CZ305599B6 - Způsob separace biopolymerních molekul a nosič pro využití při tomto způsobu - Google Patents

Způsob separace biopolymerních molekul a nosič pro využití při tomto způsobu Download PDF

Info

Publication number
CZ305599B6
CZ305599B6 CZ2014-524A CZ2014524A CZ305599B6 CZ 305599 B6 CZ305599 B6 CZ 305599B6 CZ 2014524 A CZ2014524 A CZ 2014524A CZ 305599 B6 CZ305599 B6 CZ 305599B6
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
carrier
solution
peptides
binding
anchor
Prior art date
Application number
CZ2014-524A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ2014524A3 (cs
Inventor
Rudolf KupÄŤĂ­k
Zuzana Bílková
Pavel Řehulka
Jan Macák
Original Assignee
Univerzita Pardubice
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Univerzita Pardubice filed Critical Univerzita Pardubice
Priority to CZ2014-524A priority Critical patent/CZ305599B6/cs
Priority to US15/501,020 priority patent/US20170226153A1/en
Priority to PCT/CZ2015/000081 priority patent/WO2016015690A1/en
Publication of CZ2014524A3 publication Critical patent/CZ2014524A3/cs
Publication of CZ305599B6 publication Critical patent/CZ305599B6/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C07K1/22—Affinity chromatography or related techniques based upon selective absorption processes
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
    • B01D15/38—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism involving specific interaction not covered by one or more of groups B01D15/265 - B01D15/36
    • B01D15/3804—Affinity chromatography
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
    • B01D15/38—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism involving specific interaction not covered by one or more of groups B01D15/265 - B01D15/36
    • B01D15/3804—Affinity chromatography
    • B01D15/3828—Ligand exchange chromatography, e.g. complexation, chelation or metal interaction chromatography
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
    • B01D15/38—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism involving specific interaction not covered by one or more of groups B01D15/265 - B01D15/36
    • B01D15/3861—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism involving specific interaction not covered by one or more of groups B01D15/265 - B01D15/36 using an external stimulus
    • B01D15/388—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism involving specific interaction not covered by one or more of groups B01D15/265 - B01D15/36 using an external stimulus modifying the pH
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
    • B01D15/38—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism involving specific interaction not covered by one or more of groups B01D15/265 - B01D15/36
    • B01D15/3861—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism involving specific interaction not covered by one or more of groups B01D15/265 - B01D15/36 using an external stimulus
    • B01D15/3885—Using electrical or magnetic means
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B01D15/42—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the development mode, e.g. by displacement or by elution
    • B01D15/422—Displacement mode
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/02—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof comprising inorganic material
    • B01J20/06—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof comprising inorganic material comprising oxides or hydroxides of metals not provided for in group B01J20/04
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/02—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof comprising inorganic material
    • B01J20/10—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof comprising inorganic material comprising silica or silicate
    • B01J20/103—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof comprising inorganic material comprising silica or silicate comprising silica
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/28—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof characterised by their form or physical properties
    • B01J20/28002—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof characterised by their form or physical properties characterised by their physical properties
    • B01J20/28004—Sorbent size or size distribution, e.g. particle size
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/28—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof characterised by their form or physical properties
    • B01J20/28002—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof characterised by their form or physical properties characterised by their physical properties
    • B01J20/28009—Magnetic properties
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/281—Sorbents specially adapted for preparative, analytical or investigative chromatography
    • B01J20/286—Phases chemically bonded to a substrate, e.g. to silica or to polymers
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/30—Processes for preparing, regenerating, or reactivating
    • B01J20/32—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating
    • B01J20/3202—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating characterised by the carrier, support or substrate used for impregnation or coating
    • B01J20/3204—Inorganic carriers, supports or substrates
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/30—Processes for preparing, regenerating, or reactivating
    • B01J20/32—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating
    • B01J20/3231—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating characterised by the coating or impregnating layer
    • B01J20/3234—Inorganic material layers
    • B01J20/3236—Inorganic material layers containing metal, other than zeolites, e.g. oxides, hydroxides, sulphides or salts
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/30—Processes for preparing, regenerating, or reactivating
    • B01J20/32—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating
    • B01J20/3291—Characterised by the shape of the carrier, the coating or the obtained coated product
    • B01J20/3293—Coatings on a core, the core being particle or fiber shaped, e.g. encapsulated particles, coated fibers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H1/00—Processes for the preparation of sugar derivatives
    • C07H1/06—Separation; Purification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C07H21/04—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with deoxyribosyl as saccharide radical
    • H—ELECTRICITY
    • H01—ELECTRIC ELEMENTS
    • H01F—MAGNETS; INDUCTANCES; TRANSFORMERS; SELECTION OF MATERIALS FOR THEIR MAGNETIC PROPERTIES
    • H01F1/00—Magnets or magnetic bodies characterised by the magnetic materials therefor; Selection of materials for their magnetic properties
    • H01F1/0036—Magnets or magnetic bodies characterised by the magnetic materials therefor; Selection of materials for their magnetic properties showing low dimensional magnetism, i.e. spin rearrangements due to a restriction of dimensions, e.g. showing giant magnetoresistivity
    • H01F1/0045—Zero dimensional, e.g. nanoparticles, soft nanoparticles for medical/biological use
    • H01F1/0054—Coated nanoparticles, e.g. nanoparticles coated with organic surfactant
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D2239/00—Aspects relating to filtering material for liquid or gaseous fluids
    • B01D2239/02—Types of fibres, filaments or particles, self-supporting or supported materials
    • B01D2239/0258—Types of fibres, filaments or particles, self-supporting or supported materials comprising nanoparticles
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/20—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand
    • C07K2319/21—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand containing a His-tag
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/50—Conditioning of the sorbent material or stationary liquid
    • G01N30/56—Packing methods or coating methods
    • G01N2030/567—Packing methods or coating methods coating

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Power Engineering (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Solid-Sorbent Or Filter-Aiding Compositions (AREA)

Abstract

Způsob separace biopolymerních molekul, zejména biopolymerních molekul ze skupiny mono- a multifosforylované peptidy, rekombinantní peptidy/proteiny s polyhistidinovou kotvou, His-tag, či jinou chemicky podobnou biospecifickou kotvou, peptidy/proteiny obsahující cystein, nukleové kyseliny, u kterého se biopolymerní molekula ve vazebném roztoku naváže na nosič, který obsahuje jádro s rozměry v nano- a/nebo submikro- a/nebo mikroměřítku, tvořené oxidem alespoň jednoho přechodového kovu a/nebo oxidu křemíku, na jehož povrchu je uložená alespoň jedna souvislá nebo nesouvislá vrstva a/nebo nanočástice magnetického oxidu kovu a/nebo jsou takové nanočástice uloženy v jeho vnitřní struktuře, a poté se z nosiče s navázanými biomolekulami alespoň jedním promytím promývacím roztokem odmyjí nežádoucí a nespecificky navázané komponenty, načež se z něj změnou pH a/nebo elučním roztokem eluují biopolymerní molekuly. Nosič pro využití při tomto způsobu.

Description

Způsob separace biopolymerních molekul a nosič pro využití při tomto způsobu
Oblast techniky
Vynález se týká způsobu separace biopolymerních biomolekul.
Vynález se dále týká také nosiče pro využití při tomto způsobu separace.
Dosavadní stav techniky
V současné době se pro separaci biopolymerních molekul, jako např. mono- a multifosforylovaných peptidů, rekombinantních peptidů/proteinů s polyhistidinovou kotvou (His-tag) či jinou, chemicky podobnou biospecifickou kotvou, peptidů/proteinů obsahujících cystein, a nukleových kyselin, rutinně používají různé způsoby a různé nosiče, které však, kromě nesporných užitných hodnot, vykazují také řadu limitujících vlastností - viz níže.
Separace mono- a multifosforylovaných peptidů
Funkce fosforylace proteinů ajejich dynamické změny za fyziologických podmínek byly již podrobně popsány. Jak se však během posledních 20 let ukázalo, jsou změny ve fosforylaci proteinů vztahující se k určitým patologickým stavům v lidském organismu též diagnosticky i prognosticky velice významné. Aparáty pro strukturní analýzu těchto diagnosticky významných molekul včetně míry a lokalizace fosfoiyláce jsou v současné době velice vyhledávané.
Vzhledem ktomu, že mono- a multifosforylované peptidy/proteiny se v buňkách nacházejí ve velmi nízkých koncentracích, jejich zastoupení se v čase výrazně mění ajejich stabilita v průběhu preanalytické fáze není ideální, je nezbytné pro jejich separaci použít účinnou obohacovací techniku, která výrazně zvyšuje jejich poměrné zastoupení ve směsi.
Po dlouhou dobu se po obohacování mono- a multifosforylovaných peptidů/proteinů z biologických materiálů využívala separační technika založená na chromatografii na imobilizovaných kovových iontech (1MAC) s Fe3+ nebo Ga3+ (Zr4+, Ti4+ atd.) - viz např. článek Anderson L„ Porath J.: „Isolation of phosphoproteins by immobilized metal (Fe+3) affinity chromatogramy“, Analytical Biochemistry. 1986, vol. 154, p. 250-254, a článek Zhou H.: „Zirconium phosphonate-modified porous Silicon for highly specific capture of phosphopeptides and MALDI-TOF MS analysis“. Journal of Proteome Research, 2006; vol. 5, p. 2431-2437. Jejím principem je interakce negativně nabité fosfátové skupiny s pozitivně nabitými ionty kovů. Ty přitom mohou být vázány pomocí iminodioctové kyseliny (IDA), nitrilotrioctové kyseliny (NTA) nebo tris(karboxymethyl)ethylendiaminu. Při separaci fosfopeptidů touto technikou (IMAC s Fe3+ nebo Ga3’) se však separují i peptidy obsahující kyselinu asparagovou nebo glutamovou nebo řetězce obsahující ve vyšší hustotě histidin - viz např. článek Schilling M. & Knapp D. R.: „Enrichment of Phosphopeptides Using Biphasic Immobilized Metal Affinity-Reversed Phase Microcolumns“, Journal of Proteome Research, 2008, vol. 7, p. 4164-4172. Tato nespecifická vazba přitom zvyšuje nežádoucí kontaminaci vzorku určeného pro hmotností analýzu.
V článku Haydon C. E. et al. „Identification of Novel Phosphorylatoin Sites on Xenopous laevis Aurora A and Analysis of Phosphopeptide Enrichment by Immobilized Metal-affinity Chromatography“, Molecular & Cellular Proteomics, 2003, vol. 2, p. 1055-1067, je pak popsaná redukce této nespecifické vazby methylesterifíkací karboxylových skupin.
Jinou možností redukce této nespecifická vazby je dle článku Seeley, E. H„ et al.: „Reduction of non-specific binding in Ga(III) immobilized metal affinity chromatography for phosphopeptides by using endoproteinase glu-C as the digestive enzyme“, Journal of Chromatography B, 2005,
- 1 CZ 305599 B6 vol. 817, p. 81-88 naštěpení vzorku peptidů/proteinů před separací, vedle trypsinu, i jiným typem proteázy, např. enzymem Glu-C, který štěpí peptidy/proteiny za asparagovou a glutamovou kyselinou, čímž se získají peptidy s kyselou aminokyselinou na C-konci. Tyto metody jsou však značně pracné a ne vždy dostatečně účinné, přičemž esterifikace zbytku kyseliny asparagové a glutamové navíc ztěžuje interpretovatelnost spekter. Nevýhodou použití proteázy Glu-C je tvorba příliš dlouhých peptidových řetězců.
Podobných interakcí jako nosič s Fe3+ ionty využívá také nosič na bázi čistého Fe3O4 - viz např. článek Aera, L., et al.: „Enrichment of phosphopeptides using bare magnetic particles“, Rapid Communications in Mass Spectrometry, 2008; vol. 22, p. 2561-2564.
Další, méně používanou alternativou je využití afinitní chromatografie na A1(OH)3 - viz např. článek Wolschin, F.: „Enrichment of phosphorylated proteins and peptides from complex mixtures using metal oxide/hydroxide affinity chromatography (MOAC)“, Proteomics, 2005, vol. 5, p. 4389^1397, při které je však nutné použít rozdílné podmínky vazby jako u oxidů kovů.
V současné době se pak pro specifické obohacování monofosforylovaných případně difosforylovaných peptidů používají zejména oxidy kovů. Nejčastěji se jedná o porézní mikročástice TiO2, jejichž velikost se pohybuje v jednotkách mikrometrů - viz např. článek Jiang Z. T., et al.: „Synthesis of Porous Titania Microspheres for HPLC Packings by Polymerization-Induced Colloid Aggregation (PICA)“, Analytical Chemistry, 2001, vol. 73, p. 686-688. Tyto mikročástice přitom mohou být s výhodou superparamagnetické, což přináší řadu výhod, jako např. rychlou separaci částic od kapalné fáze pomocí silného magnetu, nulovou ztrátu nosiče nebo vzorku, vsádkové mimokolonové uspořádání nebo separaci probíhající v koloně v tzv. dynamickém fluidním loži. Nevýhodou tohoto postupuje, že u multifosforylovaných peptidů dochází k výrazným ztrátám, které jsou uzpůsobeny velmi silnou interakcí fosfátových skupin s mikročásticemi TiO2, kdy je eluce multifosforylovaných forem peptidů velice nízká nebo neprobíhá vůbec - viz např. článek Tingholm Τ. E., et al. „SIMAC (Sequential Elution from IMAC), a Phosphoproteomics Stratégy for the Rapid Separation of Monophosphorylated from Multiply Phosphorylated Peptides“, Molecular & Cellular Proteomics 7, 661-671, 2008. Další nevýhodou tohoto postupu je že mikročástice TiO2 (nebo jiného přechodového kovu a SiO2) nelze používat opakovaně, neboť jejich vazebná kapacita se při každém dalším použití výrazně snižuje. Navíc, již před prvním použitím mají malý měrný povrch, který je zodpovědný za nízkou startovní vazebnou kapacitu nosiče.
Určitou výjimkou jsou magneticky aktivní nanočástice TiO2 o velikosti 100 až 200 nm s obchodním názvem MagPrep TiO2 známé např. z WO 2009/115176, které obsahují magnetické jádro tvořené Fe3O4, které je pokryté slupkou z TiO2.
V článku Chen, C.-T. & Chen, Y.-C.: „Fe3O4/TiO2 Core/Shell Nanoparticles as Affinity Probes for the Analysis of Phosphopeptides Using TiO2 Surface-Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry“, Analytical Chemistry 77 (2005), 5912-5919, bylo dále popsáno využití laboratorně připravených TiO2 nanočástic s magneticky aktivním jádrem tvořeným Fe3O4 pro obohacení fosfopeptidů a následnou SALDI-MS (hmotnostní spektrometrie s ionizací laserem za účasti povrchu).
Nevýhodou těchto nanočástic je, že na svém povrchu obsahují pouze TiO2, díky čemuž je značně oslaben efekt jejich magnetické části a nejsou také zachovány specifické vazebné interakce mezi TiO2 a magnetickým oxidem.
Separace rekombinantních peptidů/proteinů značených polyhistidinovou kotvou (His-tag)
Řada významných bioaktivních látek, podávaných injekčně do lidského organismu jako biologické terapeutikum, jako např. inzulín, erytropoetin, interferony, subjednotkové vakcíny, apod. se v současné době připravuje rekombinantní cestou - tj. způsobem, kdy se do genomu produkčního
-2CZ 305599 B6 organismu (např. bakterií, kvasinek, živočišných buněk) uměle začlení vektor s genem kódujícím požadovaný protein, díky čemuž se tento protein v dané buňce exprimuje společně s vlastními proteiny buňky. Přitom se rekombinantní protein buď hromadí v cytosolu buňky nebo se uvolňuje do extracelulámího prostoru nebo se za určitých podmínek uzavírá do tzv. inkluzních tělísek. Výsledkem je v každém případě z chemického hlediska vysoce komplexní směs heterogenních látek. Vzhledem k tomu, že i jen minimální kontaminace rekombinantních proteinů nefunkčními fragmenty, ěi jinými látkami proteinové povahy může u pacientů vyvolat značné zdravotní komplikace, jsou nároky na čistotu těchto proteinů pro in vivo použití v medicíně extrémně vysoké. Proto je pro jejich separaci nutné použít účinnou a vysoce selektivní separační metodu, která umožňuje spolehlivě oddělit daný rekombinantní protein od ostatních abundantních proteinů a jiných látek chemické povahy pocházejících z produkčního organismu.
Postupně bylo popsáno a do praxe zavedeno mnoho různých modifikací rekombinantních proteinů, které mají usnadnit jejich separaci a purifikaci. Nejpoužívanější je modifikace polyhistidinovou kotvou (His-tag), která se skládá nejčastěji ze 6 až 8 po sobě jdoucích histidinů na C- nebo N-konci polypeptidového řetězce. Pomocí této kotvy a její biospecifické interakce s ligandem na nosiči je možné rekombinantní protein ze směsi mnoha dalších proteinů snadno separovat v poměrně čisté formě. K separaci těchto proteinů se v současné době v drtivé většině aplikací používá technika IMAC, tj. chromatografie na imobilizovaných kovových iontech nosiče (viz výše) s dvojmocnými ionty kovů, z nichž nej používanějším iontem je Ni2+, méně často Co2+; alternativně lze použít i například Cu2+ či Zn2+ nebo další ionty. Nevýhodou těchto nosičů je, že jsou často připravovány na bázi zesíťovaných gelů nebo jiných polymemích materiálů, které mají nízkou mechanickou a chemickou odolnost. Časté je také nežádoucí uvolňování iontů z nosiče, například v kyselém prostředí. Asi nej významnějším limitem použití techniky IMAC pro separaci rekombinantních proteinů je fakt, že vedle polyhistidinu mají k použitému nosiči afinitu i jiné aminokyseliny (Glu, Asp, Arg, Lys, Tyr, Cys a Met) a též N-koncová aminoskupina proteinu, takže pro vysokou čistotu separovaného proteinu je nutno vhodně nastavit ekvilibrační, promývací a eluční podmínky, což vyžaduje značně zkušenou obsluhu a ne vždy je možné dosáhnout požadované čistoty izolovaného proteinu.
Separace nukleových kyselin
Separace nukleových kyselin je nezbytným krokem při studiu genetické informace mnoha organismů. Molekulární diagnostika infekcí, genetická analýza nebo profilování, též genová terapie, to jsou některé příklady, kdy je nutné nukleové kyseliny nejprve před vlastní analýzou šetrně z buněk separovat a oddělit je též od jiných kontaminujících látek přítomných v buněčném lyzátu.
V dnešní době je hojně používaným způsobem separace nukleových kyselin pomocí fenolu a chloroformu - viz např. článek Albariňo C. G., Romanowski V.: „Phenol extraction revisited: a rapid method for the isolation and preservation of human genomic DNA from whole blood“, Molecular and Cellular Probes 8 (1994), 423^427, a článek Manoj C. et al.: „A method for the extraction of high-quality RNA and protein from single smáli samples of arteries and veins preserved in RNAlater“, Journal of Pharmacological and Toxicological Methods, Volume 47, Issue 2, March-April 2002, 87-92. Jedná se o vícekrokový postup, který umožňuje separovat nukleové kyseliny ve velké čistotě a s dostatečnou účinností, neboť fenolem se vysráží prakticky všechny proteiny, které se pak snadno odstraní. Úpravou hodnoty pH reakčního prostředí přitom lze současně provádět specifické separace určitého typu nukleových kyselin, když se např. pro separaci ribonukleových kyselin použije kyselý fenol, pro separaci deoxyribonukleových kyselin se použije fenol o hodnotě pH 7,5 až 8 a kontaminující ribonukleové kyseliny se degradují RNázami, apod. Po separaci a po všech purifikačních krocích je často nutné pro další experimenty nukleové kyseliny zakoncentrovat.
Jiným způsobem separace nukleových kyselin je jejich vychytávání na skleněnou matrici za přítomnosti vysokých koncentrací chaotropních solí, s následnou elucí nukleových kyselin roztokem
-3 CZ 305599 B6 o nízké koncentraci chaotropní soli - viz např. článek Hóss M. and Páábo S.: „DNA extraction from Pleistocene bones by a silica-based purification method“, Nucleic Acids Research 21 (1993), 3913-3914. Na tomto principu je založena většina komerčních souprav pro separaci nukleových kyselin - např. DNeasy Blood&Tissue Kit od firmy Q1AGEN, kde je základním materiálem pro separaci silikagelová membrána. Podobně fungují i magnetické nosiče a to např. MagPrep Silica Particles (EMD Millipore). Nevýhodou těchto souprav je jejich vyšší cena a často také nižší výtěžnost.
Ve výhodné variantě lze také použít magnetické nanočástice pokryté SiO2, které mohou být navíc modifikovány například amino skupinou - viz např. článek Bai Y. et al.“ A rapid method for the detection of foodbome pathogens by extraction of a trace amount of DNA from raw milk based on amino-modified silica-coated magnetic nanoparticles and polymerase chain reaction“, Analytica Chimica Acta 787 (2013), 93-101.
Jiným způsobem separace nukleových kyselin je využití iontově výměnné kapalinové chromatografie, kdy se nukleová kyselina vychytává na kladně nabité částice nosiče a následně eluuje zvyšující se koncentrací solí, kdy dochází k postupnému uvolňování nejen molekul nukleové kyseliny, ale i jiných negativně nabitých molekul. Takto lze od sebe oddělit látky lišící se množstvím i hustotou negativních nábojů na svém povrchu. Nevýhodou této metody je její nízká výtěžnost a specifita, přičemž výsledný produkt je vždy kontaminován vysokou koncentrací solí.
Z článku Amano T., et al.: „Preparation of DNA-adsorbed TiO2 particles - Augmentation of performance for environmental purification by increasing DNA adsorption by extemal pH regulation“ Science of the Total Environment 408 (2010), 480-485 je pak známý způsob separace nukleových kyselin na bázi TiO2, který je založen na afinitě fosfátové skupiny nukleových kyselin k TiO2 materiálům.
Z KR 20070062940 je dále známý způsob separace deoxyribonukleové kyseliny pro analytické využití prostřednictvím nemagnetických mezoporézních materiálů vyrobených z TiO2.
Mezi nej důležitější hlediska při výběru způsobu separace deoxyribonukleové kyseliny přitom patří kompatibilita zvolené metody s následnou PCR (polymerázová řetězová reakce) technikou. Vlastní polymerizace nukleové kyseliny probíhá v rozmezí pH 8,3 až 8,8 v Tris-HCl 10 mM s přídavkem MgCl2 a KC1. Lze však využít i jiné pufřovací systémy, ale je nutné, aby byla za takových podmínek zachována funkční aktivita příslušné polymerázy (např. Taq polymeráza má pH optimum pH 7,8 až 9,0).
Většina výše uvedených technik prováděných na pevné fázi využívá principu nespecifické, na fyzikálně-chemických principech založené, sorpci nukleových kyselin.
Separace peptidů/proteinů obsahujících cystein
V článku Tambor V., et al.: „CysTRAQ - A combination of iTRAQ and enrichment of cysteinyl peptides for uncovering and quantifying hidden proteomes“, Journal of Proteomics 75 (2012), 857 - 867, bylo experimentálně potvrzeno, že až 15 % peptidů v rozmezí 800 až 3000 Da vzniklých po naštěpení všech lidských proteinů trypsinem by obsahovalo alespoň jeden cystein. Domény proteinů, které jsou bohaté na cysteiny, se totiž významně uplatňují v mnoha buněčných procesech, jsou součástí mnoha enzymů, receptorů a signálních molekul. Jejich selektivní separace je jednou ze strategií umožňující studium primární a sekundární struktury proteinů.
Peptidy/proteiny obsahující thioly, jako je glutathion nebo fytochelatiny hrají důležitou roli při obraně organismu před intoxikací těžkými kovy, zajišťují rovnováhu mezi oxidací a deoxidací. Glutathion je tripeptid složený z aminokyselin kyseliny glutamové, cysteinu a glycinu nacházející se v buňkách živočichů, rostlin i bakterií a chrání organismus před oxidačním stresem. Fytochelatiny jsou post-translačně syntetizované peptidy, které se vyskytují především v rostlinách a efek-4CZ 305599 B6 tivně vyvažují ionty těžkých kovů, čímž rostlinu chrání před jejich toxickým působením. Cysteiny také často podléhají post-translačním modifikacím jako je S-nitrosylace a následná oxidace, což má za následek špatnou konformaci proteinů, což může vést k vzniku agregátů např. u neurodegenerativních onemocnění - viz např. článek P. J. Muchowski: „Modulation of neurodegeneration by molecular chaperones“, Nátuře Reviews Neuroscience 6 (2005), 11-22.
Také jedovatí pavouci, hadi, škorpióni nebo mořští šneci produkují velkou škálu bioaktivních peptidů bohatých na cysteiny, které se podílí na stabilizaci jejich struktury množstvím disulfidických vazeb. Jinou významnou skupinou látek bohatých na cysteiny jsou hydrofobiny jako primární metabolity mikroskopických vláknitých hub způsobující nemalé škody v pivovarnictví a sladovnictví především díky tomu, že způsobují přepěňování piva - viz např. článek Linder, M. B., et al.: „Hydrophobins: the protein-amphiphiles of filamentous fungi“, FEMS Microbiology Reviews 29 (2005), 877-896. Příkladem klinicky významné funkce peptidů bohatých na cystein je asociace s Parkinsonovou chorobou, kdy se GPR37 doména bohatá na cysteiny výrazně podílí na cytotoxických efektech uvnitř buňky - viz např. článek Jorge Gandia et al, „The Parkinson's disease-associated GPR37 receptor-mediated cytotoxicity is controlled by its intracellular cysteine-rich domain“, Journal ofNeurochemistry 125 (2013), 362-372.
Do dnešního dne bylo vyvinuto několik způsobů pro specifickou separaci peptidů/proteinů obsahujících cystein, jako např. kovalentní chromatografie založená na specifické separaci peptidů/proteinů s volnou sulfanylovou skupinou pomocí nosiče obsahujícího reaktivní 2-pyridyldisulfid. 2-Pyridyldisulfid přitom reaguje s -SH skupinou peptidu, při čemž dochází ke vzniku stabilní disulfidické vazby mezi bílkovinou a nosičem a k uvolnění 1,2-dihydro-2-pyridinthionu. K elucí kovalentně vázané molekuly se používá redukující β-merkaptoethanol nebo dithiothreitol - viz např. článek Brandt J. et al., Journal of Solid-Phase Biochemistry 2 (1977) 105-109, a článek Liu T. et al.: „Improved proteome coverage by using high efficiency cysteinyl peptide enrichment: the human mammary epithelial cell proteome“, Proteomics 5 (2005), 1263-1273.
Mezi komerční výrobky, které se používají k separaci proteinů bohatých na cystein nebo peptidů obsahujících cystein se nejčastěji používá Thiopropyl Sepharose 6B nebo 4B (GE Healthcare), nosič obsahující 2-pyridyldisulfid o velikosti 45 až 165 pm.
Na podobném principu pak fungují i další metody, které slouží k specifickému označení -SH skupiny cysteinu, kdy dojde ke snížení komplexity výchozího materiálu určeného k analýze, přičemž takto označená molekula umožní též kvantifikaci látky.
Z článku Spahr C. S., et al.: „Simplification of complex peptide mixtures for proteomic analysis: reversible biotinylation of cysteinyl peptides“, Electrophoresis 21 (2000), 1635-1650 je známá technika reverzibilní biotinylace cysteinových peptidů, z článku Giron P., et al.: „Cysteinereactive covalent capture tags for enrichment of cysteine-containing peptides“, Rapid Communications in Mass Spectrometry 23 (2009), 3377-3386 značení cystein-reaktivními značkami pro kovalentní záchyt, z článku Gygi S. P., et al.: „Quantitative analysis of complex protein mixtures using isotope-coded affinity tags“, Nátuře Biotechnology 17 (1999), 994-999, přístup zvaný ICAT, a z článku Tambor V., et al.: CysTRAQ-a combination of iTRAQ and enrichment of cysteinyl peptides for uncovering and quantifying hidden proteomes“, Journal of Proteomics 75 (2012), 857 - 867 cystein reaktivní značky pro tandemovou hmotnostní spektrometrii a CysTRAQ.
Cílem vynálezu je odstranit nevýhody stavu techniky a navrhnout způsob pro účinnou separaci a purifikaci biopolymemích molekul, který by byl vhodný pro většinu významných biopolymerních molekul a vybrané biotechnologické a biomedicínské aplikace.
Kromě toho je cílem vynálezu navrhnout nosič pro použití při tomto způsobu.
-5 CZ 305599 B6
Podstata vynálezu
Cíle vynálezu se dosáhne způsobem separace biopolymemích molekul, zejména biopolymemích molekul ze skupiny mono- a multifosforylované peptidů, rekombinantních peptidů/proteinů s polyhistidinovou kotvou (His-tag) či jinou, chemicky podobnou biospecifickou kotvou, peptidů/proteinů obsahujících cystein, a nukleových kyseliny, jehož podstata spočívá v tom, že biopolymemí molekula se ve vazebném roztoku naváže specifickou vazbou na nosič, který obsahuje jádro s rozměry v nano- a/nebo submikro- a/nebo mikroměřítku, tvořené oxidem alespoň jednoho přechodového kovu a/nebo oxidu křemíku, na jehož povrchu je uložená alespoň jedna souvislá nebo nesouvislá vrstva a/nebo nanočástice magnetického oxidu kovu a/nebo jsou takové nanočástice uloženy v jeho vnitřní struktuře, poté se z nosiče s navázanými biomolekulami alespoň jedním promytím promývacím roztokem odmyjí nežádoucí a nespecificky navázané komponenty, načež se z něj změnou pH a/nebo elučním roztokem eluují požadované biopolymemí molekuly. Tímto způsobem se dosáhne vysoké čistoty separované biopolymemí molekuly.
Vazebný roztok pro navázání mono- a multifosforylovaných peptidů na nosič s výhodou obsahuje 35 až 90 % organického rozpouštědla a 0,1 až 5 % karboxylové kyseliny, Promývací roztok s výhodou obsahuje 5 až 90 % organického rozpouštědla a 0,1 až 5 % karboxylové kyseliny. Pro redukci nespecifické vazby může vazebný a/nebo promývací roztok dále obsahovat 0,5 až 3 M jiné karboxylové kyseliny. Mono- a/nebo multifosforylovaný peptid se pak z nosiče eluuje elučním roztokem s pH vyšším než 9, nebo kompetitivní elucí roztokem obsahujícím alespoň 20 mM fosfátu/fosfátů.
Vazebný roztok pro navázání rekombinantního peptidu/proteinu s polyhistidinovou kotvou (Histag) či jinou, chemicky podobnou biospecifickou kotvou na nosič s výhodou obsahuje libovolný pufr a 0 až 300 mM imidazolu, přičemž jeho pH je v rozmezí 3 až 8,7. Také promývací roztok obsahuje libovolný pufr a 0 až 300 mM imidazolu, přičemž jeho složení je s výhodou stejné jako složení vazebného roztoku. Pro redukci nespecifické vazby pak může vazebný a/nebo promývací roztok obsahovat až 0,5 M soli/solí. Rekombinantní peptid/protein s polyhistidinovou kotvou (His-tag) či jinou, chemicky podobnou biospecifickou kotvou se pak z nosiče eluuje změnou pH na 9,5 až 12. Rekombinantní protein se z nosiče výhodou eluuje elučním roztokem obsahujícím alespoň 20 mM fosfátu/fosfátů nebo přídavkem imidazolu do celkového množství imidazolu 10 mM až 1 M, rekombinační peptid pak zvýšením pH v rozmezí 9,5 až 12 nebo elučním roztokem obsahujícím alespoň 20 mM fosfátu/fosfátů.
Vazebný roztok pro navázání peptidů/proteinů obsahující cystein na nosič obsahuje libovolný pufr a 0 až 2 % dodecylsulfátu sodného, přičemž jeho pH je 6 až 8. Také promývací roztok obsahuje libovolný pufr a 0 až 2 % dodecylsulfátu sodného, s pH 6 až 8, přičemž jeho složení je s výhodou stejné jako složení vazebného roztoku. Pro redukci nespecifické vazby pak může vazebný a/nebo promývací roztok obsahovat 10 až 50 mM dithiotreitolu, merkaptoethanolu nebo kyseliny merkaptobenzoové. Peptid/protein obsahující cystein se z nosiče eluuje změnou pH na hodnotu 10 až 12, např. přídavkem fosfátu/fosfátů.
Vazebný roztok pro navázání deoxyribonukleové kyseliny na nosič je tvořen pufrem s pH 4,5 až 6,5. Také promývací roztok je v tomto případě tvořen pufrem s pH 4,5 až 6,5, přičemž ve výhodné variantě provedení je jeho složení stejné jako složení vazebného roztoku.
Vazebný roztok pro navázání ribonukleové kyseliny na nosič je tvořen pufrem s pH 3,8 až 4,5. Také promývací roztok je v tomto případě tvořen pufrem spH 3,8 až 4,5, přičemž ve výhodné variantě provedení je jeho složení stejné jako složení vazebného roztoku.
Deoxyribonukleová kyselina nebo ribonukleová kyselina se pak z nosiče eluuje zvýšením pH na hodnotu 8 až 11, nebo elučním roztokem obsahujícím alespoň 20 mM fosfátu/fosfátů.
-6CZ 305599 B6
Ve všech variantách separace biopolymemích molekul podle vynálezu je výhodné, pokud se použije nosič, kteiý obsahuje jádro tvořené nanotrubicemi z TiO2, na jejichž povrchu jsou uloženy nanočástice Fe3O4.
Po ukončení separace je pak dále výhodné použitý nosič regenerovat, resp. dekontaminovat a sterilizovat, a to např. fotokatalýzou iniciovanou UV zářením o vlnové délce 200 až 400 nm, s intenzitou alespoň 1 mW/cm2 plochy nosiče.
Kromě způsobu separace se cíle vynálezu dosáhne také nosičem pro separaci biopolymemích molekul, zejména biopolymemích molekul ze skupiny mono- a multifosforylovaných peptidů, rekombinantních peptidů/proteinů s polyhistidinovou kotvou (His-tag) či jinou, chemicky podobnou biospecifickou kotvou, peptidů/proteinů obsahující cystein, a nukleových kyselin jehož podstata spočívá v tom, že obsahuje jádro s rozměry v nano- a/nebo submikro- a/nebo mikroměřítku, tvořené oxidem alespoň jednoho přechodového kovu a/nebo oxidu křemíku, přičemž alespoň na části povrchu jádra je uložená vrstva a/nebo jsou uloženy nanočástice magnetického oxidu kovu a/nebo jsou takové nanočástice uloženy v jeho vnitřní struktuře. Přitom je výhodné, pokud alespoň část alespoň některých částic zasahuje do povrchu jádra nebo z něj vystupuje.
Jádro takového nosiče je pak s výhodou tvořené oxidem křemíku a/nebo oxidem přechodového kovu ze skupiny TiO2, ZrO2, A12O3, Ta2O5, WO3, SnO2, HfO2, Nb2O5, MoO2, MoO3, ZnO, V2O5, Fe2O3, Fe3O4, nebo směsí alespoň dvou z nich, přičemž magnetický oxid kovu jsou s výhodou oxid kovu ze skupiny FexOy, NiO, CoO, Co3O4, ferit na bázi M2O3, kde M je kov ze skupiny Fe, Ni, Co, nebo směs alespoň dvou z nich.
V nejvýhodnější variantě provedení obsahuje nosič podle vynálezu jádro tvořené nanotrubicemi z TiO2, na jejichž povrchu jsou uloženy nanočástice Fe3O4.
Objasnění výkresů
Na obr. 1 přiloženého výkresu je 100 OOOkrát zvětšená fotografie nosiče vyvinutého pro separaci biopolymemích molekul podle vynálezu vjedné z variant provedení, na obr. 2 čtyři bloková schémata způsobu izolace čtyř různých polymemích biomolekul podle vynálezu, na obr. 3 tři MS spektra srovnávající čistý standard - fosvitin naštěpený trypsinem, výsledek obohacení fosvitinu s využitím komerčního nosiče známého ze stavu techniky, a výsledek obohacení fosvitinu s využitím nosiče podle vynálezu na obr. 1, na obr. 4 dvě MS spektra srovnávající standard komerční ubikvitin s His-tag naštěpený trypsinem, a výsledek separace ubikvitinu s použitím nosiče podle vynálezu ve variantě dle obr. 1, a na obr. 5 dvě MS spektra srovnávající standard hovězí sérový albumin naštěpený trypsinem, a výsledek separace peptidů z hovězího sérového albuminu s použitím nosiče podle vynálezu ve variantě dle obr. 1.
Příklady uskutečnění vynálezu
Způsob separace biopolymemích molekul (zejména mono- a multifosfoiylovaných peptidů, rekombinantních peptidů/proteinů s polyhistidinovou kotvou (His-tag) či jinou, chemicky podobnou biospecifickou kotvou, peptidů/proteinů obsahujících cystein, a nukleových kyselin) podle vynálezu je založen na využití kompozitního nosiče tvořeného jádrem z materiálu na bázi oxidu přechodového kovu/ů (např. Ti, Al, Zr, Ta, Hf, W, Nb, Sn, V, Fe) nebo oxidu křemíku, najehož povrchu a/nebo v jehož vnitřní struktuře je uložen magnetický oxid kovu/ů (např. Fe, Co a Ni).
Jádro tohoto nosiče je přitom tvořeno v podstatě libovolným útvarem, např. kulovou nebo v podstatě kulovou částicí, trubicí (dutým podélným útvarem, který má výrazně větší délku než průměr), vláknem (plným podélným útvarem, který má výrazně větší délku než průměr), či v podstatě libovolným jiným útvarem/částicí (pravidelným nebo nepravidelným, např. krychlí, kvá-7CZ 305599 B6 drem, hranolem, jehlanem, apod.), s rozměry v nano-, submikro- nebo mikroměřítku. Jeho materiálem je přitom oxid přechodového kovu (s výhodou např. TiO2, ZrO2, A12O3, Ta2O5, WO3, SnO2, HfO2, Nb2O5, MoO2, Mo03, ZnO, V2O5, Fe2O3, Fe3O4, nebo směs alespoň dvou z nich v libovolném poměru, nebo směs stechiometrických i nestechiometrických forem alespoň jednoho z nich v libovolném poměru), oxid křemíku (SiO2 - v libovolném poměru stechiometrických a nestechiometrických forem), nebo směs alespoň jednoho oxidu přechodového kovu a SiO2 v libovolném poměru. S výhodou lze jako materiál jádra nosiče použít zejména TiO2, který je ze všech uvedených oxidů nejvíce biokompatibilní.
Na povrchu tohoto jádra a/nebo v jeho vnitřní struktuře je pak uložen magnetický oxidu kovu, s výhodou zejména libovolné stechiometrické nebo nestechiometrické varianty FexOy, NiO, CoO, Co3O4, feritu na bázi M2O3, kde M je kov ze skupiny Fe, Ni, Co, případně směs alespoň dvou žních. Výhodné je přitom použití magnetitu a/nebo maghemitu, které nejsou pro lidský organismus toxické a které vykazují, pokud jsou ve formě částic menších než 12 nm, superparamagnetické vlastnosti. Tento materiál přitom může být uložen na povrchu jádra ve formě souvislých nebo nesouvislých vrstev a/nebo nahodile dispergovaných nanočástic, a/nebo je ve formě nanočástic uložen v jeho vnitřní struktuře, ideálně tak, aby alespoň část alespoň některých nanočástic vystupovala na povrch. V první variantě jsou nanočástice magnetického oxidu kovu/ů na povrchu jádra s výhodou zakotveny kovalentními, nebo jinými fyzikálně-ehemickými interakcemi, které jim zajišťují maximální ochranu vůči externím, zejména fyzikálním vlivům (vymytí, uvolnění, apod.), a zajišťují tak dlouhodobou hybnost daného nosiče v magnetickém poli.
Hlavní přednosti nosiče podle vynálezu je, že dosahuje specifické povrchové interakce oxidu přechodového kovu s biopolymemími molekulami, které se mají separovat, přičemž je však současně zachován i příspěvek jeho magnetického materiálu, který umožňuje efektivní odstranění nosiče ze vzorku působením magnetického pole; navíc má tento nosič obrovský specifický povrch. Další předností nosiče podle vynálezu je jeho velká chemická, fyzikální a mechanické kompatibilita - v různých variantách se jedná se o principiálně velmi podobné materiály, které je možné vzájemně zaměnit a/nebo kombinovat.
Nej výhodnější variantou nosiče je přitom varianta, kdy je jeho jádro tvořeno nanotrubicí TiO2, na jejímž povrchu jsou uloženy nanočástice Fe3O4 (obr. 1), neboť tyto materiály nevykazují toxicitu pro lidský organismus, jsou biokompatibilní, a současně je lze opakovaně použít, neboť si zachovávají vysokou vazebnou schopnost a selektivitu.
Nosič podle vynálezu přitom lze s využitím fotokatalýzy účinně dekontaminovat a sterilizovat účinkem UV záření.
Při výrobě nosiče podle vynálezu se magnetický oxid kovu/ů s výhodou nanáší na předem připravená jádra, např. přímou chemickou cestou, použitím metody naprašování (sputtering), metody ukládání atomární vrstvy (ALD - Atomic Layer Deposition).
Takto připravený nosič vykazuje dostatečnou mechanickou i chemickou odolnost, takže ho lze použít pro účinnou separaci biopolymemích molekul, při které se separované biopolymemí molekuly na tento nosič specificky naváží, načež se odmyjí nežádoucí a nespecificky navázané komponenty pocházející z daného vzorku, a v závěru se separované biopolymemí molekuly eluují změnou pH nebo vhodným roztokem. Tímto způsobem separované biopolymemí molekuly díky tomu dosahují vysoké čistoty.
Magnetické vlastnosti kompozitního nosiče podle vynálezu umožní jeho variabilní použití - ať již vsádkové nebo kolonové uspořádání ve formě magneticky stabilizovaného íluidního lože (Magnetically Stabilized Fluidized Bed - MSFB). Kulovité varianty umožňují použití v klasickém kolonovém uspořádání, naopak vlákenné útvary je možné využít například pro výrobu filtrů, které budou specificky izolovat požadované látky. Ve všech případech se ke stabilizaci
-8CZ 305599 B6 separačního lože a/nebo k účinnému oddělení nosičů s navázanými biopolymemími molekulami z reakční směsi použije silné magnetické pole.
Magnetický materiál uložený na povrchu jádra nosiče a/nebo v jeho vnitřní struktuře má s výhodou superparamagnetické vlastnosti, díky kterým nosič po odstranění magnetického pole nevykazuje zbytkový magnetismus (které by vykazovaly materiály ferromagnetické), takže s ním lze pracovat střídavě v režimu homogenně rozptýlené suspenze nebo v oddělených fázích.
V jiné variantě separace biopolymemích molekul se výše popsaný nosič zakomponuje do separačních kanálků mikrofluidních systémů (tzv. pTAS), čímž se znásobí pozitivní efekt miniaturizace reakčního objemu při průkazu či separaci dané biopolymemí molekuly, avšak stále s vysokým specifickým povrchem daným povahou náplně separačního mikrokanálku systému.
Další variantou provádění separace biopolymemích molekul je uchycení kompaktního bloku nosičů, jejichž jádro je tvořeno oboustranně průchozími nanotrubicemi (jejich spodní uzavřená část vznikající při výrobě je odstraněna), v membránovém držáku, přičemž směsný roztok látek protéká dutinami nanotrubic podobně, jako je tomu u procesu membránových filtrací.
Separace mono- a multifosforylovaných peptidů
Ve výchozím médiu - např. směsi peptidů/proteinů, buněčném lyzátu, buněčném kultivačním médiu, apod. se nejprve proteolyticky rozštěpí obsažené proteiny na kratší peptidové řetězce. Takto získaná mono- a multifosforylované peptidy se pak naváží specifickou interakcí mezi jejich fosfátovou skupinou a oxidem kovu/kovů jádra na nosič podle vynálezu. Samotná vazba peptidů na nosič přitom probíhá ve vazebném roztoku, který obsahuje 35 až 90 % organické fáze (s výhodou acetonitril (ACN), methanol, ethanol nebo jiné organické rozpouštědlo) a 0,1 až 5 % karboxylové kyseliny (s výhodou kyseliny trifluoroctové (TFA), kyseliny mravenčí, apod.), přičemž nízké pH tohoto roztoku slouží k potlačení nespecifické vazby. Kromě toho však lze pro redukci nespecifické vazby použít jinou karboxylovou kyselinu, např. kyselinu mléčnou (s výhodou v koncentraci 0,5 až 2 M), kyselinu glykolovou, kyselinu salicylovou, kyselinu ftalovou, kyselinu 2,5-dihydroxybenzoovou (s výhodou v koncentraci 0,5 až 3 M), apod.
Po vazbě se z nosiče alespoň jednou promývacím roztokem, který obsahuje 5 až 90 % organické fáze (s výhodou ACN, methanol, ethanol nebo jiné organické rozpouštědlo) a 0,1 až 5 % karboxylové kyseliny (s výhodou TFA, kyseliny mravenčí, apod.), nebo vazebným roztokem odmyjí nežádoucí a nespecificky navázané komponenty.
Poté se z něj elučním roztokem s pH vyšším než 9 (např. 1 % vodný roztok amoniaku) uvolní specificky navázané mono- a/nebo multifosforylované peptidy. V jiné variantě lze tuto eluci provést kompetitivně, s použitím roztoku obsahujícího fosfát/fosfáty (minimálně 20 mM).
Vazebné, promývací a eluční kroky probíhají za asistence magnetického pole, kdy je nosič separován od kapaliny.
Separované mono- a multifosforylované peptidy lze dále využít, např. pro následnou (MS) analýzu.
Po separaci se nosič podle vynálezu s výhodou regeneruje (viz dále).
Separace mono- a multifosforylovaných peptidů je naznačena na obr. 2 prvním blokovým schématem zleva.
-9CZ 305599 B6
Příklad 1 mg nosiče podle vynálezu, který se předtím skladoval v roztoku obsahujícím 80 % acetonitrilu (ACN) a 0,1 % kyseliny trifluoroctové (TFA), se při působení magnetického pole promylo 500 μΐ promývacího roztoku obsahujícího 80 % ACN a 0,1 % TFA, a poté 500 μΐ vazebného a promývacího roztoku obsahujícího 80 % ACN, 5 % TFA a 1 M kyseliny mléčné (LA). Přebytečný roztok se odstranil a k nosiči se přidalo 200 μΐ roztoku obsahujícího 60 pmol proteolyticky naštěpeného fosvitinu - modelového hyperfosforylovaného proteinu, rozpuštěného ve vazebném a promývacím roztoku výše popsaného složení. Nosič s naneseným naštěpeným fosvitinem se poté 60 min inkuboval při laboratorní teplotě za mírného otáčení.
Po inkubaci se z reakční směsi odstranil vazebný a promývací roztok s nenavázanými složkami a nosič se promyl 2x 500 μΐ promývacího roztoku obsahujícího 80 % ACN, 5 % TFA a 1 M LA a 2x 500 μΐ promývacího roztoku obsahujícího 80 % ACN a 0,1 % TFA. K takto promytému nosiči se poté přidalo 50 μΐ elučního roztoku (1% vodného roztoku amoniaku), přičemž eluce probíhala po dobu 15 min za otáčení.
Poté se eluční roztok nad nosičem odebral, okyselil se TFA a analyzoval se pomocí hmotnostní spektrometrie (MS).
Na obr. 3 jsou znázorněna 3 MS spektra - nejvýše je MS spektrum čistého standardu - fosvitinu, uprostřed je MS spektrum fosvitinu separovaného s použitím nejpoužívanějšího nosiče - konkrétně Titansphere TiO Bulk Materal, 10 pm výrobce GL Sciences Inc., a nejníže MS spektrum fosvitinu separovaného s použitím nosiče podle vynálezu ve variantě dle obr. 1, kdy je jeho jádro tvořeno nanotrubicemi z TiO2 s nanočásticemi Fe3O4 uloženými na jejich povrchu. Z porovnání těchto spekter jasně vyplývá, že poměr mezi multifosforylovanými peptidy - píky 1620 a 1149, a monofosforylovanými peptidy - píky 1540 a 1069, je při použití nosiče podle vynálezu více posunut směrem k multifosforylovaným peptidům. Píky 1540 a 1620 i 1149 a 1069 se přitom liší pouze množstvím fosfoskupin a mají stejnou aminokyselinovou sekvenci, což znamená, že nosič podle vynálezu separuje multifosforylované peptidy lépe než nosič Titansphere™ TiO. Přitom se při stejných podmínkách získá čistší vzorek a MS spektrum má při použití nosiče podle vynálezu o jeden řád vyšší intenzitu, což značí vysokou účinnost záchytu spojenou s vysokou selektivitou.
Vzhledem k tomu, že separace podle vynálezu je založena na specifické interakci mezi fosfátovou skupinou mono- nebo multifosforylováného peptidu a oxidem kovu/kovů jádra nosiče podle vynálezu, je zřejmé, že ostatní mono- a multifosforylované peptidy se budou při stejném nebo obdobném postupu separace chovat stejně nebo obdobně jako výše uvedený fosvitin.
Separace peptidů/proteinů obsahujících His-tag
Ve výchozím médiu - např. směsi peptidů/proteinů, buněčném lyzátu, buněčném kultivačním médiu, apod. se pro separaci na peptidové úrovni nejprve proteolyticky rozštěpí obsažené proteiny na kratší polypeptidové řetězce. Pro separaci na proteinové úrovni se proteiny separují v intaktní formě. V obou případech se přitom použije nosič podle vynálezu, přičemž separace peptidů/proteinů je založena na specifické interakci pozitivně nabitých skupin kolem atomu N ve struktuře histidinu s oxidem kovu/kovů jádra nosiče.
Vazba peptidů na nosič přitom s výhodou probíhá ve vazebném roztoku obsahujícím 10 mM imidazolu ve 100 mM glycin-HCl pufu s pH 3,2, přičemž stejný roztok se pak s výhodou použije i pro odmytí nežádoucích a nespecificky navázaných komponent.
V případě proteinů se pro jejich vazbu na nosič a pro odmytí nežádoucích a nespecificky navázaných komponent z nosiče s výhodou použije roztok tvořený 50 mM Tris-HCl pufru s pH 7,5.
-10CZ 305599 B6
Obecně je možné použít vazebný a/nebo promývací roztok, který obsahuje pufr o libovolném složení s pH v rozmezí 3 až 8,7, s přídavkem 0 až 300 mM imidazolu. Všeobecně lze použít jakýkoli pufr nebo látku, která není při splnění daného rozsahu pH současně elučním činidlem. Roztoky lze pro potlačení nespecifické vazby dále doplnit i o soli, například NaCl, a to až do koncentrace 0,5 M.
Peptidy se z nosiče eluují změnou pH v rozmezí 9,5 až 12 nebo elučním roztokem/roztoky obsahujícím minimálně 20 mM fosfátu/fosfátů (například fosforečnan disodný nebo fosfátový pufr). Proteiny se z nosiče eluují přídavkem imidazolu nebo zvýšením jeho koncentrace oproti vazebnému a promývacímu roztoku (na 10 mM až 1 M) nebo také elučním roztokem/roztoky obsahujícím minimálně 20 mM fosfátu/fosfátů (například fosforečnan disodný nebo fosfátový pufr).
Pokud je z nějakého důvodu žádoucí peptidy pouze odstranit z roztoku, lze je ponechat navázané na nosiči, a po té je zlikvidovat při jeho regeneraci. Tento postup je využitelný např. pro odstranění odštěpených polyhistidinových kotev.
Vazebné, promývací a eluční kroky probíhají za asistence magnetického pole, kdy je nosič separován od kapaliny.
Po separaci se nosič podle vynálezu s výhodou regeneruje (viz dále).
Separace peptidů/proteinů obsahujících His-tag je naznačena na obr. 2 druhým blokovým schématem zleva.
Příklad 2 - Separace peptidů obsahující His-tag mg nosiče podle vynálezu, který se předtím skladovat v roztoku obsahujícím 80 % ACN a 0,1 % TFA, se při působení magnetického pole promylo 2x 500 μΐ promývacího roztoku tvořeného 0,1 M glycin-HCl pufru s pH 3,2. K promytému nosiči se poté přidalo 60 pmolů proteolyticky naštěpeného ubikvitinu s His-tag rozpuštěného v 200 μΐ vazebného roztoku tvořeného 0,1 M glycin-HCl pufru s pH 3,2. Nosič s naneseným ubikvitinem se poté 60 min inkuboval při laboratorní teplotě za mírného otáčení.
Po inkubaci se ze zkumavky odstranil vazebný roztok s nenavázanými složkami a nosič se promyl 2x 300 μΐ promývacího roztoku tvořeného 0,1 M glycin-HCl pufru s pH 3,2, 2x 300 μΐ promývacího roztoku obsahujícího 0,1 M glycin-HCl pufru s pH 3,2.
K takto promytému nosiči se poté přidalo 100 μΐ elučního roztoku (1% vodného roztoku amoniaku), přičemž po dobu 15 min a za otáčení probíhala eluce. Po ukončení eluce se odebral eluční roztok nad nosičem, tento se okyselil TFA a analyzoval pomocí MALDI-MS.
Na obr. 4 jsou znázorněna 2 MS spektra - horní je MS spektrum komerčního ubikvitinu s HisTag naštěpeného trypsinem, spodní je MS spektrum ubikvitinu separovaného s použitím nosiče podle vynálezu ve variantě dle obr. 1, kdy je jeho jádro tvořeno nanotrubicemi zTiO2 s nanočásticemi Fe3O4 uloženými na jejich povrchu. Z porovnání těchto spekter je zřejmé, že při separaci se získal téměř čistý ubikvitin s His-tag (pík 1768,840) s aminokyselinovou sekvencí GSSHHHHHHSSGLVPR. To potvrzuje vysokou afinitu nosiče podle vynálezu k rekombinantním proteinům značeným polyhistidinovou kotvou.
Příklad 3 - Separace proteinů značených His-tag mg nosiče podle vynálezu, kteiý se předtím skladoval v roztoku obsahujícím 80 % ACN a 0,1 % TFA, se při působení magnetického pole promylo 2x 500 μΐ promývacího roztoku tvoře-11 CZ 305599 B6 něho 50 mM Tris-HCl pufru s pH 7,5. Kpromytému nosiči se poté přidalo 200 μΐ vazebného roztoku tvořeného 50 mM Tris-HCl pufru s pH 7,5, který obsahoval rekombinantní protein s His-tag. Nosič s nanesenými proteiny se poté 60 min inkuboval při laboratorní teplotě za mírného otáčení.
Po inkubaci se ze zkumavky odstranil vazebný roztok s nenavázanými složkami a nosič se promyl 2x 500 μΐ promývacího roztoku tvořeného 50 mM Tris-HCl pufru s pH 7,5.
K takto promytému nosiči se poté přidalo 2x 100 μΐ elučního roztoku (obsahujícího 50 mM TrisHCl pufru s pH 7,5 a 150 mM imidazolu, přičemž po dobu 2x 15 minut a za otáčení probíhala eluce. Po ukončení eluce se odebral eluční roztok nad nosičem a eluční i promývací roztok se analyzovaly pomocí polyakrylamidové gelové elektroforézy v prostředí dodecylsulfátu sodného, přičemž se zjistilo, že elektroforeogram eluční frakce, na rozdíl od původního vzorku, obsahuje čistý rekombinantní protein s minimem příměsí.
Vzhledem k tomu, že separace podle vynálezu je založena na specifické interakci mezi pozitivně nabitou skupinou kolem atomu N ve struktuře histidinu s oxidem kovu/kovů jádra nosiče a magnetického oxidu kovu podle vynálezu, je zřejmé, že ostatní peptidy/proteiny s His-tag nebo jinou chemicky podobnou biospecifickou kotvou, se budou při stejném nebo obdobném postupu separace chovat stejně nebo obdobně.
Separace peptidů/proteinů obsahujících cystein
Ve výchozím médiu - např. směsi peptidů/proteinů, buněčném lyzátu, buněčném kultivačním médiu, apod. se pro separaci na peptidové úrovni nejprve proteolyticky rozštěpí obsažené proteiny na kratší polypeptidové řetězce. Pro separaci na proteinové úrovni se proteiny separují v intaktní formě. Peptidy nebo proteiny s cysteiny se poté separují s použitím nosiče podle vynálezu na základě specifické interakce -SH skupiny cysteinu s oxidem kovu/kovů jádra nosiče. Volná -SH skupina, pokud již není přítomna, se přitom získá předchozí redukcí -S-S- vazeb pomocí dithiotreitolu (minimálně 10 mM).
Obdobně lze peptidy/proteiny obsahující cystein izolovat pomocí specifické interakce -SO3H skupiny s oxidem kovu/kovů nosiče. Volná -SO3H skupina se přitom získá předchozí oxidací SH skupiny nebo přímo z -S-S vazeb pomocí kyseliny permravencí (minimálně 2 %).
Vazba peptidů/proteinů na nosič pak probíhá ve vazebném roztoku obsahujícím 100 mM TrisHCl pufru s pH 7,5 a 1 % dodecylsulfátu sodného (SDS). Obecně je možné použít vazebný roztok, který obsahuje pufr o libovolném složení s pH v rozmezí 6 až 8 s přídavkem 0 až 2 % SDS. Všeobecně lze použít jakýkoli pufr nebo látku, která není při splnění daného rozsahu pH současně elučním činidlem. Stejný roztok se pak použije i jako promývací roztok k odmytí nežádoucích a nespecificky navázaných komponent z nosiče. Vazebný a promývací roztok lze pro potlačení nespecifické vazby dále obohatit o 10 až 50 mM dithiotreitolu, merkaptoethanolu nebo kyseliny merkaptobenzoo vé.
Poté se zvýšením pH na hodnotu 10 až 12 nebo elučním roztokem obsahujícím minimálně 20 mM fosfátu/fosfátů provádí eluce.
Vazebné, promývací a eluční kroky probíhají za asistence magnetického pole, kdy je nosič separován od kapaliny.
Po separaci se nosič podle vynálezu s výhodou regeneruje (viz dále).
Separace peptidů/proteinů obsahující cystein je naznačena na obr. 2 druhým blokovým schématem zprava.
- 12CZ 305599 B6
Příklad 4
Pomocí nosiče podle vynálezu se provedla separace peptidů obsahující cystein/y s volnou -SH skupinou z modelového vzorku - hovězího sérového albuminu naštěpeného trypsinem. 0,5 mg tohoto nosiče, který se předtím skladoval v roztoku obsahujícím 80 % ACN a 0,1 % TFA se při působení magnetického pole promylo 2x 500 μΐ promývacího roztoku obsahujícího 100 mM Tris-HCl pufru s pH 7,5 a 1 % dodecylsulfátu sodného (SDS). K promytému nosiči se poté přidal vazebný roztok s 60 pmoly modelového vzorku ν200μ1 lOOmM Tris-HCl pufru s pH 7,5, s přídavkem 1 % SDS. Nosič s naneseným vzorkem se poté 60 min inkuboval při laboratorní teplotě za mírného otáčení.
Po inkubaci se ze zkumavky odstranil vazebný roztok s nenavázanými složkami a nosič se promyl 6x 300 μΐ promývacího roztoku obsahujícího 100 mM Tris-HCl pufru s pH 7,5 a 1 % SDS.
K takto promytému nosiči se poté přidalo 100 μΐ elučního roztoku (1% vodného roztoku amoniaku), přičemž po dobu 15 min a za otáčení probíhala eluce. Po ukončení eluce se odebral eluční roztok nad nosičem a eluční i promývací roztok se analyzovaly pomocí hmotnostní spektrometrie (MS).
Na obr. 5 jsou znázorněna 2 MS spektra - horní je MS spektrum standardu, spodní je MS spektrum peptidů separovaných s použitím nosiče podle vynálezu ve variantě dle obr. 1, kdy je jeho jádro tvořeno nanotrubicemi z TiO2 s nanočásticemi Fe3O4 uloženými na jejich povrchu. Peptidy obsahující cysteiny jsou přitom označeny šipkami, přičemž např. pík s nejvyšší intenzitou ve spodním MS spektru (1052,450) s aminokyselinovou sekvencí CCTKPESER je v horním spektru zcela neviditelný. To značí selektivitu nosiče podle vynálezu přednostně pro peptidy obsahující cysteiny.
Příklad 5 mg nosiče podle vynálezu, který se předtím skladoval v roztoku obsahujícím 80 % ACN a 0,1 % TFA, se při působení magnetického pole promylo 2x 500 μΐ promývacího roztoku tvořeného 100 mM Tris-HCl pufru s pH 7,5 s přídavkem 1 % SDS. K promytému nosiči se přidala směs proteinů (60 pmolů od každého) obsahující hovězí sérový albumin, u kterého se pomocí 20 mM dithiotreitolu redukovaly -S-S- vazby (disulfidické můstky).
Tato směs se k nosiči přidala v 200 μΐ vazebného roztoku obsahujícího 100 mM Tris-HCl pufru s pH 7,5 s přídavkem 1 % SDS. Nosič s nanesenými proteiny se poté 60 min inkuboval při laboratorní teplotě za mírného otáčení.
Po inkubaci se ze zkumavky odstranil vazebný roztok s nenavázanými složkami a nosič se promyl 6x 300 μΐ promývacího roztoku obsahujícího 100 mM Tris-HCl pufru s pH 7,5 s přídavkem 1 % SDS.
K takto promytému nosiči se přidalo 100 μΐ elučního roztoku (1% vodného roztoku amoniaku), přičemž po dobu 15 min a za otáčení probíhala eluce.
Po ukončení eluce se odebral eluční roztok nad nosičem, a tento roztok se okyselil (na pH 8). Poté následovalo štěpení separovaných proteinů tiypsinem na peptidové fragmenty a analýza elučního a promývacího roztoku pomocí hmotnostní spektrometrie (MS), přičemž v elučním roztoku byly nalezeny téměř výhradně peptidy pocházející z hovězího sérového albuminu.
Vzhledem k tomu, že separace proteinů/peptidů s cysteinem/cysteiny podle vynálezu je založena na specifické interakci -SH skupiny nebo -SO3H skupiny cysteinu s oxidem kovu/kovů nosiče
- 13CZ 305599 B6 podle vynálezu, je zřejmé, že ostatní peptidy/proteiny obsahující cystein/y, se budou při stejném nebo obdobném postupu separace chovat stejně nebo obdobně.
Separace nukleových kyselin
Řetězce deoxyribonukleové kyseliny (DNK) se separují s použitím nosiče podle vynálezu na základě interakce fosfátových skupin, které jsou součástí nukleových kyselin, s oxidem kovu/ů nosiče. Vazba DNK na nosič přitom probíhá v pufru na bázi kyseliny 2-[N-morpholino]ethansulfonové (MES) s pH 4,5 až 6,5. Pro separaci ribonukleové kyseliny (RNK) se pak použije octanový pufr s pH 3,8 až 4,5. Všeobecně lze v obou případech použít jakýkoli pufr nebo látku, která není při splnění daného rozsahu pH současně elučním činidlem. Promývací roztoky po odstranění nežádoucích a nespecificky navázaných komponent jsou v obou případech s výhodou shodné s vazebnými roztoky, ve kterých probíhá vazba na nosič.
Eluce se přitom v obou případech provádí zvýšením pH na hodnotu 8 až 11, nebo elučním roztokem obsahujícím minimálně 20 mM fosfátu/fosfátů, např. fosforečnanu disodného nebo fosfátového pufru.
Analýza elučního a promývacího roztoku poté probíhá např. pomocí elektroforézy (agarózové nebo polyakrylamidové) nebo pomocí polymerázové řetězové reakce (PCR).
Separace nukleových kyselin je naznačena na obr. 2 prvním blokovým schématem zprava.
Příklad 6 mg nosiče podle vynálezu, kteiý se předtím skladoval v roztoku obsahujícím 80 % ACN a 0,1 % TFA, se při působení magnetického pole promyl 2x 500 μΐ promývacího roztoku obsahujícího 100 mM MES pufru s pH 5,5. K promytému nosiči se poté přidal vazebný roztok obsahující 10 pg roztoku modelové deoxyribonukleové kyseliny - oligonukleotidu ve 100 μΐ 100 mM MES pufru s pH 5,0. Nosič s naneseným vazebným roztokem se poté 60 min inkuboval při laboratorní teplotě za mírného otáčení.
Po inkubaci se ze zkumavky odstranil vazebný roztok s nenavázanými složkami a nosič se promyl 5x 200 μΐ promývacího roztoku obsahujícího 100 mM MES pufru s pH 5,5.
K takto promytému nosiči se poté přidalo 100 μΐ elučního roztoku Na2HPO3, přičemž po dobu 15 minut a za otáčení probíhala eluce. Poté jejím ukončení se eluční i promývací roztok odebraly a podrobily se analýze gelovou elektroforézou v polyakrylamidovém gelu s fluorescenční detekcí, při které se zjistilo, že oligonukleotidy lze na nosič podle vynálezu nejen vázat, ale také je z něj snadno uvolňovat.
Regenerace nosiče
Pro regeneraci nosiče podle vynálezu s cílem jeho opětovného využití je nutné tento nosič zbavit všech zbytků biologických látek. V případě nosiče, který obsahuje jádro z TiO2 lze k tomuto účelu s výhodou využít ozáření nosiče UV zářením ve vodném prostředí. TiO2 totiž v takovém případě vytváří na svém povrchu velmi reaktivní hydroxylové radikály, které mají značnou schopnost štěpit organické molekuly na elementární oxid uhličitý, a vodu, díky čemuž se nosič podle vynálezu zcela očistí od jakýchkoliv nežádoucích organických zbytků. Přitom však nedochází k degradaci vrstev nebo nanočástic magnetického oxidu kovu/ů (např. Fe3O4), takže nejsou dotčeny magnetické vlastnosti nosiče.
Tato forma regenerace je možná také u jiných typů nosičů podle vynálezu s jádry z jiných přechodových kovů.
- 14CZ 305599 B6
Aby se dosáhlo maximálního efektu UV záření, je výhodné nosič dispergovat ve vodném roztoku kolujícím v uzavřeném průtočném systému přes křemennou trubici, před níž je umístěn zdroj UV záření o vhodné vlnové délce. Průtok v systému musí s ohledem na průměr křemenné trubice a délku průtočného systému zvolen tak, aby byl nosič exponován záření min. 25 % celkového času.
V jiné variantě je možné využít i systém vsádkový, např. vhodnou nádobu s nosičem ve vodném roztoku. V takovém případě je nutno využít mechanické míchání, např. vrtulové míchání nebo otáčení na rotátoru, a nepoužívat magnetické míchadlo, které by způsobilo shluknutí nosiče v místě působení magnetických sil.
Po dokončení fotokatalytického rozkladu je pak možné nosič z vodného prostředí separovat magnetickým polem.
Pro fotokatalytický rozklad zbytků biologických látek se s výhodou použije UV záření o vlnové délce 200 až 400 nm, s výhodou 260 do 340 nm. Intenzita UV záření přitom musí být alespoň 1 mW/cm2 ozařované plochy nosiče, přičemž intenzita 60 mW/cm2 ozařované plochy nosiče umožní kompletní rozklad organických molekul do 60 minut, intenzita 300 mW/cm2 ozařované plochy nosiče pak do 12 minut.

Claims (24)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Způsob separace biopolymemích molekul, zejména biopolymemích molekul ze skupiny mono- a multifosforylovaných peptidů, rekombinantních peptidů/proteinů s polyhistidinovou kotvou či jinou, chemicky podobnou biospecifickou kotvou, peptidů/proteinů obsahujících cystein, nukleových kyselin, vyznačující se tím, že biopolymemí molekula ze skupiny mono- a multifosfoiylovaných peptidů, rekombinantních peptidů/proteinů s polyhistidinovou kotvou či jinou, chemicky podobnou biospecifickou kotvou, peptidů/proteinů obsahujících cystein, nukleových kyselin, se ve vazebném roztoku naváže specifickou vazbou na nosič, který obsahuje jádro s rozměry v nano- a/nebo submikro- a/nebo mikroměřítku, tvořené oxidem alespoň jednoho přechodového kovu a/nebo oxidu křemíku, na jehož povrchu je uložená alespoň jedna souvislá nebo nesouvislá vrstva a/nebo nanočástice magnetického oxidu kovu a/nebo jsou takové nanočástice uloženy v jeho vnitřní struktuře, a poté se z nosiče s navázanými biomolekulami alespoň jedním promytím promývacím roztokem odmyjí nežádoucí a nespecificky navázané komponenty, načež se z něj změnou pH a/nebo elučním roztokem eluují biopolymemí molekuly.
  2. 2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že pro navázání mono- a multifosforylovaných peptidů na nosič obsahuje vazebný roztok 35 až 90 % organického rozpouštědla a 0,1 až 5 % karboxylové kyseliny a pro odmytí nežádoucích a nespecificky navázaných komponent obsahuje promývací roztok 5 až 90 % organického rozpouštědla a 0,1 až 5 % karboxylové kyseliny.
  3. 3. Způsob podle nároku 2, vyznačující se tím, že vazebný a/nebo promývací roztok dále obsahuje 0,5 až 3 M jiné karboxylové kyseliny pro redukci nespecifické vazby.
  4. 4. Způsob podle nároku 2 nebo 3, vyznačující se tím, že mono-a/nebo multifosforylovaný peptid se z nosiče eluuje elučním roztokem s pH vyšším než 9.
  5. 5. Způsob podle libovolného z nároků 2až4, vyznačující se tím, že mono- a/nebo multifosforylovaný peptid se z nosiče eluuje kompetitivní elucí roztokem obsahujícím alespoň 20 mM fosfátu/fosfátů.
    -15CZ 305599 B6
  6. 6. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že pro navázání rekombinantního peptidu/proteinu s polyhistidinovou kotvou či jinou, chemicky podobnou biospecifickou kotvou na nosič obsahuje vazebný roztok pufr s pH 3 až 8,7 a 0 až 300 mM imidazolu a pro odmytí nežádoucích a nespecificky navázaných komponent obsahuje promývací roztok pufr s pH 3 až 8,7 a 0 až 300 mM imidazolu.
  7. 7. Způsob podle nároku 6, vyznačující se tím, že vazebný a/nebo promývací roztok dále obsahuje až 0,5 M soli/solí pro redukci nespecifické vazby.
  8. 8. Způsob podle nároku 6 nebo 7, vyznačující se tím, že rekombinantní peptid/protein s polyhistidinovou kotvou či jinou, chemicky podobnou biospecifickou kotvou se z nosiče eluuje změnou pH v rozmezí 9,5 až 12.
  9. 9. Způsob podle nároku 6 nebo 7, vyznačující se tím, že rekombinantní peptid/protein s polyhistidinovou kotvou či jinou, chemicky podobnou biospecifickou kotvou se z nosiče eluuje elučním roztokem obsahujícím alespoň 20 mM fosfátu/fosfátů.
  10. 10. Způsob podle nároku 6 nebo 7, vyznačující se tím, že rekombinantní protein s polyhistidinovou kotvou či jinou, chemicky podobnou biospecifickou kotvou se z nosiče eluuje přídavkem imidazolu, přičemž celkové množství imidazolu dosahuje 10 mM až 1 M.
  11. 11. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že pro navázání peptidů/proteinů obsahujících cystein na nosič obsahuje vazebný roztok pufr s pH 6 až 8 a 0 až 2 % dodecylsulfátu sodného a pro odmytí nežádoucích a nespecificky navázaných komponent obsahuje promývací roztok pufr s pH 6 až 8 a 0 až 2 % dodecylsulfátu sodného.
  12. 12. Způsob podle nároku 11, vyznačující se tím, že, vazebný a/nebo promývací roztok dále obsahuje 10 až 50 mM dithiotreitolu, merkaptoethanolu nebo kyseliny merkaptobenzoové pro redukci nespecifické vazby.
  13. 13. Způsob podle nároku 11 nebo 12, vyznačující se tím, že peptid/protein obsahující cystein se z nosiče eluuje změnou pH na hodnotu 10 až 12.
  14. 14. Způsob podle nároku 11 nebo 12, vyznačující se tím, že peptid/protein obsahující cystein se z nosiče eluuje elučním roztokem obsahujícím alespoň 20 mM fosfátu/fosfátů.
  15. 15. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že pro navázání deoxyribonukleové kyseliny na nosič je vazebný roztok tvořen pufřem s pH 4,5 až 6,5 a pro odmytí nežádoucích a nespecificky navázaných komponent je promývací roztok tvořen pufrem s pH 4,5 až 6,5.
  16. 16. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že pro navázání ribonukleové kyseliny na nosič je vazebný roztok tvořen pufrem s pH 3,8 až 4,5 a pro odmytí nežádoucích a nespecificky navázaných komponent je promývací roztok tvořen pufrem s pH 3,8 až 4,5.
  17. 17. Způsob podle nároku 15 nebo 16, vyznačující se tím, že deoxyribonukleová kyselina nebo ribonukleová kyselina se z nosiče eluuje zvýšením pH na hodnotu 8 až 11.
  18. 18. Způsob podle libovolného z nároků 15 nebo 16, vyznačující se tím, že deoxyribonukleová kyselina nebo ribonukleová kyselina se z nosiče eluuje elučním roztokem obsahujícím alespoň 20 mM fosfátu/fosfátů.
  19. 19. Způsob podle libovolného z předcházej ících nároků, vy zn a č uj ící se tím, že nosič obsahuje jádro tvořené nanotrubicemi zTiO2, na jejichž povrchu jsou uloženy a/nebo do jejichž povrchu zasahují a/nebo zjejichž povrchu vystupující nanočástice Fe3O4.
    - 16CZ 305599 B6
  20. 20. Způsob podle libovolného z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že nosič se po separaci biopolymemích molekul regeneruje UV zářením o vlnové délce 200 až 400 nm, s intenzitou alespoň 1 mW/cm2 plochy nosiče.
  21. 21. Nosič pro separaci biopolymemích molekul, zejména biopolymemích molekul ze skupiny mono- a multifosforylovaných peptidů, rekombinantních peptidů/proteinů s polyhistidinovou kotvou (His-tag) či jinou, chemicky podobnou biospecifickou kotvou, peptidů/proteinů obsahující cystein, nukleových kyselin, vyznačující se tím, že obsahuje jádro srozměry v nano- a/nebo submikro- a/nebo mikroměřítku, tvořené oxidem alespoň jednoho přechodového kovu a/nebo oxidu křemíku, přičemž alespoň na části povrchu jádra je uložena vrstva a/nebo jsou uloženy nanočástice magnetického oxidu kovu a/nebo jsou takové nanočástice uloženy v jeho vnitřní struktuře.
  22. 22. Nosič podle nároku 21, vyznačující se tím, že jádro nosiče je tvořené oxidem křemíku a/nebo oxidem přechodového kovu ze skupiny TiO2, ZrO2, A12O3, Ta2O5, WO3, SnO2, HfO2, Nb2O5, MoO2, MoO3, ZnO, V2O5, Fe2O3, Fe3O4, nebo směsí alespoň dvou z nich.
  23. 23. Nosič podle nároku 21 nebo 22, vyznačující se tím, že magnetický oxid kovu je magnetický oxid kovu ze skupiny FexOy, NiO, CoO, Co3O4, ferit na bázi M2O3, kde M je kov ze skupiny Fe, Ni, Co, nebo směs alespoň dvou z nich.
  24. 24. Nosič podle libovolného z nároků 21 až 23, vyznačující se tím, že obsahuje jádro tvořené nanotrubicemi z TiO2, na jejichž povrchu jsou uloženy a/nebo do jejichž povrchu zasahují a/nebo z jejichž povrchu vystupují nanočástice Fe3O4.
CZ2014-524A 2014-08-01 2014-08-01 Způsob separace biopolymerních molekul a nosič pro využití při tomto způsobu CZ305599B6 (cs)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CZ2014-524A CZ305599B6 (cs) 2014-08-01 2014-08-01 Způsob separace biopolymerních molekul a nosič pro využití při tomto způsobu
US15/501,020 US20170226153A1 (en) 2014-08-01 2015-07-27 Method for Separation of Biopolymer Molecules and a Carrier for Application of this Method
PCT/CZ2015/000081 WO2016015690A1 (en) 2014-08-01 2015-07-27 Method for separation of biopolymer molecules and a carrier for application of this method

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CZ2014-524A CZ305599B6 (cs) 2014-08-01 2014-08-01 Způsob separace biopolymerních molekul a nosič pro využití při tomto způsobu

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ2014524A3 CZ2014524A3 (cs) 2015-12-30
CZ305599B6 true CZ305599B6 (cs) 2015-12-30

Family

ID=53969042

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ2014-524A CZ305599B6 (cs) 2014-08-01 2014-08-01 Způsob separace biopolymerních molekul a nosič pro využití při tomto způsobu

Country Status (3)

Country Link
US (1) US20170226153A1 (cs)
CZ (1) CZ305599B6 (cs)
WO (1) WO2016015690A1 (cs)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112111042B (zh) * 2019-06-21 2024-04-05 康码（上海）生物科技有限公司 一种生物磁性微球及其制备方法和使用方法
EP4093745A4 (en) * 2020-01-20 2024-03-06 Wuxi Biologics Ireland Limited NEW WASH BUFFER SOLUTION FOR AFFINITY CHROMATOGRAPHY
CN112226481B (zh) * 2020-10-28 2023-01-31 北京化工大学 一种利用葡萄糖醛酸酶生物催化制备甘草次酸的方法
CN113176329B (zh) * 2021-04-23 2024-07-05 厦门大学 四氧化三钴作为基质在maldi-tof ms检测小分子中的应用

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0420186A2 (en) * 1989-09-29 1991-04-03 Fujirebio Inc. Immunoassay using magnetic particle
DE4307262A1 (de) * 1993-03-02 1994-09-08 Christian Bergemann Magnetisches polymeres Siliciumdioxid
DE19912799A1 (de) * 1998-03-12 1999-09-16 Agowa Ges Fuer Molekularbiolog Superparamagnetisches Adsorptionsmaterial, seine Herstellung und Verwendung
US20090050839A1 (en) * 2007-05-29 2009-02-26 National Chiao Tung University Metal oxide nano-composite magnetic material, fabrication method, and method for linkage, enrichment, and isolation of phosphorylated species
WO2009115176A2 (de) * 2008-03-20 2009-09-24 Merck Patent Gmbh Magnetische nanopartikel und verfahren zu deren herstellung

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101891146B (zh) * 2010-07-01 2012-11-21 淮阴工学院 一种磁性掺杂二氧化钛纳米管的制备方法
CN101922036A (zh) * 2010-09-11 2010-12-22 天津大学 一种在二氧化钛纳米管中掺杂四氧化三铁磁性颗粒的方法
CN102151527B (zh) * 2010-11-23 2013-05-15 苏州照康生物技术有限公司 用于核酸纯化、蛋白分离的单分散氧化硅磁性微球的制备方法
CN102179216B (zh) * 2011-01-20 2013-08-21 青岛科技大学 一种仿生型α-Fe2O3/TiO2纳米复合材料的制备方法
CN102773111B (zh) * 2012-07-06 2014-06-11 上海应用技术学院 一种磁性固体超强酸纳米管催化剂及其制备方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0420186A2 (en) * 1989-09-29 1991-04-03 Fujirebio Inc. Immunoassay using magnetic particle
DE4307262A1 (de) * 1993-03-02 1994-09-08 Christian Bergemann Magnetisches polymeres Siliciumdioxid
DE19912799A1 (de) * 1998-03-12 1999-09-16 Agowa Ges Fuer Molekularbiolog Superparamagnetisches Adsorptionsmaterial, seine Herstellung und Verwendung
US20090050839A1 (en) * 2007-05-29 2009-02-26 National Chiao Tung University Metal oxide nano-composite magnetic material, fabrication method, and method for linkage, enrichment, and isolation of phosphorylated species
WO2009115176A2 (de) * 2008-03-20 2009-09-24 Merck Patent Gmbh Magnetische nanopartikel und verfahren zu deren herstellung

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Journal of Chromatography A, 1216, rok 2009, str. 6382-6386, XP026458915 *
Journal of Chromatography A, 890, rok 2000, str. 159-166, XP004228918 *

Also Published As

Publication number Publication date
CZ2014524A3 (cs) 2015-12-30
WO2016015690A1 (en) 2016-02-04
US20170226153A1 (en) 2017-08-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR102107844B1 (ko) 양이온을 이용한 세포밖 소포체의 분리 방법
Richthammer et al. Biomineralization in diatoms: the role of silacidins
Kameta et al. Soft nanotube hydrogels functioning as artificial chaperones
CN106457196B (zh) 磁性物质颗粒的操作方法和磁性物质颗粒操作用装置
EP3228709A1 (en) Tim protein-bound carrier, methods for obtaining, removing and detecting extracellular membrane vesicles and viruses using said carrier, and kit including said carrier
US20100168395A1 (en) Novel polypeptide, an affinity chromatography material, and a method for separating and/or purifying immunoglobulin
DK2687539T3 (en) ANNEXIN V VARIANT AND ITS MANUFACTURING AND USING THEREOF
CZ305599B6 (cs) Způsob separace biopolymerních molekul a nosič pro využití při tomto způsobu
EA023783B1 (ru) Способы очистки рекомбинантного adamts13 и других белков и их композиции
Voet et al. Protein-templated synthesis of metal-based nanomaterials
JP6498274B2 (ja) エクソソームの破壊方法、エクソソームの破壊キットおよび正常細胞由来のエクソソームの分離方法
Cheung-Lau et al. Engineering a well-ordered, functional protein-gold nanoparticle assembly
EP1488011A2 (en) Method of isolating binding peptides from a combinatorial phage display library and peptides produced thereby
He et al. Nickel (II)-immobilized sulfhydryl cotton fiber for selective binding and rapid separation of histidine-tagged proteins
JP2020530780A (ja) 疎水性相互作用を利用した細胞外小胞体の分離方法
Saraji et al. Plasmid DNA purification by zirconia magnetic nanocomposite
Qi et al. NiCoMnO4: A bifunctional affinity probe for his-tagged protein purification and phosphorylation sites recognition
CA3048273A1 (en) High-loading and alkali-resistant protein a magnetic bead and method of use thereof
JP5271354B2 (ja) 水性二相系中での組換えタンパク質の分離方法
González-García et al. Nanomaterials in protein sample preparation
CN101363045B (zh) 一种用超微磁颗粒分离纯化生物靶物质的方法
CA2569821A1 (en) Process for protein isolation
JP5691161B2 (ja) タンパク質の精製方法
CN102408288A (zh) 应用蛋白质功能化磁性纳米颗粒拆分手性药物的方法
JP2011036128A (ja) 抗体製造方法