CN103833824B - 一种溶解包涵体蛋白的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明一种溶解包涵体蛋白的方法，将表达包涵体蛋白的菌体离心收集，离心菌体用PBS重悬，加入溶菌酶室温1-3小时后经超生破碎，然后离心弃掉上清得到包涵体蛋白沉淀；将所述的包涵体蛋白沉淀重悬于IB？buffer中，然后离心，弃掉上清，重复1-6次洗涤包涵体蛋白；用含有尿素的PBS重悬洗涤后的包涵体蛋白；然后将包涵体蛋白悬液冷冻；将冷冻的包涵体蛋白悬液置于室温，缓慢溶解，然后离心，上清即为可溶的包涵体蛋白。本发明的方法操作简单，得到的包涵体蛋白溶液含有较低浓度的变性剂，简化了复性步骤，节约了时间，提高了蛋白复性效率。
Description
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及包涵体蛋白，特别是一种溶解包涵体蛋白的方法。
背景技术：
外源基因在原核细胞中表达时，尤其是在大肠杆菌中高效表达时，经常聚集形成蛋白的聚集体，即包涵体。传统观点认为包涵体是蛋白错误折叠所形成的无活性的、不可溶的蛋白形式，要溶解包涵体蛋白一般需要用强变性剂，如8M的尿素或6M的盐酸胍，通过离子间的相互作用，打断包涵体蛋白质分子内和分子间的各种化学键，使多肽伸展而可溶。变性的蛋白通过缓慢去除变性剂使目标蛋白从变性的伸展状态恢复到正确的高级结构。而最近研究发现包涵体蛋白具有一定的二级结构，如果在溶解包涵体的过程中能够保留原有的二级结构可以启动蛋白的复性阶段，大大提高蛋白的复性效率。由于强变性剂使多肽完全伸展，破坏了原有的二级结构，复性过程中蛋白聚集沉淀，导致复性蛋白浓度低，效率低，而且需要大体积的缓冲液，长时间的复性过程等。因此，采用温和的变性方法溶解包涵体蛋白，保护包涵体蛋白中原有的二级结构不被破坏将大大有利于包涵体蛋白的复性，简化复性过程提高复性效率。
发明内容：
本发明的目的在于提供一种溶解包涵体蛋白的方法，所述的这种溶解包涵体蛋白的方法要解决现有技术中蛋白复性的过程中，需要消耗大量的缓冲液、复性时间长而且复性效率不高的技术问题。
为实现上述目的，本发明提供了一种溶解包涵体蛋白的方法，包括一个收集包涵体蛋白的步骤，一个洗涤包涵体蛋白的步骤，一个将包涵体蛋白重悬于含有尿素的PBS溶液的步骤，一个冷冻包涵体蛋白的步骤，一个室温溶解包涵体蛋白的步骤；在一个收集包涵体蛋白的步骤中，将表达包涵体蛋白的菌体离心收集，离心菌体用PBS重悬，加入溶菌酶室温1-3小时后经超生破碎，然后离心弃掉上清得到包涵体蛋白沉淀；在一个洗涤包涵体蛋白的步骤中，将所述的包涵体蛋白沉淀重悬于IBbuffer中，然后离心，弃掉上清，重复1-6次洗涤包涵体蛋白；在一个将包涵体蛋白重悬于含有尿素的PBS溶液的步骤中，用含有尿素的PBS重悬洗涤后的包涵体蛋白；在一个冷冻包涵体蛋白的步骤中，将包涵体蛋白悬液冷冻；在一个室温溶解包涵体蛋白的步骤中，将冷冻的包涵体蛋白悬液置于室温，缓慢溶解，然后离心，上清即为可溶的包涵体蛋白。
其中，溶菌酶的终浓度为10ug/ml；PBS的组成为：137mM的NaCl、2.7mM的KCl、10mM的NaHPO4·12H2O、2mM的KH2PO4；IBbuffer的组成为：20mM的Tris–base(pH8.0)、300mM的NaCl、1mM的EDTA、1M的尿素和1%的Triton-100。
进一步的，在一个收集包涵体蛋白的步骤中，离心温度为2-8℃，离心转速为10000-15000r/min，离心时间为10-20min。
进一步的，在一个洗涤包涵体蛋白的步骤中，离心温度为2-8℃，离心转速为10000-15000r/min，离心时间为10-20min。
进一步的，在一个室温溶解包涵体蛋白的步骤中，离心温度为2-8℃，离心转速为10000-15000r/min，离心时间为10-20min。
进一步的，在一个将包涵体蛋白重悬于含有尿素的PBS溶液的步骤中，在含有尿素的PBS溶液中，尿素的浓度为1-2M。
进一步的，在一个将包涵体蛋白重悬于含有尿素的PBS溶液的步骤中，PBS溶液的pH值在7-10之间。
进一步的，在一个冷冻包涵体蛋白的步骤中，冷冻温度在-80℃～-20℃之间。
进一步的，室温的温度在10℃～30℃之间。
上述方法中，为了使菌体充分裂解，较好的利用溶菌酶和超生破碎结合的方法对菌体进行破碎。
优选的，为了保持溶菌酶的活性，pH值一般为8。
优选的，为了得到比较纯净的包涵体蛋白，用IBbuffer洗涤时，洗涤次数一般为3次。
优选的，为了使包涵体蛋白充分溶解，PBS中尿素浓度一般为2M。
优选的，为了使包涵体充分溶解，PBS的pH值一般在8-10。
优选的，为了使包涵体充分溶解，包涵体蛋白的冷冻温度一般选择-20℃。
上述方法中，为了使包涵体充分溶解，冷冻的包涵体蛋白溶液一般置于室温缓慢溶解。
为了得到没有任何杂质的，澄清的可溶的蛋白溶液，一般选择离心后取上清，离心条件为：4℃，12000r/min，15min。
本发明的原理是：首先利用溶菌酶和超生破碎结合的方法对菌体进行破碎，使菌体充分裂解，然后通过低温高速离心获得包涵体蛋白，再将包涵体蛋白重悬于IB缓冲液中，通过多次的洗涤，获得高纯度的包涵体蛋白，然后将包涵体蛋白重悬于含有尿素的pH值在8-10PBS溶液中，让包涵体充分溶解，最后再通过冷冻，室温溶解，离心后的上清液即为可溶的包涵体蛋白。通过本发明方法获得的可溶包涵体蛋白含有较低浓度的变性剂，此变性剂的浓度甚至不会影响蛋白的活性，研究发现变性蛋白复性过程中，当尿素浓度降低到2M时蛋白复性过程就已经开始。短时间的低温冷冻对蛋白活性的影响也非常小，因为一般短时间保存蛋白溶液通常置于4℃或-20℃保存。因此，本发明将低浓度的变性剂与低温冷冻相结合的方法来溶解包涵体蛋白，变性条件温和，不会破坏包涵体蛋白的类二级结构。关于此方法溶解包涵体蛋白的原理是由于温度的变化改变了包涵体蛋白的微环境，如pH值或离子浓度，有利于包涵体蛋白的重新折叠；而低浓度的变性剂则有利于维持蛋白结构的稳定，防止蛋白聚集体的形成。
本发明和已有技术相比较，其效果是积极和明显的。本发明方法操作简单，得到的包涵体蛋白溶液含有较低浓度的变性剂，变性条件温和，为后续的蛋白复性过程简化了操作步骤，节约了时间，能高效率的复性并得到有生物活性的蛋白。
附图说明：
图1为EGFP蛋白的SDS-PAGE电泳图，其中A图为EGFP包涵体蛋白重悬于含有2M尿素的PBS（pH8）在不同的冷冻时间和温度下的溶解性分析，M为蛋白marker，1为冷冻溶解前的包涵体蛋白（总包涵体蛋白），2为表一中的1#样品，3为表一中的2#样品，4为表一中的3#样品，5为表一中的4#样品。B图为EGFP包涵体蛋白重悬于含有2M尿素的不同pH值的PBS中，-20℃下冷冻过夜后室温溶解的包涵体蛋白上清分析，1为表一中的5#样品，2为表一中的6#样品，3为表一中的2#样品，4为表一中的7#样品，5为表一中的8#样品。C图EGFP包涵体蛋白重悬于含有不同尿素浓度的PBS（pH8）中，-20℃下冷冻过夜后室温溶解的包涵体蛋白上清分析，1为表一中的9#样品，2为表一中的10#样品，3为表一中的2#样品。
图2为重组鼠CRT蛋白1-180位氨基酸（r-mCRT/1-180）的SDS-PAGE电泳图，A图为r-mCRT/1-180包涵体蛋白重悬于含有不同尿素浓度的PBS（pH8）中，-20℃下冷冻过夜后室温溶解的包涵体蛋白上清分析，M为蛋白marker，1为冷冻溶解前的包涵体蛋白（总包涵体蛋白），2为表二中的2#样品，3为表二中的9#样品，4为表二中的10#样品。B图为r-mCRT/1-180包涵体蛋白重悬于含有2M尿素的PBS（pH8）在不同的冷冻时间和温度下的溶解性分析,1为冷冻溶解前的包涵体蛋白(总包涵体蛋白），2为表二中的1#样品，3为表二中的2#样品，4为表二中的4#样品，5为表二中的3#样品。C图为EGFP包涵体蛋白重悬于含有2M尿素的不同pH值的PBS中，-20℃下冷冻过夜后室温溶解的包涵体蛋白上清分析，1为表二中的5#样品，2为表二中的6#样品，3为表二中的2#样品，4为表二中的7#样品，5为表二中的8#样品。
图3为利用蛋白质的天然荧光检测蛋白质构象变化的方法，比较本发明方法得到的EGFP包涵体蛋白和8M尿素变性得到的包涵体蛋白复性前后的活性比较，并与非变性条件下纯化的EGFP蛋白的活性进行比较。EGFP吸收光谱的最大峰值为509nm。
图4是本发明一种溶解包涵体蛋白的方法的流程示意图。
具体实施方式
结合以下实施例对本发明做进一步的解释说明，但本发明的保护范围并不限于此。
实施例1
将EGFP蛋白基因序列通过分子克隆的方法连接原核表达载体pET-28a，转化大肠杆菌BL21，经37℃诱导表达后EGFP蛋白以包涵体的形式表达，应用本发明方法溶解EGFP包涵体蛋白，其具体操作如下：
（1）诱导表达重组菌株pET-28a-EGFP500ml，4℃，12000r离心15min收集菌体，然后20ml的PBS重悬，加入200ul1mg/ml的溶菌酶室温孵育2h，然后用超声波破碎；
（2）将上一步破碎的菌体在4℃，12000r离心15min，弃上清；
（3）用IBbuffer洗涤沉淀3次；
（4）最后一遍用IBbuffer重悬之后，取样50ul作为冷冻溶解前的包涵体蛋白样品，然后等体积分装为10管，4℃，12000r离心15min，弃上清；
（5）将10管（1#-10#）包涵体蛋白沉淀用相同体积的PBS重悬，检测不同的尿素浓度，不同冷冻时间，冷冻温度以及不同pH值的PBS条件下的包涵体蛋白的溶解性。每管包涵体蛋白的冷冻条件如表一所示：
表一：
（6）将10管冷冻后的包涵体室温溶解，4℃，12000r离心15min，收集上清，各取样50ul，SDS-PAGE分析。
为验证本发明方法得到的可溶包涵体蛋白的复性效率，将EGFP包涵体蛋白分别采用本发明方法和传统的8M尿素变性的方法得到可溶的包涵体蛋白。利用蛋白质的天然荧光检测蛋白质的构象变化，比较本发明方法得到的可溶EGFP包涵体蛋白和8M尿素变性得到的EGFP包涵体蛋白复性前后的活性，并与非变性条件下纯化的EGFP蛋白的活性进行比较。
结果：通过本实例结果可知，冷冻时间对EGFP蛋白的溶解性没有影响；冷冻温度-80℃，-40℃和-20℃对其溶解性影响不大；随着PBSPH值的递增（6-10），EGFP包涵体蛋白的溶解性有增大的趋势，但是8-10之间溶解性均达到最高水平；尿素浓度1-2M时具有最大溶解性，但是0M时没有得到可溶的包涵体蛋白。通过本发明方法得到的EGFP蛋白复性后其活性接近天然EGFP蛋白的活性，而8M尿素变性方法得到的EGFP蛋白复性后活性远低于天然EGFP蛋白的活性，即使用本发明方法得到的未复性的EGFP蛋白也具有一定的吸收光值，说明本发明和已有技术相比较，本发明方法操作简单，含有较低浓度的变性剂，变性条件温和，没有破坏包涵体蛋白原有的类二级结构，能够高效启动蛋白的复性过程，为后续的蛋白复性过程简化了操作步骤，节约了时间，能高效率的复性并得到有生物活性的蛋白。
实施例2
将鼠CRT蛋白的1-180（r-mCRT/1-180）位氨基酸的基因序列通过分子克隆的方法连接原核表达载体pET28a，转化大肠杆菌BL21，经37℃诱导表达后以包涵体的形式表达，应用本发明方法溶解r-mCRT/1-180包涵体蛋白，其具体操作如下：
（1）诱导表达重组菌株pET-28a-CRT500ml，4℃，12000r离心15min收集菌体，然后20ml的PBS重悬，加入200ul1mg/ml的溶菌酶室温孵育2h，然后用超声波破碎；
（2）将上一步破碎的菌体在4℃，12000r离心15min，弃上清；
（3）用IBbuffer洗涤沉淀3次；
（4）最后一遍用IBbuffer重悬之后，取样50ul作为冷冻溶解前的包涵体蛋白样品，然后等体积分装为10管，4℃，12000r离心15min，弃上清；
（5）将10管（1#-10#）包涵体蛋白沉淀用相同体积的PBS重悬，检测不同的尿素浓度，不同冷冻时间，冷冻温度以及不同pH值的PBS条件下的包涵体蛋白的溶解性。每管包涵体蛋白的冷冻条件如表二所示：
（6）将10管冷冻后的包涵体室温溶解，4℃，12000r离心15min，收集上清，各取样50ul，SDS-PAGE分析。
表二：
结果：通过本实例结果可知，冷冻时间对r-mCRT/1-180包涵体蛋白的溶解性没有影响；冷冻温度为-20℃时包涵体蛋白的溶解性最大，而-40℃和-80℃冷冻只得到少量的可溶包涵体蛋白；随着PBSPH值的递增（6-10），EGFP包涵体蛋白的溶解性有增大的趋势，但是8-10之间溶解性均达到最高水平；尿素浓度为2M时具有最大溶解性，而0M和1M尿素浓度下只得到少量的可溶包涵体蛋白。
综合以上两个实例，冷冻温度为-20℃，尿素浓度为2M，PBSPH值在8-10之间时均得到最大浓度的可溶包涵体蛋白，而冷冻时间均没有影响。
Claims (6)
1.一种溶解包涵体蛋白的方法，其特征在于：包括一个收集包涵体蛋白的步骤、一个洗涤包涵体蛋白的步骤、一个将包涵体蛋白重悬于含有尿素的PBS溶液的步骤、一个冷冻包涵体蛋白的步骤和一个室温溶解包涵体蛋白的步骤；在所述的收集包涵体蛋白的步骤中，将表达包涵体蛋白的菌体离心收集，离心菌体用PBS重悬，加入溶菌酶室温1-3小时后经超生破碎，然后离心弃掉上清得到包涵体蛋白沉淀；在所述的洗涤包涵体蛋白的步骤中，将所述的包涵体蛋白沉淀重悬于IBbuffer中，然后离心，弃掉上清，重复1-6次洗涤包涵体蛋白；在所述的将包涵体蛋白重悬于含有尿素的PBS溶液的步骤中，用含有尿素的PBS重悬洗涤后的包涵体蛋白，在含有尿素的PBS溶液中，尿素的浓度为1-2M，PBS溶液的pH值在8-10之间；在所述的冷冻包涵体蛋白的步骤中，将包涵体蛋白悬液冷冻，冷冻温度在-80℃～-20℃之间；在所述的室温溶解包涵体蛋白的步骤中，将冷冻的包涵体蛋白悬液置于室温，缓慢溶解，然后离心，上清即为可溶的包涵体蛋白。
2.如权利要求1所述的溶解包涵体蛋白的方法，其特征在于：所述的溶菌酶的终浓度为10ug/ml。
3.如权利要求1所述的溶解包涵体蛋白的方法，其特征在于：在所述的收集包涵体蛋白的步骤中，离心温度为2-8℃，离心转速为10000-15000r/min，离心时间为10-20min。
4.如权利要求1所述的溶解包涵体蛋白的方法，其特征在于：在所述的洗涤包涵体蛋白的步骤中，离心温度为2-8℃，离心转速为10000-15000r/min，离心时间为10-20min。
5.如权利要求1所述的溶解包涵体蛋白的方法，其特征在于：在所述的室温溶解包涵体蛋白的步骤中，离心温度为2-8℃，离心转速为10000-15000r/min，离心时间为10-20min。
6.如权利要求1所述的溶解包涵体蛋白的方法，其特征在于：室温的温度在10℃～30℃之间。
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