CN111424060B - 一种同时制备d-脯氨酸和l-1-吡咯啉-5-羧酸的生物法 - Google Patents

一种同时制备d-脯氨酸和l-1-吡咯啉-5-羧酸的生物法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种同时制备D‑脯氨酸和L‑1‑吡咯啉‑5‑羧酸的生物法。该方法以解木糖赖氨酸芽孢杆菌XX‑40为发酵菌株，DL‑脯氨酸为发酵前体。该菌株首先利用DL‑脯氨酸中的部分L‑脯氨酸生长并诱导产生L‑脯氨酸脱氢酶，剩余L‑脯氨酸在L‑脯氨酸脱氢酶作用下转化为L‑1‑吡咯啉‑5‑羧酸，D‑脯氨酸完全保留。发酵液中的细胞不经分离，直接或分批添加DL‑脯氨酸，利用胞内L‑脯氨酸脱氢酶将其中的L‑脯氨酸转化为L‑1‑吡咯啉‑5‑羧酸。采用本发明中的发酵/转化级联方式，发酵液中D‑脯氨酸浓度达到20g/L，ee>99％，发酵液中L‑1‑吡咯啉‑5‑羧酸浓度达到16g/L，产率达到40％。本发明提供的方法工艺简单，环境友好，适合D‑脯氨酸和L‑1‑吡咯啉‑5‑羧酸的工业化生产。

Description

一种同时制备D-脯氨酸和L-1-吡咯啉-5-羧酸的生物法
技术领域
本发明属于生物技术领域。具体地说，涉及一种同时制备D-脯氨酸和L-1-吡咯啉-5-羧酸的生物法。
背景技术
作为一种重要的五元环非蛋白源氨基酸，D-脯氨酸(D-Proline)是合成多种具有光学活性的吡咯烷衍生物如血清淀粉样P成分(SAP)消耗剂(CN 108368095A)、治疗偏头痛药物依来曲普坦(Eletriptan)的关键手性中间体。
Figure BDA0002430696720000011
D-脯氨酸的制备方法主要包括化学法和生物法。化学法包括不对称合成法和不对称转换法。
不对称合成法(CN 107827802A)以吡咯烷-2-甲醛为原料，不对称还原为D-吡咯烷-2-甲醇，然后氧化为D-脯氨酸。该法采用昂贵的原料和手性金属催化剂，D-脯氨酸的ee值不高。不对称转换法以L-脯氨酸为原料，正丁醛为催化剂，在正丁酸溶剂中，与L-酒石酸反应制备D-脯氨酸·氨酸酒石酸盐，然后在甲醇中用氨水处理得到D-脯氨酸。该法是目前生产D-脯氨酸的工业化方法，虽然收率和ee值高，但存在生产成本高，环境污染大的缺点。
生物法主要采用生物降解法。日本协和发酵(JP 95-289275)以DL-脯氨酸为原料，50g/L假丝酵母PRD-234菌株利用和同化L-脯氨酸，发酵液中D-脯氨酸浓度达到50g/L，ee99.5％，收率47％。该生物法的缺点是L-脯氨酸只是作为细胞生长的碳氮源，最终转化为二氧化碳，不能循环使用，导致D-脯氨酸的制备成本较高。
发明内容
本发明为解决现有技术中存在的问题，提供一种同时制备D-脯氨酸和L-1-吡咯啉-5-羧酸的生物法。
本发明的技术路线如下：
Figure BDA0002430696720000021
本发明中的解木糖赖氨酸芽孢杆菌XX-2保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC No.M2015520。
鉴于此，本发明采用的技术方案是：一种同时制备D-脯氨酸和L-1-吡咯啉-5-羧酸的生物法，包括解木糖赖氨酸芽孢杆菌XX-2在种子培养基中培养制得种子液，然后将种子液接种到发酵培养基中，摇床振荡进行发酵，所述发酵培养基以DL-脯氨酸作为碳氮源。DL-脯氨酸中的L-脯氨酸作为解木糖赖氨酸芽孢杆菌XX-2生长的碳氮源，同时诱导解木糖赖氨酸芽孢杆菌XX-2产生L-脯氨酸脱氢酶。
当所述发酵培养基中的L-脯氨酸完全消耗时，再次添加DL-脯氨酸，进行微生物转化。
由此，本发明的具体步骤包括：
(1)解木糖赖氨酸芽孢杆菌XX-2发酵。解木糖赖氨酸芽孢杆菌XX-2在种子培养基中，30℃下摇床振荡(180rpm)培养48小时，制得种子液。种子培养基组成为：3g/L牛肉膏、5g/L酵母膏、5g/L氯化钠，pH6.0。以10％接种量将种子液接入发酵培养基中，30℃下摇床振荡(180rpm)发酵48～72h。发酵培养基组成为：3g/L牛肉膏、5g/L酵母膏、5g/L氯化钠，10～20g/L DL-脯氨酸，pH6.0。
优选地，发酵培养基中DL-脯氨酸的浓度为20g/L，发酵时间为72h。
(2)微生物转化。发酵液中的L-脯氨酸完全消耗时添加10～20g/LDL-脯氨酸，继续转化48～96h直至L-脯氨酸消耗完全。
优选地，DL-脯氨酸的添加浓度为20g/L，分两批次添加，每次添加10g/L，转化96h。
发酵和转化过程中D-脯氨酸、L-脯氨酸、L-1-吡咯啉-5-羧酸的浓度采用柱前手性衍生-高效液相色谱检测。
柱前手性衍生-高效液相色谱条件为：发酵液离心后上清液中加入4g/L三乙胺/乙腈溶液和2g/L 2,3,4,6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖异硫氰酸酯(GITC)/乙腈溶液，30℃下水浴加热20min。离心，采用HPLC分离上清液中的D-脯氨酸和L-脯氨酸的衍生物以及L-1-吡咯啉-5-羧酸。根据校正曲线计算浓度。色谱柱：C18柱；流动相：0.1％三氟乙酸水溶液/甲醇(51:49，v/v)，pH 2.5；流速：1.0ml/min；检测波长：254nm；柱温：25℃。
与现有的D-脯氨酸生物制备法相比，本发明提出的生物法具有以下优点：1)工艺简单。细胞发酵阶段，DL-脯氨酸中的L-脯氨酸既作为细胞生长的碳氮源并诱导细胞产L-脯氨酸脱氢酶。同时，L-脯氨酸在L-脯氨酸脱氢酶作用下转化为L-1-吡咯啉-5-羧酸。转化阶段，L-脯氨酸在L-脯氨酸脱氢酶作用下转化为L-1-吡咯啉-5-羧酸。无论是发酵或是转化阶段，D-脯氨酸完全保留。发酵和转化的级联，使得发酵阶段产生的细胞勿需分离，发酵和转化在同一体系中进行。2)成本低廉。本发明可同时制备D-脯氨酸和L-1-吡咯啉-5-羧酸。L-1-吡咯啉-5-羧酸可经化学催化还原为L-脯氨酸，然后化学或生物消旋为DL-脯氨酸，从而实现L-1-吡咯啉-5-羧酸的循环利用。3)采用本发明中的发酵/转化级联方式，发酵液中D-脯氨酸浓度达到20g/L，ee达到99％以上，发酵液中L-1-吡咯啉-5-羧酸浓度达到16g/L，产率达到40％。
附图说明
图1实施例3中D-脯氨酸和L-脯氨酸衍生物以及L-1-吡咯啉-5-羧酸的柱前手性衍生-HPLC图谱，D-脯氨酸衍生物(D-Pro)和L-脯氨酸衍生物(L-Pro)的保留时间分别为17.8min、15.3min，L-1-吡咯啉-5-羧酸(P5C)的保留时间为12.7min。
图2实施例5中D-脯氨酸和L-脯氨酸衍生物以及L-1-吡咯啉-5-羧酸的柱前手性衍生-HPLC图谱，D-脯氨酸衍生物(D-Pro)和L-脯氨酸衍生物(L-Pro)的保留时间分别为17.9min、15.4min，L-1-吡咯啉-5-羧酸的保留时间为12.8min。
具体实施方式
以下所述实施例仅为本发明构思下的基本说明，根据本发明的技术方案所作的任何等效变换，均属于本发明保护的范围。
实施例1：解木糖赖氨酸芽孢杆菌XX-2种子液制备
解木糖赖氨酸芽孢杆菌XX-2在种子培养基中，30℃下摇床振荡(180rpm)培养48小时，制得种子液。种子培养基组成为：3g/L牛肉膏、5g/L酵母膏、5g/L氯化钠，pH6.0。
实施例2：解木糖赖氨酸芽孢杆菌XX-2发酵
以10％接种量将种子液接入200mL发酵培养基中，30℃下摇床振荡(180rpm)发酵培养48小时。发酵培养基组成为：3g/L牛肉膏、5g/L酵母膏、5g/L氯化钠，10g/L DL-脯氨酸，pH6.0。发酵液中D-脯氨酸的ee值为99.4％，L-1-吡咯啉-5-羧酸浓度为3.5g/L，产率36％(以DL-脯氨酸投料量计算)。
实施例3：解木糖赖氨酸芽孢杆菌XX-2发酵
以10％接种量将种子液接入200mL发酵培养基中，30℃下摇床振荡(180rpm)发酵培养72小时。发酵培养基组成为：3g/L牛肉膏、5g/L酵母膏、5g/L氯化钠，20g/L DL-脯氨酸，pH6.0。发酵液中D-脯氨酸的ee值为99.1％，L-1-吡咯啉-5-羧酸浓度为6.4g/L，产率33％(以DL-脯氨酸投料量计算)。
实施例4：微生物转化
以10％接种量将种子液接入200mL发酵培养基中，30℃下摇床振荡(180rpm)发酵培养72小时。发酵培养基组成为：3g/L牛肉膏、5g/L酵母膏、5g/L氯化钠，20g/L DL-脯氨酸，pH6.0。发酵液中添加2g DL-脯氨酸(10g/L发酵液)，30℃下摇床振荡(180rpm)转化48h。发酵液中D-脯氨酸的ee值为99.4％，L-1-吡咯啉-5-羧酸浓度为11.2g/L，产率38％(以DL-脯氨酸投料量计算)。
实施例5：微生物转化
以10％接种量将种子液接入200mL发酵培养基中，30℃下摇床振荡(180rpm)发酵培养72小时。发酵培养基组成为：3g/L牛肉膏、5g/L酵母膏、5g/L氯化钠，20g/L DL-脯氨酸，pH6.0。发酵液中添加2g DL-脯氨酸(10g/L发酵液)，30℃下摇床振荡(180rpm)转化48h。发酵液中补加2g DL-脯氨酸(10g/L发酵液)，30℃下摇床振荡(180rpm)继续转化48h。发酵液中D-脯氨酸的ee值为99.0％，L-1-吡咯啉-5-羧酸浓度为16.2g/L，产率41％(以DL-脯氨酸投料量计算)。
实施例6：其它发酵条件研究
接种和其它培养条件与实施例2相同，发酵培养基中DL-脯氨酸浓度为30g/L，发酵时间96h。发酵液中D-脯氨酸的ee值为74.7％，L-1-吡咯啉-5-羧酸浓度为9.2g/L，产率31％(以DL-脯氨酸投料量计算)。
接种和其它培养条件与实施例2相同，发酵培养基中DL-脯氨酸浓度为40g/L，发酵时间120h。发酵液中D-脯氨酸的ee值为48.9％，L-1-吡咯啉-5-羧酸浓度为9.5g/L，产率21％(以DL-脯氨酸投料量计算)。
实施例7：其它微生物转化条件研究
接种和培养条件与实施例4相同。发酵液中添加4g DL-脯氨酸(20g/L发酵液)，30℃下摇床振荡(180rpm)转化96h。发酵液中D-脯氨酸的ee值为67.3％，L-1-吡咯啉-5-羧酸浓度为12.4g/L，产率32％(以DL-脯氨酸投料量计算)。

Claims (9)

1.一种同时制备D-脯氨酸和L-1-吡咯啉-5-羧酸的生物法，其特征在于，解木糖赖氨酸芽孢杆菌XX-2在种子培养基中培养制得种子液，然后将种子液接种到发酵培养基中，摇床振荡进行发酵，所述发酵培养基以DL-脯氨酸作为碳氮源。
2.根据权利要求1所述一种同时制备D-脯氨酸和L-1-吡咯啉-5-羧酸的生物法，其特征在于，所述DL-脯氨酸中的L-脯氨酸作为解木糖赖氨酸芽孢杆菌XX-2生长的碳氮源，同时诱导解木糖赖氨酸芽孢杆菌XX-2产生L-脯氨酸脱氢酶。
3.根据权利要求2所述一种同时制备D-脯氨酸和L-1-吡咯啉-5-羧酸的生物法，其特征在于，所述种子培养基组成为：3g/L牛肉膏、5g/L酵母膏、5g/L氯化钠，pH6.0。
4.根据权利要求3所述一种同时制备D-脯氨酸和L-1-吡咯啉-5-羧酸的生物法，其特征在于，所述发酵培养基组成为：3g/L 牛肉膏、5g/L 酵母膏、5g/L氯化钠，10～20g/L DL-脯氨酸，pH6.0。
5.根据权利要求4所述一种同时制备D-脯氨酸和L-1-吡咯啉-5-羧酸的生物法，其特征在于，发酵时间为48～72h。
6.根据权利要求1到5任一项所述一种同时制备D-脯氨酸和L-1-吡咯啉-5-羧酸的生物法，其特征在于，当所述发酵培养基中的L-脯氨酸完全消耗时，再次添加DL-脯氨酸，进行微生物转化。
7.根据权利要求6所述一种同时制备D-脯氨酸和L-1-吡咯啉-5-羧酸的生物法，其特征在于，发酵液中的细胞不经分离，直接添加DL-脯氨酸，使DL-脯氨酸的浓度为10～20g/L。
8.根据权利要求7所述一种同时制备D-脯氨酸和L-1-吡咯啉-5-羧酸的生物法，其特征在于，所述DL-脯氨酸的添加采用一次或分批补料方式。
9.根据权利要求6所述一种同时制备D-脯氨酸和L-1-吡咯啉-5-羧酸的生物法，其特征在于，转化时间48～96h。
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