CN109310766A - 多特异性分子 - Google Patents

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Abstract

本公开涉及多特异性分子，它们能够同时结合至少两个不同的目标抗原或表位。所述分子包含与第一目标抗原或表位结合的至少一个结合域分子(BDM)，所述BDM经修饰以与异源性目标选择性结合，与作为与第二目标抗原或表位结合的抗体或其抗原结合片段或非抗体蛋白或肽的药理活性蛋白或肽偶合，所述BDM与所述药理活性蛋白或肽内存在的多肽的C端偶合。

Description

多特异性分子
技术领域
本公开涉及多特异性分子，它们能够同时结合至少两个不同的目标抗原或表位。这些分子包含与第一目标抗原或表位结合的至少一个结合域分子(BDM)，该BDM经修饰以与异源性目标选择性结合，与作为与第二目标抗原或表位结合的抗体或其抗原结合片段或非抗体蛋白或肽的药理活性蛋白或肽偶合，这些BDM与该药理活性蛋白或肽内存在的多肽的C端偶合。
以引用方式并入
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背景技术
已经开发了许多重组蛋白作为治疗剂。然而，已知呈未经修饰形式的蛋白在活体内通过肾过滤、网状内皮系统中的细胞清除机制、或蛋白水解降解而快速地清除(Francis(1992)Focus on Growth Factors 3:4-11)。已经开发了蛋白和肽的各种修饰以增加治疗性蛋白的稳定性、循环时间和生物活性(参见Francis(1992)Focus on Growth Factors 3:4-10)。然而，本领域对允许此类治疗性蛋白在活体内存留更久的机制存在有需求。
治疗性单克隆抗体以及与抗体相关的产品(诸如抗体融合蛋白、抗体片段、抗体-药物缀合物(下文统称为抗体产品))已渐渐变成生物制药市场内的主导性产品种类。如今，抗体产品被批准用于治疗多种疾病，略举数例，包括一些癌症、多发性硬化症、哮喘和类风湿性关节炎。
尽管抗体药物开发领域有此最近的前所未有的成功，但对某些疾病目标缺乏效果已促使去寻找开发更有效的抗体药物的新策略。一种用以改善抗体效果的方法是开发同时与两种目标结合的抗体样蛋白结构；即双特异性物。正常的抗体只能结合一个特异性目标(即，其具有一种特异性)。双特异性物通常是一种经工程改造的蛋白，其由两种不同的抗体或抗体样片段(称为抗体样支架)构成，它们被融合在一起以使得该双特异性物可同时与两种不同类型的目标结合(即，两种特异性)。大部分的抗体样支架通常由抗体的片段构成或由可与特异性目标结合(与抗体类似)的抗体样蛋白制成。双特异性抗体使得可以得到更有效的抗体药物，其可以被设计成使免疫效应细胞(诸如T 细胞)改向并活化以特异性杀死肿瘤；与多种目标结合并影响多种致病性途径；与一个目标细胞或蛋白上的多个位点结合以增加特异性或引起协同诱导；以及靶向在本质上为异源性的肿瘤。
目前，一个实施现有技术来生成双特异抗体产品的重要区分点是将各种抗体样支架融合在一起以产生双特异性物的一般方法。这种类型的双特异性物具有许多显著的缺点：首先，通过将两个或更多个抗体样支架融合在一起而产生的双特异性物的小尺寸通常明显低于肾阈值，且通常显示出非常短的血液循环半衰期，其范围在数分钟至数小时内。如此短的半衰期使得必需每日给药或进行恒量输注，这可能导致超过药物的毒性阈值。第二，许多抗体样支架对它们的目标的亲和力是不足的，这是由于它们的单价性质(即，它们与具有两个抗原结合位点的抗体相比仅具有一个抗原结合位点)所致。完整的抗体与两个抗原结合位点结合，从而改善整体结合强度(称为亲合效应)，相较于单价抗体样支架具有某种优点。
目前，只有有限数量的方法能产生呈完整IgG形式的双特异性抗体产品。通常，这些方法对抗体骨架进行工程改造以允许两个具有不同特异性的不同亲本抗体结合在一起，以形成具有与不同目标结合的多条臂的单一IgG(即卡妥索单抗(Catumaxomab))。此完整抗体方法相较于融合较小的片段具有某些优点，然而，虽然这种类型的完整IgG 双特异性方法避开了小片段双特异性物中所见的半衰期问题，但它并未解决丧失亲合力的问题，因为仅双特异性物的一条臂与每个目标结合。
因此，本领域对改进现有治疗性蛋白和抗原结合分子的方法存在需求，这些方法有助于改善此类分子的疗效和/或半衰期。此外，本领域对克服目前的双特异性抗体方法及其使用中所见的缺点的方法存在需求。
发明内容
本公开基于用于改善蛋白或肽(包括抗体或免疫球蛋白抗原结合片段)的一个或多个特性的方法。更具体地讲，本公开基于通过使不良治疗性蛋白(例如治疗性抗体)转变成多特异性形式来对其进行改善的方法。使该蛋白或肽与本文所述的至少一个结合域分子(BDM)偶合提供双特异性或多特异性分子，从而通过利用该蛋白和该BDM的不同结合目标(即抗原或表位)而允许该分子与不同的目标结合。因此，该蛋白或肽的一个或多个特性可被改善，包括疗效、半衰期、免疫接合(immune engagement)、亲合力、细胞渗透和/或耐受性。这些分子因此提供传统双特异性抗体的替代物。
优选地，被BDM结合的目标抗原或表位与被蛋白或肽结合的目标抗原或表位不同。例如，蛋白可与细胞或组织上存在的目标抗原或表位结合而BDM可与免疫调节细胞(诸如细胞毒性T细胞)或蛋白上存在的目标抗原或表位结合以帮助杀死细胞、或与人血清白蛋白(HSA)上的目标抗原结合以使得可延长蛋白或肽的半衰期。
通过利用蛋白或肽和BDM与其目标的同时结合，蛋白或肽的疗效可通过利用BDM所结合的目标的功能而促进。通过使另外的BDM 与蛋白或肽偶合，蛋白或肽可被转变成双特异性物、三特异性物或甚至多特异性物。具体地讲，这些BDM的较小尺寸、结合亲和力特性和溶解性使得它们成为用于改善不良治疗性蛋白或肽的效力(例如促进身体的天然免疫机制以摧毁肿瘤细胞)的理想药剂。
本公开因此提供能够与两种或更多种不同的目标抗原或表位结合的多特异性分子，该分子包含：
(i)与第一目标抗原或表位结合的至少一个结合域分子(BDM)，该BDM包含V样结构域(VLD)支架或由VLD支架组成，该支架内含有三个暴露的结合环(BL)并且其中该三个BL中的至少两个相对于它们在支架中的对应天然序列经修饰或置换以与异源性目标抗原或表位选择性结合；以及
(ii)药理活性蛋白或肽，其为与第二目标抗原或表位结合的抗体或其抗原结合片段或非抗体蛋白或肽；
其中该至少一个BDM与该药理活性蛋白或肽内存在的多肽的C 端偶合。
在一个实例中，该药理活性蛋白与其天然目标抗原或表位结合。
优选地，这些表位在单独的抗原上。
在一个实例中，该第一目标抗原和第二目标抗原是不同的。在一个实例中，该第一目标抗原和第二目标抗原是相同的但该分子与该目标抗原上的不同表位结合。在一个实例中，该第一目标表位和第二目标表位是不同的。
在一个实例中，该分子是双特异性物。在一个实例中，该分子是三特异性物。
在一个实例中，该分子包含一个、二个、三个、四个或五个BDM (或其多聚体，例如BDM二聚体)。在另一个实例中，该分子包含一对或两对BDM，其中该对中的BDM是相同的。在一个实例中，一个、二个或三个BDM(或其多聚体，例如二聚体)与非抗体蛋白或肽偶合。
在一个实例中，该分子包含至少两个BDM、或至少一对BDM，其中各BDM(或BDM对)与不同的目标抗原或表位结合。在另一个实例中，各BDM(或BDM对)与和该药理活性蛋白或肽所结合的目标抗原或表位不同的目标抗原或表位结合。
在另一个实例中，二个、四个、六个、或八个BDM与全长抗体偶合，其中该分子与至少两个不同的目标抗原或表位结合。在一个实例中，该分子与两个不同的目标抗原或表位结合。在另一个实例中，该分子与三个不同的目标抗原或表位结合。在另一个实例中，该分子与四个不同的目标抗原或表位结合。
在一个实例中，该药学活性蛋白是全长抗体或其免疫球蛋白抗原结合片段。在另一个实例中，该蛋白是非抗体蛋白或肽。
在一个实例中，该非抗体蛋白或肽选自：凝血因子、抗运载蛋白 (anticalin)、类毒素、胶原结合蛋白、人血清结合蛋白(例如人血清白蛋白，HSA)、肿瘤坏死因子(TNF)-α受体结合蛋白、整合素结合蛋白、血管内皮生长因子(VEGF)或其模拟物、促红细胞生成素(EPO)或其模拟物、C4结合蛋白、尿激酶受体拮抗剂、淋巴因子、细胞因子、护骨素(OPG)，或选自程序性细胞死亡1蛋白(PD1)、程序性死亡配体1 (PD-L1)、NKG2D、MHC I类多肽相关序列A(MICA)、MHC I类多肽相关序列B(MICB)、UL16结合蛋白(ULBP)的蛋白的胞外结构域。
在一个实例中，该凝血因子是因子VIII或因子IX。
在一个实例中，该类毒素是肉毒杆菌类毒素。
在一个实例中，该淋巴因子是IL-2或其模拟物或GM-CSF或其模拟物。
在一个实例中，该细胞因子是G-CSF或其模拟物或干细胞因子 (SCF)或其模拟物。
在一个实例中，该分子包含与非抗体蛋白偶合的一个BDM。在一个实例中，BDM与非抗体蛋白的比率为1:1。
在一个实例中，该至少一个BDM与抗体重链多肽的C端偶合。在一个实例中，该至少一个BDM与两个抗体重链多肽的C端偶合。
在一个实例中，该至少一个BDM与抗体轻链多肽的C端偶合。在一个实例中，该至少一个BDM与两个抗体轻链多肽的C端偶合。
在一个实例中，该至少一个BDM与所有抗体重链和轻链多肽的 C端偶合。
在一个实例中，该至少一个BDM与抗体重链多肽的CH1、CH2 或CH3结构域的C端偶合。
在一个实例中，该至少一个BDM与抗体Fc的C端偶合。
在一个实例中，至少一个BDM与以下部分偶合：
(i)抗体轻链多肽的C端；
(ii)各抗体轻链多肽的C端；
(iii)抗体重链多肽的C端；
(iv)各抗体重链多肽的C端。
根据本公开的全长抗体或免疫球蛋白抗原结合片段本身可为单特异性或双特异性的。就单特异性抗体而言，它表示该抗体通过对目标抗原或表位共有相同特异性的互补重链和轻链可变结构域(即一对 VH/VL)与单一目标或表位结合。双特异性抗体在Y形抗体分子的每条臂上包含一个VH/VL对，其中各VH/VL与不同的目标抗原或表位结合。
全长抗体包含两条重链和两条轻链，它们各自形成一对。因此，在一个实例中，抗体链与BDM的比率为4:2。在一个实例中，该分子包含与抗体偶合的四个BDM(即在每条轻链上一个BDM且在每条重链上一个BDM)。在一个实例中，抗体链与BDM的比率为4:4。在一个实例中，该分子包含与抗体偶合的六个BDM。在一个实例中，抗体链与BDM的比率为4:6。在另一个实例中，该分子包含与抗体偶合的八个BDM。在另一个实例中，抗体链与BDM的比率为4:8。在另一个实例中，抗体链与BDM的比率为4:2n，其中n为1至5的数字，包括1和5。
在一个实例中，该免疫球蛋白抗原结合片段选自Fab、F(ab’)2、 Fab’、scFv、di-scFv、或经化学连接的F(ab’)2。
在一个实例中，该分子包含与免疫球蛋白抗原结合片段偶合的单一BDM。在一个实例中，免疫球蛋白抗原结合片段链与BDM的比率为2:1。在一个实例中，免疫球蛋白抗原结合片段链与BDM的比率为2:2。在另一个实例中，BDM的链可与抗原结合片段偶合，其中免疫球蛋白抗原结合片段链与BDM的比率为2:n，其中n为1至16 的数字。在另一个实例中，n为1至14、1至12、1至10、1至8、1 至4、或2、或1的数字。
本公开考虑了许多不同的构造，其中至少一个BDM可与全长抗体偶合，例如：
(i)至少一个BDM与抗体的重链多肽的CH3结构域的C端偶合；
(ii)至少一个BDM与轻链多肽的CH1结构域的C端偶合；
(iii)至少一个BDM与重链多肽的CH3结构域的C端偶合并与轻链多肽的CH1结构域的C端偶合；
(iv)至少一个BDM与两个重链多肽的CH3结构域的C端偶合；或
(v)至少一个BDM与两个轻链多肽的CH1结构域的C端偶合。
关于免疫球蛋白抗原结合片段，BDM可与免疫球蛋白片段的重链或轻链的C端偶合。在另一个实例中，BDM可与免疫球蛋白片段的重链和轻链两者的C端偶合。在另一个实例中，该BDM可与该免疫球蛋白片段(例如Fab)的轻链和/或重链的恒定结构域(例如CH1)偶合。
例如：
(i)至少一个BDM与Fab的轻链多肽的恒定区的C端偶合；
(ii)至少一个BDM与Fab的重链多肽的CH1的C端偶合；或
(iii)至少一个BDM与轻链多肽的恒定区的C端和Fab的重链多肽的CH1的C端偶合。
根据本公开的BDM优选地包含其内含有三个暴露的结合环(BL) 的支架或由所述支架组成。该支架可选自含免疫球蛋白样(Ig样)结构域的超家族成员、V样结构域、i-体(i-body)、VNAR或VHH。
在一个实例中，该暴露的BL序列相较于天然BL序列经修饰或置换，以提供具有对异源性目标抗原或表位的选择性结合的经改变的结合环。这些结合环分别被称为BL1、BL2与BL3，如图1A中所示。这些BL与抗体可变区的CDR1、CDR2和CDR3区类似。
在一个实例中，BL1和BL3相较于天然BL序列经修饰或置换。在另一个实例中，BL1、BL2和BL3相较于天然BL序列经修饰或置换。
在另一个实例中，BDM支架与人免疫球蛋白可变区结构域具有低于约20％的序列同一性，所述支架具有两个或更多个经改变的BL 且表现出对异源性目标抗原或表位的选择性结合。
含Ig样结构域的超家族成员可选自：V样结构域(VLD)、C-set 结构域、ThyOx家族成员多肽、T细胞受体、CD2、CD4、CD8、I 类MHC、II类MHC、CD1、细胞因子受体、G-CSF受体、GM-CSF 受体、激素受体、生长激素受体、促红细胞生成素受体、干扰素γ受体、泌乳素受体、NCAM、VCAM、ICAM、N-钙粘蛋白、E-钙粘蛋白、纤连蛋白、腱生蛋白、和含I-set结构域多肽或它们的功能片段。
根据本公开的BDM支架可选自V样结构域(VLD)、C1set结构域或C2set结构域。还设想了与蛋白或肽偶合的BDM的组合。作为举例说明，一个BDM可以为VLD而另一个BDM可以为Cset结构域。
在一个实例中，BDM支架包含天然VLD或相对于天然VLD具有改变的结合环(即经修饰的BDM)的VLD的胞外部分或由所述胞外部分组成，其中VLD来自选自以下各者的蛋白：ACAN、ADORA3、 ALCAM、JAML、AMIGO1、AXL、basigin、BCAM、BTNL2、3、8、 9或10、嗜乳脂蛋白(BTN)、细胞粘附分子(CAM)、CD2、CD4、CD7、 CD8、CD28、CD33、CD48、CD79、CD80、CD83、CD86、CD101、 CD112、CD226、CD274、CD276、CD300、与癌胚抗原相关的细胞粘附分子(CEACAM)、CRTAM、CTLA4、CXADR、C10orf54、ERMAP、ESAM、FAM187A、FCAMR、F11R、GPA33、透明质酸和蛋白聚糖连接蛋白(HAPLN)、HAVCR1、HEPACAM、HHLA2、HSPG2、ICOS、 IGHA、IGSF、JAM2、JAM3、KDR、KIRREL、LY6G6F、MCAM、 MOG、MPZ、MXRA8、NCA、NCR2、NCR3、NPHS1、PD1、PDCD1、 PIGR、PILR、PSG、PTGFRN、PVR、钠通道亚单位蛋白(SCN)、SEMA3D、 Siloadhesin蛋白(SIGLEC)、信号调节蛋白(SIRP)、SLAMF6、SLAMF7、 TIGIT、TIMD4、TREM、TREML、VCAN、VPREB、VSIG、VSTM、和VTCN1。
在一个实例中，BDM支架包含天然C-set结构域(C1-set或C2-set 结构域)或相对于天然C-set结构域具有经改变的结合环的C-set结构域(即经修饰的C-set结构域)的胞外部分或由所述胞外部分组成，其中C-set结构域来自选自以下各者的蛋白：AZGP1；basigin、B2M； CEACAM1、3、4、5、6、7、8；CD1A；CD1B；CD1C；CD1D； CD1E；DMA；DQB2；DRB1；ELK2P1；FCGRT；HFE；HHLA2； HLA-A；HLA-B；HLA-B35；HLA-B57；HLA-C；HLA-CW；HLA-Cw； HLA-D；HLA-DMA；HLA-DMB；HLA-DOA；HLA-DOB；HLA-DP； HLA-DPA1；HLA-DPB1；HLA-DQA1；HLA-DQA2；HLA-DQB1； HLA-DQB2；HLA-DRA；HLA-DRB1；HLA-DRB2；HLA-DRB3； HLA-DRB4；HLA-DRw12；HLA-Dw12；HLA-E；HLA-F；HLA-G； HLA-G2.2；HLA-H；HLAC；IGHA1；IGHA2；IGHD；IGHE；IGHG1；IGHG2；IGHG3；IGHG4；IGHM；IGHV4-31；IGKC；IGKV1-5； IGKV2-24；IGL@；IGLC1；IGLC3；IGLL1；IGLV2-14；IGLV3-21； IGLV3-25；IGLV4-3；MICA；MICB；MR1；SIRPA；SIRPB1；SIRPG；SNC73；TAPBP；TAPBPL；TRBC1；TRBV19；TRBV21-1；TRBV3-1； TRBV5-4；TRBV7-2；micB、CD2、CD4、CD80、VCAM和ICAM。
在一个实例中，BDM支架包含天然Ig样结构域或相对于天然Ig 样结构域具有经改变的结合环(即经修饰的Ig样结构域)的Ig样结构域的整体或其部分或由所述整体或其部分组成，其中Ig样结构域选自：ThyOx家族成员多肽、T细胞受体、CD2、CD4、CD8、I类MHC、II类MHC、CD1、细胞因子受体、G-CSF受体、GM-CSF受体、激素受体、生长激素受体、促红细胞生成素受体、干扰素γ受体、泌乳素受体、NCAM、VCAM、ICAM、N-钙粘蛋白、E-钙粘蛋白、纤连蛋白、腱生蛋白、和含I-set结构域多肽或它们的功能片段。
如本文所提及的术语“经修饰的VLD”、“经修饰的C-set结构域”等是指BDM，其中所暴露的结合环中的至少两个且优选所有三个被改变以提供对异源性目标抗原或表位的结合。该改变可通过各个结合环的整体或其部分的氨基酸取代或置换而实现。这些结合环中的经改变的氨基酸序列赋予对除了被未经改变的含Ig样结构域的支架所结合的目标抗原以外的目标抗原的选择性结合活性。这些氨基酸改变可以在核酸或多肽水平上使用本领域已知的方法产生。
VLD或C-set结构域可涵盖与异源性目标抗原或表位结合的 BDM。经修饰的VLD或C-set结构域也可包含改变BDM对其天然目标的亲和力的一个或多个修饰。对天然目标的亲和力相较于天然 VLD或C-set结构域可以增大或减小。
在一个实例中，经修饰的BDM包含与天然VLD或C-set结构域的序列至少约60％、70％、75％、80％、85％、87％、90％、或95％相同的序列或由所述序列组成。
本领域的技术人员对选择适当的异源性结合环序列以提供BDM 与所需目标抗原的结合将是属性的。此类实例包括在US 7,166,697 (其整个内容以引用方式并入本文)中描述的那些。
在另一个实例中，BDM包含相较于对应的天然VLD或C-set结构域蛋白含有5至30个的氨基酸取代、5至20个的氨基酸取代、5 至15个的氨基酸取代、5至10个的氨基酸取代、或最多5个氨基酸取代的VLD蛋白或C-set结构域蛋白的整体或其部分或由所述整体或其部分组成。在另一个实例中，BDM不是在US 7,094,874中描述的 CLTA-4VLD突变体分子L104EA29Y或L104E。
在某些实例中，经修饰的BDM包含一个异源性BL序列。在另一个实例中，经修饰的BDM包含两个异源性BL序列。在又一个实例中，BDM包含三个异源性BL序列。
在特定的实例中，BDM是包含CTLA4、CD28或ICOS的胞外部分或由所述部分组成的VLD支架。在另一个实例中，VLD支架是人CTLA4的胞外部分。在另一个实例中，BDM VLD包含以下所示的序列或由所述序列组成：
在一个实例中，处于位置31的丙氨酸(A)被酪氨酸(Y)取代。在一个实例中，处于位置56的甲硫氨酸(M)被苏氨酸(T)置换。
在另一个实例中，BDM VLD支架由对应于SEQ ID NO:1的残基 1至25、34至54、60至96和106至126的框架序列组成。
在另一个实例中，BDM支架包含与SEQ ID NO:1或与SEQ ID NO:1的残基1至25、34至54、60至107和116至136具有至少约70％序列同一性、或至少75％、80％、85％、87％、90％、92％、93％、 94％、95％、96％、97％98％或99％同一性的序列或由所述序列组成。
在另一个实例中，天然BDM支架的单个暴露的结合环、两个暴露的结合环或三个暴露的结合环可通过氨基酸取代、添加或缺失、和 /或通过对一个或多个物理特性(例如大小、形状、电荷、疏水性等) 的任何改变来修饰。
在另一个实例中，天然人CTLA-4VLD序列的暴露的结合环(BL1) 序列ASPGKATE(SEQ ID NO:2)或ASPGKYTE(SEQ ID NO:7)、和/ 或暴露的环(BL2)序列MMGNE(SEQ ID NO:3)和/或暴露的结合环 (BL3)序列ELMYPPPYY(SEQ ID NO:4)通过氨基酸取代、添加或缺失而修饰或被异源性序列置换。
在一个实例中，处于SEQ ID NO:1的位置26至33、和/或位置 55至59和/或位置98至105的氨基酸残基被修饰或置换。
在另一个实例中，处于SEQ ID NO:1的位置27至33、和/或位置54至62和/或位置98至106的氨基酸残基被修饰或被异源性序列置换。
在另一个实例中，对天然人CTLA-4VLD进行修饰的作用是消除VLD对CD80和CD86的天然亲和力。
在一个实例中，BDM VLD支架包含以下序列或由所述序列组成： KAMHVAQPAVVLASSRGIASFVCEYXn1VRVTVLRQADSQVTEVC AATYXn2LTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAMDTGLYICKVXn3 LGIGNGTQIYVIDPEPSPDSN(SEQ ID NO:5)其中X、X和X是任何氨基酸残基并且n为5至15的数字且数字1、2和3指示结合环区域。更具体地讲，1、2和3分别对应于BDM的BL-1、BL-2和BL-3。
在一个实例中，BDM VLD支架包含以下序列或由所述序列组成： KAMHVAQPAVVLASSRGIASFVCEYXn1EVRVTVLRQADSQVTEV CAATYXn2LTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAMDTGLYICKVXn3GIGNGTQIYVIDPEPSPDSN(SEQ ID NO:6)其中X、X和X是任何氨基酸残基并且n为5至15的数字且数字1、2和3指示结合环区域。更具体地讲，1、2和3分别对应于BDM的BL-1、BL-2和BL-3。
在一个实例中，BDM的BL-1、BL-2和BL-3分别包含ASPGKATE (SEQ ID NO:2)或ASPGKYTE(SEQ ID NO:7)、MMGNE(SEQ ID NO:3)和ELMYPPPYYL(SEQ ID NO:9)或由它们组成，其中BDM与 B7-1结合。
在一个实例中，该分子的BDM的BL-1、BL-2和BL-3分别包含 TVSWVDME(SEQ ID NO:10)、WNGRW(SEQ ID NO:11)和QLDPSWGYYWQGYE(SEQ ID NO:12)或由它们组成，其中BDM与硬骨素(sclerostin)结合。
在一个实例中，BDM VLD包含以下序列或由所述序列组成： KAMHVAQPAVVLASSRGIASFVCEYASPGKYTEVRVTVLRQADSQ VTEVCAATYMTGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAMDTG LYICKVELMYPPPYYLGIGNGTQIYVIDPEPSPDSN(SEQ ID NO:13)，其中BDM与B7-1结合。
在另一个实例中，BDM VLD包含以下序列或由所述序列组成： KAMHVAQPAVVLASSRGIASFVCEYTVSWVDMEVRVTVLRQADS QVTEVCAATYWNGRWLTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAMD TGLYICKVQLDPSWGYYWQGYEGIGNGTQIYVIDPEPSPDSN (SEQ ID NO:14)，其中BDM与硬骨素结合。
在另一个实例中，BDM的BL-1、BL-2和BL-3分别被抗体的 CDR1、CDR2和CDR3序列置换。衍生出CDR序列的抗体可衍生自任何物种。在一个实例中，抗体衍生自人。在另一个实例中，抗体衍生自家畜，例如猫、狗、兔、豚鼠或马。
在一个实例中，该至少一个BDM可以单体形式或二聚体形式存在于该分子中。在另一个实例中，该至少一个BDM可由一系列连接在一起的BDM单体组成。
因此，如本文所用的术语“BDM”旨在包括呈单体形式的BDM。在一个实例中，BDM为二聚体。二聚体可通过CTLA4单体的柄部(各柄部对应于将VLD连接至跨膜区的约10个残基)中的半胱氨酸残基 (Cys120)之间的二硫键来形成。或者，该二聚体可通过连接单体单元而形成。在一个实例中，一系列(或菊花链)的单体BDM可被连接在一起。例如，2至16个的BDM单体可以像菊花链的布置方式头尾连结。在另一个实例中，2至14个、2至12个、2至10个、2至8个、或2至4个的BDM被头尾连结。
BDM单体的连接可例如通过使用共价或非共价键或通过使用如本文进一步描述的短肽接头来实现。可利用本文提及的连接方法中的任一种将BDM单体连接在一起。或者，相邻的BDM单体可被直接融合在一起。
在一个实例中，该BDM是可溶的。本公开的BDM支架的“溶解性”与正确折叠的单体结构域的产生有关。溶解性可例如通过高效液相色谱(HPLC)评估。例如，可溶性单体BDM将在HPLC色谱图上产生单个峰，而不溶性(例如多聚体或聚集的)BDM将产生多个峰。
该至少一个BDM与该药理活性蛋白的偶合可通过本领域技术人员已知的方法实现。偶合可例如通过使用接头、通过直接融合、通过缀合作用或通过共价或非共价键合来实现。
在一个实例中，该药理活性蛋白与该至少一个BDM的偶合借助肽接头实现。本领域已知的任何适合的肽接头均可用于本公开。在一个实例中，该接头包含序列(SGGGG)nS,(SEQ ID NO:15)，其中n为2 至8、或3至6或3至4的任何数字。在一个实例中，该接头包含序列SGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:16)或 SGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:17)或由所述序列组成
在另一个实例中，该药理活性蛋白与该至少一个BDM的偶合在不使用接头的情况下实现。
在一个实例中，该分子能够与第一、第二和/或任选地第三目标抗原同时结合。
在另一个实例中，该分子能够同时与B7-1-Fc和硬骨素结合。
在另一个实例中，该药理活性蛋白或肽和该至少一个BDM与它们各自的目标抗原特异性结合。在另一个实例中，该分子与表达被该分子的各个BDM和药学活性蛋白部分识别的两种或更多种不同的目标抗原或表位的细胞选择性结合，但不与仅仅表达这些目标抗原或表位之一的细胞结合。
本公开也提供包含与药理活性蛋白或肽偶合的BDM支架的多肽。在一个实例中，该多肽还包含接头。在一个实例中，该接头包含序列 (SGGGG)nS，其中n为2至8、或3至6或3至4的任何数字。在一个实例中，该接头包含序列SGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:16) 或SGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:17)或由所述序列组成。
本公开还提供一种多肽，该多肽选自包含以下任一者的序列或由所述序列组成的组：SEQ ID NO:5、6、13、14、19、21、22、23、24、 25、27、28或29。优选地，该多肽经分离。在一个实例中，本公开的多肽包含多肽标签。适合的标签的实例包括但不限于p97分子、 myc、六组氨酸标签、flag、E7。
在一个实施方案中，根据本公开的分子是核酸。本公开还提供编码本公开的多肽尤其是SEQ ID NO:5、6、13、19、21、22、23、24、 25、27、28或29中的任一者的多肽的核酸。核酸可包括DNA或RNA 或两者。
在一个实例中，该分子包含以下所示的BDM VLD的核酸序列或由所述核酸序列组成：
其中N1是编码第一结合环的核苷酸的长度，N2是编码第二结合环的核苷酸的长度且N3是编码第三结合环的核苷酸的长度。在一个实例中，N1、N2和N2是15至45个的核苷酸。在一个实例中， N1是15至24个的核苷酸。N2是15个核苷酸且N3是30至45个的核苷酸。N为任何核苷酸(A、C、T、G)。
在一个实例中，该核酸在表达构建体中提供，在该构建体中核酸可操作地连接至启动子。这样的表达构建体可在载体(例如质粒)中。在一个实例中，该表达构建体可以是双顺反子表达构建体。本公开还设想了用于抗体或免疫球蛋白抗原结合片段的重链和轻链的单独的表达构建体。例如，一个载体可包含编码免疫球蛋白轻链和BDM VLD的核酸，而另一个包含码免疫球蛋白重链的核酸，反之亦然。
该核酸可进一步包含促进纯化和鉴定的部分(例如FLAG)。用于在多种不同的宿主细胞中克隆和表达多肽的系统是已知的且如本文进一步描述。
本公开也提供用本文所述的核酸转化的宿主细胞。适合的宿主细胞包括细菌、哺乳动物细胞、酵母、苔藓(苔藓植物)、和杆状病毒系统。
本公开也提供用于制造本公开的多肽分子的方法，其包括在使该多肽能够表达的条件下培养本公开的宿主细胞并任选地回收该多肽。取决于宿主细胞的选择，多肽可经糖基化或未经糖基化。
本公开也提供用于制造包含与药理活性蛋白偶合的至少一个 BDM VLD的多特异性分子的方法，该方法包括：
(i)提供编码BDM VLD序列的核酸，其中该VLD的三个BL中的至少两个经修饰或被异源性序列置换；
(ii)提供编码药理活性蛋白或肽的核酸；以及
(iii)任选地提供编码接头序列的核酸；
(iv)在适合的载体中表达核酸序列；
(v)回收所表达的蛋白。
本公开也提供用于制造包含与抗体偶合的至少一个BDM VLD 的多特异性分子的方法，该方法包括：
(i)提供编码抗体轻链序列或其部分的核酸；
(ii)提供编码抗体重链序列或其部分的核酸；
(iii)提供编码BDM VLD序列的核酸，其中该VLD的三个BL 中的至少两个经修饰或被异源性序列置换；
(iv)在一个或多个适合的载体中表达核酸序列；以及
(v)回收所表达的蛋白。
在根据该方法的一个实例中，该抗体重链由全长序列组成。在根据该方法的另一个实例中，该抗体重链由可变区和至少CH1区组成。在另一个实例中，该抗体重链由可变区和至少CH1和CH2区组成。
在根据该方法的一个实例中，不存在接头序列且该药理活性蛋白或肽和BDM VLD的核酸序列是邻接的。在另一个实例中，不存在接头序列且编码抗体重链和/或轻链和BDM序列的核酸序列是邻接的。
抗体核酸序列可进一步包含铰链区。
本公开也提供一个或多个包含一个或多个本文所述的核酸序列的载体。在一个实例中，该载体包含编码如本文所述的药理活性蛋白和BDM VLD的核酸序列且任选地包含编码接头的核酸序列。在一个实例中，该一个或多个载体包含编码如本文所述的抗体轻链或重链的核酸序列和编码BDM VLD的核酸序列且任选地包含编码接头的核酸序列。在另一个实例中，该一个或多个载体包含编码如本文所述的抗体重链和轻链两者的核酸序列和编码BDM VLD的核酸序列且任选地包含编码接头的核酸序列。
本公开也提供宿主细胞，其含有本文所述的载体或含有本文所述的一个或多个核酸序列。
本公开也提供通过本文所述的方法制造的多特异性分子。
本公开的分子可以组合物的形式提供。因此，在另一个实施方案中，本公开提供包含本文所述的多特异性分子连同药学上可接受的载剂和/或赋形剂的药物组合物。该组合物可以药品的形式提供。在一个实例中，该组合物用于治疗失调。在另一个实例中，该组合物用于抗衰老或作为化妆品。
在另一个实例中，该分子可以用试剂标记以促进检测。
本公开的组合物也可以试剂盒的形式提供，该试剂盒具有根据特定治疗适应症的使用说明。
本公开也提供如本文所述的多特异性分子的用途，其用于检测该分子的一个或多个部分所结合的一个或多个目标抗原。
附图说明
图1提供(A)天然人CTLA4VLD支架的序列的示意图，该示意图显示框架序列和结合环1、2和3的序列所在的位置(称为BL1、BL2 与BL3)。B显示在CTLA4VLD中的结合环置换的位置，其中BL1 由Xn1指定、BL2由Xn2指定且BL3由Xn3指定，其中X是任何氨基酸且n为5至15的数字。C显示硬骨素人VLD支架的序列，其中结合环区的序列带有下划线。
图2显示根据本公开的一个实例的抗体-VLD双特异性分子的示意图。该抗体经由其重链和轻链V结构域与目标A结合。附接至该抗体重链的C端CH3恒定结构域的VLD与目标B结合。该双特异性物可与目标A和B两者单独地或同时地结合。
图3显示根据本公开的一个实例的抗体-VLD双特异性分子的示意图。该抗体经由其重链和轻链V结构域与目标A结合。VLD附接于轻链(恒定轻，CL)的各恒定结构域的C端并与目标B结合。该双特异性物可与目标A和B两者单独地或同时地结合。
图4显示根据本公开的一个实例的抗体-VLD三特异性分子的示意图。该抗体经由其重链和轻链V结构域与目标A结合。VLD附接至各轻链恒定结构域(CL)和重链恒定结构域(CH3)的C端。该三特异性物可与目标A和B和C单独地或同时地或与三个目标的组合(例如目标A和B、或目标A和C、或目标B和C)结合。
图5显示根据本公开的一个实例的Fab-VLD双特异性分子的示意图。Fab经由其重链和轻链V结构域与目标A结合。VLD附接至重链恒定结构域(CH1)的C端并与目标B结合。该双特异性物可与目标A和B两者单独地或同时地结合。
图6显示根据本公开的一个实例的Fab-VLD双特异性分子的示意图。Fab经由其重链和轻链V结构域与目标A结合。VLD附接至轻链恒定结构域(CL)的C端并与目标B结合。该双特异性物可与目标A和B两者单独地或同时地结合。
图7显示根据本公开的一个实例的Fab-VLD三特异性分子的示意图。Fab经由其重链和轻链V结构域与目标A结合。一个VLD附接至轻链恒定结构域(CL)的C端并与目标B结合且一个VLD附接至重链恒定结构域(CH1)的C端并与目标C结合。该三特异性物可与目标A和B和C单独地或同时地或与三个目标的组合(例如目标A和B、或目标A和C、或目标B和C)结合。
图8显示在非还原条件下亲本D1.3 Fab以及双特异性和三特异性变体的表达(SDSPAGE)。D1.3 Fab是抗溶菌酶Fab；D1.3 FabVLDx1 (HC)是具有融合至重链的CH1结构域的VLD的抗溶菌酶Fab；D1.3 Fab-VLDx1(LC)是具有融合至轻链的CL结构域的VLD的抗溶菌酶Fab；D1.3 Fab-VLDx2(HC+LC)是具有融合至重链的CH1结构域和轻链的CL结构域的VLD的抗溶菌酶Fab。
图9显示在还原条件下亲本D1.3 Fab、双特异性和三特异性变体的SDS PAGE表达分析。D1.3 Fab是抗溶菌酶Fab；D1.3 FabVLDx1 (HC)是具有融合至重链的CH1结构域的VLD的抗溶菌酶Fab；D1.3 VLDx1(LC)是具有融合至轻链的CL结构域的VLD的抗溶菌酶Fab；D1.3 VLDx2(HC+LC)是具有融合至重链的CH1结构域和轻链的CL 结构域的VLD的抗溶菌酶Fab。
图10显示双特异性[IgG VLDx2(HC)]对经链霉亲和素捕获的生物素所标记的溶菌酶的最初结合接着对B7.1-Fc的二次结合的分析。该双特异性物具有融合至D1.3抗体[D1.3 IgG]重链的B7-1结合性VLD。曲线1是D1.3抗溶菌酶抗体对固定在生物传感器表面上的溶菌酶的结合，接着在点1处添加缓冲剂。曲线2是D1.3抗溶菌酶抗体对溶菌酶的结合，接着在点1处添加B7-1-Fc。B7-1-Fc在点2 处用缓冲剂替换。曲线3是双特异性物-D1.3IgG-VLDx2(HC)对固定在生物传感器表面上的溶菌酶的结合，接着在点1处添加缓冲剂。曲线4是双特异性物-D1.3 IgG-VLDx2(HC)对固定在生物传感器表面上的溶菌酶的结合，接着在点1处添加B7-1-Fc。B7-1-Fc在点2 处用缓冲剂替换。该传感图(sensogram)展示对溶菌酶和B7-1-Fc的同时、双目标结合。
图11显示双特异性[IgG VLDx2(LC)]对经链霉亲和素捕获的生物素所标记的溶菌酶的最初结合接着对B7-1-Fc的二次结合的分析。该双特异性物具有融合至D1.3抗体[D1.3 IgG]轻链的B7-1结合性VLD。曲线1是D1.3抗溶菌酶抗体对固定在生物传感器表面上的溶菌酶的结合，接着在点1处添加缓冲剂。曲线2是D1.3抗溶菌酶抗体对固定在生物传感器表面上的溶菌酶的结合，接着在点1处添加B7-1-Fc。B7-1-Fc在点2处用缓冲剂替换。曲线3是双特异性物- D1.3 IgG-VLDx2(LC)对固定在生物传感器表面上的溶菌酶的结合，接着在点1处添加缓冲剂。曲线4是双特异性物-D1.3 IgG-VLDx2 (LC)对固定在生物传感器表面上的溶菌酶的结合，接着在点1处添加 B7-1-Fc。B7-1-Fc在点2处用缓冲剂替换。该传感图展示对溶菌酶和 B7-1-Fc的同时、双目标结合。
图12显示三特异性[IgG VLDx4(HCLC)]对经链霉亲和素捕获的生物素所标记的溶菌酶的最初结合接着对B7-1-Fc的二次结合的分析。该三特异性物具有融合至D1.3抗体[D1.3 IgG]重链和轻链两者的B7-1结合性VLD。曲线1是D1.3抗溶菌酶抗体对固定在生物传感器表面上的溶菌酶的结合，接着在点1处添加缓冲剂。曲线 2是D1.3抗溶菌酶抗体对固定在生物传感器表面上的溶菌酶的结合，接着在点1处添加B7-1-Fc。B7-1-Fc在点2处用缓冲剂替换。曲线3 是三特异性D1.3 IgG-VLDx4(HCLC)对固定在生物传感器表面上的溶菌酶的结合，接着在点1处添加缓冲剂。曲线4是三特异性物-D1.3 IgG-VLDx4(HCLC)对固定在生物传感器表面上的溶菌酶的结合，接着在点1处添加B7-1-Fc。B7-1-Fc在点2处用缓冲剂替换。该传感图展示对溶菌酶和B7-1-Fc的同时、双目标结合。
图13显示分析，展示了三特异性物相对于双特异性物对 B7-1-Fc的结合增加。将相等数量的抗体、双特异性分子和三特异性分子捕获在附接至生物传感器表面的经生物素标记的溶菌酶上，接着添加缓冲剂或B7-1-Fc(在点1处)以展示三特异性物相对于双特异性物的结合能力增加。曲线1是用于构建双特异性物和三特异性物的 D1.3抗溶菌酶抗体[D1.3 IgG]。示出了所结合的抗体，以及仅在点1 处注射的缓冲剂。曲线2是D1.3抗溶菌酶抗体[D1.3 IgG]，示出了在点1处注射的B7-1-Fc。在点2处，B7-1-Fc用缓冲剂替换。曲线3 是具有融合至抗体CL链的VLD的双特异性D1.3抗溶菌酶抗体[双特异性物-D1.3IgGVLDx2(LC)]。所捕获的双特异性物被显示为与在点1处注射的B7-1-Fc结合。在点2处，B7-1-Fc用缓冲剂替换。曲线4是具有融合至抗体CH和CL链的VLD的三特异性D1.3抗溶菌酶抗体[三特异性物-D1.3 IgG-VLDx4(HC+LC)]。所捕获的双特异性物被显示为与在点1处注射的B7-1-Fc结合。在点2处，B7-1-Fc用缓冲剂替换。
图14显示被叠在一起的一系列SPR结合传感图，它们显示双特异性[IgG VLDx2(HC)]对经链霉亲和素捕获的生物素所标记的溶菌酶的最初结合接着对一系列浓度的B7-1-Fc(50、25、12.5、6.25、3.125、 1.56和0μg/ml)的二次结合。该双特异性物具有融合至D1.3抗体[D1.3 IgG]重链的B7-1结合性VLD。
图15显示被叠在一起的一系列SPR结合传感图，它们显示双特异性[IgG VLDx2(LC)]对经链霉亲和素捕获的生物素所标记的溶菌酶的最初结合接着对一系列浓度的B7-1-Fc(50、25、12.5、6.25、3.125、 1.56和0μg/ml)的二次结合。该双特异性物具有融合至D1.3抗体[D1.3 IgG]轻链的B7-1结合性VLD。
图16显示被叠在一起的一系列SPR结合传感图，它们显示三特异性[IgG VLDx4(HC+LC)]对经链霉亲和素捕获的生物素所标记的溶菌酶的最初结合接着对一系列浓度的B7-1-Fc(50、25、12.5、6.25、 3.125、1.56和0μg/ml)的二次结合。该三特异性物具有融合至D1.3 抗体[D1.3 IgG]重链和轻链两者的B7-1结合性VLD。
图17显示重叠的SPR结合传感图，它们显示双特异性 [Fab-VLDx1(HC)]对溶菌酶的结合接着对一系列浓度的B7-1-Fc(25、 12.5、6.25、3.125、1.56μg/ml)的同时结合。该双特异性物具有融合至D1.3 Fab[D1.3 Fab]重链的B7-1结合性VLD。
图18显示重叠的SPR结合传感图，它们显示双特异性 [Fab-VLDx1(LC)]对溶菌酶的结合接着对一系列浓度的B7-1-Fc(25、 12.5、6.25、3.125、1.56μg/ml)的同时结合。该双特异性物具有融合至D1.3 Fab[D1.3 Fab]轻链的B7-1结合性VLD。
图19显示重叠的SPR结合传感图，它们显示三特异性 [Fab-VLDx2(HC+LC)]与溶菌酶的结合接着对一系列浓度的B7-1-Fc (25、12.5、6.25、3.125、1.56μg/ml)的同时结合。该三特异性物具有融合至D1.3 Fab[D1.3 Fab]重链和轻链两者的B7-1结合性VLD。
图20显示作为由针对双特异性和三特异性抗体-VLD分子与 B7-1-Fc的结合的SPR分析所测定的RMAX(最大能力)的百分比而测定的结合化学计量。
图21显示作为由针对双特异性和三特异性Fab-VLD分子与 B7-1-Fc的结合的SPR分析所测定的RMAX的百分比而测定的结合化学计量。
图22显示被叠在一起的一系列SPR结合传感图，它们展示三特异性[IgG VLDx4(Scl-HC)(B7-LC)]与经链霉亲和素捕获的生物素所标记的溶菌酶的最初结合接着与B7-1-Fc和硬骨素的相继和同时结合。该三特异性物具有融合至D1.3抗体[D1.3 IgG]重链的硬骨素(Scl)结合性VLD和融合至轻链的B7-1结合性VLD。仅B7-1-Fc的曲线是该三特异性物的传感图，其显示与固定在生物传感器表面上的溶菌酶的结合，接着添加B7-1-Fc。该传感图展示与溶菌酶和B7-1-Fc的同时、双目标结合。仅硬骨素的曲线是三特异性物的传感图，其显示与固定在生物传感器表面上的溶菌酶的结合，接着添加硬骨素。该传感图展示与溶菌酶和硬骨素的同时、双目标结合。B7-1-Fc和硬骨素曲线是该三特异性物的传感图，其显示与固定在生物传感器表面上的溶菌酶的结合，接着添加B7-1-Fc，然后再添加硬骨素。该传感图展示与溶菌酶和B7-1-Fc及硬骨素的同时、三目标结合。
注射三特异性物：IgG VLDx4(Scl-HC)(B7-LC)被添加至传感器表面的点。曲线显示IgG VLDx4(Scl-HC)(B7-LC)对固定在生物传感器表面上的溶菌酶的结合。
注射缓冲剂1：IgG VLDx4(Scl-HC)(B7-LC)的注射被停止并用缓冲剂替换的点。曲线显示IgG VLDx4(Scl-HC)(B7-LC)从固定在生物传感器表面上的溶菌酶的解离
注射B7-1-Fc：第二分析物B7-1-Fc被添加的点。曲线显示B7-1-Fc 对仍与固定在生物传感器表面上的溶菌酶结合的IgG VLDx4 (Scl-HC)(B7-LC)的结合。
注射缓冲剂2：B7-1-Fc的注射被停止并用缓冲剂替换的点。曲线显示B7-1-Fc从仍与固定在生物传感器表面上的溶菌酶附接的IgG VLDx4(Scl-HC)(B7-LC)的解离
注射硬骨素：第三分析物硬骨素被添加的点。曲线显示硬骨素对仍与固定在生物传感器表面上的溶菌酶结合的IgG VLDx4 (Scl-HC)(B7-LC)的结合，而IgG VLDx4(Scl-HC)(B7-LC)仍同时结合 B7-1-Fc。
注射缓冲剂3：硬骨素的注射被停止并用缓冲剂替换的点。曲线显示硬骨素从仍与固定在生物传感器表面上的溶菌酶附接的IgG VLDx4(Scl-HC)(B7-LC)的解离。
图23显示结合分析，展示了三特异性[Fab VLDx2(B7-HC) (Scl-LC)]与经链霉亲和素捕获的生物素所标记的溶菌酶的最初结合接着与B7-1-Fc和硬骨素的相继和同时结合。该三特异性物具有融合至D1.3 Fab[D1.3 Fab]轻链的硬骨素结合性VLD和融合至重链的 B7-1结合性VLD。曲线显示该三特异性物对固定在生物传感器表面上的溶菌酶的结合，接着添加B7-1-Fc。该结合曲线展示与溶菌酶和 B7-1-Fc的同时、双目标结合。添加硬骨素以展示与溶菌酶和B7-1-Fc 及硬骨素的同时、三目标结合。
添加三特异性物：Fab VLDx2(B7-1-HC)(Scl-LC)被添加至传感器表面的点。曲线显示Fab VLDx2(B7-1-HC)(Scl-LC)对固定在生物传感器表面上的溶菌酶的结合。
添加B7-1-Fc：B7-1-Fc被添加的点。曲线显示B7-1-Fc对仍与固定在生物传感器表面上的溶菌酶结合的Fab VLDx2(B71-HC)(Scl-LC) 的结合。
添加硬骨素：硬骨素被添加的点。曲线显示硬骨素对仍与固定在生物传感器表面上的溶菌酶结合的Fab VLDx2(B71-HC)(Scl-LC)的结合，而Fab VLDx2(B71-HC)(Scl-LC)仍同时结合B7-1-Fc。
添加缓冲剂：硬骨素用缓冲剂替换的点。
图24显示结合分析，展示了三特异性[Fab VLDx2(Scl-HC) (B7-LC)]与经链霉亲和素捕获的生物素所标记的溶菌酶的最初结合，接着与B7-1-Fc和硬骨素的相继和同时结合。该三特异性物具有融合至D1.3 Fab[D1.3 Fab]重链的硬骨素结合性VLD和融合至轻链的 B7-1结合性VLD。曲线显示该三特异性物对固定在生物传感器表面上的溶菌酶的结合，接着添加B7-1-Fc。该结合曲线展示与溶菌酶和 B7-1-Fc的同时、双目标结合。添加硬骨素以展示与溶菌酶和B7-1-Fc 及硬骨素的同时、三目标结合。
添加三特异性物：Fab VLDx2(Scl-HC)(B7-LC)被添加至传感器表面的点。曲线显示Fab VLDx2(Scl-HC)(B7-LC)对固定在生物传感器表面上的溶菌酶的结合。
添加B7-1-Fc：B7-1-Fc被添加的点。曲线显示B7-1-Fc对仍与固定在生物传感器表面上的溶菌酶结合的Fab VLDx2(Scl-HC)(B7-LC) 的结合。
添加硬骨素：硬骨素被添加的点。曲线显示硬骨素对仍与固定在生物传感器表面上的溶菌酶结合的Fab VLDx2(Scl-HC)(B7-LC)的结合，而Fab VLDx2(Scl-HC)(B7-LC)仍同时结合B7-1-Fc。
添加缓冲剂：硬骨素用缓冲剂替换的点。
图25显示根据本公开的一个实例的与VLD偶合的蛋白(一般表示形式)的示意图。该蛋白与目标A结合。VLD附接至蛋白多肽的C 端并与目标B结合。该双特异性物可与目标A和B两者单独地或同时地结合。
图26显示使用抗His辣根过氧化酶(HRP)对经纯化的人血清白蛋白(HAS)-VLD融合蛋白的蛋白质印迹分析和检测。第1道是具有融合至C端的VLD的HSA；第2道是具有融合至N端的VLD的HSA；第3道是具有融合至N端和C端两者的VLD的HSA。
图27显示使用ForteBio Blitz生物传感器以展示HSA-VLD融合蛋白与B7-2-Fc的结合的分析。曲线1对应于呈附接至HSA的C端的B7-2结合性VLD的HSA-VLD融合蛋白。曲线2对应于具有附接至HSA的N端和C端两者的B7-2结合性VLD的VDL-HSA-VLD 构建体。点1对应于缓冲剂的添加。
图28显示使用ForteBio Blitz生物传感器以展示HSA-VLD与 CD3的结合的分析。所显示的曲线对应于该分子与CD3de的结合。点1对应于缓冲剂的添加。
图29显示使用ForteBio Blitz生物传感器以展示HSA-VLD融合蛋白与抗HSA亲和体(affibody)和B7-2-Fc的结合的分析。所显示的曲线对应于该分子与抗HSA亲和体的结合。点1、2和3对应于缓冲剂的添加。
序列表的索引
SEQ ID NO:1人天然CTLA4支架(胞外结构域)的序列
SEQ ID NO:2CTLA4的暴露的结合环1的序列
SEQ ID NO:3CTLA4的暴露的结合环2的序列
SEQ ID NO:4CTLA4的暴露的结合环3的序列
SEQ ID NO:5BDM VLD支架的序列
SEQ ID NO:6BDM VLD支架的序列
SEQ ID NO:7结合环1序列
SEQ ID NO:8信号肽序列
SEQ ID NO:9结合环3序列
SEQ ID NO:10结合环1序列
SEQ ID NO:11结合环2序列
SEQ ID NO:12结合环3序列
SEQ ID NO:13B7-1结合性VLD支架的序列
SEQ ID NO:14硬骨素结合性VLD支架的序列
SEQ ID NO:15接头序列
SEQ ID NO:16接头序列
SEQ ID NO:17接头序列
SEQ ID NO:18抗溶菌酶IgG1重链的序列
SEQ ID NO:19通过接头与B7-1结合性VLD偶合的抗溶菌酶 IgG1重链的序列
SEQ ID NO:20抗溶菌酶IgGκ轻链的序列
SEQ ID NO:21通过接头与B7-1结合性VLD偶合的抗溶菌酶 IgGκ轻的序列
SEQ ID NO:22通过接头与B7-1结合性VLD偶合的抗溶菌酶 Fabκ轻链的序列
SEQ ID NO:23通过接头与B7-1结合性VLD偶合的抗溶菌酶 Fab重链的序列
SEQ ID NO:24具有C端组氨酸和myc标签的抗溶菌酶Fab重链的序列
SEQ ID NO:25融合至抗硬骨素VLD的抗溶菌酶IgG1重链的序列
SEQ ID NO:26融合至人血清白蛋白的C端的B7-2结合性VLD 的序列
SEQ ID NO:27融合至人血清白蛋白的N端的B7-2结合性VLD 的序列
SEQ ID NO:28融合至人血清白蛋白的N端和C端两者的B7-2 结合性VLD的序列
SEQ ID NO:29融合至人血清白蛋白的C端的CD3结合性VLD 的序列
SEQ ID NO:30BDM VLD支架的核苷酸序列。
具体实施方式
概述
在本说明书通篇中，除非明确地另外陈述或上下文另外要求，否则提及单个步骤、物质组合物、步骤的群组或物质组合物的群组应被理解成涵盖一个和多个这些步骤、物质组合物、步骤的群组或物质组合物的群组。
本领域的技术人员将领会到本公开容许这些具体描述的内容以外的变化和修饰。应了解，本公开包括所有此类变化和修饰。本公开也包括在本说明书中单独或共同提及或指出的所有步骤、特征、组合物和化合物，以及所述步骤或特征中的任何两者或更多者的任何及所有组合。
本公开的任何实例或实施方案应被理解为加以必要的变更也适用于本公开的任何其他实例，除非明确地另外陈述。
除非明确地另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语应被理解成具有与本领域(例如，在细胞培养、分子遗传学、免疫学、免疫组织化学、蛋白化学和生物化学中)的普通技术人员通常了解的相同含义。
除非另外指出，否则在本公开中利用的重组蛋白、细胞培养和免疫技术是本领域的技术人员熟知的标准程序。此类技术在诸如以下来源的文献中有所描述和解释：J.Perbal,A Practical Guide to Molecular Cloning,John Wiley and Sons(1984),J.Sambrook等人Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring HarbourLaboratory Press (1989),T.A.Brown(编辑),Essential Molecular Biology:APractical Approach,第1和2卷,IRL Press(1991),D.M.Glover和B.D.Hames (编辑),DNACloning:A Practical Approach,第1-4卷,IRL Press(1995 和1996)以及F.M.Ausubel等人(编辑),Current Protocols in Molecular Biology,Greene Pub.Associates andWiley-Interscience(1988,包括迄今的所有更新),Ed Harlow和David Lane(编辑)Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbour Laboratory,(1988)以及J.E.Coligan等人(编辑)Current Protocols in Immunology,John Wiley& Sons(包括迄今的所有更新)。
在本文中对可变区及其部分、免疫球蛋白、抗体及其片段的描述和定义可通过以下文献中的论述而进一步澄清：Kabat Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,National Institutes of Health, Bethesda,Md.,1987和1991,Bork等人,JMol.Biol.242,309-320,1994, Chothia和Lesk J.Mol Biol.196:901-917,1987,Chothia等人Nature 342,877-883,1989和/或Al-Lazikani等人,J Mol Biol 273,927-948, 1997。
术语“和/或”例如“X和/或Y”应被理解成表示“X和Y”或“X或Y”，且应被理解成对两种含义或任一种含义提供明确的支持。
如本文所用，“一个/种”表示“至少一个/种”或“一个/种或多个/种”，除非上下文另有暗示。
在本说明书通篇中，词语“包含”或诸如“含有”的变型形式将被理解成暗示包含所陈述的要素、整数或步骤，或要素、整数或步骤的群组，但不排除任何其他要素、整数或步骤，或要素、整数或步骤的群组。
所选的定义
用在本文的氨基酸序列中的字母“x”旨在表示二十种标准氨基酸的任一种可置于该位置，除非明确地另外说明。
如本文所用，“同一性”表示当两个或更多个序列被比对以使序列匹配最大化(即考虑到间隙和插入)时在这些序列中的对应位置处的相同核苷酸或氨基酸残基的百分比。同一性可通过已知方法容易地计算，这些方法包括但不限于以下文献中描述的那些：Computational Molecular Biology,Lesk,A.M.编,Oxford University Press,New York,1988；Biocomputing:Informatics and Genome Projects,Smith,D.W.编, AcademicPress,New York,1993；Computer Analysis of Sequence Data, 第I部分,Griffin,A.M.和Griffin,H.G.编,Humana Press,New Jersey, 1994；Sequence Analysis in MolecularBiology,von Heinje,G., Academic Press,1987；以及Sequence Analysis Primer,Gribskov,M.和 Devereux,J.编,M Stockton Press,New York,1991；以及Carillo,H.和Lipman,D.,SIAM J.Applied Math.,48:1073(1988)。用于测定同一性的方法被设计成在所测试的序列之间给出最大的匹配。此外，用于测定同一性的方法被编成公众可得的计算机程序。用于测定两个序列之间的同一性的计算机程序方法包括但不限于GCG程序包(Devereux,J. 等人.,Nucleic Acids Research 12(1):387(1984))、BLASTP、BLASTN 和FASTA(Altschul,S.F.等人,J.Molec.Biol.215:403-410(1990)和 Altschul等人Nuc.Acids Res.25:3389-3402(1997))。BLAST X程序可从NCBI和其他来源公开获得(BLASTManual,Altschul,S.等人, NCBI NLM NIH Bethesda,Md.20894；Altschul,S.等人,J.MoI.Biol. 215:403-410(1990)。
如本文所用的术语“序列同一性”表示在比对本公开的多肽的序列与讨论中的序列之后，两两相同的残基关于这两个序列中的较长者的残基数目的百分比。同一性通过相同残基的数目除以残基的总数并将结果乘以100来测量。因此，两个序列之间的同一性通常将以百分比表示。
术语“免疫球蛋白”涉及保持抗体分子的免疫球蛋白折叠特性的多肽的家族，其含有两个β折叠且通常含有保守的二硫键。Ig超家族的成员包括抗体、T细胞受体分子等、ICAM分子(在细胞粘附中涉及到)、在细胞信号传导中涉及到的受体分子诸如PDGF受体。优选地，本发明涉及抗体。
“免疫球蛋白样结构域”涉及一种存在于具有多样功能的蛋白(包括例如细胞外基质蛋白、肌肉蛋白、免疫蛋白、细胞表面受体和酶) 中的β夹层结构基序。Ig样结构域成员已被分成各种超家族，包括例如免疫球蛋白、III型纤连蛋白和钙粘蛋白超家族。其他含有Ig样结构域结构基序的超家族包括例如PKD结构域、β-半乳糖苷酶/葡萄糖醛酸酶结构域、转谷氨酰胺酶二C端结构域、放线黄质素 (actinoxanthin)样、CuZn过氧化物歧化酶样、CBD9样、核纤层蛋白 A/C球状尾部结构域、网格蛋白衔接子附加结构域(clathrin adaptorappendage domain)、整联蛋白结构域、PapD样、紫色酸性磷酸酶N 端结构域、过氧化物还原酶样、硫醇:二硫化物互变蛋白DsbD N端结构域和侵袭素/紧密粘附素(invasin/intimin)细胞粘附片段超家族的成员。无论是否有显著的序列同一性，在不同超家族的成员之间都维持 Ig样结构域结构相似性。该术语旨在包括各超家族内和跨各超家族的 Ig样结构域成员。因此，术语“含免疫球蛋白样(Ig样)结构域的超家族”旨在表示这些超家族以及本领域已知的其他超家族的任一者内的含Ig样结构域的成员多肽。对不同的含Ig样结构域的超家族的描述可见于例如Clarke等人，Structure Fold.Des.7:1145-53(1999)和结构数据库，诸如在URL pdb.weizmann.ac.il/scop/data/scop.b.c.b.html的数据库。
术语“抗体”可包括所有类别例如IgG、IgM、IgA、IgD或IgE，或亚类例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2，无论是衍生自任何天然产生抗体的物种还是通过重组DNA技术产生，无论是从血清、 B细胞、杂交瘤、转染瘤、酵母或细菌分离还是以合成方式制备。术语“抗体”涵盖单克隆抗体、多克隆抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、灵长类源化抗体或类人源化(synhumanized)抗体。术语“人抗体”是指含有人来源的序列(可能的非人CDR区域除外)且在人中具有最小免疫原性的抗体。
如本文所用的术语“全长抗体”旨在表示呈其基本上完整的形式的抗体，其与抗体的抗原结合片段相反。其可以是经分离的或重组的。具体地讲，完整抗体包括具有含Fc区的重链和轻链的那些抗体。恒定结构域可以是野生型序列恒定结构域(例如人野生型序列恒定结构域)或其氨基酸序列变体。抗体蛋白包含由多条多肽链(例如包含轻链可变区(VL)的多肽和包含重链可变区(VH)的多肽)构成的可变区。抗体也包含恒定结构域，它们中的一些可被布置成恒定区，该恒定区包含恒定片段或可结晶片段(Fc)(就重链而言)。VH和VL相互作用以形成包含能够与一个或一些密切相关的抗原特异性结合的抗原结合区的Fv。抗体与抗原的结合相互作用可以表现为与互补决定区(CDR) 的一个或多个氨基酸残基的分子间接触。一般来讲，来自哺乳动物的轻链是κ轻链或λ轻链而来自哺乳动物的重链是α、δ、ε、γ、或μ。抗体可以是任何类型(例如、IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类别(例如、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类的。抗体可以是人、人源化或嵌合抗体。在又一个实例中，抗体是鲨鱼、骆驼、猫或犬抗体。
如本文所用的术语“免疫球蛋白抗原结合片段”旨在表示抗体的片段，该片段包含具有互补决定区(CDR)的轻链可变区和重链可变区。该术语涵盖Fab、F(ab’)2、Fab’、scFv、di-scFv、或经化学连接的F(ab’)2。
术语“Fab”被理解为是指抗体的区域，其结合抗原且由重链和轻链中的每一者的一个恒定结构域和一个可变结构域构成。
术语“互补”是指形成同源对的免疫球蛋白结构域。例如，抗体的 VH和VL结构域是互补的，两个VH结构域不是非互补的，两个VL 结构域也不是互补的。
术语“结构域”是指折叠的蛋白结构，其独立于蛋白的其余部分保持其三级结构。
术语“CDR”或“互补决定区”旨在表示抗体或抗体片段(其与抗原结合)内的重链和轻链多肽两者的可变区内存在的非连续性抗原组合位点。这些特定的区域已由以下文献进行了描述：Kabat等人,J.Biol. Chem.252:6609-6616(1977)；Kabat等人,U.S.Dept.ofHealth and Human Services,“Sequences of proteins of immunological interest”(1991)；Chothia等人,J.Mol.Biol.196:901-917(1987)；和MacCallum 等人,J.Mol.Biol.262:732-745(1996)，其中这些定义包括当彼此比较时重叠的氨基酸残基或氨基酸残基的子集。无论如何，将任一定义应用于指代抗体或移植抗体或其变体的CDR旨在落入如本文所定义和使用的术语的范围内。
“结合域分子(BDM)”是指单体结构域，其与抗体的可变重(VH) 链或可变轻(VL)链具有类似的结构特征。这些类似的结构特征包括 BL(结合环)序列，它们是以与抗体可变结构域中与特定抗原结合的互补决定区(CDR)类似的方式起作用的表面多肽环结构或区域。BDM支架由内含的一个框架序列和三个BL序列组成。本文的BDM并非抗体可变结构域。BDM支架在本文中进行了描述，包括例如CTLA-4、脂质运载蛋白(lipocallin)、纤连蛋白、ICOS和CD28。
“BL序列”是表面多肽环结构或区域，其以与抗体可变结构域中与特定抗原结合的互补决定区(CDR)类似的方式起作用。三个抗原结合环序列(在本文中分别称为BL-1、BL-2和BL-3)存在于BDM中且它们位于提供这些环序列所需的三度构象的支架序列内。天然BL序列可被一个或多个可移植到支架上的对应抗体CDR置换。多样性可被引入BDM的BL位点内，方法是随机化支架的特定环的氨基酸序列，例如通过引入NNK密码子接着通过使用例如展示技术选择所需的结合特性。此机制类似于高亲和力、抗原特异性抗体的天然选择。
术语“结合特异性”在蛋白、多肽或肽的上下文中是指该蛋白或肽和/或BDM与其相应的目标抗原或表位结合的能力，其依赖于在该目标抗原或表位上特定结构(例如抗原决定簇或表位)的存在。例如，蛋白和/或BDM识别特定的蛋白结构并与之结合而非广泛地识别多种蛋白并与它们结合。举例而言，如果蛋白与表位“A”结合，则在含有经标记的“A”和蛋白的反应中存在包含表位“A”的分子(或游离的、未标记的“A”)将减少与该蛋白结合的经标记的“A”的量。该术语也应被理解成包括与目标抗原“特异性结合”的药理活性蛋白或肽和/或BDM。术语“特异性结合”应被理解成表示本公开的药理活性蛋白(或就抗体而言，其抗原结合结构域)或肽和/或BDM更频繁地、更快速地、以更长的持续期间和/或以更大的亲和力与特定的目标抗原反应或缔合 (相较于与替代性目标抗原的反应或缔合)。提及“结合”对术语“特异性结合”提供明确的支持，反之亦然。通常，该术语用于描述某个部分(即本文中的蛋白或BDM)对给定目标抗原的亲和力。在一些情况下，在毒性可能是问题时，可能期望具有低亲和力结合。在其他情况下，可能期望具有高亲和力结合以最小化与其他目标抗原的交叉反应性。在一个实例中，结合是本文所定义的特异性结合。
术语“选择性结合”在本文的其他地方更详细地描述。
可以测量分子(即蛋白或BDM)的某个部分对所选目标的术语“结合亲和力”或“亲和力”。术语“亲和力”是指两个作用剂的可逆结合的平衡常数且以解离常数(Kd)或平衡解离常数(KD)表示。
如本文所用，术语“亲合力”涉及两个或更多个作用剂的复合物在稀释后对解离的抗性。
如本文所用的术语“抗原”表示药理活性蛋白或肽或BDM所结合的物质。抗原通常将包含一个或多个抗原性表位，这些表位被BDM 或蛋白或肽识别。蛋白抗原可以是可溶性蛋白或膜结合性蛋白。可溶性蛋白的实例包括但不限于转录因子、抗体、生长因子、血液蛋白(例如白蛋白)、或药物(例如类固醇、医药药物等等)。膜结合性蛋白的类型包括生长因子受体、肿瘤标记物、细胞表面标记物、或介导至细胞内的转运的标记物(例如转铁蛋白)、或Fc受体。它通常是指能够在活体内引发免疫反应的物质。它可以是多肽、蛋白、核酸(例如DNA、 RNA、或DNA和RNA的组合)或其他分子。
如本文所用，术语“表位”(同义词“抗原决定簇”)应被理解成表示蛋白(或抗体或免疫球蛋白抗原结合片段的抗原结合结构域)所结合的或本公开的BDM所结合的区域。通常，该术语是指由免疫球蛋白 VH/VL对结合的结构。表位定义抗体或抗体样结构域(例如BDM)的最小结合位点。此术语不必定限于分子的蛋白和/或BDM与之接触的特定残基或结构。例如，此术语包括分别与抗体或免疫球蛋白抗原结合片段的CDR或BDM的BL序列接触的跨区域氨基酸，以及此区域之外的5-10个(或更多个)或2-5个或1-3个氨基酸。在一些实例中，表位包含一系列的不连续的氨基酸，这些氨基酸在多肽折叠时定位在另一者的附近并且例如与另一个多肽缔合，即“构象表位”。该术语包括由线性肽序列构成的那些(即“连续的”)或由非连续的氨基酸序列构成的那些(即“构象”或“不连续的”)。
如本文所用的术语“目标”是指抗原或表位。在某些实例中，目标是指细胞表面蛋白(例如受体)或病毒外壳蛋白。在其他实例中，目标是分泌的蛋白。
如本文所用，在抗体或免疫球蛋白抗原结合片段的上下文中的术语“抗原结合结构域”应被理解成表示抗体或免疫球蛋白抗原结合片段的区域，其能够特异性地与抗原(更具体地讲，存在于抗原上的表位)结合。在抗体中，抗原结合结构域对应于VH和VL。在VH和VL区内是与表位接触的CDR。
如本文所用的术语“位置”表示在本文所描绘的氨基酸序列内的氨基酸的位置，通常从序列的左边或5’端开始计算。如本文所用的术语“对应的”在BDM的氨基酸序列位置的上下文中是指某氨基酸参考天然或“野生型”BDM序列的位置。优选地，这些位置将是分别对应于天然BDM序列中的BLS1、和/或BLS2和/或BLS3的氨基酸。
如本文所用，术语“天然序列”旨在表示与来源于自然界的对应多肽具有相同的氨基酸序列的序列。因此，“天然BDM”是指具有与来源于自然界的对应多肽的氨基酸序列相同的氨基酸序列的多肽。这样的天然序列多肽可通过重组或合成方式产生。
术语“蛋白”应被理解成包括单一连续且无分支的多肽链，即通过肽键连接的一系列连续的氨基酸或彼此共价或非共价连接的一系列多肽链(即多肽复合物)。例如，该系列的多肽链可使用适合的化学物或二硫化键共价连接。非共价键的实例包括氢键、离子键、范德华力、和疏水性相互作用。
如本文所用的术语“肽”被理解成是指通过肽(酰胺)键连接的氨基酸单体的短链(通常为约50个氨基酸或更少)。
如本文所用的术语“分离的”是指这样的多肽、抗体、蛋白等，其已被鉴定并从其天然环境或其产生环境的组分中分开和/或回收。其天然环境的污染性组分是会干扰多肽的治疗用途的物质，且可包括例如酶、激素、和其他蛋白或非蛋白溶质。在一个实例中，多肽将被纯化(1)至大于80重量％、85重量％、90重量％、95重量％、或99重量％(通过劳里法(Lowry method)所测定)，(2)至足以获得N端或内部氨基酸序列的至少15个残基的程度(通过使用转杯式测序仪(spinning cup sequenator))，和/或(3)至均匀(通过SDS-PAGE在还原或非还原条件下使用考马斯亮蓝或银染剂)。术语“分离的多肽”在其范围内包括原位存在于重组细胞内的多肽，因为该多肽天然环境的至少一种组分不会存在。一般来讲，多肽的分离将包括至少一个纯化步骤。
术语“重组体”应被理解成表示人工遗传重组的产物。当多肽在细胞、组织或受试者(例如在其中表达该多肽)中时，重组多肽也涵盖通过人工重组方法表达的多肽。
如本文所用的术语“检测”在定量水平和定性水平及其组合上加以理解。因此，它包括所关注的分子的定量、半定量和定性测量。
如本文所用，术语“受试者”应被理解成表示任何动物，包括人，例如哺乳动物。示例性受试者包括但不限于人和非人灵长类动物。例如，受试者为人。术语“受试者”也旨在包括非人受试者，比如仓鼠、大鼠、兔、猫、狗和马。
结合域分子(BDM)
本公开的结合域分子(BDM)优选地包含具有三个暴露的结合环 (BL)的蛋白支架。这些BL可被改变，即通过氨基酸取代来置换或修饰以赋予BDM对给定目标抗原的结合特异性。本公开的BDM支架可选自含免疫球蛋白样(Ig样)结构域的超家族成员、i-体、VNAR或VHH。
含Ig样结构域的超家族成员可选自：V样结构域(例如VLD)，诸如CTLA-4、C-set结构域、ThyOx家族成员多肽、T细胞受体、CD2、 CD4、CD8、I类MHC、II类MHC、CD1、细胞因子受体、G-CSF 受体、GM-CSF受体、激素受体、生长激素受体、促红细胞生成素受体、干扰素γ受体、泌乳素受体、NCAM、VCAM、ICAM、N-钙粘蛋白、E-钙粘蛋白、纤连蛋白、腱生蛋白、和含I-set结构域多肽或它们的功能片段。
根据本公开的BDM的实例包括脂质运载蛋白、蛋白A衍生的分子，诸如蛋白A的Z结构域(亲和体，SpA)、亲和体、adnectin(例如纤连蛋白)或锚蛋白重复蛋白(DARPin)。
本公开的BDM具有以下优点：在支架结构域结构以及在接受广大范围的异源性结合环序列的能力两方面是稳定的且模块化的。此外， BDM支架可以从人来源容易地获得，使得当用作人治疗物时它们的免疫原性可以忽略。BDM支架也可被容易地构建成含有或不含天然存在的多糖链。
异源性结合环序列至BDM支架中的连结可通过例如化学、生物化学或重组方法执行。
优选地，本公开的BDM是指除了由B细胞产生的人抗体以外的分子。本公开的BDM分子也旨在排除大于互补决定区(CDR)的抗体片段。因此，大于约50、75、100或110个氨基酸的人抗体可变区片段不被术语BDM涵盖。此外，BDM不包括抗体可变区，诸如dAb、 VH-VH或VL-VL结构。
术语“支架”旨在表示一种支撑性多肽框架，其被用于组织、定向和携带赋予对给定目标的结合特异性的异源性结合环或经改变的氨基酸序列。支架可在结构上与赋予结合特异性的氨基酸序列分开。支架的可在结构上分开的部分可包括多种不同的结构基序，包括例如β夹层、β折叠、α螺旋、β桶、卷曲螺旋和其他本领域已知的多肽二级和三级结构。本公开的支架还将包含一个或多个可以在氨基酸序列上改变而不会实质性降低该支撑性框架结构的稳定性的区域。示例性的可被改变的区域包括连接β夹层或β折叠的两条链的结合环区段。
本公开的BDM支架优选地表现出低于约50％的与人免疫球蛋白可变重链或轻链序列的氨基酸同一性。一般来讲，该支架将表现出例如低于约45％、约40％、约30％、约20％、约15％、或约10％的相较于人免疫球蛋白可变重链或轻链氨基酸序列的氨基酸序列同一性。
可被改变的支架的残基在本文中被称为外部结合环或结合环序列(在本文中分别被指定为BL-1、BL-2和BL-3)。赋予二级或三级结构特性的残基可被保持、修饰或为保守的，只要支架的整体结构被维持即可。本领域的技术人员知道或可以确定哪些残基在多肽支架的结构稳定性上起作用以及此类残基可被修饰的程度。
在一个实例中，BDM支架是V样结构域(VLD)蛋白。
VLD通常有别于抗体或T细胞受体的那些，因为它们不具有连结在一起以成为Fv类分子的倾向。VLD在以下文献中进行了论述： The Leucocyte Antigen Facts Book 1993,Eds Barclay等人,Academic Press,London；以及CD Antigens 1996(1997)ImmunologyToday 18, 100–101,和Arlene H Sharpe和Gordon J Freeman,(2002)Nature ReviewsImmunology 2,116-126，它们的整个内容以引用方式并入本文。
本公开的主题领域的技术人员可例如通过对Uniprot数据库 (www.uniprot.org)进行搜寻来容易地确定适合用在本文中的适当的含 VLD的蛋白。
含VLD的蛋白(诸如CTLA-4)可提供替代性框架以用于开发对目标分子具有高亲和力的新型结合部分。衍生自这些结合部分的单结构域V样结合分子是可溶的并因此是有利的。含有VLD的适合的结合部分的实例尾CTLA-4、CD28合ICOS(Hutloff A等人,(1999)Nature 397(6716):263-6)。
细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)和同源性细胞表面蛋白CD28及ICOS在免疫反应期间在T细胞调节中涉及到。CTLA-4 是一个主要且短暂地在经活化的T细胞的表面上表达的44kDa同二聚体，在该处它与抗原呈递细胞上的CD80和CD86表面抗原相互作用以实现对免疫反应的调节(Waterhouse等人(1996)Immunol Rev 153:183-207,van derMerwe等人(1997)J Exp Med 185(3):393-403)。
CD28是一个主要在T细胞上表达的44kDa同二聚体，且像 CTLA-4一样与抗原呈递细胞上的CD80和CD86表面抗原相互作用以实现对免疫反应的调节(Linsley等人(1990)JImmunol 182(5):2559-63)。目前的理论表明CTLA-4与CD28之间对可用配体的竞争将控制免疫反应的程度，例如在基因敲除小鼠中CTLA-4的基因缺失造成经活化的T细胞的大量过度增殖(Waterhouse等人(1995) Science 270(5238):985-8)。
各CTLA-4单体亚基由N端胞外结构域、跨膜区和C端胞内结构域组成。胞外结构域包含N端V样结构域(VLD；基于与免疫球蛋白超家族的同源性预测分子量为约14kDa)和将VLD与跨膜区连接的约10个残基的柄部。VLD包含分别对应于BL-1、BL-2和BL-3的表面环(Metzler WJ等人(1997)Nat Struct Biol 4(7):527-31)，其与CD80 和/或CD86结合。人CTLA-4的序列之前已得到确定(US 5,434,131、 US 5,844,095、US 5,851,795)。
对CTLA-4的结构和突变研究表明，与CD80和CD86的结合经由从A’GFCC’V样β链以及也从BL-3中的高度保守的MYPPPYY序列所形成的VLD表面而发生。CTLA-4单体之间的二聚化通过两个柄部中的半胱氨酸残基(Cys120)之间的二硫键发生，该二硫键造成两个胞外结构域的拴接，但在V样结构域之间无任何明显的直接缔合(Metzler WJ等人(1997)NatStruct Biol 4(7):527-31)。二聚化似乎专门帮助增加对配体的亲合力。
CD278或ICOS(诱导性T细胞共刺激因子)是一种由ICOS基因编码的免疫检查点蛋白。它在经活化的T细胞上表达。该蛋白属于 CD28和CTLA-4细胞表面受体家族。它形成同二聚体并在信号传导、免疫反应和调节细胞增殖中发挥作用。
人CTLA4、CD28和ICOS的序列可在公众可访问的数据库上得到。
CTLA-4的人序列可以UniProt参考号P16410得到。CTLA-4的胞外结构域对应于该序列的位置36-161(其中CTLA-4具有126个氨基酸的总长)。氨基酸残基1-35对应于信号肽。
CD28的人序列可以UniProt参考号P10747得到。胞外结构域对应于该序列的位置19-152。
ICOS的人序列可以UniProt参考号Q9Y6W8得到。Ig样VLD 对应于该序列的位置30-132。
在一个实例中，BDM是免疫球蛋白C-set结构域蛋白，更优选地为C1-set结构域蛋白。C-set结构域是经典的类似于抗体恒定结构域的Ig样结构域，且几乎只存在于免疫系统所涉及到的分子(包括主要组织相容性复合物(MHC)I类和II类复合分子)中和各种T细胞受体中。
本公开的主题领域的技术人员可容易地确定适合用在本文中的含有C-set结构域的蛋白。例如，对uniprot数据库(www.uniprot.org) 进行搜寻得到超过300种人蛋白。
诸如basigin的蛋白含有C-set结构域(Xiao-Ling Yu等人(2008) JBC第283卷第26期:18056-18065)。C-set结构域的另外实例包括ROR1胞外结构域、CEA家族成员，诸如CEACAM1-8。
BDM可使用已知的选择和/或诱变方法亲和力成熟。亲和力成熟的BDM可具有为起始BDM的两倍、五倍、十倍、二十倍、三十倍或更大的亲和力。表观亲和力可通过诸如ELISA的方法或其他本领域技术人员所熟悉的技术(例如表面等离子体共振技术)测定。
i-体是一种人来源的单结构域抗体样分子。i-体框架类似于来自鲨鱼的单结构域抗体并因此与鲨鱼抗体共有有利的生物物理及靶向特性。它们在例如US 7,977,071中有所描述。
VNAR(可变新抗原受体)是一种衍生自鲨鱼免疫球蛋白新抗原受体抗体(IgNAR)的单可变区结构域片段。它们在例如Griffiths K等人(2013)Antibodies 2(1):66-81中有所描述。
VHH(重链的可变结构域)结构域或纳米抗体(nanobody)是指一种衍生自骆驼科抗体的单一单体可变抗体结构域。它们例如在 Harmsen MM和HJ De Haard(2007)ApplMicrobiol Biotechnol. 77(1):13-22中有所描述。
可以利用分子的BDM与药理活性蛋白部分的结合特异性以允许分子与一种或多种不同的目标抗原或表位，优选至少两个不同的目标抗原或表位结合。在一个实例中，蛋白具有对第一目标抗原的结合特异性且所述至少一个BDM具有对于第二目标抗原的结合特异性。
在多个BDM与蛋白偶合的实例中，蛋白可具有对第一目标抗原的结合特异性，BDM可具有对第二目标抗原的结合特异性，且另一个BDM(如果存在的话)可具有对第三目标抗原的结合特异性。在蛋白是抗体或免疫球蛋白抗原结合片段的其他实例中，抗体或抗原结合片段可具有对第一目标抗原的结合特异性，BDM(或者如果例如各重链或各轻链上存在一个BDM，则为BDM对)可具有对第二目标抗原的结合特异性，且另一个BDM(或BDM对)可具有对第三目标抗原的结合特异性。
本公开的分子可与至少一种目标抗原、至少两种不同的目标抗原、至少三种不同的目标抗原、至少四种不同的目标抗原或至少五种不同的目标抗原结合。
优选地，该分子与一种目标抗原、两种不同的目标抗原或三种不同的目标抗原结合。设想了各种非限制性实例，包括：
(i)蛋白或肽与第一目标抗原结合，该第一目标抗原与BDM所结合的第二目标抗原相同或不同；
(ii)抗体或免疫球蛋白抗原结合片段与第一目标抗原结合，该第一目标抗原与BDM所结合的第二目标抗原相同；
(iii)抗体或免疫球蛋白抗原结合片段与第一目标抗原结合，该第一目标抗原与BDM所结合的第二目标抗原不同；
(iv)抗体或免疫球蛋白抗原结合片段与第一目标抗原结合，一个 BDM与第二目标抗原结合，该第二目标抗原与该第一目标抗原相同，且另一个BDM与第三目标抗原结合，该第三目标抗原与该第一目标抗原和第二目标抗原不同；
(v)抗体或免疫球蛋白抗原结合片段与第一目标抗原结合，一个 BDM和另一个BDM分别与第二和第三目标抗原结合，其中该第二和第三目标抗原可以是相同或不同的，但其中该第二和第三目标抗原与该第一目标抗原不同；
(vi)抗体或免疫球蛋白抗原结合片段与第一目标抗原结合，一个 BDM与第二目标抗原结合，且另一个BDM与第三目标抗原结合，其中该第一、第二和第三目标抗原是不同的。
将领会到，当两个或更多个BDM被连接在一起时，可被该分子结合的潜在目标的数目可以增加。
BDM的产生
如本文所示，用硬骨素或CD3的异源性结合环序列置换BDM结构域(例如CTLA-4)中的一个或多个结合环结构造成使用细菌表达系统产生可溶性单体、未经糖基化的结合分子。V样结构域因此提供用于构建可溶性单结构域分子的基本框架，其中分子的结合特异性可通过对结合环结构进行修饰而工程改造。
BDM的框架残基可根据骆驼科抗体中存在的结构特征而修饰。骆驼重链免疫球蛋白与常规抗体结构的差异在于由单一VH结构域组成。
在暴露的框架残基处的许多非常规取代(在性质上主要从疏水性变成极性)减少疏水性表面，同时维持内部β折叠框架结构(Desmyter 等人(1996)Nat Struct Biol 3:803-811)。在三个结合环内，数个结构特征补偿通常由VL结构域提供的抗原结合表面的丧失。虽然BL2环与其他VH结构域并非差异很大，但BL1和BL3呈在长度上差异巨大的非标准构象。例如，H1环可含有2-8个之间的任何数目的残基，相比之下，Ig分子中通常为五个。然而，表现出最大的变化的是BL3：在17个经报导的骆驼抗体序列中，该区域的长度在7与21个残基之间变化(Muyldermans等人(1994)Protein Eng 7:1129-1135)。第三，许多骆驼科VH结构域具有将BL1和BL3互连(就骆驼而言)以及将 CDR-1和CDR-2互连(就美洲驼而言)的二硫键(Vu等人1997)。该结构特征的功能似乎是维持环稳定性并提供轮廓更明显的(与平坦的不同)环构象，这种构象既允许与抗原内的袋结合又产生增加的表面积。然而，并非所有的骆驼科抗体均具有该二硫键，暗示其并非绝对的结构需要。
这些上述特征已使骆驼科V结构域能够在活体内以可溶性分子存在，且具有足够高的亲和力以对各种各样的目标抗原产生有效的免疫反应。
用于产生并选择对目标分子具有新颖的结合亲和力的单VLD分子的方法已在US7,166,697中进行了描述，其整个内容以引用方式并入。该方法涉及对衍生自免疫球蛋白超家族的成员的V样结构域应用广为人知的分子演化技术。该方法可涉及产生噬菌体或核糖体展示文库以筛选大量的突变V样结构域。
对丝状fd噬菌体基因组进行工程改造以使得噬菌体在它们的表面上展示由噬菌体内所含的DNA编码的蛋白，诸如Ig样蛋白(Fab) (Smith,1985；Huse等人,1989；McCafferty等人,1990；Hoogenboom等人,1991)。蛋白分子可被展示在Fd噬菌体的表面上，与由基因III或不太常见地由基因VIII编码的噬菌体外壳蛋白共价偶合。将抗体基因插入基因III外壳蛋白中产生每个噬菌体3-5个重组蛋白分子的表达，位于末端。相反地，将抗体基因插入基因VIII中具有每个噬菌体颗粒展示约2000个拷贝的重组蛋白的潜力，然而这是一个多价系统，它可能掩蔽单一所展示蛋白的亲和力。也使用了Fd噬菌粒载体，因为它们可被容易地从在Fd-噬菌体的表面上展示功能性Ig样片段切换到在大肠杆菌中分泌可溶性Ig样片段。有可能通过策略性地置于两个蛋白基因之间的琥珀密码子来产生与基因III外壳蛋白的N端融合的经噬菌体展示的重组蛋白。在大肠杆菌的琥珀抑制子菌株中，所得的Ig结构域-基因III融合体变得被固定于噬菌体外壳中。
可将基于蛋白亲和力的选择过程应用于任何高亲和力结合试剂，诸如抗体、抗原、受体和配体(参见例如Winter和Milstein,(1991) Nature 349:293-299，其整个内容以引用方式并入本文)。因此，对在噬菌体上展示的最高亲和力结合蛋白的选择与编码该蛋白的基因的回收相结合。Ig展示性噬菌体可以通过以下方法进行亲和力选择：以与ELISA或固相放射免疫测定类似的方式，通过与共价偶合到珠粒上或吸附到塑料表面上的同源结合伴侣相结合。虽然几乎任何塑料表面均会吸附蛋白抗原，但针对此目的特别制造了一些商业产品，诸如Nunc免疫管。
核糖体展示文库涉及在无细胞翻译系统中从头合成并在核糖体的表面上展示多肽以用于选择目的(Hanes和Pluckthun,(1997)Proc Natl Acad Sci USA 94:4937-4942；He和Taussig,(1997)Nucl Acids Res 25:5132-5134)。“无细胞翻译系统”包含核糖体、蛋白合成所需的可溶性酶(通常与核糖体来自相同的细胞)、转移RNA、三磷酸腺苷、三磷酸鸟苷、核糖核苷三磷酸再生系统(诸如磷酸烯醇丙酮酸和丙酮酸激酶)、以及合成由外源性mRNA编码的蛋白所需的盐及缓冲剂。可使多肽的翻译在维持多核糖体完整的条件(即，其中核糖体、mRNA分子和翻译的多肽被缔合在单一复合物中)下发生。这有效地导致所翻译的多肽的“核糖体展示”。
对于选择，将所翻译的多肽(与对应的核糖体复合物缔合)与目标分子混合，该目标分子与基质(例如Dynabead)结合。目标分子可以是任何所关注的化合物(或其一部分)，诸如DNA分子、蛋白、受体、细胞表面分子、代谢物、抗体、激素或病毒。展示所翻译的多肽的核糖体将结合该目标分子，并且可以对这些复合物进行选择并使用 RT-PCR进行mRNA再扩增。
虽然有多种修饰结合分子的替代性方法，但是用于所有所展示的蛋白的一般方法遵循这样一种模式，其中各个结合试剂通过对其同源受体的亲和力而从展示文库中进行选择。编码这些试剂的基因通过多种活体内和活体外突变策略中的任一种或组合进行修饰，并构建成新的基因池以用于展示和选择最高亲和力的结合分子。
BDM二聚体
在一个实例中，分子的BDM部分是BDM单体的二聚体。二聚体的形成可天然地发生或通过使用接头而促进。例如，在BDM是 CTLA-4VLD的情况下，二聚化可通过两个柄部中的半胱氨酸残基 (Cys120)之间的二硫键发生(如果这些序列被保留的话)。
或者，可使用接头将BDM单体(例如CTLA-4单体)偶合在一起。也可使用该相同的原理将许多BDM单体串联连接在一起以形成串。接头可有利于增强柔韧性和/或减小任何两个单体之间的空间位阻。接头可以是天然来源的。
可以使用的其他类型的接头是下文进一步描述的那些接头，包括 (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n接头。
可溶形式的CTLA-4的活体外表达
人CTLA-4分子的胞外结构域与V样结构域(VLD)均未在细菌细胞中成功地以可溶性单体表达，这可能是由于所表达的蛋白的聚集所致(Linsley PS等人,(1995)J.Biol.Chem 270:15417-24)。在大肠杆菌中表达胞外N端结构域(Met1至Asp124，包含Cys120)造成二聚28kDa MW蛋白的产生，其中两个CTLA-4V样结构域通过Cys120处的二硫键连接。在Val114处截断将移除这些半胱氨酸且旨在使得14kDa VLD能够以可溶性单体形式表达。然而，产物发生聚集，且结论是：通常被糖基化掩蔽的疏水性位点现在暴露出来且造成聚集(Linsley PS等人,(1995)J.Biol.Chem 270:15417-24)。
已有一些在真核表达系统(即，CHO细胞和巴斯德毕赤酵母 (Pichia pastoris)；Linsley PS等人,(1995)J.Biol.Chem 270:15417-24； Metzler WJ等人(1997)Nat StructBiol 4(7):527-31；Gerstmayer B等人 (1997)FEBS Lett 407(1):63-8)中成功表达单体、糖基化CTLA-4胞外结构域的报导。据推测，在这些真核表达系统中的糖基化在VLD中的两个N连接的糖基化位点(Asn76和Asn108)处发生。然而，仅对编码融合至Ig-CH2/CH3结构域的CTLA-4VLD的基因(其产生具有附接至Fc亚基的2个CTLA-4VLD的二聚体重组蛋白)的表达描述了高产量(WO 95/01994和AU 16458/95)。AU 60590/96描述了突变形式的 CTLA-4VLD，它们具有在MYPPPY表面环中的第一个酪氨酸(Y)的单一氨基酸置换，这些置换保持并修饰对天然CD80和CD86配体的亲和力。AU 60590/96描述了作为在真核细胞中表达的重组 CTLA-4/Ig融合蛋白的优选的可溶形式的CTLA-4VLD，但并未解决在原核表达系统中的聚集问题。EP 0757099A2描述CTLA-4突变体分子的用途，例如BL序列中的突变的改变对配体结合的影响。
B7-1(CD80)蛋白和B7-2(CD86)蛋白
B7蛋白是在活化的抗原呈递细胞(APC)上存在的外周膜蛋白，当与T细胞上的CD28或CD152(CTLA-4)表面蛋白配对时，可产生共刺激信号或共抑制信号以分别增强或降低APC与T细胞之间的 MHC-TCR信号的活性。B7不仅在活化的APC上存在，也在T细胞上存在。
B7蛋白包含许多家族成员，这些成员包括B7-1、B7-2、B7DC、 B7-H1至B7-H7。B7-1蛋白也被称为CD80且与CD28和CTLA-4(细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4)结合。人序列的UniProt参考号为 P33681。
在一个实例中，BDM与B7-1人蛋白结合。在一个实例中，BDM 与B7-2蛋白结合。
硬骨素
硬骨素是一种分泌的糖蛋白，它具有C端半胱氨酸结状结构域和与骨形态发生蛋白(BMP)拮抗剂的DAN(以差示筛选而选择的神经母细胞瘤基因中畸变的基因)家族的序列相似性。硬骨素由骨细胞产生且具有骨骼形成的抗合成代谢作用。人序列的UniProt参考号为 Q9BQB4。
在一个实例中，BDM与硬骨素人蛋白结合。
药理活性蛋白
在本公开中完成的蛋白的类型是具有药理活性的那些。此类蛋白包括如本文所述的抗体(例如全长抗体)或免疫球蛋白抗原结合片段或非抗体蛋白。
术语“药理活性”表示被确定为具有影响医学参数或疾病状态或导致免疫反应中涉及到的细胞发生活化的活性的物质。蛋白可以是激动剂蛋白、拮抗剂蛋白或模拟物。蛋白也可以是治疗性抗体。
术语“模拟物”或“激动剂”是指具有与天然蛋白(例如EPO或 G-CSF)相当的生物活性的蛋白(或肽)。
根据本公开适合的示例性蛋白包括但不限于凝血因子、抗运载蛋白、类毒素、人血清白蛋白、胶原结合蛋白、TNF-α受体结合蛋白、整合素结合蛋白、VEGF或其模拟物、EPO或其模拟物、C4结合蛋白、尿激酶受体拮抗剂、淋巴因子、细胞因子、护骨素(OPG)、或选自程序性细胞死亡1蛋白(PD1)、程序性死亡配体1(PD-L1)、NKG2D、 MHC I类多肽相关序列A(MICA)、MHC I类多肽相关序列B(MICB)、 UL16结合蛋白(ULBP)的蛋白的胞外结构域。
凝血因子是本领域已知的，实例包括与血友病相关的因子VIII 和因子IX。
在一个实例中，类毒素是肉毒杆菌类毒素。类毒素可以为A型肉毒杆菌或B型肉毒杆菌。也设想了合成形式的肉毒杆菌类毒素。
在一个实例中，淋巴因子是IL-2或GM-CSF或其模拟物。
在一个实例中，细胞因子是G-CSF或其模拟物或干细胞因子或其模拟物。
在一个实例中，蛋白偶合到与人血清白蛋白结合的BDM，以使得在活体内蛋白的半衰期相较于不存在BDM的蛋白而言被延长。
抗体
在某些实例中，多特异性分子包括全长抗体。在一个实例中，抗体是人源化抗体。在另一个实例中，抗体是人抗体。在另一个实例中，抗体是嵌合抗体。
术语“人源化抗体”应被理解成是指嵌合抗体的亚类，其具有衍生自来自非人物种的抗体的抗原结合位点或可变区以及基于人抗体的结构和/或序列的其余抗体结构。在人源化抗体中，抗原结合位点通常包含被移植到人抗体的可变区中的适当框架区(FR)上的来自非人抗体的互补决定区(CDR)以及来自人抗体的其余区域。抗原结合位点可以是野生型的(即与非人抗体的那些位点相同)或被一个或多个氨基酸取代进行修饰。在一些情况下，人抗体的FR残基被对应的非人残基置换。一般而言，人源化抗体将包含至少一个且通常两个可变结构域中的基本上所有结构域，其中所有或基本上所有CDR区对应于非人免疫球蛋白的那些CDR区，且所有或基本上所有FR区是人免疫球蛋白共有序列的那些FR区。
本公开的人源化抗体也将含有免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常为人免疫球蛋白的恒定区(Jones等人,(1986)Nature,321:522-525； Riechmann等人,(1988)Nature,332:323-329；和Presta,(1992)Curr. Op.Struct.Biol.2:593-596)。
用于人源化非人抗体或其部分(例如可变区)的方法是本领域已知的。人源化可基本上按照Winter及同事的方法(Jones等人,Nature, 321:522 525(1986)；Riechmann等人,Nature,332:323 327(1988))； Verhoeyen等人Science,239:1534 1536(1988))或者在US5225539或 US5585089中描述的方法进行。并不排除其他用于人源化抗体的方法。
如本文所用的术语“人抗体”是指具有衍生自或对应于于人中(例如人生殖系细胞或体细胞中)存在的序列的可变区(例如VH、VL)和任选的恒定区的抗体。“人”抗体可包括不由人序列编码的氨基酸残基，例如通过活体外随机或定点突变引入的突变(尤其是涉及保守性取代的突变或在抗体的少数残基中的突变，例如在抗体的1、2、3、4、5 或6个残基中，例如在构成抗体的一个或多个CDR的1、2、3、4、 5或6个残基中)。这些“人抗体”实际上并不需要由人产生，反之，它们可使用重组方法产生和/或从包含编码人抗体恒定和/或可变区的核酸(例如，如上所述)的转基因动物(例如内源性免疫球蛋白基因已被部分或完全失活的小鼠)中分离。人抗体可使用本领域已知的各种技术产生，这些技术包括噬菌体展示文库(例如，如US5885793中所述)。
识别所选表位的人抗体也可使用称为“导向选择”的技术产生。在该方法中，使用所选的非人单克隆抗体(例如小鼠抗体)以指导对识别相同表位的完全人抗体的选择(例如，如US5,565,332中所述)。
人源化免疫球蛋白(包括人源化抗体)已借助基因工程来构建。大部分先前已描述的人源化免疫球蛋白已包含与特定人免疫球蛋白链 (即受体或接受者)的框架相同的框架，以及来自非人(供体)免疫球蛋白链的三个CDR。人源化也可包括一些标准，按照这些标准，对人源化免疫球蛋白链的框架中有限数目的氨基酸进行鉴定并选择为与位于供体而非接受体中的那些位置处的氨基酸相同，以增加包含人源化免疫球蛋白链的抗体的亲和力。
对用于人治疗而言，人源化抗体相较于小鼠或嵌合抗体通常具有至少三个潜在的优点。因为抗体的效应部分是人，所以据信其与人免疫系统的其他部分更好地发生相互作用(例如，通过补体依赖性细胞毒性(CDC)或抗体依赖性细胞毒性(ADCC)更有效地摧毁目标细胞)。此外，人免疫系统不应将人源化抗体的框架或恒定区识别成外来物，因此，对这样的所注射抗体的抗体反应应小于对完全外来的小鼠抗体或部分外来的嵌合抗体的抗体反应。最后，已知小鼠抗体在人体循环中具有远比人抗体的半衰期短的半衰期。据推测，人源化抗体可具有更类似于天然存在的人抗体的半衰期，从而允许给予更小且频率更低的剂量。
将领会到，任何与所需目标结合的全长抗体均可用于本公开。在一个实例中，全长抗体在与BDM偶合前被进一步亲和力成熟。
在另一个实例中，全长免疫球蛋白是非人免疫球蛋白。在一个实例中，免疫球蛋白是小鼠、大鼠、仓鼠、猫、狗、马或奶牛免疫球蛋白。
可使用常规方法制备抗体。例如，通过使用肽或全长目标蛋白，可使用标准方法制造多克隆抗血清或单克隆抗体。哺乳动物(例如小鼠、仓鼠、或兔)可用在哺乳动物中引发抗体反应的肽的免疫原性形式免疫。用于赋予增强的对肽的免疫原性的技术包括缀合至载剂或其他本领域熟知的技术。例如，蛋白或肽可在佐剂的存在下施用。免疫的进程可通过检测血浆或血清中的抗体滴度来监测。可将标准ELISA 或其他免疫分析程序与作为抗原的免疫原一起用于评估抗体的水平。在免疫后，可获得抗血清且可(如果希望的话)从血清分离多克隆抗体。
抗体可在细胞培养物、噬菌体、或各种动物中产生，这些动物包括但不限于奶牛、兔、山羊、小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、绵羊、狗、猫、猴、黑猩猩、猿。因此，可用于本公开的抗体通常为哺乳动物抗体。可以使用噬菌体技术来分离初始抗体或产生具有改变的特异性或亲合力特性的变体。此类技术是常规的并且是本领域熟知的。在一个实例中，抗体是通过本领域已知的重组方法产生的抗体。例如，重组抗体可通过用包含编码该抗体的DNA序列的载体转染宿主细胞而产生。可以使用一种或多种载体来转染在宿主细胞中表达至少一个VL 和一个VH区的DNA序列。对产生和制造抗体的重组方法的示例性描述包括：Delves,AntibodyProduction:Essential Techniques(Wiley, 1997)；Shephard等人,MonoclonalAntibodies(Oxford University Press, 2000)；和Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice (Academic Press,1993)。
可能希望针对效应子功能对抗体进行修饰以增强抗体在活体内的有效性。例如，可将一个或多个半胱氨酸残基引入Fc区域中，从而允许在此区域中形成链间二硫键。由此产生的抗体可具有改善的内化能力和/或增加的补体介导性细胞杀伤和抗体依赖性细胞毒性 (ADCC)。参见Caron等人,(1992)J.Exp Med.,176:1191-1195和 Shopes,(1992)J.Immunol.,148:2918-2922。
抗体片段
抗体片段包含完整抗体的部分且可包含完整抗体的抗原结合区或可变区。适用于本公开的抗体片段的实例包括Fab、F(ab’)2、Fab’、 scFv、di-scFv、或经化学连接的F(ab’)2。在一个特定实例中，抗体片段为Fab。
Fv是指含有完整抗原识别和结合位点的抗体片段。该区域由呈紧密、非共价缔合的一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域的二聚体组成。因为呈此构型，所以各可变结构域的三个CDR相互作用以限定在VH-VL二聚体的表面上的抗原结合位点。这六个CDR共同地为抗体片段赋予抗原结合特异性。
Fab片段含有Fv且也含有轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域(CH1)。Fab片段与Fab’片段的不同之处在于：在重链CH1结构域的羧基端添加的一些残基包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。F(ab’)2片段作为在其间具有铰链半胱氨酸的Fab’片段的对而产生。
经化学连接的F(ab’)2是通过将两个不同的Fab’片段配对在一起而形成的双特异性分子，这些Fab’片段各自具有不同的结合特异性。用于从抗体片段产生双特异性抗体的技术已在文献中进行了描述。例如，双特异性抗体可使用化学键合而制备。Brennan等人(1985)Science 229:81描述一种程序，其中将完整的抗体进行蛋白水解裂解以产生 F(ab’)2片段。这些片段在二硫醇络合剂亚砷酸钠的存在下还原，以稳定邻位二硫醇并防止分子间二硫化物形成。所产生的Fab’片段接着被转变成硫代硝基苯甲酸(TNB)衍生物。Fab’-TNB衍生物之一接着通过用巯乙胺还原而再转变成Fab’-硫醇，并与等摩尔量的其他Fab’-TNB 衍生物混合以形成双特异性抗体。
多特异性分子的产生
本公开也提供用于制备本公开的多特异性分子的方法。
这些分子的表达可以在原核或真核细胞中。原核生物最常由各种细菌菌株代表。这些细菌可以是革兰氏阳性或革兰氏阴性的。通常，革兰氏阴性细菌(诸如大肠杆菌)是优选的。也可使用其他微生物菌株。
编码这些分子的序列可被克隆到被设计成用于在原核细胞(诸如大肠杆菌)中表达外来序列的载体中。这些载体可包括常用的原核控制序列，这些原核控制序列在本文中被定义成包括用于转录起始的启动子，任选地具有操作子，连同核糖体结合位点序列，包括诸如以下常用启动子：β内酰胺酶(青霉素酶)和乳糖(lac)启动子系统(Chang等人，(1977)Nature 198:1056)、色氨酸(trp)启动子系统(Goeddel等人， (1980)Nucleic AcidsRes.8:4057)和λ衍生性PL启动子及N基因核糖体结合位点(Shimatake等人，(1981)Nature292:128)。
此类表达载体还将包括复制起点和选择性标记，诸如赋予对抗生素的抗性的β内酰胺酶或新霉素磷酸转移酶基因，以使得载体可在细菌中复制，并且当在诸如氨苄青霉素或卡那霉素的抗生素的存在下生长时可以选择携带质粒的细胞。
抗体在诸如大肠杆菌和酵母的单细胞生物中的表达已在本领域中研究透彻。有关综述，参见例如AndréFrenzel等人(2013)Front Immunol 4:217。在培养的真核细胞中的表达也作为产生本文所述的双特异性分子的选项为本领域的技术人员所知，参见最新的综述，例如Raff,M.E.(1993)Curr.Opinion Biotech.4:573-576；Trill J.J.等人 (1995)Curr.Opinion Biotech 6:553-560。
用于实现这些目标的分子克隆技术是本领域已知的并例如在以下文献中有所描述：Ausubel等人(编辑),Current Protocols in Molecular Biology,GreenePub.Associates and Wiley-Interscience(1988，包括所有迄今的更新)或Sambrook等人，Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)。各种各样的克隆和活体外扩增方法适用于构建重组核酸。产生重组抗体的方法也是本领域已知的，参见例如US4816567或US5530101。
用于在各种各样的不同宿主细胞中克隆和表达多肽的系统是熟知的。适合的宿主细胞包括细菌、哺乳动物细胞，酵母和杆状病毒系统。适合的宿主细胞包括细菌、哺乳动物细胞、酵母和杆状病毒系统。在本领域中可用于表达异源性多肽的哺乳动物细胞系包括中国仓鼠卵巢细胞、HeLa细胞、人胚胎肾细胞、幼仓鼠肾细胞、NSO小鼠黑素瘤细胞和许多其他细胞。适合的宿主将通过考虑到例如以下方面来选择：它们与所选载体的相容性、它们的分泌特性、它们正确地折叠蛋白的能力、和它们的发酵需求，以及由将要表达的DNA序列编码的产物对宿主的毒性、和表达产物的纯化容易性。
在分离后，核酸被可操作地插入连接至表达构建体或表达载体中的启动子，以用于进一步克隆(DNA扩增)或用于在无细胞系统中或在细胞中表达。载体可以是质粒、病毒，例如噬菌体、或噬菌粒(视情况而定)。
为了产生本公开的载体构建体，通过标准方法将编码如本文所述的抗体轻链序列、重链序列和接头序列以及BDM序列的核酸序列克隆到适合的载体中。
在一些实例中，将在抗体轻链序列的C端克隆BDM。在一些实例中，将在抗体重链序列的C端克隆BDM。在一些实例中，将在抗体轻链序列的N端克隆BDM。在一些实例中，将在抗体重链序列的 N端克隆BDM。在一些实例中，将在抗体轻链序列的N端和C端两者克隆BDM。在一些实例中，将在抗体重链序列的N端和C端两者克隆BDM。在一些实例中，将在抗体轻链序列和重链序列两者的N 端和C端两者克隆BDM。在一些实例中，编码抗体重链或轻链和 BDM的核酸序列在一个载体中提供，而另一条抗体链在另一个载体上提供。在其他实例中，将编码抗体轻链序列、接头序列和BDM序列的核酸序列克隆到一个载体中，并将编码抗体重链序列、接头序列和BDM序列的核酸序列克隆到另一个载体中。或者，可使用双顺反子载体，由此抗体轻链和重链两者均在相同的载体上表达。在某些实例中，重链和轻链编码序列(它们中的一个也将包含BDM)可位于单个载体上，例如在同一载体的两个表达盒中。
编码这些分子的核酸序列也可被插入到经设计以用于在真核宿主中表达外来序列的载体中。载体的调控元件可根据特定的真核宿主而变化。
有用的表达载体例如可由染色体、非染色体和合成DNA序列的区段组成。适合的载体包括SV40的衍生物和已知的细菌质粒，例如大肠杆菌质粒col El、Pcr1、Pbr322、Pmb9及它们的衍生物、诸如 RP4的质粒；噬菌体DNA，例如噬菌体λ的大量衍生物，例如NM989、和其他噬菌体DNA，例如M13和丝状单链噬菌体DNA；酵母质粒，诸如2u质粒或其衍生物；可用于真核细胞的载体，诸如可用于昆虫或哺乳动物细胞的载体；衍生自质粒和噬菌体DNA的组合的载体，诸如经修饰以采用噬菌体DNA或其他表达控制序列的质粒；等等。
编码这些分子的核酸序列可整合到真核宿主细胞的基因组中并随着宿主基因组的复制而复制。或者，携带这些核酸序列的载体可含有允许染色体外复制的复制起点。
如本文所用，术语“启动子”应以其最广的背景加以理解且包括基因组基因的转录调控序列，包括TATA盒或起始子元件，它对于精确的转录起始是必需的，同时具有或不具有例如响应于发育和/或外部刺激或以组织特异性方式改变核酸表达的另外的调控元件(例如，上游活化序列、转录因子结合位点、增强子和沉默子)。在本发明的上下文中，术语“启动子”也用于描述重组、合成或融合的核酸，或赋予、活化或增强可操作地连接到的核酸的表达的衍生物。示例性启动子可含有一个或多个特定调控元件的额外拷贝，以进一步增强所述核酸的表达和/或改变所述核酸的空间表达和/或时间表达。
如本文所用，术语“可操作地连接至”表示相对于核酸来定位启动子以使得核酸的表达受启动子控制。
可以获得许多用于在细胞中表达的载体。载体的组成部分通常包括但不限于以下一者或多者：信号序列、编码蛋白的序列(例如来源于本文提供的信息)、增强子元件、启动子、多腺苷酸化序列和转录终止序列。技术人员将认识到适用于表达蛋白的序列。示例性信号序列包括原核分泌信号(例如pelB、碱性磷酸酶、青霉素酶、Ipp、或热稳定性肠毒素II)、酵母分泌信号(例如转化酶前导序列、α因子前导序列、或酸磷酸酶前导序列)或哺乳动物分泌信号(例如单纯疱疹gD 信号)。
在哺乳动物细胞中有活性的示例性启动子包括巨细胞病毒立即早期启动子(CMV-IE)、人延长因子1-α启动子(EF1)、小核RNA启动子(U1a和U1b)、α肌球蛋白重链启动子、猴病毒40启动子(SV40)、劳斯肉瘤病毒启动子(RSV)、腺病毒主要晚期启动子、β肌动蛋白启动子；包含CMV增强子/β-肌动蛋白启动子或免疫球蛋白启动子或其活性片段的杂合调控元件。有用的哺乳动物宿主细胞系的实例是通过 SV40转化的猴肾CV1细胞系(COS-7，ATCCCRL 1651)；人胚肾细胞系(亚克隆以在悬浮培养物中生长的293或293细胞；幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL 10)；或中国仓鼠卵巢细胞(CHO)。
用于将分离的核酸或包含该核酸的表达构建体引入宿主细胞中以供表达的方法是本领域技术人员已知的。用于给定细胞的技术依赖已知的成功技术。用于将重组DNA引入细胞中的方法包括显微注射、由DEAE-葡聚糖介导的转染、由脂质体介导的转染，诸如通过使用 lipofectamine(Gibco,MD,USA)和/或cellfectin(Gibco,MD,USA)、 PEG介导的DNA摄取、逆转录病毒转导、电穿孔和微粒轰击，诸如通过使用DNA包被的钨或金颗粒(AgracetusInc.,WI,USA)等等。
引入之后可以是引起或允许从核酸表达，例如通过在表达条件下培养宿主细胞。
本公开也提供一种方法，其包括在表达系统中使用如上所述的构建体以便表达该抗体或免疫球蛋白抗原结合片段链和BDM。
本公开也提供重组宿主细胞，其包含一个或多个本文所述的核酸序列。用于产生蛋白的宿主细胞可以在多种培养基中培养，具体取决于所用的细胞类型。诸如Ham FI0(Sigma)、最低必需培养基((MEM) (Sigma)、RPMI-1640(Sigma)、和Dulbecco改良Eagle培养基((DMEM)、 Sigma)的可商购获得的培养基适用于培养哺乳动物细胞。用于培养在本文中讨论的其他细胞类型的培养基是本领域已知的。
可将各种各样的宿主/表达载体组合用于表达本公开的核酸序列。有用的表达载体例如可由染色体、非染色体和合成DNA序列的区段组成。适合的载体包括SV40的衍生物和已知的细菌质粒，例如大肠杆菌质粒col El、Perl、Pbr322、Pmb9和它们的衍生物、诸如RP4的质粒；噬菌体DNA，例如许多噬菌体衍生物，例如NM989、和其他噬菌体DNA，例如M13和丝状单链噬菌体DNA；酵母质粒，诸如 2u质粒或其衍生物；可用于真核细胞的载体，诸如可用于昆虫或哺乳动物细胞的载体；衍生自质粒和噬菌体DNA的组合的载体，诸如已经经过修饰以利用噬菌体DNA或其他表达控制序列的质粒；等等
本文还提供了重组宿主细胞，其包含本文所述的一种或多种多核苷酸。
各种各样的表达控制序列(控制与其操作性地连接的核酸序列的表达的序列)中的任一种可在这些载体中用于表达核酸序列。此类有用的表达控制序列包括例如SV40、CMV、牛痘、多瘤或腺病毒的早期或晚期启动子、lac系统、tip系统、TAC系统、TRC系统、LTR系统、噬菌体λ的主要操作子和启动子区、fd外壳蛋白的控制区、3- 磷酸甘油酸激酶或其他糖解酶的启动子、酸性磷酸酶的启动子(例如 Pho5)、酵母交配因子的启动子、和其他已知控制原核或真核细胞或其病毒的基因表达的序列、以及它们的各种组合。
本领域的技术人员无需过度实验就能够选择适当的载体、表达控制序列和宿主以实现所需的表达而不偏离本公开的范围。例如，在选择载体时，必须考虑宿主，这是因为载体必须在其中起作用。还将考虑载体的拷贝数、控制该拷贝数的能力、和任何其他由该载体编码的蛋白(诸如抗生素标记)的表达。本领域的普通技术人员可选择适当的载体、表达控制序列和宿主以实现所需的表达而不偏离本申请的范围。例如，在选择载体时，必须考虑宿主，这是因为载体必须在其中起作用。还将考虑载体的拷贝数、控制该拷贝数的能力、和任何其他由该载体编码的蛋白(诸如抗生素标记)的表达。
本公开提供编码如本文所述的多肽的经分离的多核苷酸(核酸)、包含此类多核苷酸的载体、以及用于将此类多核苷酸转录和翻译成多肽的宿主细胞和表达系统。
本公开也提供呈本文其他地方描述的质粒、载体、转录或表达盒形式的构建体，其包含至少一种如上所述的多核苷酸。
本公开也提供宿主细胞，其包含一种或多种如本文所公开的多核苷酸。
在通过表达而产生后，可使用任何适合的技术分离和/或纯化该分子。本文所述的编码性核酸分子和载体可以以下形式提供：经分离和/或纯化的，例如从它们的天然环境中分离和/或纯化，以基本上纯的或均质的形式，或就核酸而言不含或基本上不含除了编码具有所需功能的多肽的序列以外的核酸或基因来源。核酸可包含DNA或RNA 且可以是完全或部分合成的。
对于在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中表达核酸序列，可使用来自内源性酵母质粒的复制起点即2μ环。(Broach,(1983)Meth.Enz. 101:307)。或者，可以使用来自酵母基因组的能够促进自主复制的序列(参见例如Stinchcomb等人,(1979)Nature 282:39)；Tschemper等人, (1980)Gene 10:157；和Clarke等人,(1983)Meth.Enz.101:300)。
用于酵母载体的转录控制序列包括用于合成糖解酶的启动子 (Hess等人,(1968)J.Adv.Enzyme Reg.7:149；Holland等人,(1978) Biochemistry 17:4900)。本领域已知的其他启动子包括在CDM8载体中提供的CMV启动子(Toyama和Okayama,1990)FEBS 268:217-221)； 3-磷酸甘油酸激酶的启动子(Hitzeman等人，(1980)J.Biol.Chem. 255:2073)、和其他糖解酶的启动子。
多肽的表达可通过本领域已知的方法检测。例如，这些分子可通过考马斯染色SDS-PAGE凝胶和使用抗体的免疫印迹来检测，所述抗体与抗体、免疫球蛋白抗原结合片段或BDM结合。蛋白回收可使用标准蛋白纯化方法(例如亲和色谱或离子交换色谱)进行以得到基本上纯的产物(R.Scopes,“Protein Purification,Principles and Practice”, 第三版,Springer-Verlag(1994))。
本公开还提供生产本公开的多特异性分子的方法，该方法包括以下步骤：
(i)提供一个或多个包含编码所述蛋白(例如抗体)和BDM的多核苷酸的载体；
(ii)用该载体转化哺乳动物宿主细胞(例如CHO)；
(iii)在有助于将所述蛋白从宿主细胞分泌到培养基中的条件下培养步骤(b)的宿主细胞；以及
(iv)回收步骤(iii)的所分泌的蛋白。
在一个实例中，该方法包括：
(i)提供编码多特异性分子的重链的第一载体；
(ii)提供编码多特异性分子的轻链的第二载体；以及
(iii)用所述第一和第二载体转化哺乳动物宿主细胞(例如CHO)。
合成生产
编码本公开的多肽的核酸作为克隆的补充或替代方式可以用合成方式制备。核酸可被设计成具有针对所述多肽部分(例如免疫球蛋白和BDM)适当的密码子。一般而言，如果所述序列将被用于表达，则选择对于预期宿主优选的密码子。一般而言，如果所述序列将被用于表达，则选择对于预期宿主优选的密码子。完整的多核苷酸可从通过标准方法制备的重叠寡核苷酸组装，并组装成完整的编码序列。参见例如Edge,Nature,292:756(1981)；Nambair等人,Science,223:1299 (1984)；Jay等人,J.Biol.Chem.,259:6311(1984)。
蛋白的分离
用于分离多肽的方法是本领域已知的和/或如本文所述。
在多肽被分泌到培养基中的情况下，来自此类表达系统的上清液可首先使用可商购获得的蛋白浓缩过滤器(例如Amicon或Millipore Pellicon超滤单元)浓缩。上述步骤的任一个步骤均可包括蛋白酶抑制剂(诸如PMSF)以抑制蛋白水解，且可包括抗生素以防止外来污染物的生长。替代地或除此之外，可例如使用连续离心从表达该多肽的细胞中过滤和/或分离上清液。
从宿主细胞制备的多肽可使用例如以下方式纯化：离子交换、羟基磷石灰色谱、疏水性相互作用色谱、凝胶电泳、透析、亲和色谱(例如蛋白A亲和色谱或蛋白G色谱)、或它们的任何组合。这些方法是本领域已知的并且例如在WO99/57134或Ed Harlow和David Lane(编辑)Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory, (1988)中有所描述。
在一些实例中，本公开的多肽与异源性氨基酸序列(比如信号序列或亲和标签)融合，而不影响其生物活性(即，与其目标的结合)。
技术人员还将认识到，多肽可经修饰以包含亲和标签从而有助于纯化或检测，例如，多聚组氨酸标签(例如六组氨酸标签)、或流感病毒血凝素(HA)标签、或猴病毒5(V5)标签、或FLAG标签、或谷胱甘肽S转移酶(GST)标签。所得的多肽接着使用本领域已知的方法(诸如亲和力纯化)而纯化。例如，包含六组氨酸标签的多肽通过以下方式纯化：使包含多肽的样本与氮川三乙酸镍(Ni-NTA)接触，该Ni-NTA 与固定在固相或半固相载体上的六组氨酸标签特异性结合；洗涤该样本以除去未结合的蛋白；以及随后洗脱所结合的蛋白。
药理活性蛋白和BDM的偶合
根据本公开的药理活性蛋白或肽和至少BDM的偶合可使用化学键合(Brennan等人(1985)Science 229:81)或化学偶合(Shalaby等人 (1992)J Exp Med 175:217-225)或基因融合而进行。
此外，蛋白(例如抗体)与BDM之间的融合或键合可通过常规共价键或离子键、蛋白融合、或异双功能交联剂(例如碳二亚胺、戊二醛等)实现。也可以使用常规惰性接头序列(例如肽接头)，它只提供蛋白与BDM之间所需的空间量。此类接头的设计是本领域技术人员熟知的并且在例如US 8,580,922、US 5,525,491和US 6,165,476中有所描述。
可将多种偶合或交联剂用于蛋白的共价缀合。交联剂的实例包括蛋白A、碳二亚胺、N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰基-硫代乙酸酯(SATA)、 5,5'-二硫双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)、邻亚苯基双马来酰亚胺(oPDM)、 N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫)丙酸酯(SPDP)、和4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯(磺酸基-SMCC)(参见例如Karpovsky等人(1984)J.Exp.Med 160 1686,Liu,MA等人(1985) Proc.Natl.Acad.Sci.USA82 8648)。其他方法包括Paulus(1985) Behring Ins Mitt No 78,1 18-132,Brennan等人(1985)Science 229 81-83和Glennie等人(1987).J Immunol 39 2367-2375)中所述的那些。
接头可有利于增强柔韧性和/或减小任意两个蛋白之间的空间位阻。接头可以是天然来源的，诸如被确定为以随机卷曲存在于蛋白的两个结构域之间的序列。示例性接头序列是存在于RNA聚合酶α亚基的C端与N端结构域之间的接头。天然存在的接头的其他实例包括存在于1CI和LexA蛋白中的接头。
在接头内，氨基酸序列可基于接头的如凭经验判定或通过建模揭示的优选特性而变化。选择接头时的考虑因素包括接头的柔韧性、接头的电荷、和天然存在的亚基中接头的一些氨基酸的存在性。接头也可被设计成使得接头中的残基接触DNA，从而影响结合亲和力或特异性，或与其他蛋白相互作用。在一些情况下，特别是在亚基之间必须跨越较长的距离时或在这些结构域必须被维持在特定的构型下时，接头可以任选地含有另外的折叠结构域。
在一些实例中，优选的是，接头的设计涉及结构域的布置，该布置要求接头跨越相对短的距离，优选小于约然而，在某些实施方案中，接头跨越至多约或更长的距离。
术语“肽接头”是指连接或偶合多特异性分子的多肽的蛋白和 BDM部分的短肽片段。接头优选由通过肽键连接在一起的氨基酸构成。例如，肽接头可包含小氨基酸残基或亲水性氨基酸残基(例如甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、脯氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺等)。例如，这些肽接头是具有长度为至少5个氨基酸、或长度为约5个至约100 个氨基酸、或长度为约10个至50个氨基酸、或长度为约10个至15 个氨基酸的氨基酸序列的肽。
在一个实例中，接头由大部分无空间位阻的氨基酸(诸如甘氨酸和丙氨酸)构成。因此，在另一个实例中，接头是聚甘氨酸、聚丙氨酸或聚丝氨酸。
本领域的技术人员将领会到，许多常用的肽接头可用在本公开的实施方案中。在某些实施方案中，短肽接头可包含重复单元以增加接头长度。例如，二、三或四重复接头。在一个实例中，接头包含式 (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n或包含式(Ser-Gly-Gly-Gly-Gly)nSer，其中n 为3至6的数字。
在一个实例中，接头包含以下序列或由以下序列组成： SGGGGSGGGGSGGGGS(SEQID NO:16)或 SGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:17)。
非肽接头也是可能的。例如，可使用烷基接头，诸如–NH-(CH2)s-C(O)-，其中s＝2-20。这些烷基接头可进一步被任何无空间位阻的基团诸如低级烷基(例如C1-C6)、低级酰基、卤素(例如Cl、 Br)、CN、NH2、苯基取代。示例性非肽接头是具有100至5000kD，优选100至500kD的分子量的PEG接头。
其他适用的接头的实例包括GSTVAAPS、TVAAPSGS或 GSTVAAPSGS或此类接头的多聚体。其他实例包括(TVSDVP)n (GS)m，其中n＝1且m＝1、或其中n＝2且m＝1、或其中n＝2且m＝0。
在另一个实例中，接头是GS。
测定多肽活性
本公开的蛋白(或肽)和BDM部分可根据已知的方法通过各种方式测定。此类测定可包括功能测定，例如细胞杀伤测定、cAMP或钙通量测定或结合测定，例如ELISA或竞争测定。
所利用的功能测定的类型将取决于多肽的蛋白或肽和BDM部分所结合的目标。
也可利用半衰期测定。此类方法是本领域已知的。两种常用于测定蛋白的半衰期的方法是放射性脉冲追踪分析(radioactive pulse-chase analysis)和环己亚酰胺追踪(Zhou P(2004)Methods Mol. Biol.284:67-77。
测量结合亲和力
表位的结合可通过常规的抗原结合测定(诸如ELISA)、通过基于荧光的技术(包括FRET)、或通过诸如表面等离子体共振(其测量分子的质量)的技术测量。抗原结合蛋白(例如BDM)对抗原或表位的特异性结合可通过包括例如以下测定法的适合测定法测定：Scatchard分析和/或竞争性结合测定，诸如放射免疫测定(RIA)、酶免疫测定，诸如ELISA和夹心竞争测定。
可使用诸如表面等离子体共振测定的竞争测定法来测定已经经过工程改造以与特定目标结合的BDM是否能够与该特定目标结合。以举例说明的方式，BDM可经工程改造以与干细胞因子受体(CSFR 或c-kit受体)结合，并测试其与天然配体(c-kit)的结合进行竞争的能力。用于测定经修饰的BDM竞争对目标的结合的能力以及测定解离常数 (KD)的活体外竞争测定法是本领域已知的。
多肽的蛋白或BDM部分与其相应目标之间的相互作用的结合亲和力或解离常数(KD)可通过本领域已知的多种方法测量。此类方法包括但不限于荧光滴定、竞争ELISA、量热法，诸如等温滴定量热法(ITC) 和表面等离子体共振(BIAcore)或生物薄膜干涉技术(Bio-layer interferometry)(例如Blitz系统(ForteBio)。
优选的表面等离子体共振测定是本领域已知的BIAcore。
大部分结合部分具有范围在低微摩尔(10-6)至毫微摩尔(10-7至 10-9)的KD值。一般来讲，高亲和力结合部分被视为在低毫微摩尔范围(10-9)内，而极高亲和力结合部分被视为在皮摩尔(10-12)范围内。
相应部分与其目标之间的复合物形成受诸如以下多种不同因素的影响：相应结合伴侣的浓度、竞争者的存在、所用缓冲剂体系的 pH和离子强度、以及用于测定KD的实验方法(例如，荧光滴定、竞争ELISA或表面等离子体共振)或甚至是用于评估实验数据的数学算法。
因此，对于本领域的技术人员而言明显的是：KD值可在某个实验范围内变化，具体取决于用于测定特定免疫球蛋白或BDM对给定目标的亲和力的方法和实验设置。这意味着，可能存在所测量的KD 值的轻微偏差，或容许范围，具体取决于KD值是通过表面等离子体共振(Biacore)、通过竞争ELISA还是通过“直接ELISA”测定的。
在一个优选的实例中，KD值通过使用对固定化目标的表面等离子体共振测定法(例如使用BIAcore表面等离子体共振(BIAcore,Inc., Piscataway,NJ))来测定。
亲和力可以比蛋白或BDM对不相关氨基酸序列的亲和力大至少 1倍、大至少2倍、大至少3倍、大至少4倍、大至少5倍、大至少 6倍、大至少7倍、大至少8倍、大至少9倍、大至少10倍、大至少20倍、大至少30倍、大至少40倍、大至少50倍、大至少60倍、大至少70倍、大至少80倍、大至少90倍、大至少100倍、或大至少1000倍、或更多。蛋白或BDM对目标(例如蛋白抗原)的亲和力可以为例如约100毫微摩尔(nM)至约0.1nM、约100nM至约1皮摩尔 (pM)、或约100nM至约1飞摩尔(fM)或更大。
在一个实例中，蛋白具有由约200nM或更小、约100nM或更小、约50nM或更小、约25nM或更小、约10nM或更小、约5nM或更小、约1nM或更小或约0.5nM或更小的KD测量的亲和力。
在一个实例中，BDM具有由约200nM或更小、约100nM或更小、约50nM或更小、约25nM或更小、10nM或更小、约5nM或更小、约1nM或更小或约0.5nM或更小的KD测量的亲和力。
生物薄膜干涉技术是用于测量相互作用组内的生物分子相互作用的无标记技术。它是分析从以下两个表面反射的白光的干涉图样的光学分析技术：生物传感器顶端上的固定化蛋白的层，和内部参考层。与生物传感器顶端结合的分子的数目的任何改变均会造成干涉图样的偏移，这种偏移可实时测量。
固定在生物传感器顶端表面上的配体与溶液中的分析物之间的结合引起生物传感器顶端的光学厚度的增加，这造成波长偏移(△λ)，波长偏移是生物层的厚度的改变的直接度量。相互作用以实时方式测量，从而提供以高精密度和准确度监测结合特异性、缔合和解离速率、或浓度的能力。
只有与生物传感器结合或从生物传感器解离的分子才能偏移干涉图样并产生反应轮廓。未结合的分子、周围培养基的折射率的改变、或流量的改变不会影响干涉图样。这是生物薄膜干涉技术的独特特性，并将其能力扩展到在用于蛋白-蛋白相互作用、定量、亲和力和动力学应用的粗样本中执行。
目标
根据本公开的目标优选为抗原。抗原可选自蛋白、聚糖、脂质、脂蛋白或核酸。蛋白可以是人蛋白、非人蛋白(例如灵长类动物、犬、猫等)、病毒蛋白、酵母蛋白、细菌蛋白、藻类蛋白、植物蛋白或原生动物蛋白。蛋白可以是可溶性蛋白或膜结合蛋白。可溶性蛋白的实例包括但不限于转录因子、抗体、生长因子、血液蛋白(例如白蛋白)、或药物(例如类固醇、医药药物等)。膜结合性蛋白的类型包括生长因子受体、肿瘤标记物、或介导至细胞内的转运的标记物(例如转铁蛋白)、或Fc受体。
核酸目标可以是DNA、RNA或DNA与RNA的组合。
更具体地讲，目标是存在于抗原上的表位。本领域的技术人员将领会到，抗原可包含许多独特的表位，它们各自被蛋白(例如抗体)或 BDM识别。
本公开的多肽可与不同的目标结合。在一个实例中，不同的目标是两个或三个不同的抗原。各个抗原可存在于不同的细胞上。在另一个实例中，多肽可与相同抗原上的两个或三个不同的目标(例如表位) 结合。优选地，蛋白所结合的目标与BDM所结合的目标不同。
根据本公开的“目标抗原”可以是蛋白、肽、糖蛋白、多糖、聚糖、脂质、脂蛋白或核酸。根据本公开的目标抗原可以是分泌的或膜结合的。此类抗原可衍生自细菌、哺乳动物(人和非人)、真菌、藻类、原生动物来源。蛋白可以是人蛋白、非人蛋白(例如灵长类动物、犬、猫等)、病毒蛋白、酵母蛋白、细菌蛋白、藻类蛋白、植物蛋白或原生动物蛋白。
对相同的“第一目标抗原”、“第二目标抗原”等的提及将被理解成表示该药理活性蛋白和该至少一个BDM部分与相同的抗原结合，但可与存在于该抗原上的不同表位结合。
对不同的“第一目标抗原”、“第二目标抗原”等的提及将被理解成表示该药理活性蛋白部分与该至少一个BDM部分与不同的抗原并因此与存在于不同细胞上的不同表位结合。
(i)细菌抗原
抗原可衍生自细菌，包括但不限于幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori)、肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae)、沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)、解脲支原体(Ureaplasma urealyticum)、肺炎支原体 (Mycoplasma pneumoniae)、葡萄球菌属物种(Staphylococcus spp.)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、链球菌属物种(Streptococcus spp.)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、草绿色链球菌(Streptococcus viridans)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitidis)、淋病奈瑟氏菌(Neisseria gonorrhoeae)、炭疽杆菌(Bacillus anthracis)、沙门氏菌属物种(Salmonella spp.)、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)、霍乱弧菌(Vibrio cholera)、鼠疫巴氏杆菌(Pasteurella pestis)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、曲杆菌属物种(Campylobacter spp.)、空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)、梭菌属物种(Clostridium spp.)、艰难梭菌(Clostridium difficile)、分枝杆菌属物种(Mycobacterium spp.)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、螺旋体属物种(Treponema spp.)、疏螺旋体属物种(Borrelia spp.)、伯氏疏螺旋体(Borreliaburgdorferi)、钩端螺旋体属物种(Leptospira spp.)、杜克雷嗜血杆菌 (Hemophilusducreyi)、白喉杆菌(Corynebacterium diphtheria)、百日咳博德特杆菌(Bordetellapertussis)、副百日咳博德特杆菌(Bordetella parapertussis)、支气管博德特菌(Bordetella bronchiseptica)、流感嗜血杆菌(hemophilus influenza)、大肠杆菌(Escherichia coli)、志贺氏菌属物种(Shigella spp.)、埃立克体属物种(Erlichiaspp.)、和立克次氏体属物种(Rickettsia spp.)。
(ii)病毒抗原
抗原可以衍生自病毒，包括但不限于流感病毒、副流感病毒、腮腺炎病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒、EB病毒、鼻病毒、脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒、艾柯病毒、麻疹病毒、德国麻疹病毒、水痘带状疱疹病毒、疱疹病毒(人和动物)、单纯疱疹病毒、细小病毒(人和动物)、巨细胞病毒、肝炎病毒、人乳头状瘤病毒、α病毒、虫媒病毒、布尼亚病毒、狂犬病毒、沙粒病毒、丝状病毒、HIV 1、HIV 2、HTLV-1、 HTLV-II、FeLV、牛LV、FeIV、犬瘟热病毒、犬接触传染性肝炎病毒、猫杯状病毒、猫鼻气管炎病毒、TGE病毒(猪)、和口蹄疫。
(iii)肿瘤抗原
目标抗原可以是肿瘤相关性抗原。此类肿瘤相关性抗原包括但不限于MUC-1及其肽片段、蛋白MZ2-E、多形性上皮粘蛋白、叶酸结合蛋白LK26、MAGE-1或MAGE-3及其肽片段、人绒毛膜促性腺激素(HCG)及其肽片段、癌胚抗原(CEA)及其肽片段、甲胎蛋白(AFP) 及其肽片段、胰腺癌胚抗原及其肽片段、CA 125、15-3、19-9、549、 195及其肽片段、前列腺特异性抗原(PSA)及其肽片段、前列腺特异性膜抗原(PSMA)及其肽片段、鳞状细胞癌抗原(SCCA)及其肽片段、卵巢癌抗原(OCA)及其肽片段、胰腺癌相关性抗原(PaA)及其肽片段、 Her1/neu及其肽片段、gp-100及其肽片段、突变体K-ras蛋白及其肽片段、突变体p53及其肽片段、非突变体p53及其肽片段、截短的表皮生长因子受体(EGFR)、嵌合蛋白p210BCR-ABL、端粒酶及其肽片段、存活素及其肽片段、Melan-A/MART-1蛋白及其肽片段、WT1蛋白及肽片段、LMP2蛋白及肽片段、HPV E6E7蛋白及肽片段、独特型蛋白及肽片段、NY-ESO-1蛋白及肽片段、PAP蛋白及肽片段、睾丸癌蛋白及肽片段、以及5T4蛋白及肽片段。
(iv)其他哺乳动物抗原
目标抗原可以是存在于位于心脏、血液系统、肺、肠、胃、直肠、前列腺、甲状腺、肝或食道内的细胞上的抗原或表位。目标抗原可以是存在于分泌蛋白上的抗原或表位。分泌蛋白的实例包括但不限于激素、酶、毒素和抗微生物剂、肽。或者，抗原或表位存在于非膜结合性蛋白上。
选择性结合
在一个实例中，所述分子可与表达多特异性分子的不同目标抗原中的两者或更多者的细胞选择性结合的程度高于仅表达这些目标抗原中的一者的细胞。
这种细胞选择性可通过以下方式实现：对双特异性物或三特异性物上的各个部分(例如蛋白或BDM)的结合亲和力进行滴定，以使得各个部分与其目标的结合在不存在其他由该双特异性物或三特异性物结合的目标的情况下，不足以使表达该目标的细胞的荧光活化细胞分选(FACS)或免疫荧光标记或细胞杀伤成为可能，但其中弱结合部分的组合促使双特异性物或三特异性物具有充分的亲合力，以使共表达相关目标分子的细胞相较于仅表达一个这样的目标的细胞的选择性结合成为可能，使得能够实现选择性FACS分选、免疫荧光标记或细胞杀伤。
组合物
当与药学上可接受的载剂或赋形剂组合时，本公开的多特异性分子可被用作为组合物。此类药物组合物可用于在活体内施用给受试者。
药学上可接受的载剂对于所施用的患者而言是生理上可接受的，且保持与其一起施用的分子的治疗特性。药学上可接受的载剂及其制剂在例如Remington’pharmaceuticalSciences第18版,A Gennaro编, Mack Publishing Co.,Easton PA 1990)中一般地描述。示例性载剂是生理盐水。如本文所用的短语“药学上可接受的载剂”表示药学上可接受的材料、组合物或媒介物，诸如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂或胶囊材料，它们涉及将多肽从一个器官或身体部分的施用部位携带或运输至另一个器官或身体部分。各种载剂在与制剂的其他成分相容且对患者无害的意义上必须是可接受的。
药学上可接受的赋形剂可包括防腐剂或冷冻保存剂。
药物组合物可被配制成与特定施用途径(全身性或局部性)相容。
在一个实例中，本文所述的组合物可经口、经肠胃外、通过吸入喷雾、吸附、吸收、外用、经直肠、经鼻部、经颊部、经阴道、经心室内、经由呈含有常规非毒性药学上可接受的载剂的剂量制剂形式的植入式贮存器、或通过任何其他便利的剂型施用。如本文所用的术语“肠胃外”包括皮下、静脉内、肌内、腹膜内、鞘内、室内、胸骨内、和颅内注射或输注技术。
用于将分子制备成适用于施用至受试者的形式(例如药物组合物) 的方法是本领域已知的且包括例如如Remington's Pharmaceutical Sciences(第18版,MackPublishing Co.,Easton,Pa.,1990)和《美国药典：国家处方集》(Mack PublishingCompany,Easton,Pa.,1984)中描述的方法。
本公开的药物组合物尤其可用于肠胃外施用，诸如静脉内施用或施用至体腔，或器官或关节的内腔中。用于施用的组合物通常将包括多肽溶于药学上可接受的载剂(例如水性载剂)得到的溶液。可使用多种水性载剂，例如缓冲盐水等。组合物可含有接近生理条件所需的药学上可接受的辅助物质，诸如pH调节剂和缓冲剂、毒性调节剂等，例如醋酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、乳酸钠等。本公开的蛋白在这些制剂中的浓度可广泛地变化，且主要基于流体体积、粘度、体重等根据所选的特定施用模式和患者的需要来选择。示例性载剂包括水、盐水、林格氏溶液、右旋糖溶液、和5％人血清白蛋白。也可使用非水性媒介物，诸如混合油和油酸乙酯。也可以使用脂质体作为载剂。媒介物可含有微量的增强等渗性和化学稳定性的添加剂(例如缓冲剂、防腐剂或添加剂)。
在配制后，本公开的多肽将以与该剂量制剂相容的方式且以治疗上/预防上有效的量施用。制剂容易地以多种剂型施用，这些剂型诸如上文描述的可注射溶液的类型，但也设想了其他药学上可接受的形式，例如片剂、丸剂、胶囊或其他用于经口施用的固体、栓剂、子宫托、鼻部溶液或喷雾、气溶胶、吸入剂、脂质体形式等。也可使用药物“缓释”胶囊或组合物。缓释制剂通常被设计成在长时间内提供恒定的药物水平且可用于递送本公开的化合物。
对于静脉内施用，适合的载剂包括生理盐水、抑菌水、Cremophor ELTM(BASF,Parsippany,N.J.)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。载剂可以是含有例如以下成分的溶剂或分散介质：水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、和液体聚乙二醇等)及其适合的混合物。流动性可例如通过以下方式维持：使用诸如卵磷脂的包衣、就分散体而言维持所需的粒度、以及使用表面活性剂。抗细菌剂和抗真菌剂包括例如对羟基苯甲酸酯类、氯丁醇、酚、抗坏血酸和硫柳汞。可在该组合物中包含等张剂，例如糖、多元醇(诸如甘露糖醇、山梨糖醇)和氯化钠。所得的溶液可按原样包装以供使用，或进行冻干；冻干制剂随后可在施用前与无菌溶液结合。
药学上可接受的载剂可含有稳定、增加或延迟吸收或清除的化合物。此类化合物包括例如碳水化合物，诸如葡萄糖、蔗糖、或葡聚糖；低分子量蛋白；减少肽的清除或水解的组合物；或赋形剂或其他稳定剂和/或缓冲剂。延迟吸收的试剂包括例如单硬脂酸铝和明胶。也可使用洗涤剂以稳定或以增加或减少药物组合物的吸收，包括脂质体载剂。为避免被消化，化合物可与组合物复合以使其耐酸和酶水解，或化合物可在适当的抗性载剂(诸如脂质体)中复合。避免多肽被消化的方法是本领域已知的(参见例如Fix(1996)Pharm Res.13:1760 1764； Samanen(1996)J.Pharm.Pharmacol.48:119 135；和美国专利No. 5,391,377，它们描述用于经口递送治疗剂的脂质组合物)。
可使用可生物降解的生物相容性聚合物，诸如乙烯/醋酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯、和聚乳酸。用于制备此类制剂的方法是本领域技术人员已知的。这些材料也可从Alza Corporation 和Nova Pharmaceuticals,Inc商购获得。脂质体悬浮液(包括使用抗体或病毒外壳蛋白靶向细胞或组织的脂质体)也可被用作药学上可接受的载剂。这些材料可根据本领域已知的方法制备，例如，如在美国专利No.4,235,871、4,501,728、4,522,811、4,837,028、6,110,490、6,096,716、 5,283,185、5,279,833；Akimaru(1995)Cytokines Mol.Ther.1:197 210； Alving(1995)Immunol.Rev.145:5 31和Szoka(1980)Ann.Rev. Biophys.Bioeng.9:467)中描述的。能够持续递送包括肽在内的小分子的可生物降解的微球或胶囊或其他可生物降解的聚合物构型是本领域已知的(参见例如Putney(1998)Nat.Biotechnol.16:153 157)。
本公开的分子可并入胶束内(参见例如Suntres(1994)J.Pharm. Pharmacol.46:23 28；Woodle(1992)Pharm.Res.9:260 265)。所述分子可附接至脂质单层或双层的表面。例如，这些分子可附接至含有酰肼 -PEG-(二硬脂酰基磷脂酰基)乙醇胺的脂质体(参见例如Zalipsky (1995)Bioconjug.Chem.6:705 708)。或者，可使用任何形式的脂质膜，诸如平面脂质膜或完整细胞(例如红细胞)的细胞膜。脂质体和含脂质的制剂可以任何方式递送，这些方式包括例如静脉内、经皮(参见例如Vutla(1996)J.Pharm.Sci.85:5 8)、经粘膜、或经口施用。
本公开的组合物可与其他如本文所提供的治疗部分或成像/诊断部分组合。治疗部分和/或成像部分可以作为分开的组合物或作为缀合的部分而提供。接头可根据需要包含在缀合部分中且已在本文的其他地方进行了描述。
在本文中公开的分子也可被配制成免疫脂质体。含有多肽的脂质体通过本领域已知的方法制备，诸如在Epstein等人,Proc.Natl.Acad. Sci.USA,82:3688(1985)；Hwang等人,Proc.Natl Acad.Sci.USA,77: 4030(1980)；以及美国专利No.4,485,045和4,544,545中所述。具有延长的循环时间的脂质体在美国专利No.5,013,556中进行了公开。
用于活体内施用的制剂是无菌的。灭菌可经由通过无菌过滤膜过滤而容易地实现。
本公开的组合物可与其他治疗剂(例如化学治疗剂)一起施用。化学治疗剂是本领域已知的且包括细胞毒性药物和细胞生长抑制性药物。非限制性实例包括紫杉醇(paclitaxel)、顺铂、甲氨蝶呤、多柔比星、氟达拉滨等。取决于要治疗的病况，也设想了其他治疗剂。
本公开的一个实施方案设想了使用本公开的任何药物组合物来制备用于治疗失调的药品。药品可被包装在具有适当的标签的适合的药物包装内，其中该标签用于指示在受试者中治疗失调。
标记和检测
本公开提供了用试剂标记的本文所述的分子。在一个实例中，该试剂是成像/可检测部分。在另一个实例中，该试剂是治疗性部分。用于标记多肽的方法将是本领域的技术人员熟悉的。
术语“标记”或“经标记的”旨在涵盖通过将可检测物质偶合(即物理地连接)到蛋白或BDM而直接标记所述蛋白(例如抗体)或BDM，以及通过与被直接标记的另一试剂的反应性而间接标记。该术语也包括共价或非共价偶合。
在一个实例中，该分子可以用毒素、放射性核素、与铁相关的化合物、染料、成像剂或荧光标记或化学治疗剂标记。
或者，该分子可以用可检测标记(诸如放射性核素、与铁相关的化合物、染料、成像剂或用于目标抗原的免疫检测的荧光剂)标记。
放射性标记的非限制性实例包括例如32P、33P、43K、52Fe、57Co、64Cu、67Ga、67Cu、68Ga、71Ge、75Br、76Br、77Br、77As、81Rb/81MKr、87MSr、90Y、97Ru、99Tc、100Pd、101Rh、103Pb、105Rh、109Pd、111Ag、111In、113In、119Sb、121Sn、123I、125I、127Cs、128Ba、129Cs、131I、131Cs、143Pr、153Sm、161Tb、166Ho、169Eu、177Lu、186Re、188Re、189Re、191Os、 193Pt、194Ir、197Hg、199Au、203Pb、211At、212Pb、212Bi和213Bi。
多种放射性核素可用于产生经放射性缀合的蛋白。实例包括但不限于低能量放射性核素(例如适用于诊断目的)，诸如13C、15N、2H、125I、123I、99Tc、43K、52Fe、67Ga、68Ga、111In等。例如，该放射性核素是γ、光子、或正电子发射放射性核素，其半衰期适于在施用与定位到成像位点之间的经过时间之后具有一定的活性或能够检测。本公开还涵盖高能量放射性核素(例如用于治疗性目的)，诸如125I、131I、123I、111In、105Rh、153Sm、67Cu、67Ga、166Ho、177Lu、186Re和188Re。这些同位素通常产生高能量α粒子或β粒子，它们具有短的路径长度。此类放射性核素杀伤它们所靠近的细胞，例如缀合物已附接或已进入的赘生性细胞。它们对非局部细胞的影响很小或没有影响，且基本上无免疫原性。或者，高能量同位素可通过原本稳定的同位素的热辐射而产生，例如，如在硼中子俘获疗法中(Guan等人，1998)。其他可能适合的同位素在以下文献中有所描述：Carter.(2001)Nature Reviews Cancer 1,118-129,Goldmacher等人(2011)Therapeutic Delivery 2；397-416,Payne(2003)Cancer Cell 3,207–212,Schrama等人,(2006) Nature Rev.Drug Discov.5,147–159,Reichert等人(2007)Nature Reviews Drug Discovery 6；349-356。
毒素包括任何对细胞有害(例如杀伤)的作用剂。其他与制备抗体免疫毒素缀合物有关的技术例如在US 5,194,594中提供，并且可用在本公开中。毒素的非限制性实例包括例如白喉毒素A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌)、蓖麻毒素A链、想思豆毒素A链、莫迪素(modeccin A chain)、α-sarcin、油桐(Aleurites fordii)蛋白、石竹素(dianthin)蛋白、美洲商陆(Phytolaca americana)蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(momordica charantia)抑制剂、麻风树毒蛋白(curcin)、巴豆毒素、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制剂、白树毒素(gelonin)、米托菌素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、伊诺霉素(enomycin)、单端孢霉烯族化合物(tricothecenes)、产气荚膜梭菌磷脂酶C(PLC)、牛胰核糖核酸酶(BPR)、抗病毒蛋白(PAP)、想思豆毒素、眼镜蛇毒因子(CVF)、白树毒素(GEL)、皂草素(SAP)、槲寄生素(viscumin)。
与铁相关的化合物的非限制性实例包括例如磁性氧化铁颗粒、三价铁或二价铁颗粒、Fe203和Fe304。与铁相关的化合物及标记多肽、蛋白和肽的方法可例如见于美国专利4,101,435和4,452,773以及美国公开申请20020064502和20020136693，它们全部据此整体以引用方式并入。
在某些实例中，所述分子可被标记到细胞毒素或其他细胞增殖抑制化合物，以便将该药剂的递送定位至肿瘤细胞。例如，该药剂可选自药剂、酶抑制剂、增殖抑制剂、溶解剂、DNA或RNA合成抑制剂、膜渗透性修改剂、DNA代谢物、二氯二乙硫醚(dichloroethylsulfide) 衍生物、蛋白制造抑制剂、核糖体抑制剂、凋亡诱导剂和神经毒素。
在一个实例中，如本文所述的分子包含一个或多个可检测标记物以帮助检测和/或分离。例如，多肽包含荧光标记，比如荧光素(FITC)、 5,6-羧基甲基荧光素、德克萨斯红(Texas red)、硝基苯并-2-氧杂-1,3- 二唑-4-基(NBD)、香豆素、丹磺酰氯、罗丹明、4'-6二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)、和花青染料Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5及Cy7、荧光素(5- 羧基荧光素-N-羟基琥珀酰亚胺酯)、罗丹明(5,6-四甲基罗丹明)。这些荧光剂的吸收和放射最大值分别为：FITC(490nm；520nm)、Cy3(554 nm；568nm)、Cy3.5(581nm；588nm)、Cy5(652nm:672nm)、Cy5.5 (682nm；703nm)和Cy7(755nm；778nm)。
在某些实例中，该分子可与可用于肿瘤成像的试剂偶合。此类试剂包括：金属；金属螯合剂；镧系元素；镧系元素螯合剂；放射性金属；放射性金属螯合剂；正电子发射核；微泡(用于超声)；脂质体；在脂质体或纳米球中微囊化的分子；单晶氧化铁纳米化合物；磁共振成像造影剂；光吸收、反射和/或散射剂；胶态颗粒；荧光团，诸如近红外光荧光团。在许多实例中，此类次级官能团/部分会将相对大，例如大小为至少25amu，且在许多情况下大小可以为至少50、100或 250amu。在某些实例中，该次级官能团为用于螯合金属的螯合物部分，例如放射性金属或顺磁性离子的螯合剂。在其他实例中，它是可用于放射性治疗或成像程序的放射性核素的螯合剂。
替代地或除此之外，该分子可以用例如磁性或顺磁性化合物标记，诸如铁、钢、镍、钴、稀土材料、钕-铁-硼、二价铁-铬-钴、镍-二价铁、钴-铂、或锶铁氧体。
在另一个实例中，该分子与“受体”(诸如链霉亲和素)缀合以用于细胞预靶向，其中将该缀合物施用给患者，接着使用清除剂从循环中移除未结合的缀合物，然后施用与治疗剂(例如放射性核苷酸)缀合的“配体”(例如亲和素)。
示例性治疗剂包括但不限于抗血管生成剂、抗新血管形成和/或其他血管形成剂、抗增殖剂、促凋亡剂、化学治疗剂、抗有丝分裂剂 (例如抗有丝分裂剂Auristatin，(MMAF/MMAE，根据Angew.Chem.Int. Ed.2014,53,1–6)或治疗性核酸。
可用作本文中的药剂的化学治疗剂包括细胞毒性药物和细胞生长抑制药物。化学治疗剂可包括对细胞具有其他作用(诸如将转化状态逆转成分化状态)的那些或抑制细胞复制的那些。可用于本发明的已知的细胞毒性剂的实例例如在Goodman等人,“ThePharmacological Basis of Therapeutics,”第六版,A.B.Gilman等人编/MacmillanPublishing Co.New York,1980中列出。这些包括紫杉烷，诸如紫杉醇和多西他赛(docetaxel)；氮，诸如氮芥(mechlorethamine)、美法仑 (melphalan)、乌拉莫司汀(uracilmustard)和苯丁酸氮芥(chlorambucil)；乙烯亚胺衍生物，诸如塞替派(thiotepa)；磺酸烷基酯，诸如白消安 (busulfan)；亚硝基脲，诸如洛莫司汀(lomustine)、司莫司汀(semustine) 和链脲菌素(streptozocin)；三氮烯，诸如达卡巴嗪(dacarbazine)；叶酸类似物，诸如甲氨蝶呤；嘧啶类似物，诸如氟尿嘧啶、阿糖胞苷 (cytarabine)和阿扎立平(azaribine)；嘌呤类似物，诸如巯基嘌呤和硫鸟嘌呤；长春花生物碱，诸如长春花碱(vinblastine)和长春新碱 (vincristine)；抗生素，诸如放线菌素、道诺霉素、多柔比星和丝裂霉素；酶、铂配位错合物，诸如顺铂；经取代的脲，诸如羟基脲；甲基肼衍生物，诸如丙卡巴肼(procarbazine)；肾上腺皮质抑制剂，诸如米托坦(mitotane)；激素和拮抗剂，诸如肾上腺皮质类固醇(强的松 (prednisone))、孕酮(己酸羟孕酮(hydroxyprogesteronecaproate)、醋酸羟孕酮和醋酸甲地孕酮(megestrol acetate))、雌激素(乙烯雌酚(diethylstilbestrol)和乙炔雌二醇)、以及雄激素(丙酸睾酮和氟甲睾酮)。
在一个实例中，如本文所述的多特异性分子进一步与另一种蛋白 (例如人血清白蛋白或HSA)缀合或连接。在另一个实例中，非抗体蛋白为HSA。
该分子也可与治疗剂或脂质体(例如含药物的脂质体)缀合或连接。
也可以使用干扰蛋白合成的药物；此类药物是本领域的技术人员已知的且包括嘌呤霉素、环己亚酰胺和核糖核酸酶。
此外，本公开设想了其他标记，诸如生物素接着是链霉亲和素- 碱性磷酸酶(AP)、辣根过氧化物酶。
本公开的分子可经修饰以包含另外的非蛋白部分，这些部分是本领域已知的且可容易获得。例如，适用于蛋白的衍生的部分是生理上可接受的聚合物，例如水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性实例包括但不限于聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇(PVA)或聚丙二醇(PPG)。
用途
在一个实例中，本公开的分子可用于带有所述蛋白(或肽)和/或 BDM所结合的表位的所需抗原的亲和纯化或检测。
本公开还提供检测所述多肽的蛋白和BDM中的一者或两者所结合的目标的方法。此类方法可例如采用如上所述的可检测标记。在一个实例中，可将不同的标记用于该蛋白和BDM以鉴定所结合的目标是否是被该蛋白或BDM结合的目标。
可利用多种形式来测定样本是否含有与该蛋白或肽和/或BDM 结合的目标(例如蛋白)。此类形式的实例包括但不限于酶免疫测定 (EIA)、放射免疫测定(RIA)、蛋白质印迹分析和酶联免疫吸附测定 (ELISA)。
在一种形式中，该多肽可被用在诸如蛋白质印迹或免疫荧光技术的方法中以检测目标。
该蛋白(或肽)或BDM所结合的多肽或目标抗原可被固定在固相载体上。或者，该多特异性分子可与固相载体结合。适合的固相载体或载剂包括任何能够结合抗原(即目标)或免疫球蛋白或BDM的载体。熟知的载体或载剂包括玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、葡聚糖、尼龙、淀粉酶、天然和经修饰的纤维素、聚丙烯酰胺、辉长石和磁铁矿。本领域的技术人员将知道许多其他适用于结合蛋白、BDM或目标抗原的载剂，且能够改造这样的载体以用于本公开。例如，目标蛋白可在聚丙烯酰胺凝胶电泳上运行并固定到固相载体(诸如硝基纤维素)上。该载体接着可以用适合的缓冲剂洗涤，然后使用以可检测方式进行了标记的多肽处理。该固相载体接着可以用缓冲剂洗涤第二次以除去未结合的多肽。固相载体上结合的标记的量可接着通过常规方式检测。
在一个实例中，本公开的分子可用作药品。
本公开的多特异性分子的优点
关于非抗体蛋白，将BDM添加至此类蛋白可有助于增加蛋白的稳定性、循环时间和/或生物活性。例如，可使因子VIII蛋白偶合到与人血清白蛋白结合的VLD，以使得该蛋白的半衰期延长。这对于患有血友病的受试者以较低的频率给药是明显的优势。
关于抗体，根据本公开的分子提供胜过基于双特异性抗体的治疗剂的优点。用于改善抗体的一个或多个特性(例如不良治疗性抗体)的简单且高效的方法是将一个或多个与特定治疗目标结合的单结合域分子(BDM)附接到对所关注的目标具有特异性的抗体或免疫球蛋白抗原结合片段。
该双特异性方法的优点是：简单且高度有效的双特异性抗体生产；该方法适用于任何抗体序列；亲本抗体保持其原始结合位点和特异性；亲本抗体保持其亲合力；亲本抗体保持其原始结构和功能，且对于所选的应用，保持抗体介导的效应功能；保持包括血清半衰期在内的抗体药代动力学；双特异性产物无缝集成到现有IgG生产工艺(诸如制造、纯化、配制和所有其他基于标准IgG工艺的工艺)中。
在所选的应用中，由于基于抗体Fab片段的双特异性物相较于完整抗体较低的分子量、在血流中较短的半衰期和改善的分子量对结合位点比率，它们也将是有利的。
作为一个实例，传统上用完整抗体来处理的毒性物质的中和可以用Fab更有效地处理。由于抗体相较于毒性物质(通常小于1kDa)相对大的分子量(150kDa)，因此需要大量的抗体以按化学计量方式与毒素结合。由于本文所述的双特异性或三特异性Fab提供了多个结合位点，因此可以按较低的剂量使用这些双特异性或三特异性Fab。Fab相较于抗体的小尺寸使毒性物质-Fab复合物通过肾脏快速地排出。同样，用于产生基于Fab的双特异性物的高效且简单的方法是将与特定目标结合的BDM附接至对所关注的目标具有特异性的现有Fab。
试剂盒
本公开还提供包含本文所述的多特异性分子连同使用说明的试剂盒。在将组合物冻干的情况下，试剂盒可含有另外的配制溶液以复原所述制剂。所述说明可以在“印刷品”上，例如在试剂盒内或贴到试剂盒上的纸或硬纸板上，或在贴到试剂盒或包装材料的标签上，或附接到含有试剂盒组分的小瓶或管上。
此外，试剂盒可进一步包括本文中所提供的其他部分中的任一者，比如化学治疗剂。
试剂盒可进一步包括用于本文所提供的测定(例如ELISA测定) 的组成部分。
试剂盒可进一步包括规定了例如产品描述、施用模式和治疗适应症的标签。该标签或包装插入物可包括适当的书面指示。
本领域的技术人员将领会到，可对以上描述的实施方案做出许多改变和/或修饰，而不偏离本公开的广泛一般性范围。本发明的实施方案因此应在所有方面均被视为说明性而非限制性的。
实施例1抗体双特异性和三特异性分子的产生
i)载体产生
CTLA-4BDM的基因构建和克隆通过标准且详细描述的技术并进一步如此前在US7,166,697中所述的那样而进行。CTLA-4BDM得自文库(Geneart)。基因文库1696327使用合成简并寡核苷酸而组装，目标是在DNA序列中包含对应于结合环区域的不同取代。
这些实施例中使用的CTLA-4序列包含天然序列的C端修饰，其中将天然序列PEPCPDSDGSTG用PEPSPDSN置换。这些序列不含允许BDM维持单体形式的C端Cys残基。
制备了编码以下部分的核酸构建体：融合至B7-1结合性CTLA-4 V样结构域序列的抗溶菌酶IgG1重链序列(被称为D1.3 IgG-VLDx2 (HC))和融合至B7-1结合性V样结构域序列的抗溶菌酶IgGκ轻链序列(被称为D1.3 IgG-VLDx2(LC))。VLD通过Gly-Ser接头序列分别与抗体重(H)链或轻(L)链偶合。所有的DNA构建体均通过限制酶切分析和DNA测序而确认，并通过标准且熟知的技术测试了重组蛋白的表达。
这些构建体的序列如下所示。抗原结合环在相关时带有下划线：
B7-1结合性V样结构域(VLD)的序列(SEQ ID NO:13)
VLD的结合环带有下划线。
接头序列(SEQ ID NO:16)
SGGGGSGGGGSGGGGS
接头序列(SEQ ID NO:17)
SGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
用于抗体-VLD融合体的抗溶菌酶IgG1重链序列(SEQ ID NO:18)
通过接头与B7-1结合性VLD偶合的抗溶菌酶IgG1重链的序列(D1.3 IgG-VLDx2 (HC))(SEQ ID NO:19)
VLD的结合环带有下划线。
抗溶菌酶IgG κ轻链(SEQ ID NO:20)
通过21个氨基酸的Gly-Ser接头与B7-1结合性VLD偶合的抗溶菌酶IgG κ轻链(被 称为D1.3 IgG-VLDx2(LC))(SEQ ID NO:21)
VLD的结合环带有下划线。
通过21个氨基酸的Gly-Ser接头与B7.1结合性VLD偶合的抗溶菌酶Fab κ轻链(被 称为D1.3 Fab-VLDx1(LC)(SEQ ID NO:22)
VLD的结合环带有下划线。
通过21个氨基酸的Gly-Ser接头与B7.1结合性VLD偶合的抗溶菌酶Fab重链(被称 为D1.3 Fab-VLDx1(HC)(SEQ ID NO:23)
VLD的结合环带有下划线。
抗溶菌酶Fab重链(具有C端His6和myc标签)(SEQ ID NO:24)
ii)双特异性和三特异性分子的制备
将编码抗体-VLD或Fab-VLD序列的各条重链和轻链克隆到表达载体pcDNA3.4(Thermo Fisher)中。该载体在大肠杆菌细胞(得自 Agilent Technologies的Electro TenBlue)中产生/扩增。
根据本公开的双特异性和三特异性分子的示意图在图2-4中针对抗体-VLD分子举例说明，在图5-7中针对Fab-VLD分子举例说明。
图2显示了通过以下方式形成的根据一个实例的抗体-VLD双特异性分子[D1.3IgG-VLDx2(HC)]的示意图：将目标特异性VLD(例如与目标B结合)与抗溶菌酶IgG1抗体重链的各恒定重(CH3)链序列的末端偶合。该抗体分子通过抗体重链和轻链可变区与目标A结合且通过重链上的VLD与目标B结合。
图3显示了通过以下方式形成的根据一个实例的抗体-VLD双特异性分子[D1.3IgG-VLDx2(LC)]的示意图：将目标特异性VLD(例如与目标B结合)与抗溶菌酶IgG1抗体轻链的各恒定轻(CL)链序列的末端偶合。该分子通过抗体重链和轻链可变区与目标A结合且通过轻链上的VLD与目标B结合。
图4显示了通过以下方式形成的根据一个实例的抗体-VLD三特异性分子D1.3IgG-VLDx4(LC+HC)的示意图：将目标特异性VLD (例如与目标B结合)与重链和轻链两者偶合，其中VLD与末端CL 序列偶合并且也与重链CH3序列的末端偶合。该分子通过抗体重链和轻链可变区与目标A结合、通过轻链上的VLD与目标B结合、且通过与结合目标B的相同的VLD或不同的VLD与目标C结合。该三特异性物可与目标A、B和C单独地或同时地结合或与三个目标的组合(例如目标和B、或目标A和C、或目标B和C)结合。
图5显示了根据本公开的一个实例的双特异性Fab-VLD分子 (D1.3 Fab-VLDx1(HC))的示意图。在该示意图中，该双特异性物通过以下方式形成：将目标特异性VLD(例如在该实例中，VLD对目标B 具有特异性)融合到与目标A结合的Fab的恒定区(CH1)序列的末端 (例如在该实例中，Fab对目标A具有特异性)。该双特异性可与目标 A和B两者单独地或同时地结合。
图6显示了根据本公开的一个实例的双特异性Fab-VLD分子 (D1.3 Fab-VLDx1(LC))的示意图。在该示意图中，该双特异性物通过以下方式形成：将目标特异性VLD(例如在该实例中，VLD对目标B 具有特异性)融合到与目标A结合的Fab的CL序列的末端(例如在该实例中，Fab对目标A具有特异性)。该双特异性物可与目标A和B 两者单独地或同时地结合。
图7显示了根据本公开的三特异性Fab-VLD分子(D1.3 Fab-VLDx2(LC+HC))的示意图。在该示意图中，该三特异性物通过以下方式形成：将目标特异性VLD(例如在该实例中，VLD对目标B 具有特异性)融合到Fab CL序列的末端以及将第二目标特异性VLD (例如在该实例中，VLD对目标C具有特异性)融合到与目标A结合的Fab CH3序列的末端(例如在该实例中，Fab对目标A具有特异性)。该三特异性物可与目标A和B和C单独地或同时地结合或与三个目标的组合(例如目标A和B、或目标A和C、或目标B和C)结合。
细菌的载体转化根据标准技术使用2ng DNA采用电穿孔感受态细胞系(例如ElectroTen-Blue细胞，Stratagene目录号200159)进行。
在载体扩增后，将DNA用Qiagen HiSpeed质粒Maxi试剂盒(目录号12663)或Qiafilter质粒Mega试剂盒(目录号12281)提取和制备。将DNA在无核酸酶的纯化水中洗脱。
iii)将DNA转染进哺乳动物细胞中以用于蛋白表达
使用Expi293表达系统(ThermoFisher Scientific)进行生存力>95％的约2x106个Expi293细胞/mL哺乳动物细胞的转染。双特异性或三特异性DNA载体按1:3的HC：LC DNA比率制备。将DNA加热至 65℃保持5分钟，然后使之冷却至室温，之后添加Opti-MEM I(LifeTechnologies目录号31985070)和ExpiFectamine 293试剂 (ThermoFisher目录号A14525)并在室温下温育30分钟。将该转染复合物添加到细胞中并在37℃、5％CO2、120rpm下温育。在大约4-5 天后收获含蛋白的上清液。
测定了得自使用Expi293表达系统进行的转染的抗体-VLD和 Fab-VLD亲本抗溶菌酶D1.3抗体、双特异性和三特异性变体的蛋白表达水平，分别如表1和表2所示。抗体或Fab与溶菌酶结合，VLD 与B7.1结合。
表1双特异性和三特异性抗体-VLD变体的蛋白表达水平
样本 Ab-VLD融合体 总纯化产量(mg)
单独的D1.3 IgG(全长) 无 0.45
D1.3 IgG-VLDx2(HC) 重链 0.36
D1.3 IgG-VDLx2(LC) 轻链 0.71
D1.3 IgG-VLDx4(HC+LC) 重链和轻链 0.29
表2双特异性和三特异性Fab-VLD变体的蛋白表达水平
样本 Fab-VLD融合体 总纯化产量(mg)
单独的D1.3 Fab 无 0.41
D1.3 Fab-VLDx1(HC) CH1 0.31
D1.3 Fab-VLDx1(LC) 轻链 0.40
D1.3 Fab-VLDx2(HC+LC) 重链和轻链 0.14
iv)纯化
将ProsepA纯化用于双特异性和三特异性分子的纯化。用5倍柱体积的PBS/Tris(2mM Tris，pH 8)平衡ProsepA柱。将pH 8的含有双特异性分子的转染细胞上清液上样到柱上并用10倍柱体积的PBS、 2mM Tris(pH 8)洗涤柱子。用0.1M甘氨酸(pH 3)洗脱蛋白。用1MTris (pH 8)将洗脱出的蛋白级分中和至约pH 7，并根据标准方法透析。
通过SDS PAGE测定变体的蛋白表达水平。从30ml通过亲和色谱纯化的表达培养物获得数值(未显示)。
实施例2 Fab分子的表达
通过SDS PAGE在非还原和还原条件下分析在未优化的标准 Expi293表达系统中表达的亲本D1.3 Fab及其双特异性和三特异性变体的表达。从30ml通过亲和色谱纯化的表达培养物获得数值。亲本 Fab是D1.3 Fab，双特异性物是D1.3 Fab-VLDx1(HC)(其为D1.3Fab 加上融合至D1.3 Fab的CH序列的末端的VLD)和D1.3 Fab-VLDx1 (CL)(其为D1.3 Fab加上融合至D1.3 Fab的CL序列的末端的VLD)。三特异性物是D1.3 Fab-VLDx2(HC+LC)，其为D1.3 Fab加上融合至 D1.3 Fab的CH序列和CL序列的末端两者的VLD。在非还原条件下的结果在图8中示出。在还原条件下的结果可见于图9。分析表明适当的重链和轻链融合体处于预期的大小范围。
实施例3双特异性和三特异性分子的结合的评估
使用ForteBio Blitz生物传感器采用标准化学和试剂表征了经纯化的双特异性和三特异性分子的结合特性。
将亲和色谱纯化的抗体、抗体-VLD双特异性分子和抗体-VLD 三特异性分子与可商购获得的溶菌酶(Sigma Aldrich目录号L4919)和 B7-1-Fc(R&D Systems目录号140-B1)一起使用。使用链霉亲和素捕获性表面(SA Sensor ForteBio目录号18-5019，或SensorChip SA，GE 目录号BR-1000-32)捕获经生物素标记的溶菌酶。使这些抗体、抗体 -VLD双特异性分子和抗体-VLD三特异性分子通过在生物传感器表面上捕获的目标，以产生结合传感图(即，第一特异性)。对于相同的目标，在解离阶段期间，使B7-1-Fc通过已结合的抗体、抗体-VLD 双特异性分子和抗体VLD三特异性分子(即第二特异性)以展示第二结合相互作用。
图10显示了使用ForteBio Blitz生物传感器的初步分析，以展示双特异性[IgGVLDx2(HC)]对经链霉亲和素捕获的生物素所标记的溶菌酶的结合，接着对B7.1-Fc的二次结合。该双特异性物具有与 D1.3抗体[D1.3 IgG]重链偶合的B7-1结合性VLD。曲线1是用于构建该双特异性物的D1.3抗溶菌酶抗体[D1.3 IgG]的传感图。该抗体被证实与固定在生物传感器表面上的溶菌酶结合，接着在点1处添加缓冲剂。曲线2是用于构建该双特异性物的D1.3抗溶菌酶抗体[D1.3 IgG] 的传感图。该抗体被证实与固定在生物传感器表面上的溶菌酶结合，接着在点1处添加B7-1-Fc。B7-1-Fc在点2处用缓冲剂替换。曲线3 是具有与抗体恒定重(CH)链偶合的VLD的双特异性D1.3抗溶菌酶抗体[双特异性物-D1.3 IgG-VLDx2(HC)]的传感图。该双特异性物被证实与固定在生物传感器表面上的溶菌酶结合，接着在点1处添加缓冲剂。曲线4是具有与抗体CH链偶合的VLD的双特异性D1.3抗溶菌酶抗体[双特异性物-D1.3 IgG-VLDx2(HC)]的传感图。该双特异性物被证实与固定在生物传感器表面上的溶菌酶结合，接着在点1处添加B7-1-Fc。B7-1-Fc在点2处用缓冲剂替换。
图11显示了使用ForteBio Blitz生物传感器的初步分析，以展示双特异性[IgGVLDx2(LC)]对经链霉亲和素捕获的生物素所标记的溶菌酶的结合，接着对B7-1-Fc的二次结合。该双特异性物具有与 D1.3抗体[D1.3 IgG]轻链偶合的B7-1结合性VLD。曲线1是用于构建该双特异性物的D1.3抗溶菌酶抗体[D1.3 IgG]的传感图。该抗体被证实与固定在生物传感器表面上的溶菌酶结合，接着在点1处添加缓冲剂。曲线2是用于构建该双特异性物的D1.3抗溶菌酶抗体[D1.3 IgG] 的传感图。该抗体被证实与固定在生物传感器表面上的溶菌酶结合，接着在点1处添加B7-1-Fc。B7-1-Fc在点2处用缓冲剂替换。曲线3 是具有与抗体恒定轻(CL)链偶合的VLD的双特异性D1.3抗溶菌酶抗体[双特异性物-D1.3 IgG-VLDx2(LC)]的传感图。该双特异性物被证实与固定在生物传感器表面上的溶菌酶结合，接着在点1处添加缓冲剂。曲线4是具有与抗体CL链偶合的VLD的双特异性D1.3抗溶菌酶抗体[双特异性物-D1.3 IgG-VLDx2(LC)]的传感图。该双特异性物被证实与固定在生物传感器表面上的溶菌酶结合，接着在点1处添加 B7-1-Fc。B7-1-Fc在点2处用缓冲剂替换。
图12显示了使用ForteBio Blitz生物传感器的初步分析，以展示三特异性[IgGVLDx4(HC+LC)]对经链霉亲和素捕获的生物素所标记的溶菌酶的结合，接着对B7-1-Fc的二次结合。该三特异性物具有与 D1.3抗体[D1.3 IgG]重链和轻链两者偶合的B7-1结合性VLD。曲线 1是用于构建该双特异性物的D1.3抗溶菌酶抗体[D1.3 IgG]的传感图。该抗体被证实与固定在生物传感器表面上的溶菌酶结合，接着在点1 处添加缓冲剂。曲线2是用于构建该双特异性物的D1.3抗溶菌酶抗体[D1.3 IgG]的传感图。该抗体被证实与固定在生物传感器表面上的溶菌酶结合，接着在点1处添加B7-1-Fc。B7-1-Fc在点2处用缓冲剂替换。曲线3是具有与抗体CH和CL链偶合的VLD的三特异性D1.3 抗溶菌酶抗体[三特异性物-D1.3IgG-VLDx4(HCLC)]的传感图。该三特异性物被证实与固定在生物传感器表面上的溶菌酶结合，接着在点 1处添加缓冲剂。曲线4是具有与抗体CH和CL链偶合的VLD的三特异性D1.3抗溶菌酶抗体[三特异性物-D1.3 IgG-Imx4(HC+LC)]的传感图。该三特异性物被证实与固定在生物传感器表面上的溶菌酶结合，接着在点1处添加B7-1-Fc。B7-1-Fc在点2处用缓冲剂替换。
图13显示了使用ForteBio Blitz生物传感器的初步分析，以展示三特异性分子相对于双特异性分子的结合增加。该图展示三特异性物相较于双特异性物对B7-1-Fc的结合水平增加。将相等数目的抗体、双特异性分子和三特异性分子捕获在附接到生物传感器表面的经生物素标记的溶菌酶上，接着添加缓冲剂或B7-1-Fc(在点1处)以展示三特异性物相对于双特异性物的结合能力增加。曲线1是用于构建该双特异性物和三特异性物的D1.3抗溶菌酶抗体[D1.3 IgG]。示出了所结合的抗体，以及仅在点1处注射的缓冲剂。曲线2是D1.3抗溶菌酶抗体[D1.3 IgG]，示出了在点1处注射的B7-1-Fc。在点2处，B7-1-Fc 用缓冲剂替换。曲线3是具有融合至抗体CL链的VLD的双特异性 D1.3抗溶菌酶抗体[双特异性物-D1.3IgG-VLDx2(LC)]。所捕获的双特异性物被证实与在点1处注射的B7-1-Fc结合。在点2处，B7-1-Fc 用缓冲剂替换。曲线4是具有融合至抗体CH和CL链的VLD的三特异性D1.3抗溶菌酶抗体[三特异性物-D1.3 IgG-VLDx4(HCLC)]。所捕获的双特异性物被证实与在点1处注射的B7-1-Fc结合。在点2 处，B7-1-Fc用缓冲剂替换。
实施例4用表面等离子体共振(SPR)测定的分子对B7.1-Fc的结合亲和力
此章节中的结合分析在Biacore X100 SPR仪器(GE)上使用标准化学和试剂进行。浓度系列曲线已被叠在一起且所有的数据均以减去来自不含溶菌酶的参考表面的反应之后的反应单位(RU)而呈现。
图14显示了：双特异性[IgG VLDx2(HC))]对经链霉亲和素捕获的生物素所标记的溶菌酶的结合接着对一系列浓度的B7-1-Fc(50、25、 12.5、6.25、3.125、1.56和0μg/ml)的二次结合通过SPR分析来测定，该浓度系列的SPR结合传感图被叠在一起。该双特异性物具有融合至D1.3抗体[D1.3 IgG]重链的B7-1结合性VLD，如图2所示。
注射双特异性物：是IgG VLDx2(HC)被添加至传感器表面的点。曲线显示了IgGVLDx2(HC)对固定在生物传感器表面上的溶菌酶的结合。
注射缓冲剂1：IgG VLDx2(HC)的注射被停止并用缓冲剂替换的点。曲线显示了IgGVLDx2(HC)从固定在生物传感器表面上的溶菌酶的解离。
注射B7-1-Fc：第二分析物B7-1-Fc以规定的浓度(50、25、12.5、 6.25、3.125、1.56和0uμg/ml)添加的点。曲线显示了B7-1-Fc对仍与固定在生物传感器表面上的溶菌酶结合的IgG VLDx2(HC)的结合。
注射缓冲剂2：B7-1-Fc的注射被停止并用缓冲剂替换的点。曲线显示了B7-1-Fc从仍与固定在生物传感器表面上的溶菌酶附接的 IgG VLDx2(HC)的解离。
图15显示了：双特异性[IgG VLDx2(LC)]对经链霉亲和素捕获的生物素所标记的溶菌酶的结合接着对一系列浓度的B7-1-Fc(50、25、 12.5、6.25、3.125、1.56和0μug/ml)的二次结合通过SPR分析来测定，该浓度系列的SPR结合传感图被叠在一起。该双特异性物具有融合至D1.3抗体[D1.3 IgG]轻链的B7-1结合性VLD，如图3所示。
注射双特异性物：IgG VLDx2(LC)被添加至传感器表面的点。曲线显示了IgGVLDx2(LC)对固定在生物传感器表面上的溶菌酶的结合。
注射缓冲剂1：IgG VLDx2(LC)的注射被停止并用缓冲剂替换的点。曲线显示了IgGVLDx2(LC)从固定在生物传感器表面上的溶菌酶的解离。
注射B7-1-Fc：第二分析物B7-1-Fc以规定的浓度(50、25、12.5、 6.25、3.125、1.56和0μg/ml)添加的点。曲线显示了B7-1-Fc对仍与固定在生物传感器表面上的溶菌酶结合的IgG VLDx2(LC)的结合。
注射缓冲剂2：B7-1-Fc的注射被停止并用缓冲剂替换的点。曲线显示了B7-1-Fc从仍与固定在生物传感器表面上的溶菌酶附接的 IgG VLDx2(LC)的解离。
图16显示了：三特异性[IgG VLDx4(HC+LC)]对经链霉亲和素捕获的生物素所标记的溶菌酶的结合接着对一系列浓度的B7-1-Fc(25、 12.5、6.25、3.125、1.56和0μg/ml)的二次结合通过SPR分析来测定，该浓度系列的SPR结合传感图被叠在一起。该三特异性物具有融合至D1.3抗体[D1.3 IgG]重链和轻链两者的B7-1结合性VLD，如图4 所示。
注射三特异性物：IgG VLDx4(HC+LC)被添加至传感器表面的点。曲线显示了IgGImx4(HCLC)对固定在生物传感器表面上的溶菌酶的结合。
注射缓冲剂1：IgG VLDx4(HC+LC)的注射被停止并用缓冲剂替换的点。曲线显示了IgG VLDx4(HC+LC)从固定在生物传感器表面上的溶菌酶的解离
注射B7-1-Fc：第二分析物B7-1-Fc以规定的浓度(25、12.5、6.25、 3.125、1.56和0μg/ml)添加的点。曲线显示了B7-1-Fc对仍与固定在生物传感器表面上的溶菌酶结合的IgGVLDx4(HC+LC)的结合。注射缓冲剂2：B7-1-Fc的注射被停止并用缓冲剂替换的点。曲线显示了B7-1-Fc从仍与固定在生物传感器表面上的溶菌酶附接的IgG VLDx4(HC+LC)的解离
经纯化的Fab、Fab-VLD双特异性分子和三特异性分子的结合特性也使用表面等离子体共振(SPR)进行了表征。
图17显示了被叠在一起的一系列SPR结合传感图，展示了双特异性[Fab-VLDx1(HC)]对经链霉亲和素捕获的生物素所标记的溶菌酶的最初结合接着对一系列浓度的B7-1-Fc(25、12.5、6.25、3.125、 1.56和0ug/ml)的二次结合。该双特异性物具有融合至D1.3Fab[D1.3 Fab]重链的B7-1结合性VLD，如图5所示。
注射双特异性物：Fab-VLDx1(HC)被添加至传感器表面的点。曲线显示了Fab-VLDx1(HC)对固定在生物传感器表面上的溶菌酶的结合。
注射缓冲剂1：Fab-VLDx1(HC)的注射被停止并用缓冲剂替换的点。曲线显示了Fab-VLDx1(HC)从固定在生物传感器表面上的溶菌酶的解离
注射B7-1-Fc：第二分析物B7-1-Fc以规定的浓度(25、12.5、6.25、 3.125、1.56和0ug/ml)添加的点。曲线显示了B7-1-Fc对仍与固定在生物传感器表面上的溶菌酶结合的Fab-VLDx1(HC)的结合。
注射缓冲剂2：B7-1-Fc的注射被停止并用缓冲剂替换的点。曲线显示了B7-1-Fc从仍与固定在生物传感器表面上的溶菌酶附接的 Fab-VLDx1(HC)的解离。
图18显示了被叠在一起的一系列SPR结合传感图，展示了双特异性[Fab-VLDx1(LC)]对经链霉亲和素捕获的生物素所标记的溶菌酶的最初结合接着对一系列浓度的B7-1-Fc(25、12.5、6.25、3.125、 1.56和0ug/ml)的二次结合。该双特异性物具有融合至D1.3Fab[D1.3 Fab]轻链的B7-1结合性VLD，如图6所示。
注射双特异性物：Fab-VLDx1(LC)被添加至传感器表面的点。曲线显示了Fab-VLDx1(LC)对固定在生物传感器表面上的溶菌酶的结合。
注射缓冲剂1：Fab-VLDx1(LC)的注射被停止并用缓冲剂替换的点。曲线显示了Fab-VLDx1(LC)从固定在生物传感器表面上的溶菌酶的解离。
注射B7-1-Fc：第二分析物B7-1-Fc以规定的浓度(25、12.5、6.25、 3.125、1.56和0ug/ml)添加的点。曲线显示了B7-1-Fc对仍与固定在生物传感器表面上的溶菌酶结合的Fab-VLDx1(LC)的结合。
注射缓冲剂2：B7-1-Fc的注射被停止并用缓冲剂替换的点。曲线显示了B7-1-Fc从仍与固定在生物传感器表面上的溶菌酶附接的 Fab-VLDx1(LC)的解离。
图19显示了被叠在一起的一系列SPR结合传感图，展示了三特异性[Fab-VLDx2(HC+LC)]对经链霉亲和素捕获的生物素所标记的溶菌酶的最初结合接着对一系列浓度的B7-1-Fc(25、12.5、6.25、3.125、 1.56和0μg/ml)的二次结合。该三特异性物具有融合至D1.3Fab[D1.3 Fab]重链和轻链两者的B7-1结合性VLD，如图7所示。
注射三特异性物：Fab-VLDx2(HC+LC)被添加至传感器表面的点。曲线显示了Fab-VLDx2(HC+LC)对固定在生物传感器表面上的溶菌酶的结合。
注射缓冲剂1：Fab-VLDx2(HC+LC)的注射被停止并用缓冲剂替换的点。曲线显示了Fab-VLDx2(HC+LC)从固定在生物传感器表面上的溶菌酶的解离
注射B7-1-Fc：第二分析物B7-1-Fc以规定的浓度(25、12.5、6.25、3.125、1.56和0μg/ml)添加的点。曲线显示了B7-1-Fc与仍和固定在生物传感器表面上的溶菌酶结合的Fab-VLDx2(HC+LC)的结合。
注射缓冲剂2：B7-1-Fc的注射被停止并用缓冲剂替换的点。曲线显示了B7-1-Fc从仍与固定在生物传感器表面上的溶菌酶附接的 Fab-VLDx2(HC+LC)的解离。
实施例5分子的结合化学计量
通过SPR测定了双特异性[IgG VLDx2(HC)]和三特异性[IgG Imx4(HC+LC)]对B7-1-Fc的结合化学计量(图20)。通过以下方式对 IgG-VLDx2(HC)、IgG-VLDx2(LC)和IgG-VLDx4(HCLC)进行了动力学测定：在生物素-溶菌酶表面上捕获，并运行一系列浓度的作为分析物的B7-1-Fc(50、25、12.5、6.25、3.125、1.56和0μg/ml)。分析物的理论最大结合信号(Rmax)基于所捕获的IgG-VLD蛋白的量来计算(考虑到分析物和配体的分子量)。
对于所有的样本假设1:1的化学计量，将分析物和配体的结合水平针对各浓度作为Rmax值的百分比作图。随着分析物浓度增至 25μg/ml，结合水平接近饱和或平衡水平。四价蛋白 IgG-VLDx4(HC+LC)的平衡结合水平(Rmax的103.9％)是二价蛋白 IgG-VLDx2(HC)的平衡结合水平(56.7％)和IgG-VLDx2(LC)的平衡结合水平(51.4％)的大约两倍。这暗示IgG-VLDx4(HC+LC)能够同时通过与重链和轻链融合的VLD结构域来结合B7.1-Fc。
双特异性[Fab-VLDx1(HC)]、[Fab-VLDx1(LC)]和[FabVLDx2 (HC+LC)对B7-1-Fc的结合化学计量在图21中示出。结果暗示 Fab-VLDx2(HC+LC)能够同时通过与重链和轻链融合的VLD结构域来结合B7.1。
实施例6分子对B7.1-Fc的结合亲和力
通过表面等离子体共振测定了抗体-VLD双特异性分子和三特异性分子以及Fab-VLD双特异性分子和三特异性分子的结合动力学。缔合常数(Ka)、解离常数(Kd)和平衡解离常数/结合常数KD分别在表 3和表4中示出。
表3抗体-VLD分子对B7.1-Fc的亲和力
配体 Ka(1/Ms) Kd(1/s) K<sub>D</sub>(nM)
IgG VLDx2(HC) 5.16x 10<sup>5</sup> 2.80x 10<sup>-3</sup> 5.44
IgG VLDx2(LC) 1.63x 10<sup>5</sup> 4.00x 10<sup>-3</sup> 24.5
IgG VLDx4(HC+LC) 5.30x 10<sup>5</sup> 2.90x 10<sup>-3</sup> 5.47
结果展示三特异性分子IgG VLDx4(HC+LC)和双特异性分子 IgG VLDx2(HC)对B7-1-Fc的结合亲和力是相当的。
表4 Fab-VLD分子对B7.1-Fc的亲和力
配体 Ka(1/Ms) Kd(1/s) K<sub>D</sub>(nM)
Fab VLDx1(HC) 5.26x 10<sup>5</sup> 2.85x 10<sup>-3</sup> 5.41
Fab VLDx1(LC) 2.18x 10<sup>5</sup> 2.96x 10<sup>-3</sup> 13.6
Fab VLDx2(HC+LC) 4.45x 10<sup>5</sup> 4.33x 10<sup>-3</sup> 9.73
结果展示三特异性分子Fab VLDx4(HC+LC)和双特异性分子Fab VLDx1(HC)对B7-1-Fc的结合亲和力是相当的。
实施例7三特异性结合的分析
对IgG VLDx4(HCLC)构建体进行了修饰，由此将硬骨素(Scl)结合性VLD与抗溶菌酶抗体D1.3的重链的C端偶合，且将B7-1结合性VLD与抗溶菌酶抗体的抗体恒定轻(CL)链偶合。该三特异性分子被称为[IgG VLDx4(Scl-HC)(B7-LC)]。
与抗硬骨素VLD融合的抗溶菌酶IgG1重链“1E1”的序列如下所示(SEQ ID NO:25)：
抗硬骨素VLD的序列如下所示：
SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:14的VLD结合环带有下划线。
为了分析溶菌酶、B7-1和硬骨素的同时三重结合，在Biacore X100 SPR仪器(GE)上进行了分析。将抗体-Imunexin蛋白以35μg/ml 注射到链霉亲和素传感器芯片表面上，在该表面上生物素化溶菌酶被捕获在流动池2上(大约200RU)。注射抗体-Imunexin蛋白，接着是稳定期。第一分析物B7.1-Fc以25μg/ml的浓度注射。执行了对照循环，其中仅注射缓冲剂来代替B7.1-Fc。接着立即以15μg/ml经60s 注射第二分析物即硬骨素(R&D Systems目录编号1406ST/CF)，解离时间为120s。执行了对照循环，其中仅注射缓冲剂来代替硬骨素。
通过经30秒注射pH 2.1的10mM甘氨酸缓冲剂将表面再生。
所有的数据均以减去来自不含溶菌酶的参考表面(流动池1)的反应之后的反应单位(RU)呈现。
(a)全长抗体构建体的三特异性结合的分析
图22显示了被叠在一起的一系列SPR结合传感图，展示了三特异性[IgG VLDx4(Scl-HC)(B7-LC)]对经链霉亲和素捕获的生物素所标记的溶菌酶的最初结合接着对B7-1-Fc和硬骨素的同时结合。该三特异性物具有融合至D1.3抗体[D1.3 IgG]重链的硬骨素结合性VLD 和融合至轻链的B7-1结合性VLD。
仅B7-1-Fc的曲线是三特异性物的传感图，显示了对固定在生物传感器表面上的溶菌酶的结合，接着添加B7-1-Fc。该传感图展示了对溶菌酶和B7-1-Fc的同时、双目标结合。
仅硬骨素的曲线是三特异性物的传感图，显示了对固定在生物传感器表面上的溶菌酶的结合，接着添加硬骨素。该传感图展示了对溶菌酶和硬骨素的同时、双目标结合。
B7-1-Fc和硬骨素曲线是三特异性物的传感图，显示了对固定在生物传感器表面上的溶菌酶的结合，接着添加B7-1-Fc，然后再添加硬骨素。该传感图展示了对溶菌酶和B7-1-Fc和硬骨素的同时、三目标结合。
通过SPR检查了分子对B7-1和硬骨素的结合，如图22所示。结果显示该三特异性物能够同时与B7-1和硬骨素结合。
(b)Fab构建体的三特异性结合的分析
对Fab VLDx2(HC+LC)构建体进行修饰，由此将B7-1结合性 VLD与抗溶菌酶FabD3.1的重链的C端偶合，且将硬骨素(Scl)结合性VLD与抗溶菌酶Fab的Fab恒定轻(CL)链偶合。该三特异性分子被称为[Fab VLDx2(B7-1-HC)(Scl-LC)]。制备了第二构建体，由此将硬骨素结合性VLD与抗溶菌酶Fab D3.1的重链的C端偶合，且将 B7-1结合性VLD与抗溶菌酶Fab的Fab恒定轻(CL)链偶合。该三特异性分子被称为[Fab VLDx2(Scl-HC)(B7-1-LC)]
图23显示了三特异性Fab VLDx2(B7-1-HC)(Scl-LC)的结合分析且图24显示了三特异性Fab VLDx2(Scl-HC)(B7-1-LC)的结合分析。结合分析使用ForteBio Blitz进行。结合曲线展示了这些三特异性物 (图23中Fab VLDx2(B7-HC)(Scl-LC)，图24中Fab VLDx2(Scl-HC)(B7-1-LC))对经链霉亲和素捕获的生物素所标记的溶菌酶的最初结合接着对B7-1-Fc和硬骨素的相继和同时结合。生物传感器曲线显示了这些三特异性物对固定在生物传感器表面上的溶菌酶的最初结合接着对B7-1-Fc(B7-1-Fc在指定的点添加)的结合。结合曲线展示了对溶菌酶和B7-1-Fc的同时、双目标结合。随后在指定的点添加硬骨素，生物传感器曲线显示了Fab VLDx2(B7-1-HC)(Scl-LC)和Fab VLDx2(Scl-HC)(B7-1-LC)两种分子对溶菌酶和B7-1Fc和硬骨素的同时、三目标结合。最后，将硬骨素用缓冲剂替换以显示解离率。
实施例8人血清白蛋白-VLD融合蛋白的产生
方法
图25显示了根据本公开的一个实例与VLD偶合的蛋白的示意图。该双特异性物可与目标A和B两者单独地或同时地结合。
载体产生
制备了编码融合至一个或两个VLD的人血清白蛋白(HSA)的序列，其包含突出显示的16个氨基酸的接头序列 (SGGGGSGGGGSGGGGS)、和C端组氨酸标签。将该序列克隆到哺乳动物表达载体中。所用的载体是pcDNA3.4载体(Thermo Fisher)。将这些序列与信号肽一起克隆以允许分泌所述蛋白。肽的序列如下： MAWMMLLLGLLAYGSG(SEQ ID NO:8)。
根据标准技术使用电穿孔感受态细胞(例如ElectroTen-Blue细胞， Stratagene目录号200159)进行了细菌的载体转化。
在载体扩增后，使用Qiagen HiSpeed质粒Maxi试剂盒(目录号 12663)或PromegaPureYieldTM质粒Midiprep系统(目录号A2492)提取和制备质粒DNA。在无核酸酶的纯化水中洗脱DNA。
转染
使用Expi293表达系统(ThermoFisher Science目录号A14635)进行了密度为3-5x106个细胞/mL且生存力&gt;95％的Expi293哺乳动物细胞的转染。将DNA载体添加到Opti-MEM I减血清培养基 (LifeTechnologies目录号31985070)和ExpiFectamine 293试剂(ThermoFisher目录号A14525)中并在室温下温育20分钟。将转染复合物添加到细胞中并在37℃、5％CO2、120rpm下温育。20小时后，将Expifectamine 293转染增强剂1和2(ThermoFisher目录号A14525) 加至细胞。大约4-5天后收获含蛋白的上清液。
纯化
通过亲和色谱使用镍Sepharose Excel(GE，目录号17-3712-01) 纯化蛋白。用5倍柱体积的20mM磷酸钠、0.5M NaCl(ph7.4)平衡镍 Sepharose柱。将含有用组氨酸标记的HSA-VLD蛋白的经转染细胞培养物上清液上样到柱上，并用10倍柱体积的20mM磷酸钠、0.5MNaCl、5mM咪唑(ph7.4)洗涤柱子。用20mM磷酸钠、0.5M NaCl、 500mM咪唑(ph7.4)洗脱蛋白。将洗脱出的级分合并在一起，并使用 PBS根据标准方法透析。
图26显示了使用抗His HRP(Sigma Aldrich，目录号11965085001) 对经纯化的HSA融合蛋白进行蛋白质印迹分析和检测，这些蛋白包含融合至HSA的C端、N端、或C端和N端两者的VLD。这些蛋白的估计大小分别为：67kDa(预测的大小：81.9kDa)；69.3kDa(预测的大小：81.8kDa)；和94.4kDa(预测的大小：96.2kDa)。
结合的评估
使用ForteBio Blitz生物传感器采用标准化学和试剂表征了经纯化的分子的结合特性。
用可商购获得的B7.2-Fc蛋白(R&D Systems，目录号141-B2)、 CD3(Acrobiosystems，目录号CDD-H52W3)和生物素化抗HSA亲和体(Abcam，目录号31898)测试了亲和纯化的分子。
使用EZ-Link Sulfo-NHS-LC-生物素(ThermoFisher，目录号21327) 根据标准方法将CD3和B7.2Fc蛋白以1:1的摩尔比生物素化。
使用链霉亲和素捕获性表面(SA传感器，ForteBio目录号18-5019) 捕获经生物素标记的蛋白。使HSA-VLD分子通过在生物传感器表面上捕获的目标以产生结合传感图。
图27显示了使用ForteBio Blitz生物传感器的分析，以展示 HSA-VLD分子对经链霉亲和素捕获的生物素所标记的B7.2-Fc的结合。曲线1是具有附接至C端的B7结合性VLD的HSA-VLD融合蛋白的传感图。曲线2是具有附接至N端和C端两者的B7结合性 VLD的VLD-HSA-VLD融合蛋白的传感图。该分子被证实结合到固定在生物传感器表面上的B7.2-Fc，接着在点1处添加缓冲剂。
图28显示了使用ForteBio Blitz生物传感器的分析，以展示 HSA-VLD分子对经链霉亲和素捕获的生物素所标记的CD3δ/ε(de) 异元二聚体的结合。所显示的曲线是具有附接至C端的CD3结合性 VLD的HSA-VLD融合蛋白的传感图。该分子被证实结合到固定在生物传感器表面上的CD3de，接着在点1处添加缓冲剂。
图29显示了使用ForteBio Blitz生物传感器的分析，以展示 HSA-VLD分子对经链霉亲和素捕获的生物素所标记的抗HSA亲和体的结合。所显示的曲线是具有附接至C端的B7结合性VLD的 HSA-VLD融合蛋白的传感图。该分子被证实结合到固定在生物传感器表面上的抗HSA亲和体，接着在点1处添加缓冲剂。在点2处，使B7.2Fc蛋白与传感器表面上所捕获的分子结合。然后，在点3处用缓冲剂替换B7.2Fc。
结果
(i)CTLA4VLD在HSA的C端、N端或C端和N端两者融合至人血清白蛋白。
序列如下所示：
融合至HSA的C端的B7-2结合性VLD(SEQ ID NO:26)：
融合至HSA的N端的B7-1结合性VLD(SEQ ID NO:27)：
融合至HSA的N端和C端两者的B7-2结合性VLD(SEQ ID NO:28)：
(ii)融合至人血清白蛋白的C端的CD3结合性VLD(称为AF3)
序列如下所示：
融合至HSA的C端的CD3结合性VLD“AF3”(SEQ ID NO:29)：
。
序列表
&lt;110&gt; 伊蒙纽斯私人有限公司(Imunexus)
&lt;120&gt; 多特异性分子
&lt;130&gt; 524290
&lt;140&gt; 2016900709
&lt;141&gt; 2017-02-27
&lt;160&gt; 30
&lt;170&gt; PatentIn 3.5版
&lt;210&gt; 1
&lt;211&gt; 126
&lt;212&gt; PRT
&lt;213&gt; 智人(Homo sapiens)
&lt;400&gt; 1
Lys Ala Met His Val Ala Gln Pro Ala Val Val Leu Ala Ser Ser Arg
1 5 10 15
Gly Ile Ala Ser Phe Val Cys Glu Tyr Ala Ser Pro Gly Lys Ala Thr
20 25 30
Glu Val Arg Val Thr Val Leu Arg Gln Ala Asp Ser Gln Val Thr Glu
35 40 45
Val Cys Ala Ala Thr Tyr Met Met Gly Asn Glu Leu Thr Phe Leu Asp
50 55 60
Asp Ser Ile Cys Thr Gly Thr Ser Ser Gly Asn Gln Val Asn Leu Thr
65 70 75 80
Ile Gln Gly Leu Arg Ala Met Asp Thr Gly Leu Tyr Ile Cys Lys Val
85 90 95
Glu Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Tyr Leu Gly Ile Gly Asn Gly Thr
100 105 110
Gln Ile Tyr Val Ile Asp Pro Glu Pro Ser Pro Asp Ser Asn
115 120 125
&lt;210&gt; 2
&lt;211&gt; 8
&lt;212&gt; PRT
&lt;213&gt; 智人(Homo sapiens)
&lt;400&gt; 2
Ala Ser Pro Gly Lys Ala Thr Glu
1 5
&lt;210&gt; 3
&lt;211&gt; 5
&lt;212&gt; PRT
&lt;213&gt; 智人(Homo sapiens)
&lt;400&gt; 3
Met Met Gly Asn Glu
1 5
&lt;210&gt; 4
&lt;211&gt; 9
&lt;212&gt; PRT
&lt;213&gt; 智人(Homo sapiens)
&lt;400&gt; 4
Glu Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Tyr
1 5
&lt;210&gt; 5
&lt;211&gt; 107
&lt;212&gt; PRT
&lt;213&gt; 人工序列(Artificial Sequence)
&lt;220&gt;
&lt;221&gt;
&lt;222&gt;
&lt;223&gt; BDM支架序列
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; SITE
&lt;222&gt; (26)..(26)
&lt;223&gt; X是5至15个的任何氨基酸
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; SITE
&lt;222&gt; (48)..(48)
&lt;223&gt; X是5至15个的任何氨基酸
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; SITE
&lt;222&gt; (86)..(86)
&lt;223&gt; X是5至15个的任何氨基酸
&lt;400&gt; 5
Lys Ala Met His Val Ala Gln Pro Ala Val Val Leu Ala Ser Ser Arg
1 5 10 15
Gly Ile Ala Ser Phe Val Cys Glu Tyr Xaa Val Arg Val Thr Val Leu
20 25 30
Arg Gln Ala Asp Ser Gln Val Thr Glu Val Cys Ala Ala Thr Tyr Xaa
35 40 45
Leu Thr Phe Leu Asp Asp Ser Ile Cys Thr Gly Thr Ser Ser Gly Asn
50 55 60
Gln Val Asn Leu Thr Ile Gln Gly Leu Arg Ala Met Asp Thr Gly Leu
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Lys Val Xaa Leu Gly Ile Gly Asn Gly Thr Gln Ile Tyr
85 90 95
Val Ile Asp Pro Glu Pro Ser Pro Asp Ser Asn
100 105
&lt;210&gt; 6
&lt;211&gt; 107
&lt;212&gt; PRT
&lt;213&gt; 人工序列(Artificial Sequence)
&lt;220&gt;
&lt;221&gt;
&lt;222&gt;
&lt;223&gt; BDM支架序列
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; SITE
&lt;222&gt; (26)..(26)
&lt;223&gt; X是5至15个的任何氨基酸
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; SITE
&lt;222&gt; (49)..(49)
&lt;223&gt; X是5至15个的任何氨基酸
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; SITE
&lt;222&gt; (87)..(87)
&lt;223&gt; X是5至15个的任何氨基酸
&lt;400&gt; 6
Lys Ala Met His Val Ala Gln Pro Ala Val Val Leu Ala Ser Ser Arg
1 5 10 15
Gly Ile Ala Ser Phe Val Cys Glu Tyr Xaa Glu Val Arg Val Thr Val
20 25 30
Leu Arg Gln Ala Asp Ser Gln Val Thr Glu Val Cys Ala Ala Thr Tyr
35 40 45
Xaa Leu Thr Phe Leu Asp Asp Ser Ile Cys Thr Gly Thr Ser Ser Gly
50 55 60
Asn Gln Val Asn Leu Thr Ile Gln Gly Leu Arg Ala Met Asp Thr Gly
65 70 75 80
Leu Tyr Ile Cys Lys Val Xaa Gly Ile Gly Asn Gly Thr Gln Ile Tyr
85 90 95
Val Ile Asp Pro Glu Pro Ser Pro Asp Ser Asn
100 105
&lt;210&gt; 7
&lt;211&gt; 8
&lt;212&gt; PRT
&lt;213&gt; 智人(Homo sapiens)
&lt;400&gt; 7
Ala Ser Pro Gly Lys Tyr Thr Glu
1 5
&lt;210&gt; 8
&lt;211&gt; 16
&lt;212&gt; PRT
&lt;213&gt; 人工序列(Artificial Sequence)
&lt;220&gt;
&lt;221&gt;
&lt;222&gt;
&lt;223&gt; 信号肽
&lt;400&gt; 8
Met Ala Trp Met Met Leu Leu Leu Gly Leu Leu Ala Tyr Gly Ser Gly
1 5 10 15
&lt;210&gt; 9
&lt;211&gt; 10
&lt;212&gt; PRT
&lt;213&gt; 智人(Homo sapiens)
&lt;400&gt; 9
Glu Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Tyr Leu
1 5 10
&lt;210&gt; 10
&lt;211&gt; 8
&lt;212&gt; PRT
&lt;213&gt; 智人(Homo sapiens)
&lt;400&gt; 10
Thr Val Ser Trp Val Asp Met Glu
1 5
&lt;210&gt; 11
&lt;211&gt; 5
&lt;212&gt; PRT
&lt;213&gt; 智人(Homo sapiens)
&lt;400&gt; 11
Trp Asn Gly Arg Trp
1 5
&lt;210&gt; 12
&lt;211&gt; 14
&lt;212&gt; PRT
&lt;213&gt; 智人(Homo sapiens)
&lt;400&gt; 12
Gln Leu Asp Pro Ser Trp Gly Tyr Tyr Trp Gln Gly Tyr Glu
1 5 10
&lt;210&gt; 13
&lt;211&gt; 126
&lt;212&gt; PRT
&lt;213&gt; 智人(Homo sapiens)
&lt;400&gt; 13
Lys Ala Met His Val Ala Gln Pro Ala Val Val Leu Ala Ser Ser Arg
1 5 10 15
Gly Ile Ala Ser Phe Val Cys Glu Tyr Ala Ser Pro Gly Lys Tyr Thr
20 25 30
Glu Val Arg Val Thr Val Leu Arg Gln Ala Asp Ser Gln Val Thr Glu
35 40 45
Val Cys Ala Ala Thr Tyr Met Thr Gly Asn Glu Leu Thr Phe Leu Asp
50 55 60
Asp Ser Ile Cys Thr Gly Thr Ser Ser Gly Asn Gln Val Asn Leu Thr
65 70 75 80
Ile Gln Gly Leu Arg Ala Met Asp Thr Gly Leu Tyr Ile Cys Lys Val
85 90 95
Glu Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Tyr Leu Gly Ile Gly Asn Gly Thr
100 105 110
Gln Ile Tyr Val Ile Asp Pro Glu Pro Ser Pro Asp Ser Asn
115 120 125
&lt;210&gt; 14
&lt;211&gt; 130
&lt;212&gt; PRT
&lt;213&gt; 智人(Homo sapiens)
&lt;400&gt; 14
Lys Ala Met His Val Ala Gln Pro Ala Val Val Leu Ala Ser Ser Arg
1 5 10 15
Gly Ile Ala Ser Phe Val Cys Glu Tyr Thr Val Ser Trp Val Asp Met
20 25 30
Glu Val Arg Val Thr Val Leu Arg Gln Ala Asp Ser Gln Val Thr Glu
35 40 45
Val Cys Ala Ala Thr Tyr Trp Asn Gly Arg Trp Leu Thr Phe Leu Asp
50 55 60
Asp Ser Ile Cys Thr Gly Thr Ser Ser Gly Asn Gln Val Asn Leu Thr
65 70 75 80
Ile Gln Gly Leu Arg Ala Met Asp Thr Gly Leu Tyr Ile Cys Lys Val
85 90 95
Gln Leu Asp Pro Ser Trp Gly Tyr Tyr Trp Gln Gly Tyr Glu Gly Ile
100 105 110
Gly Asn Gly Thr Gln Ile Tyr Val Ile Asp Pro Glu Pro Ser Pro Asp
115 120 125
Ser Asn
130
&lt;210&gt; 15
&lt;211&gt; 7
&lt;212&gt; PRT
&lt;213&gt; 人工序列(Artificial Sequence)
&lt;220&gt;
&lt;221&gt;
&lt;222&gt;
&lt;223&gt; 接头序列
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; SITE
&lt;222&gt; (6)..(6)
&lt;223&gt; X是指任何数字，即SGGGG的倍数
&lt;400&gt; 15
Ser Gly Gly Gly Gly Xaa Ser
1 5
&lt;210&gt; 16
&lt;211&gt; 16
&lt;212&gt; PRT
&lt;213&gt; 人工序列(Artificial Sequence)
&lt;220&gt;
&lt;221&gt;
&lt;222&gt;
&lt;223&gt; 接头序列
&lt;400&gt; 16
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
&lt;210&gt; 17
&lt;211&gt; 21
&lt;212&gt; PRT
&lt;213&gt; 人工序列(Artificial Sequence)
&lt;220&gt;
&lt;221&gt;
&lt;222&gt;
&lt;223&gt; 接头序列
&lt;400&gt; 17
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
Gly Gly Gly Gly Ser
20
&lt;210&gt; 18
&lt;211&gt; 447
&lt;212&gt; PRT
&lt;213&gt; 人工序列(Artificial Sequence)
&lt;220&gt;
&lt;221&gt;
&lt;222&gt;
&lt;223&gt; 人工序列
&lt;400&gt; 18
Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Gly Tyr
20 25 30
Gly Val Asn Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Met Ile Trp Gly Asp Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Ser Ala Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu
65 70 75 80
Lys Met Asn Ser Leu His Thr Asp Asp Thr Ala Arg Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Glu Arg Asp Tyr Arg Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
115 120 125
Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
130 135 140
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
145 150 155 160
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
165 170 175
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
180 185 190
Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr
195 200 205
Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His
210 215 220
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val
225 230 235 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
260 265 270
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
290 295 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305 310 315 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
340 345 350
Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370 375 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
385 390 395 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
405 410 415
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
420 425 430
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
&lt;210&gt; 19
&lt;211&gt; 589
&lt;212&gt; PRT
&lt;213&gt; 人工序列(Artificial Sequence)
&lt;220&gt;
&lt;221&gt;
&lt;222&gt;
&lt;223&gt; 人工序列
&lt;400&gt; 19
Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Gly Tyr
20 25 30
Gly Val Asn Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Met Ile Trp Gly Asp Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Ser Ala Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu
65 70 75 80
Lys Met Asn Ser Leu His Thr Asp Asp Thr Ala Arg Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Glu Arg Asp Tyr Arg Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
115 120 125
Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
130 135 140
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
145 150 155 160
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
165 170 175
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
180 185 190
Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr
195 200 205
Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His
210 215 220
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val
225 230 235 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
260 265 270
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
290 295 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305 310 315 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
340 345 350
Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370 375 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
385 390 395 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
405 410 415
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
420 425 430
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Ser
435 440 445
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Lys
450 455 460
Ala Met His Val Ala Gln Pro Ala Val Val Leu Ala Ser Ser Arg Gly
465 470 475 480
Ile Ala Ser Phe Val Cys Glu Tyr Ala Ser Pro Gly Lys Tyr Thr Glu
485 490 495
Val Arg Val Thr Val Leu Arg Gln Ala Asp Ser Gln Val Thr Glu Val
500 505 510
Cys Ala Ala Thr Tyr Met Thr Gly Asn Glu Leu Thr Phe Leu Asp Asp
515 520 525
Ser Ile Cys Thr Gly Thr Ser Ser Gly Asn Gln Val Asn Leu Thr Ile
530 535 540
Gln Gly Leu Arg Ala Met Asp Thr Gly Leu Tyr Ile Cys Lys Val Glu
545 550 555 560
Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Tyr Leu Gly Ile Gly Asn Gly Thr Gln
565 570 575
Ile Tyr Val Ile Asp Pro Glu Pro Ser Pro Asp Ser Asn
580 585
&lt;210&gt; 20
&lt;211&gt; 214
&lt;212&gt; PRT
&lt;213&gt; 人工序列(Artificial Sequence)
&lt;220&gt;
&lt;221&gt;
&lt;222&gt;
&lt;223&gt; 人工序列
&lt;400&gt; 20
Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gly Asn Ile His Asn Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val
35 40 45
Tyr Tyr Thr Thr Thr Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Ser Thr Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
&lt;210&gt; 21
&lt;211&gt; 361
&lt;212&gt; PRT
&lt;213&gt; 人工序列(Artificial Sequence)
&lt;220&gt;
&lt;221&gt;
&lt;222&gt;
&lt;223&gt; 人工序列
&lt;400&gt; 21
Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gly Asn Ile His Asn Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val
35 40 45
Tyr Tyr Thr Thr Thr Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Ser Thr Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
210 215 220
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Lys Ala Met His Val
225 230 235 240
Ala Gln Pro Ala Val Val Leu Ala Ser Ser Arg Gly Ile Ala Ser Phe
245 250 255
Val Cys Glu Tyr Ala Ser Pro Gly Lys Tyr Thr Glu Val Arg Val Thr
260 265 270
Val Leu Arg Gln Ala Asp Ser Gln Val Thr Glu Val Cys Ala Ala Thr
275 280 285
Tyr Met Thr Gly Asn Glu Leu Thr Phe Leu Asp Asp Ser Ile Cys Thr
290 295 300
Gly Thr Ser Ser Gly Asn Gln Val Asn Leu Thr Ile Gln Gly Leu Arg
305 310 315 320
Ala Met Asp Thr Gly Leu Tyr Ile Cys Lys Val Glu Leu Met Tyr Pro
325 330 335
Pro Pro Tyr Tyr Leu Gly Ile Gly Asn Gly Thr Gln Ile Tyr Val Ile
340 345 350
Asp Pro Glu Pro Ser Pro Asp Ser Asn
355 360
&lt;210&gt; 22
&lt;211&gt; 361
&lt;212&gt; PRT
&lt;213&gt; 人工序列(Artificial Sequence)
&lt;220&gt;
&lt;221&gt;
&lt;222&gt;
&lt;223&gt; 人工序列
&lt;400&gt; 22
Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gly Asn Ile His Asn Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val
35 40 45
Tyr Tyr Thr Thr Thr Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Ser Thr Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
210 215 220
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Lys Ala Met His Val
225 230 235 240
Ala Gln Pro Ala Val Val Leu Ala Ser Ser Arg Gly Ile Ala Ser Phe
245 250 255
Val Cys Glu Tyr Ala Ser Pro Gly Lys Tyr Thr Glu Val Arg Val Thr
260 265 270
Val Leu Arg Gln Ala Asp Ser Gln Val Thr Glu Val Cys Ala Ala Thr
275 280 285
Tyr Met Thr Gly Asn Glu Leu Thr Phe Leu Asp Asp Ser Ile Cys Thr
290 295 300
Gly Thr Ser Ser Gly Asn Gln Val Asn Leu Thr Ile Gln Gly Leu Arg
305 310 315 320
Ala Met Asp Thr Gly Leu Tyr Ile Cys Lys Val Glu Leu Met Tyr Pro
325 330 335
Pro Pro Tyr Tyr Leu Gly Ile Gly Asn Gly Thr Gln Ile Tyr Val Ile
340 345 350
Asp Pro Glu Pro Ser Pro Asp Ser Asn
355 360
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&lt;212&gt; PRT
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&lt;220&gt;
&lt;221&gt;
&lt;222&gt;
&lt;223&gt; 人工序列
&lt;400&gt; 23
Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Gly Tyr
20 25 30
Gly Val Asn Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Met Ile Trp Gly Asp Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Ser Ala Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu
65 70 75 80
Lys Met Asn Ser Leu His Thr Asp Asp Thr Ala Arg Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Glu Arg Asp Tyr Arg Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
115 120 125
Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
130 135 140
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
145 150 155 160
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
165 170 175
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
180 185 190
Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr
195 200 205
Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Ser Gly Gly Gly Gly
210 215 220
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
225 230 235 240
Lys Ala Met His Val Ala Gln Pro Ala Val Val Leu Ala Ser Ser Arg
245 250 255
Gly Ile Ala Ser Phe Val Cys Glu Tyr Ala Ser Pro Gly Lys Tyr Thr
260 265 270
Glu Val Arg Val Thr Val Leu Arg Gln Ala Asp Ser Gln Val Thr Glu
275 280 285
Val Cys Ala Ala Thr Tyr Met Thr Gly Asn Glu Leu Thr Phe Leu Asp
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Asp Ser Ile Cys Thr Gly Thr Ser Ser Gly Asn Gln Val Asn Leu Thr
305 310 315 320
Ile Gln Gly Leu Arg Ala Met Asp Thr Gly Leu Tyr Ile Cys Lys Val
325 330 335
Glu Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Tyr Leu Gly Ile Gly Asn Gly Thr
340 345 350
Gln Ile Tyr Val Ile Asp Pro Glu Pro Ser Pro Asp Ser Asn
355 360 365
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&lt;213&gt; 人工序列(Artificial Sequence)
&lt;220&gt;
&lt;221&gt;
&lt;222&gt;
&lt;223&gt; 人工序列
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Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Gly Tyr
20 25 30
Gly Val Asn Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Met Ile Trp Gly Asp Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Ser Ala Leu Lys
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Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu
65 70 75 80
Lys Met Asn Ser Leu His Thr Asp Asp Thr Ala Arg Tyr Tyr Cys Ala
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Arg Glu Arg Asp Tyr Arg Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
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Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
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Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
165 170 175
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
180 185 190
Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr
195 200 205
Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Ala Ala Ala Gly Leu
210 215 220
Gly Gly His His His His His His Gly Ala Ala Glu Gln Lys Leu Ile
225 230 235 240
Ser Glu Glu Asp Leu
245
&lt;210&gt; 25
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&lt;213&gt; 人工序列(Artificial Sequence)
&lt;220&gt;
&lt;221&gt;
&lt;222&gt;
&lt;223&gt; 人工序列
&lt;400&gt; 25
Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Gly Tyr
20 25 30
Gly Val Asn Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Met Ile Trp Gly Asp Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Ser Ala Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu
65 70 75 80
Lys Met Asn Ser Leu His Thr Asp Asp Thr Ala Arg Tyr Tyr Cys Ala
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Arg Glu Arg Asp Tyr Arg Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
115 120 125
Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
130 135 140
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
145 150 155 160
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
165 170 175
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
180 185 190
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Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His
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Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
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Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
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Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
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Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
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Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
340 345 350
Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370 375 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
385 390 395 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
405 410 415
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420 425 430
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435 440 445
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Lys
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Ala Met His Val Ala Gln Pro Ala Val Val Leu Ala Ser Ser Arg Gly
465 470 475 480
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Asn
&lt;210&gt; 26
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&lt;212&gt; PRT
&lt;213&gt; 人工序列(Artificial Sequence)
&lt;220&gt;
&lt;221&gt;
&lt;222&gt;
&lt;223&gt; 人工序列
&lt;400&gt; 26
Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu
1 5 10 15
Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln
20 25 30
Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu
35 40 45
Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys
50 55 60
Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu
65 70 75 80
Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro
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100 105 110
Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His
115 120 125
Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg
130 135 140
Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg
145 150 155 160
Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala
165 170 175
Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser
180 185 190
Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu
195 200 205
Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro
210 215 220
Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys
225 230 235 240
Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp
245 250 255
Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser
260 265 270
Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His
275 280 285
Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser
290 295 300
Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala
305 310 315 320
Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg
325 330 335
Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr
340 345 350
Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu
355 360 365
Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro
370 375 380
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385 390 395 400
Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro
405 410 415
Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys
420 425 430
Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys
435 440 445
Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His
450 455 460
Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser
465 470 475 480
Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr
485 490 495
Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp
500 505 510
Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala
515 520 525
Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu
530 535 540
Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys
545 550 555 560
Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val
565 570 575
Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
580 585 590
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Lys Ala Met His Val Ala Gln
595 600 605
Pro Ala Val Val Leu Ala Ser Ser Arg Gly Ile Ala Ser Phe Val Cys
610 615 620
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625 630 635 640
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645 650 655
Met Gly Asn Glu Leu Thr Phe Leu Asp Asp Ser Ile Cys Thr Gly Thr
660 665 670
Ser Ser Gly Asn Gln Val Asn Leu Thr Ile Gln Gly Leu Arg Ala Met
675 680 685
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725 730 735
&lt;210&gt; 27
&lt;211&gt; 734
&lt;212&gt; PRT
&lt;213&gt; 人工序列(Artificial Sequence)
&lt;220&gt;
&lt;221&gt;
&lt;222&gt;
&lt;223&gt; 人工序列
&lt;400&gt; 27
Lys Ala Met His Val Ala Gln Pro Ala Val Val Leu Ala Ser Ser Arg
1 5 10 15
Gly Ile Ala Ser Phe Val Cys Glu Tyr Ala Ser Pro Gly Lys Ala Thr
20 25 30
Glu Val Arg Val Thr Val Leu Arg Gln Ala Asp Ser Gln Val Thr Glu
35 40 45
Val Cys Ala Ala Thr Tyr Met Met Gly Asn Glu Leu Thr Phe Leu Asp
50 55 60
Asp Ser Ile Cys Thr Gly Thr Ser Ser Gly Asn Gln Val Asn Leu Thr
65 70 75 80
Ile Gln Gly Leu Arg Ala Met Asp Thr Gly Leu Tyr Ile Cys Lys Val
85 90 95
Glu Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Tyr Leu Gly Ile Gly Asn Gly Thr
100 105 110
Gln Ile Tyr Val Ile Asp Pro Glu Pro Ser Pro Asp Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ala His Lys
130 135 140
Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu Glu Asn Phe Lys
145 150 155 160
Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln Gln Cys Pro Phe
165 170 175
Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu Phe Ala Lys Thr
180 185 190
Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr
195 200 205
Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu Arg Glu Thr Tyr
210 215 220
Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn Glu
225 230 235 240
Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro Arg Leu Val
245 250 255
Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His Asp Asn Glu Glu
260 265 270
Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Tyr
275 280 285
Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Lys Ala Ala
290 295 300
Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leu Pro
305 310 315 320
Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ala Lys Gln
325 330 335
Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala Phe Lys
340 345 350
Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro Lys Ala Glu Phe
355 360 365
Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys Val His Thr Glu
370 375 380
Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu
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Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser Ser Lys Leu Lys
405 410 415
Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His Cys Ile Ala Glu
420 425 430
Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser Leu Ala Ala Asp
435 440 445
Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp
450 455 460
Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg His Pro Asp
465 470 475 480
Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Glu Thr Thr
485 490 495
Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu Cys Tyr Ala Lys
500 505 510
Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro Gln Asn Leu Ile
515 520 525
Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gln
530 535 540
Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln Val Ser Thr
545 550 555 560
Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser Lys
565 570 575
Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala Glu Asp Tyr
580 585 590
Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro
595 600 605
Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg
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Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys
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Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp Ile Cys Thr Leu
645 650 655
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725 730
&lt;210&gt; 28
&lt;211&gt; 875
&lt;212&gt; PRT
&lt;213&gt; 人工序列(Artificial Sequence)
&lt;220&gt;
&lt;221&gt;
&lt;222&gt;
&lt;223&gt; 人工序列
&lt;400&gt; 28
Lys Ala Met His Val Ala Gln Pro Ala Val Val Leu Ala Ser Ser Arg
1 5 10 15
Gly Ile Ala Ser Phe Val Cys Glu Tyr Ala Ser Pro Gly Lys Ala Thr
20 25 30
Glu Val Arg Val Thr Val Leu Arg Gln Ala Asp Ser Gln Val Thr Glu
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Val Cys Ala Ala Thr Tyr Met Met Gly Asn Glu Leu Thr Phe Leu Asp
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Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu Glu Asn Phe Lys
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Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln Gln Cys Pro Phe
165 170 175
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180 185 190
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195 200 205
Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu Arg Glu Thr Tyr
210 215 220
Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn Glu
225 230 235 240
Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro Arg Leu Val
245 250 255
Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His Asp Asn Glu Glu
260 265 270
Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Tyr
275 280 285
Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Lys Ala Ala
290 295 300
Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leu Pro
305 310 315 320
Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ala Lys Gln
325 330 335
Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala Phe Lys
340 345 350
Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro Lys Ala Glu Phe
355 360 365
Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys Val His Thr Glu
370 375 380
Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu
385 390 395 400
Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser Ser Lys Leu Lys
405 410 415
Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His Cys Ile Ala Glu
420 425 430
Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser Leu Ala Ala Asp
435 440 445
Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp
450 455 460
Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg His Pro Asp
465 470 475 480
Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Glu Thr Thr
485 490 495
Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu Cys Tyr Ala Lys
500 505 510
Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro Gln Asn Leu Ile
515 520 525
Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gln
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Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln Val Ser Thr
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565 570 575
Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala Glu Asp Tyr
580 585 590
Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro
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Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg
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Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys Ala Asp Asp Lys
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Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln
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Ala Ala Leu Gly Leu Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
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Leu Ala Ser Ser Arg Gly Ile Ala Ser Phe Val Cys Glu Tyr Ala Ser
755 760 765
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850 855 860
Asp Ser Ala Ala Ala His His His His His His
865 870 875
&lt;210&gt; 29
&lt;211&gt; 736
&lt;212&gt; PRT
&lt;213&gt; 人工序列(Artificial Sequence)
&lt;220&gt;
&lt;221&gt;
&lt;222&gt;
&lt;223&gt; 人工序列
&lt;400&gt; 29
Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu
1 5 10 15
Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln
20 25 30
Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu
35 40 45
Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys
50 55 60
Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu
65 70 75 80
Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro
85 90 95
Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu
100 105 110
Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His
115 120 125
Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg
130 135 140
Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg
145 150 155 160
Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala
165 170 175
Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser
180 185 190
Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu
195 200 205
Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro
210 215 220
Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys
225 230 235 240
Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp
245 250 255
Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser
260 265 270
Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His
275 280 285
Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser
290 295 300
Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala
305 310 315 320
Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg
325 330 335
Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr
340 345 350
Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu
355 360 365
Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro
370 375 380
Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu
385 390 395 400
Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro
405 410 415
Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys
420 425 430
Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys
435 440 445
Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His
450 455 460
Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser
465 470 475 480
Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr
485 490 495
Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp
500 505 510
Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala
515 520 525
Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu
530 535 540
Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys
545 550 555 560
Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val
565 570 575
Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
580 585 590
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Lys Ala Met His Val Ala Gln
595 600 605
Pro Ala Val Val Leu Ala Ser Ser Arg Gly Ile Ala Ser Phe Val Cys
610 615 620
Glu Tyr Leu Leu Asp Ile Glu Pro Glu Phe Val Arg Val Thr Val Leu
625 630 635 640
Arg Gln Ala Asp Ser Gln Val Thr Glu Val Cys Ala Ala Thr Tyr Gln
645 650 655
Leu Gln Trp Met Leu Thr Phe Leu Asp Asp Ser Ile Cys Thr Gly Thr
660 665 670
Ser Ser Gly Asn Gln Val Asn Leu Thr Ile Gln Gly Leu Arg Ala Met
675 680 685
Asp Thr Gly Leu Tyr Ile Cys Lys Val Glu Trp Ser Arg Glu Trp Gly
690 695 700
Arg Gln Gly Leu Gly Ile Gly Asn Gly Thr Gln Ile Tyr Val Ile Asp
705 710 715 720
Pro Glu Pro Ser Pro Asp Ser Ala Ala Ala His His His His His His
725 730 735
&lt;210&gt; 30
&lt;211&gt; 332
&lt;212&gt; DNA
&lt;213&gt; 人工序列(Artificial Sequence)
&lt;220&gt;
&lt;221&gt;
&lt;222&gt;
&lt;223&gt; BDM支架序列
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; misc_feature
&lt;222&gt; (85)..(85)
&lt;223&gt; n是编码第一结合环的核苷酸的长度
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; misc_feature
&lt;222&gt; (139)..(139)
&lt;223&gt; n是编码第二结合环的核苷酸的长度
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; misc_feature
&lt;222&gt; (149)..(149)
&lt;223&gt; n是a、c、g或t
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; misc_feature
&lt;222&gt; (251)..(251)
&lt;223&gt; n是编码第三结合环的核苷酸的长度
&lt;220&gt;
&lt;221&gt; misc_feature
&lt;222&gt; (261)..(261)
&lt;223&gt; n是a、c、g或t
&lt;400&gt; 30
gccatggcaa aagcaatgca tgttgcacag cctgcagttg ttctggcaag cagccgtggt 60
attgccagct ttgtttgtga gtatngtgcg cgtgaccgtt ctgcgtcagg cagatagcca 120
ggttaccgaa gtttgtgcag caacctatnc tgacctttct ggatgatagc atttgtaccg 180
gcaccagcag cggtaatcag gttaatctga ccattcaggg tctgcgtgca atggataccg 240
gtctgtatat ttgcaaagtt nctgggcatt ggcaatggca cccagattta tgttattgat 300
cctgaaccgt caccggatag caatgcggcc gc 332

Claims (43)

1.一种能够与两种或更多种不同的目标抗原或表位结合的多特异性分子，所述分子包含：
(i)与第一目标抗原或表位结合的至少一个结合域分子(BDM)，所述BDM包含V样结构域(VLD)支架，所述支架内含有三个暴露的结合环(BL)并且其中所述三个BL中的至少两个相对于它们在所述支架中的对应天然序列经修饰或置换以与异源性目标抗原或表位选择性结合；以及
(ii)药理活性蛋白或肽，其为与第二目标抗原或表位结合的抗体或其抗原结合片段或非抗体蛋白或肽；
其中至少一个BDM与所述药理活性蛋白或肽内存在的多肽的C端偶合。
2.根据权利要求1所述的分子，其中至少一个BDM与抗体重链多肽的C端偶合。
3.根据权利要求1或2所述的分子，其中至少一个BDM与抗体轻链多肽的C端偶合。
4.根据任一项前述权利要求所述的分子，其中至少一个BDM与所有抗体重链和轻链多肽的C端偶合。
5.根据任一项前述权利要求所述的分子，其中所述药理活性蛋白是全长抗体。
6.根据任一项前述权利要求所述的分子，其中抗体链与BDM的比率为4:2n，其中n为1至5的数字。
7.根据权利要求1至5中任一项所述的分子，其中所述药理活性蛋白质是抗原结合片段，所述抗原结合片段选自Fab、Fab’、F(ab’)2或经化学连接的F(ab’)2。
8.根据权利要求7所述的分子，其中抗原结合片段链与BDM的比率为2:n，其中n为1至16的数字。
9.根据权利要求1至6中任一项所述的分子，其中至少一个BDM与所述重链多肽的CH1、CH2或CH3结构域的C端偶合。
10.根据任一项前述权利要求所述的分子，其中至少一个BDM与所述非抗体蛋白或多肽的各多肽链的C端偶合。
11.根据任一项前述权利要求所述的分子，其中所述VLD支架包含人CTLA4、ICOS或CD28的胞外部分。
12.根据任一项前述权利要求所述的分子，其中所述药理活性蛋白与其天然目标抗原或表位结合。
13.根据任一项前述权利要求所述的分子，其中所述第一目标抗原和所述第二目标抗原是不同的。
14.根据任一项前述权利要求所述的分子，其中所述第一目标表位和所述第二目标表位在相同或不同的抗原上。
15.根据任一项前述权利要求所述的分子，其中所述分子是双特异性物或三特异性物。
16.根据任一项前述权利要求所述的分子，其中所述分子包含一、二、三、四、五或六个BDM。
17.根据权利要求1至6中任一项所述的分子，其中所述分子包含一对或两对BDM，其中所述对中的所述BDM是相同的。
18.根据任一项前述权利要求所述的分子，其中所述至少一个BDM与一个或多个另外的BDM连接。
19.根据任一项前述权利要求所述的分子，其中所述分子包含至少两个BDM、或至少一对BDM，其中各BDM(或BDM对)与不同的目标抗原或表位结合。
20.根据任一项前述权利要求所述的分子，其中各BDM与和所述药理活性蛋白或多肽所结合的所述目标抗原表位不同的目标抗原或表位结合。
21.根据任一项前述权利要求所述的分子，其中所述非抗体蛋白或肽选自：凝血因子、抗运载蛋白、类毒素、胶原结合蛋白、人血清白蛋白(HSA)、TNF-α受体结合蛋白、整合素结合蛋白、VEGF或其模拟物、EPO或其模拟物、C4结合蛋白、尿激酶受体拮抗剂、淋巴因子、细胞因子、护骨素(OPG)或选自程序性细胞死亡1蛋白(PD1)、程序性死亡配体1(PD-L1)、NKG2D、MHCI类多肽相关序列A(MICA)、MHC I类多肽相关序列B(MICB)、UL16结合蛋白(ULBP)的蛋白的胞外结构域。
22.根据任一项前述权利要求所述的分子，其中所述VLD支架选自胞外结构域人CTLA4、CD28或ICOS。
23.根据权利要求22所述的分子，其中所述VLD支架由对应于以下所示的SEQ ID NO:1的残基1至25、34至54、60至97和106至126的框架序列组成：
24.根据权利要求23所述的分子，其中所述VLD支架包含与SEQ ID NO:1的残基1至25、34至54、60至97和106至126具有至少约70％序列同一性的序列。
25.根据权利要求23或24所述的分子，其中位于SEQ ID NO:1的位置26至33、和/或位置55至59和/或位置98至105的所述氨基酸残基经修饰或经异源性序列置换。
26.根据任一项前述权利要求所述的分子，其中所述BDM包含以下所示的序列或由其组成：
其中X、X和X是任何氨基酸残基并且n为5至15的数字且1、2、3分别指示BL 1、2和3。
27.根据权利要求26所述的分子，其中Xn1是5至8个的氨基酸，Xn2是5至8个的氨基酸，且Xn3是10至15个的氨基酸。
28.根据权利要求26或27所述的分子，其中Xn1是8个氨基酸。
29.根据权利要求26或27所述的分子，其中Xn2是5个氨基酸。
30.根据权利要求26或27所述的分子，其中Xn3是10至15个的氨基酸。
31.根据任一项前述权利要求所述的分子，其中所述至少一个BDM呈单体、二聚体或一系列连接在一起的BDM单体。
32.根据任一项前述权利要求所述的分子，其中所述至少一个BDM和所述药理活性蛋白或肽的偶合借助接头、通过直接融合、通过缀合作用或通过共价或非共价键合而发生。
33.根据权利要求32所述的分子，其中所述接头是Gly-Ser肽接头。
34.根据任一项前述权利要求所述的分子，其中所述目标抗原是蛋白、糖蛋白、聚糖、脂质、脂蛋白或核酸。
35.根据任一项前述权利要求所述的分子，其中所述分子与表达被所述分子的各个BDM和药学活性蛋白部分识别的两种或更多种不同的目标抗原或表位的细胞选择性结合，但不与仅仅表达所述目标抗原或表位之一的细胞选择性结合。
36.根据任一项前述权利要求所述的分子，其为多肽。
37.根据权利要求34所述的分子，其中所述多肽选自SEQ ID NO:5、6、13、14、19、21、22、23、24、25、27、28或29。
38.根据权利要求1至37中任一项所述的分子，其为核酸。
39.一种宿主细胞，其经根据权利要求38所述的核酸转化。
40.一种药物组合物，其包含根据权利要求1至37中任一项所述的分子连同药学上可接受的载剂和/或赋形剂。
41.根据权利要求40所述的组合物，其用于制造药品。
42.根据权利要求1至37中任一项所述的分子，其中所述分子用试剂标记以帮助检测。
43.根据权利要求1至37中任一项所述的分子的用途，其用于检测所述分子所结合的一种或多种目标抗原。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113631576A (zh) * 2019-03-26 2021-11-09 四十七公司 用于治疗癌症的多特异性药剂

Families Citing this family (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2019510812A (ja) * 2016-02-26 2019-04-18 イミュネクサス・ピーティーワイ・リミテッド 多重特異性分子
WO2018014260A1 (en) 2016-07-20 2018-01-25 Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. Multispecific antigen binding proteins and methods of use thereof
WO2018068201A1 (en) 2016-10-11 2018-04-19 Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. Single-domain antibodies and variants thereof against ctla-4
AU2018219887A1 (en) 2017-02-08 2019-08-22 Dragonfly Therapeutics, Inc. Multi-specific binding proteins for activation of natural killer cells and therapeutic uses thereof to treat cancer
KR20190120782A (ko) 2017-02-20 2019-10-24 드래곤플라이 쎄라퓨틱스, 인크. Her2, nkg2d 및 cd16에 결합하는 단백질
BR112019023992A2 (pt) 2017-05-19 2020-06-16 Wuxi Biologics (Shanghai) Co., Ltd. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, seu método de produção, seus usos, bem como molécula de ácido nucleico, vetor de clonagem ou expressão, célula hospedeira, hibridoma, composição farmacêutica e imunoconjugado
SG11201913969SA (en) * 2017-08-16 2020-01-30 Dragonfly Therapeutics Inc Proteins binding nkg2d, cd16, and egfr, hla-e ccr4, or pd-l1
CA3082280A1 (en) 2017-12-28 2019-07-04 Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. Single-domain antibodies and variants thereof against tigit
WO2019134710A1 (en) * 2018-01-08 2019-07-11 Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. Multispecific antigen binding proteins and methods of use thereof
TWI802633B (zh) 2018-01-15 2023-05-21 大陸商南京傳奇生物科技有限公司 針對pd-1之單域抗體及其變異體
AU2019218136A1 (en) 2018-02-08 2020-08-13 Dragonfly Therapeutics, Inc. Antibody variable domains targeting the NKG2D receptor
JP2022520978A (ja) * 2019-02-18 2022-04-04 クーリエ セラピューティクス インコーポレイテッド オルソポックスウイルス主要組織適合性複合体（ｍｈｃ）クラスｉ様タンパク質（ｏｍｃｐ）と腫瘍特異的結合パートナーを用いた二重特異性融合タンパク質
JP7462762B2 (ja) * 2020-01-20 2024-04-05 ウーシー バイオロジクス アイルランド リミテッド アフィニティークロマトグラフィー用の新規な洗浄緩衝液
EP4225802A1 (en) * 2020-10-12 2023-08-16 Greffex, Inc. Antibody constructs to target t cell responses to sars-cov protein expressing cells, their design and uses
WO2023092185A1 (en) * 2021-11-26 2023-06-01 Imunexus Therapeutics Limited Binding domain molecules on cell surfaces

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7166697B1 (en) * 1998-03-06 2007-01-23 Diatech Pty. Ltd. V-like domain binding molecules
WO2008096158A2 (en) * 2007-02-08 2008-08-14 Domantis Limited Antibody single variable domains against serum albumin
WO2010136492A2 (en) * 2009-05-28 2010-12-02 Glaxo Group Limited Antigen-binding proteins
CN101932608A (zh) * 2007-11-30 2010-12-29 葛兰素集团有限公司 抗原结合构建体
CN102227447A (zh) * 2008-10-02 2011-10-26 新兴产品开发西雅图有限公司 Cd86拮抗物多靶点结合蛋白

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU4499499A (en) * 1999-04-01 2000-10-23 Innogenetics N.V. A polypeptide structure for use as a scaffold
US20100081792A1 (en) * 2001-06-28 2010-04-01 Smithkline Beecham Corporation Ligand
EP2435479A1 (en) * 2009-05-28 2012-04-04 Glaxo Group Limited Antigen-binding proteins
JP2019510812A (ja) * 2016-02-26 2019-04-18 イミュネクサス・ピーティーワイ・リミテッド 多重特異性分子

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7166697B1 (en) * 1998-03-06 2007-01-23 Diatech Pty. Ltd. V-like domain binding molecules
WO2008096158A2 (en) * 2007-02-08 2008-08-14 Domantis Limited Antibody single variable domains against serum albumin
CN101932608A (zh) * 2007-11-30 2010-12-29 葛兰素集团有限公司 抗原结合构建体
CN102227447A (zh) * 2008-10-02 2011-10-26 新兴产品开发西雅图有限公司 Cd86拮抗物多靶点结合蛋白
WO2010136492A2 (en) * 2009-05-28 2010-12-02 Glaxo Group Limited Antigen-binding proteins

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
NUTTALL SD等: "Design and expression of soluble CTLA-4 variable domain as a scaffold for the display of functional polypeptides", 《PROTEINS》 *
SIMON E.HUFTONA等: "Development and application of cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4 as a protein scaffold for the generation of novel binding ligands", 《FEBS LETTERS》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113631576A (zh) * 2019-03-26 2021-11-09 四十七公司 用于治疗癌症的多特异性药剂

Also Published As

Publication number Publication date
AU2017222700A1 (en) 2018-03-22
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JP2019510812A (ja) 2019-04-18

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