce

-8CZ 283867 B6 se provádí 40 % isopropanolu a 0,09 % kyseliny fosforečné ve vodě. Za těchto podmínek se 1fenylbutan-3-on eluuje za 5,3 minuty.

Čistota aminů: Čistota vyrobených aminů se stanovuje plynovou chromatografií na 1,83 x 2 mm chrom Q sloupci 10 % SE-30 na nosiči 100/120 mesh (125 až 150 μτη) pri 210 °C při průtoku nosného plynu 10 ml/min.

Stanovení enantiomerického obohacení: Hodnota ee daného produktu se stanoví reakcí s (-) a(trifluormethylfenyl)methoxyacetylchloridem (viz Gal, J. Pharm. Sci., 66, 169 (1977) a Mosher a další, J. Org. Chem., 34, 25430 (1969) následovanou kapilární plynovou chromatografií derivatizovaného produktu na koloně Chrompack z taveného křemene.

Standardní solné médium: Vhodné solné médium pro mikrobiální transformace popsané v následujících příkladech má toto složení:

MgSO₄

CaCl₂

ZnSO₄.7H₂O

MnSO₄.4H₂O

H3BO3

CuSO₄.5H₂O

CoC1₂.6H₂Ó

NíC1₂.6H₂O

FeSO₄

NaMoO₄ Fe EDTA

KH₂PO₄

NaOH

1,00 g/1

0,021 g/1

0,20 mg/1

0,10 mg/1

0,02 mg/1

0,10 mg/1

0,05 mg/1

0,01 mg/1

1,50 mg/1

2,00 mg/1

5,00 mg/1 20,00 mM do pH 7

Složení solného média nemá rozhodující důležitost, ale bylo standardizováno, aby bylo eliminováno jakožto proměnná hodnota.

Mikroorganismy: Kultury byly buď získány z označené sbírky, nebo byly izolovány popsaným způsobem a potom nezávisle identifikovány.

Obohacování mikroorganismů produkujících omega-aminokyselina transaminázu: Ve standardním solném médiu se udržuje chemostat s 5 g/1 R,S-2-aminobutanu a 10 mM 2-ketoglutarátu při rychlosti ředění 0,03/h. Chemostat se naočkuje a udržuje v provozu asi 1 měsíc při 37 °C a pH 6,8 až 7,0. Kmeny, které se vyvinou se izolují a nechají růst na minimálním agaru obsahujícím solné médium doplněné 10 mM 2-ketoglutarátu a 5 mM R,S—l-fenyl-3-aminobutanu.

Izolace enzymu: Pokud není uvedeno jinak, buňky z kultury se 10 minut odstřeďují při 10 000 G, resuspendují se v 10 mM fosfátovém pufru o pH 7 a 0,5 mM pyridoxal fosfátu a rozdrtí se dvěma průchody chlazeným francouzským lisem pracujícím při 103 MPa. Rozdrcené buňky se oddělí jednohodinovým odstřeďováním při 10 000 G a supematant obsahující enzym se uschová.

Vynález je blíže osvětlen v následujících příkladech provedení. Příklady mají výhradně ilustrativní charakter a rozsah vynálezu v žádném ohledu neomezují. Pro rozsah vynálezu je určující jen definice předmětu vynálezu.

-9CZ 283867 Β6

Příklad 1

Růst mikroorganismů produkujících omega-aminokyselina transaminázu za použití aminodonoru jako jediného zdroje dusíku je ilustrován následujícím příkladem.

Bacillus megaterium se nechá růst ve 3 litrové třepací láhvi (otáčky 200 min^-1) po dobu 17 hodin při 30 °C za použití 1 litru shora uvedeného solného roztoku, 60 mM octanu sodného, 30 mM fosfátového pufru, 30 mM 2-Ketoglutarátu dvojsodného a 100 mM n-propylaminu, jako zdroje dusíku. Když kultura dosáhne hustoty 0,6 g sušiny na litr buňky se oddělí a shora uvedeným způsobem se z nich izoluje enzym. Specifická aktivita omega-aminokyselina transaminázy, která se takto získá je vyšší než 0,49 jednotky/mg.

Kmen Bacillus megaterium použitý v předchozím postupu byl získán ze vzorků půdy s žádnou zvláštní historií, pokud se týče expozici aminům, naočkováním chemostatu popsaného shora a izolací dominantních organismů (těch, které jsou schopny růstu na R,S-l-fenyl-3-aminobutanu). Kmen byl nezávisle identifikován v Američan Type Culture Collection jako Bacillus megaterium, který se významně neliší od známého kmene ATCC č. 14581 a který je fenotypově podobný ATCC 49097B.

Příklad 2

V tomto příkladu je ilustrován růst mikroorganismů produkujících omega-aminokyselina transaminázu za použití aminodonoru, jako jediného zdroje uhlíku.

Pseudomonas aeruginosa ATCC 15692 se nechá růst na β-alaninu, jakožto jediném zdroji uhlíku, způsobem, který popsali Way a další ve FEMS Micro. Lett., 34, 279 (1986). Buněčné extrakty obsahující omega-aminokyselina transaminázu se získají shora popsaným způsobem. Při zkoušení prováděném shora popsaným způsobem se zjistí, že specifická aktivita omegaaminokyselina transaminázy je 0,040 jednotky/mg.

Příklad 3

Pseudomonas putida ATCC 39213 se kultivuje způsobem popsaným v příkladu 1 a podle tohoto příkladu se postupuje i při získávání extraktu z buněk. Specifická aktivita omega-aminokyselina transaminázy je 0,045 jednotky/mg.

Příklad 4

V tomto příkladu je demonstrována potřeba aminoakceptoru.

Enzymové extrakty z Pseudomonas putida, Bacillus megaterium a Pseudomonas aeruginosa získané shora uvedeným způsobem se zkoušejí při pH 9 v 50 mM tris/HCl za použití 30 mM R,S-l-fenyl-3-aminobutanu buď v přítomnosti, nebo v nepřítomnosti 100 mM pyruvátu sodného. Dosáhne se následujících relativních rychlostí přeměny.

__________________relativní rychlost přeměny__________________ P, putida B. megaterium P. aeruginosa v přítomnosti pyruvátu 100 100 100 v nepřítomnosti pyruvátu 0 0 0

-10CZ 283867 B6

Transaminázová povaha enzymatického účinkuje zřejmá způsobení „sebevražedných inaktivátorů“, o nichž je známo, že jsou pro transaminázy specifické (viz například Bumett a další, J. Bio. Chem. 225, 428 až 432, 1980). Inaktivátor (0,5 mM) se předběžně inkubuje se zkušebním médiem před přidáním R,S— l-fenyl-3-aminobutanu.

relativní rychlost přeměny

Inaktivátor	P. putida	B. megaterium P. aeruginosa
žádný gabakulin hydroxylamin	100 0 3	100 100 13 0 10 0
Stereoselektivita omega-amino kyselina transaminázy je zřejmá z výsledků následující zkoušky za použití 15 mM R-l-feny 1-3-aminobutanu (s pyruvátem).

___________relativní rychlost přeměny_____________ P, putida B. megaterium P. aeruginosa

R, S— 1 -feny 1-3-aminobutan	100	100	100
R-1 -feny 1-3-aminobutan	3	15	4

Příklad 5

V tomto příkladu je ilustrován růst mikroorganismů za použití amonia, jako jediného zdroje dusíku, přičemž se indukce produkce omega-aminokyselina transaminázy provede přídavkem aminu.

Bacillus megaterium se nechá růst v 1 litrových kulturách ve standardním solném médiu doplněném 40 mM zdroje uhlíku, uvedeného v následující tabulce, 5 mM chloridu amonného, 80 mM fosfátového pufru a 2 mM aminu, jako indukčního činila, uvedeného v následující tabulce. Po 30 až 40 hodinách se enzym izoluje a zkouší shora popsaným způsobem.

specifická aktivita (jednotky/mg)

zdroj uhlíku	sukcinát	acetát	glukonát	glukóza
R,S-l-fenyl-l-aminoethan	0,27	0,39	n.t.	n.t.
R-l-fenyl-l-aminoethan	0,27	0,36	n.t.	n.t.
R,S-l-fenyl-3-aminobutan	0,28	0,33	0,2	0,62
R-l-fenyl-3-aminobutan	0,21	0,26	n.t.	n.t.
R, S-2-aminobutan	0,13	0,14	n.t.	n.t.
R-2-am inobutan	0,06	0,13	n.t.	n.t.
tyramin	n.t.	0,24	n.t.	n.t.

n.t. = nezkoušeno

Příklad 6

V následujícím příkladu je ilustrován růst mikroorganismů za použití zdroje bohatého na proteiny a následující indukce produkce omega-aminokyselina transaminázy přídavkem aminu.

Bacillus megaterium se nechá růst ve 121 litrovém fermentoru při pH 7 a teplotě 30 °C a shora uvedeném solném médiu doplněném 10g/l casamino kyselin. Obsah fermentoru se míchá

-11CZ 283867 B6 *·Ί

J i

Λ '?} $ a provzdušňuje. Ke směsi se postupně přidá octan sodný až do výsledné koncentrace 120 mM.

V tomto okamžiku je hustota buněk 3 g sušiny na 1 litr, l-fenyl-3-aminobutan se přidává až do celkové koncentrace 10 mM. Po 12 hodinách se enzym oddělí a zkouší shora popsaným způsobem. Jeho specifická aktivita je 0,49 jednotek/mg.

Příklad 7

V tomto příkladu je ilustrováno použití rozpustného enzymového přípravku pro enantiomerické 10 obohacování racemátu chirálního aminu.

Omega-aminokyselina transaminázový přípravek se získá způsobem popsaným v příkladu 1 z Bacillus megaterium. Jeho specifická aktivita zjištěná shora popsaným zkoušením činí 0,375 jednotky/mg. Ke 25 ml roztoku 26,4 mg tohoto enzymového přípravku, který navíc 15 obsahuje 0,4 mM pyridoxalfosfátu a 40 mM fosforečnanu sodného, se přidá 20 mM R,S-1amino-l-fenylethanu a 100 mM pyruvátu sodného, jako aminoakceptoru. Roztok se inkubuje 150 minut při pH 7 a 30 °C a pak se zalkalizuje (pH> 12) přídavkem 2,5 ml 2N hydroxidu sodného. Roztok se extrahuje n-heptanem a extrakty se odpaří. Získá se 30,8 mg (49 % konverze) R-l-amino-l-fenylethanu s hodnotou ee 96,4 %.

Příklad 8

V tomto příkladu je ilustrováno použití rozpustného enzymového přípravku pro enantiomerické 25 obohacování racemátu chirálního aminu.

Postupuje se způsobem podle příkladu 7 s tím rozdílem, že se místo R,S-l-amino-l-fenylethanu použije některého z dále uvedených racemátů:

Výchozí látka

a) R,S-l-fenyl-l-aminobutan

b) R,S-l-amino-l-(4-bromfenyl)ethan

c) R,S-l-fenyl-2-aminopropan

d) R,S-l-amino-l-fenylethan

e) R,S-A-(4-methoxyfenyl)-2-aminobutan

f) R,S-5-(3-pyridyl)-2-aminopentan

Produkt

40	ee	% konverze
a) R-l-fenyl-3-aminobutan	98,4	60
b) R-l-amino-l-(4-bromfenyl)-ethan	97,6	49
c) R-l-fenyl-2-aminopropan	98,6	49
d) R-l-amino-l-fenylethan	99	52
45 e) R-4-(4-methoxyfenyl)-2-aminobutan	99	58
f) R-5-(3-pyridyl)-2-aminopentan	99	49

Příklad 9

V tomto příkladu je ilustrováno použití nerostoucích buněk pro enantiomerické obohacování racemátu chirálního aminu.

-12CZ 283867 B6

Buňky ze tří jedno litrových kultur Bacillus megaterium, které byly ponechány růst 33 hodin způsobem popsaným v příkladu 1 na 6 mM R,S-l-fenyl-3-aminobutanu, jako jediném zdroji dusíku se oddělí odstředěním a promyjí resuspendováním ve 250 ml 10 mM fosfátového pufru (pH 6,8) a odstředěním.

Buněčná peleta se resuspenduje v 0,6 litru 10 mM fosfátového pufru (pH 6,8) obsahujícího 10 mM R,S-l-fenyl-3-aminobutanu a 50 mM oxaloctové kyseliny, jako aminoakceptor. Po inkubaci v oběhovém (orbitálním) inkubátoru při 30 °C po dobu 4 hodin se roztok zalkalizuje a extrahuje heptanem způsobem popsaným v příkladu 7. Získá se R-l-fenyl-3-aminobutan s optickou čistotou 97,9 %, což odpovídá hodnotě ee 95,8.

Příklad 10

V následujícím příkladu je ilustrováno použití rostoucích buněk pro enantiomerické obohacování racemátu chirálního aminu a použití aminoakceptorového prekurzoru.

Šestilitrové inokulum Bacillus megaterium, vyrobené v podstatě způsobem popsaným v příkladu 1, ale za použití 10 mM R,S-l-fenyl-3-aminobutanu, jakožto jediného zdroje dusíku, se kultivuje ve 120 1 shora uvedeného solného média doplněného 30 mM fumarátu, jako aminoakceptorového prekurzoru. 22 hodin po inokulaci se přidá dalších 30 mM fumarátu a po 6 hodinách se kultura sklidí odstraněním buněk ultrafiltrací na membráně Romicon PM100. Roztok se zalkalizuje a extrahuje heptanem způsobem popsaným v příkladu 7. Získá se tak R-l-fenyl-3aminobutan v čistotě 99,5 %, což odpovídá hodnotě ee 96,4 %.

Příklad 11

Následující příklad ilustruje relativní rychlosti přeměny, stanovené přímo nebo vypočítané z kinetických dat různých chirálních aminů za použití rozpustných enzymatických přípravků. Zkoušení se provádí shora popsaným způsobem, při němž se pouze mění chirální amin. Výsledky jsou uvedeny v následující tabulce:

relativní rychlost přeměny

amin (R,S)	konc. (mM)	R-enantiomer	S-enantiomer
1 -fenyl-1 -aminoethan	10	0	100
1 -feny 1-3-am inobutan	30	5	100
1 -(4-bromfeny 1)— 1 -aminoethan	30	0	100
l-(a-naftyl)-l-aminoethan	10	0	100
fenylglycinol	10	100	0
2-aminooktan	5	0	100
5—(3—pyridyl)—2-aminopentan	5	0	100
l-(4-nitrofenyl)—2-aminopropan	5	0	100
3-fenyl-2-amino-propan	15	7	100
1 -feny 1-1 -am i nopropan	20	11	100
3-fenyl-2-aminopropan	10	100	0

Příklad 12

V tomto příkladu jsou ilustrovány relativní rychlosti přeměny l-fenyl-3-aminobutanu za použití různých aminoakceptorů místo pyruvátu při zkoušení prováděném shora popsaným způsobem. Výsledky jsou uvedeny v následující tabulce:

-13CZ 283867 B6 akceptor koncentrace (mM)relativní rychlost přeměny

pyruvát	20	100
oxaloacetát	20	100
heptaldehyd	25	80
glyoxalát	20	50
2-ketobutytár	25	21
butan-2-on	20	20
acetaldehyd	20	50
propionaldehyd	20	100
butyraldehyd	20	90
benzaldehyd	25	17
2-pentanon	25	33
cyklopentanon	25	12
cyklohexanon	25	23
hydroxypyruvát	25	18
Jako aminoakceptor je také	účinný acetofenon, i	i když jeho účinnost je podstatně nižší (relativní

rychlost < 10).

Příklad 13

V tomto příkladu je ilustrováno enantiomerické obohacování za použití rozpustného enzymatického přípravku s kontinuální extrakcí obohaceného produktu.

Rozpustný enzymatický přípravek se získá z Bacillus megatarium způsobem popsaným v příkladu 1. Jeho specifická aktivita určená shora uvedenou zkouškou je 0,70 jednotky/mg. Vyrobí se vodná fáze obsahující 450 mg tohoto extraktu, 0,12M pyruvátu sodného, 0,2M R,S-l-fenyl3-aminobutanu, 1 mM pyridoxalfosfátu a 0,5 M fosfátu (pH 7,5). Přidá se 500 ml n-heptanu a dvoufázová směs se po dobu 7 hodin míchá při 22 °C. Hodnota se nastaví na 4,5 přídavkem kyseliny chlorovodíkové a vodná vrstva se oddělí od organické vrstvy. Vodná vrstva se zalkalizuje přídavkem hydroxidu sodného a extrahuje heptanem. Po odstranění heptanu se analýzou zjistí, že zbytek obsahuje 96 % R-l-fenyl-3-aminobutanu.

Příklad 14

Tento příklad ilustruje typickou syntézu chirálního aminu.

Způsobem popsaným v příkladu 1 se z Bacillus megaterium vyrobí rozpustný enzymatický přípravek. Jeho specifická aktivita stanovená shora uvedeným způsobem je 0,58 jednotky/mg. Ke 200 ml vodného roztoku 350 mg tohoto přípravku, 0,4 mM pyridoxalfosfátu a 40 mM fosforečnanu sodného se přidá 4,2 mM l-fenylbutan-3-onu a 100 ml 2-aminobutanu jako aminodonoru. Směs se inkubuje při pH 7 a 30 °C po dobu 4 hodin, přičemž po této době je v reakční směsi přítomen R-l-fenyl-3-aminobutan v koncentraci 3,35 mM, což odpovídá 80 % konverzi. Produkt se izoluje přídavkem 40 ml 10N hydroxidu sodného a extrakcí alkalického vodného roztoku 250 ml n-heptanu. Odpařením heptanových extraktů se získá 100,5 g produktu, který byl analyzován shora popsanou derivatizací. Produkt obsahuje 96,4% S-l-fenyl-3aminobutanu.

-14CZ 283867 B6

Podobně byl S-l-fenyl-2-aminopropan připraven z l-fenylpropan-2-onu při ee 96,4 a ve výtěžku 94,8%. S-l-amino-l-fenylethan byl připraven zacetofenonu při ee 100 a ve výtěžku 44 %.

Příklad 15

V tomto příkladu je ilustrován enzymatická separace a izolace R- a S-enantiomerů.

Za použití inkubace se opakuje postup přípravy R-enantiomeru R,S-l-amino-l-fenylethanu popsaný v příkladu 7. Před alkalizací inkubačního roztoku se však tento roztok extrahuje nheptanem a extrakty se uschovají. Vodná fáze se pak zpracovává způsobem popsaným v příkladu 7, aby se izoloval R-l-amino-l-fenylethan.

Z heptanových extraktů se odpařením získá acetofenon. Když se v podstatě reprodukuje postup uvedený v příkladu 14 s výjimkou použití 2,3 mM acetofenonu místo l-fenylbutan-3-onu, získá se 56 mg S-l-amino-l-fenylethanu (100 %).

Příklad 16

Tento příklad ilustruje použití immobilizovaného enzymu.

Immobilizace se provádí takto: Nosičová matrice (0,4 g) ve formě kotouče o průměru 47 mm Actidisk (FMC Corp.) se umístí v zařízení Millipore Sweenex vybaveném přívodní a odvodní trubkou, peristaltickým čerpadlem a zásobníkem. Matrice se po sobě promývá při teplotě okolí rychlostí 3 ml/min 1) 200 ml 50 mM fosfátového pufru (pH 7) obsahujícího 0,5 mM pyridoxalfosfátu po dobu 20 minut, 2) 11 ml 4,6 mg/ml roztoku enzymu získaného způsobem podle příkladu 1, po dobu 120 minut, 3) 150 ml 0,3 M chloridu sodného v 50 mM fosfátovém pufru (pH 7) obsahujícím 0,5 mM pyridoxalfosfátu, po dobu 30 minut a 4) 200 ml 50 mM fosfátového pufru (pH 7) obsahujícího 0,5 mM pyridoxalfosfátu, po dobu 20 minut.

Obohacování se provádí takto: 140 ml roztoku 10 mM R,S-l-fenyl-3-aminobutanu, 100 M pyruvátu sodného, 0,1 mM pyridoxalfosfátu a 25 mM fosforečnanu draselného (pH 7) se cirkuluje přes shora uvedenou matrici při teplotě místnosti rychlostí 5 ml/minutu. Po dvou hodinách se cirkulující kapalina z přístroje vypustí. Koncentrace vzniklého l-fenylbutan-3-onu je 5,2 mM, zatímco koncentrace R-l-fenyl-3-aminobutanu je 4,8 mM. Hodnota pH se nastaví na 12,5 a R-l-fenyl-3-aminobutan se kvantitativně izoluje extrakcí heptanem. Po odstranění heptanu odpařením se produkt analyzuje. Obsah R-l-fenyl-3-aminobutanu v produktu je 92,8 %.

Claims (11)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Způsob enantiomerického obohacování směsi dvou enantiomerických chirálních aminů obecných vzorců IA a IB

   R^Č^R¹

   H (IA), (IB), kde

   R¹ a R² představují alkyl— nebo arylskupiny, popřípadě substituované enzymaticky neinhibující skupinou, přičemž R¹ se odlišuje od R² strukturou nebo chiralitou, ve prospěch jednoho z těchto chirálních aminů, vyznačující se tím, že se výše uvedená směs chirálních aminů uvádí ve vodném prostředí a v přítomnosti aminoakceptoru do styku s omega-aminokyselina transaminázou, která je enzymaticky aktivní vůči znázorněné aminoskupině jednoho z uvedených chirálních aminů, tak dlouho, dokud se podstatné množství jednoho z těchto chirálních aminů nepřevede na keton obecného vzorce II (II), kde R¹ a R² mají stejný význam jako u výchozího aminu; a potom se popřípadě keton vzorce II izolovaný z vodného prostředí nezávisle uvádí do styku s omega-aminokyselina transaminázou v přítomnosti aminodonoru přinejmenším tak dlouho, dokud se nevytvoří stejná chirální forma, jako byla forma na počátku převáděná na keton, v množství podstatně převyšujícím množství druhé chirální formy.
2. 2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že se kontakt udržuje přinejmenším tak dlouho, dokud není enantiomerický přebytek chirálního aminu, který není převeden na keton, alespoň asi 90 % relativně ke zbývajícímu chirálnímu aminu.
3. 3. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že se chirální amin, který není převeden na keton, izoluje z reakční směsi.
4. 4. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že se z vodného média izoluje podstatné množství ketonu.
5. 5. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že se jako aminoakceptoru použije α-ketokarboxylové kyseliny, alifatického nebo cykloalifatického ketonu, alifatického nebo cykloalifatického aldehydu, nebo látky, která se biochemicky převádí na a-ketokarboxylovou kyselinu in šitu v reakčním prostředí.

   -16CZ 283867 B6
6. 6. Způsob podle nároku 5, vyznačující se tím, že se jako aminoakceptoru použije kyseliny glyoxalové, kyseliny pyrohroznové, kyseliny oxaloctové, její soli nebo heptaldehydu.
7. 7. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že se použije směsi chirálních aminů obecných vzorců IA a IB, kde každý ze symbolů R^l a R² nezávisle představuje přímou nebo rozvětvenou alkylskupinu s 1 až 6 atomy uhlíku, přímou nebo rozvětvenou fenylalkylskupinu obsahující 7 až 12 atomů uhlíku nebo fenyl- nebo naftylskupinu, přičemž každá z těchto skupin je nesubstituovaná nebo substituovaná enzymaticky neinhibující skupinou.
8. 8. Způsob podle nároku 7, vyznačující se tím, že se použije směsi chirálních aminů obecných vzorců LA a IB, kde každý ze symbolů R¹ a R² nezávisle představuje methylethyl-, η-propyl-, isopropyl-, n-butyl-, isobutyl-, sek.butyl-, fenyl-, benzyl- nebo fenethylskupinu.
9. 9. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že se směs chirálních aminů a aminoakceptor uvádí do styku s celými buňkami mikroorganismu, který produkuje omegaaminokyselina transaminázu.
10. 10. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že se směs chirálních aminů a aminoakceptor uvádí do styku s bezbuněčným vodným přípravkem omega-aminokyselina transaminázy.
11. 11. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že se směs chirálních aminů a aminoakceptor uvádějí do styku s omega-aminokyselina transaminázou, immobilizovanou na nosiči.