JP2675380B2 - 組換ｄｎａ産物及び方法 - Google Patents

組換ｄｎａ産物及び方法

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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ヒンジ領域中に変更された数のシステイン
残基を有する変更された抗体分子（altered antibody m
olecule;AAM）、及び組換DNA技法を用いるその製造方法
に関する。
本出願において： 「MAb」なる語はモノクローナル抗体を示すために用
いられ； 「組換抗体分子」（RAM）なる語は、組換DNA技法を用
いる任意の方法により生産される抗体を記載するために
用いられ、天然免疫グロブリンの任意の類似体又はその
断片を包含し；そして 「ヒト化抗体分子」（humanised antibody molecule;
HAM）なる語は、ヒト以外の種の免疫グロブリンに由来
する抗原結合部位を有し、分子の残りの免疫グロブリン
由来部分がヒトの免疫グロブリンに由来する分子を記載
するために用いられる。該抗原活性部位は定常ドメイン
に融合した完全な可変ドメインであってもよく、又は可
変ドメイン中の適切なフレームワーク領域に移植された
（grafted）相補性決定領域（complementarity determi
ning region;CDR）のみであってもよい。
本明細書において、多くの刊行物に番号をもって言及
する。これらの刊行物は本明細書の末尾に番号順に記載
する。
天然免疫グロブリンは多年にわたり、その種々の断
片、例えばFab,（Fab′）２及びFc断片、を有するもの
として知られており、これらは酵素的開裂により誘導さ
れ得る。天然免疫グロブリンは一般に各アームの末端に
抗原結合部位を有するＹ形天然免疫グロブリン及びその
断片は診断において、そしてより限定された範囲では治
療において使用されている。しかしながら、この様な使
用、特に治療における使用は、天然免疫グロブリンのポ
リクローナル性により障害されている。療法例として免
疫グロブリン可能性の実現への有意な段階は定義された
抗原特異性のモノクローナル抗体の発見であった
（１）。ほとんどのMAbは齧歯動物の脾細胞と齧歯動物
の骨髄腫細胞との混合により生産される。従ってこれら
は本質的に齧歯動物MAbである。ヒトMAbの生産の報告は
ほとんど無い。
ヒトにおいて抗原性の低い非−ヒトMAbを製造する提
案がなされている。この様な技法を一般にMAbを「ヒト
化する」（humanize）と称することができる。これらの
技法は一般に抗体分子のポリペプチド鎖をコードするDN
A配列を操作する組換DNA技法の使用を含む。
この様な方法を実施するための幾つかの初期の方法が
EP−Ａ−0 171 496（Res.Dev.Corp.日本）、EP−Ａ−0
173 494（スタンフォード大学）、EP−Ａ−0 194 276
（セルテック・リミテッド）、及びWO−Ａ−8 702 671
（Int.Gen.Eng.Inc.）に記載されている。
EP−Ａ−87302620.7（Winter）に記載されている他の
方法において、マウスMAbの相補性決定領域（CDR）が、
長いオリゴヌクレオチドを用いる部位特定変異誘発によ
りヒト免疫グロブリンの可変ドメインのフレームワーク
領域に移植（graft）された。
免疫グロブリン、そして特にMAbが癌の診断及び治療
において潜在的に非常に有用であり得ることが広く示唆
されている（2,3）。従って、癌特異抗原に対して向け
られた免疫グロブリン又はMAbの製造を試みる多くの活
動が存在する。今まで、種々のヒト癌に対して向けられ
た100を超えるMAbが腫瘍の診断又は治療の種々の観点に
おいて使用されている（４）。
本発明者らの同時に出願された出願No.（PA149）に
は、可変ドメインの少なくとも相補性決定領域（CDR）
がマウスモノクローナル抗体B72.3（B72.3MAb）に由来
しそしてHAMの残りの免疫グロブリン由来部分がヒト免
疫グロブリンに由来する。抗原結合部位を有するヒト化
抗体分子（HAM）、及びその製造方法が記載されてい
る。
B72.3MAbは、乳癌のヒト肝臓転移癌の膜富化抽出物に
対して生じたIgG1−カッパー型のマウスMAbである
（５）。B72.3MAbは多数の研究室において広範に研究さ
れている。このものは、分子量約106のムチン（mucin）
様分子である腫瘍関連糖蛋白質TAG−72を認識すること
が示されている（６）。免疫組織化学的研究が示すとこ
ろによれば、B72.3MAbは直腸結腸癌の約90％、乳癌の85
％及び卵巣癌の95％を認識する。しかしながら、それは
広範囲の正常ヒト組織と交叉反応性を示さない（７〜1
0）。
療法剤又は診断剤としての免疫グロブリン分子の効力
を増加せしめるため、それにエフェクター又はレポター
分子を共有結合により連結すべきことが提案されてい
る。しかしながら、これは常に実施できるとは限らな
い。例えば、結合の可能性ある部位はチオール基であ
る。チオール基は蛋白質中にシステイン残基として自然
に存在する。しかしながら、この様な残基は比較的に一
般的ではなく、しばしば分子の内側に存在しそしてしば
しば蛋白質分子内又は蛋白質分子間のジスフィルド橋の
形成に関与する。従って、もし天然に存在するシステイ
ン残基を結合の部位として使用すれば蛋白質の正常なフ
ォルディング及び安定化が妨害されるであろうという危
険が存在する。
従って、蛋白質分子上の他の側鎖を修飾してチオール
基を生成せしめることが提案されている。例えば、リジ
ン残基を化学的に修飾してそれらの側鎖上にチオール基
を生成せしめることができる。しかしながらこの方法
は、多数の又はすべてのこの様な利用可能なリジン残基
上にチオール基を生成せしめるであろう。従って、多数
の可能性のある結合部位が存在し、このため結合がどこ
に生ずるかをあらがじめ決定することが不可能となるで
あろう。さらに、多数の結合は蛋白質の生物学的活性を
妨害するであろう。さらに、多数の余分なチオール基の
ため、新たなチオール基が鎖間又は鎖内ジスルフィド結
合を形成し、この結合が蛋白質のコンフィグレーション
及び機能を変化せしめる可能性がある。
さらに、免疫グロブリンの炭水化物成分の特異的標識
化によりエファクター又はレポーター分子を付加するこ
とが提案されている（11）。これは一般に、糖残基の過
ヨウ素酸酸化により活性アルデヒドを生成せしめること
を含む。しかしながら、この方法は、蛋白質鎖中のアミ
ノ酸を酸化が変形せしめるという点で不利である。例え
ば、メチオニン残基は容易に酸化される。さらに、炭水
化物成分はすべて免疫グロブリン分子のFc部分に位置す
る。従って、Fab又は（Fab′）２を標識するためにこの
方法を用いることは不可能である。
従って、エフェクター又はレポーター分子を免疫グロ
ブリン分子に再現性よく且つ効果的に、部位特異的に結
合せしめることができる方法を抵抗することが望ましい
であろう。
本発明の第一の観点に従えば、分子上の表面ポケット
中の残基をシステイン残基に変えることによって該表面
ポケット中にチオール基が導入されている変更された抗
体分子を提供する。
あらゆる蛋白質分子がその自然状態において折りたた
まれたコンフィグレーションを採用することは当業者に
より理解されよう。従って、幾つかのアミノ酸残基の側
鎖は折りたたまれた蛋白質の内側にあり、そして幾つか
は外側にある。外側にあるものの内幾つかは凸状表面上
に位置し、幾かは平な表面上に位置し、そして幾つかは
凹状表面上に位置する。凹状表面はポケットとしても記
載される。
平らな又は凸状の表面上の残基の側鎖はおそらく蛋白
質の残りの部分上に突出していると、当業者は認識する
であろう。従って、この様な残基がシステイン残基に変
えられたならそのチオール基はエフェクター又はレポー
ター分子への結合のために利用可能であると予想されよ
う。驚くべきことに、そしてこの予想に反して、チオー
ル基がこの様な部位に導入された場合それらはその様な
結合のために利用されないことが見出された。さらに、
ポケット中のアミノ酸上の側鎖として導入されたチオー
ル基はその様な結合のために利用可能でないと予想され
よう。しかしながら、驚くべきことに、そしてこの予想
に反して、この様なチオール基は利用可能であり、そし
て抗体分子にエフェクター及びレポーター分子を結合せ
しめるために使用され得ることが見出された。さらに、
この様なチオール基の導入が蛋白質の巨大分子構造を大
きく変化せしめることが予想された。再び、驚くべき且
つ予想外のことには、それは起こらないことが見出され
る。
本発明の変更された抗体分子は、完全な長さの重鎖及
び軽鎖を有する完全な抗体分子；その断片、例えばFab
断片又は（Fab′）２断片；あるいは軽鎖又は重鎖の二
量体を含むことができる。但し、特定の部位に導入され
ており且つ結合のために利用可能なチオール基をこの様
な分子が有することを条件とする。
この発明に関して、「結合する」（bonding）とは、
システイン残基のチオール基に共有結合を形成すること
を意味する。
変更された抗体分子は常用のペプチド合成によって製
造することができることが予想される。しかしながら、
変更された抗体分子を組換DNA技法により製造するのが
好ましい。
本発明の第二の観点に従えば、組換抗体分子の１つの
鎖の結合能力を換えるための方法が提案され、この方法
は、 （１）前記１つの鎖をコードするオペロンを含有するが
しかし該鎖の表面ポケット中に位置するあらかじめ選択
されたアミノ酸残基をコードする配列がシステイン残基
をコードする配列に変えられている発現ベクターを生成
せしめる； ことを含んで成る。
所望により、単一のポリペプチド鎖中の２個以上のア
ミノ酸残基を変えることができ、あるいは２本の鎖のそ
れぞれに存在する１個又は複数個のアミノ酸残基を変え
ることができる。
好ましくは、配列の変更は部位特異的変異誘発によっ
て行われる。
本発明のこの観点の本質的特徴は、変更されるべきア
ミノ酸残基の位置の事前選択である。エフェクター又は
レポーター分子をRAMに結合せしめる（attach）ことを
可能にするためにシステイン残基の側鎖としてチオール
基を導入することが望ましいから、次のことが望まし
い。
（ｉ）変更されるべきアミノ酸の側鎖はシステイン残基
に類似する大きさを有すべきであり； （ii）変更されるべき残基との鎖内水素結合が存在せ
ず； （iii）システイン残基と共に生成するかもしれない鎖
内水素結合が存在せず； （iv）該チオール基は、RAMの他の部分と相互作用すべ
きではなく、又は該部分により隠されるべきではなく；
そして （ｖ）該システイン残基は小分子、例えべ直径約0.13nm
の分子によってのみ接近されることができそしてより大
きなサイズの分子、例えば直径0.5nmより大きい分子に
よっては接近され得ない。従って、システイン残基はエ
フェクター又はレポーター分子への結合のためにのみ利
用可能であり、そして同一の鎖又は他の鎖上の類似のシ
ステイン残基への結合のためには利用可能でない。
最初の３つの条件は、新たなアミノ酸残基への変更が
RAMのコンホーメーション及び安定性になんらの不都合
な効果を有しないことを可能な限り保証するであろう。
第二の２つの規準は、チオール基がエフェクター又はレ
ポーター分子のみへの結合のために利用可能でありそし
て他の同様に変異された鎖への結合のためには利用可能
でなく、従ってジスルフィド結合による架橋を回避する
ことを可能な限り保証する。（ｉ）の要件を満足する残
基はスレオニン及びセリンを包含する。従って、変更さ
れる残基は免疫グロブリン分子の表面ポケット中のセリ
ン又はスレオニン残基である。
この様な変更を行うための好ましい部位はCH1ドメイ
ンである。なぜなら、ここでの変更及びここへの分子の
結合は抗原の結合、及び変更された抗体分子のFc部分
（もし存在するとすれば）のエフェクター機能を妨害し
ないらしいからである。好ましくは、変更されるCH1ド
メイン中の残基はSer156又はThr173〔Kabat（14）に記
載されている番号付与系による〕である。しかしなが
ら、変更のための好ましい部位は抗体分子の任意のドメ
イン中に見出し得る。
好ましくは、本発明の第二の観点の方法は、 （ｂ）前記ベクターによりセルラインをトランスフェク
トし、；そして （ｃ）該トランスフェクトされたセルラインを培養して
結合能力の変化した組換抗体分子を生産せしめる；段階
を含んで成る。
所望により、変更されるべき抗体は、前記の方法のい
ずれかにより製造される「ヒト化された」（humanise
d）抗体である。
本発明の第二の観点の方法において、ベクターが単一
の抗体ポリペプチド鎖のみをコードする場合、この方法
の生成物は二量体分子であろう。天然免疫グロブリンの
様に四量体分子が要求される場合、２つの代替可能な方
策の１つを用いることができる。
第一の方法においては、セルラインをさらに第二のベ
クターにより形質導入し、第一のベクターは重鎖由来の
ポリペプチドをコードしそして第二のベクターは相補的
軽鎖由来のポリペプチドをコードする。好ましくは、各
ポリペプチドが同程度に発現されることを可能な限り保
証するために、コード配列及び選択マーカーに関する場
合を除き、ベクターは同一である。
第二の方法においては、相補的軽鎖由来のポリペプチ
ド及び重鎖由来のポリペプチドをコードする配列を含
む。
ベクターが重鎖ポリペプチドのみをコードする場合、
相補的軽鎖を天然に分泌する宿主細胞を用いることによ
り組換抗体分子を製造することが可能である。
本発明はまた、本発明の方法において使用されるクロ
ーニングベクター及び発現ベクター並びに形質導入され
たセルライン、本発明の変更された分子を含んで成る療
法用及び診断片組成物、並びに療法及び診断におけるこ
の様な組成物の使用を含む。
レポーター又はエフェクター分子は変更された抗体分
子に任意の常法により結合せしめることができる。例え
ば、放射能標識を抗体に結合せしめる方法は本発明者等
の先の英国特許出願No.8800843及びNo.8812257に記載さ
れている。
ベクターを作製するための一般的方法、形質導入法、
及び培養方法はそれ自体よく知られており、そして本発
明の部分を構成しない。これらの方法は例えば参照文献
（12）及び（13）において示されている。
本発明をここに、例により、添付図面を言及しながら
記載する。これらの図は、ヒト化B72.3抗体分子のB72.3
HAM CH1ドメインのDNA及びアミノ酸配列を、部位特定変
異誘発のために使用される８種類のオリゴヌクレオチド
プライマーの配列と共に示している。
上に言及した本発明者らの係属中の出願No.（PA149）
において、種々のIgG重鎖ドメインを有するヒト化B72.3
MAbの製造が記載されている。その出願はまた、ヒト化B
72.3 F（ab′）２断片の製造を示している。本発明書で
後記する結果は、該係属中の出願に示されているような
ヒト化B72.3MAbの使用により得られた。
ヒト化B72.3分子のCH1ドメインのヌクレオチド配列及
びアミノ酸配列は図に示されており、今これに言及す
る。ヒト化B72.3抗体分子が共有結合を介してエフェク
ター又はレポーター分子に結合されることを可能にする
ために、表面ポケット中に位置しそして前に（ｉ）〜
（ｖ）として記載した規準を満足させるセリン又はスレ
オニン残基の探索を行った。比較のため、すべての規準
に合致しない他のセリン又はスレオニン残基をも選択し
た。
B72.3分子のCH1ドメインはヒト抗体KOLのそれとかな
りの配列相同性を示す。KOL抗体はKabat等（14）により
記載されている。KOL抗体の結晶構造はＸ−線結晶写真
（crystal−lography）により決定されている。必要な
アミノ酸置換を行うため、KOL CH1ドメインの構造に基
いてB72.3CH1ドメインの構造を推定することが可能であ
る。
この推定に基いて多くのセリン残基及びスレオニン残
基を選択した。すべてがヒト化B72.3分子の表面上に位
置することが推定されたが、しかしながら幾つかはポケ
ット中にあり、幾つかは平らな表面上にあり、そして幾
つかは凸状表面上にあることが推定された。標的残基は
Thr153,Ser156,Ser163,Thr167,Ser168,Thr173,Thr205、
及びThr217と同定された。ここで用いられる番号付与は
Kabat等（14）により記載されているそれに相当する。
ギャップド−デュプレックス（gapped−duplex）法
（15）に従う部位特定変異誘発実験において使用するた
めのオリゴヌクレオチドプライマーを調製した。これら
は図に示してある。各場合において、上記のスレオニン
残基又はセリン残基の１つをシステイン残基に変えるよ
うに設計された。ここで変更されたDNAベクターを生成
せしめ、そしてチェインターミネーション法（16）によ
り配列決定した。
次に、すべての変更された遺伝子断片を、哺乳類細胞
系で発現のためにプラスミドPEE6.HCMV（17）に再クロ
ーン化した。このプラスミドはヒト・サイトメガロウイ
ルスからの強力なプロモーター／エンハンサー転写制御
要素を含有する（17）。もとの８個の提案されたシステ
イン変異体の内５個、すなわちNo.1,3,4,6、及び７をこ
の段階で採用した。
変更されたヒト化B72.3抗体の合成及び集成をCOS細胞
での一時的（transient）発現により分析した（17）。
５種類の重鎖変異体遺伝子のそれぞれを、ヒト化B72.3
軽鎖遺伝子と共に該細胞にトランスフェクトした。細胞
上清をELISA測定を用いてB72.3抗原結合活性について測
定した。免疫グロブリンの分泌及び集成をさらに、トラ
ンスフェクトされたCOS細胞の生合成標識化及び免疫沈
澱により評価した。両タイプの分析の結果が示すところ
によれば、５種類すべてのチオール変異体遺伝子が十分
に集成された４量体抗体分子を生産し、その抗原結合性
は変更されていないヒト化B72.3分子と区別できなかっ
た。どの変異体も凝集した分子を生成しないようであっ
た。
この一時的発現系は、さらに詳細な生化学的特徴付け
のために十分な量の抗体を生産しなかった。従って、変
更されたB72.3抗体を発現する安定なセルラインを樹立
した。変異体重鎖遺伝子を、ヒト化B72.3軽鎖をすでに
生産するチャイニーズ・ハムスター卵巣（CHO）セルラ
インに、エレクトロポレーションによりトランスフェク
トした。トランスフェクトされたセルラインをpEE6.HCM
Vプラスミドに導入された薬剤耐性マーカーを用いて選
択し、そして変更されたB72.3抗体を生産する細胞をク
ローン化しそして拡張した。
組換抗体（変更されていないもの及びチオール変異体
の両者）をCHO細胞上清から、プロテインＡ−セファロ
ース上でのアフィニティークロマトグラフィーにより精
製しそして限外濾過により濃縮した。精製された抗体は
十分に集成されておりそして凝集していないことがSDS
−ポリアクリルアミドゲル電気泳動及びゲル濾過HPLCに
より示され、一時的発現の実験の結果が確認された。抗
原結合がELISAにより証明された。まとめると、これら
の結果が示すところによれば、重鎖CH1ドメインの表面
の単一システイン残基の置換は変更された抗体の合成、
集成、及び抗原結合活性に影響を与えなかった。分析さ
れたすべての変異体が同じ挙動を示したから、これは導
入されたチオール基の地理的位置とは無関係のようであ
る。
各免疫グロブリン分子は２本の重鎖を含有するから、
システインが還元型のままであれば変更された抗体は２
個の遊離チオールを有するはずである。表面システイン
の酸化還元状態を4,4′−ジチオジピリジンを用いるタ
イトレーション（titration）により測定した。抗体サ
ンプル（0.5mg/ml）を4,4′−ジチオピリジンに加え
（最終濃度0.5mM）、そして遊離チオール基との反応を3
24nmにおける吸光度の増加によりモニターした。結果を
下記の表に要約する。
変異体3.4及び７は、遊離チオールの数について、変
更されていないヒト化B72.3対照とおよそ同じ値を有
し、導入されたシステインが結合のために利用可能でな
いことを示している。これらは、同じようにして、例え
ば生体内又は生体外でのグルタチオーンとの反応により
ブロックされている可能性が最も高いと推定される。他
方、変異体１及び６は抗体分子当り少なくとも１個の遊
離チオール基に相当する、対照よる実質的に高い、タイ
トレーションレベルを与えた。これと、分子当り２個の
チオールの予想される値との喰い違いは、チオールの幾
らかの酸化が生じたことを示唆した。
しかしながら、この結果が示すところによれば、平ら
な表面（変異体４及び７）又は凸状表面（変異体３）に
存在する、すなわち比較的高い接解表面接近性を有す
る、システインは、それらのチオール基がブロックされ
ているらしく、そのため部位特異的結合のためには適当
でないようである。これに対して、ポケット部位に位置
する２個のシステインは抗体分子当り少なくとも１個の
遊離チオールの程度で結合のために利用可能な形態のま
まであった。
遊離チオール基を有することが示された変異体をエフ
ェクター又はレポーター分子の部位特異的結合のために
使用することができるか否かを調るため、チオール特異
的リンカーを合成した。チロシンアミド〔0.5M PIPES緩
衝液（pH6.8）中0.1mM）をＮ−サクシニミジル−３−マ
レイミドプロピオネート（1,4−ジオキサン中0.015mM）
と反応せしめることにより２−（３−Ｎ−マレイミジ
ル）−Ｎ−プロピルアミド−３−（４−ヒドロキシ）フ
ェニルプロパノアミドを得た。このリガンドをチロシン
マレイミドと称し、これを、クロラミンＴを用いて125
ヨウ素により標識した。この放射性化合物を逆相HPLCに
より精製した。チオール変異体の１つ（No.6）をヨウ素
化プローブと共にインキュベートした（pH5.5、室温に
て１時間）。標識された抗体を未導入リガンドからゲル
濾過又はプロテインＡ−セファロース沈澱により分離
し、そしてSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動／オ
ートラジオグラフィーにより分析した。ヒト化マウスB7
2.3及びハイブリドーマ由来マウスB72.3の両者を陰性対
照として含めた。
リジン残基にチオール基を非選択的に導入する２−イ
ミノチオランと反応したヒト化B72.5を標識化法のため
の陽性対照として使用した。この分析の結果は、予想通
り、チオール特異的リガンドであるチロシンマレイミド
がチオール変異体B72.3の重鎖のみを標識したことを示
した。これに対して、非特異的に、変形されたヒト化B7
2.3は重鎖及び軽鎖の両者上で標識され、そしてさらに
多数の凝集した分子を生じさせた。従って、部位特異的
に標識された抗体はより均一な生成物を生成した。
前記の方法が示すところによれば、システイン残基を
抗体分子の重鎖に、レポーター分子が該抗体分子に導入
されたチオールを介して部位特異的に結合され得るよう
な位置に、置換することができる。チオール基がエフェ
クター又はレポーター分子に効果的に結合することがで
きるためには、該チオール基は表面ポケットに導入され
なければならないことをそれは示している。
抗体分子の重鎖又は軽鎖の異るドメインに対して同じ
方法を行うことができることが予想されよう。適切なア
ミノ酸残基をその中に有する適当な表面ポケットが存在
することが必要なすべてである。
本発明は例示的にのみ上に記載され、そして本発明の
範囲を逸脱することなく詳細な点の変更を行うことがで
きることは明らかであろう。
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フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/577 Ｇ０１Ｎ 33/577 Ｂ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 アデアー，ジョン ロバート イギリス国，ハイ ワイクーム エイチ ピー14 ３アールエヌ，ストッケンチャ ーチ，ジョージ ロード 23 (72)発明者 ウィットル，ナイジェル リチャード イギリス国，サリー ケイティー11 ２ エルエフ，コブハム，リー ロード，５ (72)発明者 リヨンス，アラン ハワード イギリス国，メイドゥンヘッド エスエ ル６ ３エックスエヌ，ウッドランズ パーク，ビューモント クロス，15 (72)発明者 オーウェンズ，レイモンド ジョン イギリス国，オックスフォードシャイア アールジー９ １エスエイチ，ヘンリ ー‐オン‐テムズ，ハミルトン アベニ ュ 23

Claims (6)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】変更された抗体分子において、分子上の表
    面ポケット中のアミノ酸残基がシステイン残基に変えら
    れることにより該表面ポケット中にチオール基が導入さ
    れており、該システイン残基には直径が約0.13〜0.5nm
    の小分子のみが接近可能であり、そして該システイン残
    基はエフエクター又はレポーター分子に結合するために
    のみ利用可能であって同一の又は他の抗体鎖上のシステ
    イン残基への結合のためには利用できない、ことを特徴
    とする変更された抗体分子。
  2. 【請求項２】組換DNA技法により生産される請求項１に
    記載の変更された抗体分子。
  3. 【請求項３】完全な抗体分子、Fab断片、又はＦ（a
    b′）２断片である、請求項１又は２に記載の変更され
    た抗体分子。
  4. 【請求項４】前記変更がCH1ドメイン中に存在する、請
    求項１〜３のいずれか１項に記載の変更された抗体分
    子。
  5. 【請求項５】前記変更される残基がSer156又はThr173で
    ある、請求項４に記載の変更された抗体分子。
  6. 【請求項６】請求項１に記載の変更された抗体の製造方
    法であって、１つの免疫グロブリン鎖をコードするオペ
    ロンを含有する発現ベクターを製造する工程を含んで成
    り、ここで前記鎖の表面ポケット中に位置するあらかじ
    め選択されたアミノ酸残基をコードする配列が変更され
    ており、該変更された配列によりコードされたアミノ酸
    残基がシステイン残基である、ことを特徴とする方法。
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