JPH01144996A - カルニチンヒドロリアーゼの分離方法およびｌ（−）−カルニチン合成への利用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は腸内細菌科に属する菌株からカルニチンヒドロ
リアーゼ酵素を分離する方法およびＬ（−）−カルニチ
ンの合成のための固定化酵素の利用に関する。

［発明の構成コ 本発明は腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃ
ｅａｅ）に属する菌株の培地から酵素を分離する方法に
関するものであり、この酵素（以下、「カルニチンヒド
ロリアーゼ」という。）は固定化されており、同様に酵
素分離後、上記培地から得られるエフェクター（以下、
「エフェクターＦ」という。）により活性化され、次の
反応式によるクロトノベタインのアキラル性前駆物質の
立体特異的水和を触媒することができる。

［従来の技術および発明が解決しようとする課題］周知
の如く、カルニチンは不斉中心を含むから、カルニチン
にはＤおよびＬ体の２Ｎの立体異性体が存在する。

Ｌ−カルニチンは通常体内に存在し、活性化長鎖Ｊ離脂
肪酸のミトコンドリア膜通過に作用する。

ミトコンドリア膜はアシルＣｏＡ誘導体を通過さ仕ない
から、長鎖の遊離酸はＬ−カルニチンとエステル化を生
じた時のみ入って行くことができる。

左旋性の異性体であるＩ７−カルニチン（Ｄ−カルニチ
ンはこれまで哺乳動物の組織内では見つかっていない）
がもっばら、生物学的形態であることは立証済みである
が、Ｄ、Ｌ−カルニチンラセミ体は長年、種々の治療学
的処方に使用されてきた。

しかし、近年になってカルニチンの左旋性異性体のみを
用いることの重要性がますます強調されるようになった
。事実、Ｄ−カルニチンはカルニチン結合酵素、例えば
カルニチンアセチルトランスフェラーゼおよびカルニチ
ンバルミチントランスフェラーゼなどの拮抗阻害剤であ
ることが示されでいる。例えば、Ｄ−カルニチンは心筋
層および骨格筋のし一カルニチン含量を激減させること
が示されている。従って、心臓病、通常の血液透析処置
、または血中脂質を減少させるための医学的治療におい
ては、Ｌ−カルニチンのみを患者に投与することが必要
である。

いくつかの工業的規模のカルニチン合成のための化学的
方法が提示されている。これらの方法は立体特異的でな
く、必然的にＤおよびＩ７異性体のラセミ混合物を生成
する。従って、ラセミ体から別々の光学異性体を得るた
めの解決法を採用しなければならない。

これらの方法は複雑かつ不経済であり、Ｌ−力ルニヂン
を生産するよりＤ−カルニチン（やっかいな副産物であ
る）をより多く生産する場合がある。

最近、アキラルな前駆物質から出発して、Ｌ（−）−カ
ルニチンを立体特異的に合成するためのいくつかの微生
物学的方法が提供されている。これらの方法のあるもの
は前記の反応式により、クロトノベタインを立体特異的
に水和してＬ（−）−カルニチンにするものである。こ
れらの方法は、反応を触媒する酵素を提供するために用
いられる特異的微生物菌株の違いために実質的には異な
るが、総体的にはこれらの菌株は腸内細菌科（Ｅｎｔｅ
ｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）に属する。これらの方
法は、例えばヨーロッパ特許出願第１２１．４４４号（
ハマリ）、ヨーロッハ特許第１２２．７７９号（アジノ
モト）、東ドイツ特許第２２１．９０５号（カール・マ
ルクス大学）、日本特許出願第６１−２３４，７８８号
およびヨーロッパ特許出願第１５８．１９４号および第
１９５，９４４号（ロンザ）などに開示されている。

これらの方法は重大な欠点を有し、たとえ全く不可能で
ないとしても、工業的規模で実施することを不可能にし
ている。これらの欠点は主に、ビタミンその他の高価な
栄養素で強化した複合培地であるべきことによる培地の
コスト高、多くの公知の菌株の低い変換能力、反応混合
物中のクロトノベタインの低濃度、そうでなくとも僅か
しかない基質の一部をしく−）−カルニチンを目的とす
る変換から転用してしまう、クロトノベタインのガンマ
−ブチロベタインへの変換のような副反応の生起、また
は生成したＬ（−）−カルニチンを微生物がＣ−源とす
る場合のしく−）−カルニチンをさらに進めた代謝物へ
の変換などである。実際は、利用されている微生物はク
ロトノベタインをＬ（−）−カルニチンに立体特異的水
和を行う目的の酵素を産生ずるだけでなく、工業的に適
した酵素と拮抗する反応を触媒する余分の酵素をも産生
ずる。

従って、クロトノベタインをしく−）−カルニチンに立
体特異的に水和し得る酵素を選択的に分離し、工業的に
適した反応以外の反応、特にクロトノベタインをガンマ
−ブチロベタインへの変換を触媒するりダクターゼから
分別することが希望されることは明らかである。その際
、Ｌ（−）−カルニチン合成に適するように精製し、強
化および固定化された本酵素の利用が可能である。

［課題を解決するための手段］ 酵素は腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅ
ａｅ）の菌株、特に下記の菌株から好収率で分離するこ
とが可能なことが判明した。

エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌ
ｔ）、好ましくは、 エシェリキア・コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）０４４　　Ｋ７４
エシェリキア・コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）０５５　　Ｋ５９
エシェリキア・コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）０１１１　Ｋ５８
エシェリキア・コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）０１１４　ｋｇ０
プロテウス・ブルガリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ　ｖｕｌｇａ
ｒｉｓ）好ましくは、 プロテウス・ブルガリス（Ｐ、ｖｕｌｇａｒｊｓ）プロ
テウス・ミラビリス（Ｐ、ｍ１ｒａｂｉｌｉｓ）シトロ
バクタ−属、 好ましくは、 シクロバクター・フロインディイ（Ｃ，ｆｒｅｕｎｄｉ
＋）サルモネラ属、 好ましくは、 サルモネラ・チフィムリウム　Ｌ　Ｔ　ｔ（Ｓ、ｔｙｐ
ｈｉｍｕｒｉｕｍ　ＬＴ＊）サルモネラ・アナツム（Ｓ
、ａｎａｔｕｍ）サルモネラ・コットブス（Ｓ、ｃｏｔ
ｔｂｕｓ）クロトノベタインをＬ（−）−カルニチンに
立体特異的に水和可能な酵素 この酵素はカルニチンヒドロリアーゼと称される。さら
に具体的には、萌述の菌株からカルニチンヒドロリアー
ゼ（それ自体は不活性である）および、この酵素の存在
下で、この酵素の活性を回復させるエフェクターの両方
を分離することが可能なことが判明した。

本発明によれば、菌株溶液の操作は、好ましくは栄養培
地、または寒天（■）（２０９／Ｑ）を含むブイヨンを
用いて行う。傾斜管を３０℃、８時間インキュベートし
、４℃にて保存する。菌株液は液中培養において、少な
くとらグリセリン（１〜５０ｎｕｎｏｌ／Ｑ、好ましく
は２０　ｍｍｏｌ／（り、フマール酸（１〜５０　ｍｍ
ｏｌ／　Ｑ、好ましくは２０　ｍｍｏｌ／１２）および
り、Ｌ−カルニチン（１−１００ｍｍｏｌ／（！、好ま
しくは１０　ｎ＋＋ａｏｌ／１２）またはそれらの塩の
一つを、十分な程度にカルニチン水和を誘発するように
添加した複合栄養培地中で培養する。

好気的条件で、温度２０〜４５℃（好ましくは３７℃）
にて６〜２４（好ましくは８〜１５）時間インキュベー
ト後、細胞を遠心分離により回収し、燐酸緩衝液で洗浄
し、アルコア（Ａｌｃｏａ）の存在下、摩擦処置または
超音波法などの機械的処理により標準化する。粗蛋白抽
出液を燐酸緩衝溶液中に集め、遠心分離して、アルコア
および未分解の全細胞と分離する。次に、硫酸アンモニ
ウムを、２５〜４０％の濃度で飽和するまで粗蛋白抽出
液に続けて添加する。遠心分離後、上澄液をフェニルセ
ファ−、ヒドロキシルアパタイト、ＤＥＡＥセファ−ま
たはＤＥＡＥセファ−またはＤＥＡＥ−セルローズエス
テルによるクロマトグラフ分離により、またはセファデ
ックス　ｃ　　ｔｏｏによるゲル濾過により分離する。

かくして得られた酵素は不活性である。その再活性化の
ために、カルニチンヒドロリアーゼの抽出および分離後
の粗蛋白抽出液から産生されるエフェクター（Ｆ）が必
要である。クロマトグラフィーの段階で、事実、エフェ
クターを含んでいる溶出液を限外濾過し、残余の蛋白質
からエフェクターを分離する。エフェクターＦを分離し
た酵素に添加直後にカルニチンヒドロリアーゼの活性化
がなされる。上記の条件により、酵素の強化はおよそ５
０／ｍ９の比活性レベルに達する。本発明により産生じ
た酵素は４℃にて数カ月保存が可能である。

エフェクターＦはカルニチンヒドロリアーゼを活性化す
るために、クロトノベタインを含む溶液に添加すること
も可能である。

固定化ヒドロリアーゼによる、カルニチンの加水分解の
方法はＬ（−）−カルニチンを合成するためには不連続
的または連続的方法により実施できる。連続法は、およ
そ１−１０　ｍｍｏｌクロトノベタイン／リットルを含
む溶液にエフェクターＦを加え、この溶液に接触させろ
。流速！〜＋００ｍｃ／ｈで培養時間（５〜３０分）後
、Ｌ（−）−カルニチンがクロトノベタイン（第１．２
．４表）から生じる。未変換のクロトノベタインは生成
したしく−）−カルニチンの分離後、別の反応サイクル
により処理するが、エフェクターＦも同様の方法により
再利用できる。フェニルセファ−の１に対するカルニチ
ンヒドロリアーゼのパーセントを増加しく第５表）、酵
素の安定性を増大するために、カルニチンヒドロリアー
ゼは次の精製工程（フェニルセファ−、ヒドロキシルア
パタイトおよびＤＥＡＥセファ−によるクロマトグラフ
ィー分離）により濃縮する。濃縮物に硫酸アンモニウム
を２５〜４０％の飽和点まで添加すると、フェニルセフ
ァ−４Ｂ上に固定化がなされる。このようにして固定化
された酵素をカラムに充填し、クロトノベタインからし
く−）−カルニチンの連続的合成に使用する。

固定化ヒドロリアーゼによるカルニチンの加水分解の方
法によるクロトノベタインからのカルニチンの合成は、
温度とｐＨ値に依存する方法である。変換反応は、温度
２５〜４０℃、好ましくは３７℃、およびｐ　１−１値
６．０〜９．０、好ましくは７．５に行うと良い。

下記に数例を挙げて、カルニチンヒドロリアーゼの分離
およびエフェクターＦの生産と、クロトノベタインのし
く−）−カルニチンへの変換における活性固定化酵素の
利用について記ａする。

実施例　ｌ エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌ
ｉ）０４４に７４をＩＯリットル容器中で液中培養する
。容器にカルニチン（パンクレアチン・ペプトン２０９
１ｇ、　ＮａｃＱ５９／（１、グリセリンｌ０ｔｔｔＱ
／Ｑ、フマール酸２９／Ｑ１Ｄ、Ｌ−カルニチンＨＣＱ
　３１？／Ｃ）を含む培地を上部まで満たす。ｐ）（を
ＮａＯＨで７゜５に調整する。

接種は、５００ｉ１２の好気性前培養物を複合培地（パ
ンクレアチン・ペプトン２０９／Ｑ、　ＮａＣ０，５ｇ
／１２）中に、指数増殖期の培養物から行う。

１°Ｒ〜０．０８である。

初代接種密度はΔＥ６ｏｏｎＩＩｌ 培養容器は気密密封し、３７℃にて８時間放置する。酵
素を分離するために、菌体は培養終了後、１５分間、６
０００ｘｇ、４℃にて遠心分離して回収し、ｐｉ−１７
，５の０．０６７Ｍ燐酸緩衝液で２回洗浄する。細胞は
アルコア（１０分間、４℃で粉砕）ご破壊する。蛋白質
は０．０５Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ７、５）で抽出し、３０
分間、１５．ＯＯＯｘｇ。

４°Ｃにて遠心分離し、アルコアおよび未破壊細胞と分
離する。このようにして得た粗蛋白抽出液に硫酸アンモ
ニウムを飽和濃度の２５％まで添加する。３０分間、４
℃にて攪拌後、粗蛋白抽出液を１５．０００ｘｇ、　３
０分間遠心分離する。その際、得た上澄液をフェニルセ
ファローズ・カラム（２Ｘ１５ｃ１１）にかける。カラ
ムは０．０５Ｍ燐酸緩衝液（ｐｉ−■７　、５　）の２
５％硫酸アンモニウム溶液で平衡にする。次に、カラム
を２５％硫酸アンモニウム溶液１５０１Ｒｆ２で洗浄す
る。この工程で得られｌｃ疋　　〉３０である）を たすべての画分（Ｅ２８０ｎｍ 集め、溶液から限外濾過（アミコン限外濾過セル、濾膜
ＹＭ５）により蛋白質を除く。かくして得られた溶液を
以下、溶液Ｆとする。カルニチンヒドロリアーゼはフェ
ニルセファローズカラムから１５％硫酸アンモニウム溶
液ととしに溶出する。溶出速度は５０ｉ１２／時である
。３　、５　ｔｎ（ｌずつ画分を分取した。活性画分を
集め、１２時間、０．０℃Ｍ燐酸緩衝液（ｐｉ−１７，
５）５Ｃに対して透析する。

その後、透析蛋白溶液をヒドロキンアパタイトカラム（
１，５ｘ　Ｉ　０ｃＩＩ）にかけろ。カラムは０．０１
Ｍ燐酸緩衝液（ｐｆ（７，５）で平衡にする。カラムを
燐酸緩衝液で洗浄後、酵素はカラムから００３Ｍ燐酸緩
衝液、ｐＨ７，５で溶出し活性画分を集める。溶出速度
は２０ｍＱ１時である。両分を３ｍ１２ずつ分取する。

このようにして得た酵素溶液をカラム（０，９Ｘ　Ｉ　
０ｃｘ）にかける。カラムにＤＥ八へεセファローズ　
ＣＬ　　６Ｂを充填する。このカラムは０．０３Ｍ燐酸
緩衝液、ｐＨ７、５て平衡にし、蛋白溶液を処理後、同
じ緩衝液５０ｍＱで洗浄する。

酵素溶出液は０．０３Ｍ−０，０３Ｍ燐酸緩衝液ｐＩＩ
　７　、５の２００１の勾配溶出を行う。溶出速度は２
０ｍＱＺ時である。両分は２．４Ｉｌｌｆ！ずつ採取し
た。活性画分を合し、限外濾過（アミコン限外濾過セル
、濾膜ＹＭ５）により２肩Ｑに濃縮した。濃縮蛋白溶液
は０．０５Ｍ燐酸緩衝液でｐｉ−１７、５の平衡にした
セファデックス　６１００カラム（１，５Ｘ４５ｃ１Ｍ
）にかけた。溶出速度は＋２ｍＬ／時である。２ｍ（ｌ
ずつ画分を分取する。活性画分を集め、限外濾過（アミ
コン限外濾過セル、濾膜ＹＭ５）により５＋ａｆ２に濃
縮する。得られた酵素を活性化するために、溶液Ｆをバ
ッチ反応液に添加する（５０％Ｖ／Ｖ）。このようにし
て得られたカルニチンヒドロリアーゼは４．９５Ｕ／ｍ
９の比活性にまで濃縮されている。製法工程を第１表に
要約する。

実施例２ 菌株プロテウス・ブルガリス（ｐｒｏＬｅｕｓ　ｖｕｌ
ｇａｒｉＳ）を培養する以外は、上記実施例１記載と同
様の方法を実施する。

分離および酵素の濃縮後、比活性５．２Ｕ、／ｙのカル
ニチンヒドロリアーゼを得る。

実施例３ 菌株ントロバクター・フロインディイ（ｃｔｔｒｏｂａ
ｃＬｅｒ　ｆｒｅｕｎｄｉｉ）を培養する以外は実施例
１記載と同様の方法を実施する。分離および濃厚化後、
比活性４．３Ｕ／ｍｇのカルニチンヒドロリアーゼを得
る。

実施例４ エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｊａ　ｃｏｌ
ｉ　　Ｏ４４Ｋ７４）を５リツトル容器で液中培養する
。

容器はカルニチン含有複合培地（蒸留水単位Ｑにパンク
レアチン・ペプトン２０ｇ、ＮａＣｌ２５ｆｊ、Ｄ。

Ｌ−カルニチンＩ−ＩＣＩ２３ｇ）を上部まで満たす。

ＮａＯＨでＩ）Ｈ７，５に調整する。接種はいわゆるカ
ルニチン無添加複合培地を用いて、好気性前培養物（λ
＝６００ｎｍ、ｄ＝１ｃｍにてＥ＝　１．８）２５０ｍ
Ｑ。

により行う。培養容器は気密密封し、培養は８時間、３
７℃にて行う。菌体を６０００Ｘｇ、４°Ｃにて１５分
間遠心分離して回収し、燐酸緩衝液（０゜０６７Ｍ、　
ｐＨ７；５）で２回洗滌する。細胞をアルコア（４°Ｃ
にて１０分間粉砕）にて破壊する。蛋白燐酸緩衝′ｔｉ
、（０，０５Ｍ、　ｐｉ−ｔ７，５）４０ｍ（ｌにて抽
出し、Ｉ　５，０００ｘｇ、　４°Ｃにて遠心分離し、
アルコアおよび未分解細胞と分離する。得られた抽出液
に、１００％（ＮＨ，）、Ｓｏ、溶液１７７１ＩＱを攪
拌しつつ２０分間かけて滴下する（（ＮＨ４）２Ｓ０４
の最終濃度３０％）。さらに１５分間攪拌後、抽出液を
１５，０００ｘｇ、４°Ｃにて３０分間遠心分離する。

カルニチンヒドロリアーゼを固定するために、前もって
燐酸緩衝液（０，０５Ｍ、ｐｌ−１７゜５）の３０％（
Ｎｌ（ｊｔｓＯ４溶液で洗滌し、十分沈降さけたフェニ
ルセファローズを用いる。蛋白抽出液をフェニルセファ
ローズと混合し、注色深＜１５分間攪拌する。未結合原
料はガラス・フリット　Ｇ３によりフェニルセファロー
ズと分離する。

次にフェニルセファローズを燐酸緩衝液（０，０５Ｍ、
　ｐＨ７、５）の３０％（Ｎｔｌ、）、Ｓｏ、溶液６０
ｍ４と混合する。溶液を洗滌緩衝液と混合し、アミコン
濾過、濾膜ＹＭ５で蛋白を除く。

得られた溶液は以下溶液Ｆとする。このようにしてフェ
ニルセファローズ単位ｍｇ当りカルニチンヒドロリアー
ゼ５Ｕが固定化される。クロトノベタインからしく−）
−カルニチン合成のために、固定化酵素は溶液Ｆのクロ
トノベタイン５ｍｍｏｌ／ｐ溶液に接触さＵ・る。培養
は攪拌しつつ３７°Ｃにて行う。変換培養期間後、合成
Ｌ　（−）−カルニチンをゲルからガラスプラグ　Ｇ３
で分離する。Ｌ（−）−カルニチン生成の経時変化を第
２表に示す。

第２表 １　　０．８０　　　　　　　１６ ３　　１．４５　　　　　　　２９ ５　　２．２５　　　　　　　４３ ｔｏ　　　２．７０　　　　　　　５４２０　　３．２
５　　　　　　　６５ ３０　　３．３５　　　　　　　６７ 実施例５ 実施例４により、フェニルセファローズＬに固定化した
カルニチンヒドロリアーゼによるＬ（−）−カルニチン
の合成をクロトノベタインの濃度を変化させて行う。こ
の目的のために固定化酵素は溶液Ｆの各クロトノベタイ
ン溶液と３０分間、３７℃にて攪拌しつつ培養する。培
養終了後、Ｌ（−）−カルニヂン含有溶液をゲルからガ
ラス・プラグ　Ｇ３により分離す゛る（第３表）。

第３表 ０．５　　０．３　　　　　　６０ １．０　　０．６８　　　　　６８ ５．８　　３．２　　　　　　６４ １０．０　　６．５　　　　　　６５ ２０．０　　１０．Ｑ　　　　　　　５０実施例６ 実施例４によりフェニルセファローズに［１またカルニ
チンヒドロリアーゼをカラム（ＩＸ６ｃｍ）に充填する
。溶液Ｆに、溶解したクロトノベタイン肛動ポンプによ
り貯蔵容器からカラムに連続的に送り出す。カラムは貯
蔵容器と同じく３７℃に維持する。流速およびクロトノ
ベタインの濃度の変化によるクロトノベタインからしく
−）−カルニチンの生成を第４表に示す。

剃１表 １　　　　２０　　　　Ｇ、４　　　　　　　　　　４
０１０　　　０．６　　　　　　　　　　６０５　　　
０．６５　　　　　　　　　６５５　　　　２０　　　
０．６５　　　　　　　　　３０１０　　　２．２５　
　　　　　　　　　４５５　　　２．９　　　　　　　
　　　５８ｔｏ　　　　　２０　　　２．４　　　　　
　　　　　２４ｔｏ　　　　４．０　　　　　　　　　
　４０実施例７ 実施例４により培地ＩＯρの菌体を培養、回収し、アル
コアにより分解する。蛋白抽出液を燐酸緩衝ｐ（０，、
０５Ｍ、　ｐｌ（７、５）テ処理ス仝。アルコアお±Ｐ
分解細胞を１５．ＱＱＯｘｇ、４℃に石シＯ５盆間遠心
分離する。上澄液に１００％（ＮＩ−■、）ｔｓｏ４溶
液３３．３＋１２を攪拌しつつ３０分間かけて滴下する
。１５分間攪拌後、＋５．ＯＯＯＸｇ、　４℃にて３０
分間遠心分離する。その後、得られた上澄液をフェニル
セファローズカラム（２Ｘ１５ｃｍ）にかける。カラム
は前もって燐酸緩衝液（０，０５Ｍ、ｐＨ７，５）の２
５％（ＮＨ，）！ＳＯ。

溶液で平衡にする。カラムを同じ平衡緩衝液！００ｔｔ
ｒ（ｌで洗滌する。溶出液を分光４変計を用いて２８０
ｎｍにて測定する。△Ｅ＞３０（ｄ＝Ｉｃｍ）の両分を
すべて合する。この溶液をアミコン濾過（濾膜　ＹＭ５
）により蛋白を除く。この蛋白無含有溶液を以下、溶液
Ｆ°という。フェニルセファローズカラムからのカルニ
チンヒドロリアーゼの溶出は燐酸緩衝液（０，０５Ｍ、
ｐＨ７，５）の１５％（Ｎ１１４）、Ｓｏ、溶液で行い
、両分を４ｍＱずつ分取する。

溶出速度は５０ｉ＆／時である。合わせた活性画分を燐
酸緩衝液（０，０１Ｍ、ｐｌ−１７，５）５＆に対して
透析する。透析蛋白液を前しって燐酸緩衝液（０゜０　
ＩＭ、ｐＨ７，５）１００℃ｇＱにて平衡にする。燐酸
緩衝液１０．０１Ｍ、叶１７．５）５０屑ρにて洗滌後
、カルニチンヒドロリアーゼを燐酸緩衝液（０゜０３Ｍ
、　ｐ）［７，５）で溶出する。両分を３１ずつ分取す
る。溶出速度は２０ｍＱ／時である。

つぎに合した活性画分をＤＥＡＥセファローズカラム（
０，９ｘ　ｌ　Ｏｃｍ）にかける。カラムを燐酸緩衝液
（０，０３Ｍ、ｐＨ７，５）５０好にて洗滌する。カル
ニチンヒドロリアーゼの溶出は直線勾配ホスファート（
燐酸緩衝液０．０３−０．３０ｍｏｌ／１２、ｐＨ７，
５）を用いて行う。活性画分を合し、アミコン濾過（膜
　ＹＭ５）により３ｙｔＱに濃縮する。

その後この溶液にｌＯＯ％硫酸アンモニウム溶液！、３
村を添加する。３０分攪拌後、この溶液をフェニルセフ
ァローズ１ｘＱと混合し、さらに３０分間攪拌する。つ
ぎに燐酸緩衝液（０，０５Ｍ、ｐＨ７、５）の３０％硫
酸アンモニウム溶液！０Ｒ１２にて洗滌する。得られた
フェニルセフ１０−ズはゲル単位ｍＱ当り固定化カルニ
チンヒドロリアーゼ４０Ｕを含む。、フェニルセファロ
ーズに結合した酵素をカラム（０，８ｘ２．Ｏｃｍ）に
充填する。溶液Ｆ°に溶解したクロトノベタインを罷動
ポンプにより３．６ｍＱ／時の速度でカラムに送る。操
作温度は３７℃である。第５表はクロトノベタインの種
々の濃度によるしく−）−カルニチンの生成を示す。

第５表 １　　　３０　　０．５５　　　　　　５５１５　　０
．６５　　　　　　６５ ５　　０．６３　　　　　　６３ ５　　　３０　　２．４５　　　　　　４９１５　　２
．７５　　　　　　５５ ５　　３．００　　　　　　６０ 実施例８ プロテウス・ブルガリス（ｐｒｏｔｅｕｓ　ｖｕｌｇａ
ｒｉｓ）を用いる以外は実施例４におけろと同様の方法
を実施する。この菌株から分離し、およびフェニルセフ
ァローズに固定化した酵素を溶液Ｆのクロトノベタイン
５ｍｍｏｌ／１２溶液と３０分間培養すると、Ｌ（−）
−カルニチン３ｍｍｏｌ／Ｑが生成する。

実施例９ シトロバクタ−・フロインディイ（ｃｉｔｒｏｂａｃｔ
ｅｒ「ｒｅｕｎｄｉｉ）を用いて実施例４におけると同
様の方法を実施する。フェニルセファローズに固定化し
、菌株から分離した酵素を溶液Ｆのクロトノベタイン５
ｍｍｏｌ／Ｑ溶液と３０分間培養後、しく＝）−カルニ
チン２　、３　ｍｍｏｌ／１２が生成する。

特許出願人　シグマ−タウ・インダストリエ・ファルマ
シウティシェ・リウニテ・ ソシエタ・ベル・アチオーニ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、クロトノベタインおよびクロトノベタ イン誘導体の立体特異的水和によるＬ（−）−カルニチ
   ンの微生物学的製法において、 （ａ）（ｉ）菌株を好気的条件にて、Ｄ，Ｌ−カルニチ
   ンおよび／またはクロトノベタインを含む完全培地を用
   いて培養し、 （ｉｉ）腸内細菌細胞を破壊し、粗蛋白抽出液を得て、 （ｉｉｉ）粗蛋白抽出液を疎水性陰イオン交換樹脂から
   なる担体によるクロマトグラフィーにかけて分離し、お
   よび担体にカルニチンヒドロリアーゼを固定化し、蛋白
   画分およびエフェクターを含む溶出液を作製し、 （ｉｖ）溶出液を限外濾過し、実質的に蛋白質およびカ
   ルニチンヒドロリアーゼ無含有のエフェクターを含む濾
   液を得ることにより、 腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）
   に属する菌株から、それ自体は不活性な酵素であるカル
   ニチンヒドロリアーゼ、およびこの酵素の存在下、クロ
   トノベタインをＬ（−）−カルニチンに立体特異的に水
   和させ得るように酵素を活性化するエフェクターを分離
   し、 （ｂ）クロトノベタインおよびクロトノベタイン誘導体
   の溶液をエフェクターの存在下カルニチンヒドロリアー
   ゼと接触させ、Ｌ（−）−カルニチンを得て、 （ｃ）Ｌ（−）−カルニチンを未反応クロトノベタイン
   およびエフェクターと分離する ことを特徴とする、Ｌ（−）−カルニチンの微生物学的
   製法。 ２、菌株が、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）
   、プロテウス（ｐｒｏｔｅｕｓ）、シトロバクター（Ｃ
   ｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）およびサルモネラ（Ｓａｌｍｏ
   ｎｅｌｌａ）属から選ばれる、請求項１記載の方法。 ３、菌株が、 エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　Ｃｏｌ
   ｉ）プロテウス・ブルガリス（Ｐｒｏｔｅｕｓｖｕｌｇ
   ａｒｉｓ）プロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓｍ
   ｉｒａｂｉｌｉｓ）シトロバクター・フロインディイ （Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒｆｒｅｕｎｄｉｉ）サルモネ
   ラ・チフィムリウム （Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）サル
   モネラ・アナツム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａａｎａｔｕｍ
   ）サルモネラ・コットブス（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｃｏ
   ｔｔｂｕｓ）の種から選ばれる、請求項２記載の方法。 ４、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏ
   ｌｉ）が、 エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ
   ）０４４Ｋ７４ エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ
   ）０５５Ｋ５９ エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ
   ）０１１１Ｋ５８ エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ
   ）０１１４Ｋ９０ から選ばれる、請求項３記載の方法。 ５、工程（ａ）（ｉｉｉ）の担体物質が、フェニルセフ
   ァローズ、ヒドロキシアパタイト、ＤＥＡＥ−セファロ
   ーズおよびＤＥＡＥ−セルローズから選ばれる、請求項
   １−４のいずれか１項記載の方法。 ６、工程（ｂ）を実施する前に、カルニチンヒドロリア
   ーゼを濃縮する、請求項１−５のいずれか１項記載の方
   法。 ７、担体に固定化したカルニチンヒドロリ アーゼをエフェクター含有溶液と接触させることにより
   活性化する、請求項１−６のいずれか１項記載の方法。 ８、担体に固定化したカルニチンヒドロリ アーゼを、エフェクター、およびＬ（−）−カルニチン
   に変換するクロトノベタイン、またはクロトノベタイン
   誘導体の両方を含む溶液と接触させることにより活性化
   する、請求項１−６のいずれか１項記載の方法。 ９、工程（ｂ）において、クロトノベタインまたはクロ
   トノベタイン誘導体を１−１０ｍｍｏｌ含む溶液を、２
   ５−４０℃およびｐＨ６−９にてカルニチンヒドロリア
   ーゼと接触させる、請求項１−８のいずれか１項記載の
   方法。 １０、クロトノベタイン５ｍｍｏｌ／ｌを含む溶液を、
   ３７℃にて、６ｍｌ／時の流速およびｐＨ７．５でエフ
   ェクターの存在下、固定化カルニチンヒドロリアーゼを
   充填したカラムに供給する、請求項９記載の方法。 １１、連続的に実施する、請求項１−１０のいずれか１
   項記載の方法。 １２、Ｌ（−）−カルニチンを分離後、未反応クロトノ
   ベタインを再循環させる、請求項１−１１のいずれか１
   項記載の方法。 １３、クロトノベタイン誘導体が、クロトノベタイン塩
   、クロトノベタインニトリルおよびクロトノベタインの
   エステルおよびアミドから選ばれる、請求項１−１２の
   いずれか１項記載の方法。