EA023783B1

EA023783B1 - Способы очистки рекомбинантного adamts13 и других белков и их композиции

Info

Publication number: EA023783B1
Application number: EA201270214A
Authority: EA
Inventors: Майнхард Хасслахер; Артур Миттерер; Кристиан Фидлер; Криста Майер
Original assignee: Баксалта Инкорпорейтид; Баксалта Гмбх
Priority date: 2009-07-31
Filing date: 2010-08-02
Publication date: 2016-07-29
Also published as: JP2015147815A; KR20120053013A; KR20190122272A; CA2769362A1; JP2021004265A; EA201270214A1; EP3211077B1; SG178175A1; EP2459715B1; EA034292B1; JP2018203781A; CO6612194A2; JP2013500711A; AU2010277491B2; DK2459715T3; EP4299735A3; CN102482660A; PT2459715T; JP5907869B2; US11661593B2

Abstract

Представлены способы очистки рекомбинантного белка, подобного дезинтегрину, и металлопептидазы с мотивом 13 тромбоспондина типа 1 (ADAMTS13) из образца. Способы включают обогащение в отношении белка ADAMTS13 посредством приведения хроматографическим образом образца в контакт с гидроксиапатитом в условиях, обеспечивающих попадание белка ADAMTS13 в элюат или супернатант из гидроксиапатита. Способы могут дополнительно включать тандемную хроматографию с использованием смолы со смешанным принципом работы на основе катионообмена/гидрофобных взаимодействий, которая связывает белок ADAMTS13. Дополнительные необязательные стадии включают ультрафильтрацию/диафильтрацию, анионообменную хроматографию, катионообменную хроматографию и инактивацию вирусов. Также представлены способы инактивации загрязнений вирусами в образцах белка, когда белок является иммобилизованным на носителе. Также представлены композиции, содержащие ADAMTS13, полученный согласно указанным способам.

Description

По заявке на данное изобретение испрашивается приоритет предварительной патентной заявки США № 61/230308, поданной 31 июля 2009 г., которая тем самым включена в данное описание посредством ссылки во всей своей полноте, и на приоритет которой авторы настоящего изобретения претендуют.

Область техники

Настоящее изобретение относится в целом к способам очистки рекомбинантного белка, подобного дезинтегрину, и металлопептидазы с мотивом 13 тромбоспондина типа 1 (АЭАМТ§13) и других белков, и композициям, содержащим такие очищенные белки.

Предпосылки создания изобретения

Семейство генов металлопротеиназ, АЛАМ (дезинтегрин и металлопротеиназа), включает члены, которые являются прикрепленными к мембране протеазами с разнообразными функциями. Члены семейства АЛАМТ§ отличаются от АЛАМ наличием одного или нескольких подобных тромбоспондину-1 (Т8Р1) доменов на С-конце и отсутствием повтора БОР, трансмембранного домена и цитоплазматического хвоста, обычно отмечаемых у металлопротеиназ АПАМ.

Подобный дезинтегрину белок и металлопептидаза с мотивом 13 тромбоспондина типа 1 (АЛАМТ§13) является членом семейства АЛАМТ8. АЛАМТ§13 имеет восемь тромбоспондиновых доменов и не имеет гидрофобного трансмембранного домена. Соответственно, он секретируется. АЛАМТ813 расщепляет фактор Виллебранда в месте связи Тут¹⁶⁰⁵-Ме1¹⁶⁰⁶, и для его функционирования требуются ионы как кальция, так и цинка. АЛАМТ813 также известен как расщепляющая фактор Виллебранда протеаза и У\УРСР.

Недостаточная экспрессия АЛАМТ813 вовлечена в патогенез некоторых заболеваний, например тромботических нарушений, таких как тромботическая тромбоцитопеническая пурпура (ТТР) (см., например, публикацию патентной заявки США № 20070015703). В случае ТТР недостаток и/или ингибирование АЛАМТ813 приводит к диссеминированным микроскопическим тромбам, которые образуются в мелких кровеносных сосудах по всему телу (тромботической микроангиопатии). Эритроциты, проходящие через микроскопические тромбы, подвергаются напряжению сдвига, которое вызывает повреждение мембраны эритроцита, которое, в свою очередь, приводит к внутрисосудистому гемолизу и образованию шизоцитов. Тромбозы также приводят к уменьшенному кровотоку, который может приводить в результате к повреждению органов. Симптомы обычно включают неврологические проблемы, такие как галлюцинация, аномальное поведение, измененное психическое состояние, удар или головные боли; почечную недостаточность; лихорадку и тромбоцитопению (низкое содержание тромбоцитов), приводящую к синяку или пурпуре; и микроангиопатическую гемолитическую анемию, включающую анемию и желтуху. Современная терапия включает плазмаферез для уменьшения количества циркулирующих антител против АЛАМТ§13 и/или пополнения уровней этого фермента в крови.

По этой причине существует острая необходимость в обеспечении способов очистки рекомбинантного АЛАМТ813, в частности, в масштабе промышленного производства, который может использоваться в качестве терапевтического средства. Очистка АЛАМТ§13 была признана трудной, и были испробованы различные подходы, включая хроматографию. Хроматографический материал, который связывает не являющийся АЛАМТ§13 белок, что делает возможным попадание белка АЛАМТ813 в элюат или супернатант, мог бы обеспечить применимый подход к очистке. Материал для хроматографии, который связывает белок АЛАМТ813, в то время как не являющиеся АЛАМТ813 примеси либо остаются в растворе, либо связываются намного сильнее, также представляет привлекательный подход и может использоваться в тандеме с другими подходами. В настоящем описании представлены такие подходы.

Кроме того, загрязнения вирусами представляли дополнительные проблемы при очистке белков АЛАМТ§13, а также других белков и рекомбинантных белков. Один традиционный подход включал обработку образца, подвергаемого очистке, смесью растворитель-детергент в растворе. Инкубация образца с химическими веществами смеси растворитель-детергент приводила к дезактивации покрытых липидами вирусов. Однако в случае этой обработки в растворе непроизводительно требовался перенос образца по меньшей мере в один другой сосуд, например, чтобы способствовать удалению химических веществ смеси растворитель-детергент после обработки. Кроме того, некоторые белки, включающие АЛАМТ§13, чувствительны к химическим веществам смеси растворитель-детергент, приводя к образованию агрегатов. В настоящем описании представлен подход, включающий иммобилизацию белка во время обработки смесью растворитель-детергент, для решения таких проблем в результате инактивации вирусов.

Краткое изложение сущности изобретения

Один аспект настоящего изобретения относится к способу очистки рекомбинантного белка, подобного дезинтегрину, и металлопептидазы с мотивом 13 тромбоспондина типа 1 (АЛАМТ§13) (в частности, АЛАМТ813 человека) из образца, включающего белок АЛАМТ813 и не являющиеся АЛАМТ813 примеси. К удивлению было обнаружено, что хроматография с использованием гидроксиапатита может быть использована в условиях, подходящих для очистки белка АЛАМТ813 от не являющихся АОАМТ813 примесей. Данный способ включает обогащение в отношении белка АЛАМТ813 путем приведения образца хроматографически в контакт с гидроксиапатитом в условиях, обеспечивающих попада- 1 023783 ние белка ΑΟΑΜΤδ13 в элюат из гидроксиапатита. Т.е. образец подвергают хроматографии с использованием гидроксиапатита в условиях, которые позволяют белку ΛΌΛΜΤ§13, предпочтительно существенной части белка ΆΌΛΜΤ§13, не связываться с гидроксиапатитом, в то время как примеси удерживаются. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления рекомбинантный белок ΆΌΛΜΤ§13 очищают из супернатанта, собранного из культивирующих СНО клеток, включающих нуклеиновую кислоту рекомбинантного ΑΌΑΜΤδ13. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления процентный выход в супернатанте или элюате составляет, как ни удивительно, от 50 до 100%. Данный способ может дополнительно включать тандемную хроматографию, включающую приведение элюата из гидроксиапатита хроматографически в контакт со смолой со смешанным принципом работы на основе катионообмена/гидрофобных взаимодействий, которая связывает белок ΑΌΑΜΤδ13. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления выход ΆΌΆΜΤ§13 в процентах после обогащения тандемной хроматографией составляет, как ни удивительно, по меньшей мере 60%.

В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает необязательную стадию подготовки к обогащению для увеличения концентрации ΑΌΑΜΤδ13 в образце и/или связывания белка ΆΌΆΜΤ§13 с анионообменной смолой. Например, способ может дополнительно включать приведение образца хроматографически в контакт с анионообменной смолой и элюирование белка ΑΌΑΜΤδ13 из анионообменной смолы перед хроматографическим контактом с гидроксиапатитом; и/или концентрирование белка ΑΌΑΜΤδ13 в образце ультрафильтрацией перед хроматографическим контактом с гидроксиапатитом; и/или стабилизацию белка ΛΌΆΜΤ§13 обменом с использованием диафильтрации в буфер, включающий ионы кальция и ионы цинка, перед хроматографическим контактом с гидроксиапатитом. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления образец концентрируют 10-20-кратной ультрафильтрацией, обмен буфера осуществляют диафильтрацией с молекулярной отсечкой 30 кДа на буфер с низкой проводимостью, содержащий ионы кальция и цинка, и ΆΌΆΜΤ§13 связывают и элюируют из анионообменной смолы, такой как ЛЫХ-§ерЬаго8е Ра§1 Ρίον, ΡΟΚΟδ 50Ό или ΡΟΚΟδ 50ΡΙ, перед тандемной хроматографией. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления пул элюата со стадии анионообменной хроматографии разбавляют в соотношении 1:4 буфером для разжижения гидроксиапатита для снижения проводимости до 6 мСм/см перед тандемной хроматографией с использованием гидроксиапатита, включающей хроматографию с использованием гидроксиапатита с последующей хроматографией с использованием элюата из гидроксиапатита, при использовании смолы с принципом работы на основе катионообмена/гидрофобных взаимодействий, которая связывает белок ΑΌΑΜΤδ13. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления элюат со стадии(й) предварительного обогащения может, как ни удивительно, быть обеспечен с процентным выходом, составляющим по меньшей мере 75%.

В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает необязательную стадию доочистки катионообменной хроматографией, после приведения в хроматографический контакт с гидроксиапатитом или смолой со смешанным принципом работы. В таких вариантах осуществления после приведения в контакт с гидроксиапатитом или смолой на основе катионообмена/гидрофобных взаимодействий, способ может дополнительно включать стадию подготовки белка ΑΌΑΜΤδ13 к катионообмену посредством снижения проводимости буфера. В некоторых вариантах осуществления эту стадию подготовки выполняют посредством ультрафильтрации/диафильтрации, диализа и/или гель-фильтрации. В некоторых вариантах осуществления, в которых используется ультрафильтрация/диафильтрация, отсечка составляет 10 кДа. В некоторых вариантах осуществления буферный обмен осуществляют анионообменной хроматографией на ΑΝΧ §ерйаго8е-РР с узким диапазоном разделения. В некоторых вариантах осуществления, в которых используется диализ, диализ может состоять не более чем из 2 прохождений через один модуль для диализа. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления катионообменную хроматографию выполняют на колонке 8оигее δ или колонке ΡΘΚΟδ δ. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления выход ΑΟΑΜΤδ13 в процентах после снижения проводимости буфера составляет, как ни удивительно, по меньшей мере 90%, и после доочистки катионообменной хроматографией, как ни удивительно, по меньшей мере 70%.

В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает подвергание белка ΑΟΑΜΤδ13 необязательной стадии инактивации вирусов, например для дезактивации вирусов и/или удаления вирусов и вирусных частиц. В некоторых вариантах осуществления стадия инактивации вирусов включает добавление смеси растворитель-детергент, включающей неионный детергент и органический растворитель, к белку ΑΌΑΜΤδ13. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления белок ΑΟΑΜΤδ13 является иммобилизованным, например иммобилизованным на катионообменной смоле. В некоторых вариантах осуществления смесь растворитель-детергент включает 1% ΤΚΙΤΟΝ Х-100, 0,3% три-н-бутилфосфата и 0,3% ΤνΕΕΝ 80 и/или обработка смесью растворитель-детергент длится в течение 30 мин при 12°С-16°С. Альтернативно или дополнительно, стадия инактивации вирусов может включать фильтрацию белка ΑΌΑΜΤδ13 через нанофильтр для удаления вирусов и/или вирусных частиц. В некоторых таких вариантах осуществления нанофильтрацию осуществляют через фильтр 20 N или 35 Ν, перед и/или после обработки смесью растворитель-детергент. В некоторых вариантах осуществления стадию инактивации вирусов выполняют после стадии подготовки, описанной выше, и/или после стадии

- 2 023783 тандемной хроматографии; и/или после описанной выше катионообменной хроматографии для доочистки. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления выход ΆΌΆΜΤ§13 в процентах после инактивации вирусов, как ни удивительно, составляет по меньшей мере 95%.

В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает элюирование белка ΑΌΑΜΤ§13 из катионообменной смолы. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления используют градиентное элюирование, например элюирование с использованием градиента, включающего первый буфер с низкой концентрацией соли и второй буфер с более высокой концентрацией соли. В некоторых более предпочтительных вариантах осуществления используют стадию элюирования, даже более предпочтительно стадия элюирования включает элюирование белка ΑΌΑΜΤ813 из смолы с использованием буфера для хранения. Например, буфер для хранения может иметь рН выше, чем 7,0, и включать менее 10 мМ ионов кальция, буферирующее соединение, 0,05% неионного детергента и соль. В некоторых более предпочтительных вариантах осуществления способ не включает последующую стадию концентрирования или буферного обмена, после элюирования из смолы буфером для хранения.

В особенно предпочтительном варианте осуществления представлен способ очистки рекомбинантного белка ΑΌΑΜΤ813 из образца, включающего белок ΑΌΑΜΤ813 и не являющиеся ΛΌΛΜΤδ13 примеси, который включает приведение образца хроматографически в контакт с гидроксиапатитом в условиях, обеспечивающих попадание белка ΑΌΛΜΤ513 в элюат или супернатант из гидроксиапатита; и затем приведение указанного элюата хроматографически в контакт со смолой на основе катионообмена/гидрофобных взаимодействий, которая связывает белок ΑΌΑΜΤ813, предпочтительно в виде тандемной хроматографии.

В другом, особенно предпочтительном варианте осуществления, описанным выше стадиям хроматографии предшествует приведение образца хроматографически в контакт с анионообменной смолой и элюирование белка ΑΌΑΜΤ813 из анионообменной смолы; и/или концентрирование белка ΛΌΛΜΤ513 в образце ультрафильтрацией, и стабилизация белка ΑΌΑΜΤ813 обменом с помощью диафильтрации в буфер, включающий ионы кальция и ионы цинка, перед хроматографическим контактом с гидроксиапатитом.

В другом, особенно предпочтительном варианте осуществления, после приведения в контакт с гидроксиапатитом или смолой на основе катионообмена/гидрофобных взаимодействий, способ дополнительно включает стадию подготовки белка ΑΌΑΜΤ813 для катионого обмена путем снижения проводимости буфера, где стадию подготовки выполняют с использованием ультрафильтрации/диафильтрации, и/или с использованием диализа, состоящего не более чем из 2 прохождений через один модуль для диализа; и/или с использованием гель-фильтрации.

В еще одном особенно предпочтительном варианте осуществления способ включает получение образца из супернатанта, собранного из культивирующих СНО клеток, включающих нуклеиновую кислоту рекомбинантного ΑΌΑΜΤ813; приведение образца хроматографически в контакт с анионообменной смолой и элюирование белка ΑΌΑΜΤ813 из анионообменной смолы перед хроматографическим контактом с гидроксиапатитом; и/или концентрирование белка ΑΌΑΜΤ813 в образце ультрафильтрацией; и стабилизацию белка ΑΌΑΜΤ813 обменом с помощью диафильтрации в буфер, включающий ионы кальция и ионы цинка, перед хроматографическим контактом с гидроксиапатитом; с последующим приведением образца хроматографически в контакт с гидроксиапатитом в условиях, обеспечивающих попадание белка ΑΌΑΜΤ813 в элюат или супернатант из гидроксиапатита; и затем приведение элюата хроматографически в контакт со смолой на основе катионообмена/гидрофобных взаимодействий, которая связывает белок ΑΌΑΜΤ813; с последующей подготовкой белка ΑΌΑΜΤ813 для катионого обмена путем снижения проводимости буфера, например с использованием ультрафильтрации/диафильтрации; и/или с использованием диализа, состоящего не более чем из 2 прохождений через один модуль для диализа; и/или с использованием гель-фильтрации, необязательно дополнительно включая одну или более стадий инактивации вирусов. В некоторых таких вариантах осуществления стадия инактивации вирусов включает добавление смеси растворитель-детергент, включающей неионный детергент и органический растворитель, к белку ΑΌΑΜΤ813, где белок ΑΌΑΜΤ813 иммобилизован на катионообменной смоле, и смесь растворитель-детергент включает 1% ΤΚΙΤΟΝ Х-100, 0,3% три-н-бутилфосфата и 0,3% ΤΑΕΕΝ 80. В еще одном варианте осуществления на стадии инактивации вирусов используют, также или вместо обработки смесью растворитель-детергент, нанофильтр для удаления вирусов и/или вирусных частиц. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления процентный выход ΑΌΑΜΤ813 в результате полной методики, представленной выше, как ни удивительно, составляет 22-24% или более, и даже в более предпочтительных вариантах осуществления количество агрегатов, как ни удивительно, снижено на 50%.

В некоторых вариантах осуществления, в которых ΑΌΑΜΤ813 иммобилизован на катионообменной смоле, способ дополнительно включает элюирование белка ΑΌΑΜΓ§13 из смолы, используя стадию элюирования буфером для хранения, имеющего рН выше, чем 7,0, и включающего менее 10 мМ ионов кальция, буферирующее соединение, 0,05% неионного детергента и соль; или используя градиентное элюирование, включающее первый буфер с низким содержанием соли и второй буфер с более высоким содержанием соли.

- 3 023783

Другой аспект настоящего изобретения относится к композиции, содержащей рекомбинантный белок ΑΌΆΜΤδ13, полученный согласно любому варианту осуществления способов, описанных в данном описании. В некоторых вариантах осуществления композицией является фармацевтическая композиция, например композиция, содержащая очищенный белок ΑΌΑΜΤ§13 и фармацевтически приемлемый носитель.

Еще дальнейший аспект настоящего изобретения относится к способу инактивации загрязнений вирусами в образце белка, где белком может быть любой белок из источника, который может иметь загрязнения вирусами. В предпочтительных вариантах осуществления белком является рекомбинантный белок, в частности, белки, подверженные агрегации после воздействия органических растворителей и детергентов. В некоторых вариантах осуществления белком может быть белок ΆΟΑΜΤ§13, в частности, рекомбинантный ΑΌΑΜΤ§13, или отличный белок (в частности, отличный рекомбинантный белок). В некоторых вариантах осуществления рекомбинантным белком является фактор свертывания крови. В некоторых вариантах осуществления белком является, например, один или несколько белков, выбранных из фактора VIII, фактора II, фактора νΐΐα, фактора IX, тромбина, фактора Виллебранда, антитела против ΜΙΡ или другого белка, подвергаемого очистке с помощью хроматографии. Инактивация вирусов может быть осуществлена совместно с очисткой белка или без нее. В некоторых вариантах осуществления способ включает иммобилизацию белка на носителе; и обработку иммобилизованного белка смесью детергент-растворитель, включающей неионный детергент и органический растворитель. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления носителем является хроматографическая смола. Даже в более предпочтительных вариантах осуществления смесь детергент-растворитель включает 1% Τήΐοη Х-100, 0,3% три-н-бутилфосфата и 0,3% полисорбата 80 (Ъуссп 80). Обработка смесью растворитель-детергент может продолжаться в течение удлиненного периода времени, например в течение от 30 мин до 1 ч, когда белок остается иммобилизованным на хроматографической смоле, например на катионообменной смоле; и/или обработка смесью растворитель-детергент может происходить при 2-10°С. Этот подход к инактивации вирусов может, как ни удивительно, уменьшить образование белковых агрегатов во время обработки смесью детергент-растворитель в значительной степени, например более чем на 50%, по сравнению с обработкой смесью детергент-растворитель, когда белок присутствует в растворе, не являясь иммобилизованным. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления за данной процедурой следует элюирование белка из носителя буфером, такое как градиентное элюирование, где небольшое количество агрегатов, которое действительно образуются, в дальнейшем удаляется во фракции позднего элюирования. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления за данной процедурой следует элюирование белка буфером для хранения. В некоторых более предпочтительных вариантах осуществления буфер для элюирования включает Шуссп 80 в концентрации, составляющей 0,01%. В некоторых даже более предпочтительных вариантах осуществления способ не включает последующую стадию концентрирования или буферного обмена, после элюирования из смолы с использованием буфера для хранения. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления количество агрегатов, как ни удивительно, снижается на 50%.

В еще другом, особенно предпочтительном варианте осуществления, представляется способ инактивации загрязнений вирусами в образце белка, включающий иммобилизацию белка на хроматографической смоле и обработку иммобилизованного белка смесью растворитель-детергент, включающей 1% Ττίΐοη Х-100, 0,3% три-н-бутилфосфата и 0,3% полисорбата 80, в течение от 30 мин до 1 ч. В некоторых таких вариантах осуществления способ дополнительно включает элюирование белка с использованием буфера для хранения, имеющего рН выше, чем 7,0, и включающего менее 10 мМ ионов кальция, буферирующее соединение, 0,05% неионного детергента и соль.

Эти и другие аспекты настоящего изобретения описываются более подробно ниже.

Краткое описание фигур

На фиг. 1 отображена блок-схема приводимых в качестве примеров стадий способа очистки рекомбинантного белка, подобного дезинтегрину, и металлопептидазы с мотивом 13 тромбоспондина типа 1 (ΑΌΑΜΤ§13) из образца, включающего ΑΌΑΜΤ§13 и не являющиеся ΑΌΑΜΤ§13 примеси, в соответствии с настоящим изобретением. Порядок стадий, представленных на фиг. 1, может быть изменен и/или может быть пропущена одна или несколько стадий, как описано в данном описании, и как понятно специалисту в данной области техники.

На фиг. 2Α-2Ό отображены варианты выполнений очистки на катионообменной колонке. На фиг. 2А отображена процедура, включающая катионообменную хроматографию со стадией элюирования, после инактивации вирусов; на фиг. 2В отображена процедура, включающая катионообменную хроматографию со стадией элюирования, но без предшествующей инактивации вирусов; на фиг. 2С отображена процедура, включающая катионообменную хроматографию с использованием градиентного элюирования с последующей инактивацией вирусов на хроматографической колонке; и на фиг. 2Ό отображена процедура, включающая катионообменную хроматографию с использованием градиентного элюирования, но без предшествующей инактивации вирусов.

- 4 023783

Подробное описание настоящего изобретения

Один аспект настоящего изобретения относится к способу очистки рекомбинантного белка, подобного дезинтегрину, и металлопептидазы с мотивом 13 тромбоспондина типа 1 (АОАМТ§13) из образца, который может также включать не являющиеся АИАМТ813 примеси. Образец белка может также включать загрязнения вирусами, которые можно удалить и/или инактивировать с помощью одной или нескольких стадий инактивации вирусов.

Как использовано в данном описании, термины подобный дезинтегрину, и металлопептидаза с мотивом 13 тромбоспондина типа 1, АИАМТ813, белок АИАМТ813, полипептид АИАМТ813 и рекомбинантный АИАМТ813 являются равнозначными (если особо не указано иное) и относятся к рекомбинантному белку АИАМТ813 млекопитающих, который также может быть биологически активным производным или фрагментом полноразмерного белка АИАМТ813. Аминокислотной последовательности полноразмерного белка АИАМТ§13 человека и мыши соответствуют номера доступа в υηίΡΓΟίΚΒ® - 076ЙХ8 и 076916. Детализацию структуры и информацию о последовательности АИАМТ§13 человека можно найти у ΖΗβη§ е! а1. ((2001) 1. ΒίοΙ. Сйет. 276: 41059-41063).

Под используемым в данном описании термином его биологически активное производное или фрагмент подразумевают любые полипептиды с биологической функцией, соответствующей или по существу соответствующей, биологической функции АОАМТ813. Полипептидные последовательности его биологически активных производных или фрагментов могут включать делеции, добавления и/или замены одной или нескольких аминокислот, отсутствие, присутствие и/или замена которых, соответственно, не оказывает какого-либо существенного отрицательного влияния на одну или несколько биологических активностей белка АИАМТ§13. Например, альтернативный сплайсинг приводит к образованию вида с 130 кДа, который представляет собой биологически активный фрагмент полноразмерного белка. Биологическую активность указанных полипептидов можно определить с помощью хорошо известных методов, например методами тестирования протеолитической активности АИАМТ§13 на факторе Виллебранда (ννΡ) и/или последующего уменьшения и/или приостановки последующих эффектов. Под последующими эффектами подразумевается одно или несколько биологических, биохимических или физиологических проявлений действия белка АОАМТ§13 на его природный субстрат(ы), независимо от того, вызван ли этот эффект прямым или косвенным действием АОАМТ§13, например эффект, являющийся результатом каскада явлений, следующих за активностью АОАМТ§13. Анализы включают, но без ограничения, методы тестирования уменьшения и/или приостановки адгезии тромбоцитов к эндотелию, уменьшения и/или приостановки агрегации тромбоцитов, уменьшения и/или приостановки образования цепочек тромбоцитов, уменьшения и/или приостановки образования тромба, уменьшения и/или приостановки увеличения тромба, уменьшения и/или приостановки окклюзии сосуда, протеолитическое расщепление ν\νΕ (например, РКЕТ§-У^Б73 (Рерййе8 НИегпаОопак ^1118111^ ΚΥ)) и/или распад тромбов (см., например, патент США 7270976, озаглавленный Ме1йой8 Гог теазигшд АЭАМТ§13 αοίίνίΐν апй рго!еш оп р1а!е1е!8 апй ίη р1а8та, со строки 55 в колонке 6 до строки 34 в колонке 10 и со строки 1 в колонке 12 до строки 25 в колонке 18, и патент США 7468258, озаглавленный §е1Г-циепсЫп§ йотойиогорйоге сотро8Йюп8 Гог йе1есНпд еп/уте асШйу, со строки 26 в колонке 11 до строки 50 в колонке 16; см. также публикацию патентной заявки США № 20070015703, озаглавленной АЭАМТ§13-соп1а1тп§ сотро81Нон8 Наетд 1НготЪо1уНс асШНу, параграфы [0036], [0043]- [0045] и [0053], и публикацию патентной заявки США № 20070065895, озаглавленной §иЪ81га1е8 8ресШс !о νοη νίΙΚόπιιΠ Гас1ог с1еа\апд рго1еа8е апй тейюй оГ а88ауш§ 1йе асОуНу; и заявку на Европейский патент № 1990421 А1, озаглавленную Мейюй Гог ОеЮсОоп оГ СопйНюп ш Соп8сюи8пе88 Э18огйег Райей апй Κίΐ Гог 1йе ОеЮсОоп. которые включены в данное описание посредством ссылки, что касается анализов полипептидов АОАМТ§13 и их производных и/или фрагментов).

Рекомбинантный АОАМТ§13, например рекомбинантный АОАМТ§13 человека, можно экспрессировать с помощью любого известного в данной области техники способа. Один конкретный пример описан в заявке νθ 02/42441, которая включена в данное описание посредством ссылки, что касается способа получения рекомбинантной нуклеотидной последовательности АОАМТ§13 (см. со строки 6 на стр. 14 до строки 4 на стр. 18). В некоторых вариантах осуществления рекомбинантный АОАМТ§13 продуцируют в согласно следующему способу: (ί) получение рекомбинантной нуклеотидной последовательности АОАМТ§13 с помощью генетической инженерии, например посредством обратной транскрипции РНК и/или амплификации ДНК; (ίί) введение рекомбинантной нуклеотидной последовательности АОАМТ§13 в эукариотические клетки, например с помощью трансфекции, например посредством электропорации или микроинъекции; (ίίί) культивирование трансформированных клеток, например непрерывно или периодически; (ίν) обеспечение экспрессии рекомбинантного АОАМТ§13, например конститутивно или в результате индукции; и (ν) выделение образцов, включающих экспрессированный рекомбинантный АОАМТ§13, например из культуральной среды или путем сбора трансформированных клеток; и (νί) очистка белка АОАМТ§13 из образца, согласно описанным в данном описании способам.

Рекомбинантный АОАМТ§13 можно продуцировать экспрессией в подходящей системе-хозяине, предпочтительно эукариотической системе-хозяине, и более предпочтительно в системе, характеризующейся тем, что она может продуцировать фармакологически эффективную молекулу АОАМТ§13. При- 5 023783 меры эукариотических клеток включают, но без ограничения, клетки млекопитающих, такие как СНО, СО8, НЕК 293, ВНК, 8К-Нер и НерС2. В предпочтительном варианте осуществления используют клетки СНО, и данные клетки секретируют рекомбинантный белок ΑΌΑΜΤ813 в культуральную среду. Нет ограничения в отношении реагентов или условий, используемых для рекомбинантной экспрессии ΑΌΑΜΤ813, и может быть использована любая система, известная в данной области техники или коммерчески доступная.

Как используется в данном описании, образец относится к любой композиции, содержащей белок ΑΌΑΜΤ813 и не являющиеся ΑΌΑΜΤ813 примеси. Специалисту в данной области будет очевидно, что образец, как используется в данном описании, может быть результатом описанного выше продуцирования рекомбинантного ΑΌΑΜΤ813. Соответственно, образец может включать супернатант, собранный при культивировании трансформированных клеток, которые экспрессируют рекомбинантный ΑΌΑΜΤ813; буферы, включающие ΑΌΑΜΤ813, на одной или нескольких стадиях процесса очистки рекомбинантного белка ΑΌΑΜΤ813 из культуральной среды; и/или трансформированные клетки, полученные из культуры клеток. Альтернативно, образцом может быть кровь, плазма или фракция крови или плазмы.

В некоторых вариантах осуществления ΑΌΑΜΤ813 подвергают очистке из образца, включающего супернатант 100-л культуры клеток. Однако специалисту в данной области будет понятно, что масштаб способов настоящего изобретения может быть увеличен сообразно обстоятельствам, например для высокомасштабного производства. Соответственно, в некоторых вариантах осуществления способ включает очистку белка ΑΌΑΜΤ813 в масштабе промышленного производства, например по меньшей мере из приблизительно 250-л образца по меньшей мере приблизительно 500-л образца или по меньшей мере приблизительно 1000-л образца.

Как использовано в данном описании, не являющиеся ΑΌΑΜΤ813 примеси, как правило, относятся к связанным с процессом примесям (загрязнениям). Примеси могут включать, например, имеющие отношение к клеткам-хозяевам примеси (такие как загрязняющие белки клеток-хозяев, также называемые антигенами клеток-хозяев) и другие биомолекулярные примеси, такие как ДНК, РНК и клеточный дебрис; компонент (ы) сред; растворители; детергенты и т.п. Кроме того, не являющиеся ΑΌΑΜΤ813 примеси также включают связанные с продуктом примеси, например производные или фрагменты белка ΑΌΑΜΤ813, которые не являются биологически активными, или агрегаты белка ΑΌΑΜΤ813. В случае крови или плазмы не являющиеся ΑΌΑΜΤ813 примеси могут включать другие белки, обычно обнаруживаемые в крови или плазме, например альбумин, иммуноглобулины и т.д. Как используется в данном описании, агрегат относятся к структуре, включающей более одной молекулы полипептида ΑΌΑΜΤ813 или более одной любой другой молекулы белка, которая соответствует высокомолекулярным структурам или олигомерным структурам, таким как димеры, тримеры и другие мультимеры макромолекулы. Не являющиеся ΑΌΑΜΤ813 примеси могут также включать загрязнения вирусами. Загрязнения вирусами относятся к любым примесям, являющимся следствием присутствия и/или происходящим из вируса, включающим, например, вирусные частицы, вирусные белки, вирусную ДНК, вирусную РНК или их фрагменты.

Термины очистка, очищенный и т.п. относятся к удалению, изолированию или отделению ΑΌΑΜΤ813 от не являющихся ΑΌΑΜΤ813 примесей. Например, рекомбинантный белок ΑΌΑΜΤ813, экспрессируемый в клетках-хозяевах растений, бактерий, дрожжей или млекопитающих, может быть очищен посредством удаления не являющихся ΑΌΑΜΤ813 примесей, включающих, например, белки клеток-хозяев. Процент чистоты может относиться к проценту белка ΑΌΑΜΤ813 по отношению к белку клеток-хозяев (например, белку клеток СНО). По существу очищенный рекомбинантный ΑΌΑΜΤ813 лишен по меньшей мере приблизительно 60%, предпочтительно по меньшей мере приблизительно 75% и более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 90% (или приблизительно 95%, приблизительно 99% или приблизительно 99,9%) не являющихся ΑΌΑΜΤ813 примесей. В частности, по существу очищенный рекомбинантный ΑΌΑΜΤ813 лишен по меньшей мере приблизительно 60%, предпочтительно по меньшей мере приблизительно 75% и более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 90% (или приблизительно 95%, приблизительно 99%, или приблизительно 99,9%) белков клетокхозяев. Белки клеток-хозяев можно детектировать, например, с помощью иммунохимических способов, используя поликлональные антисыворотки, как обсуждается более подробно ниже.

Удаление загрязнений может также привести к обогащению белком ΑΌΑΜΤ813. Как использовано в данном описании, обогащение и обогащать относится к увеличению процентного содержания рекомбинантного ΑΌΑΜΤ813 в образце. Соответственно, обогащение белком ΑΌΑΜΤ813 имеет место, когда процентное содержание ΑΌΑΜΤ813 увеличивается в образце после некоторой манипуляции с образцом, например подвергания образца одной или нескольким хроматографическим стадиям. В одном варианте осуществления ΑΌΑΜΤ813 является по существу обогащенным, когда отмечается по меньшей мере приблизительно от 10-кратного до приблизительно 115-кратного уменьшения не являющихся ΑΌΑΜΤ813 примесей, в частности, белков клеток-хозяев. В одном варианте осуществления ΑΌΑΜΤ813 является по существу обогащенным, когда отмечается по меньшей мере приблизительно 20-кратное (например, приблизительно 30-кратное, приблизительно 40-кратное, приблизительно 50-кратное, приблизи- 6 023783 тельно 60-кратное, приблизительно 70-кратное, приблизительно 80-кратное, приблизительно 90-кратное, приблизительно 100-кратное и т.д.) уменьшение не являющихся ЛЭЛМТ§13 примесей, и, в частности, уменьшение имеет место в отношении белков клеток-хозяев.

Специалист в данной области будет способен использовать имеющиеся в данной области техники способы для определения кратности уменьшения не являющихся ЛЭЛМТ§13 примесей, в частности, белков клеток-хозяев. Например, можно использовать анализ для не являющихся ЛЭЛМТ§13 примесей. В одном варианте осуществления образцом является кондиционированный супернатант, собранный при культивировании трансформированных клеток, экспрессирующих рекомбинантный ЛЭЛМТ§13, и в анализе для определения кратности уменьшения не являющихся ЛЭЛМТ§13 примесей определяют уровни белков клеток-хозяев. В одном конкретном варианте осуществления трансформированными клетками являются трансформированные клетки СНО, и анализом является иммуноферментный твердофазный серологический анализ, в котором измеряются белки клеток СНО. Кратность уменьшения не являющихся ЛЭЛМТ§13 примесей можно рассчитать, например, как количество не являющихся ЛЭЛМТ§13 примесей в образце по сравнению с количеством не являющихся ЛЭЛМТ§13 примесей, извлеченных из сорбента, как уровень примесей в загружаемом образце (например, в ч./млн), разделенный на уровень примесей в элюате (например, в ч./млн).

Белки клеток-хозяев можно детектировать, например, с помощью иммунохимических способов, используя поликлональные антисыворотки против белковых компонентов клетки-хозяина и/или рекомбинантной векторной системы, использованной для производства ЛЭЛМТ§13. Как правило, можно индуцировать антисыворотки против антигена, происходящего из клетки-хозяина, которая включает экспрессионный вектор, который используют в процессе производства, но в котором отсутствует ген, кодирующий ЛЭЛМТ§13. Имеющие отношение к клеткам-хозяевам примеси можно извлечь, используя способ(ы), идентичный(ые) и/или по существу аналогичный(ые) описанным в данном описании способам. Очищенные (или частично очищенные) антигены клетки-хозяина, полученные при использовании способа(ов), идентичного(ых) и/или по существу аналогичного(их) описанным в данном описании способам, можно далее использовать для приготовления антисывороток против белковых компонентов клеткихозяина и рекомбинантной векторной системы, используемой для производства ЛЭЛМТ§13. Белки клетки-хозяина можно детектировать, используя антисыворотки, в иммуноанализе, например в ЕЬ1§Л или анализе Вестерн-блоттинге. Являющиеся белками клетки-хозяина примеси можно также детектировать путем разделения подвергаемого анализу образца с помощью двумерного гель-электрофореза и окрашивания серебром и/или окрашивания коллоидным золотом для выявления присутствия белков. Можно также использовать ВЭЖХ для количественного определения уровней имеющих отношение к клеткамхозяевам примесей; однако способы с использованием ВЭЖХ не являются столь же чувствительными, как иммуноанализ или способы окрашивания серебром. Предпочтительно имеющие отношение к клеткам-хозяевам примеси уменьшают до уровней, которые ниже уровней, выявляемых при использовании, например, одного или нескольких из этих аналитических способов.

Используемый в данном описании термин приблизительно означает примерный диапазон, составляющий плюс или минус 10% от указанной величины.

Обогащение ЛЭЛМТ§13.

В целом, настоящим изобретением обеспечивается способ очистки рекомбинантного белка ЛЭЛМТ§13 (предпочтительно белка ЛЭЛМТ§13 человека) из образца, включающего белок ЛЭЛМТ§13 и не являющиеся ЛЭЛМТ§13 примеси, который включает приведение образца хроматографически в контакт с (ί) гидроксиапатитом или (ίί) гидроксиапатитом и смолой со смешанным принципом работы на основе катионообмена/гидрофобных взаимодействий в тандеме так, чтобы повысить количество ЛЭЛМТ§13 в образце. Как используется в данном описании, приведение хроматографически в контакт относится к приведению образца или другой смеси, подвергаемой разделению, в контакт с хроматографической смолой, используя любой способ хроматографии, описанный в данном описании и/или известный в данной области техники. Способы включают, но без ограничения, хроматографию периодического режима и колоночную хроматографию. Приведение в контакт осуществляют, подвергая образец воздействию смолы и/или инкубирования образца на, в или внутри смолы, фильтрования образца через смолу или любыми другими способами. Буфером, используемым для хроматографии, является фосфатный буфер.

В некоторых вариантах осуществления образец приводят хроматографически в контакт с гидроксиапатитом в условиях, обеспечивающих попадание белка ЛЭЛМТ§13 в элюат из гидроксиапатита. При использовании в условиях отсылают к одному или нескольким параметрам или переменным, при которых проводят хроматографию, включающим, например, высоту колонки, набивку, буфер (рН, концентрацию соли, ионную силу и т.д.), температуру, давление и т.п. Т.е. образец подвергают хроматографии с использованием гидроксиапатита в условиях, которые позволяют белку ЛЭЛМТ§13, предпочтительно существенной части белка ЛЭМЛТ§13, в образце не связываться с гидроксиапатитом. В случае использования колоночной хроматографии белок ЛЭЛМТ§13, предпочтительно его существенная часть, будет протекать через колонку, с обогащением, таким образом, в буфере, вытекающем из колонки в виде проточной фракции или элюата, в то время как не являющиеся ЛЭЛМТ§13 примеси будут удерживаться.

- 7 023783

В случае использования хроматографии периодического режима супернатант или супернатантная фракция будет включать белок ΆΌΆΜΤ§13 или его существенную часть. Термин элюат используется в данном описании взаимозаменяемо с термином проточная фракция, супернатант или супернатантная фракция. Элюат (или супернатант) можно собрать. Такой сбор происходит, например, путем центрифугирования, осаждения, фильтрации и т.д. хроматографической смолы после подвергания образца воздействию смолы и завершения инкубации. Элюат (или супернатант) из гидроксиапатита можно далее подвергнуть одной или нескольким стадиям согласно настоящему изобретению.

В некоторых вариантах осуществления, например, способ дополнительно включает приведение элюата из гидроксиапатита хроматографически в контакт со смолой, такой как смола с принципом работы на основе катионообмена/гидрофобных взаимодействий, которая связывает белок ΆΌΆΜΤ§13. Т.е. образец белка ΆΌΆΜΤ§13 может быть подвергнут тандемной хроматографии, сначала с использованием гидроксиапатита, предпочтительно в условиях, при которых существенная часть белка ΆΌΛΜΤ§13 не связывается с гидроксиапатитом, с последующим использованием смолы со смешанным принципом работы на основе катионообмена/гидрофобных взаимодействий, которая связывает белок ΆΌΛΜΤ§13. Ниже представлены дополнительные детали, касающиеся стадии хроматографии с использованием гидроксиапатита и необязательной тандемной стадии хроматографии со смешанным принципом работы, используя смолу на основе катионного обмена/гидрофобных взаимодействий.

(а) Хроматография с использованием гидроксиапатита.

Стадия хроматографии с использованием гидроксиапатита включает любой способ хроматографии с использованием гидроксиапатита, который описан в данном описании, известен в данной области техники или может быть оценен специалистом в данной области техники, особенно с учетом приведенных в данном описании сообщений. Способы хроматографии с использованием гидроксиапатита широко известны в данной области техники. Гидроксиапатит имеет химическую формулу Саю(РО4)б(ОН)₂ и является основным минеральным компонентом костей и зубов, а также других биологических структур. Гидроксиапатит можно получить из таких природных источников или можно синтезировать хорошо известными способами. Гидроксиапатит широко используется в качестве хроматографической среды или носителя, в частности, для хроматографического разделения белков. Размер частиц не является, как правило, решающим и может значительно варьировать. Типичные частицы имеют размеры в диаметре в интервале приблизительно от 1 до приблизительно 1000 мкм, предпочтительно приблизительно от 10 до приблизительно 100 мкм. Пористость может также значительно варьировать. В предпочтительных вариантах осуществления средний диаметр пор колеблется приблизительно от 100 до приблизительно 10000 А, более предпочтительно приблизительно от 500 до приблизительно 3000 А, даже предпочтительнее от 500 до 3000 А.

Различные гидроксиапатитные хроматографические среды коммерчески доступны, и при осуществлении на практике описанных в данном описании способов может использоваться любая доступная форма материала. Не ограничивающие примеры коммерчески доступных материалов, представляющих собой гидроксиапатитную керамику, которые могут использоваться, включают ΜΆΟΚΟ-ΡΡΕΡ™, типы I и II гидроксиапатита (Вюгаб, Нсгеи1с5. СА) и НА υΤΤΚΟΟΕΤ® (РАЬЬ, Апп АгЬог, ΜΙ). В одном варианте осуществления образец подвергают хроматографии с использованием типа II гидроксиапатита (Вюгаб, Негси1е8, СА).

Как ни удивительно, было обнаружено, что в результате приведения образца хроматографически в контакт с гидроксиапатитом, значительная или существенная часть не являющихся ΛΟΛΜΤ813 примесей в образце связывается с гидроксиапатитом, в то время как значительная или существенная часть белка А^АΜΤ§13 остается в растворе. Соответственно, как обсуждалось выше, обработка образца гидроксиапатитом может быть выполнена хроматографией периодического режима или колоночной хроматографией в соответствии с хорошо известными методами, и по существу обогащенный белок А^АΜΤ§13 получают в супернатанте или элюате, соответственно.

Как используется в данном описании, существенная часть относится к выходу при извлечении в супернатанте или элюате, составляющему приблизительно от 30 до приблизительно 100% (например, приблизительно от 40 до приблизительно 90%, например приблизительно от 50 до приблизительно 80%, например приблизительно от 60 до приблизительно 70%) рекомбинантного белка А^АΜΤ§13 из образца по сравнению с его содержанием до стадии хроматографии с использованием гидроксиапатита. Например, выход при извлечении в супернатанте или элюате, составляющий приблизительно от 50 до приблизительно 100%, означает, что образец был подвергнут хроматографии с использованием гидроксиапатита в условиях, обеспечивающих протекание существенной части белка А^АΜΤ§13.

В предпочтительных вариантах осуществления образец, подвергаемый хроматографии с использованием гидроксиапатита, имеет низкую проводимость, например приблизительно от 3 до приблизительно 15 мСм/см при комнатной температуре, предпочтительно менее приблизительно 10 мСм/см при комнатной температуре. В одном варианте осуществления образец имеет проводимость, составляющую 6 мСм/см при комнатной температуре. В другом варианте осуществления образец имеет проводимость, составляющую 7 мСм/см при комнатной температуре. Специалисту в данной области будет очевидно,

- 8 023783 что проводимость образца можно регулировать с помощью солевого раствора, включающего нейтральные соли, например хлорид натрия, хлорид калия, сульфат натрия, фосфат натрия, фосфат калия и т.п., и ему можно придать подходящие буферные свойства с помощью приблизительно 20 мМ фосфатного буфера. Предпочтительно образец имеет рН приблизительно от 6,5 до приблизительно 9,0, и предпочтительно он имеет рН от 7 до 8. Образец может оставаться в контакте с гидроксиапатитом в течение любой продолжительности, которая будет обеспечивать достаточное связывание не являющихся ΛΌΛΜΤ§13 примесей, например в течение приблизительно от 5 мин до приблизительно 24 ч. Обогащенный ΑΟΑΜΤ§13 можно получить в супернатантной фракции или проточной фракции, которая может включать элюат от последующих промывок, особенно первой промывки.

В одном варианте осуществления подвергание образца хроматографии с использованием гидроксиапатита в условиях, обеспечивающих сохранение существенной части белка ΑΌΑΜΤ813 в супернатанте или элюате, приводит к обогащению ΑΌΑΜΤ813, например приблизительно от 10-кратного уменьшения до приблизительно 115-кратного уменьшения не являющихся ΑΌΑΜΤ813 примесей, в частности, белков клеток-хозяев, по сравнению с образцом до хроматографии с использованием гидроксиапатита. В одном варианте осуществления хроматография с использованием гидроксиапатита уменьшает количество белков клеток-хозяев в образце по меньшей мере приблизительно в 20 раз (например, приблизительно 30 раз, приблизительно 40 раз, приблизительно 50 раз, приблизительно 60 раз, приблизительно 70 раз, приблизительно 80 раз, приблизительно 90 раз, например приблизительно 100 раз и т.д.).

В предпочтительных вариантах осуществления подвергание образца хроматографии с использованием гидроксиапатита в условиях, обеспечивающих сохранение существенной части белка ΑΌΑΜΤ813 в супернатанте или элюате, приводит к удалению приблизительно от 90 до приблизительно 99% не являющихся ΑΌΑΜΤ813 примесей, в частности, белков клеток-хозяев. В одном варианте осуществления подвергание образца хроматографии с использованием гидроксиапатита приводит к удалению по меньшей мере приблизительно 90% (например, приблизительно 91%, приблизительно 92%, приблизительно 93%, приблизительно 94%, приблизительно 95%, приблизительно 96%, приблизительно 97%, приблизительно 98%, приблизительно 99%, приблизительно 99,5% и т.д.) не являющихся ΑΌΑΜΤ813 примесей, в частности, удалению белков клеток-хозяев. Соответственно, способы, описанные в данном описании, включающие обогащение в отношении белка ΑΌΑΜΤ813 путем подвергания образца хроматографии с использованием гидроксиапатита в условиях, обеспечивающих сохранение существенной части белка ΑΌΑΜΤ813 в супернатанте или элюате, также может обеспечить буфер, включающий белок ΑΌΑΜΤ813, который является по существу очищенным.

Приводимые в качестве примеров условия колоночной хроматографии, которые обеспечивают протекание существенной части ΑΌΑΜΤ813 через хроматографическую колонку с гидроксиапатитом, представлены в примерах ниже. Как правило, для обеспечения протекания существенной части белка ΑΌΑΜΤ813 во время хроматографии с использованием гидроксиапатита хроматографическая колонка будет предпочтительно иметь высоту слоя приблизительно от 5 до приблизительно 30 см, например 20-30 см. Кроме того, перед подверганием образца хроматографии с использованием гидроксиапатита, например, перед внесением образца в колонку с гидроксиапатитом, колонка может быть сначала промыта, активирована и/или уравновешена с использованием соответствующих известных буферов для промывки, активации и/или уравновешивания, в частности, таких, которые рекомендованы производителем гидроксиапатита. В одном варианте осуществления колонку активируют и уравновешивают одним и тем буфером, например буфером, включающим 20 мМ Να/Κ РО₄, имеющим рН 7,0 и имеющим проводимость 5,5 мСм/см при комнатной температуре.

(Ь) Хроматография со смешанным принципом работы на основе катионообмена/гидрофобных взаимодействий.

В одном варианте осуществления белок ΑΌΑΜΤ813 обогащают тандемной хроматографией с использованием гидроксиапатита, с последующим использованием смолы со смешанным принципом работы на основе катионообмена/гидрофобных взаимодействий, которая связывает белок ΑΌΑΜΤ§13. Как ни удивительно, было обнаружено, что ΑΌΑΜΤ813 связывается со смолой со смешанным принципом работы на основе катионообмена/гидрофобных взаимодействий, в то время как не являющиеся ΑΌΑΜΤ813 примеси либо остаются в растворе, либо связываются намного сильнее со смолой со смешанным принципом работы на основе катионообмена/гидрофобных взаимодействий. Соответственно, обработку образца гидроксиапатитом с последующей обработкой смолой со смешанным принципом работы на основе катионообмена/гидрофобных взаимодействий можно выполнить последовательной хроматографией периодического режима или последовательной колоночной хроматографией согласно широко известным способам, и по существу обогащенный ΑΌΑΜΤ813 может быть собран в конечной супернатантной фракции или конечном пуле элюата после подвергания образца тандемной хроматографии периодического режима или тандемной колоночной хроматографии, соответственно. Соответственно, как описано в данном описании, белок ΑΌΑΜΤ§13 обогащают, подвергая образец хроматографии с использованием гидроксиапатита в условиях, обеспечивающих сохранение существенной части белка ΑΌΑΜΤ§13 в супернатанте или его протекание через колонку, включающую гидроксиапатит, в качестве элюата. После обработки гидроксиапатитом собранный супернатант или элюат, включающий обогащен- 9 023783 ный ΑΌΑΜΤδ13, необязательно подвергают хроматографии периодического режима или колоночной хроматографии с использованием смолы со смешанным принципом работы на основе катионообмена/гидрофобных взаимодействий. В одном варианте осуществления супернатант или элюат со стадии хроматографии с использованием гидроксиапатита вводят в хроматографическую колонку, включающую смолу со смешанным принципом работы на основе катионообмена/гидрофобных взаимодействий. Хроматографию периодического режима или колоночную хроматографию с использованием смолы со смешанным принципом работы на основе катионообмена/гидрофобных взаимодействий можно проводить любым способом, который описан в данном описании, известен в данной области техники или может оценить специалист в данной области техники, особенно с учетом приведенных в данном описании сообщений. Предпочтительной смолой со смешанным принципом работы на основе катионообмена/гидрофобных взаимодействий, подходящей для применения после хроматографии с использованием гидроксиапатита, является матрица на основе сефарозы, включающая гидрофильный линкер. Гидрофильный линкер может включать функциональный лиганд, например посредством тиоэфирной группы. Гидрофильный лиганд может быть отрицательно заряженным и может дополнительно включать гидрофобную группу, например углеводород. Гидрофильный лиганд, дополнительно включающий гидрофобную группу, может создавать лиганд со смешанным принципом работы, т.е. лиганд с мультимодальной функциональностью, подходящие для выполнения описываемой в данном описании хроматографии со смешанным принципом работы. В некоторых вариантах осуществления ионная способность смолы со смешанным принципом работы на основе катионообмена/гидрофобных взаимодействий может составлять приблизительно от 0,07 до приблизительно 0,09 мМ/мл и имеет рН, стабильно находящийся приблизительно от 2 до приблизительно 14. Как правило, ΑΌΑΜΤδ13 будет связываться со смолой со смешанным принципом работы на основе катионообмена/гидрофобных взаимодействий через ионные, водородные и/или гидрофобные связи.

Примеры коммерчески доступных смол со смешанным принципом работы на основе катионообмена/гидрофобных взаимодействий, которые могут использоваться в соответствии с описанными в данном описании способами, включают, но без ограничения, среду САРТО™ ММС (ОБ НеаИЪсаге) и δαιηρΙίΟ δΑΧ (АдПеШ Тес1то1още5. δαηία С1ага, СА). В предпочтительном варианте осуществления смолой со смешанным принципом работы на основе катионообмена/гидрофобных взаимодействий является САРТО™ ММС. САРТО™ ММС представляет собой мультимодальную слабую катионообменную смолу на основе твердой, в высокой степени сшитой, гранулированной агарозы со средним размером частиц, составляющим приблизительно 75 мкм. Она включает лиганды с мультимодальной функциональностью, которые связывают белки при высоких концентрациях соли. Она характеризуется обычной скоростью потока, составляющей приблизительно 600 см/ч в случае колонки с диаметром 1 см, высотой слоя приблизительно от 10 до приблизительно 20 см, приблизительно при 20°С, при использовании технологических буферов с вязкостью, приблизительно равной вязкости воды при менее чем приблизительно 3 бар (приблизительно 0,3 мПа).

Во время хроматографии с использованием смолы со смешанным принципом работы на основе катионообмена/гидрофобных взаимодействий ΑΟΑΜΤδ13 связывается со смолой со смешанным принципом работы на основе катионообмена/гидрофобных взаимодействий и дополнительно отделяться от не являющихся ΑΏΑΜΤδ13 примесей (например, белков клеток-хозяев, присутствующих в образце до обогащения). В случае выполнения стадии хроматографии со смешанным принципом работы на колонке белок ΑΌΑΜΤδ13 абсорбируется на смоле на основе катионообмена/гидрофобных взаимодействий, в то время как загрязняющие, не являющиеся ΑΌΑΜΤδ13 примеси удаляются из технологической цепи и отделяются от белка ΑΟΑΜΤδ13 в образце в результате протекания через хроматографическую колонку.

Смолу со смешанным принципом работы на основе катионообмена/гидрофобных взаимодействий, на которой абсорбируется ΑΌΑΜΤδ13, затем промывают, например для удаления слабосвязанных загрязнений или примесей и/или для подгонки проводимости буфера в препарате для элюирования ΑΟΑΜΤδ13 из смолы. Т.е., после приведения образца хроматографически в контакт с гидроксиапатитом и приведения собранного супернатанта или элюата, включающего ΑΌΑΜΤδ13, хроматографически в контакт со смолой со смешанным принципом работы на основе катионообмена/гидрофобных взаимодействий и абсорбции на ней, смолу со смешанным принципом работы на основе катионообмена/гидрофобных взаимодействий промывают буфером для промывки. Как правило, буфер для промывки будет включать буферирующие фосфатный ион и нейтральную соль и будет иметь высокое значение рН, чтобы связывание ΑΟΑΜΤδ13 со смолой со смешанным принципом работы на основе катионообмена/гидрофобных взаимодействий ослаблялось по мере увеличения соответствующих параметров буфера, например увеличения концентрации соли и/или рН буфера. В одном варианте осуществления связавшую ΑΟΑΜΤδ13 смолу со смешанным принципом работы на основе катионообмена/гидрофобных взаимодействий сначала промывают уравновешивающим буфером, например уравновешивающим буфером, включающим приблизительно 20 мМ фосфат и приблизительно 25 мМ ЫаС1 и имеющим рН приблизительно 7,0 при комнатной температуре. Последующие промывки могут выполняться с использованием буфера для промывки, включающего, например, приблизительно 20 мМ фосфат, приблизительно 80 мМ

- 10 023783

ΝαΟ и имеющего рН приблизительно 8,0 при комнатной температуре. Связавшую ΛΌΆΜΤ§13 смолу со смешанным принципом работы на основе катионообмена/гидрофобных взаимодействий можно подвергнуть конечной промывке буфером, включающим, например, 50 мМ Να/Κ РО₄ и 160 мМ ΝαΟ и имеющим рН приблизительно 8,0, и проводимость, составляющую 16,5 мСм/см при комнатной температуре.

После хроматографии с использованием гидроксиапатита с последующей хроматографией со смешанным принципом работы с использованием смолы со смешанным принципом работы на основе катионообмена/гидрофобных взаимодействий, которая связывает белок ΛΌΛΜΤ§13, и необязательной промывки, рекомбинантный белок ΛΌΛΜΤδ13 подвергают элюированию из хроматографической смолы со смешанным принципом работы буфером для элюирования. Как правило, буфер для элюирования будет включать приблизительно от 5 до приблизительно 100 мМ буферирующих ионов, например от 20 до 50 мМ буферирующих ионов. Приводимые в качестве примеров буферы включают, но без ограничения, фосфат, Трис, ΗΕΡΕδ, имидазол, гистидин, ΜΕδ, цитрат, 01у-01у, Трис/ацетат и т.п. Буфер для элюирования также обычно включает одновалентные или двухвалентные катионы, такие как, но без ограничения, ионы натрия, калия или кальция, предпочтительно в высоких концентрациях в форме соли (например, с анионами С1, РО₄, 8О₄ или ОАс и т.п.). В предпочтительном варианте осуществления буфер для элюирования включает ионы натрия в высокой концентрации, например в концентрации, превышающей приблизительно 700 мМ Να'. Буфер для элюирования может иметь рН в диапазоне приблизительно от 7 до приблизительно 11. В одном варианте осуществления буфер для элюирования включает 50 мМ Να/Κ РО₄, 1000 мМ ΝαΟ и имеет рН 8,0, и проводимость, составляющую 93 мСм/см при комнатной температуре.

Приводимые в качестве примеров условия, обеспечивающие связывание обогащенного ΑΌΑΜΤ813, полученного в виде элюата из колонки с гидроксиапатитом, со смолой со смешанным принципом работы на основе катионообмена/гидрофобных взаимодействий в колонке и его отделение от не являющихся ΑΌΑΜΤ813 примесей, представлены в примерах ниже. Как правило, высота слоя в колонке со смолой со смешанным принципом работы на основе катионообмена/гидрофобных взаимодействий может составлять приблизительно от 1 до приблизительно 100 см или даже больше, в зависимости от объема образца. Кроме того, отношение объема хроматографической колонки с гидроксиапатитом к объему колонки со смолой со смешанным принципом работы на основе катионообмена/гидрофобных взаимодействий может составлять приблизительно 10:1, в зависимости, например, от количества не являющихся ΛΌΛΜΤδ13 примесей в образце по сравнению с количеством ΛΌΛΜΤδ13.

Кроме того, специалисту в данной области будет понятно, что в случае вариантов осуществления, включающих тандемную хроматографию с использованием гидроксиапатита и смолы со смешанным принципом работы на основе катионообмена/гидрофобных взаимодействий, смолы и буферы, используемые для промывки, активации и/или уравновешивания, будут в определенных вариантах осуществления выбираться таким образом, чтобы они были совместимыми с обеими колонками. В одном варианте осуществления колонки активируют по отдельности. В другом варианте осуществления колонки уравновешивают, загружают и промывают один раз в тандеме, с последующей одной или несколькими вторыми или последующими промывками и элюированиями, применяемыми только к смоле со смешанным принципом работы на основе катионообмена/гидрофобных взаимодействий. В одном варианте осуществления буферы для активации и уравновешивания хроматографической колонки со смолой со смешанным принципом работы на основе катионообмена/гидрофобных взаимодействий являются такими, как используют для активации и уравновешивания колонки с гидроксиапатитом. В одном варианте осуществления буфером для активации и уравновешивания хроматографической колонки со смолой со смешанным принципом работы на основе катионообмена/гидрофобных взаимодействий является буфер, включающий 20 мМ Να/Κ РО₄ и имеющий рН, равный 7,0, и проводимость 5,5 мСм/см при комнатной температуре.

В предпочтительных вариантах осуществления образец подвергают тандемной хроматографии с использованием гидроксиапатита и смолы со смешанным принципом работы на основе катионообмена/гидрофобных взаимодействий в условиях, обеспечивающих протекание существенной части белка ΑΌΑΜΤ813 через гидроксиапатитную смолу, с последующим ее связыванием и затем элюированием из смолы со смешанным принципом работы на основе катионообмена/гидрофобных взаимодействий. В более предпочтительных вариантах осуществления эта тандемная хроматография приводит к по существу обогащенному ΛΌΛΜΤδ13. В некоторых вариантах осуществления подвергание образца, например кондиционированного супернатанта, собранного при культивировании трансформированных клеток-хозяев, экспрессирующих рекомбинантный ΛΌΛΜΤδ13. который может быть подвергнут предварительному обогащению, тандемной хроматографии, описанной в данном описании, дает приблизительно от 40% до приблизительно 80 ΑΌΑΜΤ813 (например, приблизительно от 45 до приблизительно 75%, например приблизительно от 50 до приблизительно 70%, например,приблизительно от 55 до приблизительно 65%) и/или приблизительно от 40 до приблизительно 90% активности (например, приблизительно от 45 до приблизительно 85%, например приблизительно от 50 до приблизительно 80%, например приблизительно от 55 до приблизительно 75%).

В некоторых вариантах осуществления в результате тандемной хроматографии удаляется приблизительно от 90 до приблизительно 99% имеющих отношение к клеткам-хозяевам примесей. В одном ва- 11 023783 рианте осуществления описываемая в данном описании тандемная хроматография увеличивает чистоту ΆΌΆΜΤ§13 по меньшей мере приблизительно в 600 раз, например по меньшей мере приблизительно в 650 раз, например по меньшей мере в приблизительно 700 раз, например по меньшей мере приблизительно в 800 раз, например по меньшей мере приблизительно в 900 раз, например по меньшей мере приблизительно в 1000 раз, например по меньшей мере приблизительно в 1100 раз, например по меньшей мере приблизительно в 12 00 раз, например по меньшей мере приблизительно в 1300 раз, например по меньшей мере приблизительно в 1400 раз или по меньшей мере приблизительно в 1500 раз, по сравнению с чистотой ΆΌΆΜΤ§13 до подвергания образца тандемной хроматографии.

В некоторых вариантах осуществления подвергание образца, например кондиционированного супернатанта, собранного при культивировании трансформированных клеток-хозяев, экспрессирующих рекомбинантный ΛΌΆΜΤ§13, который может быть подвергнут предварительному обогащению, предпочтительно путем ультрафильтрации/диафильтрации и/или анионообменной хроматографии, описываемой в данном описании тандемной хроматографии приводит к образцу с приблизительно от 600 до приблизительно 1500 ч./млн не являющихся ΆΌΆΜΤ§13 примесей (например, антигенов клеток-хозяев). Например, тандемная хроматография может приводить к образцу с приблизительно от 750 до приблизительно 1250 ч./млн не являющихся ΆΌΛΜΤ§13 примесей, предпочтительно к образцу с менее чем приблизительно 1000 ч./млн не являющихся ΛΌΛΜΤ§13 примесей.

В некоторых вариантах осуществления тандемная хроматография приводит приблизительно к 1000-кратному уменьшению до приблизительно 3000-кратного уменьшения не являющихся ΛΌΛΜΤ§13 примесей (в частности, антигенов клеток-хозяев) по сравнению с образцом до тандемной хроматографии. В некоторых вариантах осуществления подвергание кондиционированного супернатанта, собранного при культивировании трансформированных клеток-хозяев, экспрессирующих рекомбинантный ΆΌΆΜΤ§13, который может быть подвергнут предварительному обогащению, тандемной хроматографии, описанной в данном описании, уменьшает количество не являющихся ΆΌΆΜΤ§13 примесей (например, антигенов клеток-хозяев) по меньшей мере приблизительно в 1000 раз, например по меньшей мере приблизительно в 1300 раз, например по меньшей мере приблизительно в 1500 раз, например по меньшей мере приблизительно в 2000 раз, например по меньшей мере приблизительно в 2500 раз, например по меньшей мере приблизительно в 3000 раз и т.д.

Соответственно, в предпочтительных вариантах осуществления, буфер для элюирования из смолы со смешанным принципом работы на основе катионообмена/гидрофобных взаимодействий, который включает рекомбинантный ΛΌΆΜΤ§13, обеспечивает композицию, содержащую белок ΛΌΛΜΤ§13, который является по существу очищенным.

Подготовка образца к предварительному обогащению.

В некоторых вариантах осуществления описываемый в данном описании способ дополнительно включает подготовку образца, включающего ΆΌΛΜΤ§13, к обогащению с помощью хроматографии с использованием гидроксиапатита или тандемной хроматографии с использованием гидроксиапатита и смолы со смешанным принципом работы на основе катионообмена/гидрофобных взаимодействий. На этой необязательной стадии предварительного обогащения ΆΌΆΜΤ§13 в образце может быть подвергнут одной из двух или обеим манипуляциям: (а) концентрированию с помощью ультрафильтрации/диафильтрации (ИР/ΌΡ) и/или (Ь) приведению хроматографически в контакт с ионообменной смолой, с которой ΛΌΛΜΤ§13 связывается и из которой он впоследствии элюируется.

(а) Предварительное обогащение ультрафильтрацией/диафильтрацией (ИР/ΌΡ).

На необязательной стадии предварительного обогащения ΆΌΆΜΤ§13 в образце концентрируют с помощью предварительного обогащения ультрафильтрацией, и обмен буфера образца осуществляют с помощью диафильтрации. Стадию предварительного обогащения ультрафильтрацией/диафильтрацией обычно выполняют перед обогащением ΆΌΆΜΤ§13 хроматографией с использованием гидроксиапатита или тандемной хроматографией с использованием гидроксиапатита, и последующим использованием смолы со смешанным принципом работы на основе катионообмена/гидрофобных взаимодействий, описанной выше. Стадию предварительного обогащения ультрафильтрацией/диафильтрацией обычно выполняют перед любым предварительным обогащением анионообменной хроматографией (в случае ее выполнения). Стадия предварительного обогащения ультрафильтрацией/диафильтрацией (ИР/ΌΡ) может быть эффективна при удалении низкомолекулярных компонентов, например низкомолекулярных компонентов сред для культивирования клеток. Такие компоненты могут связываться с последовательной хроматографической колонкой и уменьшать производительность колонки в отношении ΛΌΆΜΤ§13.

Соответственно, предварительное обогащение ИР/ΌΡ может оптимизировать загрузку для стадий хроматографии впоследствии. В одном варианте осуществления компоненты с низкой молекулярной массой ниже примерно 30 кДа удаляются или по меньшей мере их существенная часть. В некоторых вариантах осуществления удаленными (или по существу удаленными) низкомолекулярными компонентами являются компоненты ниже приблизительно 60 кДа, ниже приблизительно 55 кДа, ниже приблизительно 50 кДа, ниже приблизительно 45 кДа, ниже приблизительно 40 кДа, ниже приблизительно 35 кДа, ниже приблизительно 30 кДа, ниже приблизительно 25 кДа, ниже приблизительно 20 кДа и т.д.

Стадия предварительного обогащения ультрафильтрацией/диафильтрацией также используется в

- 12 023783 некоторых вариантах осуществления, чтобы перевести ΑΏΑΜΤδ13 в соответствующий буферный раствор для последующей обработки и/или дополнительного концентрирования образца. В одном варианте осуществления соответствующим буферным раствором является буфер с низкой проводимостью, подходящий для предварительного обогащения анионообменной хроматографией, если такая анионообменная хроматография должна проводиться. Например, буфер с низкой проводимостью будет иметь проводимость, составляющую менее приблизительно 10 мСм/см, например приблизительно от 7 до приблизительно 8 мСм/см, например 7 мСм/см при комнатной температуре, и может иметь рН, равный или превышающий приблизительно 7,0.

В другом варианте осуществления соответствующим буферным раствором является буфер, подходящий для обогащения хроматографией с использованием гидроксиапатита, за которой может следовать хроматография на смоле со смешанным принципом работы на основе катионообмена/гидрофобных взаимодействий. Например, буфер для обогащения может включать 20 мМ Να/Κ ΡΟ₄ и иметь рН, равный приблизительно 7, при комнатной температуре. В другом варианте осуществления соответствующий буферный раствор также включает ионы кальция и/или цинка, любой или оба из которых стабилизируют белок ΑΏΑΜΤδ13. В одном варианте осуществления соответствующий буферный раствор включает ионы кальция в концентрациях, составляющих менее приблизительно 10 мМ, например 2 мМ. В другом варианте осуществления соответствующий буферный раствор дополнен ионами цинка в концентрации, составляющей менее приблизительно 50 мкМ, например 5 мкМ.

В некоторых вариантах осуществления соответствующий буферный раствор включает буферирующий агент, который обладает буферирующей способностью в растворах с рН, равным или превышающим приблизительно 7,0. В одном варианте осуществления буферирующий агент выбирают из группы, состоящей из фосфата, трис, ΗΕΡΕδ, имидазола, гистидина, ΜΕδ, цитрата, 01у-01у, Трис-ацетата и т.д.

Образец, полученный после этой стадии предварительного обогащения υΡ/ΏΡ, может быть использован на последующих стадиях очистки, например, образцом может быть концентрированный с помощью υΡ/ΏΡ пул, включающий белки клеток-хозяев, удаляемые с помощью хроматографии с использованием гидроксиапатита или хроматографии с использованием гидроксиапатита с последующей хроматографией со смолой со смешанным принципом работы на основе катионообмена/гидрофобных взаимодействий. В некоторых вариантах осуществления образец после стадии предварительного обогащения υΡ/ΌΡ концентрируют приблизительно в 10 раз до приблизительно 20 раз, например приблизительно в 15 раз, по сравнению с образцом до стадии предварительного обогащения υΡ/ΏΡ.

(Ь) Предварительное обогащение анионообменной хроматографией.

Другая необязательная стадия предварительного обогащения включает предварительное обогащение хроматографией, которая может проводиться перед обогащением ΑΏΑΜΤ813 посредством хроматографии с использованием гидроксиапатита или тандемной хроматографии с использованием гидроксиапатита и затем смолы со смешанным принципом работы на основе катионообмена/гидрофобных взаимодействий. Специалисту в данной области будет понятно, что предварительное обогащение хроматографией может проводиться после необязательной стадии предварительного обогащения ультрафильтрацией/диафильтрацией. Альтернативно, предварительное обогащение хроматографией можно проводить как таковое, т.е. без необязательной стадии предварительного обогащения ультрафильтрацией/диафильтрацией.

В некоторых вариантах осуществления стадия предварительного обогащения хроматографией включает приведение образца, включающего Λ^ΛΜΤδ13. хроматографически в контакт с анионообменной смолой и элюирование белка ΑΏΑΜΤδ13 из анионообменной смолы. Т.е. ΑΏΑΜΤ813 связывают с анионообменной смолой и впоследствии элюируют из нее. Используемый в данном описании термин анионообменная смола относится к любой смоле, подходящей для анионообменной хроматографии и имеющей результирующий положительный заряд, например из-за положительно заряженной группы (при нейтральном рН). Примеры включают, но без ограничения, диэтиламиноэтан (ΏΕΑΕ), диметилэтаноламин (ΏΜΑΕ), полиэтиленимин (ΡΕΙ), четвертичный аминоэтан (ΟΑΕ). триметиламиноэтил (ТМАЕ), четвертичный аммоний (О) и т.п., и их комбинации.

В одном варианте осуществления анионообменная смола также обладает одним или несколькими следующими свойствами: большой размер пор, режим перфузионного потока и режим конвективного потока. Неограничивающие примеры коммерчески доступных анионообменных смол, которые могут использоваться на стадии предварительного обогащения, описанной в данном описании, включают О-5срйаго5С Ρ;·ΐ5ΐ Ρ1ο\ν (ΟΕ НеаИЪсате, Р^саЕпуау, N1), ΑΝΧ-δορΙκ-ποδο Еа51 Ρ1ο\ν с узким диапазоном разделения (ΟΕ НеаНЪсате), ΏΕΑΕ-δΌρΗητοκΌ Ρακί Ρ1ο^ (ΟΕ НеаНЪсате), ^ΕΑΕ-Τοуορеа^1 (Τοκοΐι Вюкаепсе ЬЬС, Огоуе СЬу, ΟΗ), ^ΑΕ-Τοуορеа^1 (Τοκοΐι Вюкаепсе ЬЬС), ΡΟΡΟδ®® О (Αρρ1ΐΌά В1окук!етк, Ροκϊότ СПу, СΑ), ΡΟΡΟδ® 50Ώ (ΑρρΙίΌά В1окук!етк), ΡΟΚΌδ® 50ΡΙ (ΑρρΙίΌά В1окук!етк), конвективно взаимодействующие среды (ΟΜ®; ΡΙΑ δеρа^аί^οп), Ρ^асΐοде1-^ΜΑΕ (0?;·ιρίΙο1 δс^епι^Γ^с 1пс., Αυκίίη, ΤΧ), Ρπιαοде1 ΕΜΏ-ΤΜΑΕ (Τ.’;·ιρίΙ;·ι1 δαΌΗΐίΓχ 1пс., Αυκίίη, ΤΧ), Μ;·ιΙιό\ Се11ийпе ΏΕΑΕ (СЫкко Сощ., Руе, ΝΥ) и т.п.

Во время предварительного обогащения анионообменной хроматографией ΑΏΑΜΤδ13 связывается с анионообменной смолой и отделяется от не являющихся ΑΏΑΜΤδ13 примесей (например, компонен- 13 023783 тов клеток-хозяев, которые могут присутствовать в концентрированном с помощью используемого перед обогащением ИР/ЛР пуле). Как правило, анионообменная смола абсорбирует белок АЛАМТ813, в то время как не являющиеся АЛАМТ813 примеси с изоэлектрическими точками, превышающими рабочий рН, удаляются из технологической цепи в результате протекания через анионообменную колонку. Не являющиеся АЛАМТ813 примеси с изоэлектрическим точками, которые ниже рабочего рН, связываются сильнее, предпочтительно намного сильнее, со смолой, так что они предпочтительно не элюируются вместе с белком АЛАМТ813. Перед элюированием колонку, на которой абсорбирован АЛАМТ813, затем промывают, например для удаления слабосвязанных примесей или загрязнений и/или для подгонки проводимости буфера в препарате к элюированию. Как правило, связанный АЛАМТ813 элюируют из анионообменной смолы путем увеличения ионной силы буфера. В одном варианте осуществления АЛАМТ813 элюируют ступенчатым элюированием. Как правило, вводимый образец и буфер для промывки имеют рН приблизительно от 7 до приблизительно 9, например 7,7, и проводимость приблизительно менее 10 мСм/см (например, 6,5 мСм/см) при комнатной температуре. Буфер(ы) для элюирования может иметь рН, составляющий приблизительно от 6 до приблизительно 9 (например, 7), и иметь проводимость, больше приблизительно 10 мСм/см (например, 16,5 мСм/см) при комнатной температуре.

Как правило, элюат выходит со стадии анионообменной хроматографии с активностью, составляющей приблизительно от 60 до приблизительно 120% активности АЛАМТ813 (например, составляющей приблизительно от 70 или приблизительно 80 до приблизительно 107% активности АЛАМТ813) и/или включает рекомбинантный АЛАМТ813 с чистотой, составляющей приблизительно от 20 до приблизительно 70%, (например, с чистотой, составляющей приблизительно 30%, приблизительно 40%, приблизительно 50%, приблизительно 60% и т.д.). В одном варианте осуществления анионообменная хроматография уменьшает количество не являющихся АЛАМТ813 примесей приблизительно в 2 раза до приблизительно 5 раз. В предпочтительном варианте осуществления процентный выход после подготовки к обогащению может составлять приблизительно 75%.

Концентрацию элюированного АЛАМТ813 можно затем повысить, подвергая образец хроматографии с использованием гидроксиапатита, обеспечивающей протекание существенной части белка АЛАМТ813, или подвергая образец тандемной хроматографии с использованием гидроксиапатита в условиях, обеспечивающих протекание существенной части белка АЛАМТ813, с последующей хроматографией с использованием смолы со смешанным принципом работы на основе катионообмена/гидрофобных взаимодействий, которая связывает АЛАМТ813, как описано выше.

Инактивация вирусов.

Специалисту в данной области будет понятно, что способы инактивации вирусов могут быть, в частности, полезны при очистке рекомбинантного АЛАМТ813 из образцов, которые включают или возможно включают загрязнения вирусами (примеси, являющиеся следствием присутствия и/или происходящие из вируса, включающие, например, вирусные частицы, вирусный белок, вирусную ДНК, вирусную РНК или их фрагменты). Соответственно, в одном варианте осуществления, описываемый в данном описании способ дополнительно включает по меньшей мере одну стадию инактивации вирусов. Термин инактивация вирусов относится либо к ситуация, когда вирусы остаются в растворе, но являются дезактивированными или инактивированными (например, нежизнеспособными, например в результате растворения липидной оболочки вирусов с липидной оболочкой); или к физическому удалению вирусов и/или загрязнений вирусами из образца (например, с помощью гель-фильтрации), либо к тому и другому. Таким образом, в контексте представленного в данном описании описания инактивация вирусов относится либо к вирусной дезактивации или к удалению вирусов, либо к тому и другому.

В случае проведения инактивация вирусов она может иметь место один раз или более чем один раз на протяжении всего процесса очистки. Кроме того, она может иметь место перед или после подвергания образца хроматографии с использованием гидроксиапатита. В некоторых вариантах осуществления инактивация вирусов имеет место перед и после необязательной стадии доочистки с помощью катионообменной хроматографии, описанной более подробно ниже. Однако специалисту в данной области будет понятно, что инактивация вирусов может необязательно иметь место, если вообще проводится, на любой стадии во время процесса очистки. Кроме того, специалист в данной области сможет определить подходящее время для инактивации вирусов.

Способы приведения вирусов с липидными оболочками в нежизнеспособное состояние широко известны в данной области техники. Как правило, способы дезактивации (или инактивации) вирусов с липидными оболочками в образце включают добавление смеси растворитель-детергент к образцу (см., например, Е0\\аг05. е1 а1. (1987) Тг1(п-Ьи1у1) рНо5рНа1е/бе1егдеп1 (геаПпеШ о£ Бсепкей ШегареиБс апб ехрептеп1а1 Ь1оой БепуаБуек Уох 8ап§ 52: 53-59 (особенно см. стр. 54-55); и патент США 4540573 (со строки 9 в колонке 7 до строки 42 в колонке 12); 4764369 (со строки 17 в колонке 7 до строки 47 в колонке 12); 4939176 (со строки 59 в колонке 3 до строки 14 в колонке 10); 5151499 (со строки 59 в колонке 2 до строки 38 в колонке 11); 6090599 (со строки 20 в колонке 4 до строки 67 в колонке 8); 6468733 (со строки 12 в колонке 5 до строки 36 в колонке 9); и 6881573 (со строки 63 в колонке 5 до строки 9 в колонке 14); все из которых включены в данное описание посредством ссылки). Комбинация растворитель-детергент, используемая для дезактивации вирусов с липидными оболочками, может быть любой комбинацией рас- 14 023783 творитель-детергент, известной в данной области техники, и предпочтительно включает неионный детергент и органический растворитель. Неограничивающие примеры включают три-н-бутилфосфат (ТпВР) и ΤΚΙΤΟΝ Х-100™, а также ΤνΕΕΝ 80™ (ί'Αδ 9005-65-6), полиоксиэтиленсорбитанмоноолеат, холат натрия и т.п. Концентрации растворителя(ей) и/или детергента(ов) могут быть такими, как обычно используются в данной области техники, например больше чем приблизительно 0,1% ΤηΒΡ и больше чем приблизительно 0,1% ΤΚΙΤΟΝ Х-100™.

В некоторых вариантах осуществления условия, при которых смесь растворитель-детергент инактивирует вирусы, включают приблизительно от 10 до приблизительно 100 мг/мл растворителядетергента, при уровне рН в диапазоне приблизительно от 5 до приблизительно 8 и температуре в диапазоне приблизительно от 2 до приблизительно 37°С, предпочтительно приблизительно от 12 до приблизительно 25°С, в течение приблизительно от 30 мин до приблизительно 24 ч, предпочтительно приблизительно от 30 мин до приблизительно 1 ч. В некоторых вариантах осуществления смесь слегка встряхивают или перемешивают во время обработки. В одном варианте осуществления стадия инактивации вирусов включает добавление смеси растворитель-детергент (например, в виде смеси растворительдетергент, включающей 0,3% ΤηΒΡ, 1% ΤΚΙΤΟΝ Х-100™ и 0,3% ΤνΕΕΝ 80™) к образцу по меньшей мере на 1 ч при 15-25°С. В другом варианте осуществления образец обрабатывают смесью растворительдетергент, включающей 0,3% ΤηΒΡ, 1% ΤΚΙΤΟΝ Х-100™ и 0,3% ΤνΕΕΝ 80™, в течение 30 мин при 12-16°С. Как будет понятно специалисту в данной области техники, могут использоваться другие комбинации растворитель-детергент и/или подходящие условия, такие как комбинации полисорбата или холата и три-н-бутилфосфата. В случае таких комбинаций может потребоваться более длительный период времени обработки, например 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ч или дольше.

Инактивацию можно осуществлять любым способом, известным в данной области техники. Например, инактивацию можно остановить путем разбавления, предпочтительно разбавления холодным буфером для разбавления. Например, в некоторых вариантах осуществления, инактивацию останавливают разбавлением одним объемом холодного буфера для разбавления, включающего приблизительно 20 мМ ΜΕδ и имеющего рН приблизительно 6 при комнатной температуре.

После дезактивации вирусов с липидными оболочками с помощью комбинации растворительдетергент смесь растворитель-детергент можно удалить. Например, смесь растворитель-детергент можно удалить посредством хроматографии или другого подходящего способа. В некоторых вариантах осуществления используют хроматографию с использованием смолы для удаления растворителя-детергента (δΌΚ), такой как, например, смола НурегИ™ (Вюкерга Ιηο., ΜΑ) (см., например, патент США 6468733 (со строки 12 в колонке 5 до строки 36 в колонке 9), который включен в данное описание во всей его полноте посредством ссылки).

Инактивация загрязнений вирусами при иммобилизации белка.

В некоторых вариантах осуществления инактивация вирусов включает дезактивацию вирусов с помощью смеси растворитель-детергент, когда белок иммобилизован. Такая процедура может использоваться при вирусной инактивации для полипептида ΑΟΑΜΤδ13, описанного в данном описании, а также других белков. Другие белки могут включать, но без ограничения, любой белок или биологическую молекулу из источника, который может быть загрязнен вирусами, включающего белки иммунной системы (антитела, моноклональные антитела, гибридные белки, слитые с Рс-фрагментом белки, основные антигены гистосовместимости, Т-клеточный рецептор), ферменты (оксидоредуктазы, трансферазы, гидролазы, лиазы, изомеразы, лигазы), структурные белки, фибриллярные белки (такие как белки цитоскелета, подобные актину, Лгр2/3, коронину, дистрофину, кератину, миозину, спектину, белку Τаи, тубулину, и белки экстраклеточного матрикса, подобные коллагену, эластину, Р-спондину), глобулярные белки, белки плазмы (сывороточный альбумин и сывороточный амилоидный Р), факторы свертывания (подобные белкам комплемента, фактору УШ, фактору ΧΙΙΙ, фибрину, белку С, белку δ, белку Ζ, родственному белку Ζ ингибитора протеазы, тромбину, фактору Виллебранда), С-реактивный белок, гемопротеины, белки клеточной адгезии (кадгерин, эпендимин, интегрин, Ν0ΑΜ, селектин), осуществляющие трансмембранный перенос белки (ΟΡΤΚ, гликофорин Ό, скрамблазу), ионные каналы (являющийся рецептором ацетилхолина калиевый канал), осуществляющие синпорт/антипорт белки (переносчик глюкозы), гормоны и факторы роста (эпидермальный фактор роста, инсулин, инсулиноподобный фактор роста, окситоцин), рецепторы (трансмембранные рецепторы, сопряженные с О-белком рецепторы, родопсин, внутриклеточные рецепторы, подобные рецептору эстрогена), ДНК-связывающие белки (гистоны), белки для регуляции транскрипции (с-тус ΡΟΧΡ2, ΡΟΧΡ3, ЫуоИ, р53), осуществляющие запас/перенос питательных веществ белки (ферритин), белки теплового шока, макромолекулярные комплексы (нуклеосому, рибонуклеопротеин, частицу распознавания сигнала, спайсому) и т.п. В предпочтительных вариантах осуществления белком является рекомбинантный белок, в частности белки, подверженные агрегации, когда подвергнуты воздействию органических растворителей и детергентов. В некоторых вариантах осуществления белком является белок Л^ЛΜΤδ13. в частности, рекомбинантный ΑΒΑΜΤδ13, или отличный белок (в частности, отличный рекомбинантный белок). В некоторых вариантах осуществления рекомбинантным белком является фактор свертывания крови. В некоторых вариантах осуществления белком являет- 15 023783 ся, например, один или несколько из следующих белков: фактора VIII, фактора II, тромбина, фактора νΠα. фактора IX, фактора Виллебранда, антител против ΜΓΡ и, в частности, белков, поддающихся хроматографической очистке, и/или белков, чувствительных к обработке смесью растворитель-детергент. Соответственно, другой аспект настоящего изобретения направлен на инактивацию вирусов, когда белок иммобилизован. Предпочтительно инактивацию вирусов выполняют совместно с процедурой очистки белка, так что эта процедура включает инактивацию вирусов в препарате белка при иммобилизации белка, подвергаемого очистке.

Общепринятая стадия инактивации вирусов с использованием смеси растворитель-детергент, применяемая в последующих способах очистки различных белков, таких как белки, описанные выше, как правило, включает добавление смеси растворитель-детергент в растворе к образцу, подвергаемому очистке, например в периодическом способе. В периодическом способе образец, включающий белок, обрабатывают смесью растворитель-детергент (например, смесью, включающей приблизительно 1% Τήΐοη X100, приблизительно 0,3% три-н-бутилфосфата и приблизительно 0,3% полисорбата 80) в сосуде с перемешиванием (например, баке для крупномасштабных очисток). После растворения химических веществ растворителя-детергента, подвергнутый обработке раствор образца можно перекачать во второй сосуд с перемешиванием, в котором в действительности происходит фактическая инактивация вирусов, поскольку здесь инкубируют раствор белка для обеспечения того, чтобы такая дезактивация имела место (например, в течение приблизительно от 30 мин до приблизительно 1 ч).

Напротив, некоторые варианты осуществления настоящего изобретения включают инактивацию вирусов в композиции, содержащей белок, например подвергаемый очистке белок, когда белок иммобилизован. Данный способ включает приведение композиции, содержащей представляющей интерес белок, в контакт со смесью растворитель-детергент, когда белок иммобилизован, в отличие от целевого белка, находящегося в растворе. В предпочтительных вариантах осуществления белок иммобилизован на хроматографической смоле. Инактивацию вирусов, когда белок иммобилизован на хроматографической смоле, например хроматографической колонке, называют в данном описании инактивацией вирусов на колонке. Очистка ΑΟΑΜΤ§13 на Рогоз 8, описанная в примерах ниже, обеспечивает один вариант осуществления этого способа, когда инактивацию вирусов осуществляют на колонке. Специалисту в данной области техники будет понятно, что белок можно иммобилизовать на различных носителях, различными способами. Например, белок можно связать с любым твердым или полутвердым носителем, включая предметное стекло, гранулы, матрицу или мембраны. Иммобилизация может происходить вследствие любого процесса, с помощью которого белок закрепляется на носителе относительно других компонентов раствора белка. Иммобилизация может возникать вследствие образования одного или нескольких типов связей между группами на носителе и группами белка, таких как, например, ковалентная связь, водородные связи, электростатические взаимодействия, силы Ван-дер-Ваальса и т.п., или их комбинации.

Инактивация вирусов при иммобилизации белка на хроматографической колонке может упростить очистку. Например, вместо необходимости использования более одного сосуда (например, системы из двух баков, используемой при крупномасштабных очистках), хроматографическая очистка и инактивация вирусов могут выполняться в одном и том же сосуде, например на одной и той же хроматографической колонке. Это упрощает последующие процессы очистки белка, например сокращая время, сберегая реагенты и/или увеличивая эффективность. В некоторых вариантах осуществления хроматографическая колонка содержит катионообменную смолу. В некоторых вариантах осуществления хроматографическая колонка содержит анионообменную смолу.

Дополнительным и неожиданным преимуществом определенных вариантов осуществления инактивации вирусов при иммобилизации белка является уменьшение образования агрегатов. Некоторые белки демонстрируют чувствительность к смесям растворитель-детергент, например подверженность образованию агрегатов после приведения в контакт с реагентами растворителем-детергентом в растворе. Без ограничения конкретной теорией или гипотезой, приведение в контакт со смесью растворительдетергент чувствительного белка, когда он иммобилизован, например когда белок связан с хроматографической смолой, может предотвратить образование агрегатов просто на основе физической неспособности иммобилизованных молекул белка к контакту друг с другом. В некоторых вариантах осуществления инактивация приводит к образованию менее чем приблизительно 20% агрегатов, менее чем приблизительно 18%, менее чем приблизительно 15%, менее чем приблизительно 12%, менее чем приблизительно 10% или менее чем приблизительно 5% агрегатов. И в определенных вариантах осуществления уровень агрегации снижается по меньшей мере приблизительно на 10%, приблизительно на 20%, приблизительно на 50% или приблизительно на 100% уровня агрегации, когда препарат белка подвергают инактивации вирусов, когда белок не иммобилизован.

В одном предпочтительном варианте осуществления белок загружают на хроматографическую смолу, и обработку смесью растворитель-детергент используют в виде стадии промывки, предпочтительно стадии промывки, которая длится в течение достаточно долгого периода инкубация, чтобы обеспечить инактивацию вирусов с липидными оболочками. Например, предпочтительно стадия промывки длится в течение приблизительно от 30 мин до приблизительно 1 ч. Смесь растворитель-детергент будет

- 16 023783 включать неионный детергент и органический растворитель в концентрациях, подходящих для осуществления такой инактивации вирусов, как описано выше. Например, в некоторых вариантах осуществления смесь растворитель-детергент включает 1% Τήΐοη Х-100, 0,3% три-н-бутилфосфата и 0,3% полисорбата 80. Ниже представлены дополнительные подробности в отношении некоторых конкретных вариантов осуществления, что касается очистки ΑΌΑΜΤδ13.

Инактивация вирусов может также включать удаление вирусов, например, посредством фильтрации, такой как нанофильтрация с использованием нанофильтра. Такое удаление вирусов может иметь место само по себе или в комбинации с дезактивацией (инактивацией) вирусов, например стадией дезактивации вирусов, включающей обработку смесью растворитель-детергент, как описано выше. Когда инактивация вирусов включает как дезактивацию вирусов, так и удаление вирусов, удаление вирусов может иметь место перед и/или после дезактивации вирусов обработкой смесью растворитель-детергент. Как правило, удаление вирусов из образца включает фильтрацию образца, например пропускание образца через фильтр с размером пор, который удерживает ΑΌΑΜΤ813 в образце, обеспечивая прохождение вирусов и вирусных загрязнений. В одном варианте осуществления размер пор фильтра составляет приблизительно от 15 до приблизительно 50 нм. Фильтрацию можно также осуществить нанофильтрацией, используя фильтры 20 N или 35 N (Р1апоуа, Αδαό| Ка§е1). В некоторых вариантах осуществления используют предфильтры для предотвращения забивания нанофильтра, например можно использовать фильтр приблизительно 2 мкм, или 0,2 мкм РУИР, или РЕ§ мембрану.

Доочистка с помощью катионообменной хроматографии.

В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает, после хроматографии с использованием гидроксиапатита (или тандемной хроматографии с использованием гидроксиапатита и затем смолы со смешанным принципом работы на основе катионообмена/гидрофобных взаимодействий), необязательную стадию доочистки образца, включающего ΑΌΑΜΤ13, с помощью хроматографии на катионообменной смоле. На этой стадии перед доочисткой можно снизить, в случае необходимости, проводимость буфера, включающего ΑΌΑΜΤ813, для достижения проводимости, подходящей для катионообменной хроматографии.

(а) Снижение проводимости буфера.

После хроматографии с использованием гидроксиапатита или тандемной хроматографии с использованием гидроксиапатита и затем смолы со смешанным принципом работы на основе катионообмена/гидрофобных взаимодействий буфер, включающий белок ΑΌΑΜΤ813, можно подготовить к катионообмену путем снижения проводимости буфера, например удалением ионных компонентов (например, хлорида натрия). В некоторых вариантах осуществления проводимость буфера снижают менее чем приблизительно до 5 мСм/см, и/или рН снижают приблизительно до 6,0. Проводимость буфера можно снизить с помощью любого способа, который известен в данной области техники, описан в данном описании или может оценить специалист в данной области техники, особенно с учетом приведенных в данном описании сообщений. Неограничивающие примеры включают ультрафильтрацию/диафильтрацию (например, с использованием кассет с поперечным потоком или модулей из полых волокон), гельфильтрацию, диализ и т.д.

В одном варианте осуществления белок ΑΌΑΜΤ813 подготавливают к катионообмену посредством ультрафильтрации/диафильтрации с использованием мембраны с отсечкой, составляющей приблизительно 10 кДа, в обмен на буфер для уравновешивания катионообменной смолы (например, буфер, включающий 20 мМ ΜΕδ, рН 6,0 при комнатной температуре). В некоторых вариантах осуществления мембраной для ультрафильтрации/диафильтрации является РΕδ мембрана с отсечкой, составляющей приблизительно от 10 до приблизительно 50 кДа, например приблизительно 20 кДа, приблизительно 30 кДа, приблизительно 40 кДа и т.д. Используя такой подход, рН буфера можно снизить приблизительно с 8,0 до приблизительно 6,0; и/или проводимость буфера можно снизить меньше чем приблизительно до 2 мСм/см при комнатной температуре. В некоторых таких вариантах осуществления буфер для диафильтрации может включать 20 мМ ΜΕδ и может иметь рН, равный 6,0 при комнатной температуре, и/или проводимость, составляющую 0,6 мСм/см при комнатной температуре. В некоторых вариантах осуществления проводимость буфера для диафильтрации может быть равной или по существу равной проводимости используемого буфера для уравновешивания катионообменной смолы.

В одном варианте осуществления подготовку буфера, включающего ΑΌΑΜΤδ13, к катионообмену проводят посредством диализа, например используя оборудование для диализатора, включающее модули для гемодиализа, такие как модуль для гемодиализа из полых волокон (серии Α^иатаx, РΕδ химия полых волокон, ЕфуагЬх Ьйекаепсек, ИтегксЫеШеш, Германия). Как правило, для приблизительно 5 л образца используют фильтр с площадью, составляющей приблизительно 2 м²; и буфер образца и буфер для диализа проходят в противотоке относительно друг друга. В некоторых вариантах осуществления диализ состоит не более чем из двух прохождений через один модуль для диализа. Под одним модулем для диализа подразумевают один элемент или структура, через который осуществляется диализ. Модуль для диализа обычно включает пакет с открытыми концами из мембраны с полыми волокнами, помещаемый в корпус в виде трубки для создания двух различных проточных камер, полостной и экстракапиллярной, каждая с доступом для входа и выхода. Полупроницаемая мембрана с полыми волокнами разделяет две

- 17 023783 камеры и дает возможность избирательного прохождения на основе размера и градиента концентрации растворенных веществ, ограничивая, при этом, прохождение других растворенных веществ между 2 камерами. При работе модуля в противоточном режиме растворенные вещества, проходящие через мембрану, быстро смываются и растворяются в большом объеме раствора диализата (смыв), поддерживая наибольший из возможных градиент концентрации. Соответственно, диализ может быть проведен в один смыв при прохождении через один модуль для диализа.

В некоторых вариантах осуществления используют комбинацию этих подходов, например, ИР/ЭР с диализом можно использовать для концентрирования образца и буферного обмена в препарате для доочистки катионообменной хроматографией. В еще одних вариантах осуществления буферный обмен можно проводить с помощью анионообменной хроматографии.

(Ь) Катионообменная хроматография.

Как указано выше, описываемый в данном описании способ может необязательно включать доочистку образца с помощью хроматографии на катионообменной смоле. Используемый в данном описании термин катионообменная смола относится к любой смоле, которая подходит для катионообменной хроматографии и которая имеет результирующий отрицательный заряд, например из-за присутствия отрицательно заряженной группы (при нейтральном рН). Примеры включают, но без ограничения, карбоксильную группу, карбоксиметильную (СМ) группу, сульфоалкильную группу (8Р, 8Е), метилсульфонатную (8) группу, сульфатированный эфир целлюлозы, гепарин и т.п., и их комбинации. Эта стадия, как правило, предназначена для концентрирования продукта АЭАМТ813, включения продукта в буфер для предварительного составления и дальнейшего уменьшения количества не являющихся АЭАМТ813 примесей, включая связанные с процессом примеси (например, белков клеток-хозяев, таких как белки клеток СНО, ДНК клеток-хозяев, такой как ДНК клеток СНО, реагентов смеси растворитель-детергент и т.д.), а также связанные с продуктом примесей (например, агрегатов и не являющихся биологически активными фрагментов АЭАМТ813).

В одном варианте осуществления катионообменная смола также обладает одним или несколькими следующими свойствами: большой размер пор, режим перфузионного потока и режим конвективного потока. Неограничивающие примеры коммерчески доступных катионообменных смол, которые могут использоваться на описываемой в данном описании стадии доочистки, включают РОК.О8® 8 (ЛррЬей ВювуМств). среды для взаимодействий с режимом конвективного потока (СХМ®; ΒΙΑ ЗерагаЬтоп), ТоуореаП Схдасар 3 (ТоеоЪ Вхозсхепсе, Моп£дотегуН11е, РА), ТоуореаП Схдасар СМ (ТозоЬ), Тоуореаг1 ЗР (ТозоЬа), Тоуореаг1 СМ (ТозоЬ), МасгоРгер 3 (Вд.о-га<3, Негсч1ез, СА) , ШОзрЬегеЗ (В1о-га<1. Негси1ев, СА) ,

МасгоргерСМ ( (В1О-га<1, Негси1ез, СА) , Ргас£оде1 ЕМВ 30, (Мегск) , РгасЬоде1 ЕМО СОО (Мегск) , РгасЬоде! ЕМО ЗЕ Шсар (Мегск), Се11и£те Зи1£а£е (СЬгззо), СМ и ЗР Тг1засгу1 <Ра11),

СМ и 3 НурегР (Ра11), МизСапд 3 (Ра11), 3 и СМ ЗерЬагозе СЬ (СЕ Неа1СЬсаге) , 3 и СМ ЗерЬагозе РР (СЕ НеаЮЬсаге) , 3 и СМ САРТО™ (СЕ Неа1ьЬсаге> , МопоЗ (СЕ Неа1£Ьсаге) , Зоигсе 3 (СЕ Неа1ьЬсаге) и т.п.

Хроматография на катионообменной смоле является известным в данной области техники способом. В некоторых вариантах осуществления максимальная загрузка на катионообменную колонку составляет приблизительно от 0,2 до приблизительно 0,5 мг ЛОЛМТ813/мл. В предпочтительном варианте осуществления в колонку вводят по меньшей мере 0,3 мг ЛВЛМТ813/мл. Как правило, во время хроматографии на катионообменной смоле АЭАМТ813 связывается с катионообменной смолой, и буферу и определенным примесям обеспечивается протекание. Колонку, на которой абсорбирован АЭАМТ813, затем промывают, например для удаления слабосвязанных загрязнений или примесей и/или для доведения буфера в препарате для элюирования АЭАМТ813 из катионообменной смолы. Затем АЭАМТ813 можно подвергнуть элюированию в элюате.

В некоторых вариантах осуществления элюат, полученный на стадии катионообменной хроматографии, содержит большее количество агрегатов АЭАМТ813, чем желательно. В некоторых вариантах осуществления, например, элюат включает более чем приблизительно 15% агрегатов, которые, как полагают, привносятся после стадии концентрирования и буферного обмена с использованием диализатора и/или стадии катионообменной хроматографии.

Для обеспечения получения АЭАМТ813 по существу с пониженным процентным содержанием агрегатов при использовании катионообменной смолы можно использовать определенные условия, детализированные ниже на фиг. 2 в отношении катионообменной смолы Рогов 8. Например, в некоторых вариантах осуществления используют комбинацию, включающую очистку катионообменной хроматографией с последующей инактивацией вирусов смесью растворитель-детергент на колонке, например, как описа- 18 023783 но более подробно выше. Эта комбинация предпочтительно приводит к уменьшенному количеству агрегатов, возникающих при использовании полипептида А^ΛΜΤБ13, в элюате. В более предпочтительных вариантах осуществления процедура элюирования включает градиентное элюирование (но не ступенчатое элюирование), которое может дополнительно удалить агрегаты Λ^ΛΜΤБ13, например в нисходящей части пика элюирования. Даже в более предпочтительных вариантах осуществления концентрация Ъуееп 80 в буфере для элюирования больше чем приблизительно 0,05%, например, составляет приблизительно 0,06%, приблизительно 0,07%, приблизительно 0,08%, приблизительно 0,09%, предпочтительно приблизительно 0,1%, приблизительно 0,11%, приблизительно 0,12%, приблизительно 0,13%, приблизительно 0,14% или приблизительно 0,15%. Полагают, что повышенная концентрация оказывает дополнительный стабилизирующий эффект на А^ΛΜΤБ13, дополнительно предотвращая образование высокомолекулярных структур во время элюирования Λ^ΛΜΤБ13 из смолы. Под стабилизацией белка А^АΜΤБ13 или стабилизирующим эффектом на Λ^ΛΜΤБ13 подразумевают стремление поддерживать природную структуру А^ΛΜΤБ13, особенно, в интактной и/или мономерной форме, или по существу интактной и/или мономерной форме, отличной от фрагментированной или агрегированной формы. Стабилизация может также относиться к стремлению полученного А^ΛΜΤБ13 не поддаваться фрагментации, утрате природной структуры и/или агрегации, несмотря на иные дестабилизирующие условия, такие как изменяющиеся температуры, изменяющиеся рН, ионные силы и т.п.

Белок Λ^ΛΜΤБ13 также может быть стабилизирован используемой во время сбора матрицей, например, когда инактивацию вирусов обработкой смесью растворитель-детергент проводят на концентрированном сборе. Кроме того, агрегаты, которые действительно образуются, можно удалить на последующих стадиях очистки, таких как ввод в анионообменную хроматографическую колонку (такую как АЫХ Бербагоке, описанную в данном описании); и/или доочистка с помощью хроматографии (такой как тандемная хроматография с использованием гидроксиапатита/Сар!о ММС, описанная в данном описании).

Использование одной или нескольких модификаций, описанных выше, может привести к элюату, включающему меньшее количество агрегатов полипептида А^ΛΜΤБ13. Например, в предпочтительных вариантах осуществления элюат из катионообменной колонки может включать менее чем приблизительно 20%, менее чем приблизительно 18%, менее чем приблизительно 15%, менее чем приблизительно 12%, менее чем приблизительно 10% или менее чем приблизительно 5% агрегатов.

Конечная стадия при хроматографии на катионообменной смоле включает элюирование белка Λ^ΛΜΤБ13 с помощью буфера для элюирования. В некоторых вариантах осуществления связанный Λ^ΛΜΤБ13 элюируют из катионообменной смолы путем увеличения ионной силы буфера. Включающий А^ΛΜΤБ13 буфер, используемый для приведения в хроматографический контакт с катионообменной смолой, обычно имеет проводимость, составляющую менее чем приблизительно 10 мСм/см при комнатной температуре, например, менее чем 5 мСм/см. Кроме того, включающий А^ΛΜΤБ13 буфер, используемый для приведения в хроматографический контакт с катионообменной смолой, обычно имеет рН, ниже, чем приблизительно 7,0, при комнатной температуре, например, равен 6,0. Буфер, используемый для элюирования белка Λ^ΛΜΤБ13 из катионообменной смолы, может обладать ионной силой, которая ниже ионной силы таких буферов. Смолу можно также промыть буфером, имеющим рН, равный или по существу равный рН буфера предназначенного для хранения.

В предпочтительном варианте осуществления белок А^ΛΜΤБ13 элюируют из катионообменной смолы с помощью буфера для хранения. Как правило, под буфером для хранения подразумевают буфер, имеющий рН приблизительно от 5 до приблизительно 9 при комнатной температуре и включающий кальций, буферирующее соединение и соль. рН буфера для хранения может быть выше приблизительно 7,0 (например, равняться приблизительно 7,5) при комнатной температуре. Буфер для хранения может включать менее чем приблизительно 10 мМ Са' (например, 2 мМ Са'); буферирующее соединение может быть выбрано из группы, состоящей из фосфата, Трис, ΗΕΡΕδ, гистидина, имидазола, 01у-01у, ΜΕδ, трицина, ацетата и т.п.; и соль может быть выбрана из группы, состоящей из ЫаС1, КС1, СаС1₂, Μ§Ο₂ и т.п. В предпочтительном варианте осуществления буфер для хранения имеет рН выше чем 7,0, и включает менее чем 10 мМ ионов кальция, буферирующее соединение и соль. В более предпочтительном варианте осуществления буфер для хранения дополнительно включает неионный детергент, например приблизительно от 0,01 до приблизительно 0,5% неионного детергента, например 0,05% неионного детергента. В даже более предпочтительных вариантах осуществления элюат не подвергают ни последующему концентрированию, ни стадии буферного обмена после элюирования из катионообменной смолы буфером для хранения.

В одном конкретном варианте осуществления в качестве катионообменной смолы на стадии доочистки используют Боигсе δ (ΟΕ беаИЪсаге), например колонку Боигсе Б с высотой слоя, составляющей приблизительно 20 см. В таких вариантах осуществления колонку можно активировать приблизительно 2 объемами колонки приблизительно 2 М ЫаС1 и уравновесить приблизительно 6 объемами колонки буфера, включающего приблизительно 20 мМ ΜΕδ, приблизительно 10 мМ ЫаС1 и приблизительно 2 мМ СаС1₂, с рН, равным приблизительно 6 при комнатной температуре. Включающий Λ^ΛΜΤБ13 буфер можно привести в контакт с колонкой при проводимости, которая ниже приблизительно 5 мСм/см при

- 19 023783 комнатной температуре, и впоследствии колонку промывают буфером для уравновешивания, и, наконец, собирают элюат, включающий белок ΛΌΛΜΤδ13. После сбора элюат может быть концентрирован и обменять буфер в буфер для хранения, например с помощью анионообменной хроматографии, диафильтрации, ультрафильтрации, диализа и т.п.

В другом конкретном варианте осуществления в качестве катионообменной смолы при доочистке образца, включающего белок ΑΌΑΜΤδ13, используют РОКО8® δ. В этом варианте осуществления включающий ΛΌΛΜΤδ13 буфер, используемый для приведения в хроматографический контакт с катионообменной смолой, может иметь проводимость, составляющую менее чем приблизительно 5 мСм/см, и рН приблизительно от 6,1 до приблизительно 6,4. ΛΌΛΜΤδ13 можно элюировать, используя градиентное элюирование, хотя ступенчатое элюирование может предпочтительно обеспечить более концентрированный продукт. В случае проведения градиентного элюирования можно использовать два буфера, например первый буфер, который имеет низкое содержание соли (например, от незначительного содержания соли до ее отсутствия), и второй буфер, который имеет более высокое содержание соли (например, приблизительно 500 мМ), так что пул элюата может иметь концентрацию соли, составляющую приблизительно 200 мМ. В случае проведения ступенчатого элюирования буфер для элюирования может включать буфер для хранения, например буфер для хранения, содержащий приблизительно 300 мМ ЫаС1, приблизительно 2 мМ СаС1₂, приблизительно 20 мМ гистидин, приблизительно 0,05% Куссн 80, и может иметь рН приблизительно 7,5 при комнатной температуре. В некоторых таких вариантах осуществления обмен буфера не требуется после стадии с использованием ΡОΚΌδ® δ, т.е. включающие ΛΌΛΜΤδ13 фракции, полученные из ΡОΚΌδ® δ, уже находятся в буфере и в концентрациях, подходящих для хранения. В еще одних вариантах осуществления включающие ΛΌΛΜΤδ13 фракции, полученные из колонки ΡОΚΌδ® δ, могут быть подвергнуты дополнительным стадиям концентрирования и/или буферного обмена. Как правило, очистка рекомбинантного белка ΑΌΑΜΤδ13 в соответствии с некоторыми вариантами осуществления способов, описанных в данном описании, приводит к композициям из чистого белка ΑΌΑΜΤδ13. В одном варианте осуществления очистка рекомбинантного белка ΑΌΑΜΤδ13, в соответствии с описанным способом, дает белок ΑΌΑΜΤδ13, чистота которого составляет по меньшей мере приблизительно 90%, например по меньшей мере приблизительно 95%, например по меньшей мере приблизительно 98% или, например по меньшей мере приблизительно 99%. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления описанного в данном описании способа могут быть достигнуты выходы, составляющие по меньшей мере приблизительно 20%. В одном варианте осуществления способ обеспечивает выходы, составляющие по меньшей мере приблизительно 5%, например приблизительно 30%, например приблизительно 10%, например приблизительно 20%, например приблизительно 40%, например приблизительно 50%, например приблизительно 60%, например приблизительно 70%, например приблизительно 80%, например приблизительно 90% или, например, приблизительно 95%. В некоторых вариантах осуществления способ обеспечивает белок ΑΌΑΜΤδ13 со специфической активностью в диапазоне приблизительно от 500 ΑΌΑΜΤδ13 до приблизительно 1000 единиц/мг ΑΌΑΜΤδ13. В другом варианте осуществления способ обеспечивает белок ΑΌΑΜΤδ13 со специфической активностью в диапазоне приблизительно от 1200 ΑΌΑΜΤδ13 при длине УФ 280 нм до приблизительно 2400 единиц/мг белка ΑΌΑΜΤδ13 при длине УФ 280 нм. В другом варианте осуществления, в котором рекомбинантный белок ΑΌΑΜΤδ13 продуцируют клетки СНО, трансформированные нуклеиновой кислотой рекомбинантного ΑΌΑΜΤδ13, очистка рекомбинантного ΑΌΑΜΤδ13 в соответствии с описанным способом приводит к композиции, которая содержит менее чем приблизительно 1000 ч./млн имеющих отношение к клеткам-хозяевам примесей. В некоторых вариантах осуществления способ обеспечивает по меньшей мере приблизительно 2 мг/мл белка ΑΌΑΜΤδ13 в буфере для хранения.

Композиции, содержащие рекомбинантный белок ΑΌΑΜΤδ13.

Настоящее изобретение дополнительно обеспечивает композиции, содержащие рекомбинантный ΑΌΑΜΤδ13, очищенный согласно описанному в данном описании способу. Описываемые в данном описании композиции могут быть пригодны для хранения очищенного рекомбинантного ΑΌΑΜΤδ13. Например, в некоторых вариантах осуществления очищенный белок ΑΌΑΜΤδ13 хранят в замороженном виде, например, при температуре ниже приблизительно -60°С. Описываемые в данном описании композиции также могут быть пригодны для терапевтического введения белка ΑΌΑΜΤδ13 и/или для получения композиций для терапевтического введения, в частности, парентерального введения. Например, в некоторых вариантах осуществления очищенный ΑΌΑΜΤδ13, полученный согласно описанным в данном описании способам, находится в форме нерасфасованного лекарственного вещества (ΒΌδ), т.е. в форме, готовой к составлению композиций для терапевтического введения.

Соответственно, другой аспект настоящего изобретения относится к фармацевтическим композициям, в которых очищенный рекомбинантный белок ΑΌΑΜΤδ13 смешан с эксципиентами или другими фармацевтически приемлемыми носителями. В предпочтительных вариантах осуществления фармацевтически приемлемый носитель является фармацевтически инертным. Фармацевтически инертным носителем является носитель, который не вступает в реакцию или по существу не вступает в реакцию с активным фармацевтическим веществом и/или, в частности, не наносит ущерб или по существу не наносит

- 20 023783 ущерб желаемым фармацевтическим свойствам активного ингредиента.

Фармацевтические композиции могут быть получены любым способом, известным в данной области техники, например путем обычного смешивания, растворения, гранулирования, получения драже, растирания в порошок, эмульгирования, инкапсулирования, включения, лиофилизации и т.п.

В зависимости от подвергаемого лечению заболевания эти фармацевтические композиции можно составить и вводить системно или местно. Методы составления и введения можно найти в последнем издании РеттдЮпА РЬагтасеийса1 Зтеисек (ΜαοΚ РнЫМипд Со, ЕаМоп Ра.). Подходящие пути могут, например, включать пероральное или чресслизистое введение; а также парентеральную доставку, включающую внутримышечное введение, подкожное введение, костномозговое введение, подоболочечное введение, внутрижелудочковое введение, внутривенное введение, внутрибрюшинное введение, интраназальное введение и т.п.

Фармацевтические композиции, подходящие для применения в настоящем изобретении, включают композиции, содержащие ΑΌΑΜΤ813 в качестве активного ингредиента в количестве, эффективном для достижения намеченной цели. Как используется в данном описании, эффективное количество ΑΌΑΜΤ8Ε3 может относиться к такому количеству, которое усиливает, увеличивает, улучшает или вызывает биологический эффект природного ΑΌΑΜΤ8Ε3.

Биологические эффекты природного ΑΌΑΜΤ8Ε3 включают νΑΕ-расщепляющую протеазную активность, основанную на эффекте ΑΌΑΜΤ8Ε3 через расщепление фактора Виллебранда, крупного белка, вовлеченного в свертывание крови. Эффективное количество будет включать количество ΑΌΑΜΤ813, которое вызывает снижение уровня агрегации тромбоцитов, например снижение уровня у индивидуума, страдающего нарушением свертывания крови, до уровня, который в большей степени сопоставим с уровнем у индивидуума, не страдающего нарушением свертывания крови. Нарушения свертывания крови включают, но без ограничения, тромботическую тромбоцитопеническую пурпуру (ТТР), также известную как синдром Мошковича, синдром Апшо-Шульмана (наследственная форма ТТР) и удар. Эффективное количество также включает количество, необходимое для достижения профилактического и/или терапевтического эффекта при лечении одного или более нарушений свертывания крови и связанных состояний. Определение определенных эффективных количеств полностью находится в компетенции специалистов в данной области техники.

Настоящее изобретение представляет способы, фармацевтические композиции и наборы для лечения и/или предупреждения нарушений свертывания крови и связанных состояний у являющихся животными субъектов. Используемый в данном описании термин являющийся животным субъект включает людей, а также других млекопитающих.

Используемый в данном описании термин лечение и/или предупреждение включает достижение терапевтического эффекта и/или профилактического эффекта, соответственно. Под терапевтическим эффектом подразумевается реверсия или ослабление лежащего в основе нарушения свертывания крови, подвергаемые лечению. Например, у пациента с ТТР терапевтический эффект включает ликвидацию или ослабление одного или более состояний и/или симптомов, связанных с ТТР, так что у пациента отмечается улучшение, несмотря на тот факт, что пациент может все еще страдать лежащим в основе нарушением. Например, лечение может обеспечить терапевтический эффект не только, когда уменьшается или исключается образование тромбов, но также, когда у пациента отмечается ослабление симптомов, сопровождающих ТТР, такое как уменьшение головных болей, ослабление лихорадки и/или отсрочка почечной недостаточности.

Для профилактического эффекта фармацевтическую композицию настоящего изобретения можно вводить пациенту, подверженному риску развития нарушения свертывания крови, в том числе, например, пациенту, сообщающему об одном или нескольких симптомах или состояний, обычно ассоциируемых с нарушениями свертывания крови, подобно ТТР, даже несмотря на то, что диагноз может быть еще не поставлен.

Помимо активного ингредиента, фармацевтические композиции могут содержать подходящие фармацевтически приемлемые носители, такие как эксципиенты и вспомогательные вещества, которые способствуют переработке активных соединений в препараты, которые могут быть использованы фармацевтически.

Фармацевтические композиции для парентерального введения, как правило, включают водные растворы активного ингредиента в водорастворимой форме. В некоторых вариантах осуществления могут быть приготовлены суспензии активного ингредиента, как например подходящие масляные суспензии для инъекции. Подходящие липофильные растворители или носители включают масла, такие как кунжутное масло, или синтетические сложные эфиры жирных кислот, такие как этилолеат или триглицериды, или липосомы. Водные суспензии для инъекции могут содержать вещества, которые повышают вязкость суспензии, такие как натрийкарбоксиметилцеллюлоза, сорбит или декстран.

Необязательно суспензия также может содержать подходящие стабилизаторы или агенты, которые увеличивают растворимость активного ингредиента, например для обеспечения приготовления в высокой степени концентрированных растворов.

Для инъекции, фармацевтические композиции настоящего изобретения можно составить в водных

- 21 023783 растворах, предпочтительно в физиологически совместимых буферах, таких как раствор Ханка, раствор Рингера или забуференный физиологический солевой раствор. В случае тканевого или клеточного введения в композиции используют пенетранты, подходящие для прохождения сквозь конкретный барьер. Такие пенетранты обычно известны в данной области техники.

Фармацевтические препараты для перорального введения можно получить путем объединения активного ингредиента с твердым эксципиентом, необязательно измельчения полученной смеси и обработки смеси гранул, после добавления подходящих вспомогательных веществ, если желательно, для получения таблеток или сердцевин драже. Подходящие эксципиенты включают являющиеся углеводами или белками эксципиенты, такие как сахара, включающие лактозу, сахарозу, маннит или сорбит; кукурузный, пшеничный, рисовый, картофельный крахмал и т.д.; целлюлозу, такую как метилцеллюлоза, гидроксипропилметилцеллюлоза или натрийкарбоксиметилцеллюлоза; камеди, включая аравийскую камедь и трагакант; и белки, такие как желатин и коллаген. Если желательно, можно добавить дезинтегрирующие агенты или солюбилизаторы, такие как сшитый поливинилпирролидон, агар, альгиновая кислота или их соль, такая как альгинат натрия. Носители также могут быть использованы для обеспечения составления фармацевтических композицией в виде таблеток, пилюль, капсул, жидкостей, гелей, сиропов, суспензий, растворов, суспензий, драже и т.п. для перорального и/или интраназального введения подвергаемым лечению пациентам.

Фармацевтические препараты, которые могут применяться перорально, включают твердые капсулы, изготовленные из желатина, а также мягкие, герметизированные капсулы, составленные из желатина и покрытия, такого как глицерин или сорбит. Твердые капсулы могут содержать активный ингредиент, смешанный с наполнителями или связующими веществами, такими как лактоза или крахмалы; лубрикантами, такими как тальк или магния стеарат; и необязательно стабилизаторами. В мягких капсулах активные соединения могут быть растворены или суспендированы в подходящих жидкостях, таких как масла, жидкий парафин или жидкий полиэтиленгликоль, вместе со стабилизаторами или без них.

Композиции, включающие ΑΟΑΜΤδ13 или другой белок, полученный согласно описанному в данном описании способу, могут быть составлены с использованием фармацевтически приемлемого носителя, помещены в соответствующий контейнер (или набор), и к ним может быть прикреплена этикетка для описания лечения указанного состояния.

Примеры

Следующие примеры представлены с иллюстративной целью и, как предполагается, не ограничивают объем настоящего изобретения.

Пример 1.

На фиг. 1 представлен приводимый в качестве примера способ очистки белка ΑΟΑΜΤδ13, согласно определенным вариантам осуществления настоящего изобретения, описанным в данном описании. В представленном примере рекомбинантный белок ΑΟΑΜΤδ13 очищают из супернатанта, собранного из культивирующих СНО клеток, включающих нуклеотидную последовательность рекомбинантного ΑΌΑΜΤδ13. В данном примере образцом является супернатант культуры клеток, включающий приблизительно 2 единицы/мл (приблизительно 2 мкг/мл) белка ΑΟΑΜΤδ13

Как показано на фиг. 1, образец, включающий ΑΟΑΜΤδ13 и не являющиеся ΑΌΑΜΤδ13 примеси, сначала подвергают необязательной подготовке к обогащению: (а) как показано на стадии 101, образец может быть концентрирован ультрафильтрацией (приблизительно в 10 раз до приблизительно 20 раз) и подвергнут буферному обмену посредством диафильтрации (с отсечкой по молекулярной массе, составляющей приблизительно 30 кДа); и (Ь) как показано на стадии 102, белок ΑΟΑΜΤδ13 можно связать с анионообменной смолой и элюировать из нее, перед дальнейшим обогащением.

Подготовка образца к обогащению.

(a) Предварительное обогащение ультрафильтрацией/диафильтрацией (ИР/ЭР).

Как показано на фиг. 1, стадии 101, для оптимизации загрузки в случае предварительного обогащения анионообменной хроматографией супернатант культуры клеток концентрируют приблизительно в 10 раз до приблизительно 20 раз и подвергают диафильтрации, используя ΡΕδ мембрану (с отсечкой, составляющей приблизительно от 30 до приблизительно 50 кДа; Ра11 Отеда) против буфера с низкой проводимостью, содержащего ионы кальция и цинка, которые, как считается, стабилизируют ΑΌΑΜΤδ13. Буфером для диафильтрации супернатанта культуры клеток является 20 мМ Трис, 0,1% полисорбата 80, 85 мМ ЫаС1, 2 мМ СаС1₂, 5 мкМ ΖηΟ₂, с рН, равным 7,7 при комнатной температуре.

(b) Предварительное обогащение анионообменной хроматографией.

Как показано на фиг. 1, стадия 102, предварительное обогащение анионообменной хроматографией можно выполнить, используя ΑΝΧ δеρЬа^о5е Рак! Р1о\у с узким диапазоном разделения от ОЕ НеаИЪсаге. Эта анионообменная смола может быть использована согласно следующим условиями (табл. 1, 2).

Загрузка на колонку: максимум 0,5 мг ΑΌΑΜΤΤδ13 Άд/мл смолы; высота слоя: 20 см.

- 22 023783

Таблица 1

Стадия	Буфер	Объем колонки (СУ)	Скорость потока (см/ч)
Активация колонки	Буфер с высокой концентрацией соли для ΑΝΧ	2	100
У равновешивание	Буфер для уравновешивания ΑΝΧ	6	100
Загрузка	Концентрированный и подвергнутый диафильтрации супернатант культуры клеток
Промывка 1	Буфер для промывки 1 ΑΝΧ	2,5	100
Промывка 2	12,5% буфера В для элюирования с ΑΝΧ/87,5% буфера А для элюирования из ΑΝΧ	3	100
Градиент для элюирования	12,5% буфера В для элюирования из ΑΝΧ/87,5% буфера А для элюирования из ΑΝΧ до 100% буфера В для элюирования из ΑΝΧ	11	100
После элюирования	Буфер с высокой концентрацией соли для ΑΝΧ	3	100

Альтернативно, на стадии элюирования можно использовать 2,8 объемов колонки буфера, включающего 48% буфера В для элюирования из ΑΝΧ и 52% буфера А для элюирования из ΑΝΧ, как детализировано в табл. 2. Также указаны другие потенциально подходящие буферы.

Таблица 2

Буфер	Состав
Буфер для уравновешивания ΑΝΧ	20 мМ Трис, 0,1% полисорбата 80, 50 мМ 14аС1, 2 мМ СаСБ, 5 мкМ ΖηΟΕ, рН=7,7 (при комнатной температуре)
Буфер для промывки 1 ΑΝΧ	20 мМ Трис, 0,1% полисорбата 80, 50 мМ Νβϋΐ, рН=7,7 (при комнатной температуре)
Буфер А для элюирования из ΑΝΧ	20 мМ Иа/К РО₄, рН=7,0 (при комнатной температуре)
Буфер В для элюирования из ΑΝΧ	20 мМ Νβ/Κ РО₄,400 мМ ЧаС1, рН=7,0 (при комнатной температуре)
Буфер с высокой концентрацией соли для ΑΝΧ	2М №С1

Можно использовать смолы, отличные от той, которая указана на фиг. 1, стадия 102. Можно использовать, например, ΡΘΚΌδ 50Ό и ΡΘΚΟδ 50ΡΙ от АррНеб ВюхуШепъ, РоШег Сбу, СА. Элюат из этой смолы для предварительного обогащения анионообменной хроматографией может обеспечить рекомбинантный ΑΌΑΜΤ813 с чистотой, составляющей приблизительно от 20 до приблизительно 70%, и процентный выход после этой стадии подготовки образца к обогащению может составить по меньшей мере приблизительно 75%.

Обогащение ΑΌΑΜΤ813.

Как показано на фиг. 1, стадии 103 и 104, соответственно, ΑΌΑΜΤ813 можно затем подвергнуть обогащению через посредство стадий (а) и (Ь) доочистки. Включающий ΑΌΑΜΤ813 образец подвергают тандемной хроматографии, сначала с использованием гидроксиапатита на колонке НубгохуараШе Τуре II (Вюгаб, Негси1е8, СΑ), стадия 103, с последующей хроматографией на смоле смешанного принципа работы на основе катионообмена/гидрофобных взаимодействий САРТО™ ММС (СЕ НеаИЪсаге), стадия 104. Более конкретно, пул элюата со стадии предварительного обогащения анионообменной хроматографией разбавляют в соотношении 1:4 буфером для разжижения гидроксиапатита для снижения проводимости приблизительно до 6 мСм/см. Разбавленный пул элюата подвергают тандемной хроматографии с использованием гидроксиапатита в условиях, обеспечивающих протекание существенной части белка ΑΌΑΜΤ813, стадия 103, и затем смолы смешанного принципа работы на основе катионообмена/гидрофобных взаимодействий, которая связывает белок ΑΌΑΜΤ813, стадия 104. Условия для тандемной хроматографии представлены ниже в табл. 3, 4.

Колонка 1: смола: гидроксиапатит типа II (Вюгаб) (НА); загрузка: максимум 2 мг общего белка/мл смолы; высота слоя: 20-30 см.

Колонка 2: смола: СарЮ ΜΜС (СЕ НеаИЪсаге); загрузка: 3-6 мг АОАМТ313/мл смолы; высота слоя: 10 см.

Отношение объема колонки НА:ММС = 10:1.

- 23 023783

Таблица 3

Стадия	Буфер	Объем колонк· (СУ)	Скорость потока (см/ч)
Активация (ММС)	Буфер для элюирования из ММС	З(ММС)	50 (ММС)
Уравновешивание	Буфер для уравновешивания НА	4 (НА)	50 (НА)
У равновешивание	Буфер для уравновешивания НА	1 (НА)	50 (НА)
Загрузка	Разбавленный элюат из смолы для захвата (разбавленный 1:5 буфером для уравновешивания НЕ) до <6 мСм/см проводимости	20-30 л	30 (НА)
Повторное уравновешивание	Буфер для уравновешивания НА	0,5 (НА)	30 (НА)
Промывка 1 (ММС)	Буфер для уравновешивания ММС	3(ММС)	50 (ММС)
Промывка 2 (ММС)	Буфер для промывки ММС	4 (ММС)	50 (ММС)
Элюирование (ММС)	75% буфера для элюирования из ММС/25% буфера для промывки ММС	4 (ММС)	50 (ММС)

Таблица 4

Буфер	Состав	Проводи мость
Буфер для разжижения НЕ	20 мМ Иа/К РО₄, рН = 7,0 (при комнатной температуре)
Буфер для уравновешивания колонок, используемых при тандемной хроматографии	20 мМ Νβ/Κ РО₄,25 мМ №С1, рН=7,0 (при комнатной температуре)	Приблизительно 5,5 мСм/см (при комнатной температуре)
Буфер для промывки ММС	50μΜΝ3/ΚΡΟ₄, 160 мМ ИаС!, рН=8,0 (при комнатной температуре)	Приблизительно 16,5 мСм/см (при комнатной температуре)
Буфер для элюирования из ММС	50 мМ Ν3/Κ РО₄, 1000 мМ ИаС1, рН=8,0 (при комнатной температуре)	Приблизительно 93 мСм/см (при комнатной температуре)
Буфер для элюирования из НЕ	300 мМ Ν3/Κ РО₄, рН=7,0 (при комнатной температуре)	Приблизительно 33 мСм/см (при комнаткой температуре)

Процентный выход ΑΌΑΜΤδ13 после обогащения тандемной хроматографией может составлять по меньшей мере 60%.

Инактивация вирусов.

Как показано на фиг. 1, стадия 105, образец можно подвергнуть обработке смесью растворительдетергент для инактивации загрязняющих вирусов или вирусных частиц; и/или образец фильтруют для удаления таких вирусов или вирусных частиц. Также, как показано на фиг. 1, стадию 105 инактивации вирусов можно выполнить в различных местах способа, например перед стадиями 103 и 104 тандемной хроматографии или после стадии, которая включает концентрирование и буферный обмен, стадия 106, как описано ниже.

Для инактивации вирусов обработкой смесью растворитель-детергент, образец обрабатывают смесью растворитель-детергент, включающей 1% ΤΚΙΤΟΝ Х-100®, 0,3% три-н-бутилфосфата и 0,3% полисорбата 80, в течение 30 мин приблизительно от 12 до приблизительно 16°С (в частности, для инактивации вирусов с липидными оболочками). Дополнительные детали представлены ниже в примере 2.

Альтернативно или дополнительно, образец подвергают фильтрации, например нанофильтрации через фильтр для удаления частиц размером 0,2 мкм. Например, смесь после обработки растворителемдетергентом разбавляют 1 объемом буфера для уравновешивания, используемого для доочистки, описанного ниже, и фильтруют через 0,2 мкм ΡΥΏΡ или ΡΕδ мембрану. Фильтрацию можно проводить перед и/или после обработки смесью растворитель-детергент. Фильтрация после данной обработки может быть использована для удаления твердых частиц, которые могли образоваться во время такой обработки. Фильтрация также может быть осуществлена нанофильтрацией с использованием 20 Ν фильтра (Иапоуа, ЛδаЬ^ Ка8е1), что также показано на фиг. 1, когда стадию 105 инактивации вирусов проводят перед стадиями 103 и 104 тандемной хроматографии. Дополнительная стадия 105 инактивации вирусов может быть осуществлена после того, как образец был дочищен с помощью катионообменной хроматографии, как описано ниже.

- 24 023783

Процентный выход ΑΌΑΜΤ813 в результате инактивации вирусов может составлять по меньшей мере 95%.

После обогащения ΑΌΑΜΤ813 может быть доочищен с помощью хроматографии на катионообменной смоле, и перед доочисткой можно снизить проводимость включающего ΑΌΑΜΤ813 буфера для получения соответствующей проводимости для катионообменной хроматографии. Соответственно, стадии после обогащения могут включать (а) снижение проводимости буфера; с последующей (Ь) катионообменной хроматографией.

(а) Снижение проводимости буфера.

Как показано на фиг. 1, стадия 106, подготовка к катионообменной хроматографии может включать концентрирование и буферный обмен с использованием ϋΡ/ΌΡ, с составляющей 10 кДа отсечкой, и оборудования для диализатора. В иллюстративном варианте осуществления оборудование для диализатора, используемое для буферного обмена, включает модуль для гемодиализа с полыми волокнами (серия Αςиатах, РЕ8 химия полых волокон, Ей^агйз ЫГезиепсез, ИйегесЫеШеш, Германия), имеющий площадь фильтра, составляющую 0,3-0,9 м². В ходе оперативного режима контролируют следующие параметры: давление (до модуля, после модуля и трансмембранное давление), проводимость и температуру. Картридж диализатора соединяют двумя насосами, одним, подающим образец (через полые волокна), и другим, подающим диализный буфер (окружающий полые волокна, в направлении противотока). Для приблизительно 5 л образца используют приблизительно 2 м² площадь фильтра,- и устанавливают следующую скорость потока жидкости: 40 мл/мин (для потока образца или 20 мл/мин/м² площади фильтра), 60 мл/мин (для потока диализного буфера, противотока). Перед и после диализа модуль с полыми волокнами промывают диализным буфером, и промывку после диализа добавляют к собранному продукту. После диализа образец имеет приблизительно тот же объем, что и до него, хотя он является немного концентрированным.

Процентный выход ΑΌΑΜΤ813 после снижения проводимости буфера, таким образом, может составлять приблизительно 90%.

В других вариантах осуществления буферный обмен может быть осуществлен с помощью анионообменной хроматографии на ΑΝΧ 8ерЬагозе-РР с узким диапазоном разделения, как на стадии 102.

Катионообменная хроматография.

Как показано на фиг. 1, стадия 107, после обогащения белком ΑΌΑΜΤ813 (и необязательной стадии 106 концентрирования и буферного обмена и/или стадии 105 инактивации вирусов), образец может быть подвергнут доочистке с помощью катионообменной хроматографии. Включающий белок ΑΌΑΜΤ813 буфер подвергают доочистке либо на колонке 8оигсе 8 (ОЕ НеаИЪсаге), либо на колонке РОКО8® 8, такой как колонка РОКО8 50 Н8 (АррПей Вю5у51етз).

Условия для доочистки на колонке 8оигсе 308 представлены в табл. 5, и буферы для стадии доочистки представлены в табл. 6.

Смола: 8оигсе 30 8 (ОЕ НеаИЪсаге); загрузка на колонку: максимум 0,2 (0,5) мг АБАМТ313/мл смолы; высота слоя: 20 см.

Таблица 5

Стадия	Буфер	Объем колонки (СУ)	Скорость потока (см/ч)
Активация колонки	2М ИаС1	2	32
У рар.новепг иван ие	Буфер для уравновешивания 805	6	32
Загрузка			32
Промывка	Буфер для уравновешивания 805	3	32
Элюирование (с использованием градиента)	100% буфера для уравновешивания 808/0% буфера для элюирования из 808 до 0% буфера для уравновешивания 303/100% буфера для элюирования из 303	5	19
После элюирования	Буфер для элюирования из 808	3	32

- 25 023783

Таблица 6

Буфер	Состав	Примечания
Буфер для уравновешивания 505	20 мМ МЕ5, рН=6,0 (при комнатной температуре)	Буфер может содержать 10 мМ ИаС!, 2 мМ СаС1₂.
Буфер для элюирования из 505	20 мМ МЕ5, 500 мМ ЫаС1,2 мМ СаС1₂, рН=6,0 (при комнатной температуре)

Пул элюата из колонки δοω^ δ концентрируют и подвергают диафильтрации в обмен на буфер для хранения.

Условия для доочистки на колонке РОΚОδ® δ представлены в табл. 7, и буферы для стадии доочистки представлены в табл. 8.

Смола: РОΚОδ® δ (Αρρ^ά ВюхуъЮпъ. Ро81ег СИу, ΟΑ); загрузка на колонку: максимум 12 мг ΑΠΑΜ^^/^ смолы; высота слоя: 20 см.

Таблица 7

Стадия	Буфер	Объем колонки (СУ)	Скорость потока (ем/ч)
Активация колонки	2М 1ЧаС1	50 СУ	50
У равновешивание	Буфер для уравновешивания Рогоз	10 СУ (пока сигналы значений рН и проводимости не станут ровными и неизменными)	50
Загрузка	Элюат из ММС после обработки растворителемдетергентом и разбавления	Проводимость, составляющая менее 5 мСм/см (при комнатной температуре)	31
Повторное уравновешивание	Буфер для уравновешивания Рогоз	5 СУ	32
Промывка 1	Буфер для промывки 1 Рогоз	5 СУ	32
Промывка 2	Буфер для промывки 2 Рогоз	7 СУ	32
Элюирование	Буфер для элюирования из Рогоз	5 СУ	19

| После элюирования | 2М МаС1 ......... | 3 СУ ! 32

Таблица 8

Буфер для уравновешивания Рогоз	20 мМ МЕЗ-кислота, 30 мМ №С1, 0,1% Тл ееп 80, рН=6,0 (при комнатной температуре, проводимость = приблизительно 3,9 мСм/см при 25°С
Буфер для промывки 1 Рогоз	20 мМ Ь-гистидин, 5 мМ №С1,2 мМ СаС1₂, 0,05% Ти'ееп 80, рН=6,0 (при комнатной температуре, проводимость = приблизительно 1,9 мСм/см при 25°С
Буфер для промывки 2 Рогоз	20 мМ Ь-гистидин, 5 мМ ΝαΟ, 2 мМ СаС1₂, 0,05% Тдаееп 80, рН=7,5 (при комнатной температуре, проводимость = 1,9 мСм/см при 25 °С
Буфер для элюирования из Рогоз	20 мМ Е-гистидин, 300 мМ ИаСЕ 2 мМ СаС1₂,0,05% Τν/ееп 80, рН=7,5 (при комнатной температуре, проводимость = приблизительно 18 мСм/см при 25°С

Пул элюата из колонки РОΚОδ® δ концентрируют и подвергают диафильтрации в обмен на буфер для хранения.

Процентный выход ΑΌΑΜΤδ13 после этой дополнительной стадии доочистки может составлять по меньшей мере приблизительно 70%, и после обмена буфера по меньшей мере приблизительно 90%.

Как показано на фиг. 1, стадия 108, очищенный белок ΑΌΑΜΤδ13 получают согласно описанному выше способу. ΑΌΑΜΤδ замораживают и хранят, например, при температуре, приблизительно ниже -60°С. Выход в результате процесса в целом может составлять приблизительно от 22 до приблизительно 24% или более.

Пример 2.

На фиг. 2 кратко представлены различные условия, которые могут быть использованы для стадии

- 26 023783

107 катионообменной хроматографии фиг. 1. В частности, сравнение продукта АОАМТ813, полученного из различий серий, показывает, что условия, приведенные на фиг. 2С, уменьшают количество загрязняющих агрегатов.

Как показано на фиг. 2А, вариант А представляет собой комбинацию инактивации вирусов с использованием обработки растворителем-детергентом (8/Ό), обсуждаемой более подробно ниже, с последующей катионообменной хроматографией на Рого8 8, при которой применяется стадия элюирования. Как показано на фиг. 2В, вариант В включает катионообменную хроматографию на Рого8 508, со стадией разбавления, но без предшествующей инактивации вирусов. Оба варианта А и В могут быть выполнены согласно методике, представленной в табл. 9.

Таблица 9

	Объем колонки (СУ)	Буферный состав	Скорость потока (см/ч)	Данные наблюдений
Активация	5	2М №С1	50
У равновишиван ие	6	20 мМ МЕ5кислота, 30 мМ ИаС1, рН=6,0 (при комнатной температуре)	50
Загрузка продукта	Приблизительно 12	Подвергнутый обработке растворителемдетергентом и разбавленный раствор продукта	32	Максимальная загрузка на колонку = 6 мг АЛАМТ513/мл смолы
Промывка 1	10	20 мМ МЕ5кислота, 30 мМ ИаС1, рН=6,0 (при комнатной температуре)	32
Промывка 2	5	20 мМ гистидин, 30 мМ ЫаС1,2 мМ СаС1_;, 0,05% Тдаееп 80, рН=7,0 (при комнатной температуре)	32
Стадия элюирования	5	20 мМ гистидин, 200 мМ ЫаС1,2 мМ СаС1₂,0,05% Тзгееп 80, рН=7,5 (при комнатной температуре)	25	Объединение начинается после значительного увеличения сигнала при длине УФ=280 нм, и объединение завершается после снижения сигнала при длине УФ=280 нм ниже 5% от сигнала при длине УФ=280 нм в максимуме пика (приблизительно 1 СУ)

В случае варианта А кондиционированный (подвергнутый диализу) элюат со стадии 106 подвергают стадии 105 инактивации вирусов обработкой растворителем-детергентом. Сначала элюат фильтруют через фильтр с размером пор 0,2 мкм для удаления твердых частиц. Затем фильтрат дополняют смесью растворитель-детергент до конечных концентраций: 1% ТгЛоп Х-100, 0,3% три-н-бутилфосфата и 0,3% полисорбата 80 (Т\уееп 80), из стоковых растворов. Инактивацию выполняют при температуре в диапазоне приблизительно от 12 до приблизительно 25°С в течение периода времени, составляющего приблизительно от 30 мин до приблизительно 1 ч, при легком перемешивании или встряхивании. Инактивацию останавливают путем разбавления раствора одним объемом холодного буфера для разбавления (20 мМ МЕ8, рН 6,0, при комнатной температуре). Для предохранения колонки, подвергнутый обработке растворителем-детергентом и разбавленный раствор снова фильтруют с использованием 0,2 мкм фильтра, например для удаления твердых частиц, которые могли образоваться во время обработки для инактивации вирусов.

- 27 023783

Инактивированный растворителем-детергентом и разбавленный раствор продукта затем подвергают стадии 107 катионообменной хроматографии на Рогок 50Ηδ, используя стадию разбавления, подробности хроматографической методики представлены в табл. 9. Полученный в результате пул элюата обеспечивает белок АЛАМТ§13 в форме нерасфасованного лекарственного вещества, который можно хранить в замороженном виде при ниже -60°С.

В случае варианта В стадию 107 катионообменной хроматографии выполняют на кондиционированном (подвергнутом диализу) элюате со стадии 106, без стадии 105 инактивации вирусов обработкой растворителем-детергентом. Подробности катионообменной хроматографии являются такими, как подробно представлено выше.

Как показано на фиг. 2С, вариант С представляет собой комбинацию, включающую очистку катионообменной хроматографией на Рою 50Ηδ при использовании градиентного элюирования, с последующей инактивацией вирусов путем обработки растворителем-детергентом на колонке. Как ни удивительно, этот вариант уменьшает количество иных агрегатов, обнаруженных в очищенном белке АЛАМТ§13. Подробности хроматографической методики, которые могут быть использованы в случае варианта С, представлены в табл. 10.

Таблица 10

	Объем колонки (εν)	Буферный состав	Скорость потока (см/ч)	Примечания
Активация	5	2М 1ЧаС1	50
Уравновешивание	6	20 мМ МЕЗ-кислота, 30 мМ ЯаС1, рН=6,0 (при комнатной температуре)	50
Загрузка продукта	Приблизительно б	Подвергнутый диализу пул элюата от очистки на Сар1о ММС	32	Максимальная загрузка на колонку 6 мг АЮАМТ$13/мл смолы
Промывка 1	10	20 мМ МЕЗ-кислота, 30 мМ N»01, рН=6,0 (при комнатной температуре)	32
Промывка 2	1,5	20 мМ МЕЗ-кислота, 30 мМ ИаС1, 1% Тгйоп Х-100, 0,3% ΤΝΒΡ, 0,3% Т\уееп 80, рН 6,0 (при комнатной температуре)	32
Промывка 3	2,1	20 мМ МЕЗ-кислота, 30 мМ N»01, 1% Тгйоп Х-100,0,3% ΤΝΒΡ, 0,3% Ти/ееп 80, рН 6,0 (при комнатной температуре)	20	Обработка растворителемдетергентом (8/0): составляющее 1 час время контактирования с химическими веществами 5/О
Промывка 4	10	20 мМ МЕЗ-кислота, 30 мМ.ЯаС1, рН=6,0 (при комнатной температуре)	32	Удаление химических веществ 5/0
Промывка 5 (буфером А)	8	20 мМ гистидин, 30 мМ ΝαΟΙ, 2 мМ СаС1₂,0,1% Т\уееп 80, рН=7,0 (при комнатной температуре)	32	Кондиционирование колонки для элюирования
Стадия элюирования	10	Градиент со 100% буфера А до 100% буфера В (20 мМ гистидин, 300 мМ ΝαΟΙ, 2 мМ СаС1₂,0,1% Т\уееп 80, рН=7,5 (при комнатной температуре)) в пределах 10 СУ	32	Объединение начинается после значительного увеличения сигнала при длине УФ=28О нм, и объединение завершается после снижения сигнала при длине УФ=280 нм ниже 5% от сигнала при длине УФ=280 нм в максимуме пика (приблизительно 2-3 СУ)

В случае варианта С загрузочным материалом является пул элюата со стадии 104 доочистки катионообменной хроматографией и предпочтительно имеет проводимость, которая меньше 4,5 мСм/см, достигаемую с помощью диализа или буферного обмена посредством гель-фильтрации. Примечательно, что катионообменная хроматография на Рою δ приспособлена к включению обработки растворителемдетергентом на колонке, которая включает инактивацию вируса, иммобилизованного на хроматографической колонке, как обсуждалось выше. Инактивация вирусов на колонке включает промывку в течение одного часа смесью растворитель-детергент при 2-10°С. После обработки на колонке, осуществляют замену буфера для промывки, чтобы эффективно отмыть химические вещества смеси растворительдетергент перед элюированием.

Элюирование изменяют с переходом от стадии элюирования с использованием 200 мМ ЫаС1 к градиентному элюированию, которое, как полагают, способствует разделению мономерных и олигомерных видов АПАМ^13, особенно в нисходящей части пика элюирования. Агрегаты удаляются в поздней фракции элюирования, обеспечивая, таким образом, дополнительное удаление иных агрегатов, обнаруженных в очищенном белке АПАМ^13. В качестве дополнительного приспособления для стабилизации мономерного белка АЛАМ1Б13 концентрацию Т\уееп 80 в буфере для элюирования увеличивают с 0,05 до 0,1% в буферах для промывки и элюирования. Как полагают, это дополнительно предотвращает образование агрегатов во время элюирования АОАМ1Б13 из смолы Рогок δ. Подробности хроматографической методики на Рогок δ, включающей инактивацию вирусов обработкой растворителем-детергентом на колонке, представлены в табл. 10.

Как показано на фиг. 2Ό, вариант Ό служит в качестве контроля. В случае варианта Л стадию 107 доочистки катионообменной хроматографией выполняют на Рогок 50 Ηδ снова с использованием градиентного элюирования и увеличенной концентрации Тетееп 80 в буфере для элюирования, но без инактивации вирусов на колонке обработкой растворителем-детергентом. Стадию 105 обработки растворителем-детергентом для инактивации вирусов выполняют вместо концентрированного сбора перед катионообменной хроматографией. Подробности хроматографической методики представлены в табл. 11.

- 28 023783

Таблица 11

	Объем колонки (СУ)	Буферный состав	Скорость потока (см/ч)	Примечания
Активация	5	2М ИаС1	50
У равнове шивание	6	20 мМ МЕЗкислота, 30 мМ ЫаС1, рН=6,0 (при комнатной температуре)	50
Загрузка продукта	Приблизительно 6	Подвергнутый диализу пул элюата от очистки на СарЬ> ММС	32	Максимальная загрузка на колонку 6 мг АОАМТ513/мл смолы
Промывка 1	10	20 мМ МЕ8кислота, 30 мМ ЫаС1, рН=6,0 (при комнатной температуре)	32
Промывка 2 (буфером А)	10	20 мМ гистидин, 30 мМ ИаС!, 2 мМ СаСЬ, 0,1% Τν/ееп 80, рН=7,0 (при комнатной температуре)	32	Кондициониров ание колонки ДЛЯ элюирования
Стадия элюирования	10	Градиент со 100% буфера А до 100% буфера В (20 мМ гистидин, 300 мМ ИаСЬ 2 мМ СаСЬ, 0,1% Тдасеп 80, рН=7,5 (при комнатной температуре)) в пределах 10 СУ	32	Объединение начинается после значительного увеличения сигнала при длине УФ=280 нм, и объединение завершается после снижения сигнала при длине УФ=280 нм ниже 5% от сигнала при длине УФ=2&0 нм в максимуме пика (приблизительн о 2-3 СУ)

В случае варианта Ό загрузочным материалом является пул элюата со стадии 104 доочистки катионообменной хроматографией и предпочтительно имеет проводимость, которая меньше 4,5 мСм/см, достигаемую с помощью диализа или буферного обмена посредством гель-фильтрации. На стадии 107 катионообменной хроматографии на Ρογοκ δ используют градиентное элюирование, вместо стадии элюирования, а также 0,1% Етееп 80 в буферах для промывки и элюирования, как описано выше. Подробности хроматографической методики на Ρογοκ δ с использованием градиентного элюирования представлены в табл. 11.

Пример 3.

Эксперименты, проводимые в лабораторных масштабах, используя масштаб 100-л ферментера, проводили с использованием инактивации вирусов обработкой растворителем-детергентом на колонке, для определения возможного влияния данной методики на проведение стадии 107 катионообменной хроматографии. Данные представлены в табл. 12.

- 29 023783

Таблица 12

Образец	Методика обработки растворителемдетергентом	Выход из Рогов 8	Специфи- ческая активность	Примеси СНО НСР	Агрегаты
		%Аг ΑΌΑΜΤ513	% АБАМТ813 в единицах по методу РКЕТ	Единицы/ мг Аг АОАМТ513	нгСНО НСР/ единицу ΑΌΑΜΤ5Ι3	нг СНО НСР/мг Аг ΑΌΑΜΤ813	% мультиме- ров	% димеров	% мономеров
1	Обработка растворителемдетергентом непосредственно перед хроматографией на Рогов 8 (вариант А)	99	100	696	0,49	346	9,7	7,0	83,3
2	Без обработки растворителемдетергентом (вариант В)	133	154	894	0,58	519	1,3	4,6	94,1
3	Обработка растворителемдетергентом на колонке (Рогоз 5) (вариант С)	89	95	931	0,60	561	1,0	2,3	96,7
4	87	117	905	0,39	354	1,0	3,7	95,3
5	Обработка растворителемдетергентом на стадии сконцентрированного сбора (вариант ϋ)	65	93	764	0,21	163	0,8	1,5	97,8
6	81	108	845	0,38	324	0,7	1,5	98,7
7	66	131	741	0,31	231	0,2	1,1	98,7

*Выходы, превышающие 100%, отражают проблему анализа хроматографически загружаемой на Рогоз 508 фракции.

Аг ΑΌΑΜΤ813: антиген ΑΌΑΜΤ813.

ΑΌΑΜΤ813 ΡΚΕΤ: ΑΌΑΜΤ8 13 в единицах по методу ΡΚΕΤ.

СНО НСР: белки клеток-хозяев яичника китайского хомячка.

Как представлено в табл. 12, выполнение инактивации вирусов через обработку растворителемдетергентом, перед катионообменной хроматографией на Рогоз 8, может привести к образованию большого количества агрегатов (вариант А на фиг. 2А и образец 1). В случае пропуска обработки растворителем-детергентом и осуществления этой же методики, образование агрегатов значительно уменьшается (вариант В на фиг. 2В и образец 2).

Выполнение обработки растворителем-детергентом на колонке, т.е. приведение ΑΌΑΜΤ813 в контакт со смесью растворитель-детергент, когда он иммобилизован на поверхности смолы, также может предотвратить образование агрегатов. Кроме того, небольшое количество агрегатов, которые действительно образуются, можно в дальнейшем удалить градиентным элюированием в поздних фракциях элюирования (вариант С на фиг. 2С; образцы 3 и 4).

Для сравнения, в процессе очистки стандартную обработку растворителем-детергентом в растворе осуществляют с последующей катионообменной хроматографией на Рогоз 8 без обработки растворителем-детергентом ни непосредственно перед, ни на колонке (вариант Ό на фиг. 2Ό, образцы 5, 6 и 7). Такая методика также приводит к ΑΌΑΜΤ813 с низким содержанием агрегатов.

Все патенты и публикации патентных заявок, на которые ссылаются в данном описании, включены, тем самым, посредством ссылки.

Определенные модификации и улучшения могут быть осуществлены специалистами в данной области техники после прочтения приведенного выше описания. Следует понимать, что все такие модификации и улучшения были исключены из описания для краткости и удобочитаемости, но они, как следует, входят в объем следующей формулы изобретения.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Способ очистки рекомбинантного белка, подобного дезинтегрину, и металлопептидазы с мотивом 13 тромбоспондина типа 1 (ΑΌΑΜΤ813) из образца, включающего белок ΑΌΑΜΤ813 и не являющиеся ΑΌΑΜΤ813 примеси, который включает стадию (a) приведения хроматографическим образом образца в контакт с гидроксиапатитом в условиях, обеспечивающих попадание указанного белка ΑΌΑΜΤ813 в проточную фракцию из указанного гидроксиапатита посредством того, что указанный белок ΑΌΑΜΤ813 не связывается с указанным гидроксиапатитом, а указанные не являющиеся ΑΌΑΜΤ813 примеси задерживаются на указанном гидроксиапатите.
2. Способ по п.1, дополнительно включающий стадии:

(b) последующего приведения хроматографическим образом указанной проточной фракции в контакт со смолой со смешанным принципом работы на основе катионообмена/гидрофобных взаимодействий, которая связывает указанный белок ΑΌΑΜΤ813; и (c) элюирования указанного белка ΑΌΑΜΤ813 с указанной смолы со смешанным принципом работы на основе катионообмена/гидрофобных взаимодействий с помощью буфера для элюирования.
3. Способ по п.1 или 2, дополнительно включающий приведение хроматографическим образом указанного образца в контакт с анионообменной смолой и элюирование указанного белка ΑΌΑΜΤ813 из указанной анионообменной смолы перед стадией (а) хроматографического контакта с указанным гидро- 30 023783 ксиапатитом.
4. Способ по п.1 или 2, дополнительно включающий увеличение концентрации указанного белка ΑΌΑΜΤδ13 в указанном образце посредством ультрафильтрации и стабилизацию указанного белка ΑΌΑΜΤδ13 посредством обмена с использованием диафильтрации в буфер, включающий ионы кальция и ионы цинка, перед стадией (а) хроматографического контакта с указанным гидроксиапатитом.
5. Способ по п.2, дополнительно включающий, после приведения в контакт на стадии (а) с указанным гидроксиапатитом или на стадии (Ь) указанной смолой со смешанным принципом работы на основе катионообмена/гидрофобных взаимодействий, (б) стадию подготовки указанного белка ΑΌΑΜΤδ13 к катионообмену посредством снижения проводимости буфера.
6. Способ по п.5, в котором указанную стадию подготовки (б) выполняют посредством ультрафильтрации/диафильтрации.
7. Способ по п.5, в котором указанную стадию подготовки (б) выполняют посредством диализа, где указанный диализ выполняют один или два раза.
8. Способ по п.5, в котором указанную стадию подготовки (б) выполняют посредством гельфильтрации.
9. Способ по любому из пп.1, 2 или 5, дополнительно включающий (е) подвергание указанного белка ΑΌΑΜΤδ13 по меньшей мере одной стадии инактивации вирусов или удаления вирусов.
10. Способ по п.9, в котором указанная стадия инактивации вирусов (е) включает добавление смеси растворитель-детергент, включающей неионный детергент и органический растворитель, к указанному белку ΑΌΑΜΤδ13.
11. Способ по п.10, в котором указанный белок ΑΌΑΜΤδ13 является иммобилизованным в течение указанной стадии инактивации вирусов (е).
12. Способ по п.11, в котором указанный белок ΑΌΑΜΤδ13 на стадии (е) является иммобилизованным на катионообменной смоле.
13. Способ по п.10, в котором указанная смесь растворитель-детергент включает 1% ΤΚΠΌΝ Х-100, 0,3% три-н-бутилфосфата и 0,3% ΤνΕΕΝ 80.
14. Способ по п.9, в котором указанная стадия удаления вирусов (е) включает фильтрацию указанного белка ΑΌΑΜΤδ13 через нанофильтр для удаления вирусов и/или вирусных частиц.
15. Способ по п.5, дополнительно включающий подвергание указанного белка ΑΌΑΜΤδ13 по меньшей мере одной стадии инактивации вирусов или удаления вирусов, где указанную стадию инактивации вирусов или удаления вирусов (е) выполняют после указанной стадии подготовки (б).
16. Способ по п.12, который дополнительно включает элюирование указанного белка ΑΌΑΜΤδ13 из указанной катионообменной смолы с использованием градиентного элюирования, в котором указанное градиентное элюирование включает использование первого буфера с низким содержанием соли и второго буфера с более высоким содержанием соли.
17. Способ по п.12, который дополнительно включает элюирование указанного белка ΑΌΑΜΤδ13 из указанной катионообменной смолы с использованием стадии элюирования.
18. Способ по п.17, в котором указанная стадия элюирования включает элюирование указанного белка ΑΌΑΜΤδ13 из указанной катионообменной смолы буфером для хранения.
19. Способ по п.18, в котором указанный буфер для хранения имеет рН выше чем 7,0 и включает менее 10 мМ ионов кальция, буферирующее соединение, 0,05% неионного детергента и соль.
20. Способ по п.18, в котором отсутствует стадия ультрафильтрации, диафильтрации или буферного обмена после указанной стадии элюирования из указанной катионообменной смолы буфером для хранения.
21. Композиция, содержащая рекомбинантный белок ΑΌΑΜΤδ13, полученный согласно способу по любому из пп.1, 2 или 5.
22. Композиция, содержащая рекомбинантный белок ΑΌΑΜΤδ13, полученный согласно способу по

п.12.