JP4237413B2 - （Ｓ）−α−フェネチルアミン：ピルビン酸トランスアミナーゼ - Google Patents
（Ｓ）−α−フェネチルアミン：ピルビン酸トランスアミナーゼ Download PDFInfo
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Description
【０００１】
技術分野
本発明は、アミノ基転移反応により、ケトン化合物を効率よく光学活性アミノ化合物に変換しうる酵素および該酵素を用いた光学活性アミノ化合物の製造方法に関する。得られる光学活性アミノ化合物は、医薬品や農薬等の中間体として利用しうる。
【０００２】
背景技術
生化学的な光学活性アミノ化合物の製法としては、ラセミ体α−フェネチルアミンの微生物による不斉分解法（特開平１−１７４３９８号公報、特開平６―２５３８９１号公報）及びアセトフェノンの微生物によるアミノ化法（特開平４−３６５４９０号公報、特開平６−２５３８７５号公報）による光学活性α−フェネチルアミンの製法等が知られている。しかし、これらの方法においては、反応に関与する酵素の性質、例えば、デヒドロゲナーゼ、オキシダーゼ、アンモニアリアーゼ等について示されていない。さらに、前記方法による光学活性アミノ化合物の生産性も低いため工業的規模での実用化は困難であると考えられる。また、これらの方法には、α―フェネチルアミン以外の光学活性アミノ化合物の製造については記載されていない。
【０００３】
一方、ブレビバクテリウム属微生物を用い、１−（４―メトキシフェニル）−２−プロパノンにアミノ基を転移させることにより光学活性１―（４―メトキシフェニル）―２―アミノプロパンが合成できることが報告されている（特開昭６３−２７３４８６号公報）。前記公報には、反応において還元型補酵素、例えば、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドの添加効果があることが記載されている。このことより、利用している酵素はデヒドロゲナーゼと考えられるが、実体は明らかでない。
【０００４】
また、特公平４―１１１９４号公報には、ブレビバクテリウム属微生物が、塩化アンモニウム存在下、１−（４−メトキシフェニル）−２−プロパノンから（Ｒ）−１−（４−メトキシフェニル）−２−アミノプロパンを生成することが記載されている。本発明者らが前記公報に開示された微生物および基質について追試を行ったところ、非常に再現性に乏しかった。
【０００５】
さらに、特開平３−１０３１９２号公報では、ラセミ体のアミノ化合物にω―アミノ酸トランスアミナーゼを作用させて（Ｓ）体のみを分解し、残った（Ｒ）体を取得することが開示されている。前記公報において、トランスアミナーゼの反応が、ガバクリン、ヒドロキシルアミンなどのトランスアミナーゼの阻害剤で阻害されるため、使用している酵素はω−アミノ酸トランスアミナーゼであるとしている。しかし、阻害剤の作用だけで酵素を特定することは不十分であり、また、ω−アミノ酸に対する使用酵素の反応性については開示されていない。また、この方法によると微生物不斉分解法（特開平１−１７４３９８号公報、特開平６―２５３８９１号公報）同様、光学活性アミノ化合物を得るためには、目的化合物とは逆の光学活性を有するアミノ化合物を分解してしまうため、基質に対する収率は５０％以下に低下し、コスト的に有利な方法とはいえないという欠点を有する。
【０００６】
発明の開示
本発明は、アミノ基転移反応により、ケトン化合物を効率よく光学活性アミノ化合物に変換しうる酵素、該酵素を用いた光学活性アミノ化合物の製造方法および該酵素の生産微生物の培養方法を提供することを目的とする。
【０００７】
本発明者らは、様々な土壌よりスクリーニングを行なった結果、ピルビン酸存在下、（Ｓ）−α―フェネチルアミンをアセトフェノンに変換する（Ｓ）−α−フェネチルアミン：ピルビン酸トランスアミナーゼ活性を有する微生物を土壌より取得することができ、その微生物より該活性を有する酵素を単離、精製することができた。さらに我々は、この（Ｓ）−α−フェネチルアミン：ピルビン酸トランスアミナーゼの反応特性について詳細な検討を行った結果、該酵素は、（Ｓ）−α−フェネチルアミンなどをアミノ基供与体として用いると、ピルビン酸のようなα−ケト酸だけでなく、α−ケト酸以外のケトン化合物にも作用し、対応する光学活性アミノ化合物に変換するという優れた性質を有することを見出し、本発明に至った。
【０００８】
即ち、本発明の要旨は、
〔１〕 下記理化学的性質：
（Ａ）作用：
光学活性（Ｓ）−α−フェネチルアミンとピルビン酸とに作用してそれぞれアセトフェノンとアラニンとを生成するアミノ基転移反応を触媒する、ならびに
（Ｂ）基質特異性：
（ａ）アミノ基供与体：（Ｓ）−α―フェネチルアミンに対し活性を示し、β−アラニン、タウリン、プトレッシン、ＤＬ−オルニチンおよびＤＬ−リシンのそれぞれに対し活性を示さない、および
（ｂ）アミノ基受容体：ピルビン酸およびグリオキシル酸のそれぞれに対し活性を示す、
を有する（Ｓ）−α−フェネチルアミン：ピルビン酸トランスアミナーゼ、
〔２〕 一般式（１）：
【０００９】
【化５】
【００１０】
（式中、ｐは０または１を示し、ｑは０〜８の整数を示し、ｒは０〜４の整数を示し、Ｒは炭素数６〜１４の置換もしくは無置換のアリール基、炭素数４〜１２の複素環基、カルボキシル基、炭素数２〜６のアルコキシカルボニル基、メチル基、または水素原子を示し、Ｘは水酸基、カルボキシル基、炭素数２〜６のアルコキシカルボニル基、または水素原子を示す）で表わされるケトン化合物に、前記〔１〕記載の（Ｓ）−α−フェネチルアミン：ピルビン酸トランスアミナーゼをアミノ基供与体の存在下に作用させることにより、対応する光学活性アミノ化合物を得ることを特徴とする、光学活性アミノ化合物の製造方法、
〔３〕 一般式（４）：
【００１１】
【化６】
【００１２】
（式中、ｐは０もしくは１を示し、ｑは０〜８の整数を示し、ｒは０〜４の整数を示し、Ｒは炭素数６〜１４の置換もしくは無置換のアリール基、炭素数４〜１２の複素環基、カルボキシル基、炭素数２〜６のアルコキシカルボニル基、メチル基、または水素原子を示し、Ｘは水酸基、カルボキシル基、炭素数２〜６のアルコキシカルボニル基、または水素原子を示す）で表わされるラセミ体のアミノ化合物に、前記〔１〕記載の（Ｓ）−α−フェネチルアミン：ピルビン酸トランスアミナーゼをアミノ基受容体の存在下に作用させることにより、対応する光学活性アミノ化合物を得ることを特徴とする、光学活性アミノ化合物の製造方法、ならびに
〔４〕 （Ｓ）−α−フェネチルアミン：ピルビン酸トランスアミナーゼを生産する微生物を培養する際に、該酵素の誘導物質として、プロピルアミン、１−ブチルアミン、２―ブチルアミン、２―ペンチルアミン、イソプロピルアミンおよびイソブチルアミンからなる群より選ばれた１種以上を培地に添加する（Ｓ）−α―フェネチルアミン：ピルビン酸トランスアミナーゼ生産微生物の培養方法、に関する。
【００１３】
発明を実施するための最良の形態
本発明の（Ｓ）−α−フェネチルアミン：ピルビン酸トランスアミナーゼは、下記理化学的性質：
（Ａ）作用：
光学活性（Ｓ）−α−フェネチルアミンとピルビン酸とに作用してそれぞれアセトフェノンとアラニンとを生成するアミノ基転移反応を触媒する、ならびに
（Ｂ）基質特異性：
（ａ）アミノ基供与体：（Ｓ）−α―フェネチルアミンに対し活性を示し、β−アラニン、タウリン、プトレッシン、ＤＬ−オルニチンおよびＤＬ−リシンのそれぞれに対し活性を示さない、および
（ｂ）アミノ基受容体：ピルビン酸およびグリオキシル酸のそれぞれに対し活性を示す、
を有する酵素である。
【００１４】
さらに、本発明の酵素は、（Ｓ）−α−フェネチルアミンとα−ケト酸以外のケトン化合物とにも作用し、アセトフェノンと該ケトン化合物に対応するアミノ化合物とを生成するアミノ基転移反応を触媒しうる。
【００１５】
本発明の酵素は、前記したような基質特異性を有し、立体選択的にアミノ基転移反応を触媒するため、本酵素を用いることにより、光学活性アミノ化合物を従来よりも高い収率で、かつ容易に得ることが可能になる。
【００１６】
さらに、本発明の酵素は、下記理化学的性質：
ａ）分子量：約４４，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
ｂ）至適ｐＨ：７．０〜９．０
ｃ）至適温度：３０〜５０℃
ｄ）熱安定性：ｐＨ７．０、３０〜５０℃の温度で１５分間処理したとき、処理前の全活性の９５％以上の残存活性を保持する、
を有していてもよい。
【００１７】
前記「ケトン化合物」としては、一般式（１）：
【００１８】
【化７】
【００１９】
（式中、ｐは０または１を示し、ｑは０〜８の整数を示し、ｒは０〜４の整数を示し、Ｒは炭素数６〜１４の置換もしくは無置換のアリール基、炭素数４〜１２の複素環基、カルボキシル基、炭素数２〜６のアルコキシカルボニル基、メチル基、または水素原子を示し、Ｘは水酸基、カルボキシル基、炭素数２〜６のアルコキシカルボニル基、または水素原子を示す）で表わされるケトン化合物が挙げられる。かかるケトン化合物としては、例えば、３−メトキシアセトフェノン、２−ヒドロキシアセトフェノン、３−ヒドロキシアセトフェノン、４−クロロアセトフェノン、４’−メトキシアセトフェノン、３’，４’−ジメトキシフェニルアセトン、３’−トリフロオロメチルアセトン、ベンジルアセトン、４−（４’−メトキシフェニル）−２−ブタノン、ベンゾイルアセトン、２−アセチルピリジン、３−アセチルピリジン、４−アセチルピリジン、アセチルピラジン、２−アセチルフラン、２−アセチルチアゾールなどが挙げられる。ただし、本発明の酵素は、２−ケトグルタル酸には作用しないことも特徴の１つである。
【００２０】
前記一般式（１）において、ｐは０または１、ｑは、０〜８、好ましくは０〜４の整数、ｒは、０〜４、好ましくは０〜２の整数を示す。
【００２１】
前記一般式（１）において、Ｒは、炭素数６〜１４、好ましくは６〜１０の置換もしくは無置換のアリール基、炭素数４〜１２、好ましくは４〜８の複素環基、カルボキシル基、炭素数２〜６、好ましくは２〜４のアルコキシカルボニル基、メチル基または水素原子を示す。
【００２２】
前記置換アリール基としては、例えばハロゲン原子、炭素数１〜６、好ましくは１〜４のアルキル基、水酸基、メトキシ基、ニトロ基、モノフルオロメチル基、ジフルオロメチル基およびトリフルオロメチル基からなる群より選ばれた置換基により少なくとも１ヶ所を置換されたアリール基が挙げられる。
【００２３】
Ｒの具体例としては、メチル基、フェニル基、ナフチル基、２−クロロフェニル基、３−クロロフェニル基、４−クロロフェニル基、２―ヒドロキシフェニル基、３−ヒドロキシフェニル基、４−ヒドロキシフェニル基、２―メトキシフェニル基、３−メトキシフェニル基、４−メトキシフェニル基、２，４−ジメトキシフェニル基、３，４−ジメトキシフェニル基、２−トリフルオロメチルフェニル基、３−トリフルオロメチルフェニル基、４−トリフルオロメチルフェニル基、ピリジル基、ピラジニル基、ピロリル基、チエニル基、フリル基、チアゾリル基が挙げられる。
【００２４】
前記一般式（１）において、Ｘは、水酸基、カルボキシル基、炭素数２〜６、好ましくは２〜４のアルコキシカルボニル基または水素原子を示す。
【００２５】
本発明の酵素によれば、（Ｓ）−α−フェネチルアミンと３−ヒドロキシアセトフェノンとに作用し、アセトフェノンと光学活性（Ｓ）−３−α−ヒドロキシ−フェネチルアミンとを生成しうる。
【００２６】
かかる酵素は、例えば、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属の微生物などに存在する。その中で代表的なシュードモナス・スピーシーズは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ． ＫＮＫ４２５と命名・表示され、平成１０年９月２５日（原寄託日）より寄託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−６５２５として、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所〔あて名：日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号（郵便番号３０５−８５６６）〕に寄託されている。前記シュードモナス・スピーシーズＫＮＫ４２５株（以下、単にＫＮＫ４２５株という場合もある）の菌学的な性質を以下に示す。
菌学的性質
細胞の形態 ：桿菌
グラム染色 ：陰性
胞子形成 ：無し
運動性 ：有り
コロニーの形態 ：丸い、規則的な、完全な、クリーム色、
スムースな、光沢のある、平らな、
やや半透明な、直径３ｍｍのコロニー
（イースト−グルコース寒天培地）
生育（３７℃） ：＋
（４１℃） ：−
カタラーゼ ：＋
オキシダーゼ ：＋
ＯＦテスト（グルコース） ：−
【００２７】
前記ＫＮＫ４２５株由来の酵素は、例えば、以下のようにして精製することができる：
【００２８】
まず、シュードモナス・スピーシーズＫＮＫ４２５を、５００ｍＬ容坂口フラスコ中５０ｍＬの培地〔組成：５ｇ／Ｌ ＫＨ2 ＰＯ4 、５ｇ／Ｌ Ｋ2 ＨＰＯ4 、１ｇ／Ｌ ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ、０．００５ｇ／Ｌ ＺｎＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ、０．００５ｇ／Ｌ ＦｅＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ、０．００１ｇ／Ｌ ＭｎＣｌ2 ・４Ｈ2 Ｏ，３ｇ／Ｌ ＮａＣｌ、１５ｇ／Ｌ グリセリン、２ｇ／Ｌ イーストエキス、８ｇ／Ｌ プロエキス、２ｇ／Ｌ （ＲＳ）−２−ブチルアミン、１．５ｇ／Ｌ ピルビン酸、（ｐＨ７．２）〕に植菌し、３０℃で１日培養し、前培養液を得る。ついで、５リットル容ミニジャー中３．０リットルの培地（前記培地と同組成）に、得られた前培養液を植菌し、０．５ｖｖｍ、６００ｒｐｍでｐＨ７．５以下で３０℃で２２時間培養する。
【００２９】
なお、前記微生物を培養する際に、（Ｓ）−α−フェネチルアミン：ピルビン酸トランスアミナーゼの誘導物質として、プロピルアミン、１−ブチルアミン、２―ブチルアミン、２―ペンチルアミン、イソプロピルアミン、イソブチルアミンなどを培地に添加し、培養することもできる。前記誘導物質は、単独でまたは２種以上を混合して用いてもよい。
【００３０】
前記誘導物質の添加量は、特に限定されるものではないが、菌の生育阻害などの観点より、通常培地組成中１重量％以下が好ましい。
【００３１】
また、前記誘導物質の添加時期は、特に限定されるものではなく、培養開始時、または培養途中のいずれでもよい。
【００３２】
ついで、遠心分離により培養液から菌体を集め、０．１％ ２―メルカプトエタノールおよび０．１ｍＭピリドキサールリン酸を含む０．０５Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．８）に懸濁する。
【００３３】
得られた懸濁液をダイノーミルにより破砕後、遠心分離により上清を得る。得られた上清を５０℃、３０分間の熱処理を行なった後、遠心分離により沈殿物を除き、得られた上清に硫酸プロタミンを添加し核酸を除く。
【００３４】
得られた硫酸プロタミン処理液は、イオン交換クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィーなどに代表される各種カラムクロマトグラフィーにより、さらに精製することができる。前記各種カラムクロマトグラフィーの操作は、５〜１０℃で行なうことが好ましい。
【００３５】
好ましくは、前記のようにして得られた硫酸プロタミン処理液を、ＤＥＡＥ−セファロース ファーストフロー（ファルマシアＬＫＢ）カラムにチャージし、０−０．２Ｍ ＮａＣｌ直線濃度勾配により、溶出させ活性画分を集める。得られた活性画分を、Ｑ−セファロース（ファルマシアＬＫＢ）カラムにチャージし、０−０．２５ＭのＮａＣｌ直線濃度勾配により、溶出させ活性画分を集める。得られた活性画分をフェニルセファロースカラムにチャージし、５％、１０％および３０％のエチレングリコールのステップワイズ濃度勾配により溶出させ活性画分を集める。この活性画分は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により、ほぼ単一のバンドを示す。
【００３６】
本発明における（Ｓ）−α−フェネチルアミン：ピルビン酸トランスアミナーゼの活性測定法は、以下に示す通りである。
【００３７】
酵素調製物０．１ｍＬを下記組成を有する０．１Ｍリン酸カリウム溶液（ｐＨ７．０）０．９ｍＬに添加し、３０℃、１時間反応させた後、１Ｎ ＨＣｌを０．１ｍＬ添加し、生成するアセトフェノンを高速液体グロマトグラフィーにより定量する。
組成：
（Ｓ）−α−フェネチルアミン ２２．５ｍＭ
ピルビン酸 ２２．５ｍＭ
ピリドキサールリン酸 ０．１ｍＭ
【００３８】
高速液体クロマトグラフィーによる測定条件は以下の通りである。
カラム：Ｄｅｖｅｒｏｓｉｌ ＯＤＳ−ＨＧ−３
（ＮＯＭＵＲＡ ＣＨＥＭＩＣＡＬ）
溶離液：アセトニトリル７５０ｍＬ／蒸留水２２５０ｍＬ／ＫＨ2 ＰＯ4 ６．７ ５ｇ／Ｈ3 ＰＯ4 ２．７ｇ
流速 ：１ｍＬ／分
検出 ：２１０ｎｍ
【００３９】
なお、酵素活性の値は、１分間で１μｍｏｌのアセトフェノンを生成する酵素量を１ユニットとする。
【００４０】
上記のような精製酵素において、慣用の技術により、その部分アミノ酸配列の情報を得ることができる。具体的には、例えば、気相プロテインシークエンサー〔４９２ ＰＲＯＴＥＩＮ ＳＥＱＵＥＮＣＥＲ（アプライド バイオシステムズ社製）〕などを用いたエドマン分解法により、直接精製酵素のアミノ酸配列決定を行なうことにより、Ｎ末端アミノ酸配列を決定できる。前記のようにして得られる酵素としては、例えば、配列番号：１記載のアミノ酸配列をＮ末端アミノ酸配列として有する酵素などが挙げられる。かかる酵素も本発明に含まれる。
【００４１】
本発明の酵素は、アミノ基供与体に対する基質特異性に関して、（Ｓ）−α―フェネチルアミンを用いた場合、高い活性を示し、また、アミノ基受容体に対する基質特異性に関して、ピルビン酸およびグリオキシル酸を用いた場合、活性を示す。これらの性質により、本発明の酵素は、（Ｓ）―α―フェネチルアミン：ピルビン酸トランスアミナーゼと特徴づけられる。
【００４２】
下記の表１に示されるように、本発明の（Ｓ）―α―フェネチルアミン：ピルビン酸トランスアミナーゼは、グリシン、ＤＬ−オルニチン、ＤＬ−リシン、Ｌ−アスパラギン酸、ＤＬ−グルタミン酸に作用しないため、従来より知られているα―アミノ酸トランスアミナーゼではないことが示唆される。また、本発明の（Ｓ）―α―フェネチルアミン：ピルビン酸トランスアミナーゼは、塩化アンモニウム等の無機アンモニウム塩にも作用しないため、特公平４−１１１９４号公報記載のブレビバクテリウム由来の酵素とは異なることが示唆される。
【００４３】
【表１】
【００４４】
また、代表的なω−アミノ酸トランスアミナーゼの基質に対して、本発明の（Ｓ）―α―フェネチルアミン：ピルビン酸トランスアミナーゼの反応性と、従来より知られている代表的なω−アミノ酸トランスアミナーゼの反応性とを比較したところ、本発明の酵素は、β−アラニン、タウリン、プトレッシン、４−アミノ酪酸などの代表的なω−アミノ酸トランスアミナーゼの基質に作用せず、（Ｓ）−α−フェネチルアミンに対し特異的に高い活性を示すため、本酵素は、従来のω−アミノ酸トランスアミナーゼとは異なり、特開平３−１０３１９２号公報において使用されている酵素とも明らかに異なることが示される。
【００４５】
ここで、「代表的なω−アミノ酸トランスアミナーゼ」とは、アグリカルチャル・バイオリジカル・ケミストリー（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ）４１巻、１７０１頁（１９７７年）記載のシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属細菌Ｆ−１２６由来のω−アミノ酸：ピルビン酸トランスアミナーゼ；およびアシーブズ・オブ・バイオケミストリー・アンド・バイオフィジクス（Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．）２００巻、１５６頁記載のシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属細菌Ｆ−１２６由来の４−アミノ酪酸：２−ケトグルタル酸トランスアミナーゼである。
【００４６】
以上の点より本発明の（Ｓ）−α−フェネチルアミン：ピルビン酸トランスアミナーゼは従来から知られているトランスアミナーゼとは全く異なる新規酵素であることが示唆される。さらに、本発明の（Ｓ）−α−フェネチルアミン：ピルビン酸トランスアミナーゼは、ピルビン酸のようなα−ケト酸だけでなく、α−ケト酸以外のさまざまなケトン化合物をもアミノ基受容体とし、対応する光学活性アミノ化合物に変換する反応を触媒する能力を有する。
【００４７】
本発明の（Ｓ）−α−フェネチルアミン：ピルビン酸トランスアミナーゼにより、光学活性アミノ化合物の製造方法が提供される。本発明には、かかる光学活性アミノ化合物の製造方法も含まれる。
【００４８】
本発明の光学活性アミノ化合物の製造方法は、本発明の酵素を用いることを１つの大きな特徴とする。本発明においては、かかる酵素を使用するため、該酵素が有する立体選択性に基づいて、高い効率で光学活性アミノ化合物を製造することができる。
【００４９】
本発明の光学活性アミノ化合物の製造方法としては、基質としてアミノ基供与体を用いる方法（以下、製造方法Ｉという）と、その逆反応を利用した、アミノ基受容体を用いる方法（以下、製造方法IIという）が挙げられる。
【００５０】
製造方法Ｉ
（Ｓ）−α―フェネチルアミンなどのアミノ基供与体の存在下、一般式（１）：
【００５１】
【化８】
【００５２】
で表わされるケトン化合物に、本発明の（Ｓ）−α−フェネチルアミン：ピルビン酸トランスアミナーゼを作用させることにより、対応する光学活性アミノ化合物を得ることができる。
【００５３】
前記一般式（１）で表わされるケトン化合物の中では、ｐが０、ｑが０、ｒが１およびＸが水素原子である化合物、またはｐが０、ｑが１、ｒが１およびＸが水素原子である化合物が好ましく、さらに具体的には、例えば、４―クロロアセトフェノン、２―ヒドロキシアセトフェノン、３―ヒドロキシアセトフェノン、４−ヒドロキシアセトフェノン、２−メトキシアセトフェノン、３―メトキシアセトフェノン、４−メトキシアセトフェノン、２，４−ジメトキシアセトフェノン、３，４−ジメトキシアセトフェノン、２−トリフルオロメチルアセトフェノン、３―トリフルオロメチルアセトフェノン、４―トリフルオロメチルアセトフェノン、フェニルアセトン、４' ―クロロフェニルアセトン、２' ―ヒドロキシフェニルアセトン、３' ―ヒドロキシフェニルアセトン、４' −ヒドロキシフェニルアセトン、２' −メトキシフェニルアセトン、３' ―メトキシフェニルアセトン、４' −メトキシフェニルアセトン、２' ，４' −ジメトキシフェニルアセトン、３' ，４' −ジメトキシフェニルアセトン、２' −トリフルオロメチルフェニルアセトン、３' ―トリフルオロメチルフェニルアセトン、４' ―トリフルオロメチルフェニルアセトン、１−ナフチルアセトン、２−ナフチルアセトン、２−アセチルピリジン、３−アセチルピリジン、４−アセチルピリジン、アセチルピラジン、２−アセチルフラン、３−アセチルフラン、２−アセチルチオフェン、３−アセチルチオフェン、２−アセチルチアゾール等が挙げられる。
【００５４】
前記光学活性アミノ化合物の具体例としては、例えば、４−クロロ−α−フェネチルアミン、２−ヒドロキシ−α−フェネチルアミン、３−ヒドロキシ−α−フェネチルアミン、４−ヒドロキシ−α−フェネチルアミン、２−メトキシ−α−フェネチルアミン、３−メトキシ−α−フェネチルアミン、４−メトキシ−α−フェネチルアミン、２，４−ジメトキシ−α−フェネチルアミン、３，４−ジメトキシ−α−フェネチルアミン、２−トリフルオロメチル−α−フェネチルアミン、３−トリフルオロメチル−α−フェネチルアミン、４−トリフルオロメチル−α−フェネチルアミン、１−フェニル−２−アミノプロパン、１−（４−クロロフェニル）−２−アミノプロパン、１−（２−ヒドロキシフェニル）−２−アミノプロパン、１−（３−ヒドロキシフェニル）−２−アミノプロパン、１−（４−ヒドロキシフェニル）−２−アミノプロパン、１−（２−メトキシフェニル）−２−アミノプロパン、１−（３−メトキシフェニル）−２−アミノプロパン、１−（４−メトキシフェニル）−２−アミノプロパン、１−（２，４−ジメトキシフェニル）−２−アミノプロパン、１−（３，４−ジメトキシフェニル）−２−アミノプロパン、１−（２−トリフルオロメチルフェニル）−２−アミノプロパン、１−（３−トリフルオロメチルフェニル）−２−アミノプロパン、１−（４−トリフルオロメチルフェニル）−２−アミノプロパン、１−（１−ナフチル）−２−アミノプロパン、１−（２−ナフチル）−２−アミノプロパン、１−（２−ピリジル）エチルアミン、１−（３−ピリジル）エチルアミン、１−（４−ピリジル）エチルアミン、１−ピラジルエチルアミン、１−（２−フリル）エチルアミン、１−（３−フリル）エチルアミン、１−（２−チエニル）エチルアミン、１−（３−チエニル）エチルアミン、１−（２−チアゾイル）エチルアミン等が挙げられる。
【００５５】
本発明に使用されるアミノ基供与体としては、一般式（３）：
【００５６】
【化９】
【００５７】
で表わされる化合物が挙げられ、かかる化合物には、アキラル、光学活性アミノ化合物およびそのラセミ体が包含される。
【００５８】
前記一般式（３）において、Ｒ1 およびＲ2 は、それぞれ独立して、水素原子、炭素数１〜１４、好ましくは１〜４の置換もしくは無置換のアルキル基または炭素数６〜１４、好ましくは６〜１０の置換もしくは無置換アリール基を示す。
【００５９】
前記Ｒ1 の具体例としては、好ましくは炭素数１〜１０のアルキル基またはフェニル基が挙げられ、前記Ｒ2 の具体例としては、好ましくは水素原子、メチル基、エチル基が挙げられる。
【００６０】
前記一般式（３）で表わされる化合物の具体例としては、α−フェネチルアミン、２―ブチルアミン、２−ペンチルアミン、２―ヘプチルアミン、２―オクチルアミンおよびそれらの光学活性体が挙げられる。
【００６１】
製造方法Ｉにおいては、前記ケトン化合物に、（Ｓ）−α−フェネチルアミン：ピルビン酸トランスアミナーゼをアミノ基供与体の存在下に作用させる際、（Ｓ）−α−フェネチルアミン：ピルビン酸トランスアミナーゼを生産する微生物の培養物、分離した細胞、固定化細胞および無細胞抽出物からなる群より選ばれた１種以上を用いてもよく、あるいは該（Ｓ）−α−フェネチルアミン：ピルビン酸トランスアミナーゼの粗精製酵素、精製酵素および固定化酵素からなる群より選ばれた１種以上を用いてもよい。
【００６２】
反応に用いる基質の濃度としては、ケトン化合物においては、反応液組成中、０．１〜１０重量％、好ましくは１〜５重量％であり、また、アミノ基供与体は、キラルアミンの場合は、主に（Ｓ）体がケトン化合物に対し、８０〜１５０モル％の濃度になるように用いることが好ましい。なお、前記アミノ基供与体としてラセミ体のアミノ化合物を同様の濃度で使用することもできる。
【００６３】
本発明の酵素を作用させる際のｐＨは、酵素の至適ｐＨの観点から、好ましくはｐＨ６．０以上であり、より好ましくはｐＨ７．０以上であり、好ましくはｐＨ１０．０以下であり、より好ましくはｐＨ９．０以下であることが望ましい。 本発明の酵素を作用させる際の温度は、酵素の至適温度および熱安定性の観点から、好ましくは２５℃以上であり、より好ましくは３０℃以上であり、好ましくは６０℃以下であり、より好ましくは５０℃以下である。
【００６４】
製造方法II
本発明の酵素は、キラルなアミノ化合物の一方の立体〔（Ｓ）体〕に特異的に作用するため、一般式（４）：
【００６５】
【化１０】
【００６６】
で表わされるラセミ体のアミノ化合物に、本発明の（Ｓ）−α−フェネチルアミン：ピルビン酸トランスアミナーゼをアミノ基受容体の存在下に作用させることにより、（Ｓ）体のアミノ化合物のみがケトン化合物に変換されるため、対応する（Ｒ）体の光学活性アミノ化合物を得ることができる。
【００６７】
前記一般式（４）において、Ｒ、ｐ、ｑ、ｒおよびＸは、それぞれ前記一般式（１）におけるＲ、ｐ、ｑ、ｒおよびＸと同じ基を示す。
【００６８】
本発明に用いられるアミノ基受容体としては、特に限定するものでないが、具体的には、ピルビン酸、グリオキシル酸、オキサロ酢酸などが挙げられる。
【００６９】
製造方法IIにおいて、一般式（４）で表わされるラセミ体のアミノ化合物に、（Ｓ）−α−フェネチルアミン：ピルビン酸トランスアミナーゼをアミノ基受容体の存在下に作用させる際、（Ｓ）−α−フェネチルアミン：ピルビン酸トランスアミナーゼを生産する微生物の培養物、分離した細胞、固定化細胞および無細胞抽出物からなる群より選ばれた１種以上を用いてもよく、あるいは該（Ｓ）−α−フェネチルアミン：ピルビン酸トランスアミナーゼの粗精製酵素、精製酵素および固定化酵素からなる群より選ばれた１種以上を用いてもよい。
【００７０】
反応に用いる基質の濃度としては、ラセミ体のアミノ化合物においては、反応液組成中、０．１〜２０重量％、好ましくは１〜１０重量％の濃度で用いることが好ましい。また、アミノ基受容体は、ラセミ体のアミノ化合物に対し、３０〜１００モル％、好ましくは５０〜６０モル％の濃度で用いることが好ましい。
【００７１】
本発明の酵素を作用させる際のｐＨは、酵素の至適ｐＨの観点から、好ましくはｐＨ６．０以上であり、より好ましくはｐＨ７．０以上であり、好ましくはｐＨ１０．０以下であり、より好ましくはｐＨ９．０以下であることが望ましい。
【００７２】
本発明の酵素を作用させる際の温度は、酵素の至適温度および熱安定性の観点から、好ましくは２５℃以上であり、より好ましくは３０℃以上であり、好ましくは６０℃以下であり、より好ましくは５０℃以下である。
【００７３】
これらの製造方法により製造された光学活性アミノ化合物の収率および純度は、例えば、反応液を逆相カラム（コスモシル５Ｃ18−ＡＲ、ナカライテスク等）を用い、２５％アセトニトリル等を移動相として分離し、２１０ｎｍの吸収を対照と比較することにより定量分析を行なうことができる。また、光学純度を測定する方法としては、生成したアミノ化合物をＮ−カルボキシ−Ｌ−ロイシンアンヒドライド等と結合させてジアステレオマーを形成させ、これを逆相カラム（コスモシル５Ｃ18−ＡＲ、ナカライテスク等）を用いた高速液体クロマトグラフィーにより測定することができる。
【００７４】
以下、実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例になんら限定されるものではない。
【００７５】
実施例１
国内各地より採取した土壌サンプル各２ｇを５ｍＬの生理食塩水に懸濁し、その上清液０．２ｍＬを４ｍＬのＳ培地（２ｇ／Ｌ ＫＨ2 ＰＯ4 、２ｇ／Ｌ Ｋ2 ＨＰＯ4 、０．３ｇ／Ｌ ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ、０．５ｇ／Ｌ グリセリン、３ｇ／Ｌ ＮａＣｌ、１ｇ／Ｌ イーストエキス、０．００４ｇ／Ｌ ＦｅＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ、０．０００５ｇ／Ｌ ＺｎＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ、０．０００５ｇ／Ｌ ＭｎＣｌ2 ・４Ｈ2 Ｏ、ｐＨ７．５を高圧蒸気殺菌後、除菌フィルター（ＡＤＶＡＮＴＥＣ社製、商品名：ＤＩＳＭＩＣ−２５ＣＳ）でろ過した２−オキソグルタル酸またはピルビン酸と（Ｓ）−１−（３，４−ジメトキシフェニル）−２−アミノプロパンとをそれぞれ最終濃度１．５ｇ／Ｌ、１．０ｇ／Ｌとなるように添加）に加えて、３０℃で３〜７日間集積培養を行った。菌が生育した培養液を１．５％寒天を含むＳ培地プレートに０．２ｍＬずつ塗付し、３０℃で７２時間培養を行なった。生育したコロニーについて、それぞれの菌体をＳ培地で振とう培養（３０℃、２４時間）し、集菌した。ついで、０．１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ８．５）、５０ｍＭピルビン酸、３０ｍＭ（Ｓ）−１−（３，４−ジメトキシフェニル）−２−アミノプロパンを含む０．２５ｍＬの溶液に得られた菌体を懸濁した。得られた菌体懸濁液を３０℃で攪拌しながら２４時間反応させた。 反応終了後のの反応液を薄層クロマトグラフィー〔Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ ６０Ｆ２５４（Ｍｅｒｃｋ社製）、展開液はジエチルエーテル：メタノール：アンモニア水（２７％）＝５０：５０：２〕で分離したのち、生成物である１−（３，４−ジメトキシフェニル）−２−プロパノンの生成を、０．４％の２，４−ジヒドロフェニルヒドラジンを用いて検出した。１−（３，４−ジメトキシフェニル）−２−プロパノンの生成が確認できた菌株については、０．６％ １−（３，４−ジメトキシフェニル）−２−プロパノンおよびアミノ基供与体として０．６％ （Ｓ）−α−フェネチルアミンを含む溶液に、前記Ｓ培地中、３０℃、２４時間培養し、得られた菌体を懸濁したのち、得られた反応液を３０℃で攪拌しながら２日間反応させた。その結果、シュードモナス スピーシーズＫＮＫ４２５株に（Ｓ）選択的なアミノ基転移活性が認められた。
【００７６】
実施例２
土壌より分離したシュードモナス・スピーシーズＫＮＫ４２５を５００ｍＬ容坂口フラスコ中５０ｍＬの培地（組成：５ｇ／Ｌ ＫＨ2 ＰＯ4 、５ｇ／Ｌ Ｋ2 ＨＰＯ4 、１ｇ／Ｌ ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ、０．００５ｇ／Ｌ ＺｎＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ、０．００５ｇ／Ｌ ＦｅＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ、０．００１ｇ／Ｌ ＭｎＣｌ2 ・４Ｈ2 Ｏ，３ｇ／Ｌ ＮａＣｌ、１５ｇ／Ｌ グリセリン、２ｇ／Ｌ イーストエキス、８ｇ／Ｌ プロエキス、２ｇ／Ｌ （ＲＳ）−２−ブチルアミン、１．５ｇ／Ｌ ピルビン酸、ｐＨ７．２）に植菌し、３０℃で１日培養し、前培養液を得た。ついで、５リットル容ミニジャー中３．０リットルの培地（前記培地と同組成）に、得られた前培養液を植菌し、０．５ｖｖｍ、６００ｒｐｍでｐＨ７．５以下で３０℃で２２時間培養した。
【００７７】
ついで、得られた培養液から遠心分離により菌体を集め、０．１％ ２―メルカプトエタノール、０．１ｍＭピリドキサールリン酸を含む０．０５Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．８）３２０ｍＬに懸濁した。
【００７８】
得られた菌体懸濁液をダイノーミルにより破砕後、遠心分離により上清を得た（酵素比活性０．５７Ｕ／ｍｇ）。
【００７９】
得られた上清を５０℃、３０分間の熱処理の後、遠心分離により沈殿物を除き、得られた上清に硫酸プロタミン（１ｇ／２０ｍＬ）を５ｍＬ添加し、核酸を除いた（酵素比活性０．９３Ｕ／ｍｇ）。
【００８０】
得られた硫酸プロタミン処理液を、０．０１％ ２―メルカプトエタノールおよび２０μＭピリドキサールリン酸を含む０．０５Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．８）で予め平衡化したＤＥＡＥ−セファロース ファーストフロー（ファルマシアＬＫＢ）カラム（カラム直径：４．０ｃｍ、高さ１８ｃｍ）にチャージし、０−０．２Ｍ ＮａＣｌ直線濃度勾配により、流速４０ｍＬ／ｈｒで溶出させ活性画分を集めた。得られた活性画分を、０．０１％ ２―メルカプトエタノールおよび２０μＭピリドキサールリン酸を含む０．０５Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．８）２Ｌにより透析を行った後、０．０１％ ２―メルカプトエタノールおよび２０μＭピリドキサールリン酸を含む０．０５Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．８）で予め平衡化したＱ−セファロース（ファルマシアＬＫＢ）カラム（カラム直径：２．４ｃｍ、高さ１７ｃｍ）にチャージし、０−０．２５ＭのＮａＣｌ直線濃度勾配により、流速４０ｍＬ／ｈｒで溶出させ活性画分を集めた（酵素比活性８．３７Ｕ／ｍｇ）。
【００８１】
得られた活性画分を、０．０１％ ２―メルカプトエタノールおよび２０μＭピリドキサールリン酸を含む０．０５Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．８）で予め平衡化したフェニルセファロースカラム（カラム直径：１．４ｃｍ、高さ１５ｃｍ）にチャージし、５％、１０％および３０％のエチレングリコールのステップワイズ濃度勾配により、流速３０ｍＬ／ｈｒで溶出させ活性画分を集めた（酵素比活性１６．４９Ｕ／ｍｇ）。
【００８２】
得られた活性画分を、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供したところ、分子量約４４，０００に相当するところに、単一バンドを形成した。
【００８３】
実施例３
実施例２で得た精製酵素について、その理化学的性質について調べた。
【００８４】
（作用）
（Ｓ）−α−フェネチルアミンとピルビン酸に作用し、それぞれアセトフェノンとアラニンを生成した。
【００８５】
（至適ｐＨ）
０．１Ｍリン酸緩衝液、及び０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液を用い、ｐＨ５〜１０の範囲で（Ｓ）−α−フェネチルアミン：ピルビン酸トランスアミナーゼ活性を測定した。その結果を図１に示す。至適ｐＨは７．０〜９．０であった。
【００８６】
（至適温度）
温度２０〜７０℃の範囲で、緩衝液として０．０５Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．８）を用い、（Ｓ）−α−フェネチルアミン：ピルビン酸トランスアミナーゼ活性を測定した。その結果を図２に示す。至適温度は３０〜５０℃であった。
【００８７】
（熱安定性）
０．０５Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）中、３０〜８０℃、１５分間処理した後、（Ｓ）−α−フェネチルアミン：ピルビン酸トランスアミナーゼ活性を測定した。その結果を図３に示す。処理前の全活性に比べ、３０〜５０℃では、９５％以上の活性が残存していた。
【００８８】
（Ｎ末端配列）
該精製酵素タンパクを気相プロテインシークエンサー（４９２ ＰＲＯＴＥＩＮ ＳＥＱＵＥＮＣＥＲ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ））にて分析することにより、アミノ酸配列を調べた。その結果、該酵素は、配列番号：１に記載されたアミノ酸配列をＮ末端アミノ酸配列として有することが示された。
【００８９】
実施例４
実施例２で得た精製酵素液を用い、本酵素のアミノ基供与体に対する基質特異性について調べた。
【００９０】
精製酵素０．１ｍＬを、各種アミノ化合物２２．５ｍＭ、ピルビン酸２２．５ｍＭ、ピリドキサールリン酸０．１ｍＭを含む０．１Ｍリン酸カリウム溶液（ｐＨ７．０）０．９ｍＬに添加し、３０℃、１時間反応させた後、５分間沸騰水に浸し反応を停止した。反応終了後に得られた反応液を０．２Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液で５倍希釈し、得られた希釈液のうちの０．１ｍＬに１０ｍＭダブシルクロライドのアセトン溶液０．２ｍＬを添加し、７０℃、１５分間反応し、冷却後、１ＮのＨＣｌ ０．１ｍＬを添加した。この反応液を高速液体クロマトグラフィーで分析し、ダブシル化したアラニンを定量した。
【００９１】
高速液体クロマトグラフィーによる測定条件は以下の通りである。
カラム：Ｄｅｖｅｒｏｓｉｌ ＯＤＳ−ＨＧ−３
（ＮＯＭＵＲＡ ＣＨＥＭＩＣＡＬ）
溶離液：アセトニトリル／０．０４５Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．１３）＝
３５／６５（体積比）
流速 ：１ｍＬ／分
検出 ：４３６ｎｍ
【００９２】
その結果を、（Ｓ）−α−フェネチルアミンをアミノ基供与体として用いたときの活性を１００としたときの相対活性で表２に示す。
【００９３】
【表２】
【００９４】
表２に示すように、本酵素は（Ｓ）−α−フェネチルアミンに対し、特に高い活性を示した。
【００９５】
実施例５
実施例２で得た精製酵素液を用い、本酵素のアミノ基受容体に対する基質特異性について調べた。
【００９６】
精製酵素０．１ｍＬを、下記に示す（Ｓ）−α−フェネチルアミン２２．５ｍＭ、各種ケトン化合物２２．５ｍＭ、ピリドキサールリン酸０．１ｍＭを含む０．１Ｍリン酸カリウム溶液（ｐＨ７．０）０．９ｍＬに添加し、３０℃、１時間反応させ、得られた反応液を高速液体クロマトグラフィーで分析し、生成したアセトフェノンを定量した。
【００９７】
高速液体クロマトグラフィーによる測定条件は以下の通りである。
カラム：Ｄｅｖｅｒｏｓｉｌ ＯＤＳ−ＨＧ−３
（ＮＯＭＵＲＡ ＣＨＥＭＩＣＡＬ）
溶離液：アセトニトリル７５０ｍＬ／蒸留水２２５０ｍＬ／ＫＨ2 ＰＯ4 ６．７５ｇ／Ｈ3 ＰＯ4 ２．７ｇ
流速 ：１ｍＬ／分
検出 ：２１０ｎｍ
【００９８】
その結果を、ピルビン酸をアミノ基受容体として用いたときの活性を１００としたときの相対活性で表３に示す。
【００９９】
【表３】
【０１００】
表３に示されるように、本酵素は、ピルビン酸、グリオキシル酸に高い活性を示し、２−ケトグルタル酸には活性を示さなかった。
【０１０１】
実施例６
実施例２で得た精製酵素を用い、本酵素の代表的なω−アミノ酸トランスアミナーゼの基質に対する反応性について、実施例４と同様の方法で調べた。その結果を表４に示す。
【０１０２】
【表４】
【０１０３】
表４に示すように、本酵素は、β−アラニン、タウリン、プトレッシン、４−アミノ酪酸などの代表的なω−アミノ酸トランスアミナーゼの基質に作用せず、（Ｓ）−α−フェネチルアミンに対し特異的に高い活性を示す。
【０１０４】
実施例７
実施例２で得た精製酵素を用い、実施例５と同様な方法で、（Ｓ）−α−フェネチルアミンをアミノ基供与体とした時の各種ケトン化合物に対する活性について調べた。その結果を表５に示す。
【０１０５】
【表５】
【０１０６】
（Ｓ）−α−フェネチルアミンをアミノ基供与体として用いれば表５に示す各種化合物についても活性を有することがわかる。
【０１０７】
実施例８
実施例２で得た精製酵素を用い、実施例５と同様の方法で、（Ｓ）−α−フェネチルアミンをアミノ基供与体として用いた時の実施例７で用いた以外の各種ケトン化合物に対する活性について調べた。その結果を表６に示す。
【０１０８】
【表６】
【０１０９】
表６に示すように、ピルビン酸に対し、高い活性を示す。
【０１１０】
実施例９
精製酵素２ユニット、（Ｓ）−α−フェネチルアミン１０ｍｇ、３−ヒドロキシアセトフェノン１０ｍｇを含む０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）２ｍＬを３０℃で２４時間攪拌し反応させた。反応終了後に得られた反応液を高速液体クロマトグラフィーで分析したところ、７ｍｇの（Ｓ）−３−ヒドロキシ−α−フェネチルアミンが生成していた。その光学純度は９９ｅ．ｅ．％以上であった。
1 Ｈ−ＮＭＲ（４００Ｍｚ，ＣＤＣｌ3 ）： δ＝１．３９−１．４０（ｄ，３Ｈ）、２．７２（ｂｓ，２Ｈ）、４．０５−４．１０（ｑ，１Ｈ）、６．７０−７．１９（４Ｈ）
【０１１１】
実施例１０
精製酵素１ユニット、（Ｓ）−α−フェネチルアミン１０ｍｇ、３’−トリフルオロメチルフェニルアセトン１０ｍｇを含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）２ｍＬを３０℃で２４時間攪拌して反応させた。反応終了後に得られた反応液を高速液体クロマトグラフィーで分析したところ、８．５ｍｇの（Ｓ）−１−（３−トリフルオロメチルフェニル）−２−アミノプロパンが生成していた。その光学純度は９９ｅ．ｅ．％以上であった。
【０１１２】
実施例１１
シュードモナス・スピーシーズＫＮＫ４２５株を１００ｍＬの培地（５ｇ／Ｌ ＫＨ2 ＰＯ4 、５ｇ／Ｌ Ｋ2 ＨＰＯ4 、１ｇ／Ｌ ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ、０．００５ｇ／Ｌ ＺｎＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ、０．００５ｇ／Ｌ ＦｅＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ、０．００１ｇ／Ｌ ＭｎＣｌ2 ・４Ｈ2 Ｏ，３ｇ／Ｌ ＮａＣｌ、１５ｇ／Ｌ グリセリン、２ｇ／Ｌ イーストエキス、８ｇ／Ｌ プロエキス、２ｇ／Ｌ （ＲＳ）−２−ブチルアミン、１．５ｇ／Ｌ ピルビン酸、ｐＨ７．２）で２０時間培養した。この培養液５０ｍＬを遠心分離後、沈殿した菌体を０．１％ ２メルカプトエタノール、０．１ｍＭピリドキサールリン酸を含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）５０ｍＬに懸濁した。この懸濁液を氷上にて超音波破砕した（ＢＲＡＮＳＯＮ ＳＯＮＩＦＩＥＲ２５０、Ｄｕｔｙ Ｃｙｃｌｅ７、Ｏｕｔｐｕｔｃｏｎｔｒｏｌｅ７にて、２分間、１２回）。このようにして得た菌体破砕液は、４Ｕ／ｍＬの（Ｓ）−α−フェネチルアミン：ピルビン酸トランスアミナーゼ活性を有していた。
【０１１３】
実施例１２
実施例１１と同様に培養したシュードモナス・スピーシーズＫＮＫ４２５の培養液１００ｍＬに、（Ｓ）−α−フェネチルアミン１ｇ、３−ヒドロキシアセトフェノン１ｇを添加し、塩酸を用いてｐＨを７．５に調整し、３７℃で２４時間攪拌し反応させた。反応終了後に得られた反応液を実施例５と同様に、高速液体クロマトグラフィーで分析したところ、３−ヒドロキシアセトフェノンの７５％が（Ｓ）−３−ヒドロキシ−α−フェネチルアミンに変換していた。塩酸を用いて、前記反応液のｐＨを２．０に調整し、トルエンを用いて抽出し、有機層にケトン類を除いた。その後、水酸化ナトリウム水溶液を用いて、水層のｐＨを１０．０に調整した後、再びトルエンで抽出したところ、有機層に０．７ｇの（Ｓ）−３−ヒドロキシ−α−フェネチルアミンが含まれていた。その抽出物を蒸発乾固した後、エタノール：水＝１：１を用いて再結晶化することにより、（Ｓ）−３−ヒドロキシ−α−フェネチルアミン０．６５ｇが結晶として得られた。得られた（Ｓ）−３−ヒドロキシ−α−フェネチルアミンの光学純度は９９ｅ．ｅ．％以上であった。
【０１１４】
実施例１３
実施例１１と同様に培養したシュードモナス・スピーシーズＫＮＫ４２５の培養液２ｍＬに２−ブチルアミン２０ｍｇ、３−トリフルオロメチル−フェニルアセトン２０ｍｇを添加し、塩酸を用いてｐＨを７．５に調整したのち、４０℃、２４時間攪拌し反応させた。反応終了後に得られた反応液を高速液体クロマトグラフィーで分析したところ、５０％の３' −トリフルオロメチル−フェニルアセトンが（Ｓ）−３' −トリフルオロメチル−フェニル−２−アミノプロパンに変換されていた。（Ｓ）−３' −トリフルオロメチル−フェニル−２−アミノプロパンの光学純度は９９％ｅ．ｅ．以上であった。
【０１１５】
1 Ｈ−ＮＭＲ（４００Ｍｚ，ＣＤＣｌ3 ）： σ＝１．１２−１．１３（ｄ，３Ｈ）、１．５７（ｂｓ，２Ｈ）、２．５８−２．６３（ｄｄ，１Ｈ）、２．７３−２．７８（ｄｄ，１Ｈ）、３．１６−３．２４（ｍ，１Ｈ）、７．３７−７．４８（４Ｈ）
【０１１６】
実施例１４
実施例１１と同様に培養したシュードモナス・スピーシーズＫＮＫ４２５の培養液２ｍＬに（Ｓ）−α−フェネチルアミン４０ｍｇ、３' −トリフルオロメチル−フェニルアセトン４０ｍｇを添加し、塩酸を用いてｐＨを７．５に調整したのち、４０℃、２４時間攪拌し反応させた。反応終了後に得られた反応液を高速液体クロマトグラフィーで分析したところ、８０％の３' −トリフルオロメチル−フェニルアセトンが（Ｓ）−３−トリフルオロメチル−フェニル−２−アミノプロパンに変換されていた。（Ｓ）−３−トリフルオロメチル−フェニル−２−アミノプロパンの光学純度は９９％ｅ．ｅ．以上であった。
【０１１７】
実施例１５
実施例１１と同様に培養したシュードモナス・スピーシーズＫＮＫ４２５の培養液５０ｍＬを遠心分離により上清を除去し、沈殿した菌体を、０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．８）２０ｍＬに懸濁し、超音波により菌体を破砕した。得られた破砕物を遠心分離することにより沈殿物を除去し、無細胞抽出液１７ｍＬを得た。この無細胞抽出液１７ｍＬに、（Ｓ）−α−フェネチルアミン０．２ｇ、３' −トリフルオロメチル−フェニルアセトン０．２ｇを添加したのち、塩酸を用いてｐＨを７．５に調整後、４０℃、２４時間反応させた。その結果、０．６ｇの（Ｓ）−３' −トリフルオロメチル−フェニル−２−アミノプロパンが生成した。得られた（Ｓ）−３' −トリフルオロメチル−フェニル−２−アミノプロパンの光学純度は９９％ｅ．ｅ．以上であった。
【０１１８】
実施例１６
実施例１１と同様にして培養したシュードモナス・スピーシーズＫＮＫ４２５の培養液２ｍＬにラセミ体のα−フェネチルアミン６０ｍｇ、ピルビン酸３０ｍｇを添加し、水酸化ナトリウム水溶液を用いてｐＨを７．５に調整後、４０℃、２５時間反応させた。その結果、２７ｍｇのα−フェネチルアミンが残存しており、その（Ｒ）体の光学純度は９９％ｅ．ｅ．以上であった。
【０１１９】
実施例１７
実施例１１と同様にして培養したシュードモナス・スピーシーズＫＮＫ４２５の培養液２ｍＬにラセミ体の３−ヒドロキシ−α−フェネチルアミン６０ｍｇ、ピルビン酸３０ｍｇを添加し、水酸化ナトリウム水溶液を用いてｐＨを７．５に調整した。得られた溶液を、４０℃、２５時間攪拌し反応させた。その結果、２７ｍｇの３−ヒドロキシ−α−フェネチルアミンが残存しており、その（Ｒ）体の光学純度は９９％ｅ．ｅ．以上であった。
【０１２０】
実施例１８
ピルビン酸の代わりにグリオキシル酸を用いた以外は、実施例１７と同様に行なうことにより、２６ｍｇの３−ヒドロキシ−α−フェネチルアミンが残存しており、その（Ｒ）体の光学純度は９９％ｅ．ｅ．以上であった。
【０１２１】
実施例１９
ピルビン酸の代わりにオキサロ酢酸を用いた以外は、実施例１７と同様に行なうことにより、２７ｍｇの３−ヒドロキシ−α−フェネチルアミンが残存しており、その（Ｒ）体の光学純度は９９％ｅ．ｅ．以上であった。
【０１２２】
産業上の利用可能性
本発明の（Ｓ）−α−フェネチルアミン：ピルビン酸トランスアミナーゼによれば、ケトン化合物を効率よく光学活性アミノ化合物に変換することができる。本発明の光学活性アミノ化合物の製造方法によれば、高い収率で光学活性アミノ化合物を得ることができ、かつ得られる光学活性アミノ化合物の光学純度が高いため、該製造方法は、医薬品や農薬等の中間体の製造に有用である。
【０１２３】
【配列表】
SEQUENCE LISTING
<110> KANEKA CORPORATION
<120> (S)-α-phenethylamine:pyruvate transaminase
<130> 99-041-PCT
<150> JP 10-309310
<151> 1998-10-30
<160> 1
【０１２４】
<210> 1
<211> 16
<212> PRT
<213> Pseudomonas sp.
<400> 1
Met Tyr Glu Gln Tyr Lys Thr Ala Gln Lys Lys Phe Trp His Pro
1 5 10 15
Met
【図面の簡単な説明】
【図１】 第１図は、（Ｓ）−α−フェネチルアミン：ピルビン酸トランスアミナーゼの至適ｐＨを示す図である。図中、黒丸は０．１Ｍリン酸緩衝液を用いて測定した結果を示し、白抜四角は０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液を用いて測定した結果を示す。
【図２】 第２図は、（Ｓ）−α−フェネチルアミン：ピルビン酸トランスアミナーゼの至適温度を示す図である。
【図３】 第３図は、（Ｓ）−α−フェネチルアミン：ピルビン酸トランスアミナーゼの熱安定性を示す図である。
技術分野
本発明は、アミノ基転移反応により、ケトン化合物を効率よく光学活性アミノ化合物に変換しうる酵素および該酵素を用いた光学活性アミノ化合物の製造方法に関する。得られる光学活性アミノ化合物は、医薬品や農薬等の中間体として利用しうる。
【０００２】
背景技術
生化学的な光学活性アミノ化合物の製法としては、ラセミ体α−フェネチルアミンの微生物による不斉分解法（特開平１−１７４３９８号公報、特開平６―２５３８９１号公報）及びアセトフェノンの微生物によるアミノ化法（特開平４−３６５４９０号公報、特開平６−２５３８７５号公報）による光学活性α−フェネチルアミンの製法等が知られている。しかし、これらの方法においては、反応に関与する酵素の性質、例えば、デヒドロゲナーゼ、オキシダーゼ、アンモニアリアーゼ等について示されていない。さらに、前記方法による光学活性アミノ化合物の生産性も低いため工業的規模での実用化は困難であると考えられる。また、これらの方法には、α―フェネチルアミン以外の光学活性アミノ化合物の製造については記載されていない。
【０００３】
一方、ブレビバクテリウム属微生物を用い、１−（４―メトキシフェニル）−２−プロパノンにアミノ基を転移させることにより光学活性１―（４―メトキシフェニル）―２―アミノプロパンが合成できることが報告されている（特開昭６３−２７３４８６号公報）。前記公報には、反応において還元型補酵素、例えば、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドの添加効果があることが記載されている。このことより、利用している酵素はデヒドロゲナーゼと考えられるが、実体は明らかでない。
【０００４】
また、特公平４―１１１９４号公報には、ブレビバクテリウム属微生物が、塩化アンモニウム存在下、１−（４−メトキシフェニル）−２−プロパノンから（Ｒ）−１−（４−メトキシフェニル）−２−アミノプロパンを生成することが記載されている。本発明者らが前記公報に開示された微生物および基質について追試を行ったところ、非常に再現性に乏しかった。
【０００５】
さらに、特開平３−１０３１９２号公報では、ラセミ体のアミノ化合物にω―アミノ酸トランスアミナーゼを作用させて（Ｓ）体のみを分解し、残った（Ｒ）体を取得することが開示されている。前記公報において、トランスアミナーゼの反応が、ガバクリン、ヒドロキシルアミンなどのトランスアミナーゼの阻害剤で阻害されるため、使用している酵素はω−アミノ酸トランスアミナーゼであるとしている。しかし、阻害剤の作用だけで酵素を特定することは不十分であり、また、ω−アミノ酸に対する使用酵素の反応性については開示されていない。また、この方法によると微生物不斉分解法（特開平１−１７４３９８号公報、特開平６―２５３８９１号公報）同様、光学活性アミノ化合物を得るためには、目的化合物とは逆の光学活性を有するアミノ化合物を分解してしまうため、基質に対する収率は５０％以下に低下し、コスト的に有利な方法とはいえないという欠点を有する。
【０００６】
発明の開示
本発明は、アミノ基転移反応により、ケトン化合物を効率よく光学活性アミノ化合物に変換しうる酵素、該酵素を用いた光学活性アミノ化合物の製造方法および該酵素の生産微生物の培養方法を提供することを目的とする。
【０００７】
本発明者らは、様々な土壌よりスクリーニングを行なった結果、ピルビン酸存在下、（Ｓ）−α―フェネチルアミンをアセトフェノンに変換する（Ｓ）−α−フェネチルアミン：ピルビン酸トランスアミナーゼ活性を有する微生物を土壌より取得することができ、その微生物より該活性を有する酵素を単離、精製することができた。さらに我々は、この（Ｓ）−α−フェネチルアミン：ピルビン酸トランスアミナーゼの反応特性について詳細な検討を行った結果、該酵素は、（Ｓ）−α−フェネチルアミンなどをアミノ基供与体として用いると、ピルビン酸のようなα−ケト酸だけでなく、α−ケト酸以外のケトン化合物にも作用し、対応する光学活性アミノ化合物に変換するという優れた性質を有することを見出し、本発明に至った。
【０００８】
即ち、本発明の要旨は、
〔１〕 下記理化学的性質：
（Ａ）作用：
光学活性（Ｓ）−α−フェネチルアミンとピルビン酸とに作用してそれぞれアセトフェノンとアラニンとを生成するアミノ基転移反応を触媒する、ならびに
（Ｂ）基質特異性：
（ａ）アミノ基供与体：（Ｓ）−α―フェネチルアミンに対し活性を示し、β−アラニン、タウリン、プトレッシン、ＤＬ−オルニチンおよびＤＬ−リシンのそれぞれに対し活性を示さない、および
（ｂ）アミノ基受容体：ピルビン酸およびグリオキシル酸のそれぞれに対し活性を示す、
を有する（Ｓ）−α−フェネチルアミン：ピルビン酸トランスアミナーゼ、
〔２〕 一般式（１）：
【０００９】
【化５】
（式中、ｐは０または１を示し、ｑは０〜８の整数を示し、ｒは０〜４の整数を示し、Ｒは炭素数６〜１４の置換もしくは無置換のアリール基、炭素数４〜１２の複素環基、カルボキシル基、炭素数２〜６のアルコキシカルボニル基、メチル基、または水素原子を示し、Ｘは水酸基、カルボキシル基、炭素数２〜６のアルコキシカルボニル基、または水素原子を示す）で表わされるケトン化合物に、前記〔１〕記載の（Ｓ）−α−フェネチルアミン：ピルビン酸トランスアミナーゼをアミノ基供与体の存在下に作用させることにより、対応する光学活性アミノ化合物を得ることを特徴とする、光学活性アミノ化合物の製造方法、
〔３〕 一般式（４）：
【００１１】
【化６】
（式中、ｐは０もしくは１を示し、ｑは０〜８の整数を示し、ｒは０〜４の整数を示し、Ｒは炭素数６〜１４の置換もしくは無置換のアリール基、炭素数４〜１２の複素環基、カルボキシル基、炭素数２〜６のアルコキシカルボニル基、メチル基、または水素原子を示し、Ｘは水酸基、カルボキシル基、炭素数２〜６のアルコキシカルボニル基、または水素原子を示す）で表わされるラセミ体のアミノ化合物に、前記〔１〕記載の（Ｓ）−α−フェネチルアミン：ピルビン酸トランスアミナーゼをアミノ基受容体の存在下に作用させることにより、対応する光学活性アミノ化合物を得ることを特徴とする、光学活性アミノ化合物の製造方法、ならびに
〔４〕 （Ｓ）−α−フェネチルアミン：ピルビン酸トランスアミナーゼを生産する微生物を培養する際に、該酵素の誘導物質として、プロピルアミン、１−ブチルアミン、２―ブチルアミン、２―ペンチルアミン、イソプロピルアミンおよびイソブチルアミンからなる群より選ばれた１種以上を培地に添加する（Ｓ）−α―フェネチルアミン：ピルビン酸トランスアミナーゼ生産微生物の培養方法、に関する。
【００１３】
発明を実施するための最良の形態
本発明の（Ｓ）−α−フェネチルアミン：ピルビン酸トランスアミナーゼは、下記理化学的性質：
（Ａ）作用：
光学活性（Ｓ）−α−フェネチルアミンとピルビン酸とに作用してそれぞれアセトフェノンとアラニンとを生成するアミノ基転移反応を触媒する、ならびに
（Ｂ）基質特異性：
（ａ）アミノ基供与体：（Ｓ）−α―フェネチルアミンに対し活性を示し、β−アラニン、タウリン、プトレッシン、ＤＬ−オルニチンおよびＤＬ−リシンのそれぞれに対し活性を示さない、および
（ｂ）アミノ基受容体：ピルビン酸およびグリオキシル酸のそれぞれに対し活性を示す、
を有する酵素である。
【００１４】
さらに、本発明の酵素は、（Ｓ）−α−フェネチルアミンとα−ケト酸以外のケトン化合物とにも作用し、アセトフェノンと該ケトン化合物に対応するアミノ化合物とを生成するアミノ基転移反応を触媒しうる。
【００１５】
本発明の酵素は、前記したような基質特異性を有し、立体選択的にアミノ基転移反応を触媒するため、本酵素を用いることにより、光学活性アミノ化合物を従来よりも高い収率で、かつ容易に得ることが可能になる。
【００１６】
さらに、本発明の酵素は、下記理化学的性質：
ａ）分子量：約４４，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
ｂ）至適ｐＨ：７．０〜９．０
ｃ）至適温度：３０〜５０℃
ｄ）熱安定性：ｐＨ７．０、３０〜５０℃の温度で１５分間処理したとき、処理前の全活性の９５％以上の残存活性を保持する、
を有していてもよい。
【００１７】
前記「ケトン化合物」としては、一般式（１）：
【００１８】
【化７】
（式中、ｐは０または１を示し、ｑは０〜８の整数を示し、ｒは０〜４の整数を示し、Ｒは炭素数６〜１４の置換もしくは無置換のアリール基、炭素数４〜１２の複素環基、カルボキシル基、炭素数２〜６のアルコキシカルボニル基、メチル基、または水素原子を示し、Ｘは水酸基、カルボキシル基、炭素数２〜６のアルコキシカルボニル基、または水素原子を示す）で表わされるケトン化合物が挙げられる。かかるケトン化合物としては、例えば、３−メトキシアセトフェノン、２−ヒドロキシアセトフェノン、３−ヒドロキシアセトフェノン、４−クロロアセトフェノン、４’−メトキシアセトフェノン、３’，４’−ジメトキシフェニルアセトン、３’−トリフロオロメチルアセトン、ベンジルアセトン、４−（４’−メトキシフェニル）−２−ブタノン、ベンゾイルアセトン、２−アセチルピリジン、３−アセチルピリジン、４−アセチルピリジン、アセチルピラジン、２−アセチルフラン、２−アセチルチアゾールなどが挙げられる。ただし、本発明の酵素は、２−ケトグルタル酸には作用しないことも特徴の１つである。
【００２０】
前記一般式（１）において、ｐは０または１、ｑは、０〜８、好ましくは０〜４の整数、ｒは、０〜４、好ましくは０〜２の整数を示す。
【００２１】
前記一般式（１）において、Ｒは、炭素数６〜１４、好ましくは６〜１０の置換もしくは無置換のアリール基、炭素数４〜１２、好ましくは４〜８の複素環基、カルボキシル基、炭素数２〜６、好ましくは２〜４のアルコキシカルボニル基、メチル基または水素原子を示す。
【００２２】
前記置換アリール基としては、例えばハロゲン原子、炭素数１〜６、好ましくは１〜４のアルキル基、水酸基、メトキシ基、ニトロ基、モノフルオロメチル基、ジフルオロメチル基およびトリフルオロメチル基からなる群より選ばれた置換基により少なくとも１ヶ所を置換されたアリール基が挙げられる。
【００２３】
Ｒの具体例としては、メチル基、フェニル基、ナフチル基、２−クロロフェニル基、３−クロロフェニル基、４−クロロフェニル基、２―ヒドロキシフェニル基、３−ヒドロキシフェニル基、４−ヒドロキシフェニル基、２―メトキシフェニル基、３−メトキシフェニル基、４−メトキシフェニル基、２，４−ジメトキシフェニル基、３，４−ジメトキシフェニル基、２−トリフルオロメチルフェニル基、３−トリフルオロメチルフェニル基、４−トリフルオロメチルフェニル基、ピリジル基、ピラジニル基、ピロリル基、チエニル基、フリル基、チアゾリル基が挙げられる。
【００２４】
前記一般式（１）において、Ｘは、水酸基、カルボキシル基、炭素数２〜６、好ましくは２〜４のアルコキシカルボニル基または水素原子を示す。
【００２５】
本発明の酵素によれば、（Ｓ）−α−フェネチルアミンと３−ヒドロキシアセトフェノンとに作用し、アセトフェノンと光学活性（Ｓ）−３−α−ヒドロキシ−フェネチルアミンとを生成しうる。
【００２６】
かかる酵素は、例えば、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属の微生物などに存在する。その中で代表的なシュードモナス・スピーシーズは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ． ＫＮＫ４２５と命名・表示され、平成１０年９月２５日（原寄託日）より寄託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−６５２５として、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所〔あて名：日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号（郵便番号３０５−８５６６）〕に寄託されている。前記シュードモナス・スピーシーズＫＮＫ４２５株（以下、単にＫＮＫ４２５株という場合もある）の菌学的な性質を以下に示す。
菌学的性質
細胞の形態 ：桿菌
グラム染色 ：陰性
胞子形成 ：無し
運動性 ：有り
コロニーの形態 ：丸い、規則的な、完全な、クリーム色、
スムースな、光沢のある、平らな、
やや半透明な、直径３ｍｍのコロニー
（イースト−グルコース寒天培地）
生育（３７℃） ：＋
（４１℃） ：−
カタラーゼ ：＋
オキシダーゼ ：＋
ＯＦテスト（グルコース） ：−
【００２７】
前記ＫＮＫ４２５株由来の酵素は、例えば、以下のようにして精製することができる：
【００２８】
まず、シュードモナス・スピーシーズＫＮＫ４２５を、５００ｍＬ容坂口フラスコ中５０ｍＬの培地〔組成：５ｇ／Ｌ ＫＨ2 ＰＯ4 、５ｇ／Ｌ Ｋ2 ＨＰＯ4 、１ｇ／Ｌ ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ、０．００５ｇ／Ｌ ＺｎＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ、０．００５ｇ／Ｌ ＦｅＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ、０．００１ｇ／Ｌ ＭｎＣｌ2 ・４Ｈ2 Ｏ，３ｇ／Ｌ ＮａＣｌ、１５ｇ／Ｌ グリセリン、２ｇ／Ｌ イーストエキス、８ｇ／Ｌ プロエキス、２ｇ／Ｌ （ＲＳ）−２−ブチルアミン、１．５ｇ／Ｌ ピルビン酸、（ｐＨ７．２）〕に植菌し、３０℃で１日培養し、前培養液を得る。ついで、５リットル容ミニジャー中３．０リットルの培地（前記培地と同組成）に、得られた前培養液を植菌し、０．５ｖｖｍ、６００ｒｐｍでｐＨ７．５以下で３０℃で２２時間培養する。
【００２９】
なお、前記微生物を培養する際に、（Ｓ）−α−フェネチルアミン：ピルビン酸トランスアミナーゼの誘導物質として、プロピルアミン、１−ブチルアミン、２―ブチルアミン、２―ペンチルアミン、イソプロピルアミン、イソブチルアミンなどを培地に添加し、培養することもできる。前記誘導物質は、単独でまたは２種以上を混合して用いてもよい。
【００３０】
前記誘導物質の添加量は、特に限定されるものではないが、菌の生育阻害などの観点より、通常培地組成中１重量％以下が好ましい。
【００３１】
また、前記誘導物質の添加時期は、特に限定されるものではなく、培養開始時、または培養途中のいずれでもよい。
【００３２】
ついで、遠心分離により培養液から菌体を集め、０．１％ ２―メルカプトエタノールおよび０．１ｍＭピリドキサールリン酸を含む０．０５Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．８）に懸濁する。
【００３３】
得られた懸濁液をダイノーミルにより破砕後、遠心分離により上清を得る。得られた上清を５０℃、３０分間の熱処理を行なった後、遠心分離により沈殿物を除き、得られた上清に硫酸プロタミンを添加し核酸を除く。
【００３４】
得られた硫酸プロタミン処理液は、イオン交換クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィーなどに代表される各種カラムクロマトグラフィーにより、さらに精製することができる。前記各種カラムクロマトグラフィーの操作は、５〜１０℃で行なうことが好ましい。
【００３５】
好ましくは、前記のようにして得られた硫酸プロタミン処理液を、ＤＥＡＥ−セファロース ファーストフロー（ファルマシアＬＫＢ）カラムにチャージし、０−０．２Ｍ ＮａＣｌ直線濃度勾配により、溶出させ活性画分を集める。得られた活性画分を、Ｑ−セファロース（ファルマシアＬＫＢ）カラムにチャージし、０−０．２５ＭのＮａＣｌ直線濃度勾配により、溶出させ活性画分を集める。得られた活性画分をフェニルセファロースカラムにチャージし、５％、１０％および３０％のエチレングリコールのステップワイズ濃度勾配により溶出させ活性画分を集める。この活性画分は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により、ほぼ単一のバンドを示す。
【００３６】
本発明における（Ｓ）−α−フェネチルアミン：ピルビン酸トランスアミナーゼの活性測定法は、以下に示す通りである。
【００３７】
酵素調製物０．１ｍＬを下記組成を有する０．１Ｍリン酸カリウム溶液（ｐＨ７．０）０．９ｍＬに添加し、３０℃、１時間反応させた後、１Ｎ ＨＣｌを０．１ｍＬ添加し、生成するアセトフェノンを高速液体グロマトグラフィーにより定量する。
組成：
（Ｓ）−α−フェネチルアミン ２２．５ｍＭ
ピルビン酸 ２２．５ｍＭ
ピリドキサールリン酸 ０．１ｍＭ
【００３８】
高速液体クロマトグラフィーによる測定条件は以下の通りである。
カラム：Ｄｅｖｅｒｏｓｉｌ ＯＤＳ−ＨＧ−３
（ＮＯＭＵＲＡ ＣＨＥＭＩＣＡＬ）
溶離液：アセトニトリル７５０ｍＬ／蒸留水２２５０ｍＬ／ＫＨ2 ＰＯ4 ６．７ ５ｇ／Ｈ3 ＰＯ4 ２．７ｇ
流速 ：１ｍＬ／分
検出 ：２１０ｎｍ
【００３９】
なお、酵素活性の値は、１分間で１μｍｏｌのアセトフェノンを生成する酵素量を１ユニットとする。
【００４０】
上記のような精製酵素において、慣用の技術により、その部分アミノ酸配列の情報を得ることができる。具体的には、例えば、気相プロテインシークエンサー〔４９２ ＰＲＯＴＥＩＮ ＳＥＱＵＥＮＣＥＲ（アプライド バイオシステムズ社製）〕などを用いたエドマン分解法により、直接精製酵素のアミノ酸配列決定を行なうことにより、Ｎ末端アミノ酸配列を決定できる。前記のようにして得られる酵素としては、例えば、配列番号：１記載のアミノ酸配列をＮ末端アミノ酸配列として有する酵素などが挙げられる。かかる酵素も本発明に含まれる。
【００４１】
本発明の酵素は、アミノ基供与体に対する基質特異性に関して、（Ｓ）−α―フェネチルアミンを用いた場合、高い活性を示し、また、アミノ基受容体に対する基質特異性に関して、ピルビン酸およびグリオキシル酸を用いた場合、活性を示す。これらの性質により、本発明の酵素は、（Ｓ）―α―フェネチルアミン：ピルビン酸トランスアミナーゼと特徴づけられる。
【００４２】
下記の表１に示されるように、本発明の（Ｓ）―α―フェネチルアミン：ピルビン酸トランスアミナーゼは、グリシン、ＤＬ−オルニチン、ＤＬ−リシン、Ｌ−アスパラギン酸、ＤＬ−グルタミン酸に作用しないため、従来より知られているα―アミノ酸トランスアミナーゼではないことが示唆される。また、本発明の（Ｓ）―α―フェネチルアミン：ピルビン酸トランスアミナーゼは、塩化アンモニウム等の無機アンモニウム塩にも作用しないため、特公平４−１１１９４号公報記載のブレビバクテリウム由来の酵素とは異なることが示唆される。
【００４３】
【表１】
また、代表的なω−アミノ酸トランスアミナーゼの基質に対して、本発明の（Ｓ）―α―フェネチルアミン：ピルビン酸トランスアミナーゼの反応性と、従来より知られている代表的なω−アミノ酸トランスアミナーゼの反応性とを比較したところ、本発明の酵素は、β−アラニン、タウリン、プトレッシン、４−アミノ酪酸などの代表的なω−アミノ酸トランスアミナーゼの基質に作用せず、（Ｓ）−α−フェネチルアミンに対し特異的に高い活性を示すため、本酵素は、従来のω−アミノ酸トランスアミナーゼとは異なり、特開平３−１０３１９２号公報において使用されている酵素とも明らかに異なることが示される。
【００４５】
ここで、「代表的なω−アミノ酸トランスアミナーゼ」とは、アグリカルチャル・バイオリジカル・ケミストリー（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ）４１巻、１７０１頁（１９７７年）記載のシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属細菌Ｆ−１２６由来のω−アミノ酸：ピルビン酸トランスアミナーゼ；およびアシーブズ・オブ・バイオケミストリー・アンド・バイオフィジクス（Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．）２００巻、１５６頁記載のシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属細菌Ｆ−１２６由来の４−アミノ酪酸：２−ケトグルタル酸トランスアミナーゼである。
【００４６】
以上の点より本発明の（Ｓ）−α−フェネチルアミン：ピルビン酸トランスアミナーゼは従来から知られているトランスアミナーゼとは全く異なる新規酵素であることが示唆される。さらに、本発明の（Ｓ）−α−フェネチルアミン：ピルビン酸トランスアミナーゼは、ピルビン酸のようなα−ケト酸だけでなく、α−ケト酸以外のさまざまなケトン化合物をもアミノ基受容体とし、対応する光学活性アミノ化合物に変換する反応を触媒する能力を有する。
【００４７】
本発明の（Ｓ）−α−フェネチルアミン：ピルビン酸トランスアミナーゼにより、光学活性アミノ化合物の製造方法が提供される。本発明には、かかる光学活性アミノ化合物の製造方法も含まれる。
【００４８】
本発明の光学活性アミノ化合物の製造方法は、本発明の酵素を用いることを１つの大きな特徴とする。本発明においては、かかる酵素を使用するため、該酵素が有する立体選択性に基づいて、高い効率で光学活性アミノ化合物を製造することができる。
【００４９】
本発明の光学活性アミノ化合物の製造方法としては、基質としてアミノ基供与体を用いる方法（以下、製造方法Ｉという）と、その逆反応を利用した、アミノ基受容体を用いる方法（以下、製造方法IIという）が挙げられる。
【００５０】
製造方法Ｉ
（Ｓ）−α―フェネチルアミンなどのアミノ基供与体の存在下、一般式（１）：
【００５１】
【化８】
で表わされるケトン化合物に、本発明の（Ｓ）−α−フェネチルアミン：ピルビン酸トランスアミナーゼを作用させることにより、対応する光学活性アミノ化合物を得ることができる。
【００５３】
前記一般式（１）で表わされるケトン化合物の中では、ｐが０、ｑが０、ｒが１およびＸが水素原子である化合物、またはｐが０、ｑが１、ｒが１およびＸが水素原子である化合物が好ましく、さらに具体的には、例えば、４―クロロアセトフェノン、２―ヒドロキシアセトフェノン、３―ヒドロキシアセトフェノン、４−ヒドロキシアセトフェノン、２−メトキシアセトフェノン、３―メトキシアセトフェノン、４−メトキシアセトフェノン、２，４−ジメトキシアセトフェノン、３，４−ジメトキシアセトフェノン、２−トリフルオロメチルアセトフェノン、３―トリフルオロメチルアセトフェノン、４―トリフルオロメチルアセトフェノン、フェニルアセトン、４' ―クロロフェニルアセトン、２' ―ヒドロキシフェニルアセトン、３' ―ヒドロキシフェニルアセトン、４' −ヒドロキシフェニルアセトン、２' −メトキシフェニルアセトン、３' ―メトキシフェニルアセトン、４' −メトキシフェニルアセトン、２' ，４' −ジメトキシフェニルアセトン、３' ，４' −ジメトキシフェニルアセトン、２' −トリフルオロメチルフェニルアセトン、３' ―トリフルオロメチルフェニルアセトン、４' ―トリフルオロメチルフェニルアセトン、１−ナフチルアセトン、２−ナフチルアセトン、２−アセチルピリジン、３−アセチルピリジン、４−アセチルピリジン、アセチルピラジン、２−アセチルフラン、３−アセチルフラン、２−アセチルチオフェン、３−アセチルチオフェン、２−アセチルチアゾール等が挙げられる。
【００５４】
前記光学活性アミノ化合物の具体例としては、例えば、４−クロロ−α−フェネチルアミン、２−ヒドロキシ−α−フェネチルアミン、３−ヒドロキシ−α−フェネチルアミン、４−ヒドロキシ−α−フェネチルアミン、２−メトキシ−α−フェネチルアミン、３−メトキシ−α−フェネチルアミン、４−メトキシ−α−フェネチルアミン、２，４−ジメトキシ−α−フェネチルアミン、３，４−ジメトキシ−α−フェネチルアミン、２−トリフルオロメチル−α−フェネチルアミン、３−トリフルオロメチル−α−フェネチルアミン、４−トリフルオロメチル−α−フェネチルアミン、１−フェニル−２−アミノプロパン、１−（４−クロロフェニル）−２−アミノプロパン、１−（２−ヒドロキシフェニル）−２−アミノプロパン、１−（３−ヒドロキシフェニル）−２−アミノプロパン、１−（４−ヒドロキシフェニル）−２−アミノプロパン、１−（２−メトキシフェニル）−２−アミノプロパン、１−（３−メトキシフェニル）−２−アミノプロパン、１−（４−メトキシフェニル）−２−アミノプロパン、１−（２，４−ジメトキシフェニル）−２−アミノプロパン、１−（３，４−ジメトキシフェニル）−２−アミノプロパン、１−（２−トリフルオロメチルフェニル）−２−アミノプロパン、１−（３−トリフルオロメチルフェニル）−２−アミノプロパン、１−（４−トリフルオロメチルフェニル）−２−アミノプロパン、１−（１−ナフチル）−２−アミノプロパン、１−（２−ナフチル）−２−アミノプロパン、１−（２−ピリジル）エチルアミン、１−（３−ピリジル）エチルアミン、１−（４−ピリジル）エチルアミン、１−ピラジルエチルアミン、１−（２−フリル）エチルアミン、１−（３−フリル）エチルアミン、１−（２−チエニル）エチルアミン、１−（３−チエニル）エチルアミン、１−（２−チアゾイル）エチルアミン等が挙げられる。
【００５５】
本発明に使用されるアミノ基供与体としては、一般式（３）：
【００５６】
【化９】
で表わされる化合物が挙げられ、かかる化合物には、アキラル、光学活性アミノ化合物およびそのラセミ体が包含される。
【００５８】
前記一般式（３）において、Ｒ1 およびＲ2 は、それぞれ独立して、水素原子、炭素数１〜１４、好ましくは１〜４の置換もしくは無置換のアルキル基または炭素数６〜１４、好ましくは６〜１０の置換もしくは無置換アリール基を示す。
【００５９】
前記Ｒ1 の具体例としては、好ましくは炭素数１〜１０のアルキル基またはフェニル基が挙げられ、前記Ｒ2 の具体例としては、好ましくは水素原子、メチル基、エチル基が挙げられる。
【００６０】
前記一般式（３）で表わされる化合物の具体例としては、α−フェネチルアミン、２―ブチルアミン、２−ペンチルアミン、２―ヘプチルアミン、２―オクチルアミンおよびそれらの光学活性体が挙げられる。
【００６１】
製造方法Ｉにおいては、前記ケトン化合物に、（Ｓ）−α−フェネチルアミン：ピルビン酸トランスアミナーゼをアミノ基供与体の存在下に作用させる際、（Ｓ）−α−フェネチルアミン：ピルビン酸トランスアミナーゼを生産する微生物の培養物、分離した細胞、固定化細胞および無細胞抽出物からなる群より選ばれた１種以上を用いてもよく、あるいは該（Ｓ）−α−フェネチルアミン：ピルビン酸トランスアミナーゼの粗精製酵素、精製酵素および固定化酵素からなる群より選ばれた１種以上を用いてもよい。
【００６２】
反応に用いる基質の濃度としては、ケトン化合物においては、反応液組成中、０．１〜１０重量％、好ましくは１〜５重量％であり、また、アミノ基供与体は、キラルアミンの場合は、主に（Ｓ）体がケトン化合物に対し、８０〜１５０モル％の濃度になるように用いることが好ましい。なお、前記アミノ基供与体としてラセミ体のアミノ化合物を同様の濃度で使用することもできる。
【００６３】
本発明の酵素を作用させる際のｐＨは、酵素の至適ｐＨの観点から、好ましくはｐＨ６．０以上であり、より好ましくはｐＨ７．０以上であり、好ましくはｐＨ１０．０以下であり、より好ましくはｐＨ９．０以下であることが望ましい。 本発明の酵素を作用させる際の温度は、酵素の至適温度および熱安定性の観点から、好ましくは２５℃以上であり、より好ましくは３０℃以上であり、好ましくは６０℃以下であり、より好ましくは５０℃以下である。
【００６４】
製造方法II
本発明の酵素は、キラルなアミノ化合物の一方の立体〔（Ｓ）体〕に特異的に作用するため、一般式（４）：
【００６５】
【化１０】
で表わされるラセミ体のアミノ化合物に、本発明の（Ｓ）−α−フェネチルアミン：ピルビン酸トランスアミナーゼをアミノ基受容体の存在下に作用させることにより、（Ｓ）体のアミノ化合物のみがケトン化合物に変換されるため、対応する（Ｒ）体の光学活性アミノ化合物を得ることができる。
【００６７】
前記一般式（４）において、Ｒ、ｐ、ｑ、ｒおよびＸは、それぞれ前記一般式（１）におけるＲ、ｐ、ｑ、ｒおよびＸと同じ基を示す。
【００６８】
本発明に用いられるアミノ基受容体としては、特に限定するものでないが、具体的には、ピルビン酸、グリオキシル酸、オキサロ酢酸などが挙げられる。
【００６９】
製造方法IIにおいて、一般式（４）で表わされるラセミ体のアミノ化合物に、（Ｓ）−α−フェネチルアミン：ピルビン酸トランスアミナーゼをアミノ基受容体の存在下に作用させる際、（Ｓ）−α−フェネチルアミン：ピルビン酸トランスアミナーゼを生産する微生物の培養物、分離した細胞、固定化細胞および無細胞抽出物からなる群より選ばれた１種以上を用いてもよく、あるいは該（Ｓ）−α−フェネチルアミン：ピルビン酸トランスアミナーゼの粗精製酵素、精製酵素および固定化酵素からなる群より選ばれた１種以上を用いてもよい。
【００７０】
反応に用いる基質の濃度としては、ラセミ体のアミノ化合物においては、反応液組成中、０．１〜２０重量％、好ましくは１〜１０重量％の濃度で用いることが好ましい。また、アミノ基受容体は、ラセミ体のアミノ化合物に対し、３０〜１００モル％、好ましくは５０〜６０モル％の濃度で用いることが好ましい。
【００７１】
本発明の酵素を作用させる際のｐＨは、酵素の至適ｐＨの観点から、好ましくはｐＨ６．０以上であり、より好ましくはｐＨ７．０以上であり、好ましくはｐＨ１０．０以下であり、より好ましくはｐＨ９．０以下であることが望ましい。
【００７２】
本発明の酵素を作用させる際の温度は、酵素の至適温度および熱安定性の観点から、好ましくは２５℃以上であり、より好ましくは３０℃以上であり、好ましくは６０℃以下であり、より好ましくは５０℃以下である。
【００７３】
これらの製造方法により製造された光学活性アミノ化合物の収率および純度は、例えば、反応液を逆相カラム（コスモシル５Ｃ18−ＡＲ、ナカライテスク等）を用い、２５％アセトニトリル等を移動相として分離し、２１０ｎｍの吸収を対照と比較することにより定量分析を行なうことができる。また、光学純度を測定する方法としては、生成したアミノ化合物をＮ−カルボキシ−Ｌ−ロイシンアンヒドライド等と結合させてジアステレオマーを形成させ、これを逆相カラム（コスモシル５Ｃ18−ＡＲ、ナカライテスク等）を用いた高速液体クロマトグラフィーにより測定することができる。
【００７４】
以下、実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例になんら限定されるものではない。
【００７５】
実施例１
国内各地より採取した土壌サンプル各２ｇを５ｍＬの生理食塩水に懸濁し、その上清液０．２ｍＬを４ｍＬのＳ培地（２ｇ／Ｌ ＫＨ2 ＰＯ4 、２ｇ／Ｌ Ｋ2 ＨＰＯ4 、０．３ｇ／Ｌ ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ、０．５ｇ／Ｌ グリセリン、３ｇ／Ｌ ＮａＣｌ、１ｇ／Ｌ イーストエキス、０．００４ｇ／Ｌ ＦｅＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ、０．０００５ｇ／Ｌ ＺｎＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ、０．０００５ｇ／Ｌ ＭｎＣｌ2 ・４Ｈ2 Ｏ、ｐＨ７．５を高圧蒸気殺菌後、除菌フィルター（ＡＤＶＡＮＴＥＣ社製、商品名：ＤＩＳＭＩＣ−２５ＣＳ）でろ過した２−オキソグルタル酸またはピルビン酸と（Ｓ）−１−（３，４−ジメトキシフェニル）−２−アミノプロパンとをそれぞれ最終濃度１．５ｇ／Ｌ、１．０ｇ／Ｌとなるように添加）に加えて、３０℃で３〜７日間集積培養を行った。菌が生育した培養液を１．５％寒天を含むＳ培地プレートに０．２ｍＬずつ塗付し、３０℃で７２時間培養を行なった。生育したコロニーについて、それぞれの菌体をＳ培地で振とう培養（３０℃、２４時間）し、集菌した。ついで、０．１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ８．５）、５０ｍＭピルビン酸、３０ｍＭ（Ｓ）−１−（３，４−ジメトキシフェニル）−２−アミノプロパンを含む０．２５ｍＬの溶液に得られた菌体を懸濁した。得られた菌体懸濁液を３０℃で攪拌しながら２４時間反応させた。 反応終了後のの反応液を薄層クロマトグラフィー〔Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ ６０Ｆ２５４（Ｍｅｒｃｋ社製）、展開液はジエチルエーテル：メタノール：アンモニア水（２７％）＝５０：５０：２〕で分離したのち、生成物である１−（３，４−ジメトキシフェニル）−２−プロパノンの生成を、０．４％の２，４−ジヒドロフェニルヒドラジンを用いて検出した。１−（３，４−ジメトキシフェニル）−２−プロパノンの生成が確認できた菌株については、０．６％ １−（３，４−ジメトキシフェニル）−２−プロパノンおよびアミノ基供与体として０．６％ （Ｓ）−α−フェネチルアミンを含む溶液に、前記Ｓ培地中、３０℃、２４時間培養し、得られた菌体を懸濁したのち、得られた反応液を３０℃で攪拌しながら２日間反応させた。その結果、シュードモナス スピーシーズＫＮＫ４２５株に（Ｓ）選択的なアミノ基転移活性が認められた。
【００７６】
実施例２
土壌より分離したシュードモナス・スピーシーズＫＮＫ４２５を５００ｍＬ容坂口フラスコ中５０ｍＬの培地（組成：５ｇ／Ｌ ＫＨ2 ＰＯ4 、５ｇ／Ｌ Ｋ2 ＨＰＯ4 、１ｇ／Ｌ ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ、０．００５ｇ／Ｌ ＺｎＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ、０．００５ｇ／Ｌ ＦｅＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ、０．００１ｇ／Ｌ ＭｎＣｌ2 ・４Ｈ2 Ｏ，３ｇ／Ｌ ＮａＣｌ、１５ｇ／Ｌ グリセリン、２ｇ／Ｌ イーストエキス、８ｇ／Ｌ プロエキス、２ｇ／Ｌ （ＲＳ）−２−ブチルアミン、１．５ｇ／Ｌ ピルビン酸、ｐＨ７．２）に植菌し、３０℃で１日培養し、前培養液を得た。ついで、５リットル容ミニジャー中３．０リットルの培地（前記培地と同組成）に、得られた前培養液を植菌し、０．５ｖｖｍ、６００ｒｐｍでｐＨ７．５以下で３０℃で２２時間培養した。
【００７７】
ついで、得られた培養液から遠心分離により菌体を集め、０．１％ ２―メルカプトエタノール、０．１ｍＭピリドキサールリン酸を含む０．０５Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．８）３２０ｍＬに懸濁した。
【００７８】
得られた菌体懸濁液をダイノーミルにより破砕後、遠心分離により上清を得た（酵素比活性０．５７Ｕ／ｍｇ）。
【００７９】
得られた上清を５０℃、３０分間の熱処理の後、遠心分離により沈殿物を除き、得られた上清に硫酸プロタミン（１ｇ／２０ｍＬ）を５ｍＬ添加し、核酸を除いた（酵素比活性０．９３Ｕ／ｍｇ）。
【００８０】
得られた硫酸プロタミン処理液を、０．０１％ ２―メルカプトエタノールおよび２０μＭピリドキサールリン酸を含む０．０５Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．８）で予め平衡化したＤＥＡＥ−セファロース ファーストフロー（ファルマシアＬＫＢ）カラム（カラム直径：４．０ｃｍ、高さ１８ｃｍ）にチャージし、０−０．２Ｍ ＮａＣｌ直線濃度勾配により、流速４０ｍＬ／ｈｒで溶出させ活性画分を集めた。得られた活性画分を、０．０１％ ２―メルカプトエタノールおよび２０μＭピリドキサールリン酸を含む０．０５Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．８）２Ｌにより透析を行った後、０．０１％ ２―メルカプトエタノールおよび２０μＭピリドキサールリン酸を含む０．０５Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．８）で予め平衡化したＱ−セファロース（ファルマシアＬＫＢ）カラム（カラム直径：２．４ｃｍ、高さ１７ｃｍ）にチャージし、０−０．２５ＭのＮａＣｌ直線濃度勾配により、流速４０ｍＬ／ｈｒで溶出させ活性画分を集めた（酵素比活性８．３７Ｕ／ｍｇ）。
【００８１】
得られた活性画分を、０．０１％ ２―メルカプトエタノールおよび２０μＭピリドキサールリン酸を含む０．０５Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．８）で予め平衡化したフェニルセファロースカラム（カラム直径：１．４ｃｍ、高さ１５ｃｍ）にチャージし、５％、１０％および３０％のエチレングリコールのステップワイズ濃度勾配により、流速３０ｍＬ／ｈｒで溶出させ活性画分を集めた（酵素比活性１６．４９Ｕ／ｍｇ）。
【００８２】
得られた活性画分を、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供したところ、分子量約４４，０００に相当するところに、単一バンドを形成した。
【００８３】
実施例３
実施例２で得た精製酵素について、その理化学的性質について調べた。
【００８４】
（作用）
（Ｓ）−α−フェネチルアミンとピルビン酸に作用し、それぞれアセトフェノンとアラニンを生成した。
【００８５】
（至適ｐＨ）
０．１Ｍリン酸緩衝液、及び０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液を用い、ｐＨ５〜１０の範囲で（Ｓ）−α−フェネチルアミン：ピルビン酸トランスアミナーゼ活性を測定した。その結果を図１に示す。至適ｐＨは７．０〜９．０であった。
【００８６】
（至適温度）
温度２０〜７０℃の範囲で、緩衝液として０．０５Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．８）を用い、（Ｓ）−α−フェネチルアミン：ピルビン酸トランスアミナーゼ活性を測定した。その結果を図２に示す。至適温度は３０〜５０℃であった。
【００８７】
（熱安定性）
０．０５Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）中、３０〜８０℃、１５分間処理した後、（Ｓ）−α−フェネチルアミン：ピルビン酸トランスアミナーゼ活性を測定した。その結果を図３に示す。処理前の全活性に比べ、３０〜５０℃では、９５％以上の活性が残存していた。
【００８８】
（Ｎ末端配列）
該精製酵素タンパクを気相プロテインシークエンサー（４９２ ＰＲＯＴＥＩＮ ＳＥＱＵＥＮＣＥＲ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ））にて分析することにより、アミノ酸配列を調べた。その結果、該酵素は、配列番号：１に記載されたアミノ酸配列をＮ末端アミノ酸配列として有することが示された。
【００８９】
実施例４
実施例２で得た精製酵素液を用い、本酵素のアミノ基供与体に対する基質特異性について調べた。
【００９０】
精製酵素０．１ｍＬを、各種アミノ化合物２２．５ｍＭ、ピルビン酸２２．５ｍＭ、ピリドキサールリン酸０．１ｍＭを含む０．１Ｍリン酸カリウム溶液（ｐＨ７．０）０．９ｍＬに添加し、３０℃、１時間反応させた後、５分間沸騰水に浸し反応を停止した。反応終了後に得られた反応液を０．２Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液で５倍希釈し、得られた希釈液のうちの０．１ｍＬに１０ｍＭダブシルクロライドのアセトン溶液０．２ｍＬを添加し、７０℃、１５分間反応し、冷却後、１ＮのＨＣｌ ０．１ｍＬを添加した。この反応液を高速液体クロマトグラフィーで分析し、ダブシル化したアラニンを定量した。
【００９１】
高速液体クロマトグラフィーによる測定条件は以下の通りである。
カラム：Ｄｅｖｅｒｏｓｉｌ ＯＤＳ−ＨＧ−３
（ＮＯＭＵＲＡ ＣＨＥＭＩＣＡＬ）
溶離液：アセトニトリル／０．０４５Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．１３）＝
３５／６５（体積比）
流速 ：１ｍＬ／分
検出 ：４３６ｎｍ
【００９２】
その結果を、（Ｓ）−α−フェネチルアミンをアミノ基供与体として用いたときの活性を１００としたときの相対活性で表２に示す。
【００９３】
【表２】
表２に示すように、本酵素は（Ｓ）−α−フェネチルアミンに対し、特に高い活性を示した。
【００９５】
実施例５
実施例２で得た精製酵素液を用い、本酵素のアミノ基受容体に対する基質特異性について調べた。
【００９６】
精製酵素０．１ｍＬを、下記に示す（Ｓ）−α−フェネチルアミン２２．５ｍＭ、各種ケトン化合物２２．５ｍＭ、ピリドキサールリン酸０．１ｍＭを含む０．１Ｍリン酸カリウム溶液（ｐＨ７．０）０．９ｍＬに添加し、３０℃、１時間反応させ、得られた反応液を高速液体クロマトグラフィーで分析し、生成したアセトフェノンを定量した。
【００９７】
高速液体クロマトグラフィーによる測定条件は以下の通りである。
カラム：Ｄｅｖｅｒｏｓｉｌ ＯＤＳ−ＨＧ−３
（ＮＯＭＵＲＡ ＣＨＥＭＩＣＡＬ）
溶離液：アセトニトリル７５０ｍＬ／蒸留水２２５０ｍＬ／ＫＨ2 ＰＯ4 ６．７５ｇ／Ｈ3 ＰＯ4 ２．７ｇ
流速 ：１ｍＬ／分
検出 ：２１０ｎｍ
【００９８】
その結果を、ピルビン酸をアミノ基受容体として用いたときの活性を１００としたときの相対活性で表３に示す。
【００９９】
【表３】
表３に示されるように、本酵素は、ピルビン酸、グリオキシル酸に高い活性を示し、２−ケトグルタル酸には活性を示さなかった。
【０１０１】
実施例６
実施例２で得た精製酵素を用い、本酵素の代表的なω−アミノ酸トランスアミナーゼの基質に対する反応性について、実施例４と同様の方法で調べた。その結果を表４に示す。
【０１０２】
【表４】
表４に示すように、本酵素は、β−アラニン、タウリン、プトレッシン、４−アミノ酪酸などの代表的なω−アミノ酸トランスアミナーゼの基質に作用せず、（Ｓ）−α−フェネチルアミンに対し特異的に高い活性を示す。
【０１０４】
実施例７
実施例２で得た精製酵素を用い、実施例５と同様な方法で、（Ｓ）−α−フェネチルアミンをアミノ基供与体とした時の各種ケトン化合物に対する活性について調べた。その結果を表５に示す。
【０１０５】
【表５】
（Ｓ）−α−フェネチルアミンをアミノ基供与体として用いれば表５に示す各種化合物についても活性を有することがわかる。
【０１０７】
実施例８
実施例２で得た精製酵素を用い、実施例５と同様の方法で、（Ｓ）−α−フェネチルアミンをアミノ基供与体として用いた時の実施例７で用いた以外の各種ケトン化合物に対する活性について調べた。その結果を表６に示す。
【０１０８】
【表６】
表６に示すように、ピルビン酸に対し、高い活性を示す。
【０１１０】
実施例９
精製酵素２ユニット、（Ｓ）−α−フェネチルアミン１０ｍｇ、３−ヒドロキシアセトフェノン１０ｍｇを含む０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）２ｍＬを３０℃で２４時間攪拌し反応させた。反応終了後に得られた反応液を高速液体クロマトグラフィーで分析したところ、７ｍｇの（Ｓ）−３−ヒドロキシ−α−フェネチルアミンが生成していた。その光学純度は９９ｅ．ｅ．％以上であった。
1 Ｈ−ＮＭＲ（４００Ｍｚ，ＣＤＣｌ3 ）： δ＝１．３９−１．４０（ｄ，３Ｈ）、２．７２（ｂｓ，２Ｈ）、４．０５−４．１０（ｑ，１Ｈ）、６．７０−７．１９（４Ｈ）
【０１１１】
実施例１０
精製酵素１ユニット、（Ｓ）−α−フェネチルアミン１０ｍｇ、３’−トリフルオロメチルフェニルアセトン１０ｍｇを含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）２ｍＬを３０℃で２４時間攪拌して反応させた。反応終了後に得られた反応液を高速液体クロマトグラフィーで分析したところ、８．５ｍｇの（Ｓ）−１−（３−トリフルオロメチルフェニル）−２−アミノプロパンが生成していた。その光学純度は９９ｅ．ｅ．％以上であった。
【０１１２】
実施例１１
シュードモナス・スピーシーズＫＮＫ４２５株を１００ｍＬの培地（５ｇ／Ｌ ＫＨ2 ＰＯ4 、５ｇ／Ｌ Ｋ2 ＨＰＯ4 、１ｇ／Ｌ ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ、０．００５ｇ／Ｌ ＺｎＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ、０．００５ｇ／Ｌ ＦｅＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ、０．００１ｇ／Ｌ ＭｎＣｌ2 ・４Ｈ2 Ｏ，３ｇ／Ｌ ＮａＣｌ、１５ｇ／Ｌ グリセリン、２ｇ／Ｌ イーストエキス、８ｇ／Ｌ プロエキス、２ｇ／Ｌ （ＲＳ）−２−ブチルアミン、１．５ｇ／Ｌ ピルビン酸、ｐＨ７．２）で２０時間培養した。この培養液５０ｍＬを遠心分離後、沈殿した菌体を０．１％ ２メルカプトエタノール、０．１ｍＭピリドキサールリン酸を含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）５０ｍＬに懸濁した。この懸濁液を氷上にて超音波破砕した（ＢＲＡＮＳＯＮ ＳＯＮＩＦＩＥＲ２５０、Ｄｕｔｙ Ｃｙｃｌｅ７、Ｏｕｔｐｕｔｃｏｎｔｒｏｌｅ７にて、２分間、１２回）。このようにして得た菌体破砕液は、４Ｕ／ｍＬの（Ｓ）−α−フェネチルアミン：ピルビン酸トランスアミナーゼ活性を有していた。
【０１１３】
実施例１２
実施例１１と同様に培養したシュードモナス・スピーシーズＫＮＫ４２５の培養液１００ｍＬに、（Ｓ）−α−フェネチルアミン１ｇ、３−ヒドロキシアセトフェノン１ｇを添加し、塩酸を用いてｐＨを７．５に調整し、３７℃で２４時間攪拌し反応させた。反応終了後に得られた反応液を実施例５と同様に、高速液体クロマトグラフィーで分析したところ、３−ヒドロキシアセトフェノンの７５％が（Ｓ）−３−ヒドロキシ−α−フェネチルアミンに変換していた。塩酸を用いて、前記反応液のｐＨを２．０に調整し、トルエンを用いて抽出し、有機層にケトン類を除いた。その後、水酸化ナトリウム水溶液を用いて、水層のｐＨを１０．０に調整した後、再びトルエンで抽出したところ、有機層に０．７ｇの（Ｓ）−３−ヒドロキシ−α−フェネチルアミンが含まれていた。その抽出物を蒸発乾固した後、エタノール：水＝１：１を用いて再結晶化することにより、（Ｓ）−３−ヒドロキシ−α−フェネチルアミン０．６５ｇが結晶として得られた。得られた（Ｓ）−３−ヒドロキシ−α−フェネチルアミンの光学純度は９９ｅ．ｅ．％以上であった。
【０１１４】
実施例１３
実施例１１と同様に培養したシュードモナス・スピーシーズＫＮＫ４２５の培養液２ｍＬに２−ブチルアミン２０ｍｇ、３−トリフルオロメチル−フェニルアセトン２０ｍｇを添加し、塩酸を用いてｐＨを７．５に調整したのち、４０℃、２４時間攪拌し反応させた。反応終了後に得られた反応液を高速液体クロマトグラフィーで分析したところ、５０％の３' −トリフルオロメチル−フェニルアセトンが（Ｓ）−３' −トリフルオロメチル−フェニル−２−アミノプロパンに変換されていた。（Ｓ）−３' −トリフルオロメチル−フェニル−２−アミノプロパンの光学純度は９９％ｅ．ｅ．以上であった。
【０１１５】
1 Ｈ−ＮＭＲ（４００Ｍｚ，ＣＤＣｌ3 ）： σ＝１．１２−１．１３（ｄ，３Ｈ）、１．５７（ｂｓ，２Ｈ）、２．５８−２．６３（ｄｄ，１Ｈ）、２．７３−２．７８（ｄｄ，１Ｈ）、３．１６−３．２４（ｍ，１Ｈ）、７．３７−７．４８（４Ｈ）
【０１１６】
実施例１４
実施例１１と同様に培養したシュードモナス・スピーシーズＫＮＫ４２５の培養液２ｍＬに（Ｓ）−α−フェネチルアミン４０ｍｇ、３' −トリフルオロメチル−フェニルアセトン４０ｍｇを添加し、塩酸を用いてｐＨを７．５に調整したのち、４０℃、２４時間攪拌し反応させた。反応終了後に得られた反応液を高速液体クロマトグラフィーで分析したところ、８０％の３' −トリフルオロメチル−フェニルアセトンが（Ｓ）−３−トリフルオロメチル−フェニル−２−アミノプロパンに変換されていた。（Ｓ）−３−トリフルオロメチル−フェニル−２−アミノプロパンの光学純度は９９％ｅ．ｅ．以上であった。
【０１１７】
実施例１５
実施例１１と同様に培養したシュードモナス・スピーシーズＫＮＫ４２５の培養液５０ｍＬを遠心分離により上清を除去し、沈殿した菌体を、０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．８）２０ｍＬに懸濁し、超音波により菌体を破砕した。得られた破砕物を遠心分離することにより沈殿物を除去し、無細胞抽出液１７ｍＬを得た。この無細胞抽出液１７ｍＬに、（Ｓ）−α−フェネチルアミン０．２ｇ、３' −トリフルオロメチル−フェニルアセトン０．２ｇを添加したのち、塩酸を用いてｐＨを７．５に調整後、４０℃、２４時間反応させた。その結果、０．６ｇの（Ｓ）−３' −トリフルオロメチル−フェニル−２−アミノプロパンが生成した。得られた（Ｓ）−３' −トリフルオロメチル−フェニル−２−アミノプロパンの光学純度は９９％ｅ．ｅ．以上であった。
【０１１８】
実施例１６
実施例１１と同様にして培養したシュードモナス・スピーシーズＫＮＫ４２５の培養液２ｍＬにラセミ体のα−フェネチルアミン６０ｍｇ、ピルビン酸３０ｍｇを添加し、水酸化ナトリウム水溶液を用いてｐＨを７．５に調整後、４０℃、２５時間反応させた。その結果、２７ｍｇのα−フェネチルアミンが残存しており、その（Ｒ）体の光学純度は９９％ｅ．ｅ．以上であった。
【０１１９】
実施例１７
実施例１１と同様にして培養したシュードモナス・スピーシーズＫＮＫ４２５の培養液２ｍＬにラセミ体の３−ヒドロキシ−α−フェネチルアミン６０ｍｇ、ピルビン酸３０ｍｇを添加し、水酸化ナトリウム水溶液を用いてｐＨを７．５に調整した。得られた溶液を、４０℃、２５時間攪拌し反応させた。その結果、２７ｍｇの３−ヒドロキシ−α−フェネチルアミンが残存しており、その（Ｒ）体の光学純度は９９％ｅ．ｅ．以上であった。
【０１２０】
実施例１８
ピルビン酸の代わりにグリオキシル酸を用いた以外は、実施例１７と同様に行なうことにより、２６ｍｇの３−ヒドロキシ−α−フェネチルアミンが残存しており、その（Ｒ）体の光学純度は９９％ｅ．ｅ．以上であった。
【０１２１】
実施例１９
ピルビン酸の代わりにオキサロ酢酸を用いた以外は、実施例１７と同様に行なうことにより、２７ｍｇの３−ヒドロキシ−α−フェネチルアミンが残存しており、その（Ｒ）体の光学純度は９９％ｅ．ｅ．以上であった。
【０１２２】
産業上の利用可能性
本発明の（Ｓ）−α−フェネチルアミン：ピルビン酸トランスアミナーゼによれば、ケトン化合物を効率よく光学活性アミノ化合物に変換することができる。本発明の光学活性アミノ化合物の製造方法によれば、高い収率で光学活性アミノ化合物を得ることができ、かつ得られる光学活性アミノ化合物の光学純度が高いため、該製造方法は、医薬品や農薬等の中間体の製造に有用である。
【０１２３】
【配列表】
SEQUENCE LISTING
<110> KANEKA CORPORATION
<120> (S)-α-phenethylamine:pyruvate transaminase
<130> 99-041-PCT
<150> JP 10-309310
<151> 1998-10-30
<160> 1
【０１２４】
<210> 1
<211> 16
<212> PRT
<213> Pseudomonas sp.
<400> 1
Met Tyr Glu Gln Tyr Lys Thr Ala Gln Lys Lys Phe Trp His Pro
1 5 10 15
Met
【図面の簡単な説明】
【図１】 第１図は、（Ｓ）−α−フェネチルアミン：ピルビン酸トランスアミナーゼの至適ｐＨを示す図である。図中、黒丸は０．１Ｍリン酸緩衝液を用いて測定した結果を示し、白抜四角は０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液を用いて測定した結果を示す。
【図２】 第２図は、（Ｓ）−α−フェネチルアミン：ピルビン酸トランスアミナーゼの至適温度を示す図である。
【図３】 第３図は、（Ｓ）−α−フェネチルアミン：ピルビン酸トランスアミナーゼの熱安定性を示す図である。
Claims (22)
- 下記理化学的性質：
（Ａ）作用：
光学活性（Ｓ）−α−フェネチルアミンとピルビン酸とに作用してそれぞれアセトフェノンとアラニンとを生成するアミノ基転移反応を触媒する、
（Ｂ）基質特異性：
（ａ）アミノ基供与体：（Ｓ）−α―フェネチルアミンに対し活性を示し、β−アラニン、タウリン、プトレッシン、ＤＬ−オルニチンおよびＤＬ−リシンのそれぞれに対し活性を示さない、および
（ｂ）アミノ基受容体：ピルビン酸およびグリオキシル酸のそれぞれに対し活性を示す、
（Ｃ）分子量：約４４，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、
（Ｄ）至適ｐＨ：７．０〜９．０、
（Ｅ）至適温度：３０〜５０℃、ならびに
（Ｆ）熱安定性：ｐＨ７．０、３０〜５０℃の温度で１５分間処理したとき、処理前の全活性の９５％以上の残存活性を保持する
を有し、かつ、配列番号：１記載のアミノ酸配列をＮ末端アミノ酸配列として有する（Ｓ）−α−フェネチルアミン：ピルビン酸トランスアミナーゼ。 - （Ｓ）−α−フェネチルアミンとα−ケト酸以外のケトン化合物とに作用し、アセトフェノンと該ケトン化合物に対応するアミノ化合物とを生成するアミノ基転移反応を触媒する反応特性をさらに有する、請求項１記載の（Ｓ）−α−フェネチルアミン：ピルビン酸トランスアミナーゼ。
- ケトン化合物が、一般式（１）：
で表わされるケトン化合物である、請求項２記載の（Ｓ）−α−フェネチルアミン：ピルビン酸トランスアミナーゼ。 - ケトン化合物が、３−メトキシアセトフェノン、２−ヒドロキシアセトフェノン、３−ヒドロキシアセトフェノン、４−クロロアセトフェノン、４’−メトキシアセトフェノン、３’，４’−ジメトキシフェニルアセトン、３’−トリフロオロメチルアセトン、ベンジルアセトン、４−（４’−メトキシフェニル）−２−ブタノン、ベンゾイルアセトン、２−アセチルピリジン、アセチルピリジン、２−アセチルフランおよび２−アセチルチアゾールからなる群より選ばれた少なくとも１種である、請求項２または３記載の（Ｓ）−α−フェネチルアミン：ピルビン酸トランスアミナーゼ。
- （Ｓ）−α−フェネチルアミンと３−ヒドロキシアセトフェノンとに作用し、アセトフェノンと光学活性（Ｓ）−３−α−ヒドロキシ−フェネチルアミンとを生成しうる、請求項４記載の（Ｓ）−α−フェネチルアミン：ピルビン酸トランスアミナーゼ。
- シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属の微生物により生産される、請求項１〜５いずれか記載の（Ｓ）−α−フェネチルアミン：ピルビン酸トランスアミナーゼ。
- シュードモナス属に属する微生物がＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ． ＫＮＫ４２５（ＦＥＲＭ ＢＰ−６５２５）である、請求項６記載の（Ｓ）−α−フェネチルアミン：ピルビン酸トランスアミナーゼ。
- 一般式（１）：
で表わされるケトン化合物に、請求項１〜７いずれか記載の（Ｓ）−α−フェネチルアミン：ピルビン酸トランスアミナーゼをアミノ基供与体の存在下に作用させることにより、対応する光学活性アミノ化合物を得ることを特徴とする、光学活性アミノ化合物の製造方法。 - 一般式（１）において、Ｒが、ハロゲン原子、炭素数１〜６のアルキル基、水酸基、メトキシ基、ニトロ基、モノフルオロメチル基、ジフルオロメチル基およびトリフルオロメチル基からなる群より選ばれた置換基により少なくとも１ヶ所を置換されたアリール基である、請求項８記載の製造方法。
- 一般式（１）において、Ｒが、メチル基、フェニル基、ナフチル基、２−クロロフェニル基、３−クロロフェニル基、４−クロロフェニル基、２―ヒドロキシフェニル基、３−ヒドロキシフェニル基、４−ヒドロキシフェニル基、２―メトキシフェニル基、３−メトキシフェニル基、４−メトキシフェニル基、２，４−ジメトキシフェニル基、３，４−ジメトキシフェニル基、２−トリフルオロメチルフェニル基、３−トリフルオロメチルフェニル基、４−トリフルオロメチルフェニル基、ピリジル基、ピラジニル基、ピロリル基、チエニル基、フリル基、またはチアゾリル基である請求項９記載の製造方法。
- 一般式（１）において、ｐおよびｑが０、ｒが１、Ｘが水素原子である請求項８〜１０記載の製造方法。
- 一般式（１）において、ｐが０、ｑが１、ｒが１、Ｘが水素原子である請求項８〜１０記載の製造方法。
- アミノ基供与体が、一般式（３）：
で表わされる化合物である請求項８〜１２いずれか記載の製造方法。 - 一般式（３）において、Ｒ1 が炭素数１〜１０のアルキル基またはフェニル基であり、Ｒ2が水素原子、メチル基またはエチル基である、請求項１３記載の製造方法。
- アミノ基供与体が、α−フェネチルアミン、２―ブチルアミン、２−ペンチルアミン、２―ヘプチルアミン、２―オクチルアミンおよびそれらの光学活性体からなる群より選ばれた化合物である請求項１３または１４記載の製造方法。
- （Ｓ）−α−フェネチルアミン：ピルビン酸トランスアミナーゼを作用させる際、該（Ｓ）−α−フェネチルアミン：ピルビン酸トランスアミナーゼを生産する微生物の培養物、分離した細胞、固定化細胞および無細胞抽出物からなる群より選ばれた１種以上を用いる、請求項８〜１５いずれか記載の製造方法。
- （Ｓ）−α−フェネチルアミン：ピルビン酸トランスアミナーゼを作用させる際、該（Ｓ）−α−フェネチルアミン：ピルビン酸トランスアミナーゼの粗精製酵素、精製酵素および固定化酵素からなる群より選ばれた１種以上を用いる、請求項８〜１５いずれか記載の製造方法。
- 一般式（４）：
で表わされるラセミ体のアミノ化合物に、請求項１〜７いずれか記載の（Ｓ）−α−フェネチルアミン：ピルビン酸トランスアミナーゼをアミノ基受容体の存在下に作用させることにより、対応する光学活性アミノ化合物を得ることを特徴とする、光学活性アミノ化合物の製造方法。 - アミノ基受容体が、ピルビン酸、グリオキシル酸およびオキサロ酢酸から選ばれた化合物である請求項１８記載の製造方法。
- （Ｓ）−α−フェネチルアミン：ピルビン酸トランスアミナーゼを作用させる際、該（Ｓ）−α−フェネチルアミン：ピルビン酸トランスアミナーゼを生産する微生物の培養物、分離した細胞、固定化細胞および無細胞抽出液からなる群より選ばれた１種以上を用いる、請求項１８または１９記載の製造方法。
- （Ｓ）−α−フェネチルアミン：ピルビン酸トランスアミナーゼを作用させる際、（Ｓ）−α−フェネチルアミン：ピルビン酸トランスアミナーゼの粗精製酵素、精製酵素および固定化酵素からなる群より選ばれた１種以上を用いる、請求項１８または１９記載の製造方法。
- 請求項１〜７いずれか記載の（Ｓ）−α−フェネチルアミン：ピルビン酸トランスアミナーゼを生産するシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属の微生物を培養する際に、該酵素の誘導物質として、プロピルアミン、１−ブチルアミン、２−ブチルアミン、２−ペンチルアミン、イソプロピルアミンおよびイソブチルアミンからなる群より選ばれた１種以上を培地に添加する、前記（Ｓ）−α―フェネチルアミン：ピルビン酸トランスアミナーゼ生産微生物の培養方法。
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