JPH08103284A - Ｌ−トリプトファンの製造法 - Google Patents
Ｌ−トリプトファンの製造法Info
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- JPH08103284A JPH08103284A JP6243095A JP24309594A JPH08103284A JP H08103284 A JPH08103284 A JP H08103284A JP 6243095 A JP6243095 A JP 6243095A JP 24309594 A JP24309594 A JP 24309594A JP H08103284 A JPH08103284 A JP H08103284A
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- JP
- Japan
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- tryptophan
- concentration
- synthase
- serine
- indole
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- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【構成】 Ｌ−トリプトファンによるフィードバック阻
害が軽微なトリプトファンシンターゼを含有する微生物
またはその処理物の存在下、ｐＨ９.０〜１０.０の水溶
液中でインドールとＬ−セリンとを反応させて、Ｌ−ト
リプトファンを３〜５％（ｗ／ｖ）の濃度まで生成蓄積
せしめ、該水溶液よりＬ−トリプトファンを採取するこ
とを特徴とする、Ｌ−トリプトファンの製造法。 【効果】 本発明の製造方法により、Ｌ−トリプトファ
ンを高効率で安価に製造することが可能となる。
害が軽微なトリプトファンシンターゼを含有する微生物
またはその処理物の存在下、ｐＨ９.０〜１０.０の水溶
液中でインドールとＬ−セリンとを反応させて、Ｌ−ト
リプトファンを３〜５％（ｗ／ｖ）の濃度まで生成蓄積
せしめ、該水溶液よりＬ−トリプトファンを採取するこ
とを特徴とする、Ｌ−トリプトファンの製造法。 【効果】 本発明の製造方法により、Ｌ−トリプトファ
ンを高効率で安価に製造することが可能となる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、Ｌ−トリプトファンの
製造法に関し、更に詳しくは、インドールおよびセリン
を用い、トリプトファンシンターゼの酵素法により、反
応液中に高濃度のＬ−トリプトファンを生成蓄積せしめ
る、Ｌ−トリプトファンの製造方法に関する。
製造法に関し、更に詳しくは、インドールおよびセリン
を用い、トリプトファンシンターゼの酵素法により、反
応液中に高濃度のＬ−トリプトファンを生成蓄積せしめ
る、Ｌ−トリプトファンの製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】インドールおよびＬ−セリンを基質とし
てトリプトファンシンターゼを触媒とする酵素反応によ
り、Ｌ−トリプトファンを製造する方法として、本発明
者らは、先にエシェリヒア・コリ（Escherichia coli）
菌体のトリプトファンシンターゼを用いる方法を提案し
ている（特公平５−７９３１１号公報参照）。さらに、
本発明者らは、ブレビバクテリウム・フラバム（Brevib
acterium flavum）菌体を用いる方法も提案している
（特公平５−２５４７６号公報参照）。これらの方法に
よれば、酵素反応液のｐＨをｐＨ６．０〜８．５に維持
して酵素反応を実施するため、反応生産物であるＬ−ト
リプトファンの生成濃度はいずれも３％（ｗ／ｖ）未満
であった。本発明者らは、酵素反応液のｐＨを９．０〜
１０．０に維持することにより、酵素反応液中のＬ−ト
リプトファン濃度を向上可能なことに着目した。酵素反
応液中のＬ−トリプトファンを高濃度に生成させること
ができれば、効率よく安価にＬ−トリプトファンを製造
することが可能となる。しかしながら、一般に、アミノ
酸の生合成酵素は、生成物によるフィードバック阻害に
よりその生合成が制御されており、Ｌ−トリプトファン
生合成系においてもその濃度が上昇すると、トリプトフ
ァンシンターゼは、フィードバック阻害を受け、十分な
酵素活性を発揮することができないことが知られてい
る。例えば、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）
のトリプトファンシンターゼに対するＬ−トリプトファ
ンの阻害定数はＫｉ＝０．２ｍＭであり、低濃度のＬ−
トリプトファンにより強い阻害を受けることが知られて
いる（Agric. Biol. Chem.,vol.46, 2711〜2718, 198
2）。従って、トリプトファンシンターゼ活性を利用し
てインドールとＬ−セリンから高濃度にＬ−トリプトフ
ァンを製造することは、困難を伴う。
てトリプトファンシンターゼを触媒とする酵素反応によ
り、Ｌ−トリプトファンを製造する方法として、本発明
者らは、先にエシェリヒア・コリ（Escherichia coli）
菌体のトリプトファンシンターゼを用いる方法を提案し
ている（特公平５−７９３１１号公報参照）。さらに、
本発明者らは、ブレビバクテリウム・フラバム（Brevib
acterium flavum）菌体を用いる方法も提案している
（特公平５−２５４７６号公報参照）。これらの方法に
よれば、酵素反応液のｐＨをｐＨ６．０〜８．５に維持
して酵素反応を実施するため、反応生産物であるＬ−ト
リプトファンの生成濃度はいずれも３％（ｗ／ｖ）未満
であった。本発明者らは、酵素反応液のｐＨを９．０〜
１０．０に維持することにより、酵素反応液中のＬ−ト
リプトファン濃度を向上可能なことに着目した。酵素反
応液中のＬ−トリプトファンを高濃度に生成させること
ができれば、効率よく安価にＬ−トリプトファンを製造
することが可能となる。しかしながら、一般に、アミノ
酸の生合成酵素は、生成物によるフィードバック阻害に
よりその生合成が制御されており、Ｌ−トリプトファン
生合成系においてもその濃度が上昇すると、トリプトフ
ァンシンターゼは、フィードバック阻害を受け、十分な
酵素活性を発揮することができないことが知られてい
る。例えば、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）
のトリプトファンシンターゼに対するＬ−トリプトファ
ンの阻害定数はＫｉ＝０．２ｍＭであり、低濃度のＬ−
トリプトファンにより強い阻害を受けることが知られて
いる（Agric. Biol. Chem.,vol.46, 2711〜2718, 198
2）。従って、トリプトファンシンターゼ活性を利用し
てインドールとＬ−セリンから高濃度にＬ−トリプトフ
ァンを製造することは、困難を伴う。
【０００３】そこで、Ｌ−トリプトファン阻害を軽減し
た酵素の取得が図られている。例えば、フィードバック
阻害の脱感作株としてブレビバクテリウム・ラクトファ
ーメンタム（Brevibacterium lactofermentum）のトリ
プトファンアナログ耐性株（特開昭６１−４０４７９号
公報参照）が取得されているが、そのフィードバック阻
害の脱感作濃度は、２０ｍＭ（４．０８ ｇ/ｌ）とい
う、非常に低濃度であり、３％（ｗ／ｖ)(約１００ｍ
Ｍ）以上のトリプトファン濃度でのフィードバック阻害
に関する知見はない。また、脱感作株を用いるＬ−トリ
プトファンの生成濃度は２．８％（ｗ／ｖ；ｐＨ８．
５）であった。
た酵素の取得が図られている。例えば、フィードバック
阻害の脱感作株としてブレビバクテリウム・ラクトファ
ーメンタム（Brevibacterium lactofermentum）のトリ
プトファンアナログ耐性株（特開昭６１−４０４７９号
公報参照）が取得されているが、そのフィードバック阻
害の脱感作濃度は、２０ｍＭ（４．０８ ｇ/ｌ）とい
う、非常に低濃度であり、３％（ｗ／ｖ)(約１００ｍ
Ｍ）以上のトリプトファン濃度でのフィードバック阻害
に関する知見はない。また、脱感作株を用いるＬ−トリ
プトファンの生成濃度は２．８％（ｗ／ｖ；ｐＨ８．
５）であった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】従来、トリプトファン
シンターゼを用いたインドールおよびＬ−セリンからの
Ｌ−トリプトファンの製造では生成したＬ−トリプトフ
ァンによりトリプトファンシンターゼが強いフィードバ
ック阻害を受けるため３％〜５％という高濃度ではＬ−
トリプトファンを生成蓄積することができなかった。本
発明は、上記問題を解決し、従来に比べて効率的かつ安
価なＬ−トリプトファンの製造方法を提供すべくなされ
たものである。
シンターゼを用いたインドールおよびＬ−セリンからの
Ｌ−トリプトファンの製造では生成したＬ−トリプトフ
ァンによりトリプトファンシンターゼが強いフィードバ
ック阻害を受けるため３％〜５％という高濃度ではＬ−
トリプトファンを生成蓄積することができなかった。本
発明は、上記問題を解決し、従来に比べて効率的かつ安
価なＬ−トリプトファンの製造方法を提供すべくなされ
たものである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、Ｌ−トリプトファ
ンによるフィードバック阻害が軽微なトリプトファンシ
ンターゼを産生する微生物菌体またはその処理物の存在
下、ｐＨ９.０〜１０.０の水溶液中でインドールとＬ−
セリンとを反応させることにより、３〜５％（ｗ／ｖ）
の高濃度でＬ−トリプトファンを生成蓄積し、該水溶液
よりＬ−トリプトファンを採取し得ることを見いだし、
本発明を完成するに至った。
を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、Ｌ−トリプトファ
ンによるフィードバック阻害が軽微なトリプトファンシ
ンターゼを産生する微生物菌体またはその処理物の存在
下、ｐＨ９.０〜１０.０の水溶液中でインドールとＬ−
セリンとを反応させることにより、３〜５％（ｗ／ｖ）
の高濃度でＬ−トリプトファンを生成蓄積し、該水溶液
よりＬ−トリプトファンを採取し得ることを見いだし、
本発明を完成するに至った。
【０００６】以下に本発明の方法を詳述する。本明細書
中において、「Ｌ−トリプトファンによるフィードバッ
ク阻害が軽微なトリプトファンシンターゼ」とは、Ｌ−
トリプトファンが反応液中に不存在の際のトリプトファ
ン合成活性に対する、Ｌ−トリプトファンが反応液中に
存在する際に残存しているトリプトファン合成活性の割
合が高いトリプトファンシンターゼを意味し、具体的に
は、Ｌ−トリプトファン不存在の際の活性を１００％と
したときに、Ｌ−トリプトファンが３％（ｗ／ｖ)(約１
５０ｍＭ）の濃度で存在する際にＬ−トリプトファン不
存在の際に示す活性の１０％以上、Ｌ−トリプトファン
が４％（ｗ／ｖ)(約２００ｍＭ）の濃度で存在する際に
Ｌ−トリプトファン不存在の際に示す活性の５％以上、
またはＬ−トリプトファンが５％（ｗ／ｖ)(約２５０ｍ
Ｍ）の濃度で存在する際にＬ−トリプトファン不存在の
際に示す活性の３％以上の活性を示すトリプトファンシ
ンターゼを意味する（試験条件：ｐＨ９．６、３７
℃）。また、Ｌ−トリプトファンによるフィードバック
阻害が軽微なトリプトファンシンターゼは、もとより該
阻害が軽微なトリプトファンシンターゼであっても、突
然変異処理または遺伝子組換等により人為的に該阻害を
軽微にされたトリプトファンシンターゼであってもよ
い。従って、トリプトファンシンターゼの供給源は、前
記トリプトファンシンターゼを含有する微生物であれば
特に制限されず、そのような微生物として、例えば、コ
リネ型細菌である、コリネバクテリウム・グルタミカム
（Corynebacterium glutamicum）ATCC31831、ブレビバク
テリウム・ラクトファーメンタム（Breviba cterium lac
tofermentum）ATCC13869、ブレビバクテリウム・フラバ
ム（Breviba cterium flavum）ＭＪ−２３３株（FERM BP
-1497）等を好適に用いることができる。当然ながら、
Ｌ−トリプトファンによるフィードバック阻害が軽微な
トリプトファンシンターゼに関し、遺伝子組換え技術を
用いて該酵素を菌体内に著量蓄積せしめた遺伝子組換え
菌体（形質転換微生物菌体）およびその処理物も本発明
に包含される。
中において、「Ｌ−トリプトファンによるフィードバッ
ク阻害が軽微なトリプトファンシンターゼ」とは、Ｌ−
トリプトファンが反応液中に不存在の際のトリプトファ
ン合成活性に対する、Ｌ−トリプトファンが反応液中に
存在する際に残存しているトリプトファン合成活性の割
合が高いトリプトファンシンターゼを意味し、具体的に
は、Ｌ−トリプトファン不存在の際の活性を１００％と
したときに、Ｌ−トリプトファンが３％（ｗ／ｖ)(約１
５０ｍＭ）の濃度で存在する際にＬ−トリプトファン不
存在の際に示す活性の１０％以上、Ｌ−トリプトファン
が４％（ｗ／ｖ)(約２００ｍＭ）の濃度で存在する際に
Ｌ−トリプトファン不存在の際に示す活性の５％以上、
またはＬ−トリプトファンが５％（ｗ／ｖ)(約２５０ｍ
Ｍ）の濃度で存在する際にＬ−トリプトファン不存在の
際に示す活性の３％以上の活性を示すトリプトファンシ
ンターゼを意味する（試験条件：ｐＨ９．６、３７
℃）。また、Ｌ−トリプトファンによるフィードバック
阻害が軽微なトリプトファンシンターゼは、もとより該
阻害が軽微なトリプトファンシンターゼであっても、突
然変異処理または遺伝子組換等により人為的に該阻害を
軽微にされたトリプトファンシンターゼであってもよ
い。従って、トリプトファンシンターゼの供給源は、前
記トリプトファンシンターゼを含有する微生物であれば
特に制限されず、そのような微生物として、例えば、コ
リネ型細菌である、コリネバクテリウム・グルタミカム
（Corynebacterium glutamicum）ATCC31831、ブレビバク
テリウム・ラクトファーメンタム（Breviba cterium lac
tofermentum）ATCC13869、ブレビバクテリウム・フラバ
ム（Breviba cterium flavum）ＭＪ−２３３株（FERM BP
-1497）等を好適に用いることができる。当然ながら、
Ｌ−トリプトファンによるフィードバック阻害が軽微な
トリプトファンシンターゼに関し、遺伝子組換え技術を
用いて該酵素を菌体内に著量蓄積せしめた遺伝子組換え
菌体（形質転換微生物菌体）およびその処理物も本発明
に包含される。
【０００７】微生物の培養は炭素源、窒素源、無機塩等
を含む通常の栄養培地を用いて行うことができる。培養
には、炭素源として、例えばグルコース、エタノール、
メタノール、廃糖蜜等を、そして窒素源として、例えば
アンモニア、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝
酸アンモニウム、尿素等を、それぞれ単独もしくは混合
して使用することができる。また、無機塩として、例え
ばリン酸一水素カリウム、リン酸二水素カリウム、硫酸
マグネシウム等を使用することができる。この他にも必
要に応じ、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンス
ティープリカー、カザミノ酸、ビオチン、チアミン等の
各種ビタミン等の栄養素を培地に適宜添加することもで
きる。
を含む通常の栄養培地を用いて行うことができる。培養
には、炭素源として、例えばグルコース、エタノール、
メタノール、廃糖蜜等を、そして窒素源として、例えば
アンモニア、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝
酸アンモニウム、尿素等を、それぞれ単独もしくは混合
して使用することができる。また、無機塩として、例え
ばリン酸一水素カリウム、リン酸二水素カリウム、硫酸
マグネシウム等を使用することができる。この他にも必
要に応じ、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンス
ティープリカー、カザミノ酸、ビオチン、チアミン等の
各種ビタミン等の栄養素を培地に適宜添加することもで
きる。
【０００８】培養は、通常、通気攪拌、振盪等の好気的
条件下、約２０〜約４０℃、好ましくは約２５℃〜約３
５℃の温度で行うことができる。培養途中のｐＨは５〜
１０、好ましくは７〜８付近の範囲とすることができ、
培養中のｐＨ調整は酸又はアルカリを添加することによ
り行うことができる。培養開始時の炭素源濃度は、好ま
しくは１〜２０％（ｗ／ｖ）、更に好ましくは２〜５％
（ｗ／ｖ）である。また、培養期間は通常１〜７日間で
ある。
条件下、約２０〜約４０℃、好ましくは約２５℃〜約３
５℃の温度で行うことができる。培養途中のｐＨは５〜
１０、好ましくは７〜８付近の範囲とすることができ、
培養中のｐＨ調整は酸又はアルカリを添加することによ
り行うことができる。培養開始時の炭素源濃度は、好ま
しくは１〜２０％（ｗ／ｖ）、更に好ましくは２〜５％
（ｗ／ｖ）である。また、培養期間は通常１〜７日間で
ある。
【０００９】Ｌ−トリプトファンを製造するに際し、こ
れらの微生物菌体は、上記の如く培養して得られる培養
物（培養生成物）、該培養物を遠心法等により分離して
得られる微生物菌体または該菌体処理物、例えば洗浄菌
体、乾燥菌体、あるいはそれらの固定化物等の種々の形
態で使用され得る。また、前記菌体の破砕物、あるいは
それらを抽出・精製して得た酵素または該酵素を固定化
した固定化酵素を使用してもよい。かくして得られるト
リプトファンシンターゼを含有する微生物またはその処
理物をインドールとＬ−セリンを含有する水溶液中で酵
素反応させて、反応液中にＬ−トリプトファンを生成蓄
積せしめることができる。
れらの微生物菌体は、上記の如く培養して得られる培養
物（培養生成物）、該培養物を遠心法等により分離して
得られる微生物菌体または該菌体処理物、例えば洗浄菌
体、乾燥菌体、あるいはそれらの固定化物等の種々の形
態で使用され得る。また、前記菌体の破砕物、あるいは
それらを抽出・精製して得た酵素または該酵素を固定化
した固定化酵素を使用してもよい。かくして得られるト
リプトファンシンターゼを含有する微生物またはその処
理物をインドールとＬ−セリンを含有する水溶液中で酵
素反応させて、反応液中にＬ−トリプトファンを生成蓄
積せしめることができる。
【００１０】酵素反応液中における基質の濃度は特に制
限されるものではないが、インドールの濃度としては
０.１〜１０ｍＭの範囲が好ましく、セリンの濃度とし
ては、Ｌ−セリンを用いる場合は１０ｍＭ以上、そして
Ｄ，Ｌ−セリンを用いる場合は２０ｍＭ以上であること
が好ましい。Ｌ−トリプトファンの生成率を高めるた
め、反応液中に、基質であるインドールおよびセリンの
他にピリドキサールリン酸を存在させることが好まし
い。
限されるものではないが、インドールの濃度としては
０.１〜１０ｍＭの範囲が好ましく、セリンの濃度とし
ては、Ｌ−セリンを用いる場合は１０ｍＭ以上、そして
Ｄ，Ｌ−セリンを用いる場合は２０ｍＭ以上であること
が好ましい。Ｌ−トリプトファンの生成率を高めるた
め、反応液中に、基質であるインドールおよびセリンの
他にピリドキサールリン酸を存在させることが好まし
い。
【００１１】溶媒としては、一般的には脱イオン水、蒸
留水等の水を用いるが、必要に応じて、トリトンＸ−１
００（ポリオキシエチレンアルキルフェノールエーテル
系非イオン性界面活性剤）、ツイーン２０（ポリオキシ
エチレンソルビタンモノラウレイト系非イオン性界面活
性剤）等の界面活性剤を添加してもよい。反応液のｐＨ
は９．０〜１０．０であり、ｐＨの調整は通常用いられ
る酸および／またはアルカリを添加して行うことができ
る。反応温度は、通常１５〜６０℃、好ましくは２０〜
５０℃の範囲である。
留水等の水を用いるが、必要に応じて、トリトンＸ−１
００（ポリオキシエチレンアルキルフェノールエーテル
系非イオン性界面活性剤）、ツイーン２０（ポリオキシ
エチレンソルビタンモノラウレイト系非イオン性界面活
性剤）等の界面活性剤を添加してもよい。反応液のｐＨ
は９．０〜１０．０であり、ｐＨの調整は通常用いられ
る酸および／またはアルカリを添加して行うことができ
る。反応温度は、通常１５〜６０℃、好ましくは２０〜
５０℃の範囲である。
【００１２】さらに、本発明の製造法は、上記酵素また
は該酵素を産生する微生物菌体を、適当な膜を利用して
系内に封じ込め、反応の進行と同時に生成物含有透過液
を系内より抜き出して生成物と菌体との分離を連続的に
行うことにより、Ｌ−トリプトファンを高濃度に効率よ
く連続製造することもできる。得られたＬ−トリプトフ
ァンの分離および精製は、通常のイオン交換樹脂法およ
び晶析法等の公知の方法を組み合わせることにより、容
易に行うことができる。以上の条件に従い処理すること
により、目的物であるＬ−トリプトファンを、効率よ
く、かつ安価に得ることができる。以上に本発明を説明
してきたが、下記の参考例および実施例によりさらに具
体的に説明する。
は該酵素を産生する微生物菌体を、適当な膜を利用して
系内に封じ込め、反応の進行と同時に生成物含有透過液
を系内より抜き出して生成物と菌体との分離を連続的に
行うことにより、Ｌ−トリプトファンを高濃度に効率よ
く連続製造することもできる。得られたＬ−トリプトフ
ァンの分離および精製は、通常のイオン交換樹脂法およ
び晶析法等の公知の方法を組み合わせることにより、容
易に行うことができる。以上の条件に従い処理すること
により、目的物であるＬ−トリプトファンを、効率よ
く、かつ安価に得ることができる。以上に本発明を説明
してきたが、下記の参考例および実施例によりさらに具
体的に説明する。
【００１３】
【実施例】参考例： トリプトファンシンターゼを用いたＬ−トリ
プトファン合成反応におけるＬ−トリプトファンのフィ
ードバック阻害 コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium
glutamicum）ATCC31831、ブレビバクテリウム・ラクト
ファーメンタム（Brevibacterium lactoferment um）ATC
C13869、およびブレビバクテリウム・フラバム（Brevib
acterium flavum）ＭＪ−２３３株（FERM BP-1497）が
それぞれ産するトリプトファンシンターゼを用い、イン
ドールとＬ−セリンとを基質とするトリプトファン合成
反応におけるＬ−トリプトファンのフィードバック阻害
を、下記手順にて測定した。まず、上記３種類の微生物
菌体から、それぞれの粗酵素液を調製した。即ち、半合
成培地ＢＴＣ培地［組成：尿素２ｇ、(ＮＨ4)2ＳＯ4 ７
ｇ、Ｋ2ＨＰＯ4 ０.５ｇ、ＫＨ2ＰＯ4 ０.５ｇ、ＭｇＳ
Ｏ4 ０.５ｇ、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ６ｍｇ、ＭｎＳＯ4・
４〜６Ｈ2Ｏ ６ｍｇ、カザミノ酸 ５ｇ、ビオチン ２０
０μｇ、塩酸チアミン ２００μｇ、グルコース ２０
ｇ、および蒸留水 １０００ｍ１、ｐＨ７．２］１００
ｍｌ中にて、それぞれの菌株を対数増殖期後期まで培養
し、遠心分離により菌体を集めた。得られた湿菌体 ０.
５ｇを２ｍｌの菌体懸濁液［組成：Ｌ−セリン １０ｍ
Ｍ、ピリドキサールリン酸（ＰＬＰ） ０.１２ｍＭ、お
よび蒸留水１Ｌ］に懸濁し、０.２ｇのガラスビーズを
加えてソニック型菌体破砕装置（ソニファー２５０、ブ
ランソン社製）を用いて低温下（約４℃）で３分間の超
音波処理を３回行った。この菌体破砕物を遠心分離（１
２,０００ｒｐｍ、４℃、３０分間）に付し、その上清
液を粗酵素液とした。
プトファン合成反応におけるＬ−トリプトファンのフィ
ードバック阻害 コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium
glutamicum）ATCC31831、ブレビバクテリウム・ラクト
ファーメンタム（Brevibacterium lactoferment um）ATC
C13869、およびブレビバクテリウム・フラバム（Brevib
acterium flavum）ＭＪ−２３３株（FERM BP-1497）が
それぞれ産するトリプトファンシンターゼを用い、イン
ドールとＬ−セリンとを基質とするトリプトファン合成
反応におけるＬ−トリプトファンのフィードバック阻害
を、下記手順にて測定した。まず、上記３種類の微生物
菌体から、それぞれの粗酵素液を調製した。即ち、半合
成培地ＢＴＣ培地［組成：尿素２ｇ、(ＮＨ4)2ＳＯ4 ７
ｇ、Ｋ2ＨＰＯ4 ０.５ｇ、ＫＨ2ＰＯ4 ０.５ｇ、ＭｇＳ
Ｏ4 ０.５ｇ、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ６ｍｇ、ＭｎＳＯ4・
４〜６Ｈ2Ｏ ６ｍｇ、カザミノ酸 ５ｇ、ビオチン ２０
０μｇ、塩酸チアミン ２００μｇ、グルコース ２０
ｇ、および蒸留水 １０００ｍ１、ｐＨ７．２］１００
ｍｌ中にて、それぞれの菌株を対数増殖期後期まで培養
し、遠心分離により菌体を集めた。得られた湿菌体 ０.
５ｇを２ｍｌの菌体懸濁液［組成：Ｌ−セリン １０ｍ
Ｍ、ピリドキサールリン酸（ＰＬＰ） ０.１２ｍＭ、お
よび蒸留水１Ｌ］に懸濁し、０.２ｇのガラスビーズを
加えてソニック型菌体破砕装置（ソニファー２５０、ブ
ランソン社製）を用いて低温下（約４℃）で３分間の超
音波処理を３回行った。この菌体破砕物を遠心分離（１
２,０００ｒｐｍ、４℃、３０分間）に付し、その上清
液を粗酵素液とした。
【００１４】Ｌ−トリプトファンを種々の濃度（０ｇ/
ｌ、２０ｇ/ｌ、３０ｇ/ｌ、４０ｇ/ｌ、または５０ｇ/
ｌ）で含有する酵素反応液［組成：Ｌ−セリン ２０ｍ
Ｍ、インドール １ｍＭ、ＰＬＰ ０.０４ｍＭ、および
ＮａＣｌ ４０ｍＭ、２５％アンモニア溶液にてｐＨ
９．６に調製］０.９ｍｌに、希釈液［組成：Ｌ−セリ
ン ２０ｍＭ、およびＰＬＰ ０.０４ｍＭ］で適宜希釈
した上記粗酵素液 ０.１ｍｌを添加し、３７℃で６０分
間反応させた後、１０％トリクロロ酢酸溶液 １.０ｍｌ
を添加して反応を停止させた。この液を遠心分離（８０
００×ｇ、４℃、１０分間）に付した後、得られた上清
液を ０.５ｍｌ分取し、これに０.１ｍｌの５ＮＮａＯ
Ｈ溶液とトルエン ４.０ｍｌを添加し、撹拌後２分間静
置した。上層（トルエン層）１.０ｍｌを呈色液［Ｐ−
ジメチルベンズアルデヒド ３.６ｇ、濃塩酸 １８ｍｌ
をエタノールで３００ｍｌにメスアップした溶液］３.
０ｍｌに添加し、撹拌して充分に混和させた。４０分間
放置した後、この液の波長５４０ｎｍにおける吸光度
（ＯＤ540nm）を測定することによりインドールの残量
を測定した。得られたインドールの減少量を基に、上記
３種類の微生物菌体由来の粗酵素液中に存在するトリプ
トファンシンセターゼのＬ−トリプトファン合成活性を
それぞれ算出した。比較例として、エシェリヒア・コリ
（Escherichia coli）Ｋ−１２株（ATCC27325）につい
ても、同様の試験を実施した。結果を下記表１に示す。
なお、トリプトファンシンターゼのＬ−トリプトファン
合成活性は、それぞれの粗酵素液について、反応液中の
Ｌ−トリプトファン濃度が０ｇ/ｌである際の活性を１
００とした相対値として示した。
ｌ、２０ｇ/ｌ、３０ｇ/ｌ、４０ｇ/ｌ、または５０ｇ/
ｌ）で含有する酵素反応液［組成：Ｌ−セリン ２０ｍ
Ｍ、インドール １ｍＭ、ＰＬＰ ０.０４ｍＭ、および
ＮａＣｌ ４０ｍＭ、２５％アンモニア溶液にてｐＨ
９．６に調製］０.９ｍｌに、希釈液［組成：Ｌ−セリ
ン ２０ｍＭ、およびＰＬＰ ０.０４ｍＭ］で適宜希釈
した上記粗酵素液 ０.１ｍｌを添加し、３７℃で６０分
間反応させた後、１０％トリクロロ酢酸溶液 １.０ｍｌ
を添加して反応を停止させた。この液を遠心分離（８０
００×ｇ、４℃、１０分間）に付した後、得られた上清
液を ０.５ｍｌ分取し、これに０.１ｍｌの５ＮＮａＯ
Ｈ溶液とトルエン ４.０ｍｌを添加し、撹拌後２分間静
置した。上層（トルエン層）１.０ｍｌを呈色液［Ｐ−
ジメチルベンズアルデヒド ３.６ｇ、濃塩酸 １８ｍｌ
をエタノールで３００ｍｌにメスアップした溶液］３.
０ｍｌに添加し、撹拌して充分に混和させた。４０分間
放置した後、この液の波長５４０ｎｍにおける吸光度
（ＯＤ540nm）を測定することによりインドールの残量
を測定した。得られたインドールの減少量を基に、上記
３種類の微生物菌体由来の粗酵素液中に存在するトリプ
トファンシンセターゼのＬ−トリプトファン合成活性を
それぞれ算出した。比較例として、エシェリヒア・コリ
（Escherichia coli）Ｋ−１２株（ATCC27325）につい
ても、同様の試験を実施した。結果を下記表１に示す。
なお、トリプトファンシンターゼのＬ−トリプトファン
合成活性は、それぞれの粗酵素液について、反応液中の
Ｌ−トリプトファン濃度が０ｇ/ｌである際の活性を１
００とした相対値として示した。
【００１５】
【表１】
【００１６】表に示した如く、コリネ型細菌であるコリ
ネバクテリウム・グルタミカム、ブレビバクテリウム・
ラクトファーメンタム、およびブレビバクテリウム・フ
ラバムＭＪ−２３３株において、トリプトファンシンタ
ーゼを用いたトリプトファン合成反応におけるＬ−トリ
プトファンのフィードバック阻害は、エシェリヒア・コ
リＫ−１２株における阻害よりも軽微なものとなってお
り、Ｌ−トリプトファンが４％（ｗ／ｖ）の濃度で存在
する際に５％以上の残存活性を示している。
ネバクテリウム・グルタミカム、ブレビバクテリウム・
ラクトファーメンタム、およびブレビバクテリウム・フ
ラバムＭＪ−２３３株において、トリプトファンシンタ
ーゼを用いたトリプトファン合成反応におけるＬ−トリ
プトファンのフィードバック阻害は、エシェリヒア・コ
リＫ−１２株における阻害よりも軽微なものとなってお
り、Ｌ−トリプトファンが４％（ｗ／ｖ）の濃度で存在
する際に５％以上の残存活性を示している。
【００１７】実施例１ コリネバクテリウム・グルタミ
カム ＡＴＣＣ３１８３１ 株によるＬ−トリプトファン
の生産 前記半合成培地ＢＴＣ培地 １００ｍｌを５００ｍｌ容
三角フラスコに分注してオートクレーブにより滅菌（１
２０℃、３０分間）した後、コリネバクテリウム・グル
タミカム ＡＴＣＣ３１８３１ 株を植菌した。これにグ
ルコースを２０ｇ/ｌの濃度となるように添加し、３０
℃にて２日間、振とう培養を行った。次に、本培養培地
ＪＢＴ培地［組成：（ＮＨ4）2ＳＯ4 ２３ｇ、Ｋ2ＨＰ
Ｏ4０.５ｇ、ＫＨ2ＰＯ4 ０.５ｇ、ＭｇＳＯ4 ０.５
ｇ、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ２０ｍｇ、ＭｎＳＯ4・４〜６
Ｈ2Ｏ ２０ｍｇ、ビオチン ２００μｇ、塩酸チアミン
１００μｇ、カザミノ酸 ３ｇ、酵母エキス ３ｇ、グル
コース ５０ｇ、および蒸留水１０００ｍ１］１０００
ｍｌを２Ｌ容ジャーファーメンター（エイブル社製）に
仕込み、オートクレーブにて滅菌（１２０℃、３０分
間）後、前記培養物２０ｍｌを添加して、回転数１００
０ｒｐｍ，通気量１ｖｖｍ、温度３３℃、ｐＨ７.６に
て２４時間培養を行った。１０台のジャーファーメンタ
ーを用いて培養した培養終了液から、遠心分離により菌
体を集めた。脱イオン水にて２度洗浄した菌体を−２０
℃で２日間冷凍した。
カム ＡＴＣＣ３１８３１ 株によるＬ−トリプトファン
の生産 前記半合成培地ＢＴＣ培地 １００ｍｌを５００ｍｌ容
三角フラスコに分注してオートクレーブにより滅菌（１
２０℃、３０分間）した後、コリネバクテリウム・グル
タミカム ＡＴＣＣ３１８３１ 株を植菌した。これにグ
ルコースを２０ｇ/ｌの濃度となるように添加し、３０
℃にて２日間、振とう培養を行った。次に、本培養培地
ＪＢＴ培地［組成：（ＮＨ4）2ＳＯ4 ２３ｇ、Ｋ2ＨＰ
Ｏ4０.５ｇ、ＫＨ2ＰＯ4 ０.５ｇ、ＭｇＳＯ4 ０.５
ｇ、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ２０ｍｇ、ＭｎＳＯ4・４〜６
Ｈ2Ｏ ２０ｍｇ、ビオチン ２００μｇ、塩酸チアミン
１００μｇ、カザミノ酸 ３ｇ、酵母エキス ３ｇ、グル
コース ５０ｇ、および蒸留水１０００ｍ１］１０００
ｍｌを２Ｌ容ジャーファーメンター（エイブル社製）に
仕込み、オートクレーブにて滅菌（１２０℃、３０分
間）後、前記培養物２０ｍｌを添加して、回転数１００
０ｒｐｍ，通気量１ｖｖｍ、温度３３℃、ｐＨ７.６に
て２４時間培養を行った。１０台のジャーファーメンタ
ーを用いて培養した培養終了液から、遠心分離により菌
体を集めた。脱イオン水にて２度洗浄した菌体を−２０
℃で２日間冷凍した。
【００１８】得られた凍結菌体 ４２０ｇを、インドー
ル ０.１ｇ、Ｌ−セリン ２.１ｇ、ピリドキサールリン
酸 １００ｍｇおよびＮａＣｌ ２.３ｇを含有する反応
液５００ｍｌ（該液のｐＨは、表２に示す実験区に従
い、２５％アンモニアにてそれぞれｐＨ９.３、９.５、
および９.７に調整）に懸濁した後、全体の体積が１０
００ｍｌとなるように蒸留水にて調整した。この懸濁液
を３Ｌ容ジャーファーメンター（エイブル社製）に注入
し、３０℃で９６時間撹拌しながら反応を行った。反応
中、反応液のｐＨを２５％アンモニアを用いて各実験区
の初期ｐＨ値に維持した。また、３分毎に、０.０１３
ｇのインドールおよび０.０１２ｇのＬ−セリンを添加
した。反応中、Ｌ−トリプトファンの生成量を、反応液
を遠心分離して得た上清液を高速液体クロマトグラフィ
ー（島津製作所製）で分析することによりモニタリング
した。その結果、実験区（２）では、９６時間後にＬ−
トリプトファンが溶解度限界の濃度まで生成蓄積された
（表２参照）が、この時点までに総量２４.９６ｇのイ
ンドールおよび２３.０４ｇのＬ−セリンが添加されて
いた。また、実験区（１）および（３）においても、そ
れぞれ７２時間後および１２０時間後に、表２に示す如
く、Ｌ−トリプトファンが溶解度限界の濃度まで生成さ
れた。各実験区の反応終了液 ５００ｍｌにＮａＯＨ水
溶液を添加してｐＨを１０に調整した後、アンモニア型
強酸性イオン交換樹脂（ダイヤイオンＳＫ−１Ｂ、三菱
化成製）のカラムを通してＬ−トリプトファンの粗結晶
を析出させた。次いで、これをアセトンで洗浄した後に
乾燥させたところ、Ｌ−トリプトファンの結晶が回収さ
れた。これらの結果を表２に示す。
ル ０.１ｇ、Ｌ−セリン ２.１ｇ、ピリドキサールリン
酸 １００ｍｇおよびＮａＣｌ ２.３ｇを含有する反応
液５００ｍｌ（該液のｐＨは、表２に示す実験区に従
い、２５％アンモニアにてそれぞれｐＨ９.３、９.５、
および９.７に調整）に懸濁した後、全体の体積が１０
００ｍｌとなるように蒸留水にて調整した。この懸濁液
を３Ｌ容ジャーファーメンター（エイブル社製）に注入
し、３０℃で９６時間撹拌しながら反応を行った。反応
中、反応液のｐＨを２５％アンモニアを用いて各実験区
の初期ｐＨ値に維持した。また、３分毎に、０.０１３
ｇのインドールおよび０.０１２ｇのＬ−セリンを添加
した。反応中、Ｌ−トリプトファンの生成量を、反応液
を遠心分離して得た上清液を高速液体クロマトグラフィ
ー（島津製作所製）で分析することによりモニタリング
した。その結果、実験区（２）では、９６時間後にＬ−
トリプトファンが溶解度限界の濃度まで生成蓄積された
（表２参照）が、この時点までに総量２４.９６ｇのイ
ンドールおよび２３.０４ｇのＬ−セリンが添加されて
いた。また、実験区（１）および（３）においても、そ
れぞれ７２時間後および１２０時間後に、表２に示す如
く、Ｌ−トリプトファンが溶解度限界の濃度まで生成さ
れた。各実験区の反応終了液 ５００ｍｌにＮａＯＨ水
溶液を添加してｐＨを１０に調整した後、アンモニア型
強酸性イオン交換樹脂（ダイヤイオンＳＫ−１Ｂ、三菱
化成製）のカラムを通してＬ−トリプトファンの粗結晶
を析出させた。次いで、これをアセトンで洗浄した後に
乾燥させたところ、Ｌ−トリプトファンの結晶が回収さ
れた。これらの結果を表２に示す。
【００１９】
【表２】
【００２０】実施例２ ブレビバクテリウム・ラクトフ
ァーメンタム ＡＴＣＣ１３８６９ 株によるＬ−トリプ
トファンの生産 実施例１と同様にして得たブレビバクテリウム・ラクト
ファーメンタム ＡＴＣＣ１３８６９ 株の凍結菌体 ４
５０ｇを用い、３Ｌ容ジャーファーメンター（エイブル
社製）内で、実施例１と同様の条件下に反応を行った。
その結果、実験区（１)、(２）および（３）では、それ
ぞれ７２時間後、９６時間後および１２０時間後に、表
３に示す如く、Ｌ−トリプトファンが溶解度限界の濃度
まで生成された。各実験区の反応終了液 ５００ｍｌに
ＮａＯＨ水溶液を添加してｐＨを１０に調整した後、ア
ンモニア型強酸性イオン交換樹脂（ダイヤイオンＳＫ−
１Ｂ、三菱化成製）のカラムを通してＬ−トリプトファ
ンの粗結晶を析出させた。次いで、これをアセトンで洗
浄して乾燥させたところ、Ｌ−トリプトファンの結晶が
回収された。これらの結果を表３に示す。
ァーメンタム ＡＴＣＣ１３８６９ 株によるＬ−トリプ
トファンの生産 実施例１と同様にして得たブレビバクテリウム・ラクト
ファーメンタム ＡＴＣＣ１３８６９ 株の凍結菌体 ４
５０ｇを用い、３Ｌ容ジャーファーメンター（エイブル
社製）内で、実施例１と同様の条件下に反応を行った。
その結果、実験区（１)、(２）および（３）では、それ
ぞれ７２時間後、９６時間後および１２０時間後に、表
３に示す如く、Ｌ−トリプトファンが溶解度限界の濃度
まで生成された。各実験区の反応終了液 ５００ｍｌに
ＮａＯＨ水溶液を添加してｐＨを１０に調整した後、ア
ンモニア型強酸性イオン交換樹脂（ダイヤイオンＳＫ−
１Ｂ、三菱化成製）のカラムを通してＬ−トリプトファ
ンの粗結晶を析出させた。次いで、これをアセトンで洗
浄して乾燥させたところ、Ｌ−トリプトファンの結晶が
回収された。これらの結果を表３に示す。
【００２１】
【表３】
【００２２】実施例３ ブレビバクテリウム・フラバム
ＭＪ−２３３株によるＬ−トリプトファンの生産 実施例１と同様にして得たブレビバクテリウム・フラバ
ムＭＪ−２３３（FERMBP-1497）株の凍結菌体 ４００ｇ
を用い、３Ｌ容ジャーファーメンター（エイブル社製）
内で、実施例１と同様の条件下に反応を行った。その結
果、実験区（１)、(２）および（３）では、それぞれ７
２時間後、９６時間後および１２０時間後に、表４に示
す如く、Ｌ−トリプトファンが溶解度限界の濃度まで生
成された。各実験区の反応終了液 ５００ｍｌにＮａＯ
Ｈ水溶液を添加してｐＨを１０に調整した後、アンモニ
ア型強酸性イオン交換樹脂（ダイヤイオンＳＫ−１Ｂ、
三菱化成製）のカラムを通してＬ−トリプトファンの粗
結晶を析出させた。次いで、これをアセトンで洗浄して
乾燥させたところ、Ｌ−トリプトファンの結晶が回収さ
れた。これらの結果を表４に示す。
ＭＪ−２３３株によるＬ−トリプトファンの生産 実施例１と同様にして得たブレビバクテリウム・フラバ
ムＭＪ−２３３（FERMBP-1497）株の凍結菌体 ４００ｇ
を用い、３Ｌ容ジャーファーメンター（エイブル社製）
内で、実施例１と同様の条件下に反応を行った。その結
果、実験区（１)、(２）および（３）では、それぞれ７
２時間後、９６時間後および１２０時間後に、表４に示
す如く、Ｌ−トリプトファンが溶解度限界の濃度まで生
成された。各実験区の反応終了液 ５００ｍｌにＮａＯ
Ｈ水溶液を添加してｐＨを１０に調整した後、アンモニ
ア型強酸性イオン交換樹脂（ダイヤイオンＳＫ−１Ｂ、
三菱化成製）のカラムを通してＬ−トリプトファンの粗
結晶を析出させた。次いで、これをアセトンで洗浄して
乾燥させたところ、Ｌ−トリプトファンの結晶が回収さ
れた。これらの結果を表４に示す。
【００２３】
【表４】
【００２４】
【発明の効果】本発明の方法に従い、Ｌ−トリプトファ
ンによるフィードバック阻害が軽微なトリプトファンシ
ンターゼを産生する微生物菌体またはその処理物の存在
下、ｐＨ９.０〜１０.０の水溶液中でインドールとＬ−
セリンとを反応させてＬ−トリプトファンを３〜５％
（ｗ／ｖ）の濃度まで生成蓄積せしめ、該水溶液よりＬ
−トリプトファンを採取することにより、従来に比べ
て、高効率かつ安価にＬ−トリプトファンを製造するこ
とができる。
ンによるフィードバック阻害が軽微なトリプトファンシ
ンターゼを産生する微生物菌体またはその処理物の存在
下、ｐＨ９.０〜１０.０の水溶液中でインドールとＬ−
セリンとを反応させてＬ−トリプトファンを３〜５％
（ｗ／ｖ）の濃度まで生成蓄積せしめ、該水溶液よりＬ
−トリプトファンを採取することにより、従来に比べ
て、高効率かつ安価にＬ−トリプトファンを製造するこ
とができる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:15） (72)発明者 湯川 英明 茨城県稲敷郡阿見町中央８丁目３番１号 三菱化学株式会社筑波研究所内
Claims (3)
- 【請求項１】 Ｌ−トリプトファンによるフィードバッ
ク阻害が軽微なトリプトファンシンターゼを含有する微
生物またはその処理物の存在下、ｐＨ９.０〜１０.０の
水溶液中でインドールとＬ−セリンとを反応させてＬ−
トリプトファンを３〜５％（ｗ／ｖ）の濃度まで生成蓄
積せしめ、該水溶液よりＬ−トリプトファンを採取する
ことを特徴とする、Ｌ−トリプトファンの製造法。 - 【請求項２】 Ｌ−トリプトファンによるフィードバッ
ク阻害が軽微なトリプトファンシンターゼが、インドー
ルとＬ−セリンとを含有する酵素反応液中にＬ−トリプ
トファンが３％（ｗ／ｖ)(約１５０ｍＭ）の濃度で存在
する際にＬ−トリプトファン不存在の際に示す活性の１
０％以上、Ｌ−トリプトファンが４％（ｗ／ｖ)(約２０
０ｍＭ）の濃度で存在する際にＬ−トリプトファン不存
在の際に示す活性の５％以上、またはＬ−トリプトファ
ンが５％（ｗ／ｖ)(約２５０ｍＭ）の濃度で存在する際
にＬ−トリプトファン不存在の際に示す活性の３％以上
の活性値を示すトリプトファンシンターゼである、請求
項１に記載のＬ−トリプトファンの製造法。 - 【請求項３】 前記トリプトファンシンターゼがコリネ
型細菌由来のトリプトファンシンターゼである、請求項
１に記載のＬ−トリプトファンの製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6243095A JPH08103284A (ja) | 1994-10-06 | 1994-10-06 | Ｌ−トリプトファンの製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6243095A JPH08103284A (ja) | 1994-10-06 | 1994-10-06 | Ｌ−トリプトファンの製造法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08103284A true JPH08103284A (ja) | 1996-04-23 |
Family
ID=17098719
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6243095A Pending JPH08103284A (ja) | 1994-10-06 | 1994-10-06 | Ｌ−トリプトファンの製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH08103284A (ja) |
-
1994
- 1994-10-06 JP JP6243095A patent/JPH08103284A/ja active Pending
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