CN104673733A - 工程菌及其在制备(r)-6-氰基-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种工程菌及其在制备(R)-6-氰基-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯中的应用，该工程菌包括宿主细胞和转入宿主细胞的目的基因，所述目的基因为碱基序列如SEQ ID N 0.3所示的卤代醇脱卤酶基因。本发明将SEQ ID N 0.3所示的卤代醇脱卤酶基因导入宿主细胞构建的工程菌可表达卤代醇脱卤酶HHDH，通过该酶的催化作用可实现将(S)-6-氯-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯催化成(R)-6-氰基-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯。该反应条件温和，操作简便，提高了产物的转化率和纯度。

Description

工程菌及其在制备(R)-6-氰基-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯中的应用
技术领域
本发明涉及生物制药领域，尤其涉及工程菌及其在制备(R)-6-氰基-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯中的应用。
背景技术
他汀类药物是一类羟甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶的竞争性抑制剂药物，是目前临床上应用较广泛的降血脂药物。HMG-CoA还原酶催化HMG-CoA还原成3-甲基-3，5-二羟基戊酸的反应是胆固醇的生物合成途径，他汀类药物通过抑制HMG-CoA还原酶的合成，来抑制体内胆固醇的合成，降低低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平，对以胆固醇升高为主的高血脂症和冠心病有较好的疗效。在结构上，他汀类药物通常由憎水性的刚性平面结构母核和具有双手性中心的(3R，5S/R)-双羟基己酸酯组成。其中，阿托伐他汀(Atorvastatin)和瑞舒伐他汀(Rosuvastatin)是全新第三代、全合成、高纯化、高选择性的HMG-CoA还原酶抑制剂，多年来占据降血脂药物的主要市场份额。(3R，5R)-6-氰基-3，5-二羟基己酸叔丁酯是合成阿托伐他汀的关键手性中间体，其可以通过已经建立了一个手性中心的(S)-6-氯-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯脱卤上氰基得到(R)-6-氰基-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯，再通过羰基还原酶的作用得到。因此，开展对((R)-6-氰基-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯的合成改进，阿托伐他汀类药物的制备方法研究均具有十分重要的作用。
目前，报道的制备(R)-6-氰基-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯的方法主要有三种，两种为化学酶法，其中之一是由美国Codexis公司开发出来，先采用两步三酶[游离酶]全生物催化法合成4-氰基-3-羟基丁酸乙酯，另外一种是腈水解酶不对称水解4-氰基-3-羟基丁酸铵得到4-氰基-3-羟基丁酸乙酯，由法国的Diversa Corporation研发，两者都是再通过克莱森反应与醋酸叔丁酯缩合加长碳链来合成(R)-6-氰基-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯，这过程中需要锂催化剂和无水无氧反应，反应条件较为苛刻，无法大面积推广生产；另一种是一步化学法，以(S)-6-氯-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯为底物，与NaCN在碱性条件下反应生成(R)-6-氰基-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯，但底物和产物在强碱性的反应条件下通常是不稳定的。因此，与化学法相比，生物法反应更温和，费用相对低，过程更绿色化，区域和立体选择性好，更值得深入研究。
现有报道中，仅发现卤代醇脱卤酶能作用于(S)-6-氯-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯，脱掉卤素把氰基连上得到(R)-6-氰基-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯((文献Journal of Molecular CatalysisB：Enzymatic，2009，61：123-128.；专利US2013/0040364 A1))，但是催化此反应的酶的活力并不高。因此，如何能够简化制备工艺，实现(R)-6-氰基-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯的制备，且获得立体异构纯的(R)-6-氰基-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯，是我们有待解决的重要问题。
发明内容
本发明提供了一种工程菌及其在制备(R)-6-氰基-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯中的应用，该工程菌能够催化底物(S)-6-氯-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯制得(R)-6-氰基-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯，提高了产物的转化率和纯度。
本发明提供了一种工程菌，包括宿主细胞和转入宿主细胞的目的基因，所述目的基因为碱基序列如SEQ ID NO.3所示的卤代醇脱卤酶基因。
所述的卤代醇脱卤酶基因(简称为HHDH)为全合成基因，基因来源于Agrobacteriumradiobacter AD1基因组的一个突变体。
所述工程菌含有带所述卤代醇脱卤酶基因的表达载体pET-30a(+)；宿主细胞为大肠杆菌，优选地，为大肠杆菌BL21(DE3)菌株。所述卤代醇脱卤酶基因在在大肠杆菌BL21(DE3)中表达，使工程菌表达卤代醇脱卤酶。
本发明提供了一种所述的工程菌在以(S)-6-氯-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯为底物制备(R)-6-氰基-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯中的应用。
具体地，本发明提供了一种(R)-6-氰基-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯的制备方法，包括：
(1)制备包含碱基序列如SEQ ID No.3所示的卤代醇脱卤酶基因的工程菌；
(2)制备所述工程菌的静息细胞悬液；
(3)将静息细胞悬液与底物(R)-6-氰基-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯、氰化物混合，反应制得(R)-6-氰基-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯。
本发明的反应式为：
如上述反应式所示，该反应中底物(S)-6-氯-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯在工程菌静息细胞的催化下发生取代反应生成产物(R)-6-氰基-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯，反应结束后，从反应液中分离纯化得到目标产物。
所述反应中，底物和产物在高温碱性的水溶液中不稳定，作为优选，所述反应的温度为18～40℃，反应液的pH值为7.0～9.0；更优选，反应的温度为25～40℃，反应液的pH值为7.0～9.0。
具体地，所述反应中，待底物、酶反应完成后，需继续搅拌反应0.1～20小时，至HPLC检测底物完全耗尽。所述的分离纯化为向步骤(3)反应产物中加入乙酸乙酯，萃取，合并有机相，除水后，减压蒸馏除去有机溶剂，并用油泵彻底抽除溶剂。
所述的静息细胞悬液的制备方法为：所述静息细胞悬液的制备方法包括：将所述工程菌活化后，扩大培养至OD600达到0.6～1.2，加入诱导剂，继续培养，离心收集细胞，用缓冲液重悬，获得静息细胞悬液。优选地，所述的诱导剂为IPTG，诱导剂浓度为0.1～0.5mM。
所述缓冲液为HEPES缓冲液。作为优选，所述缓冲液在反应液中的浓度为1～100mM。作为优选，所述氰化物为NaCN。作为优选，所述工程菌在35～40℃下活化8～12小时；在加入诱导剂后，工程菌在16～22℃下继续培养8～20小时。
本发明将SEQ ID NO.3所示的卤代醇脱卤酶基因导入宿主细胞构建的工程菌可表达卤代醇脱卤酶HHDH，通过该酶的催化作用可实现将底物(S)-6-氯-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯催化成(R)-6-氰基-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯。该反应条件温和，操作简便，提高了产物的转化率和纯度。
附图说明
图1为本发明卤代醇脱卤酶基因HHDH的电泳图；
M：核酸Marker，1，2：基因HHDH样品。
图2为质粒pET30-HHDH的图谱。
图3为基因工程菌EcoHHDH诱导表达的蛋白质SDS-PAGE电泳图；
M：蛋白质Marker；1：pET-30a(+)空载质粒对照破胞上清；2：基因工程菌EcoHHDH诱导菌体破胞上清；3：pET-30a(+)空载质粒对照破胞沉淀；4：基因工程菌EcoHHDH诱导菌体破胞沉淀；5纯化后的HHDH酶。
图4为(S)-6-氯-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯的HPLC分析标准图谱。
图5为(R)-6-氰基-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯的HPLC分析标准图谱。
图6为(R)-6-氰基-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯的质谱图。
图7为(S)-6-氯-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯的1H NMR谱图。
图8为(S)-6-氯-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯的13C NMR谱图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明。
本发明采用的酶活力单位定义为：每分钟催化底物反应产生1μmol产物。
本发明的整体反应式为：
转化率、产率的计算公式如下：
底物转化率(％)＝(初始底物浓度-剩余底物浓度)/初始底物浓度×100％；
产物产率(％)＝产物浓度/理论产物最大浓度×100％。
实施例1
卤代醇脱卤酶基因为hhdh基因，是Agrobacterium radiobacter AD1基因组中卤代醇脱卤酶基因的一个突变体，该基因为全合成基因，且连接在pMD18-HHDH质粒上。
用引物F_HHDH/R_HHDH克隆HHDH基因，得到长度为765bp的HHDH基因(SEQ IDNo.3)。
核酸电泳验证基因大小，如图1。
引物F_HHDH的序列为：
5’-CGCGGATCCATGTCAACCGCAATTGTAAC(SEQ ID No.1)：
引物R_HHDH的序列为：
5’-CCGCTCGAGCTACTCTGGCATACCAGG(SEQ ID No.2)。
BamHI和XhoI双酶切HHDH基因，回收酶切后的基因条带，BamHI和XhoI双酶切pET-30a(+)质粒，回收酶切后的质粒条带，将酶切后的HHDH基因和酶切后的pET-30a(+)质粒，用连接酶连接，转化克隆宿主Escherichia coli DH5α。用引物F_HHDH/R_HHDH进行菌落PCR验证，转化重组子，然后提取重组质粒，进行测序。测序结果无误的重组质粒，即为重组质粒pET30-HHDH，质粒图谱如图2所示，-20℃保存备用。
实施例2基因工程菌的构建及诱导表达
用实例1中构建的质粒pET30-HHDH，转化表达宿主Escherichia coli BL21(DE3)。用引物F_HHDH/R_HHDH做菌落PCR，验证转化的重组子。验证无误的基因工程菌即为EcoHHDH。将EcoHHDH接种到含卡那霉素抗性的3～5mL液体LB试管培养基中，于37℃下摇床活化12小时，将活化后得到的培养物按1％转接量转接到含卡纳霉素抗性的液体LB摇瓶培养基中，发酵培养基中恒温震荡培养3h，培养条件为37℃，200rpm。待菌体浓度长到OD600＝0.8时，加入0.5mM IPTG(终浓度)，18℃诱导13h，10,000g离心5min收集细胞，用pH＝7.0的HEPES缓冲液洗涤1次后，弃上清，即得静息细胞，置于-80℃冻存。蛋白表达情况用SDS-PAGE检测，如图3所示。
实施例3基因工程菌的构建及诱导表达
用实例1中构建的质粒pET30-HHDH，转化表达宿主Escherichia coli BL21(DE3)。用引物F_HHDH/R_HHDH做菌落PCR，验证转化的重组子。验证无误的基因工程菌即为EcoHHDH。将EcoHHDH接种到含卡那霉素抗性的3～5mL液体LB试管培养基中，于35℃下摇床活化12小时，将活化后得到的培养物按1％转接量转接到含卡纳霉素抗性的液体LB摇瓶培养基中，发酵培养基中恒温震荡培养3h，培养条件为40℃，200rpm。待菌体浓度长到OD600＝0.6时，加入0.1mM IPTG(终浓度)，16℃诱导20h，10,000g离心5min收集细胞，用pH＝7.5的HEPES缓冲液洗涤1次后，弃上清，即得静息细胞，置于-80℃冻存。
实施例4基因工程菌的构建及诱导表达
用实例1中构建的质粒pET30-HHDH，转化表达宿主Escherichia coli BL21(DE3)。用引物F_HHDH/R_HHDH做菌落PCR，验证转化的重组子。验证无误的基因工程菌即为EcoHHDH。将EcoHHDH接种到含卡那霉素抗性的3～5mL液体LB试管培养基中，于40℃下摇床活化8小时，将活化后得到的培养物按1％转接量转接到含卡纳霉素抗性的液体LB摇瓶培养基中，发酵培养基中恒温震荡培养3h，培养条件为35℃，200rpm。待菌体浓度长到OD600＝1.2时，加入0.2mM IPTG(终浓度)，22℃诱导8h，10,000g离心5min收集细胞，用pH＝7.5的HEPES缓冲液洗涤1次后，弃上清，即得静息细胞，置于-80℃冻存。
实施例5反应过程监测方法
采用HPLC检测方法测定(S)-6-氯-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯到的(R)-6-氰基-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯转化。样品处理：取不同时间点反应液50μL，反应液用等体积的乙酸乙酯萃取，取上层，用无水硫酸钠除水，待HPLC检测。色谱条件为：柱子OA-2200(25cm*4mm*5um)；流动相：正己烷：乙醇＝96∶4，流速1.0mL/min，检测波长220nm；进样量5μL。(S)-6-氯-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯和(R)-6-氰基-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯的HPLC图谱分别如图4，5所示。(R)-6-氰基-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯的保留时间为6.692min，其结构鉴定的质谱图为图6所示；(S)-6-氯-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯的保留时间为5.292min，其结构鉴定的H谱和C谱分别如图7和图8所示。
实施例6(R)-6-氰基-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯的制备
取一定量的实施例2工程菌EcoHHDH静息细胞，用pH＝7.0的100mM的HEPES缓冲液重悬。在10mL的反应瓶中加入3ml 1.2g干重/L的HHDH静息细胞，10mM的底物以及30mM的NaCN，然后置于30℃恒温水浴槽中，搅拌反应16小时，HPLC检测底物完全消耗，加NaCl至饱和，用乙酸乙酯萃取3次，合并有机相萃取液。无水硫酸钠除水，抽滤，减压浓缩，可得黄色油状液体(R)-6-氰基-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯。转化率大于99％，产率大于94％。
实施例7(R)-6-氰基-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯的制备
取一定量的实施例2工程菌EcoHHDH静息细胞，用pH＝7.5的100mM的HEPES缓冲液重悬。在10mL的反应瓶中加入3ml 1.2g干重/L的HHDH静息细胞，10mM的底物以及30mM的NaCN，然后置于37℃恒温水浴槽中，搅拌反应18小时，HPLC检测底物完全消耗，加NaCl至饱和，用乙酸乙酯萃取3次，合并有机相萃取液。无水硫酸钠除水，抽滤，减压浓缩，可得黄色油状液体(R)-6-氰基-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯。转化率大于99％，产率约90％。
实施例8(R)-6-氰基-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯的制备
取一定量的实施例2工程菌EcoHHDH静息细胞，用pH＝7.0的100mM的HEPES缓冲液重悬。在10mL的反应瓶中加入4ml 1.2g干重/L的HHDH静息细胞，10mM的底物以及30mM的NaCN，然后置于40℃恒温水浴槽中，搅拌反应18小时，HPLC检测底物完全消耗，加NaCl至饱和，用乙酸乙酯萃取3次，合并有机相萃取液。无水硫酸钠除水，抽滤，减压浓缩，可得黄色油状液体(R)-6-氰基-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯。转化率大于99％，产率约62％。
实施例9(R)-6-氰基-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯的制备
取一定量的实施例2工程菌EcoHHDH静息细胞，用pH＝7.5的100mM的HEPES缓冲液重悬。在10mL的反应瓶中加入3ml 1.2g干重/L的HHDH静息细胞，10mM的底物以及30mM的NaCN，然后置于25℃恒温水浴槽中，搅拌反应20小时，HPLC检测底物完全消耗，加NaCl至饱和，用乙酸乙酯萃取3次，合并有机相萃取液。无水硫酸钠除水，抽滤，减压浓缩，可得黄色油状液体(R)-6-氰基-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯。转化率大于99％，产率约59％。
实施例10(R)-6-氰基-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯的制备
取一定量的实施例2工程菌EcoHHDH静息细胞，用pH＝7.0的100mM的HEPES缓冲液重悬。在10mL的反应瓶中加入3ml 1.2g干重/L的HHDH静息细胞，10mM的底物以及30mM的NaCN，然后置于35℃恒温水浴槽中，搅拌反应18小时，HPLC检测底物完全消耗，加NaCl至饱和，用乙酸乙酯萃取3次，合并有机相萃取液。无水硫酸钠除水，抽滤，减压浓缩，可得黄色油状液体(R)-6-氰基-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯。转化率大于99％，产率约85％。
实施例11(R)-6-氰基-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯的制备
取一定量的实施例2工程菌EcoHHDH静息细胞，用pH＝7.0的100mM的HEPES缓冲液重悬。在10mL的反应瓶中加入4ml 1.2g干重/L的HHDH静息细胞，10mM的底物以及30mM的NaCN，然后置于35℃恒温水浴槽中，搅拌反应20小时，HPLC检测底物完全消耗，加NaCl至饱和，用乙酸乙酯萃取3次，合并有机相萃取液。无水硫酸钠除水，抽滤，减压浓缩，可得黄色油状液体(R)-6-氰基-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯。转化率大于99％，产率约86％。
实施例12(R)-6-氰基-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯的制备
取一定量的实施例2工程菌EcoHHDH静息细胞，用pH＝9.0的100mM的HEPES缓冲液重悬。在50mL的反应瓶中加入10ml 1.2g干重/L的HHDH静息细胞，10mM的底物以及30mM的NaCN，然后置于40℃恒温水浴槽中，搅拌反应20小时，HPLC检测底物完全消耗，加NaCl至饱和，用乙酸乙酯萃取3次，合并有机相萃取液。无水硫酸钠除水，抽滤，减压浓缩，可得黄色油状液体(R)-6-氰基-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯。转化率大于99％，产率约67％。
实施例13(R)-6-氰基-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯的制备
取一定量的实施例2工程菌EcoHHDH静息细胞，用pH＝7.0的100mM的HEPES缓冲液重悬。在50mL的反应瓶中加入10ml 1.2g干重/L的HHDH静息细胞，10mM的底物以及30mM的NaCN，然后置于30℃恒温水浴槽中，搅拌反应20小时，HPLC检测底物完全消耗，加NaCl至饱和，用乙酸乙酯萃取3次，合并有机相萃取液。无水硫酸钠除水，抽滤，减压浓缩，可得黄色油状液体。(R)-6-氰基-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯。转化率大于99％，产率约88％。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种工程菌，包括宿主细胞和转入宿主细胞的目的基因，其特征在于，所述目的基因为碱基序列如SEQ ID NO.3所示的卤代醇脱卤酶基因。
2.如权利要求1所述的工程菌在以(S)-6-氯-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯为底物制备(R)-6-氰基-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯中的应用。
3.一种(R)-6-氰基-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯的制备方法，其特征在于，包括：
(1)制备包含碱基序列如SEQ ID No.3所示的卤代醇脱卤酶基因的工程菌；
(2)制备所述工程菌的静息细胞悬液；
(3)将静息细胞悬液与底物(R)-6-氰基-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯、氰化物混合，反应制得(R)-6-氰基-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯。
4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述反应的温度为18～40℃，反应液的pH值为7.0～9.0。
5.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述静息细胞悬液的制备方法包括：将所述工程菌活化后，扩大培养至OD600达到0.6～1.2，加入诱导剂，继续培养，离心收集细胞，用缓冲液重悬，获得静息细胞悬液。
6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述诱导剂为IPTG；诱导剂的浓度为0.1～0.5mM。
7.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述缓冲液为HEPES缓冲液。
8.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述缓冲液在反应液中的浓度为1～100mM。
9.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述氰化物为NaCN。
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