CN113631576A - 用于治疗癌症的多特异性药剂 - Google Patents

Abstract

本发明提供了具有结合CD47的一个臂和结合CD24的第二臂的多特异性药剂。本发明还提供了具有结合SIRPα的一个臂和结合siglec‑10的第二臂的多特异性药剂。

Description

用于治疗癌症的多特异性药剂

相关申请的交叉引用

本申请要求2019年3月26日提交的US 62/824,213的优先权，该专利申请全文以引用方式并入以用于所有目的。

序列表

本专利申请公开了2020年3月25日创建的命名为20-03-25 544571SL、7千字节的txt序列表中包含的序列，该序列表以引用方式并入本文。

背景技术

CD47是广泛表达的具有单个Ig样结构域和五个跨膜区的跨膜糖蛋白，其作为SIRPα的细胞配体通过SIRPα的NH2末端V样结构域介导的结合起作用。SIRPα主要在骨髓细胞上表达，该骨髓细胞包括巨噬细胞、粒细胞、骨髓树突状细胞(DC)、肥大细胞及其前体，包括造血干细胞。CD47介导多种生物过程，包括白细胞粘附和迁移、T细胞活化、凋亡和吞噬作用。

巨噬细胞上的SIRPα与宿主靶细胞上表达的CD47的结合产生由SHP-1介导的抑制信号，该抑制信号负调节吞噬作用。SIRPα的作用是负控制针对宿主细胞的先天免疫效应子功能。

CD47在许多癌症中也是组成型上调的，包括造血系统癌症和实体瘤。CD47的过表达通过允许癌症细胞逃避吞噬作用而增加癌症的致病性。虽然CD47代表用于治疗癌症的靶标，但CD47在正常细胞尤其是红血细胞上的表达可导致脱靶效应。

类似于CD47，CD24在许多正常组织中表达，并且在许多癌症中以升高的水平表达。CD24的反受体之一被称为siglec G(小鼠)或siglec-10(人)。Siglec G/10主要在B细胞、单核细胞谱系的细胞和嗜酸性粒细胞上表达。CD24-siglec G/10途径通过选择性阻遏宿主对DAMP的响应来区分病原体相关分子模式(PAMP)与危险相关分子模式(DAMP)。DAMP而非PAMP将CDS24 Siglec G/10带入TLR/NLR附近，因此允许siglec G/10相关的磷酸酶诸如SHP1阻遏DAMP发起的TLR/NLR信号传导。可溶形式的CD24正在开发中以用于治疗自身免疫疾病。

CD24与siglec G/10的顺式或反式结合导致通过siglec G/10的ITIM基序的信号传导，从而引起对炎性途径的SHP-1抑制。因此，CD24与siglec G/10的相互作用与CD47与SIRPα的相互作用具有平行的抗炎效应。

发明内容

本发明提供了一种多特异性药剂，该多特异性药剂包含特异性结合CD47的第一结合臂和特异性结合CD24的第二结合臂。任选地，第一结合臂拮抗CD47与SIRPα的结合，并且第二结合臂拮抗CD24与siglec-10的结合。任选地，第一结合臂是抗体VH-VL对或SIRPα胞外结构域，并且第二结合臂是抗体VH-VL对或siglec-10胞外结构域。任选地，多特异性药剂具有单个第一结合臂和单个第二结合臂。任选地，多特异性药剂具有第一结合臂的两个拷贝和第二结合臂的两个拷贝。任选地，多特异性药剂还包含特异性结合癌症抗原的第三结合臂。任选地，癌症抗原是CD20。任选地，第一结合臂和第二结合臂对CD47和CD24的亲和力彼此在四倍以内。任选地，第二结合臂对CD24的亲和力比第一结合臂对CD47的亲和力高至少五倍。任选地，多特异性药剂还包含Fc结构域。任选地，Fc结构域是人IgG4同种型。任选地，Fc结构域是人IgG1或IgG4同种型。任选地，多特异性药剂是经突变以降低效应子功能的人IgG1同种型。

本发明还提供了一种治疗患有癌症的患者的方法，该方法包括向患者施用多特异性药剂。任选地，癌症表达CD24和CD47。任选地，多特异性药剂还包含特异性结合癌症抗原的第三结合臂，其中癌症表达该癌症特异性抗原。任选地，癌症是腺癌。任选地，癌症是淋巴瘤。任选地，该方法还包括检测CD24和CD47在癌症细胞上的表达。

本发明还提供了一种多特异性药剂，该多特异性药剂包含特异性结合SIRPα的第一结合臂和特异性结合siglec-10的第二结合臂。任选地，第一结合臂拮抗CD47与SIRPα的结合，并且第二结合臂拮抗CD24与siglec-10的结合。任选地，第一结合臂是抗体VH-VL对或SIRPα胞外结构域，并且第二结合臂是抗体VH-VL对或siglec-10结合结构域。任选地，多特异性药剂具有单个第一结合臂和单个第二结合臂。任选地，多特异性药剂具有第一结合臂的两个拷贝和第二结合臂的两个拷贝。任选地，第一结合臂和第二结合臂对SIRPα和siglec-10的亲和力彼此在四倍以内。任选地，第二结合臂对siglec-10的亲和力比第一结合臂对SIRPα的亲和力高至少五倍。任选地，多特异性药剂还包含Fc结构域。任选地，Fc结构域是人IgG4同种型。任选地，Fc结构域是人IgG1或IgG4同种型。任选地，Fc结构域是经突变以降低效应子功能的人IgG1同种型。

本发明还提供了一种治疗患有癌症的患者的方法，该方法包括向患者施用多特异性药剂，该多特异性药剂包含特异性结合SIRPα的第一结合臂和特异性结合siglec-10的第二结合臂。任选地，多特异性药剂还包含特异性结合癌症抗原的第三结合臂，其中癌症表达该癌症特异性抗原。

附图说明

图1示出了CD24在癌症和组织匹配的正常组织中的表达。

图2示出了CD24在淋巴瘤中的表达。

图3示出了siglec-10在癌症和组织匹配的正常组织中的表达。

图4示出了各种抗体对结肠直肠腺癌的巨噬细胞吞噬作用。

图5示出了各种抗体对卵巢腺癌的巨噬细胞介导的吞噬作用。

定义

本发明的多特异性药剂通常以分离的形式提供。这意味着多特异性药剂的纯度通常是由其生产或纯化产生的干扰蛋白质和其他污染物的至少50重量％，但不排除多特异性药剂与过量的药学上可接受的载体或旨在促进其使用的其他媒介物组合的可能性。有时多特异性药剂的纯度是来自生产或纯化的干扰蛋白质和污染物的至少60重量％、70重量％、80重量％、90重量％、95重量％或99重量％。通常，多特异性药剂是在其纯化之后剩余的主要大分子物质。

多特异性药剂与其靶抗原的特异性结合意指至少10⁶、10⁷、10⁸、10⁹或10¹⁰M^-1的亲和力。亲和力对于不同的靶标可不同。特异性结合在量值上可检测地更高并且可与发生在至少一个不相关靶标上的非特异性结合区分开。特异性结合可以是特定官能团之间形成键合或特定空间匹配(例如，锁和钥匙类型)的结果，而非特异性结合通常是范德华力的结果。然而，特异性结合并不一定暗示具有两个不同结合位点的多特异性药剂仅结合针对这两个结合位点的靶标。

基本的抗体结构单元是亚基的四聚体。每个四聚体包括两对相同的多肽链，每对具有一条“轻”链(约25kDa)和一条“重”链(约50kDa-70kDa)。每条链的氨基末端部分包括约100至110或更多个氨基酸的可变区，其主要负责抗原识别。该可变区最初表达为与可切割信号肽连接。没有信号肽的可变区有时被称为成熟可变区。因此，例如，轻链成熟可变区意指没有轻链信号肽的轻链可变区。然而，提及可变区并不意味着必然存在信号序列；并且事实上，一旦已表达和分泌了本发明的多特异性药剂，信号序列就被切割。一对重链可变区和轻链可变区限定抗体的结合区。轻链和重链的羧基末端部分分别限定轻链恒定区和重链恒定区。重链恒定区主要负责效应子功能。在IgG抗体中，重链恒定区被分成CH1、铰链、CH2和CH3区。在IgA中，重链恒定区被分成CH1、CH2和CH3。IgM包括恒定区结构域Cμ1、Cμ2、Cμ3、Cμ4(20个氨基酸的尾片)。CH1区通过二硫键和非共价键与轻链恒定区结合。铰链区提供抗体的结合区和效应子区之间的柔性，并且还提供四聚体亚基中两个重链恒定区之间的分子间二硫键合的位点。CH2和CH3区是效应子功能和FcRn结合的主要位点。

轻链被分类为κ或λ。重链被分类为γ、μ、α、δ或ε，并且将抗体的同种型分别定义为IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。在轻链和重链内，可变区和恒定区通过约12个或更多个氨基酸的“J”片段连接，其中重链还包括约10个或更多个氨基酸的“D”片段。(一般参见FundamentalImmunology(Paul,W.编辑，第2版，Raven Press,N.Y.,1989)，第7章)(全文以引用方式并入以用于所有目的)。

每个轻链/重链对的成熟可变区形成抗体结合位点。因此，完整抗体具有两个结合位点，即是二价的。在天然抗体中，结合位点是相同的。然而，在双特异性抗体中，这些结合位点可根据形式而相同或不同(参见例如Songsivilai和Lachmann，Clin.Exp.Immunol.,79:315-321(1990)；Kostelny等人，J.Immunol.,148:1547-53(1992))。可变区全部表现出由三个高变区(也称为互补决定区或CDR)连接的相对保守的框架区(FR)的相同通用结构。来自每对的两条链的CDR通过框架区进行比对，使得能够结合到特异性表位。从N末端到C末端，轻链和重链均包含FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4结构域。对每个结构域的氨基酸分配根据以下文献中的定义：Kabat，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest(National Institutes of Healthh，Bethesda,Md.，1987和1991)，或Chothia&Lesk,J.Mol.Biol.196:901-917(1987)；Chothia等人，Nature 342:878-883(1989)。Kabat还提供了一种广泛使用的编号惯例(Kabat编号)，其中不同重链可变区之间或不同轻链可变区之间的对应残基被分配相同的编号。尽管Kabat编号可用于抗体恒定区，但EU索引(也称为EU编号)更常用，如本申请中的情况。

术语“表位”是指多特异性药剂的臂与之结合的抗原上的位点。表位可由邻接氨基酸或通过一个或多个蛋白质的三级折叠而并置的非邻接氨基酸形成。由邻接氨基酸形成的表位(也称为线性表位)通常在暴露于变性溶药剂时保留，而由三级折叠形成的表位(也称为构象表位)通常在用变性溶药剂处理时丧失。一些抗体结合末端特异性表位，这意味着相对于融合至另一多肽的相同多肽，抗体优先结合具有游离末端的多肽，从而导致游离末端的丧失。表位通常在独特的空间构象中包含至少3个并且更常见的至少5个或8-10个氨基酸。确定表位的空间构象的方法包括例如X射线晶体学和二维核磁共振。参见例如，EpitopeMapping Protocols，Methods in Molecular Biology，第66卷，Glenn E.Morris编辑(1996)。

术语“抗原”或“靶抗原”指示由多特异性药剂的一个结合位点结合的靶分子。抗原可以是任何长度的蛋白质(天然的、合成的或重组表达的)、核酸或碳水化合物以及其他分子。抗原包括受体、配体、反受体和外壳蛋白。

可在显示一种抗体与另一种抗体与靶抗原的结合竞争的能力的简单免疫测定中鉴定识别相同或重叠表位的抗体。抗体的表位也可通过结合到其抗原以鉴定接触残基的抗体的X射线晶体学来定义。另选地，如果抗原中减少或消除一种抗体的结合的所有氨基酸突变减少或消除另一种抗体的结合，则两种抗体具有相同的表位。如果减少或消除一种抗体的结合的一些氨基酸突变减少或消除另一种抗体的结合，则两种抗体具有重叠表位。

抗体之间的竞争通过其中待测抗体抑制参考抗体与共同抗原的特异性结合的测定来确定(参见例如，Junghans等人，Cancer Res.50:1495,1990)。如在竞争性结合测定中所测量的，如果过量的测试抗体(例如，至少2倍、5倍、10倍、20倍或100倍)抑制参考抗体的结合达至少50％但优选地75％、90％或99％，则测试抗体与参考抗体竞争。通过竞争测定鉴定的抗体(竞争性抗体)包括结合到与参考抗体相同的表位的抗体，以及结合到与参考抗体所结合的表位足够接近的相邻表位以发生空间位阻的抗体。

术语“受试者”包括接受预防性或治疗性治疗的人和其他哺乳动物受试者。

出于将氨基酸置换分类为保守性或非保守性的目的，氨基酸分组如下：组I(疏水性侧链)：met、ala、val、leu、ile；组II(中性亲水性侧链)：cys、ser、thr；组III(酸性侧链)：asp、glu；组IV(碱性侧链)：asn、gln、his、lys、arg；组V(影响链取向的残基)：gly、pro；和组VI(芳族侧链)：trp、tyr、phe。保守置换涉及同一类别中的氨基酸之间的置换。非保守置换包括将这些类别中的一个类别的成员与另一个类别的成员交换。

用通过可变区的Kabat编号惯例或恒定区的EU编号最大程度地比对的抗体序列来确定序列同一性百分比。比对后，如果将主题抗体区(例如重链或轻链的整个成熟可变区)与参考抗体的相同区进行比较，主题抗体区和参考抗体区之间的序列同一性百分比是主题抗体区和参考抗体区两者中相同氨基酸占据的位置数除以两个区的比对位置总数，其中空位未计数，乘以100以转化为百分比。

“包括”一个或多个所列举的要素的组合物或方法可包括未具体列举的其他要素。例如，包含抗体的组合物可含有单独的或与其他成分组合的抗体。

术语“抗体依赖性细胞毒性”或ADCC是依赖于抗体包被的靶细胞(即，具有结合抗体的细胞)与具有裂解活性的免疫细胞(也称为效应细胞)的相互作用的诱导细胞死亡的机制。此类效应细胞包括自然杀伤细胞、单核细胞/巨噬细胞和中性粒细胞。ADCC由结合到细胞的抗体Fc区与免疫效应细胞(诸如中性粒细胞、巨噬细胞和自然杀伤细胞)上的Fcγ受体(尤其是FcγRI和FcγRIII)之间的相互作用触发。靶细胞通过吞噬作用或裂解而消除，这取决于介导效应细胞的类型。作为效应细胞活性的结果发生抗体包被的靶细胞死亡。

术语调理作用也称为“抗体依赖性细胞吞噬作用”或ADCP，是指抗体包被的细胞被结合免疫球蛋白Fc区的吞噬免疫细胞(例如巨噬细胞、中性粒细胞和树突状细胞)全部或部分地内化的过程。

术语“补体依赖性细胞毒性”或CDC(也称为CMC)是指诱导细胞死亡的机制，其中靶结合抗体的Fc效应结构域活化一系列酶促反应，最终在靶细胞膜中形成孔。通常，抗原-抗体复合物(诸如抗体包被的靶细胞上的那些)结合并活化补体成分C1q，其继而活化补体级联反应，从而导致靶细胞死亡。补体的活化还可导致补体成分在靶细胞表面上的沉积，这通过结合白细胞上的补体受体(例如CR3)来促进ADCC。

具体实施方式

I.概述

本发明提供了多特异性药剂，该多特异性药剂包含特异性结合第一“别吃我”(don’t eat me)受体的第一结合臂和特异性结合第二“别吃我”受体的第二结合臂。此类药剂的示例是具有分别特异性结合CD47和CD24的第一臂和第二臂的多特异性药剂，以及具有分别特异性结合SIRPα和siglec-10的第一结合臂和第二结合臂的多特异性药剂。靶向CD47和CD24两者在消除两个“别吃我”信号方面是有利的，这两个信号中的任一个信号将减少效应细胞对靶细胞(例如，癌细胞)的消除。由同一药剂靶向CD47和CD24两者导致表达CD47和CD24两者的靶细胞的结合与仅表达这些分子中的一种分子的非靶细胞的结合之间的区别更高，因此例如减少了治疗药剂与表达CD47但不表达CD24的红血细胞的结合。来自多特异性药剂的靶向CD47和CVD24的反受体即SIRPα和siglec-10具有类似的优点。

II.靶标

用于结合多特异性药剂的结合臂的靶标是“别吃我”受体或其反受体。“别吃我”受体是保护表达受体的细胞免受细胞通常所在生物体的免疫系统影响的受体。受体可保护细胞免受先天免疫系统或适应性免疫系统或两者的影响。CD47和CD24保护对抗先天免疫系统。

CD24(Swiss Prot P25063)是具有31个氨基酸的糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定的细胞表面蛋白质，其在成熟蛋白质中具有16个潜在的O-糖基化和N-糖基化位点(在人中)。侧链包括α2,3和α2,6唾液酸、路易斯X抗原和HNK-1碳水化合物。人CD24首先表达为80个氨基酸的前体，从其中从成熟形式中去除占据残基1-26的信号肽和对应于残基60-80的前肽。针对CD24的抗体可特异性结合蛋白质核心或唾液酸侧链或两者。据认为，CD24与siglec-10的相互作用至少部分地由α2,3和α2,6唾液酸介导。

CD47(Swiss Port Q08722)是一种膜结合糖基化受体，包括五个跨膜结构域、三个胞质结构域(残基163-176、229-235和290-323)和三个胞外结构域(残基19-141、198-207和257-268)。残基1-18是信号肽。受体具有糖基化和磷酸化位点。

SIRPα(Swiss Prot P78324)是496个氨基酸的受体，其中残基1-20是信号肽，残基31-373是胞外结构域，残基374-394是跨膜结构域，并且残基395至504是胞质结构域。受体具有糖基化和磷酸化位点。

siglec-10(Swiss Prot Q96LC7)是697个氨基酸的受体，其中残基1-16是信号肽，残基17-550是胞外结构域，残基551-571是跨膜结构域，并且残基572-697是胞质结构域。受体包括二硫键以及糖基化和磷酸化位点。

除非从上下文中明显看出，否则提及特定靶标应理解为是指人形式，尤其是所提供的Swiss Prot登录号的人形式。然而，也可使用非人形式，诸如实验室动物(例如，小鼠、大鼠)、伴侣动物或农场动物的那些。

与多特异性药剂靶向的“别吃我”受体或其反受体配对相关的因素包括存在脱靶分子的相当大小的库(换句话讲，当靶标是癌症细胞时，脱靶分子是在正在治疗的受试者的任何正常细胞上表达的那些)以及通过相同的机制(诸如经由SHP-1途径)抑制免疫应答。

任选地，多特异性药剂并入了特异性结合在癌症细胞上共表达的具有由其他结合臂靶向的“别吃我”受体的癌症相关抗原的第三结合臂。第三臂的存在促进免疫效应细胞对癌症细胞的杀伤。肿瘤细胞抗原的示例包括例如CD19、CD96、CD20、CD22、CD33、CD38、CD52、CD123、CD44、EGFR、VEGFR、BRCA1和-2、PSMA、PD-L1、PSA、CEA、HER-2、Mart1/MalanA、Erbb2、IL-17R、PDGFR-α、SLMF7、GD2、CTLA-4、RANKL和EpCAM。

III.示例性抗体或ECD

多特异性药剂由来自组分抗体的重链可变区和轻链可变区对以及/或者“别吃我”受体的ECD形成。多特异性药剂的结合臂可具有大致相同的亲和力(例如，在2倍、3倍或4倍以内)或对其靶标的不同亲和力(差异大于5倍或10倍)。对于针对在靶细胞和脱靶细胞上受体比率不同的第一“别吃我”受体和第二“别吃我”受体的多特异性靶向，优选的是，与具有较高比率的靶分子与脱靶分子的受体结合的结合臂比与其他受体结合的结合臂具有更高的亲和力，以最小化药剂的脱靶结合。

组分抗体可以是啮齿动物抗体、嵌合抗体、镶饰抗体、人源化抗体、灵长类化抗体、灵长类动物抗体或人抗体等。组分抗体可以是相同或不同类型的；例如，一种可以是人源化的，另一种可以是人的。

针对抗原的其他非人单克隆抗体(例如，鼠、豚鼠、灵长类动物、兔或大鼠)的产生可通过例如用抗原或其片段或携带抗原的细胞免疫动物来实现。参见Harlow&Lane,Antibodies,A Laboratory Manual(CSHP NY,1988)(以引用方式并入以用于所有目的)。此类抗原可通过肽合成或通过重组表达从天然来源获得。任选地，抗原可与载体蛋白融合或以其他方式复合而施用。任选地，抗原可与佐剂一起施用。如下所述，可使用几种类型的佐剂。优选完全弗氏佐剂和随后的不完全佐剂用于实验室动物的免疫。

人源化抗体是基因工程抗体，其中来自非人“供体”抗体的CDR被移植到人“受体”抗体序列中(参见例如，Queen，美国专利5,530,101和5,585,089；Winter，美国专利5,225,539；Carter，美国专利6,407,213；Adair，美国专利5,859,205、6,881,557；Foote，美国专利6,881,557)。受体抗体序列可以是例如成熟人抗体序列、此类序列的复合物、人抗体序列的共有序列或种系区域序列。因此，人源化抗体是具有完全或基本上来自供体抗体的一些或全部CDR以及完全或基本上来自人抗体序列的可变区框架序列和恒定区(如果存在的话)的抗体。类似地，人源化重链具有完全或基本上来自供体抗体重链的至少一个、两个并且通常全部三个CDR，以及基本上来自人重链可变区框架和恒定区序列的重链可变区框架序列和重链恒定区(如果存在的话)。类似地，人源化轻链具有完全或基本上来自供体抗体轻链的至少一个、两个并且通常全部三个CDR，以及基本上来自人轻链可变区框架和恒定区序列的轻链可变区框架序列和轻链恒定区(如果存在的话)。除纳米抗体和dAb之外，人源化抗体还包含人源化重链和人源化轻链。当相应CDR之间至少85％、90％、95％或100％的对应残基(如Kabat所定义)相同时，人源化抗体中的CDR基本上来自非人抗体中的对应CDR。当由Kabat定义的对应残基的至少85％、90％、95％或100％是相同的时，抗体链的可变区构架序列或抗体链的恒定区基本上分别来自人可变区构架序列或人恒定区。

虽然人源化抗体通常并入了来自小鼠抗体的全部六个CDR(优选地如Kabat所定义)，但它们也可用少于全部CDR的CDR(例如，来自小鼠抗体的至少3、4或5个CDR)制备(例如，Pascalis等人，J.Immunol.169:3076,2002；Vajdos等人，Journal of MolecularBiology,320:415-428,2002；Iwahashi等人，Mol.Immunol.36:1079-1091,1999；Tamura等人，Journal of Immunology,164:1432-1441,2000)。

嵌合抗体是其中非人抗体(例如，小鼠)的轻链和重链的成熟可变区与人轻链和重链恒定区组合的抗体。此类抗体基本上或完全保留小鼠抗体的结合特异性，并且为约三分之二的人序列。

镶饰抗体是一种人源化抗体，其保留了非人抗体的一些且通常全部CDR和一些非人可变区构架残基，但置换了可能对B细胞或T细胞表位有贡献的其他可变区构架残基，例如用来自人抗体序列的对应位置的残基替换暴露的残基(Padlan,Mol.Immunol.28:489,1991)。结果是这样的抗体，其中CDR完全或基本上来自非人抗体，并且非人抗体的可变区框架通过置换而变得更类似于人。

人抗体可从人分离，或以其他方式由人免疫球蛋白基因的表达(例如，在转基因小鼠中、在体外或通过噬菌体展示)产生。用于产生人抗体的方法包括：Oestberg等人，Hybridoma 2:361-367(1983)；Oestberg，美国专利4,634,664；和Engleman等人，美国专利4,634,666的trioma方法，使用包括人免疫球蛋白基因的转基因小鼠(参见例如，Lonberg等人，WO93/12227(1993)；美国专利5,877,397、5,874,299、5,814,318、5,789,650、5,770,429、5,661,016、5,633,425、5,625,126、5,569,825、5,545,806，Nature 148,1547-1553(1994)，Nature Biotechnology 14,826(1996)，Kucherlapati，WO 91/10741(1991))以及噬菌体展示方法(参见例如，Dower等人，WO 91/17271和McCafferty等人，WO 92/01047，美国专利5,877,218、5,871,907、5,858,657、5,837,242、5,733,743和5,565,332。

针对与预期靶标(例如，CD47、CD24、SIRPα或siglec-10)的特异性结合来筛选抗体。可针对与靶标的特定区的结合、与参考抗体的竞争、对携带靶标的细胞与配体或反受体结合的拮抗作用(例如，对CD47与SIRPα结合或CD24与siglec-10结合的拮抗作用)来进一步筛选抗体。一些抗体以小于10ug/ml、5ug/ml或1ug/ml的IC50拮抗CD47与SIRPα的结合或CD24与siglec-10的结合。非人抗体可以转化为如上所述的嵌合、镶饰或人源化形式。

也可使用其他抗体，如Kabat所定义的，或另选的定义，诸如Chothia、Chothia和Kabat的复合体、AbM或Contact(参见万维网bioinf.org.uk/abs)，其具有相同的重链可变区和轻链可变区或相同的六个CDR、或结合相同表位或与这些抗体中的任何一种竞争结合其靶蛋白。

合适的抗CD47抗体的示例包括克隆B6H12、5F9、8B6、C3(例如，如WO 2011/143624中所述)、CC9002(Vonderheide,Nat Med 2015；21:1122–3.,2015)、SRF23(SurfaceOncology)和ZF1(Zeng等人，Oncotarget.2016年12月13日；7(50):83040–83050)。合适的抗CD47抗体包括：此类抗体的人、人源化或嵌合型式，具有相同重链可变区和轻链可变区的抗体，或此类抗体的六个CDR，以及结合相同表位或与其竞争结合CD47的抗体。人源化抗体(例如，hu5F9-IgG4-WO2011/143624或马格里单抗(magrolimab))由于其低抗原性而尤其可用于人的体内应用。一些人源化抗体特异性结合人CD47，其包含可变重(VH)区和可变轻(VL)区，该可变重区含有分别在SEQ ID NO:20、21和22中示出的VH互补区CDR1、CDR2和CDR3；该可变轻区含有分别在WO2011/143624的SEQ ID NO:23、24和25(本文SEQ ID NO:1-6)中示出的VL互补区CDR1、CDR2和CDR3。一些人源化抗体包括WO2011/143624(本文SEQ ID NO:7-12)中示出的选自SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:38的重链可变区以及选自SEQ IDNO:41、SEQ ID NO:42和SEQ ID NO:43的轻链可变区。类似地，犬源化、猫源化抗体等尤其可用于分别在狗、猫和其他物种中的应用。

合适的抗SIRPα抗体特异性结合SIRPα(不活化/刺激足够的信号传导应答以抑制吞噬作用)并抑制SIRPα和CD47之间的相互作用。合适的抗SIRPα抗体包括此类抗体的完全人、人源化或嵌合型式。示例性抗体是KWAR23(Ring等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U S A.，2017年12月5日；114(49):E10578–E10585，WO/2015/138600)、MY-1、Effi-DEM(Zhang等人，Antibody Therapeutics，第1卷，第2期，2018年9月21日，第27-32页)。也可使用与这些抗体中的任何一种共享相同的重链可变区和轻链可变区或相同的六个CDR、或者竞争结合SIRPα或结合相同表位的抗体。

人源化抗体由于其低抗原性而尤其可用于人的体内应用。类似地，犬源化、猫源化等抗体尤其可用于分别在狗、猫和其他物种中的应用。

特异性结合SIRPα并减少癌症细胞上CD47和吞噬细胞上SIRPα之间相互作用的可溶性CD47多肽可用于代替SIRPα抗体(参见例如，WO2016179399)。此类多肽可包括具有上述功能的整个ECD或其部分。合适的可溶性CD47多肽特异性结合SIRPα，而不活化或刺激通过SIRPα的信号传导，因为SIRPα的活化将抑制吞噬作用。相反，合适的可溶性CD47多肽促进癌症细胞的吞噬作用。可溶性CD47多肽可与Fc融合(例如，如US20100239579中所述)。

同样，可溶性SIRPα多肽可用于代替针对CD47的抗体。示例性药剂包括ALX148(Kauder等人，Blood 2017 130:112)以及TTI-622和TTI-661 Trillium。此类药剂可包括具有上述功能的整个SIRPαECD或其任何部分。SIRPα试剂通常将包含至少SIRPα的d1结构域。可溶性SIRPα多肽可与Fc区融合。称为“高亲和力SIRPα试剂”的示例性SIRPα多肽，其包括SIRPα衍生的多肽及其类似物(例如，CV1-hlgG4和CV1单体)，在WO2013/109752中有所描述。高亲和力SIRPα试剂是天然SIRPα蛋白的变体。提供增加的亲和力的氨基酸变化位于d1结构域中，因此高亲和力SIRPα试剂包含人SIRPα的d1结构域，其相对于d1结构域中的野生型序列具有至少一个氨基酸变化。此类高亲和力SIRPα试剂任选地包含：附加的氨基酸序列，例如抗体Fc序列；野生型人SIRPα蛋白的除d1结构域以外的部分，包括但不限于天然蛋白质的残基150至374或其片段，通常是与d1结构域邻接的片段；等等。高亲和力SIRPα试剂可以是单体或多聚体，即二聚体、三聚体、四聚体等。在一些实施方案中，高亲和力SIRPα试剂是可溶的，其中多肽缺少SIRPα跨膜结构域并且包含相对于野生型SIRPα序列的至少一个氨基酸改变，并且其中该氨基酸变化例如通过将解离速率降低至少10倍、至少20倍、至少50倍、至少100倍、至少500倍或更多倍来增加SIRPα多肽与CD47结合的亲和力。

针对CD24的抗体可结合至蛋白质核心内的表位或结合至一个或多个唾液酸侧链内的表位、或蛋白质核心和一个或多个唾液酸侧链两者均贡献的表位。此类抗体可使用为纯化的CD24蛋白或其肽组分的免疫原或其中CD24经由磷脂酰肌醇接头连接至细胞表面的表达CD24的细胞产生。如果使用细胞，则细胞可以是癌症细胞，包括来自待治疗癌症的特定受试者的细胞，或可以是表达CD24的细胞系。WO2009063461和WO2008002112描述了具有抗癌活性的CD24抗体。许多针对CD24的抗体可商购获得(参见万维网biocompare.com/pfu/110447/soids/3585/Antibodies/CD24O)。特异性结合人C24的此类抗体的示例包括MAB5248和AF5247(R&D Systems)、32D12(Stem Cell Technologies)和SN3(BioRad)。也可使用与这些抗体中的任何一种共享相同的重链可变区和轻链可变区或相同的六个CDR、或者竞争结合CD24或结合相同表位的抗体。

任选地与Fc融合蛋白连接的可溶形式的CD24已在自身免疫性疾病治疗的背景中描述于若干专利公布中。这些专利公布包括WO2001072355、WO2011113047、WO2018217659、WSO2018213266和WO2018105204。

针对siglec-10的抗体可通过用siglec-10蛋白、其胞外结构域或来自该胞外结构域的肽或表达siglec-10的细胞进行免疫来产生。可针对与siglec-10的特异性结合以及任选地不与其他siglec(例如，siglec 1-9和11-16)的特异性结合来筛选抗体。然后可针对对CD24或唾液酸修饰的CD24的结合的抑制来筛选抗体。WO2017085166描述了特异性结合siglec-10而非其他siglec并且抑制siglec-10与唾液酸结合的抗体的示例。针对人siglec-10的抗体也可商购获得(参见万维网biocompare.com/pfu/110447/soids/331695/Antibodies/SIGLEC10)。此类抗体的示例包括得自R&D Systems的AF2130、得自Bio-Rad的5G6和得自Novus Biologicals的NBP1-59247。也可使用与这些抗体中的任何一种共享相同的重链可变区和轻链可变区或相同的六个CDR、或者竞争结合siglec-10CD24或结合相同表位的抗体。

IV.多特异性药剂的形式

已描述了双特异性或多特异性药剂的超过100种形式(例如，Kontermann等人，Drug Discovery Today 20,838-847(2015)；Sedykh等人，Drug Des.Devel.Ther.2,195-209(2018))。此类形式包括针对两个靶标中的每个靶标的至少一个结合位点。一些形式包括针对每个靶标的两个或更多个结合位点。一些形式包括针对至少三个靶标中的每个靶标的一个或多个结合位点。

一些形式具有与具有两个不同结合区的正常抗体类似的四聚体结构，两个靶标中的每个靶标一个结合区。每个结合区由分别与重链恒定区和轻链恒定区连接的成对的重链可变区和轻链可变区形成。此类双特异性抗体与正常抗体的不同之处在于两个结合位点和形成它们的重链和轻链对是不同的。因此，此类抗体需要两个不同的重链和轻链对的缔合。

已采用“旋钮入孔(knobs-into-holes)”方法，通过在一种抗体CH3的结构域中用大氨基酸置换小氨基酸(“旋钮”)以及对另一抗体进行相反处理(“孔”)来减少同源二聚体的形成和重链的错配(Ridgway等人，Protein Eng.9:617-21,1996；Atwell等人，J.Mol.Biol.270:26-35,1997；和美国专利7,695,936)。此类形式中的轻链错配可通过多种策略来减少。一种策略是对两个不同的重链可变区使用共同的轻链可变区。但这仅适用于一些抗体。另一种方法是在不同的细菌中分别表达含旋钮和含孔的半分子。另一种称为CrossMab的方法将重链中的一个重链的CH1结构域与对应轻链的恒定CL结构域交换以诱导轻链的正确配对。Schaefer等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 108:11187-92,2011；WO 2009/080251；WO 2009/080252；WO 2009/080253)。另一种方法是将附加的突变引入VH-VL和CH1-CL界面。Lewis等人，Nat.Biotechnol.32,191-198(2014)。这些突变促使重链优先与轻链配对。另一种方法是将促进蛋白A结合的突变引入Fc区之一中，并通过亲和色谱法从具有较高或较低蛋白A结合的同源二聚体中选择具有中间蛋白A结合的异源二聚体配对(Tusdin等人，MAbs.8(4):828-38(2016))。

其他双特异性抗体通过在相同的重链轻链对中组合多种结合特异性来避免错配的问题。这样做的一种方法，称为双可变结构域，是将两个不同的重链可变区串联连接至重链恒定区，并且将两个不同的轻链可变区串联连接至轻链恒定区。Correia等人，MAbs.2013年5月1日；5(3):364–372。此类抗体可通过两个相同的配对重链和轻链的缔合而组装为四聚体。组装的抗体对于每个靶标包含两个不同的结合位点。

另一种方法是通过将scFv与重链恒定区的C末端连接而并入第二结合特异性。此类双特异性包括如在标准抗体中由附接到重链恒定区和轻链恒定区的N末端的重链可变区和轻链可变区形成的第一结合位点。重链的C末端附接到scFv，从而提供第二结合位点。scFv通常经由接头附接，并且另一个接头连接scFv中的重链可变区和轻链可变区。scFv可通过其轻链可变区或重链可变区端部经由接头附接到Fc区。当通过两个相同的配对重链和轻链的复合而组装时，此类双特异性包括针对两种不同特异性中的每一种的两个结合位点。用于相应靶标的抗体可以任一取向附接。待附接到重链恒定区和轻链恒定区的N末端的臂作为单独的重链可变区和轻链可变区提供，并且待附接到C末端的臂作为scFv片段提供。

另一种形式将特异性结合第一靶标的scFv与重链恒定区连接，并且将特异性结合另一靶标的scFv与轻链恒定区连接。此类抗体组装成四聚体，其包括每个结合位点的两个拷贝(Bs(scFv)4-IgG)。(Zuo等人，Protein Eng 13:361-367,2000)。

其他形式将单链上的scFv结合区连接起来而没有恒定区。例如，BiTe形式通过接头连接两个scFv片段(参见例如Ross等人，PLoS ONE 12(8):e0183390,2017)。此类形式缺乏效应子功能并且趋于具有短半衰期，但由于它们的小尺寸，可具有可接近性和易于制造的优点。另一种形式将两个或更多个不同的scFv与Fc结构域连接，通常与其N末端连接。

在上述形式的任何一种中，包括重链可变区和轻链可变区的抗体结合臂可被“别吃我”受体或其反受体的ECD替换。通常，ECD以此类形式与Fc结构域融合。

许多形式可扩展到具有三个或更多个结合臂的多特异性形式(参见例如，Runcie等人，Mol.Med 24,50(2018)；Steinhardt等人，Nature Communications 9,877(2018)；Hu等人，Cancer Res,75,159-170(2015))。例如，具有与正常抗体相同的四聚体结构的双特异性形式可通过在重链或轻链中的任一者上或在Fc片段的C末端上包括scFv而扩展至三聚体或更高聚体。另选地，可将编码第三结合臂的单独的重链可变区和轻链可变区与四聚体抗体结构的重链可变区和轻链可变区融合。BiTe形式同样可通过串联融合三个以上scFv而扩展。

反受体的ECD的作用类似于针对受体的抗体，并且受体的ECD的作用类似于针对反受体的抗体。ECD应包括来自受体的胞外部分的足够序列，以便保持结合受体的配体或反受体的能力。

许多上述形式包括在重可变区和轻可变区之间或在可变区和恒定区之间的接头肽。接头是赋予柔性的短肽，其通常主要被gly、ala和/或ser占据。一些示例性接头是Gly-Gly-Ala-Ala、Gly-Gly-Gly-Ser、Leu-Ala-Ala-Ala-Ala以及它们的多聚体。

V.恒定区的选择

多特异性药剂的许多形式包括人恒定区或其Fc部分的至少一部分。恒定区的选择部分地取决于是否需要抗体依赖性细胞介导的细胞毒性、抗体依赖性细胞吞噬作用和/或补体依赖性细胞毒性。例如，人同种型IgG1和IgG3具有补体依赖性细胞毒性，而人同种型IgG2和IgG4则没有。轻链恒定区可以是λ或κ。人IgG1和IgG3还比人IgG2和IgG4诱导更强的细胞介导的效应子功能。对于本发明的多特异性药剂，通常优选具有降低的效应子功能的IgG4、IgG2或减毒IgG1，因为在此尽管ADCC、ADCP和CDC可能在提供针对由多特异性药剂的一个臂结合的癌症细胞的附加作用机制中有用，但这也增加了对脱靶细胞的毒性。因此，在一些多特异性药剂中优选具有降低的效应子功能的人IgG4、IgG2或突变IgG1。

轻链和/或重链的氨基或羧基末端处的一个或若干个氨基酸，诸如重链的C末端赖氨酸，可在分子的一部分或全部中缺失或衍生化。可在恒定区中进行置换以降低或增加效应子功能，诸如补体介导的细胞毒性或ADCC或去除糖基化位点(参见例如，Winter等人，美国专利5,624,821；Tso等人，美国专利5,834,597；以及Lazar等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 103:4005,2006)，或延长在人体中的半衰期(参见例如，Hinton等人，J.Biol.Chem.279:6213,2004)。例如，在IgG Fc中存在许多已知的增加FcRn结合的突变。示例性置换包括位置250处的Gln和/或位置428处的Leu、位置434处的Ser或Asn、位置252处的Tyr、位置254处的Thr和位置256处的Glu以及位置434处的Ala(EU编号)。增加的FcRn结合有利于使本发明的杂合蛋白与内源IgG更强地竞争结合FcRn。还已知许多突变用于降低ADCC、ADCP或CMC中的任一种。(参见例如，Winter等人，美国专利5,624,821；Tso等人，美国专利5,834,597；以及Lazar等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 103:4005,2006)。例如，位置234、235、236和/或237中的任一者的置换降低了对Fcγ受体(特别是FcγRI受体)的亲和力(参见例如US6,624,821)。任选地，人IgG2中的位置234、236和/或237被丙氨酸置换，并且位置235被谷氨酰胺或谷氨酸置换。(参见例如US 5,624,821。)降低效应子功能的其他置换包括位置268处的Ala、位置297处的Gly或Ala、位置309处的Leu、位置322处的Ala、位置327处的Gly、位置330处的Ser、位置331处的Ser、位置238处的Ser、位置268处的Ala、位置309处的Leu。

人恒定区显示不同个体之间的同种异型变异和异同种异型变异，即，恒定区在不同个体中在一个或多个多态性位置处可不同。异同种异型与同种异型的区别在于识别异同种异型的血清与一种或多种其他同种型的非多态性区域结合。

VI.重组多特异性药剂的表达

多特异性药剂通常通过重组表达产生。根据形式，可能需要表达一条、两条或更多条抗体链和/或ECD结构域。如果表达多条链，则它们可由相同或不同的载体表达。重组多核苷酸构建体通常包括可操作地连接至抗体链的编码序列的表达控制序列，包括天然相关的或异源的表达控制元件，诸如启动子。表达控制序列可以是能够转化或转染真核或原核宿主细胞的载体中的启动子系统。一旦载体已整合到适当的宿主中，就将宿主保持在适于核苷酸序列的高水平表达以及多特异性药剂的收集和纯化的条件下。

这些表达载体通常可在宿主生物中作为附加体或作为宿主染色体DNA的组成部分复制。通常，表达载体含有选择标记，例如氨苄青霉素抗性或潮霉素抗性，以允许检测用期望DNA序列转化的那些细胞。

大肠杆菌(E.coli)是一种可用于表达抗体、尤其是抗体片段的原核宿主。微生物诸如酵母也可用于表达。酵母属是具有合适载体的酵母宿主，该载体根据需要具有表达控制序列、复制起点、终止序列等。典型的启动子包括3-磷酸甘油酸激酶和其他糖酵解酶。诱导型酵母启动子包括来自醇脱氢酶、异细胞色素C以及负责麦芽糖和半乳糖利用的酶的启动子等。

哺乳动物细胞可用于表达编码免疫球蛋白或其片段的核苷酸片段。参见Winnacker，From Genes to Clones，(VCH出版社，NY，1987)。已经开发出多种能够分泌完整异源蛋白的合适宿主细胞系，包括CHO细胞系、各种COS细胞系、HeLa细胞、HEK293细胞、L细胞和非抗体产生的骨髓瘤(包括Sp2/0和NS0)。细胞可以是非人的。用于这些细胞的表达载体可包括表达控制序列，诸如复制起点、启动子、增强子(Queen等人，Immunol.Rev.89:49(1986))，以及必需的加工信息位点，诸如核糖体结合位点、RNA剪接位点、聚腺苷酸化位点和转录终止子序列。表达控制序列可包括源自内源性基因、巨细胞病毒、SV40、腺病毒、牛乳头瘤病毒等的启动子。参见Co等人，J.Immunol.148:1149(1992)。

另选地，可将编码多特异性药剂的序列整合到转基因中以引入转基因动物的基因组中并随后在转基因动物的乳汁中表达(参见例如，美国专利5,741,957；美国专利5,304,489；和美国专利5,849,992)。合适的转基因包括轻链和/或重链的编码序列，或与来自乳腺特异性基因(诸如酪蛋白或β乳球蛋白)的启动子和增强子可操作地连接的ECD。

可通过取决于细胞宿主类型的方法将含有目的DNA片段的载体转移到宿主细胞中。例如，氯化钙转染通常用于原核细胞，而磷酸钙处理、电穿孔、脂质转染、基因枪或基于病毒的转染可用于其他细胞宿主。用于转化哺乳动物细胞的其他方法包括使用聚凝胺、原生质体融合、脂质体、电穿孔和显微注射。为了产生转基因动物，可将转基因显微注射到受精的卵母细胞中或可整合到胚胎干细胞的基因组中，并将此类细胞的核转移到去核卵母细胞中。

在将编码抗体重链和轻链的载体引入细胞培养物中后，可针对无血清培养基中的生长生产率和产物质量筛选细胞库。然后可对产量最高的细胞库进行基于FACS的单细胞克隆以产生单克隆系。可使用高于50pg或100pg/细胞/天的比生产率，其对应于大于7.5g/L培养物的产物滴度。还可测试由单细胞克隆产生的抗体的浊度、过滤特性、PAGE、IEF、UV扫描、HP-SEC、碳水化合物-低聚糖作图、质谱和结合测定，诸如ELISA或Biacore。然后可将所选择的克隆储存在多个小瓶中并冷冻储存以供后续使用。

一旦表达，就可根据本领域的标准程序纯化多特异性药剂，包括蛋白质A捕获、HPLC纯化、柱色谱、凝胶电泳等(一般参见Scopes，Protein Purification(Springer-Verlag,NY,1982))。

可采用商业生产抗体或Fc融合蛋白的方法，包括密码子优化、启动子选择、转录元件选择、终止子选择、无血清单细胞克隆、细胞建库、用于扩增拷贝数的选择标记、CHO终止子或蛋白质滴度改善(参见例如，US 5,786,464；US 6,114,148；US 6,063,598；US 7,569,339；W02004/050884；W02008/012142；W02008/012142；W02005/019442；W02008/107388；W02009/027471；和US 5,888,809)。

VII.核酸

本发明还提供了编码上述抗体或ECD链中的任一者的核酸。任选地，此类核酸还编码信号肽并且可与连接至恒定区的信号肽一起表达。核酸的编码序列可与调控序列可操作地连接以确保编码序列的表达，诸如启动子、增强子、核糖体结合位点、转录终止信号等。编码重链和轻链或ECD的核酸可以分离形式存在或可克隆到一个或多个载体中。核酸可通过例如重叠寡核苷酸的固态合成或PCR来合成。编码重链和轻链的核酸可例如在表达载体内作为一个连续核酸连接，或者可为单独的，例如各自克隆到其自身的表达载体中。

VIII.治疗方法和药物组合物

本发明的多特异性药剂可用于治疗癌症。一些癌症具有同时表达多特异性药剂的靶标(诸如CD24和CD47)中的每一者的细胞。然而，一些针对例如SIRPα和siglec-10的多特异性药剂也可用于促进表达SIRPα和siglec-10的效应细胞针对癌细胞的作用。多特异性药剂可用于治疗实体瘤和血液恶性肿瘤。血液恶性肿瘤包括白血病(例如，急性或慢性髓细胞或骨髓性白血病、急性淋巴母细胞或淋巴细胞性白血病)、淋巴瘤(霍奇金或非霍奇金)或多发性骨髓瘤。实体瘤癌症、肉瘤、腺癌。实体瘤可发生在皮肤(例如，黑素瘤)、卵巢、子宫内膜、肾、肝脏、胰腺、膀胱、乳腺、卵巢、前列腺、直肠、结肠、胃、肠、胰腺、肺、胸腺、甲状腺、肾、脑、骨中。显示比匹配的正常组织更高的CD24表达的癌症的示例包括宫颈鳞状细胞癌、胆管癌、肾乳头状细胞癌、肝细胞癌、肺腺癌、肺鳞状细胞癌、嗜铬细胞瘤和副神经节瘤和子宫体子宫内膜癌。几种淋巴瘤还显示比组织匹配的非癌细胞(包括弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL))更高的CD24表达，其中siglec-1也上调。以高于正常组织的水平表达CD47的癌症的示例包括白血病(例如，急性髓细胞白血病(AML)和急性淋巴母细胞白血病(ALL)，以及实体瘤癌症，例如乳腺癌、膀胱癌、结肠癌、卵巢癌、成胶质细胞瘤、平滑肌肉瘤和头颈部鳞状细胞癌。

多特异性药剂以有效方案施用，意指延迟病症的发作、降低其严重程度、抑制其进一步恶化和/或改善其至少一种体征或症状的剂量、施用途径和施用频率。如果受试者已患有障碍，则该方案可被称为治疗有效方案。如果受试者相对于一般人群处于病症的高风险但尚未经历症状，则该方案可被称为预防有效方案。在一些情况下，相对于同一受试者的历史对照或过去经验，可在个体受试者中观察到治疗性或预防性功效。在其他情况下，治疗性或预防性功效可在临床前或临床试验中在治疗的受试者群体中相对于未治疗的受试者的对照群体来展示。

优选地，多特异性药剂与其单独的组分结合臂相比，表现出针对癌症的至少加和性和更优选的协同活性。优选地定量评估协同作用，如Tallarida，Genes Cancer，2011年11月；2(11):1003–1008中所讨论的。优选地，多特异性药剂还表现出与其组分结合臂的混合物相比增加的活性，这些组分结合臂各自与多特异性药剂等摩尔浓度。此类活性可测量为例如在表达多特异性药剂的反受体的免疫细胞的存在下针对表达由多特异性药剂的臂特异性结合的“别吃我”受体的癌症细胞或受感染细胞的细胞毒性。

多特异性药剂的示例性剂量为0.01mg/kg体重-20mg/kg体重、或0.5mg/kg体重-5mg/kg体重、或0.01mg/kg体重-1mg/kg体重、或0.01mg/kg体重-0.5mg/kg体重或0.05mg/kg体重-0.5mg/kg体重(例如0.1mg/kg、0.5mg/kg、1mg/kg、2mg/kg、3mg/kg、4mg/kg或5mg/kg)或10mg-1500mg作为固定剂量。剂量取决于患者的状况和对先前治疗的响应(如果有的话)、治疗是预防性的还是治疗性的以及障碍是急性的还是慢性的等因素。

施用可以是肠胃外、静脉内、口服、皮下、动脉内、颅内、鞘内、腹膜内、局部、鼻内或肌内。优选地通过静脉内或皮下施用而施用到体循环中。静脉内施用可例如通过在诸如30分钟-90分钟的时间段内输注来进行。

施用频率取决于多特异性药剂在循环中的半衰期、受试者的状况和施用途径等因素。频率可以是每天、每周、每月、每季度或响应于患者状况的变化或所治疗障碍的进展的不规则间隔。静脉内施用的示例性频率在连续原因的治疗内介于每周和每季度之间，但更多或更少频率的给药也是可能的。对于皮下施用，示例性的给药频率是每天至每月，但更多或更少频率的给药也是可能的。

施用的剂量数取决于障碍是急性还是慢性的以及障碍对治疗的响应。对于急性障碍或慢性障碍的急性恶化，介于1和10之间的剂量通常是足够的。有时单次推注剂量，任选地为分开的形式，对于急性障碍或慢性障碍的急性恶化是足够的。对于急性障碍的复发或急性恶化，可重复治疗。对于慢性障碍，多特异性药剂可以规则的间隔施用，例如每周、每两周、每月、每季度、每六个月施用，持续至少1年、5年或10年、或受试者的寿命。

药物组合物优选地适于肠胃外施用于人(例如，根据FDA的标准)。用于肠胃外施用的药物组合物优选是无菌且基本上等渗的，并且在GMP条件下制造。药物组合物可以单位剂型(即，单次施用的剂量)提供。药物组合物可使用一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂或助剂来配制。药学上可接受的意指适于人施用，例如FDA批准或可批准的。制剂取决于所选择的施用途径。对于注射，可将抗体配制在水溶液中，优选地在生理相容性缓冲液诸如汉克氏溶液、林格氏液或生理盐水或乙酸盐缓冲液中(以减少注射部位处的不适)。溶液可含有配制剂，诸如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。另选地，抗体可为在使用前用合适的媒介物(例如，不含热原的无菌水)重构的冻干形式。

用本发明的多特异性药剂的治疗可与有效对抗所治疗障碍的其他治疗组合。当用于治疗癌症时，多特异性药剂可与化疗、放射、干细胞治疗、手术或用其他生物制剂诸如针对HER2抗原的Herceptin^TM(曲妥珠单抗)、针对VEGF的Avastin^TM(贝伐珠单抗)、或对EGF受体的抗体诸如(Erbitux^TM、西妥昔单抗)和Vectibix^TM(帕尼单抗)的治疗组合。化疗药剂包括苯丁酸氮芥、环磷酰胺或美法仑、卡铂、柔红霉素、多柔比星、伊达比星和米托蒽醌、甲氨蝶呤、氟达拉滨和阿糖胞苷、依托泊苷或拓扑替康、长春新碱和长春碱。

IX.其他方法

本发明的多特异性药剂也可用于诊断、预后和实验室方法。它们可用于测量由癌症表达的或在患有癌症的患者的循环系统中的抗原的水平，以确定该水平是否是可测量的或甚至升高的，并且因此追踪和指导癌症的治疗，因为与可测量的或升高的抗原水平相关联的癌症最易受用包含与癌症结合的臂的多特异性药剂治疗的影响。多特异性药剂可用于ELISA测定、放射免疫测定或免疫组织化学等。多特异性药剂可用荧光分子、自旋标记分子、酶或放射性同位素标记，并且可以具有进行测定的所有必需试剂的试剂盒的形式提供。

上文或下文引用的所有专利文件、网站、其他出版物、登录号等全文以引用方式并入以用于所有目的，其程度如同每个单独的项目被具体地和单独地指出以引用方式并入一样。如果序列的不同版本在不同时间与登录号相关联，则意指与本申请的有效提交日期的登录号相关联的版本。有效提交日期意指实际提交日期或在适用的情况下参考登录号的优先权申请的提交日期中的较早者。同样，如果出版物、网站等的不同版本在不同时间公布，则除非另外指明，否则意指在本申请的有效提交日期最近公布的版本。除非另外特别指明，否则本发明的任何特征、步骤、元件、实施方案或方面可与任何其他特征、步骤、元件、实施方案或方面组合使用。虽然为了清楚和理解的目的已通过举例说明和示例的方式较详细地描述了本发明，但显而易见的是，可在所附权利要求书的范围内实施某些变化和修改。

实施例

实施例1：CD24和siglec-10的表达

本实施例比较了与匹配的非癌组织相比的在各种组织的癌症中的CD24表达。CD24在癌症中相对于正常组织的最高差异表达可见于宫颈鳞状细胞癌、胆管癌、肾乳头状细胞癌、肝细胞癌、肺腺癌、肺鳞状细胞癌、嗜铬细胞瘤和副神经节瘤、子宫体子宫内膜癌(图1)。CD24也在若干淋巴瘤尤其是CLL、DLCSBL、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤和PMBCL中以不同水平表达(图2)。siglec-10的表达主要发生在正常受试者的造血细胞和淋巴组织中。siglec-10在几种癌症特别是DLBCL中差异表达(图3)。

实施例2：图4和图5示出了由各种抗体诱导的癌细胞的巨噬细胞吞噬。5F9是针对CD47的单克隆抗体。ML5(Novus)、SN3和SN3B(Thermo Fisher)以及SC20(Uchid，PNAS 97,14720(2000))是针对CD24的抗体。

序列表

<110> 四十七公司

MCCAMISH, MARK

V0LKMER, JENS-PETER

<120> 用于治疗癌症的多特异性药剂

<130> 063673-544571

<150> US 62/824,213

<151> 2019-03-26

<160> 12

<170> FastSEQ适用于Windows 4.0版本

<210> 1

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 5F9重链CDR1

<400> 1

Asn Tyr Asn Met His

1 5

<210> 2

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 5F9重链CDR2

<400> 2

Thr Ile Tyr Pro Gly Asn Asp Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys

1 5 10 15

Asp

<210> 3

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 5F9重链CDR3

<400> 3

Gly Gly Tyr Arg Ala Met Asp Tyr

1 5

<210> 4

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 5F9轻链CDR1

<400> 4

Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val Tyr Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Gly

1 5 10 15

<210> 5

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 5F9轻链CDR2

<400> 5

Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser

1 5

<210> 6

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 5F9轻链CDR3

<400> 6

Phe Gln Gly Ser His Val Pro Tyr Thr

1 5

<210> 7

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人源化抗体hu5F9-vh1

<400> 7

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Thr Ile Tyr Pro Gly Asn Asp Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Gly Tyr Arg Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 8

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人源化抗体hu5F9-vh2

<400> 8

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Thr Ile Tyr Pro Gly Asn Asp Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Asp Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Gly Tyr Arg Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 9

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人源化抗体hu5F9-vh3

<400> 9

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Thr Ile Tyr Pro Gly Asn Asp Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Asp Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ala Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Gly Tyr Arg Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 10

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人源化抗体hu5F9-vl1

<400> 10

Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val Tyr Ser

20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Gly Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr His Cys Phe Gln Gly

85 90 95

Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 11

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人源化抗体hu5F9-vl2

<400> 11

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val Tyr Ser

20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Gly Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly

85 90 95

Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 12

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人源化抗体hu5F9-vl3

<400> 12

Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val Tyr Ser

20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Gly Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr His Cys Phe Gln Gly

85 90 95

Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

Claims (32)

1.一种多特异性药剂，所述多特异性药剂包含特异性结合CD47的第一结合臂和特异性结合CD24的第二结合臂。

2.根据权利要求1所述的多特异性药剂，其中所述第一结合臂拮抗CD47与SIRPα的结合，并且所述第二结合臂拮抗CD24与siglec-10的结合。

3.根据任一前述权利要求所述的多特异性药剂，其中所述第一结合臂是抗体VH-VL对或SIRPα胞外结构域，并且所述第二结合臂是抗体VH-VL对或siglec-10胞外结构域。

4.根据任一前述权利要求所述的多特异性药剂，所述多特异性药剂具有单个第一结合臂和单个第二结合臂。

5.根据权利要求1至3中任一项所述的多特异性药剂，所述多特异性药剂具有第一结合臂的两个拷贝和第二结合臂的两个拷贝。

6.根据任一前述权利要求所述的多特异性药剂，所述多特异性药剂还包含特异性结合癌症抗原的第三结合臂。

7.根据权利要求6所述的多特异性药剂，其中所述癌症抗原是CD20。

8.根据任一前述权利要求所述的多特异性药剂，其中所述第一结合臂和所述第二结合臂对CD47和CD24的亲和力彼此在四倍以内。

9.根据权利要求1至7中任一项所述的多特异性药剂，其中所述第二结合臂对CD24的亲和力比所述第一结合臂对CD47的亲和力高至少五倍。

10.根据任一前述权利要求所述的多特异性药剂，所述多特异性药剂还包含Fc结构域。

11.根据权利要求10所述的多特异性药剂，其中所述Fc结构域是人IgG4同种型。

12.根据权利要求10所述的多特异性药剂，其中所述Fc结构域是人IgG1或IgG4同种型。

13.根据权利要求10所述的多特异性药剂，所述多特异性药剂是经突变以降低效应子功能的人IgG1同种型。

14.一种治疗患有癌症的患者的方法，所述方法包括向所述患者施用根据任一前述权利要求所述的多特异性药剂。

15.根据权利要求14所述的方法，其中所述癌症表达CD24和CD47。

16.根据权利要求13或15所述的方法，其中所述多特异性药剂还包含特异性结合癌症抗原的第三结合臂，其中所述癌症表达癌症特异性抗原。

17.根据权利要求14至16中任一项所述的方法，其中所述癌症是腺癌。

18.根据权利要求14至16中任一项所述的方法，其中所述癌症是淋巴瘤。

19.根据权利要求14至18中任一项所述的方法，所述方法还包括检测CD24和CD47在所述癌症的细胞上的表达。

20.一种多特异性药剂，所述多特异性药剂包含特异性结合SIRPα的第一结合臂和特异性结合siglec-10的第二结合臂。

21.根据权利要求20所述的多特异性药剂，其中所述第一结合臂拮抗CD47与SIRPα的结合，并且所述第二结合臂拮抗CD24与siglec-10的结合。

22.根据权利要求20或21所述的多特异性药剂，其中所述第一结合臂是抗体VH-VL对或SIRPα胞外结构域，并且所述第二结合臂是抗体VH-VL对或siglec-10结合结构域。

23.根据权利要求20至22中任一项所述的多特异性药剂，所述多特异性药剂具有单个第一结合臂和单个第二结合臂。

24.根据权利要求20至22中任一项所述的多特异性药剂，所述多特异性药剂具有第一结合臂的两个拷贝和第二结合臂的两个拷贝。

25.根据权利要求20至24中任一项所述的多特异性药剂，其中所述第一结合臂和所述第二结合臂对SIRPα和siglec-10的亲和力彼此在四倍以内。

26.根据权利要求20至24中任一项所述的多特异性药剂，其中所述第二结合臂对siglec-10的亲和力比所述第一结合臂对SIRPα的亲和力高至少五倍。

27.根据权利要求20至27中任一项所述的多特异性药剂，所述多特异性药剂还包含Fc结构域。

28.根据权利要求27所述的多特异性药剂，其中所述Fc结构域是人IgG4同种型。

29.根据权利要求27所述的多特异性药剂，其中所述Fc结构域是人IgG1或IgG4同种型。

30.根据权利要求27所述的多特异性药剂，其中所述Fc结构域是经突变以降低效应子功能的人IgG1同种型。

31.一种治疗患有癌症的患者的方法，所述方法包括向所述患者施用根据权利要求20至30中任一项所述的多特异性药剂。

32.根据权利要求31所述的方法，其中所述多特异性药剂还包含特异性结合癌症抗原的第三结合臂，其中所述癌症表达所述癌症特异性抗原。

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