JPH02501531A - 有機化学品の製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 有機化宇品の製法 本発明は一般式１： ％式％（１） シ、ペンシルまたは低級アルキルチオによりｌｋ換されていてよい低級アルキル を表わすかまたはＲに次の置換基：ヒドロキシ、アミノ、へ口ｒン、カルボキン ｌたは低級アルコキシの１個以上により置換きれていてよいフェニルに、Ｎわす 〕の化合物を完全にμたに部分的にラセミ化する方法に関する。

発明の背景 アミノ酸アミドは化学的、同時に＃集的方法により容易に得られる化合物であり 、かつアミノ酸の衾嚢における前駆体として１要でりる。光字８つに活性アミノ 酸は、たとえはアミノ酸アミドのエナンチオ選択性の＃累加水分解により得らｎ る。こｎ’Ｅで公矧でない、アミノ酸アミドの同量の酵素ラセミ化に、その後ア ミノ酸アミドの、所望の九字活注アミノ数への完全な変換で・可舵であるので、 非富に有利でるると、しわれる。

不Ｉｍ発明で使用さルたように、ステレオ遇玖任（エナンチオ選択性）酵素は、 もっばら１つｌｆｃは２つのエナンチオマーと選択的Ｖこ反応し、それにより各 々光学的に純粋なまたは光学的に活性の生成物を製造する。

立体特異性（エナンチオ特異性）の＃累は、もっばら１つのエナンチオマーとの み反応して、光学的に純粋な生成物を製造する。

光学的に活性のα−■、α−アミノＩ￥ｆは工条的に非常ＶｃＭ要な有シ化合物 の類を構成する。これらの化合物の２つの主要な群は、次のように認められる： ｆｃとえはタンパク質、ペゾテドの成分のような天然で見出される天然アミノ酸 および他の重要な化合物の様々な種類および天然のアミノ酸とある横のｍ造的″ ＃ｆ命は分かちあうが、先物の天然の櫓戚安累ではない、いわゆる非天然アミノ 酸。双方の群のアミノ酸か工粟的通用で１要である。天然に白米するアミノ酸は 従って豊富に食品および飼料添加物としておよび医薬品工莱でたとえに注入衣の 取分として使用芒几る。近年、非天然アミノ酸たとえは糧々の薬学化合物の中間 体として広範囲に使用できることが見出てれた。

式ｌのアミノ酸に、その分子裕造に基づき、アミノ酸分子のいわゆるキラリティ ーに関して典なる２つの別個の形で生じる。与えられたアミノ酸のこれらの２つ の形は、逝冨アミノ葭のＤ−１ｆｃＦｉＬ−形として表わで几る。天然に見出ち ｎるたいていのアミノ酸は、Ｌ−配置でめり、かつ孔当するＤ−共性座〃・カ常 生体ｈ＠中で代謝逼れずかつ通常のＩｖ１１１Ｆ＠代謝および機能を妨害さえす るので、食品および飽科添加物用に使用でれるアミノ酸は、この配置のものであ ることが必須でおる。この結果、これらの非天然アミノ酸はしばしば医薬および 農化学生成物のビルディングブロック（ｂｕｉｌｄｉｎｇ　ｂｌｏｃｋ　）　と して使用笛れる。たとえば、Ｄ−フェニルグリセリンおよびＤ−ｐ−ヒドロキシ フェニルグリセリンに、アンピシリン（／ｕｎｐｉｃｉｌｌｉｎ　）およびアモ キシシリン（Ａｍｏｒｙｃｉｌｌｉｎ　）のような広幅スペクトルの抗先物員の ために使用される。

医薬品、食品および良化字工兼での選択的生地物の増大性要求のために、光学的 に純粋な、卸ちエナンチオマー純粋なり−ならひにＬ−配置のアミノ酸を製造す るために役立つ方法か大いに所望でれ、一方対照的に、２つの形が同量で存在す る動台のラセミ体と称される、上記アミノ酸の２つのエナンチオ形の混合物に工 東的にＦｉお１すｈｅでない。その理由ｒ１２つの光字異性体の１つのみがＦ９ Ｔ望の用途で明らかな活性ｒ示すからである。しかしなから、他の光字異性体は 、活性を示さないか、はとんど示さすｌたは不所望な面の活性を示す。

丸字活性化合物を製造するｆｃＪｏの公知方法にたとえに、発酵、不角合凧およ び化学的１だに酵素的分陰方法でめる。これらに文献に、たとえはＧ、　Ｓｃｈ ｍｉｄｚ−Ｋａａｃｎｅｒ　＆よひＰ、　Ｅｇｅｒｅｒによるｂｉｏｔｅｃｈｎ ｏｌｏｇｙ　。

Ｈｏ−、Ｌ　Ｒｅｈｍ　＆よびＧ、Ｒｅｅｄ　（Ｅｄｓ、　）、ＶｅｒｌａｇＣ ｈｅｍｉｅ　、Ｆｌｏｒｉｄａ−Ｂａｓｅｌ、Ｖｏｌ＋６ａ％ｐｐ、　３８７〜 ４２１（１９８４年）およびＦ、　Ｍ、　Ｍｅ１３ｅｒ　その他によるＳｙｍｐ ｏｓｉｕｍ　Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　：　”’　Ｂｉｏｃａｃａｌｙｓｚｓ　 ｉｎＯｒｇａｎｉｃ　５ｙｎｚｈｅｓｅｓ　”、Ｎｏｏｒｄｗｉｊｋｅｒｈｏｕ ｚ　Ａｐｒｉｌ　１４〜１７．１９８５年、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ　５ｃｉｅｎｃｅ 　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓに記載嘔ｎている。

Ｌ−アミノ酸の製造のたｊｔ）に、いくつかの酵素分解方法および酵素不★合成 の他に、殊に微生物発酵が好適な製法である。従って、今日でに天然アミノ酸の より多くが発酵技術によシ製嚢さｎるが、これらは、天然で生じるＬ−アミノ酸 のＤ−形（わずかな天然に生じるＤ−アミノ酸、たとえｔ′ｉＤ−アラニンは除 く）でろろうと、その化学的紐取によりＣＲ−１！ｉｔ？！に基により）天然で 生じないアミノ酸であろ５と、非天然アミノ酸の製造のためには使用できない。

こ九らの非天然アミノ酸の製造のために、不介合既および化学的またに酵素的分 解のような上記方伝は使用できない。

近年、一般に有憬合取で酵素を使用すること〃・ます！−ｊｌ賛になってきた。

この領域での一晃は酵素が、天然で生じる化合物の合成のための生ＰＢ妹として 生じかつ天然で適用芒れるにもかかわらす、通常天然では行なわないが、■氷化 学者に有利ｒＣ利用される糧々の反応ｌｆｉ録作川す用。合成のための部系の使 用に関してに、これｌの開発は、＃累がエナンチオ選択性であり、光学的に純粋 な化合物の構成を触媒反応する能力を有するので、アミノ酸製造との関連で殊に １景である。このような方法では、酵素のエナンチオ選択性特性は、化学合成に より入手できる典型的に製造されたラセミ混合物中に存在するエナンチオマーの 唯一つを変換することにより光学的にＩＰＡ枠な化合物を生じるために利用でき る。

この高い立体選択性と並んで、酪累釣方法は、温和な反応条件及び過ガ広い基質 ′４＋異注の観点から１利である。後者の状況は、１ｍの同じ酵素ＩＡ造は数棟 の異なるアミノ酸の製造のために使用することができる事実に関連している。

酵素的分割の優れ′ｆｃｆ１１は、米国特許（ｔ、１ｓ−Ａ　）第３９７１７０ ０号、Ｆｌ第４０８０２５９号及び同第４１７２８４６号Ｆ！Ａ細書に記載され ている。

これらの特許でラセミのり、Ｌ−アミノ酸アミドは、反応式ｌに示されているよ うに、Ｌ−エナンチオ占択注７ミダーゼを含有する論製品と接旭される。Ｌ−ア ミノ酸アミドのみが加水分解され、Ｌ−７ミノｋｓｐよびＤ−アミノ酸アミドの 混合＠が形ａ嘔れる。Ｌ−アミノ酸に、これから、いくつかの方法、たとえに結 晶化、抽出またにイオン父洪クロマトグラフィーによりる。シラｌ塩基の回収後 に、Ｄ−アミノ酸アミドが回収されかつこれからＤ−Ｉミノ酸カ・その後化学的 （＃）加水分解、同じく＃素的加水分解により回収できる（たとえばヨーロッパ 特許第１７９５２３号Ｆ！Ａ細書参照）。

上記特許文献に記載された方法は、従って、光学的に純粋なり一同じくＬ−アミ ノ酸の製造のための方法として役立つ。しかしながら、これはラセミ出鈍物質の 多くて５０％しか相当するＤ−まｆｃはＬ−アミノ酸の回収のために利用できな いという欠点ｋｌｊする。

反応式Ｉ。

以上かられかるように、アミドは光学活性アミノ酸の製造のための１袈な前駆体 である。

光学的に純粋なアミノ酸および光学的に純粋な前駆体の混合物に、アミノ酸用の 前駆体のラセミ混合物を分離するために使用する＃素のエナンチオ選択性特性の 一般的原理は、広い適応性を有するが、少なくとも１つの１娶々欠点を有する： 即ち、通常は光学的に純粋なアミノ酸の唯一の形のみが大量に公費でろり、その エナンチオマーの対照物を製造する必要はない。それゆえに、通常実隙に必要と されるアミノ酸の製造が行われた後、光学的に純￥ｐ々前躯体又は光学活性アミ ノ酸が残留する必肇はない。従って、工栗的笑地で、有機化学品の製造のための エナンチオ選択性＃紫合成の原則を適用する場合、未使用の材料をラセミ化しか つ循環利用することが公費とされる。多くの例で、前駆体のラセミ混合物の変換 後に残留する前躯体分子のラセミ化は、このようにして光学的に純粋なアミノ酸 の＃累合成の主費部分でろる。それゆえに、かなりの注意がこの間趙に向けられ 、アミノ酸罰躯体のラセミ化のための多数の化学的方法が利用できる〇たとえは 、Ｄ−アミノ酸アミドに、そのＤ−Ｎ−ペンゾリデン誘導体への裳侠により容易 にラセミ化できることが判明している（木国特許紀４０９４９０４号ンよひ同第 ４１７２８４６号明細畳参照）。

しかしなから、アミノ酸アミドのラセミ化のための化学的方法は、通常酵素反応 と両立できず、ラセミ化ンよひ分割工程は別々に行われなけれはならないという 結果を生じる。妊らに、アミノ酸アミド前躯体のラセミ化のための化学的方法は 、化学品、設備、たとえは副産物生成によるラセミ化工程の間の損失のコストお よび種々の他の事情のために全工程にわたって特別なコストが負わされるという 欠点を有する。

不発明の説明 に異的にも、これまで公知でなかった、アミノ酸アミドラセマーゼ活性を有する 酵素の存在を発見した。

従って、本発明はアミドを、当該アミドに対してアミノ酸ラセマーゼ活性″を有 する＃累にさらすことにより％ｅづけられる、−ｈ一式Ｉのアミノ酸アミドをラ セミ化する方法″４ｃ提供する。

換 この変２のために化学品まｆｃは他の技術のかわシにアミノ酸アミドのラセミ化 のための本発明の方法を適用することにより極々の利点が得られる。まず第一に 酵素反応の闇、通常一般の徳かな状りが＠主成物形成の間の材料のわずかな損失 を生じる。つ筐シ、本発明の方法は、その使用後、たとえはその廃業に関して壊 境間−嘔え生じる、ｇｔ川のかかる化学品を使用することなしに過用できる。妊 らに、不発明の万伝で使＃３てれる状態は、アミノ酸アミドの酵素ラセミ化ｉＤ −まｆｃはＬ−アミドのエナンチオ選択ＦＦＪ詳累Ｗ水分解と結合して、光字活 性アミノ酸を半一の１柱で禾反応アミドを分子ＩＭおよび再生利用することなし ＫＬｌ造することを可能にする。

本発明の方法により完全にまたは部分的にラセミ化できる化合物に、一般式Ｉ Ｒ−ＣＨ（ＮＨ２）　−ＣＯＮＨ２（］　）Ｅ式中Ｒｔｆｆインドリル、ベンシ ルオキシ、ヒドロキシ、メルカプト、アミノ、ハロゲン、フェニル、フェノキシ 、ベンジルにより１１％−ｇれていてよい低級アルキルまたに低級アルキルチオ を表わすか、またはＲは仄の！［換基のｉａｍ上：ヒドロキシ、アミン、ハロゲ ン、カルボキシまｆｃは低級アルコキシにより置侠テれていてよいフェニルを表 わす〕により表わ妊れ、この方法は上記化合物を当該アミドに対してアミノ酸ア ミドラセマーゼ活性ｔ■する酵素に露呈することを特徴とする。もちろん、本発 明の万云ハ、式Ｉ中の基Ｒがα−アミノ基ＫＭ合でれている複素環式アミノ酸の アミドにも適用できる。１つの例は天然アミノ酸プロリンでおる。

基ＲのＮｔ’ｉ、仄のようなものでろる：メチル、イソゾロビル、第ニブチル、 フェニル、ｐ−ヒドロキシフェニル、ベンジル、２−７二二ルエチル、１−ヒド ロキシエチル、メルカグトメチル、メチルチオメチルおよびフェノキシメチル。

δらに、フェニル、インドーリル２よひペンシル基は仄の基の１つにより（ｌｉ 決芒れていてよい：ヒドロキシ、アミノ、ハロゲン、カルボキシおよび低級アル コキシ。ＦＦ３話”低級アルキルｍに８より少ない、有利に５より少ない炭素原 子を有するアルキルを表わす。同様に、低級アルコキシは８より少ない、有利に ５より少ない炭素原子を鳴する。

殊に刊利な具体例では、本発明の方法に、同時にアミドをアミノ酸アミドラセマ ーゼおよび当該Ｄ−またｔｊＬ−アミノ酸アミドに対して活性を有するステレオ 選択７Ｄ−またにＬ−アミダーゼと接触させることにより、相邑するアミドから 光字活性アミノ酸を製造するために使用芒れる。（このアミダーゼ酵素にｌた時 にはアミノペグチダーゼと呼にれる）。反応は反応式１式％ Ｌ−アミダーゼを使用する吻合、Ｄ−アミダーゼに不在でなけれはならすかつ逆 もまた同じでおる。さらＶこ、当該アミノ酸に河して活性を有するアミノ散ラセ マーゼが不在でなけｎｒｉならない。

アミノ酸アミドに、純粋なり一’！ｆｃはＬ−形でまたけ２つの混合物、たとえ はラセミ混合物として供給さｎる。この方法で、Ｄ−アミノ酸アミドｉＬ−アミ ノ酸にｌｆｃはＬ−アミドｉＤ−図に没洪すること芒え可能でるる。化学的に表 這６れた、アミドのラセミ混合ｖｌに使用することρ１殊に有利でるる。

反応式… Ｏ Ｈ２ この方法の利点はアミノ酸アミドの、ラセミ混合物を含むエナンチオマーの混合 物、同じく光学的に純粋なり−またにＬ−アミノ酸から、光学的に純粋なり−ま たはＬ−アミノ酸がステレオ選択的ｖＣ製造でき、アミノ酸アミドが完全に所望 のアミノ酸に変換されることでろる。

不発明による酵素的方法は、たとえはラセミ化丁べぎアミノ酸アミドと＃＃累と の混合物を水性録体中で、−価および反応混合物の温度を論勤しな２）−ら攪拌 することにより行う。反応ｍ合物の声価は、６〜１２、殊に７．５〜９．５の間 で変化してよい。反応温良に反応媒体の融点から約６５°Ｃ１有利に２０〜４５ ℃、嘔らに有利には約３７℃である。この範囲外では、生触媒の活性および／ま たは安定性に一般に満足できる収率を得るためには不十分である。所望により、 反応物の曲解性を高めるために、有機浴剤を反応混合物に添加してよく、このよ うなｆ＆剤は、たとえば、エタノール、メタノール、インゾロパノールまｆｃｔ ｉｚ−ブタノールのようなアルコールまたはジオキプン、Ｎ、Ｎ−ジメチルホル ムアミド、ゾメテルスルホキシドまたはへキプメナルリン酸トリアミドのような 伯の有＆浴剤である。反応は反応物の懸濁液またはたとえは水およびヘキサノま たはシクロヘキブンのような炭化水素を用いる２相系でまｆｃは疎水性で水−飽 和された音像浴剤の完全なＷ＆相中で行う。

本発明による方法で使＃３されるラセマーゼに精製された酵素、粗製診紮済液、 所望の活性を示す微生物細胞、細＠またＦｉ透過可能にされた細胞のホモシ４− トであってよい。所望によシ、＃素を、使用される状態下に酵素の良好な安定性 ２よひ反応性？ｌ−保証するために、固足化妊れた状態でまたは化学的に俊性芒 几た形で適用してよい。

不発明の方法は、きらに、アミノ酸アミドのアミノ酸へのエナンチオ選択的、酵 素的加水分解と付魔して行われる。上に、酪累ｙｆｃに酵素活性に、生触媒（ｂ ｉｏｃａｃａｌｙｓｃ　）とも祢δｎる。こ几に明らかに各々結合すべき酵素活 性の１つを有する生触媒のき合物または有利に双方の酵素活性が存在する１つの 生触媒を包含すると理解される。反応混合物はまた各々アミノ酸アミダーゼｐよ ひラセマーゼ＃累活性を有する二者択一的反応器に通すこともできる。

不発明の方法で使用される酵素は、アミノ酸アミドの１つのエナンチオマーの、 その対掌体への（または付加的に小角中心を有するアミドの場合は、エピマー化 合物への）変換に触媒作用する＃累でるる。

本発明の方法により使用すべき＃累を、たとえはＡｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉ ｓｚｒｙ、　１２１．３７０（１９８２）にＷｅｉｎｓ＋ｃｅｉｎ等によシ記載 されてキラル高圧液体クロマトグラフィー（）（ＰＬＯ）を使用することにより に験することが殊に有利である。

本発明の方法によシ使用される＃累は、ａ物および動物から早険することができ る。しかし、バクテリア、白駒のような微生物まｆｃｒｉ他の微生物のような微 生物に白米するｔ＃累を使用するのが有利でろる。たとえは次の微生物類がアミ ノ鈑アミドラセマーゼの可能な出所で６る：シェードモナｘ　（Ｐｓｅｕｄｏｍ ｏｎａｓ　）、グルコノバクタ−（Ｇ１ｕｃｏｎｏｂａｃ＋ｃｅｒ　）、アグロ バクテリワム（Ａｇｒｏｂａｃｚｅｒｉｕｍ　）、アセトバクター（Ａｃｅ　ｚ ｏｂａｃ　ｃａｒ　）、アクロモバクタ−（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｚｅｒ　）、 アルトロバクター（Ａｒｚｎｒｏｂａｃｚｅｒ　）、アシネトバクタ−１（Ａｃ １ｎｅｚｏｂａｃｔｅｒ　）、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓｓ）、 シトロバクタ−（Ｃ１ｚｒｏｂａｃｚｅｒ　）、二ンテロパクタ−（Ｅｎｚｅｒ ｏｂａｃｚｅｒ　）　（１，ｅｌｏａｃａのような）、エルビニア（Ｅｒｗｉｎ ｉａ　）、エシェリキア（Ｅａｃｈｅｒｉｃｈｉａ　）、タレプシエラ（Ｋｌｅ ｂａｉｅｌｌａ　）、ゾロテワス（Ｐｒｏｚｅｕｓ　）、セラティア（５ｅｒｒ ａｚｉａ　）、イエルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ　）、シｒう（Ｓｈｉｇｅｌｌ ａ　）、ペプトカセアエ（Ｐｅｐｚｏｃｃａｃｅａｅ　）、シューＦモナダダエ （Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｄｅａｅ　）−シト７アが（Ｃｙｚｏｐｈａｇａ　 ）。

バタテロイタセアエ（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄａｓｅａｅ　）、プチリビトリオ（Ｂ ｕｃｙｒｉｖｉｚｒｉｏ　）　、セレノモナス（Ｓｅｌｅｎｏｍｏ−ｎａａ）、 ライモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ　）、クロモバクテリクＡ　（Ｃｈｒｏｍｏ ｂａｃｚｅｒｉｕｍ　）　、アエロモナス（Ａｅｒｏ−ｍｏｎａｓ　）　（Ａ、 −ｐｒｏｚｅｏｌｙｃｉｃａのような）、ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ　）、フラボ バクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｚｅｒｉｕｍ）。

マイクロコツカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ　）　、スタフィロコッカス（５ｚ ａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕａ　）　、ストレプトコッカス（５ｚｒｅｐｃｏｃｏｃ ｃｕｓ　）　、ペディオコッカス（Ｐｅｄｉｏｃｏ−ｃｃｕａ　）　、バチルス （Ｂａｃｉｌｌｕｓ　）　（Ｂ、　５ｕｂｃｉｌｉａ　ｓ？よひＢ、　ｓｚｅａ ｒｏｚｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのような）、クロストリジクム（Ｃｌｏｓｃｒｉ ａｉｕｍ　）、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏ−ｂａｃｉｌｌｕｓ　）、ロイコノ ストック（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｚｏｃ　）、ブレビバクテリ！７　Ａ　（Ｂｒｅｖ ｉｂａｃｚｅｒｉｕｍ　）、テルムス（Ｔｈｅｒｍｕｓ　）、セルロモナス（Ｃ ｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ　）、コリネバクテリクＡ　（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｃｅ ｒｉｕｍ　）−マイクロバクテリワｂ　（Ｍｉｃｒｏｂａｃｚｅｒｉｕｍ　）、 ハイフオミクロビクｔ、　（Ｅｙｐｈｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ　）、プロビオニバ クテリクム（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｚｅｒｉｕｍ　）　、”ｄコバクチリフＪ −（Ｍｙｃｏ−ｂａｃｚｅｒｉｕｍ　）　（Ｍ、　ｐｈｌｅｉのような）、スト レゾトマイ七ス（ｓｚｒｅｐｃｏｍｙｃｅｓ　）　、バタテリジクム（Ｂａｃｚ ｅ−ｒｉｄｉｕｍ　）、アクチノマイセタレス（Ａｃｃｉｎｏｍｙｃｅｚａ−１ ｅｓ　）、カエトメラ（Ｃｈａｅ、ｂｏｍｅｌｌａ　）、セゾトリア（５ｅｐｚ ｏｒｉａ　）、ドブロブイア（：Ｄｏｐｌｏｄｉａ　）、フオマ、（Ｐｈｏｍａ 　）、コノチリウムＣＣ０ｎｏｃｔｋｎｒ　ｉｕｍ　）、ミロテシてワｂ　ｊ（ １％ｙｒ、ｏｔｔｒｈｅｃｉｕｍ　、）　、、ペスタ１ティア（Ｐｅａｚａ−− Ｉｌ′６１１Ｉ！Ｌ）−〆う〜コニ“ワム−（Ｍｅｌｌａｃｏｎｉｕｍ　）、エ ビコクム゛（’Ｒｐ’ｉｃσセヒ幽）２、−＃＝ｖリクム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉ ｕｍ　）、リゾプス（Ｒｈ１ｒ、ｏｐｕｓ　）、ムコール（Ｍｕｅｏｒ　）、カ ンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ　）、アスペルギルス（Ａｓｐ−ｅｒｇｉｌ）ｕｓ　） 、（Ａ、　ｏｒｙｚａｅおよびＡ、　ｐａｒａａｉｃｉｃｕｓのよう欧）１、七 ベドニワｂ　（Ｓｅｐｅｄｏｎｉｕｍ　）、フシジクム（Ｆｕｓｉｄｉｕｍ　） 、オリジオｒノドロン（０ｒｉｄｉｏｄｅｎｄ−ｒｏｎ　）、セファロスボリク ム（ＣｅｐｈａｌＯｓｐｏｒｉｕｍ　）、スコゾラリオプシス（８ｃｏｐｕｌａ ｒｉｏｐｓｉｓ　）、バエ７０マイセス（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ　）、ベル テイシリワム（Ｖａｒｚｉｃｉｌｌｉｕｍ　）、トリコテシワム（Ｔｒｉｃｏ　 ｚｈｅｃｉｕｍ）、グルラリア（Ｐｕ１ｌｕｌａｒｉａ　）、モントグボラ（Ｍ ｏｎｏｚｏｓｐｏｒａ　）、タラドスボリクム（Ｃ１ａｄｏｓｐｏｒｉ−ｕｍ　 ）、ヘルメントスホリクム（Ｈｅｌｍｉｎｃｏｓｐｏｒｉｕｍ　）、クリノスボ リクム（Ｃｈｒｙａｏｓｐｏｒｉｕｍ　）、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｚｏｒｕｌ ａ　）、クロエラクラ（Ｋｌｏｅｃｋｅｒａ　）、ブツカｏマイセス（Ｓａｃｃ ｈａｒｏｍｙｃｅａ　）、ゴエトリクム（Ｇｅｏｚｒｉｃｉｕｍ　）　、および フサリ９ム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ　）。

殊に、ラセマーゼ酵素は、Ｎａｃｉｏｎａｌ　Ｃｏ１１ｅｃｓｉｏｎｓｏｆ　Ｉ ｎｄｕｓｚｒｉａｌ　＆　Ｍａｒｉｎｅ　Ｂａｃｚｅｒｉａ　Ｌｃｄ、でのブタ ベスト条約の条件下で特許目的のために出願人により寄託嘔れた、次の２つの菌 株のようなシューＦモナス（殊にＰｓ、プチダ）およびロドコッカスの一株から 柘られる： 寄　託　−ＮＣｕＢＭ２５６９　ＮＣｌＢ４Ｏ０４２寄　託　日　１９８７年１ ゛０月１９日　１９８８年８月６日寄　託　者　Ｎ　ＯＭＯＣｌ５Ｍ を託者参照番号　０Ｄ２１１１　７９Ｍ分　類　名　口°ドコツカス・ｓｙｐ、 　Ｐｇ、プチダ゛本ン扼吻′で′使１用、さ−れるアミノ酸アξドラセマーゼに 、有・利′に上記微生物の１つの一株から引き出されかつこれにたとえは好適な 媒地中での一株の培養まｆｃはこの活性をコード化しかつ徴税する遺伝子１ｒ有 する形質変換てれた宿主微生物の培養により得られ、その遺伝子は上記微生物の １つから得られた。

アミノ酸アミドラセマーゼ源としての上記−株の過性まｆｃは粗製酵木組地中の このような酵素の存在の過性は、当該微生物の細＠または当該アミノ酸アミドの 光学的に純粋な形を有する粗製＃＃木のインキュベーションにより有利に試験さ ｎる。インキュベーションの間に反応混合物の少ｋｔ−噴シ出しかったとえにキ ラルＨＰＬＣを使用することによりアミノ酸アミドおよびアミノ酸の含量を分析 する。アミノ酸アミドラセマーゼの発生は、インキュベーションがＬ−アミノ酸 アミドを用いて行われる場合には、相当するＤ−アミノ酸アミドおよび／ま７’ （はＤ−アミノ酸の存在を惹起する（ラセマーゼ活性がＤ−アミダーゼ活性を付 随して使用てれる場合）。逆に、Ｌ−アミノ酸アミドおよび／またＦｉＬ−アミ ノ酸は（Ｌ−アミダーゼを付随して使用する場合）、Ｄ−アミノ酸アミドがラセ マーゼ活性を示す細胞または酵素と恒温保持てれる場合に発生する。

微生物または粗ｖｃ酵素中のアミノ酸アミドラセマーセマーゼおよびＤ−および ／またはＬ−アミダーゼがしにしは出くわしかつ実験結果の判断を出御にする。

しかし、光学的に純粋なアミノ酸を当該粗表酵素または細胞と恒温保持すること により、これらのアミノ酸ラセマーゼの存在およびその活性全直接試験すること によりいくつかの欠点が容易に克＆嘔れる。たとえばβ−クロロ−Ｌ−アラニン のようなアミノ酸ラセマーゼ阻害？！ｌ＊を恒温保持混合物に務加することもで きる。

実験結果の判断に関する他の問題に、アミノ酸アミドラセマーゼ活性と同時にＤ −ｊ＋ｌ−よひ／またにＬ−アミダーゼ活性である。Ｊａｈｒｅｉｓその他によ るＢｉｏｍｅｄ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ａｃｚａ、４６−６８３　（１９８７年）に把戦妊れている α−アミノメチルクトンのようなアミノ酸アミドアミダーゼ阻害物質は、アミノ 酸アミドの相当するアミノ酸への変換を保護するために使用てれる。

最後に、Ｉ＠＠または＠ｌ袈酵素の分析がアミノ酸アミドラセマーゼ活性の存在 を示す場合、粗ＩＱ酵素または試験てれた細胞からの酵素はタンパク質を得るた めの方法を用いるｎ製および従来技術で公知の＃木精製を行なうことができる。

このようなｒｒＪ製工程の間に得られる画分をキラルＨＰＬＣ−系を使用するこ とにより、そのアミノ酸アミドラセマーゼ活性に関して分析することができる。

アミノ酸アミドラセマーゼ活性に関して試験すべぎ微生物は、いくつかの独立の 方法で供給され得る。

１、　微生物は培地成業から得らｎる。このような微生物の試鋏削に、たとえは 当該Ｄ−アミノ酸の存在で微生物を膳元またに生長させることか好適である。Ｄ −アミダーゼ活性の誘導の可能性の次に、アミノ酸アミドラセマーゼ活性も訪尋 され得る。

２、微生物に非天然立体ＩＣ置のアミノ酸、非天然立体配置のアミノ酸を含有す るベグテドまたは非天然立体配置のアミノ酸から誘導場れる化合物を製造するた めに公知の固体から選択することかできる。このような微生物は、たとえはＣＲ ＣＰｒｅｓｓ　Ｌｉｄ、から出版ちｎたＨａｎｄｂｏｏｋ　ｏｆ　Ｍｉｃｒｏｂ ｉｏｌｏｇｙ　まｆｃハ関連する著作に記載されている。

３、　アミノ酸アミドラセマーゼを製造しうる微生物はまた利用できる微生物を 、たとえばＮＴＧ　、紫外線照射またはがンマ線照射のような突然変異誘発因子 に露呈することによっても得られる。このような処理は、酵素の特異性を変えか つ随性の遺伝子からの酵素の発現を誘導することが従来文献中に公知である。

４、　アミノ酸アミドラセマーゼを製造する微生物は、たとえば富化培養技術を 用いるスクリーニング（ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　）により直接得ることもできる。

好適な富化方法には、たとえば、ただ１つの炭素または窒素源としての当該純粋 Ｄ−アミノ酸アミドを追加ちれた、好適な富化培地への周囲の土壌試験の添加を 包含する。

この方法を用いてアミノ酸アミドラセマーゼを製造する微生物は、富化されかつ 引続き、慣用の微生物学的方法により単離される。選択圧力は、定義されたかつ 半合成てれた培地を使用することによるスクリーニングの間に運Ｉ！ｉ、きれる 。単離されｆｃ微生物を上記方法の使用により検定する。真なる条杆下の使用に 好適なアミノ酸アミドラセマーゼの収集のために、好気性筐たＦｉ嫌気性条件下 に、向じ〈巣なる温度およびｐｈ　−１＠で富化を笑施するのが好適である。

Ｄ−アミダーゼ活性を有する一株がどのように供給さ几るかという央カは、困株 ＮＣＩＢ　４００４１の率−でろる：窒化源に欠けているかＤ−アミドが：Ｉｇ ＠給されている富化媒体５０紅會含有するエルレンマイヤーフラスコに土壌試験 を接種する。良好な発育を示す７日後のフラスコを選択しかつ同じ媒体中で液中 培養する。

妊らに７８後良好な発育を示すフラスコを選択しかつその内容物をＤ−アミドの 存在で分析する。Ｄ−アミドのないこれらの培養物を寒天プレート上に塗布し、 これから、コロニーを選択しかつアミダーゼ活性を分析する。

この方法によシ薗株ＮＣＩＢ　４００４１を単離した。他のＤ−アミダーゼは、 同様の方法で単離できかつその特異性は、公費に従って適用芒れるＤ−アミノ酸 アミドの選択によシ影響されうる。

殊に、Ｄ−アミダーゼ活性を有する生触媒と比較的高い程度のアミノ酸アミドラ セマーゼ活性を有する生触媒との組合せおよび有利に比較可能な程度に双方の活 性を示す単一微生物はＤ−まｆｃはＬ−アミノ酸アミダーゼから出発する光学的 に純粋なり一アミノ酸を製造する好適な方法を提供する。同じことが、上記粗製 の材料から光学的に純粋なＬ−７ミノ醒の製造に関して比較的高い活性を有する １微生物中で有利に発現されるＬ−アミダーゼおよびアミノ酸アミドラセマーゼ の組合せを得るための突然父典体（ｍｕｃａｃｉｓ　ｍｕｚａｎ−ｄｉｓ　）に いえる。

双方のアミノ酸アミドラセマーゼおよびアミダーゼ活性を発現する微生物の例に 、削にのシュードモナスＩ′７′チダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｃｉｄａ 　）　ＮＣＩＢ　４　（Ｊ　０４２の−株である。この菌株は最近のオランダ国 特許出願第８８．０１８６４号明細書に記載嘔れた方法により得られる。

誘導できるＤ−アミダーゼ活性は、Ｄ−アミノ酸アミド、有利にＤ−フェニルグ リシンアミド（Ｎ−源としてかあるいはそうでない）が存在する培養媒地中にこ の菌株を接種することによシ発現させられる。

Ｌ−アミダーゼ活性と一緒のアミノ酸アミドラセマーゼ活性の発現は、Ｄ−アミ ノ酸アミドの不在でこのシュードモナス・ゾチダー株を培養することにより得ら れる仁とができ、その結果としてＤ−７ミダーゼ活性は発現されない。

アミノ酸アミドラセマーゼ活性およびＤ−アミダーゼ活性の発現は、できるかぎ り、たとえは伝統的な遺伝子技術（ＵＶ−照射まｙｃはアルキレート化に薬）を 用いるシュードモナス・プチダからのＬ−アミダーゼネがチプ突然変異体の製造 まｆｃに組慄えＤＮＡ技術を用い、次いでこれ’ｔＤ−アミノ酸アミドの存在で （Ｎ−源としてまたはそうでなく）培養することによシ得ることができる。酵素 材製により、−万でＤ−アミダーゼ活性を刊するｈｓ画分および他方でアミノ酸 アミドラセマーゼ活性１１するｎ＆−されｆｃ画分を得ることもできる。これら の画分の組合せは、その後元字活注り−アミノ酸の製造のための好伽な主触媒ｔ ″圧しる。

前記の１ｉｆｉ株ＮＣＩＢ　４００４２の他にも、Ｄ−アミダーゼは、ロドコッ カスｅ　ｓｐ、（Ｒｈｏａｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ、　）　ｉ株ＮＣＩＢ　４００ ４１からも誘導される。この薗抹Ｆｉ特許目的のために１９８８年８月２日にＮ ａｔｉｏｎａｌ　Ｃｏ１１ｅｃｚ−ｉｏｕｓ　ｏｆ　Ｉｎｄｕｓｚｒｉａｌ　ａ ｎｄ　Ｍａｒｉｎｅ　Ｂａｃｚｅｒｉａ　Ｌｃｄ、によシブタペスト条約下に寄 託された。

多くの微生物のＬ−アミダーゼは公知でありかつ本発明の実施で使用されうる。

菌株ＮＣＩＢ　４００４２からの上記酵素の他に、すぐれた例はシュードモナス ・ゾチダ酌株ＡＴＣＣ１２６３３からの酵素である。

アミダーゼ活性は、アミドラセマーゼを得るために挙げられたと同様の方法で、 指示微生物から誘導きれうる。

次の実施例につぎ、本発明の方法実２ｉｌ！１１を詳述するが不発明はもちろん これらの例に限定さｎるものではない： 例１ シュードモナス・ゾチダ酷株ＮＣＩＢ　４００４２をＮ−源としてのＤ−フェニ ルグリシンアミド（１＆／ｉ　）を有するｙｃＢ（１０，９／Ｊ）培地中で一晩 中培養した。

遠心分屡および洗浄による細胞の獲得後に、各々！ｌｉｔｍ泥１２０〜を基質と してのＤ−またはＬ−フェニルグリシンアミドまたはＤ−またはＬ−フェニルグ リシンの１％（ｖ／ｖ　）　＠液５勧に６加した。反応を、小容器中３７℃２よ ひｐ）１８．５で撹拌しながら２０時間行った。

各々の反応は仄の結果音生じｆｃ＝ Ｄ−フェニルグリシンアミド　あり　７７％　１４％Ｌ−フェニルグリシンアミ ド　あり　７％　８９係Ｄ−フェニルグリシンアミド　なし　く１％　〈１％Ｌ −フェニルグリシンアミド　なし　く１％　＜１　％Ｄ−フェニルグリシン　６ り　＜１％ Ｌ−フェニルグリシン　クリ　＜１％　−得られた反応混合物のキラルＨＰＣＬ 分析後に計算された上記の結果は、明らかに、製造場れたＤ−７ミダーゼ活性の 他に、この生触媒がフェニルグリシンアミドへのアミノ酸アミドラセマーゼ活性 を有することを示している。示されたように、ラセミ化は製造されたアミノ酸の 水準では生じない。基質（Ｄ−およびＬ−２エニルグリシンアミドの双方）とし て相応するアミドを用いてのみ、Ｄ−フェニルグリシンおよびＬ−７二二ルグリ シンの双方がＬ−アミダーゼおよびＤ−アミダーゼ活性の同時の存在下に形Ｍ、 てれる。

例２ シュードモナス・グチダー株ＮＣＩＢ　４００４２　′に％Ｎ−源としてのＤ− フェニルグリシンアミドｔ１１＃）全２ＮするｙｅＢ（１０＃／ｌ）培地中で２ ８℃で１帆中培養した。遠心分陰および洗浄によるｉ！Ｂ胞の獲得後に細胞を７ レンチープレス（Ｆｒｅｎｃｈ−ｐｒｅｓｓ＋　）　’ｉｔ用いて多くの酵素ラ セミ化反応はコファクターとしてピリドキサルー５１−ホス７エー）　（ＰＬＰ ）を有することが公知であるので、これもまたアミノ酸アミドのラセミ化を伴う 場合であるか否かを調査した。

アミノ酸アミドラセマーゼが実際にＰＬＰ−依存性であるなら、この反応は、Ｐ ＬＰ−依存性反応に固有の阻害剤たとえばヒドロキシルアミンにより阻害される べきである。

反応は、基質としての１％（Ｗ／Ｖ　）フェニルグリシンアミド５齢を用いて６ ７℃およびｐｉ−１８，５で、かつ生触媒としての細胞不含の抽出物０．５鮎を 用いて１６時間笑実施た。次の結果が得られた： 反応生成物 ヒドロキシルアミン　Ｄ−フェニルグリシン　Ｌ−フェニルクリシンスルフェー ト ０．２ｍモル／継 １０１１ノ　＋　＋＋ ５０　ｐｌ　＋　＋ これらのラセミ化反応で、付加的なＰＬＰは、増大されたアミノ酸アミドラセマ ーゼ活性管生じる。

これらの結果に、アミノ歌アミドのラセミ化か不当にＰＬＰ−依存性反応であり 、これがヒドロキシルアミンで阻害てれることを示している。

？ｌＩ３ シュードモナス・プチダ菌株ＮＣＩＢ　４００４２を一晩中２８℃でバイオリア クター（ＭＢＲ）３０　ｌ中、−７，１でＤ−アミノ酸アミド（たとえばＤ−フ ェニルグリシンアミド）が添加嘔れていない、培地２０７に用いて培養した。こ の方法で培養された生触媒は、もつはらし−アミダーゼ゛およびアミノ酸アミド ラセマーゼ活性を示しかつＤ−アミダーゼ活性は示芒ない。引続き限外ｍ辿、遠 心分離、洗浄および凍結乾燥による細胞の８！得後に、これらの細＠を生触媒と して（基質に対して異なる比で）下記の酵素反応中で使用した。基質として２％ （ｗ／ｖ　）　Ｄ　＋　Ｌ−フェニルグリシンアミド浴液５０１１１ｐ）１８． ６）を使用した。反応は４０℃で行った。変換率は相当するアミノ酸へのアミノ 酸アミドの酵素的加水分解によシ形成されたアンモニアの童に基づき測定した。

反乙培地中でのアンモニア酸度の測定は、イオン−選択性アンモニア電極（０ｒ ｉｏｎ　）を用いて行った。

先触！＆＃累／基貴　反応時間　基質（アミノ酸アミ〜　比　時　間　ド）の変 換率 １００　１：１０　２４　５２％ ５０５３％ ７２５８％ ５００　１：２０　２４　５３％ ２０００　２：１　２４　６５％ これらの結果は、明らかにアミノ酸アミドラセマーゼ活性がアミノ酸アミドの加 水分解中の限定＃累活性であることを示しているにもかかわらす、反応の基質と してのアミノ酸アミドの酵素的ラセミ化により５０係よシ多い変換率が達成でき ることを示している。爽に、キラルＴＬＣ分析に、もっばらＬ−フェニルグリシ ンが形成され、Ｄ−フェニルグリシンは形成されな−・ことを示しており、この ことは、この方法が光学的に純粋なＬ−フェニルグリシンの製造のために非常に 好適にする。

ガ４ 例３に記載の製法で得られｆｃ変換率は、長い反応時間を必要とするので、この 時間の間に、Ｄ−アミダーゼｆｆｉ性２ｊ（、Ｌ　−７二エルグリシンアミドの 他に反応混合’ｆＪＩＪ　中Ｋ　Ｄ−フェニルグリシンアミドが存在するために 誘発することができる。これを防ぐために、同じ反応を、蛋白質合成阻害剤、こ の場合全阻害を生じる濃度（１０μｓ／紅）でのテトラブイクリンの存在で行な った。この反応は、４０℃およびｐ）１８．１５で、かつ基質としての２％（ｗ ／ｖ　）ラセミ性り、Ｌ−フェニルグリシンアミド混合物（４０ＩＬＬ）を用い て行なった。この方法で、次の結果が得られｆｃ： 生触媒　酵素／基寅　反応時間　基質の変換率１６００　２：１　１７．５　５ ８％ このようにして得られた変換率は、蛋白質合成阻害剤が反応混合物に添加嘔れて （・な（・、例６で得られたものと同じ水準におるので、削記震俟率〃；５０よ り上でおるという事笑は、アミノ酸アミドラセマーゼの存在に基づくことと結論 を下すべきでろる０１Ｊ　５ Ｌ−７ミダーゼ活性と結合したアミノ酸アミドラセマーゼ活ａを有する生触媒の 任仕で、基質としての光学的に純粋なり一フェニルグリシンアミドから出発する 生成物としてのＬ−フェニルグリシンを得ることも可能であるべきなので、これ を同様の実験で行なった（例３および例４参照）。例６と同様の方法で培養され た、シュードモナス・プチダ（菌株ＮＣＩＢ　４００４２の細胞ｔ　、ｏ−フェ ニルグリシンアミドの１％（Ｗ／Ｖ）水浴液３Ｑｍ中の生触媒（３０ＤＩＩＩ９ ）として使用した。

反応を４０℃および−９，０で行った。変？！に率を、再びイオン選択電極を用 いて、製造場れたアンモニアの量を測定することによシ泗」定した。次の結果が 得られた。

反応時間　基質の変換率 この実験は、アミノ酸アミド、この場合には光学的に純粋なり一フェニルグリシ ンアミドの酵素的ラセミ化と同時の形＆−ｇれｆｃＬ−フェニルグリシンアミド の光学的に純粋なＬ−フェニルグリシンアミドへの加水分解を証明している。

？ｌ１６ アミノ酸アミドラセマーゼの基買袴典性を砕」定するために、２徨の芳香族同様 に２徨の脂助族り−アミノ酸アミドを基質として（１％　（ｗ／り水陪欣の５１ ｕ）使用した。生触媒として、例３，４および５に記載されたのと同様の方法で 得られた、凍結乾燥された細＠を使用した。この反応は、３８℃および８．１の −で、１７時間にわたって行った。芳香族アミノ酸アミドとして、Ｄ−フェニル グリシンアミドおよびＤ−ホモフェニルアラニンアミドを、かつ脂肪族アミノ酸 アミドとしてＤ−バリンアミドおよびＤ−ロイシンアミドを使用した。全ての場 合に、キラルＴＬＣ分析により分析して、もっばら相当するＬ−アミノ酸が反応 生成物として形成された。これは、アミノ酸アミドラセメート（これは同じく芳 香族アミノ酸アミド基ひに脂肪族アミノ酸アミドに関するラセミ化＃累活性を有 する）の広い基質特異性を証明している。

アラニノニトリルを１００ｍＭのニトリルの１１度に相当するリン酸塩緩衝液（ ０，Ｉ　Ｍ、　−７，０）　５ｊｔｊに添加し次。反応混合物ヲ呈温で１拌し、 シュードモナス・ａｐ、ＮＣｌＢ１２５６９の新たに培養されｆｃ細胞の懸濁液 α１社をこの反応混合物に添加した。３０分間の間隔でＤ　−＆−よびＬ−アラ ニンアミド並びにＤ−およびＬ−アラニンの良度ヲキラルＨＰＬＣｔ−用いて４ 時間にわたって監視した。久の工程が反応混合物中で行われるのｔ認めｆｃ：ア ラニノニトリルのアミドへの加水分解、アミドのラセミ化およびアミドの７ラニ ンへの加水分解。

例８ Ｌ−７ラニｙ７ミド（ＥＢｒ塩、１１．４Ｍ９）ｔ−リン酸塩緩衝液（０，１Ｍ ％−７，０）　１．１２５１Ｌｔに添加し、それにより６０ｍ）、ｉのアミド溶 液を生じた。この溶液を室温で攪拌しかつ同じ緩衝液Ｑ、２２５紅に懸濁嘔れた 、シュードモナス・ｓｐ、ＮＣｌＢ１２５６９の新たに培養されたｍ＠をこの反 応混合物に添加した。５．１０．３０．６０および１２０分後に、反応混合物の 少量を取り出し、キラルＥＰＬＣを用いてそれらのアミノ酸およびアミノ酸アミ ドの含量を分析した。インキュベーションの６０分後に形成されたＤ−およびＬ −アラニンの濃度は、各々１３．４および２０．５ｍＭでめった。

Ｌ−アラニンと同量のｍ＠のインキュベーションにより、細胞のアミノ酸ラセマ ーゼ活性を歯元し、そのう例９ Ｄ〜アラニンアミド塩酸塩の６３　ｍＭ浴液は、リン酸塩緩ＷＭ（０，１Ｍ、　 ｐｈ７．０　）　１．１２５β中にアミド８．４９を曲解することによシ製造し た。前記のようなシュードモナス・ｓｐ、　ＮＣＩＢ　１２５６９と共にインキ ュベーションの後に、６０分後に検出されたＤ−およびＬ−アラニンの良度は、 各々３０．１　ｓｐよひ７．５ｍＭでめった。同じ絢＠ｐａ濁液を用いて５０　 ｍＭ　Ｄ−アラニンは６０分間かかつて向じ条汗下に、Ｌ−アラニンの２．４ｒ ｎＭのみまでラセミ化された。

例１０ １１１１ｍ　０．２５　Ｎ中ｃｒ）ｏ　トコツカ：Ｘ、　・ｓｐ、　ＮＣｌＢ１ ２５６９の新たに培養された細胞の懸濁液を、リン酸塩緩衝液（０，１Ｍ％−７ ，０）中のラセミ性アラニンアミドの１２０ｍＭ浴液１．１２５ＩＬＬに添加し た。４時間後に、アミドのアラニンへの変換は完結した。Ｄ−−Ｌ アラニンのエナンチオマー過剰は、ＣＤ＋Ｌ　×１００係として計算して）７５ ％と測定された。

Ｄ−アミダーゼおよびアミノ酸アミドラセマーゼへのラセミのアミドの露呈によ り、良好な収率および高い選択性で　Ｄ−アラニンは合成されることが判明した 。

例１１ 緩衝液０．２２５ｊ１７＝中のロドコッカス・ｓｐ、ＮＣｌＢ１２５６９の新た に培養された細胞の懸濁液および米国特許第４０８０２５９号明り薔に記本石れ たようなＬ−アミダーゼ活性を示すシュードモナス・プチダ細胞の懸濁液０．２ ２５鮎を、リン酸堪駿両欣（α１Ｍ。

ｐｉ−１７，０）中のラセミ性アラニンアミドの１４０　ｍＭ　浴液に添加した 。４時間後に反ろは終了した。Ｌ−アラニンのエナンチオマーの過剰に８０％で おった。

？ｌ１１２ リンに塩後ｍ＆甲のロドコッカス・８ｐ、−抹ＮＣｌＢ１２５６９ｈよひ′ｍ抹 ＮＣＩＢ　４００４１　（Ｎｏｖｏ　５ｔｒａｉｎ２６．１９８８．６．２６Ｎ ＣＩＢ寄託）の新たに培養された細胞のｌｌｌ１！濁液α４５ＩＬｔを緩衝液（ ０，１Ｍ、ｐＨ７，０）中のラセミ性バリンアミドの１４０ｍＭ＠液に添加した 。生じる混合物を室温で攪拌しかつ反応の進行をキラルＨＰＬＣにより監視した 。６時間後に反応は終了した。Ｄ−バリンのエナンチオマー過剰は９０％であっ た。こうして、Ｌ−異性体中の富化されたバリンが、ラセミ性アミドからＬ−ア ミダーゼおよびアミノ酸アミドラセマーゼへの露呈により製造する仁とができる 。

国際調査報告 国際調査報告 りに８８００１３４

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．一般式Ｉ： Ｒ−ＣＨ（ＮＨ２）−ＣＯＮＨ２ （Ｉ） 〔式中Ｒはインドリル、ペンジルオキシ、ヒドロキシ、メルカプト、アミノ、ハ ロゲン、フエニル、フエノキシ、ベンジルまたは低級アルキルチオにより置換さ れていてよい低級アルキルを表わすか、またはＲは次の置換基：ヒドロキシ、ア ミノ、ハロゲン、カルボキシまたは低級アルコキシの１個以上により置換されて いてよいフェニルを表わす〕の化合物を完全にまたは部分的にラセミ化する方法 において、前記化合物を当該アミドに対してアミド酸アミドラセマーゼ活性を有 する酵素に露呈することを特徴とする、一般式Ｉの化合物を完全にまたは部分的 にラセミ化する方法。 ２．前記酵素はロドコッカス・ｓｐ．の菌株有利にＮＣＩＢ１２５６９菌株から またはシュードモナースの菌株有利にｐｓ．プチダ菌株、より有利にはＮＣＩＢ ４００４２菌株から誘導されている、請求項１記載の方法。 ５．前記酵素は菌株ＮＯＩＢ１２５６９又は菌株ＮＣＩＢ４００４２から得られ る請求項１記載の方法。 ４．ラセミ化を、当該アミドに対して活在を有するエナンチオ選択性のアミノ酸 アミドアミダーゼの存在て実施する、請求項１から３までのいずれか１項記載の 方法。 ５．前記エナンチオ撰択性アミダーゼは、Ｌ−特異性である、請求項４記載の方 法。 ６．前記Ｌ−特異柱アミダーゼは、シュードモナス有利にｐｓ．プチダの菌株、 より有利にはＡＴＣＣ１２６３３又にＮＣＩＢ４００４２菌株から誘導されてい る、請求項１記載の方法。 ７．前記エナンテオ選択性アミダーゼは、Ｄ−特異性である、請求項４記載の方 法。 ８．Ｄ−特徴異性アミダーゼは、ロドコッカス・ｓｐ．の菌株有利にＮＣＩＢ４ ００４１菌株から誘導されているまたはシユードモナスの菌株有利にｐｓ．プチ ダ、より有利にＮＣＩＢ４００４２菌株から誘導されてい、請求項７記載の方法 。 ９．アミドラセマーゼおよびエナンチオ選択性アミダーゼ活性は、共に１微生物 中で発現されている、請求項４記載の方法。 １０．有機浴剤の存在でこの方法を実施する、請求項１から９までのいずれか１ 項記載の方法。 １１．ここに記載の態様の任意の態様または組み合せ。