JP3439195B2 - 抗原の定量的検出方法 - Google Patents
抗原の定量的検出方法Info
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Description
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は抗原の定量的検出方法に関し、より詳しく
は、荷電性アミノ酸残基を含むアミノ酸配列が付加さ
れ、発蛍光団色素で標識されており、且つ分析用試料に
含まれる抗原と免疫複合体を形成する等電点均一化Ｆａ
ｂ’抗体を用いた抗原の定量的検出方法に関する。
は、荷電性アミノ酸残基を含むアミノ酸配列が付加さ
れ、発蛍光団色素で標識されており、且つ分析用試料に
含まれる抗原と免疫複合体を形成する等電点均一化Ｆａ
ｂ’抗体を用いた抗原の定量的検出方法に関する。
背景技術
電荷を有する物質を電解質溶液に浮遊させて電圧を印
加すると、物質の電荷とは逆の電極へ向かって物質が移
動するという電気泳動の現象は、様々な物質の分離の手
段として広く利用されている。一般的な電気泳動は、一
定ｐＨの泳動用担体中で分析試料の泳動を行うものであ
るが、泳動担体にｐＨ勾配を持たせその担体中で試料の
電気泳動を行うという等電点電気泳動法が開発されて以
来、アミノ酸やタンパク質などの両性電解質の分離の手
段としてその用途が拡大してきている。
加すると、物質の電荷とは逆の電極へ向かって物質が移
動するという電気泳動の現象は、様々な物質の分離の手
段として広く利用されている。一般的な電気泳動は、一
定ｐＨの泳動用担体中で分析試料の泳動を行うものであ
るが、泳動担体にｐＨ勾配を持たせその担体中で試料の
電気泳動を行うという等電点電気泳動法が開発されて以
来、アミノ酸やタンパク質などの両性電解質の分離の手
段としてその用途が拡大してきている。
両性電解質は、等電点と呼ばれる、実効電荷がゼロと
なるようなｐＨ値を有する。等電点電気泳動法により両
性電解質試料の電気泳動を行うと、試料がある一定の位
置に濃縮されて静止するが、その位置は、泳動用担体中
のｐＨが試料の等電点と等しくなっている点である。そ
の際、試料は焦点的に濃縮されて分離されるので、等電
点電気泳動法は非常に高い分離能を有している。
なるようなｐＨ値を有する。等電点電気泳動法により両
性電解質試料の電気泳動を行うと、試料がある一定の位
置に濃縮されて静止するが、その位置は、泳動用担体中
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の際、試料は焦点的に濃縮されて分離されるので、等電
点電気泳動法は非常に高い分離能を有している。
また、近年、電気泳動を内径が数十μｍ、長さが数百
ｍｍ程度の毛細管（キャピラリー）の中で行なうキャピ
ラリー電気泳動法が考案され、微量な分析試料でも高い
分離能を有することから、タンパク質のみならず、無機
イオン、低分子化合物、核酸等の分離・分析に応用され
ている。キャピラリー電気泳動を行う際に、キャピラリ
ーの一端に検出器を装着し分離されてきた試料成分を検
出することにより、温度を定量化する試みもなされてい
る。
ｍｍ程度の毛細管（キャピラリー）の中で行なうキャピ
ラリー電気泳動法が考案され、微量な分析試料でも高い
分離能を有することから、タンパク質のみならず、無機
イオン、低分子化合物、核酸等の分離・分析に応用され
ている。キャピラリー電気泳動を行う際に、キャピラリ
ーの一端に検出器を装着し分離されてきた試料成分を検
出することにより、温度を定量化する試みもなされてい
る。
電気泳動により分離された試料の検出は、試料に紫外
光あるいは可視光を照射し吸収される光量の変化を測定
する紫外可視検出法が一般的であるが、さらに高感度な
検出方法として、あらかじめ分析試料を発蛍光団色素で
標識（蛍光標識）し分離された試料成分に、励起光を照
射して蛍光を発生させることで濃度を定量化する蛍光検
出法がある。
光あるいは可視光を照射し吸収される光量の変化を測定
する紫外可視検出法が一般的であるが、さらに高感度な
検出方法として、あらかじめ分析試料を発蛍光団色素で
標識（蛍光標識）し分離された試料成分に、励起光を照
射して蛍光を発生させることで濃度を定量化する蛍光検
出法がある。
上記の等電点電気泳動法とキャピラリー電気泳動法を
組み合わせ、さらに検出を蛍光検出法で行うことも可能
である（蛍光検出キャピラリー等電点電気泳動法)。す
なわち、ｐＨ勾配を有した泳動担体に含まれる蛍光標識
された試料をキャピラリー中で電気泳動させ、励起光を
照射して生じる蛍光を光検出器等で検出する。この方法
によれば、微量の試料であっても高精度の定量的検出が
可能であるため、タンパク質等の超高感度分析方法とし
て注目されている。
組み合わせ、さらに検出を蛍光検出法で行うことも可能
である（蛍光検出キャピラリー等電点電気泳動法)。す
なわち、ｐＨ勾配を有した泳動担体に含まれる蛍光標識
された試料をキャピラリー中で電気泳動させ、励起光を
照射して生じる蛍光を光検出器等で検出する。この方法
によれば、微量の試料であっても高精度の定量的検出が
可能であるため、タンパク質等の超高感度分析方法とし
て注目されている。
近年、生体内の微量成分を上記のような電気泳動法の
分析の対象物とする場合が増加している。このような分
析を行う場合は、生体内の微量成分と、該微量成分を抗
原として認識する抗体とを結合させ免疫複合体を形成さ
せて、該免疫複合体を検出することが行われる。高精度
の検出のためには免疫複合体が蛍光標識されていること
が好ましい。このとき、抗原もしくは抗体のいずれかが
蛍光標識されている必要があるが、抗原もしくは抗体を
一般的な標識方法により蛍光標識することは以下に述べ
る理由により好ましくない。
分析の対象物とする場合が増加している。このような分
析を行う場合は、生体内の微量成分と、該微量成分を抗
原として認識する抗体とを結合させ免疫複合体を形成さ
せて、該免疫複合体を検出することが行われる。高精度
の検出のためには免疫複合体が蛍光標識されていること
が好ましい。このとき、抗原もしくは抗体のいずれかが
蛍光標識されている必要があるが、抗原もしくは抗体を
一般的な標識方法により蛍光標識することは以下に述べ
る理由により好ましくない。
すなわち、抗原の多くと抗体はタンパク質からなって
おり、タンパク質のＮ末端のアミノ基およびリシン側鎖
のアミノ基の数とその解離状態は、タンパク質の等電点
を決める大きな要因となるので（続生化学実験講座２、
タンパク質の化学−上、日本生化学会、１９８７)、ア
ミノ基を利用して発蛍光団色素を化学結合させる一般的
な標識方法によれば、タンパク質自身の等電点が大きく
変化してしまう。
おり、タンパク質のＮ末端のアミノ基およびリシン側鎖
のアミノ基の数とその解離状態は、タンパク質の等電点
を決める大きな要因となるので（続生化学実験講座２、
タンパク質の化学−上、日本生化学会、１９８７)、ア
ミノ基を利用して発蛍光団色素を化学結合させる一般的
な標識方法によれば、タンパク質自身の等電点が大きく
変化してしまう。
また、タンパク質には蛍光標識物質と反応可能なアミ
ノ酸が多く存在するため、結合する蛍光標識物質の数と
位置が不特定となり、結果として、一つのタンパク質で
あるにもかかわらず複数の等電点を示す混合物となって
しまう。このため、等電点電気泳動で正確な分析をする
ことが困難となる。さらに、発蛍光団色素による標識の
ためタンパク質の３次構造が変化するために、タンパク
質自身の化学的安定性が悪くなるという問題もある。
ノ酸が多く存在するため、結合する蛍光標識物質の数と
位置が不特定となり、結果として、一つのタンパク質で
あるにもかかわらず複数の等電点を示す混合物となって
しまう。このため、等電点電気泳動で正確な分析をする
ことが困難となる。さらに、発蛍光団色素による標識の
ためタンパク質の３次構造が変化するために、タンパク
質自身の化学的安定性が悪くなるという問題もある。
検出に用いる抗体として、ハイブリドーマにより産出
させて得られた、分子量が均一なモノクローナル抗体を
用いた場合でも等電点電気泳動法で正確な分析ができな
い場合がある。これは、ハイブリドーマ産出の分子量が
均一なモノクローナル抗体であっても、等電点が必ずし
も均一とならないmicroheterogeneityと呼ばれる現象が
生じるからである（Bouman H et al. Z Immunitatsfors
ch. Exp Klin Immunol. 1975 Oct; 150(4): 370-7)。
させて得られた、分子量が均一なモノクローナル抗体を
用いた場合でも等電点電気泳動法で正確な分析ができな
い場合がある。これは、ハイブリドーマ産出の分子量が
均一なモノクローナル抗体であっても、等電点が必ずし
も均一とならないmicroheterogeneityと呼ばれる現象が
生じるからである（Bouman H et al. Z Immunitatsfors
ch. Exp Klin Immunol. 1975 Oct; 150(4): 370-7)。
このような等電点不均一の原因としては、タンパク質
の脱アミド化（Robinson ABら，Proc Natl Acad Sci Ｕ
ＳＡ．1970 Jul;66(3):753-7)、Ｎ末端のピログルタミ
ル化（Stott DIら，Biochem J 1972 Aug:128(5):1221-7
)、糖鎖の付加（Cohenford MAら，Immunol Commun 198
3;12(2):189-200)、ミリストイル化（Pillai Sら，Proc
Natl Acad Sci ＵＳＡ 1987 Nov;84(21):7654-8）等が
提唱されているが、タンパク質の等電点不均一性のメカ
ニズムは、未だ特定されていない。
の脱アミド化（Robinson ABら，Proc Natl Acad Sci Ｕ
ＳＡ．1970 Jul;66(3):753-7)、Ｎ末端のピログルタミ
ル化（Stott DIら，Biochem J 1972 Aug:128(5):1221-7
)、糖鎖の付加（Cohenford MAら，Immunol Commun 198
3;12(2):189-200)、ミリストイル化（Pillai Sら，Proc
Natl Acad Sci ＵＳＡ 1987 Nov;84(21):7654-8）等が
提唱されているが、タンパク質の等電点不均一性のメカ
ニズムは、未だ特定されていない。
したがって、等電点電気泳動を行った結果、試料が複
数の等電点を有することが判明したとしても、それが抗
原に起因するのか抗体に起因するのかわからないことが
ある。これは、上述のように、抗原および抗体の両者と
も等電点の不均一性を有する可能性があるからである。
数の等電点を有することが判明したとしても、それが抗
原に起因するのか抗体に起因するのかわからないことが
ある。これは、上述のように、抗原および抗体の両者と
も等電点の不均一性を有する可能性があるからである。
上記のことから、抗原抗体反応を利用して電気泳動法
により分析を行う場合は、少なくとも抗体は等電点的に
均一である必要があり、等電点が均一な抗体を発蛍光団
色素で標識する場合は、上述のようなアミノ基を利用し
た蛍光標識方法は好ましくないということができる。
により分析を行う場合は、少なくとも抗体は等電点的に
均一である必要があり、等電点が均一な抗体を発蛍光団
色素で標識する場合は、上述のようなアミノ基を利用し
た蛍光標識方法は好ましくないということができる。
等電点が均一な抗体を用いて抗原を定量的に検出する
方法としては、Shimura Kおよび Karger BLの方法が知
られている（Anal Chem 1994 Jan 1;66(1):9-15、また
は特表平８−５０６１８２号公報参照 )。これらの文献
に開示の方法を模式的に示すと図８Ａ〜Ｇのようにな
る。すなわち、ハイブリドーマ産出のＩｇＧ抗体（図８
Ａ）をタンパク質分解酵素（ペプシン）により切断し、
得られたＦ（ａｂ’）2抗体（図８Ｂ）を分離する。こ
れをメルカプトエチルアミン等の還元剤で処理して３つ
の連結ジスルフィド結合（Ｓ−Ｓ結合）を還元し、Ｆａ
ｂ’抗体を得る（図８Ｃ)。このＦａｂ’抗体を酸化し
て反応性チオール基（ＳＨ基）を１つだけ残すようにし
て（図８Ｄ）、このチオール基に発蛍光団色素を結合さ
せる（図８Ｅ)。得られた蛍光標識Ｆａｂ’抗体を用い
て等電点電気泳動を行い、等電点が均一な蛍光標識Ｆａ
ｂ’抗体を泳動担体から取り出す（図８Ｆ）。取り出し
た等電点が均一な蛍光標識Ｆａｂ’抗体を抗原と結合さ
せ電気泳動を行い励起光で生じた蛍光を測定する（図８
Ｇ)。
方法としては、Shimura Kおよび Karger BLの方法が知
られている（Anal Chem 1994 Jan 1;66(1):9-15、また
は特表平８−５０６１８２号公報参照 )。これらの文献
に開示の方法を模式的に示すと図８Ａ〜Ｇのようにな
る。すなわち、ハイブリドーマ産出のＩｇＧ抗体（図８
Ａ）をタンパク質分解酵素（ペプシン）により切断し、
得られたＦ（ａｂ’）2抗体（図８Ｂ）を分離する。こ
れをメルカプトエチルアミン等の還元剤で処理して３つ
の連結ジスルフィド結合（Ｓ−Ｓ結合）を還元し、Ｆａ
ｂ’抗体を得る（図８Ｃ)。このＦａｂ’抗体を酸化し
て反応性チオール基（ＳＨ基）を１つだけ残すようにし
て（図８Ｄ）、このチオール基に発蛍光団色素を結合さ
せる（図８Ｅ)。得られた蛍光標識Ｆａｂ’抗体を用い
て等電点電気泳動を行い、等電点が均一な蛍光標識Ｆａ
ｂ’抗体を泳動担体から取り出す（図８Ｆ）。取り出し
た等電点が均一な蛍光標識Ｆａｂ’抗体を抗原と結合さ
せ電気泳動を行い励起光で生じた蛍光を測定する（図８
Ｇ)。
発明の開示
しかしながら、上記のShimura Kおよび Karger BLの
文献に開示の方法により等電点電気泳動を行う場合にお
いては、等電点が均一なＦａｂ’抗体を得るまでの工程
が煩雑であることに加えて、測定対象である抗原の等電
点と蛍光標識された抗体の等電点が近い場合、電気泳動
の結果、抗原と抗体からなる免疫複合体と、余剰の抗原
および／または抗体がほぼ等しい移動時間で検出される
ために、ピークが重なってしまい精度の高い検出ができ
ないという問題点がある。
文献に開示の方法により等電点電気泳動を行う場合にお
いては、等電点が均一なＦａｂ’抗体を得るまでの工程
が煩雑であることに加えて、測定対象である抗原の等電
点と蛍光標識された抗体の等電点が近い場合、電気泳動
の結果、抗原と抗体からなる免疫複合体と、余剰の抗原
および／または抗体がほぼ等しい移動時間で検出される
ために、ピークが重なってしまい精度の高い検出ができ
ないという問題点がある。
本発明は上記の従来技術の問題点を鑑みてなされたも
のであり、測定対象である抗原の等電点と蛍光標識され
た抗体の等電点が近い場合であっても、高精度で抗原を
分析することが可能な、抗原の定量的検出方法を提供す
ることを目的とする。
のであり、測定対象である抗原の等電点と蛍光標識され
た抗体の等電点が近い場合であっても、高精度で抗原を
分析することが可能な、抗原の定量的検出方法を提供す
ることを目的とする。
本発明者らは鋭意研究を重ねた結果、荷電性アミノ酸
残基を含むアミノ酸配列が付加された蛍光標識等電点均
一化Ｆａｂ’抗体を用いることにより、測定対象である
抗原の等電点と蛍光標識された抗体の等電点が近い場合
であっても、高精度で抗原を分析することが可能である
ことを見出し、本発明を完成させた。
残基を含むアミノ酸配列が付加された蛍光標識等電点均
一化Ｆａｂ’抗体を用いることにより、測定対象である
抗原の等電点と蛍光標識された抗体の等電点が近い場合
であっても、高精度で抗原を分析することが可能である
ことを見出し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は、荷電性アミノ酸残基を含むアミ
ノ酸配列が付加され、発蛍光団色素で標識されており、
且つ分析用試料に含まれる抗原と免疫複合体を形成する
等電点均一化Ｆａｂ’抗体を提供する第１の工程と、前
記等電点均一化Ｆａｂ’抗体と、前記抗原を含む前記分
析用試料とを混合し、前記免疫複合体を含む混合物を得
る第２の工程と、前記混合物を担体中で電気泳動させ、
前記混合物を分離させる第３の工程と、前記第３の工程
で分離された前記混合物に、前記発蛍光団色素を励起可
能な励起光を照射して、前記免疫複合体に蛍光を生じせ
しめる第４の工程と、前記蛍光を検出する第５の工程と
を含む抗原の定量的検出方法を提供するものである。
ノ酸配列が付加され、発蛍光団色素で標識されており、
且つ分析用試料に含まれる抗原と免疫複合体を形成する
等電点均一化Ｆａｂ’抗体を提供する第１の工程と、前
記等電点均一化Ｆａｂ’抗体と、前記抗原を含む前記分
析用試料とを混合し、前記免疫複合体を含む混合物を得
る第２の工程と、前記混合物を担体中で電気泳動させ、
前記混合物を分離させる第３の工程と、前記第３の工程
で分離された前記混合物に、前記発蛍光団色素を励起可
能な励起光を照射して、前記免疫複合体に蛍光を生じせ
しめる第４の工程と、前記蛍光を検出する第５の工程と
を含む抗原の定量的検出方法を提供するものである。
本発明の抗原の定量的検出方法においては、前記アミ
ノ酸配列が、前記等電点均一化Ｆａｂ’抗体のＬ鎖のＣ
末端に隣接するように付加されていることが好ましく、
前記発蛍光団色素が、前記等電点均一化Ｆａｂ’抗体の
ＣＨ１領域のＣ末端に隣接するアミノ酸配列におけるＬ
鎖との結合に関与しないシステイン残基に結合している
ことが好ましい。
ノ酸配列が、前記等電点均一化Ｆａｂ’抗体のＬ鎖のＣ
末端に隣接するように付加されていることが好ましく、
前記発蛍光団色素が、前記等電点均一化Ｆａｂ’抗体の
ＣＨ１領域のＣ末端に隣接するアミノ酸配列におけるＬ
鎖との結合に関与しないシステイン残基に結合している
ことが好ましい。
本発明の抗原の定量的検出方法においては、前記電気
泳動が、等電点電気泳動法により実施されることが好ま
しく、また、前記電気泳動が、キャピラリー電気泳動法
により実施されることが好ましい。
泳動が、等電点電気泳動法により実施されることが好ま
しく、また、前記電気泳動が、キャピラリー電気泳動法
により実施されることが好ましい。
また、前記等電点均一化Ｆａｂ’抗体が、Ｆａｂ’抗
体のＶＨ領域、ＣＨ１領域、および該ＣＨ１領域のＣ末
端に隣接しＬ鎖との結合に関与しないシステイン残基を
含むアミノ酸配列をコードするＦｄ鎖遺伝子を提供する
第１の工程と、前記Ｆｄ鎖遺伝子において、前記ＣＨ１
領域のアミド基含有アミノ酸残基をコードするコドンの
少なくとも一つを、システインを除くアミド基非含有ア
ミノ酸残基をコードするコドンに部位特異的変異させ
て、改変Ｆｄ鎖遺伝子を得る第２の工程と、前記改変Ｆ
ｄ鎖遺伝子と、前記Ｆａｂ’抗体のＬ鎖をコードするＬ
鎖遺伝子とを発現可能な状態で連結させ、改変Ｆａｂ’
抗体発現遺伝子を得る第３の工程と、前記改変Ｆａｂ’
抗体発現遺伝子を、前記Ｌ鎖のＣ末端に隣接して荷電性
アミノ酸残基を含むアミノ酸配列が発現するように改変
し、荷電性付与改変Ｆａｂ’抗体発現遺伝子を得る第４
の工程と、前記荷電性付与改変Ｆａｂ’抗体発現遺伝子
で宿主細胞を形質転換し、得られた形質転換体を培養す
ることにより、Ｌ鎖のＣ末端に隣接して荷電性アミノ酸
残基を含むアミノ酸配列が付加され、且つＣＨ１領域の
Ｃ末端に隣接してＬ鎖との結合に関与しないシステイン
残基を含むアミノ酸配列が形成された、等電点均一化Ｆ
ａｂ’抗体を得る第５の工程と、前記第５の工程で得ら
れた等電点均一化Ｆａｂ’抗体におけるＬ鎖との結合に
関与しないシステイン残基に発蛍光団色素を結合させる
第６の工程とを含む方法により製造されたものであるこ
とが好ましい。
体のＶＨ領域、ＣＨ１領域、および該ＣＨ１領域のＣ末
端に隣接しＬ鎖との結合に関与しないシステイン残基を
含むアミノ酸配列をコードするＦｄ鎖遺伝子を提供する
第１の工程と、前記Ｆｄ鎖遺伝子において、前記ＣＨ１
領域のアミド基含有アミノ酸残基をコードするコドンの
少なくとも一つを、システインを除くアミド基非含有ア
ミノ酸残基をコードするコドンに部位特異的変異させ
て、改変Ｆｄ鎖遺伝子を得る第２の工程と、前記改変Ｆ
ｄ鎖遺伝子と、前記Ｆａｂ’抗体のＬ鎖をコードするＬ
鎖遺伝子とを発現可能な状態で連結させ、改変Ｆａｂ’
抗体発現遺伝子を得る第３の工程と、前記改変Ｆａｂ’
抗体発現遺伝子を、前記Ｌ鎖のＣ末端に隣接して荷電性
アミノ酸残基を含むアミノ酸配列が発現するように改変
し、荷電性付与改変Ｆａｂ’抗体発現遺伝子を得る第４
の工程と、前記荷電性付与改変Ｆａｂ’抗体発現遺伝子
で宿主細胞を形質転換し、得られた形質転換体を培養す
ることにより、Ｌ鎖のＣ末端に隣接して荷電性アミノ酸
残基を含むアミノ酸配列が付加され、且つＣＨ１領域の
Ｃ末端に隣接してＬ鎖との結合に関与しないシステイン
残基を含むアミノ酸配列が形成された、等電点均一化Ｆ
ａｂ’抗体を得る第５の工程と、前記第５の工程で得ら
れた等電点均一化Ｆａｂ’抗体におけるＬ鎖との結合に
関与しないシステイン残基に発蛍光団色素を結合させる
第６の工程とを含む方法により製造されたものであるこ
とが好ましい。
さらに、前記等電点均一化Ｆａｂ’抗体が、Ｆａｂ’
抗体のＶＨ領域、ＣＨ１領域、および該ＣＨ１領域のＣ
末端に隣接しＬ鎖との結合に関与しないシステイン残基
を含むアミノ酸配列をコードするＦｄ鎖遺伝子を提供す
る第１の工程と、前記Ｆｄ鎖遺伝子において、前記ＣＨ
１領域のアミド基含有アミノ酸残基をコードするコドン
の少なくとも一つを、システインを除くアミド基非含有
アミノ酸残基をコードするコドンに部位特異的変異させ
て、改変Ｆｄ鎖遺伝子を得る第２の工程と、前記Ｆａ
ｂ’抗体のＬ鎖をコードするＬ鎖遺伝子を提供する第３
の工程と、前記Ｌ鎖遺伝子を、前記Ｌ鎖のＣ末端に隣接
して荷電性アミノ酸残基を含むアミノ酸配列が発現する
ように改変し、荷電性付与Ｌ鎖遺伝子を得る第４の工程
と、前記改変Ｆｄ鎖遺伝子と、前記荷電性付与Ｌ鎖遺伝
子を発現可能な状態で連結させ、荷電性付与改変Ｆａ
ｂ’抗体発現遺伝子を得る第５の工程と、前記荷電性付
与改変Ｆａｂ’抗体発現遺伝子で宿主細胞を形質転換
し、得られた形質転換体を培養することにより、Ｌ鎖の
Ｃ末端に隣接して荷電性アミノ酸残基を含むアミノ酸配
列が付加され、且つＣＨ１領域のＣ末端に隣接してＬ鎖
との結合に関与しないシステイン残基を含むアミノ酸配
列が形成された、等電点均一化Ｆａｂ’抗体を得る第６
の工程と、前記第６の工程で得られた等電点均一化Ｆａ
ｂ’抗体におけるＬ鎖との結合に関与しないシステイン
残基に発蛍光団色素を結合させる第７の工程とを含む方
法により製造されたものであることが好ましい。
抗体のＶＨ領域、ＣＨ１領域、および該ＣＨ１領域のＣ
末端に隣接しＬ鎖との結合に関与しないシステイン残基
を含むアミノ酸配列をコードするＦｄ鎖遺伝子を提供す
る第１の工程と、前記Ｆｄ鎖遺伝子において、前記ＣＨ
１領域のアミド基含有アミノ酸残基をコードするコドン
の少なくとも一つを、システインを除くアミド基非含有
アミノ酸残基をコードするコドンに部位特異的変異させ
て、改変Ｆｄ鎖遺伝子を得る第２の工程と、前記Ｆａ
ｂ’抗体のＬ鎖をコードするＬ鎖遺伝子を提供する第３
の工程と、前記Ｌ鎖遺伝子を、前記Ｌ鎖のＣ末端に隣接
して荷電性アミノ酸残基を含むアミノ酸配列が発現する
ように改変し、荷電性付与Ｌ鎖遺伝子を得る第４の工程
と、前記改変Ｆｄ鎖遺伝子と、前記荷電性付与Ｌ鎖遺伝
子を発現可能な状態で連結させ、荷電性付与改変Ｆａ
ｂ’抗体発現遺伝子を得る第５の工程と、前記荷電性付
与改変Ｆａｂ’抗体発現遺伝子で宿主細胞を形質転換
し、得られた形質転換体を培養することにより、Ｌ鎖の
Ｃ末端に隣接して荷電性アミノ酸残基を含むアミノ酸配
列が付加され、且つＣＨ１領域のＣ末端に隣接してＬ鎖
との結合に関与しないシステイン残基を含むアミノ酸配
列が形成された、等電点均一化Ｆａｂ’抗体を得る第６
の工程と、前記第６の工程で得られた等電点均一化Ｆａ
ｂ’抗体におけるＬ鎖との結合に関与しないシステイン
残基に発蛍光団色素を結合させる第７の工程とを含む方
法により製造されたものであることが好ましい。
また、前記等電点均一化Ｆａｂ’抗体が、Ｆａｂ’抗
体のＶＨ領域、ＣＨ１領域、および該ＣＨ１領域のＣ末
端に隣接しＬ鎖との結合に関与しないシステイン残基を
含むアミノ酸配列をコードするＦｄ鎖遺伝子と、該Ｆａ
ｂ’抗体のＬ鎖をコードするＬ鎖遺伝子とを提供する第
１の工程と、前記Ｆｄ鎖遺伝子と前記Ｌ鎖遺伝子とを発
現可能な状態で連結させ、Ｆａｂ’抗体発現遺伝子を得
る第２の工程と、前記Ｆａｂ’抗体発現遺伝子を、前記
Ｌ鎖のＣ末端に隣接して荷電性アミノ酸残基を含むアミ
ノ酸配列が発現するように改変し、且つ、前記Ｆａｂ’
抗体発現遺伝子における前記ＣＨ１領域のアミド基含有
アミノ酸残基をコードするコドンの少なくとも一つを、
システインを除くアミド基非含有アミノ酸残基をコード
するコドンに部位特異的変異させて、荷電性付与改変Ｆ
ａｂ’抗体発現遺伝子を得る第３の工程と、前記荷電性
付与改変Ｆａｂ’抗体発現遺伝子で宿主細胞を形質転換
し、得られた形質転換体を培養することにより、Ｌ鎖の
Ｃ末端に隣接して荷電性アミノ酸残基を含むアミノ酸配
列が付加され、且つＣＨ１領域のＣ末端に隣接してＬ鎖
との結合に関与しないシステイン残基を含むアミノ酸配
列が形成された、等電点均一化Ｆａｂ’抗体を得る第４
の工程と、前記第４の工程で得られた等電点均一化Ｆａ
ｂ’抗体におけるＬ鎖との結合に関与しないシステイン
残基に発蛍光団色素を結合させる第５の工程とを含む方
法により製造されたものであることが好ましい。
体のＶＨ領域、ＣＨ１領域、および該ＣＨ１領域のＣ末
端に隣接しＬ鎖との結合に関与しないシステイン残基を
含むアミノ酸配列をコードするＦｄ鎖遺伝子と、該Ｆａ
ｂ’抗体のＬ鎖をコードするＬ鎖遺伝子とを提供する第
１の工程と、前記Ｆｄ鎖遺伝子と前記Ｌ鎖遺伝子とを発
現可能な状態で連結させ、Ｆａｂ’抗体発現遺伝子を得
る第２の工程と、前記Ｆａｂ’抗体発現遺伝子を、前記
Ｌ鎖のＣ末端に隣接して荷電性アミノ酸残基を含むアミ
ノ酸配列が発現するように改変し、且つ、前記Ｆａｂ’
抗体発現遺伝子における前記ＣＨ１領域のアミド基含有
アミノ酸残基をコードするコドンの少なくとも一つを、
システインを除くアミド基非含有アミノ酸残基をコード
するコドンに部位特異的変異させて、荷電性付与改変Ｆ
ａｂ’抗体発現遺伝子を得る第３の工程と、前記荷電性
付与改変Ｆａｂ’抗体発現遺伝子で宿主細胞を形質転換
し、得られた形質転換体を培養することにより、Ｌ鎖の
Ｃ末端に隣接して荷電性アミノ酸残基を含むアミノ酸配
列が付加され、且つＣＨ１領域のＣ末端に隣接してＬ鎖
との結合に関与しないシステイン残基を含むアミノ酸配
列が形成された、等電点均一化Ｆａｂ’抗体を得る第４
の工程と、前記第４の工程で得られた等電点均一化Ｆａ
ｂ’抗体におけるＬ鎖との結合に関与しないシステイン
残基に発蛍光団色素を結合させる第５の工程とを含む方
法により製造されたものであることが好ましい。
さらに、前記等電点均一化Ｆａｂ’抗体が、第１のＦ
ａｂ’抗体のＣＨ１領域、および該ＣＨ１領域のＣ末端
に隣接しＬ鎖との結合に関与しないシステイン残基を含
むアミノ酸配列をコードするＣＨ１遺伝子と、該第１の
Ｆａｂ’抗体のＣＬ領域をコードするＣＬ遺伝子とを提
供する第１の工程と、前記ＣＨ１遺伝子において、ＣＨ
１領域のアミド基含有アミノ酸残基をコードするコドン
の少なくとも一つを、システインを除くアミド基非含有
アミノ酸残基をコードするコドンに部位特異的変異させ
て、改変ＣＨ１遺伝子を得る第２の工程と、前記改変Ｃ
Ｈ１遺伝子を制限酵素で切断しＣＨ１領域をコードする
遺伝子を含む遺伝子断片を得る第３の工程と、第２のＦ
ａｂ’抗体のＶＨ領域をコードするＶＨ遺伝子と、該第
２のＦａｂ’抗体のＶＬ領域をコードするＶＬ遺伝子を
提供する第４の工程と、前記遺伝子断片、前記ＣＬ遺伝
子、前記ＶＨ遺伝子および前記ＶＬ遺伝子を発現可能な
状態で連結し、改変Ｆａｂ’抗体発現遺伝子を得る第５
の工程と、前記改変Ｆａｂ’抗体発現遺伝子を、前記Ｃ
Ｌ領域のＣ末端に隣接して荷電性アミノ酸残基を含むア
ミノ酸配列が発現するように改変し、荷電性付与改変Ｆ
ａｂ’抗体発現遺伝子を得る第６の工程と、前記荷電性
付与改変Ｆａｂ’抗体発現遺伝子で宿主細胞を形質転換
し、得られた形質転換体を培養することにより、Ｌ鎖の
Ｃ末端に隣接して荷電性アミノ酸残基を含むアミノ酸配
列が付加され、且つＣＨ１領域のＣ末端に隣接してＬ鎖
との結合に関与しないシステイン残基を含むアミノ酸配
列が形成された、等電点均一化Ｆａｂ’抗体を得る第７
の工程と、前記第７の工程で得られた等電点均一化Ｆａ
ｂ’抗体におけるＬ鎖との結合に関与しないシステイン
残基に発蛍光団色素を結合させる第８の工程とを含む方
法により製造されたものであることが好ましい。
ａｂ’抗体のＣＨ１領域、および該ＣＨ１領域のＣ末端
に隣接しＬ鎖との結合に関与しないシステイン残基を含
むアミノ酸配列をコードするＣＨ１遺伝子と、該第１の
Ｆａｂ’抗体のＣＬ領域をコードするＣＬ遺伝子とを提
供する第１の工程と、前記ＣＨ１遺伝子において、ＣＨ
１領域のアミド基含有アミノ酸残基をコードするコドン
の少なくとも一つを、システインを除くアミド基非含有
アミノ酸残基をコードするコドンに部位特異的変異させ
て、改変ＣＨ１遺伝子を得る第２の工程と、前記改変Ｃ
Ｈ１遺伝子を制限酵素で切断しＣＨ１領域をコードする
遺伝子を含む遺伝子断片を得る第３の工程と、第２のＦ
ａｂ’抗体のＶＨ領域をコードするＶＨ遺伝子と、該第
２のＦａｂ’抗体のＶＬ領域をコードするＶＬ遺伝子を
提供する第４の工程と、前記遺伝子断片、前記ＣＬ遺伝
子、前記ＶＨ遺伝子および前記ＶＬ遺伝子を発現可能な
状態で連結し、改変Ｆａｂ’抗体発現遺伝子を得る第５
の工程と、前記改変Ｆａｂ’抗体発現遺伝子を、前記Ｃ
Ｌ領域のＣ末端に隣接して荷電性アミノ酸残基を含むア
ミノ酸配列が発現するように改変し、荷電性付与改変Ｆ
ａｂ’抗体発現遺伝子を得る第６の工程と、前記荷電性
付与改変Ｆａｂ’抗体発現遺伝子で宿主細胞を形質転換
し、得られた形質転換体を培養することにより、Ｌ鎖の
Ｃ末端に隣接して荷電性アミノ酸残基を含むアミノ酸配
列が付加され、且つＣＨ１領域のＣ末端に隣接してＬ鎖
との結合に関与しないシステイン残基を含むアミノ酸配
列が形成された、等電点均一化Ｆａｂ’抗体を得る第７
の工程と、前記第７の工程で得られた等電点均一化Ｆａ
ｂ’抗体におけるＬ鎖との結合に関与しないシステイン
残基に発蛍光団色素を結合させる第８の工程とを含む方
法により製造されたものであることが好ましい。
加えて、前記等電点均一化Ｆａｂ’抗体が、第１のＦ
ａｂ’抗体のＣＨ１領域、および該ＣＨ１領域のＣ末端
に隣接しＬ鎖との結合に関与しないシステイン残基を含
むアミノ酸配列をコードするＣＨ１遺伝子と、該第１の
Ｆａｂ’抗体のＣＬ領域をコードするＣＬ遺伝子とを提
供する第１の工程と、前記ＣＨ１遺伝子において、ＣＨ
１領域のアミド基含有アミノ酸残基をコードするコドン
の少なくとも一つを、システインを除くアミド基非含有
アミノ酸残基をコードするコドンに部位特異的変異させ
て、改変ＣＨ１遺伝子を得る第２の工程と、前記改変Ｃ
Ｈ１遺伝子を制限酵素で切断しＣＨ１領域をコードする
遺伝子を含む遺伝子断片を得る第３の工程と、前記ＣＬ
遺伝子を、前記ＣＬ領域のＣ末端に隣接して荷電性アミ
ノ酸残基を含むアミノ酸配列が発現するように改変し、
荷電性付与ＣＬ遺伝子を得る第４の工程と、第２のＦａ
ｂ’抗体のＶＨ領域をコードするＶＨ遺伝子と、該第２
のＦａｂ’抗体のＶＬ領域をコードするＶＬ遺伝子を提
供する第５の工程と、前記遺伝子断片、前記荷電性付与
ＣＬ遺伝子、前記ＶＨ遺伝子および前記ＶＬ遺伝子を発
現可能な状態で連結し、荷電性付与改変Ｆａｂ’抗体発
現遺伝子を得る第６の工程と、前記荷電性付与改変Ｆａ
ｂ’抗体発現遺伝子で宿主細胞を形質転換し、得られた
形質転換体を培養することにより、Ｌ鎖のＣ末端に隣接
して荷電性アミノ酸残基を含むアミノ酸配列が付加さ
れ、且つＣＨ１領域のＣ末端に隣接してＬ鎖との結合に
関与しないシステイン残基を含むアミノ酸配列が形成さ
れた、等電点均一化Ｆａｂ’抗体を得る第７の工程と、
前記第７の工程で得られた等電点均一化Ｆａｂ’抗体に
おけるＬ鎖との結合に関与しないシステイン残基に発蛍
光団色素を結合させる第８の工程とを含む方法により製
造されたものであることが好ましい。
ａｂ’抗体のＣＨ１領域、および該ＣＨ１領域のＣ末端
に隣接しＬ鎖との結合に関与しないシステイン残基を含
むアミノ酸配列をコードするＣＨ１遺伝子と、該第１の
Ｆａｂ’抗体のＣＬ領域をコードするＣＬ遺伝子とを提
供する第１の工程と、前記ＣＨ１遺伝子において、ＣＨ
１領域のアミド基含有アミノ酸残基をコードするコドン
の少なくとも一つを、システインを除くアミド基非含有
アミノ酸残基をコードするコドンに部位特異的変異させ
て、改変ＣＨ１遺伝子を得る第２の工程と、前記改変Ｃ
Ｈ１遺伝子を制限酵素で切断しＣＨ１領域をコードする
遺伝子を含む遺伝子断片を得る第３の工程と、前記ＣＬ
遺伝子を、前記ＣＬ領域のＣ末端に隣接して荷電性アミ
ノ酸残基を含むアミノ酸配列が発現するように改変し、
荷電性付与ＣＬ遺伝子を得る第４の工程と、第２のＦａ
ｂ’抗体のＶＨ領域をコードするＶＨ遺伝子と、該第２
のＦａｂ’抗体のＶＬ領域をコードするＶＬ遺伝子を提
供する第５の工程と、前記遺伝子断片、前記荷電性付与
ＣＬ遺伝子、前記ＶＨ遺伝子および前記ＶＬ遺伝子を発
現可能な状態で連結し、荷電性付与改変Ｆａｂ’抗体発
現遺伝子を得る第６の工程と、前記荷電性付与改変Ｆａ
ｂ’抗体発現遺伝子で宿主細胞を形質転換し、得られた
形質転換体を培養することにより、Ｌ鎖のＣ末端に隣接
して荷電性アミノ酸残基を含むアミノ酸配列が付加さ
れ、且つＣＨ１領域のＣ末端に隣接してＬ鎖との結合に
関与しないシステイン残基を含むアミノ酸配列が形成さ
れた、等電点均一化Ｆａｂ’抗体を得る第７の工程と、
前記第７の工程で得られた等電点均一化Ｆａｂ’抗体に
おけるＬ鎖との結合に関与しないシステイン残基に発蛍
光団色素を結合させる第８の工程とを含む方法により製
造されたものであることが好ましい。
図面の簡単な説明
図１は、ヒトのＩｇＧ１抗体を示す模式的に示す図で
ある。
ある。
図２Ａは、等電点均一化Ｆａｂ’抗体発現遺伝子の構
成図である。
成図である。
図２Ｂは、等電点均一化Ｆａｂ’抗体発現遺伝子が導
入されたpCANTAB5Eプラスミドベクターを示す図であ
る。
入されたpCANTAB5Eプラスミドベクターを示す図であ
る。
図３は、改変を行っていない抗ヒト アルファ１アン
チトリプシンＦａｂ’抗体を用いて蛍光検出キャピラリ
ー等電点電気泳動を行った際の移動時間と蛍光強度を示
す図である。
チトリプシンＦａｂ’抗体を用いて蛍光検出キャピラリ
ー等電点電気泳動を行った際の移動時間と蛍光強度を示
す図である。
図４は、改変を行った抗ヒト アルファ１アンチトリ
プシンＦａｂ’抗体（Ｈ−Ｎ１６２Ｄ改変Ｆａｂ’抗
体）を用いて蛍光検出キャピラリー等電点電気泳動を行
った際の移動時間と蛍光強度を示す図である。
プシンＦａｂ’抗体（Ｈ−Ｎ１６２Ｄ改変Ｆａｂ’抗
体）を用いて蛍光検出キャピラリー等電点電気泳動を行
った際の移動時間と蛍光強度を示す図である。
図５は、等電点均一化Ｆａｂ’抗体と抗原の免疫複合
体を電気泳動で分離した際の移動時間と蛍光強度を示す
図である。
体を電気泳動で分離した際の移動時間と蛍光強度を示す
図である。
図６は、荷電性のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列が
付加された等電点均一化Ｆａｂ’抗体と抗原の免疫複合
体を電気泳動で分離した際の移動時間と蛍光強度を示す
図である。
付加された等電点均一化Ｆａｂ’抗体と抗原の免疫複合
体を電気泳動で分離した際の移動時間と蛍光強度を示す
図である。
図７Ａは、等電点均一化Ｆａｂ’抗体を発現する遺伝
子を組み込んだ大腸菌を模式的に示す図である。
子を組み込んだ大腸菌を模式的に示す図である。
図７Ｂは、IPTGによる抗体誘導により生じた等電点均
一化Ｆａｂ’抗体を模式的に示す図である。
一化Ｆａｂ’抗体を模式的に示す図である。
図７Ｃは、蛍光標識された等電点均一化Ｆａｂ’抗体
を模式的に示す図である。
を模式的に示す図である。
図７Ｄは、蛍光標識された等電点均一化Ｆａｂ’抗体
と抗原の免疫複合体を電気泳動で分離したときに得られ
る、移動時間と蛍光強度の関係を模式的に示す図であ
る。
と抗原の免疫複合体を電気泳動で分離したときに得られ
る、移動時間と蛍光強度の関係を模式的に示す図であ
る。
図８Ａは、ハイブリドーマ産出のＩｇＧ抗体を模式的
に示す図である。
に示す図である。
図８Ｂは、ハイブリドーマ産出のＩｇＧ抗体をタンパ
ク質分解酵素により切断して得られたＦ（ａｂ’）2抗
体を模式的に示す図である。
ク質分解酵素により切断して得られたＦ（ａｂ’）2抗
体を模式的に示す図である。
図８Ｃは、Ｆ（ａｂ’）2抗体を還元剤で処理してジ
スルフィド結合を還元して得られたＦａｂ’抗体を模式
的に示す図である。
スルフィド結合を還元して得られたＦａｂ’抗体を模式
的に示す図である。
図８Ｄは、酸化により反応性チオール基を１つだけ残
したＦａｂ’抗体を模式的に示す図である。
したＦａｂ’抗体を模式的に示す図である。
図８Ｅは、蛍光標識されたＦａｂ’抗体を模式的に示
す図である。
す図である。
図８Ｆは、蛍光標識されたＦａｂ’抗体を等電点電気
泳動した時に得られる電気泳動像を模式的に示す図であ
る。
泳動した時に得られる電気泳動像を模式的に示す図であ
る。
図８Ｇは、等電点電気泳動して取り出された蛍光標識
された等電点均一化Ｆａｂ’抗体と、抗原の免疫複合体
を電気泳動で分離したときに得られる、移動時間と蛍光
強度の関係を模式的に示す図である。
された等電点均一化Ｆａｂ’抗体と、抗原の免疫複合体
を電気泳動で分離したときに得られる、移動時間と蛍光
強度の関係を模式的に示す図である。
発明を実施するための最良の形態
本発明の抗原の定量的検出方法は、荷電性アミノ酸残
基を含むアミノ酸配列が付加され、発蛍光団色素で標識
されており、且つ分析用試料に含まれる抗原と免疫複合
体を形成する等電点均一化Ｆａｂ’抗体を提供する第１
の工程と、前記等電点均一化Ｆａｂ’抗体と、前記抗原
を含む前記分析用試料とを混合し、前記免疫複合体を含
む混合物を得る第２の工程と、前記混合物を担体中で電
気泳動させ、前記混合物を分離させる第３の工程と、前
記第３の工程で分離された前記混合物に、前記発蛍光団
色素を励起可能な励起光を照射して、前記免疫複合体に
蛍光を生じせしめる第４の工程と、前記蛍光を検出する
第５の工程とを含むものである。
基を含むアミノ酸配列が付加され、発蛍光団色素で標識
されており、且つ分析用試料に含まれる抗原と免疫複合
体を形成する等電点均一化Ｆａｂ’抗体を提供する第１
の工程と、前記等電点均一化Ｆａｂ’抗体と、前記抗原
を含む前記分析用試料とを混合し、前記免疫複合体を含
む混合物を得る第２の工程と、前記混合物を担体中で電
気泳動させ、前記混合物を分離させる第３の工程と、前
記第３の工程で分離された前記混合物に、前記発蛍光団
色素を励起可能な励起光を照射して、前記免疫複合体に
蛍光を生じせしめる第４の工程と、前記蛍光を検出する
第５の工程とを含むものである。
抗体は、ヒトＩｇＧ１抗体を例にとると、図１の模式
図に示すように、Ｌ鎖（light chain、軽鎖）と呼ばれ
るポリペプチド鎖２本と、Ｈ鎖（heavy chain、重鎖）
と呼ばれるポリペプチド鎖２本が、Ｙ字型の対をなした
構造を有しており、Ｆａｂ’抗体とは、ＶＨ領域および
ＣＨ１領域からなるＦｄ鎖（ヒンジ領域よりＮ末端側の
Ｈ鎖）と、ＶＬ領域およびＣＬ領域とからなるＬ鎖とが
−Ｓ−Ｓ−結合で連結したＦａｂ部分に、ヒンジ領域ま
たはその一部が付加した抗体の断片をいう。
図に示すように、Ｌ鎖（light chain、軽鎖）と呼ばれ
るポリペプチド鎖２本と、Ｈ鎖（heavy chain、重鎖）
と呼ばれるポリペプチド鎖２本が、Ｙ字型の対をなした
構造を有しており、Ｆａｂ’抗体とは、ＶＨ領域および
ＣＨ１領域からなるＦｄ鎖（ヒンジ領域よりＮ末端側の
Ｈ鎖）と、ＶＬ領域およびＣＬ領域とからなるＬ鎖とが
−Ｓ−Ｓ−結合で連結したＦａｂ部分に、ヒンジ領域ま
たはその一部が付加した抗体の断片をいう。
本発明で用いるＦａｂ’抗体は、抗原の検出のために
用いることから、分析用試料に含まれる該抗原と特異的
に反応して、免疫複合体を形成するものでなければなら
ない。本発明の定量的検出方法の検出対象である抗原の
種類に関しては、抗原抗体反応を生じるものであればよ
く、特に制限はない。分析用試料に関しても特に制限は
なく、検出対象である抗原を含むものであればよい。
用いることから、分析用試料に含まれる該抗原と特異的
に反応して、免疫複合体を形成するものでなければなら
ない。本発明の定量的検出方法の検出対象である抗原の
種類に関しては、抗原抗体反応を生じるものであればよ
く、特に制限はない。分析用試料に関しても特に制限は
なく、検出対象である抗原を含むものであればよい。
また、本発明で用いるＦａｂ’抗体は、荷電性アミノ
酸残基を含むアミノ酸配列が付加されているが、本発明
において荷電性アミノ酸残基を含むアミノ酸配列が付加
されたＦａｂ’抗体とは、＋または−に荷電する荷電性
アミノ酸残基を含むアミノ酸配列が、Ｆａｂ’抗体のＦ
ｄ鎖、Ｌ鎖、ヒンジ領域（またはその一部）のいずれか
の部位に少なくとも１つ付加したものをいう。＋に荷電
する荷電性アミノ酸としては、アルギニン、リシン等が
挙げられ、−に荷電する荷電性アミノ酸としては、アス
パラギン酸、グルタミン酸等が挙げられる。荷電性アミ
ノ酸残基を含むアミノ酸配列が付加されるＦａｂ’抗体
の部位は特に制限されないが、Ｆａｂ’抗体が抗原と結
合する部位はＶＨ領域およびＶＬ領域に存在しているた
め、抗原抗体反応になるべく影響を与えないという観点
から、荷電性アミノ酸残基を含むアミノ酸配列は、Ｆａ
ｂ’抗体のＨ鎖またはＬ鎖にＣ末端側に付加されている
ことが好ましい。なかでも、Ｌ鎖のＣ末端に隣接するよ
うに付加されていることが好ましい。また、荷電性アミ
ノ酸残基を含むアミノ酸配列のアミノ酸残基の数は１以
上であればよく特に制限されないが、その数は１〜５０
であることが好ましい。また、当該アミノ酸配列中の荷
電性アミノ酸残基の数も特に制限されないが、その数は
１〜３０であることが好ましい。
酸残基を含むアミノ酸配列が付加されているが、本発明
において荷電性アミノ酸残基を含むアミノ酸配列が付加
されたＦａｂ’抗体とは、＋または−に荷電する荷電性
アミノ酸残基を含むアミノ酸配列が、Ｆａｂ’抗体のＦ
ｄ鎖、Ｌ鎖、ヒンジ領域（またはその一部）のいずれか
の部位に少なくとも１つ付加したものをいう。＋に荷電
する荷電性アミノ酸としては、アルギニン、リシン等が
挙げられ、−に荷電する荷電性アミノ酸としては、アス
パラギン酸、グルタミン酸等が挙げられる。荷電性アミ
ノ酸残基を含むアミノ酸配列が付加されるＦａｂ’抗体
の部位は特に制限されないが、Ｆａｂ’抗体が抗原と結
合する部位はＶＨ領域およびＶＬ領域に存在しているた
め、抗原抗体反応になるべく影響を与えないという観点
から、荷電性アミノ酸残基を含むアミノ酸配列は、Ｆａ
ｂ’抗体のＨ鎖またはＬ鎖にＣ末端側に付加されている
ことが好ましい。なかでも、Ｌ鎖のＣ末端に隣接するよ
うに付加されていることが好ましい。また、荷電性アミ
ノ酸残基を含むアミノ酸配列のアミノ酸残基の数は１以
上であればよく特に制限されないが、その数は１〜５０
であることが好ましい。また、当該アミノ酸配列中の荷
電性アミノ酸残基の数も特に制限されないが、その数は
１〜３０であることが好ましい。
Ｆａｂ’抗体に、荷電性アミノ酸残基を含むアミノ酸
配列を付加する方法に関して特に制限はないが、例え
ば、後述するように、等電点均一化Ｆａｂ’抗体を発現
する遺伝子を鋳型として、荷電性アミノ酸残基を含むア
ミノ酸配列を付加するためのプライマーを用いてポリメ
ラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行うことにより、荷電性ア
ミノ酸残基を含むアミノ酸配列が付加された等電点均一
化Ｆａｂ’抗体を発現する遺伝子が得られるので、これ
により形質転換された宿主細胞を培養すればよい。ま
た、等電点均一化Ｆａｂ’抗体に別途合成した荷電性ア
ミノ酸残基を含むアミノ酸配列を結合させてもよい。
配列を付加する方法に関して特に制限はないが、例え
ば、後述するように、等電点均一化Ｆａｂ’抗体を発現
する遺伝子を鋳型として、荷電性アミノ酸残基を含むア
ミノ酸配列を付加するためのプライマーを用いてポリメ
ラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行うことにより、荷電性ア
ミノ酸残基を含むアミノ酸配列が付加された等電点均一
化Ｆａｂ’抗体を発現する遺伝子が得られるので、これ
により形質転換された宿主細胞を培養すればよい。ま
た、等電点均一化Ｆａｂ’抗体に別途合成した荷電性ア
ミノ酸残基を含むアミノ酸配列を結合させてもよい。
本発明で用いるＦａｂ’抗体は、荷電性アミノ酸残基
を含むアミノ酸配列の付加されていることに加えて、等
電点も均一化されている。Ｆａｂ’抗体に等電点の均一
性を付与する方法については、特に制限はないが、後述
するように、Ｆａｂ’抗体のＣＨ１領域におけるアミド
基含有アミノ酸（アスパラギンおよび／またはグルタミ
ン）を、システインを除くアミド基非含有アミノ酸に遺
伝子工学的に変異させることにより等電点の均一性を付
与することが好ましい。
を含むアミノ酸配列の付加されていることに加えて、等
電点も均一化されている。Ｆａｂ’抗体に等電点の均一
性を付与する方法については、特に制限はないが、後述
するように、Ｆａｂ’抗体のＣＨ１領域におけるアミド
基含有アミノ酸（アスパラギンおよび／またはグルタミ
ン）を、システインを除くアミド基非含有アミノ酸に遺
伝子工学的に変異させることにより等電点の均一性を付
与することが好ましい。
本発明で用いるＦａｂ’抗体は、荷電性アミノ酸残基
を含むアミノ酸配列が付加され、等電点が均一化されて
いるが、これに加え発蛍光団色素により標識されてい
る。発蛍光団色素としては、ローダミン、フルオレセイ
ン、シアニン、インドシアニン、インドカルボシアニ
ン、ピロニン、ルシファーイエロー、キナクリン、スク
エア酸、クマリン、フルオロアンセニルマレイミド、ア
ントラセン等を挙げることができる。発蛍光団色素とし
てはローダミンおよび／またはシアニンを用いることが
好ましく、ローダミンを用いることがより好ましい。ロ
ーダミンは、メタノール中において、５５６ｎｍに極大
吸収（モル吸光係数９３，０００）を有し、また５７６
ｎｍを極大とする蛍光を発する。ローダミンに関して
は、Handbook of Fluorescent Probes and Research Ch
emicals, 5th Edition MOLECULAR PROBES, INC.,1992
を参照することができる。
を含むアミノ酸配列が付加され、等電点が均一化されて
いるが、これに加え発蛍光団色素により標識されてい
る。発蛍光団色素としては、ローダミン、フルオレセイ
ン、シアニン、インドシアニン、インドカルボシアニ
ン、ピロニン、ルシファーイエロー、キナクリン、スク
エア酸、クマリン、フルオロアンセニルマレイミド、ア
ントラセン等を挙げることができる。発蛍光団色素とし
てはローダミンおよび／またはシアニンを用いることが
好ましく、ローダミンを用いることがより好ましい。ロ
ーダミンは、メタノール中において、５５６ｎｍに極大
吸収（モル吸光係数９３，０００）を有し、また５７６
ｎｍを極大とする蛍光を発する。ローダミンに関して
は、Handbook of Fluorescent Probes and Research Ch
emicals, 5th Edition MOLECULAR PROBES, INC.,1992
を参照することができる。
更に、本発明においては、アントラセン、ナフタレ
ン、フェナントレン、キノリン、ピレン、ペリレン等に
代表される芳香族複素環式化合物や多環芳香族炭化水素
を発蛍光団色素として用いることも可能である。このよ
うな発蛍光団色素に関しては、例えば、蛍光リン光分
析、西川泰治、平木敬三著、共立出版、１９８９を参照
することができる。
ン、フェナントレン、キノリン、ピレン、ペリレン等に
代表される芳香族複素環式化合物や多環芳香族炭化水素
を発蛍光団色素として用いることも可能である。このよ
うな発蛍光団色素に関しては、例えば、蛍光リン光分
析、西川泰治、平木敬三著、共立出版、１９８９を参照
することができる。
上記の発蛍光団色素とＦａｂ’抗体とを反応させる場
合、発蛍光団色素により標識されるＦａｂ’抗体の部位
には特に制限はないが、発蛍光団色素はＦａｂ’抗体の
システイン残基のＳＨ基に結合することが好ましく、Ｆ
ａｂ’抗体のＣＨ１領域のＣ末端に隣接するアミノ酸配
列におけるＬ鎖との結合に関与しないシステイン残基の
ＳＨ基に結合させることがより好ましい。
合、発蛍光団色素により標識されるＦａｂ’抗体の部位
には特に制限はないが、発蛍光団色素はＦａｂ’抗体の
システイン残基のＳＨ基に結合することが好ましく、Ｆ
ａｂ’抗体のＣＨ１領域のＣ末端に隣接するアミノ酸配
列におけるＬ鎖との結合に関与しないシステイン残基の
ＳＨ基に結合させることがより好ましい。
上記の発蛍光団色素とＦａｂ’抗体とを反応させる場
合、反応により生じる結合の種類に関しても特に制限は
ないが、結合は、チオエステル結合、ジチオエステル結
合、チオエーテル結合からなる群より選ばれる少なくと
も１つの結合であることが好ましい。このとき、Ｆａ
ｂ’抗体のアミノ酸残基が有するＳＨ基等の官能基に発
蛍光団色素を直接反応させてもよいが、発蛍光団色素中
の官能基（例えば、ハロゲン化メチル基、活性エステル
基、酸塩化物基、酸無水物基、マレイミド基等）に反応
性の官能基と、Ｆａｂ’抗体のアミノ酸残基が有するＳ
Ｈ基等の官能基に反応性の官能基とをそれぞれ少なくと
も１個有した多官能化合物を介して結合させてもよい。
合、反応により生じる結合の種類に関しても特に制限は
ないが、結合は、チオエステル結合、ジチオエステル結
合、チオエーテル結合からなる群より選ばれる少なくと
も１つの結合であることが好ましい。このとき、Ｆａ
ｂ’抗体のアミノ酸残基が有するＳＨ基等の官能基に発
蛍光団色素を直接反応させてもよいが、発蛍光団色素中
の官能基（例えば、ハロゲン化メチル基、活性エステル
基、酸塩化物基、酸無水物基、マレイミド基等）に反応
性の官能基と、Ｆａｂ’抗体のアミノ酸残基が有するＳ
Ｈ基等の官能基に反応性の官能基とをそれぞれ少なくと
も１個有した多官能化合物を介して結合させてもよい。
本発明においては、第１の工程に続く第２の工程とし
て、荷電性アミノ酸残基を含むアミノ酸配列が付加さ
れ、且つ発蛍光団色素で標識された上記の等電点均一化
Ｆａｂ’抗体と、上記の抗原を含む分析用試料とを混合
し、免疫複合体を含む混合物を得る。
て、荷電性アミノ酸残基を含むアミノ酸配列が付加さ
れ、且つ発蛍光団色素で標識された上記の等電点均一化
Ｆａｂ’抗体と、上記の抗原を含む分析用試料とを混合
し、免疫複合体を含む混合物を得る。
第２の工程において複合体を形成せしめる方法は特に
制限されない。例えば、抗原を含む分析用試料を所望の
濃度で超純水もしくは緩衝液に溶解した溶液と、荷電性
アミノ酸残基を含むアミノ酸配列が付加され発蛍光団色
素で標識された等電点均一化Ｆａｂ’抗体（以下、場合
により、荷電性の蛍光標識等電点均一化Ｆａｂ’抗体と
呼ぶことがある）を所望の濃度で超純水もしくは緩衝液
に溶解した溶液を混合し、低温（４℃程度）〜室温（２
５℃程度）で数分〜数十分保持することにより、複合体
を形成させることが可能である。抗原と、荷電性の蛍光
標識等電点均一化Ｆａｂ’抗体との混合溶液は、さらに
電気泳動用の泳動担体に溶解させる。泳動担体は電気泳
動の種類によって異なり、例えば、スラブゲル等電点電
気泳動を行う場合は、ポリアクリルアミドゲル等が泳動
担体として用いられ、キャピラリー等電点電気泳動を行
う場合は、Pharmalyte（アマシャム ファルマシアバイ
オテク社製）等の両性担体が用いられる。なお、キャピ
ラリー等電点電気泳動を行う場合は、電気浸透流やタン
パク質の吸着を防ぐために、ヒドロキシプロピルメチル
セルロース等をさらに添加してもよい。
制限されない。例えば、抗原を含む分析用試料を所望の
濃度で超純水もしくは緩衝液に溶解した溶液と、荷電性
アミノ酸残基を含むアミノ酸配列が付加され発蛍光団色
素で標識された等電点均一化Ｆａｂ’抗体（以下、場合
により、荷電性の蛍光標識等電点均一化Ｆａｂ’抗体と
呼ぶことがある）を所望の濃度で超純水もしくは緩衝液
に溶解した溶液を混合し、低温（４℃程度）〜室温（２
５℃程度）で数分〜数十分保持することにより、複合体
を形成させることが可能である。抗原と、荷電性の蛍光
標識等電点均一化Ｆａｂ’抗体との混合溶液は、さらに
電気泳動用の泳動担体に溶解させる。泳動担体は電気泳
動の種類によって異なり、例えば、スラブゲル等電点電
気泳動を行う場合は、ポリアクリルアミドゲル等が泳動
担体として用いられ、キャピラリー等電点電気泳動を行
う場合は、Pharmalyte（アマシャム ファルマシアバイ
オテク社製）等の両性担体が用いられる。なお、キャピ
ラリー等電点電気泳動を行う場合は、電気浸透流やタン
パク質の吸着を防ぐために、ヒドロキシプロピルメチル
セルロース等をさらに添加してもよい。
第３の工程では、第２の工程で得られた混合物を担体
中で電気泳動させ、該混合物を分離させる。
中で電気泳動させ、該混合物を分離させる。
第３の工程において実施する電気泳動の方法に関して
は、特に制限はないが、検出精度が高いことから等電点
電気泳動法によることが好ましい。また、免疫複合体が
微量しか存在しない場合であっても検出が可能なことか
ら、キャピラリー電気泳動法を用いることが好ましい。
また、マイクロセル電気泳動法やチップ電気泳動法を用
いることも可能である。本発明においては、微量の免疫
複合体を高精度で検出が可能なキャピラリー等電点電気
泳動法を用いることがより好ましい。
は、特に制限はないが、検出精度が高いことから等電点
電気泳動法によることが好ましい。また、免疫複合体が
微量しか存在しない場合であっても検出が可能なことか
ら、キャピラリー電気泳動法を用いることが好ましい。
また、マイクロセル電気泳動法やチップ電気泳動法を用
いることも可能である。本発明においては、微量の免疫
複合体を高精度で検出が可能なキャピラリー等電点電気
泳動法を用いることがより好ましい。
キャピラリー電気泳動を行う場合のキャピラリーとし
ては、例えば、ソーダ石灰ガラス等からなり、内径が数
〜百μｍ程度、外径が数百μｍ程度、長さが数十〜百ｃ
ｍ程度のものが用いられる。なお、これらの寸法、特に
長さは、測定しようとする免疫複合体の種類等によって
適宜選択される。
ては、例えば、ソーダ石灰ガラス等からなり、内径が数
〜百μｍ程度、外径が数百μｍ程度、長さが数十〜百ｃ
ｍ程度のものが用いられる。なお、これらの寸法、特に
長さは、測定しようとする免疫複合体の種類等によって
適宜選択される。
印加する電圧に関しても特に制限はなく、電気泳動の
種類、測定しようとする免疫複合体の種類や濃度、泳動
担体の形状や長さ、用いる電気泳動装置の種類等により
適宜選択が可能である。
種類、測定しようとする免疫複合体の種類や濃度、泳動
担体の形状や長さ、用いる電気泳動装置の種類等により
適宜選択が可能である。
第４の工程においては、第３の工程で分離された混合
物に、発蛍光団色素を励起可能な励起光を照射して、免
疫複合体に蛍光を生じせしめる 励起光の種類に関して特に制限はない。発蛍光団色素
としてローダミンを用いる場合は、アルゴンレーザー、
半導体励起ＹＡＧレーザー、ヘリウムネオンレーザー等
を好適に用いることができる。
物に、発蛍光団色素を励起可能な励起光を照射して、免
疫複合体に蛍光を生じせしめる 励起光の種類に関して特に制限はない。発蛍光団色素
としてローダミンを用いる場合は、アルゴンレーザー、
半導体励起ＹＡＧレーザー、ヘリウムネオンレーザー等
を好適に用いることができる。
第５の工程では、第４の工程で生じた蛍光を検出す
る。蛍光を掲出する手段としては蛍光検出が可能な光検
出器を用いることができる。光検出器としては、例え
ば、デンシトメータ（例えば、島津製作所製、島津二波
長フライングスポットスキャニングデンシトメータＣＳ
９３００ＰＣ）を好適に用いることができる。
る。蛍光を掲出する手段としては蛍光検出が可能な光検
出器を用いることができる。光検出器としては、例え
ば、デンシトメータ（例えば、島津製作所製、島津二波
長フライングスポットスキャニングデンシトメータＣＳ
９３００ＰＣ）を好適に用いることができる。
光検出器により蛍光強度が測定されるが、用いた発蛍
光団色素に関して、濃度−蛍光強度との関係をあらかじ
め測定して得られたデータに基づいて、検出した複合体
の濃度を定量化することが可能である。
光団色素に関して、濃度−蛍光強度との関係をあらかじ
め測定して得られたデータに基づいて、検出した複合体
の濃度を定量化することが可能である。
以上説明したように、本発明においては用いられる抗
体は、等電点が均一であるため、電気泳動の結果複数の
ピークが観察された場合は、その複数のピークは抗原の
等電点の不均一性に起因するものであると特定すること
ができる。また、本発明において用いられる抗体は、発
蛍光団色素等により蛍光標識されているため高精度の検
出が可能である。さらに、本発明において用いられる抗
体は、荷電性アミノ酸残基を含むアミノ酸配列が付加さ
れているために、荷電性アミノ酸残基の種類および／ま
たは導入量を変化させることにより、等電点の均一性を
保ったまま等電点を所望の値に変化させることができる
ため、測定対象である抗原の等電点と抗体の等電点が近
い場合であっても、電気泳動の結果、免疫複合体と、余
剰の抗原および／または抗体がほぼ等しい移動時間で検
出されることがなく、精度の高い検出が可能になる。
体は、等電点が均一であるため、電気泳動の結果複数の
ピークが観察された場合は、その複数のピークは抗原の
等電点の不均一性に起因するものであると特定すること
ができる。また、本発明において用いられる抗体は、発
蛍光団色素等により蛍光標識されているため高精度の検
出が可能である。さらに、本発明において用いられる抗
体は、荷電性アミノ酸残基を含むアミノ酸配列が付加さ
れているために、荷電性アミノ酸残基の種類および／ま
たは導入量を変化させることにより、等電点の均一性を
保ったまま等電点を所望の値に変化させることができる
ため、測定対象である抗原の等電点と抗体の等電点が近
い場合であっても、電気泳動の結果、免疫複合体と、余
剰の抗原および／または抗体がほぼ等しい移動時間で検
出されることがなく、精度の高い検出が可能になる。
上述したShimura Kおよび Karger BLの方法で用いら
れるＦａｂ’抗体も、化学変性することにより電荷を付
与し等電点を抗体の等電点と異なるようにすることも不
可能ではないが、化学変性のために使用するＦａｂ’抗
体の官能基（例えば、アミノ基）は、抗体中にランダム
に分布しているため均一な変性が不可能であり、また、
変性によって等電点の均一性が損なわれることも考えら
れる。したがって、Shimura Kおよび Karger BLの方法
では、測定対象である抗原の等電点と蛍光標識された抗
体の等電点が近い場合、精度の高い検出をすることが不
可能である。
れるＦａｂ’抗体も、化学変性することにより電荷を付
与し等電点を抗体の等電点と異なるようにすることも不
可能ではないが、化学変性のために使用するＦａｂ’抗
体の官能基（例えば、アミノ基）は、抗体中にランダム
に分布しているため均一な変性が不可能であり、また、
変性によって等電点の均一性が損なわれることも考えら
れる。したがって、Shimura Kおよび Karger BLの方法
では、測定対象である抗原の等電点と蛍光標識された抗
体の等電点が近い場合、精度の高い検出をすることが不
可能である。
本発明においては、抗体の定量的検出に用いる荷電性
の蛍光標識等電点均一化Ｆａｂ’抗体は、以下に述べる
遺伝子工学的手法による第１〜第５の製造方法のいずれ
かにより製造することが好ましい。
の蛍光標識等電点均一化Ｆａｂ’抗体は、以下に述べる
遺伝子工学的手法による第１〜第５の製造方法のいずれ
かにより製造することが好ましい。
遺伝子工学的手法による第１の製造方法は、Ｆａｂ’
抗体のＶＨ領域、ＣＨ１領域、および該ＣＨ１領域のＣ
末端に隣接しＬ鎖との結合に関与しないシステイン残基
を含むアミノ酸配列をコードするＦｄ鎖遺伝子を提供す
る第１の工程と、前記Ｆｄ鎖遺伝子において、前記ＣＨ
１領域のアミド基含有アミノ酸残基をコードするコドン
の少なくとも一つを、システインを除くアミド基非含有
アミノ酸残基をコードするコドンに部位特異的変異させ
て、改変Ｆｄ鎖遺伝子を得る第２の工程と、前記改変Ｆ
ｄ鎖遺伝子と、前記Ｆａｂ’抗体のＬ鎖をコードするＬ
鎖遺伝子とを発現可能な状態で連結させ、改変Ｆａｂ’
抗体発現遺伝子を得る第３の工程と、前記改変Ｆａｂ’
抗体発現遺伝子を、前記Ｌ鎖のＣ末端に隣接して荷電性
アミノ酸残基を含むアミノ酸配列が発現するように改変
し、荷電性付与改変Ｆａｂ’抗体発現遺伝子を得る第４
の工程と、前記荷電性付与改変Ｆａｂ’抗体発現遺伝子
で宿主細胞を形質転換し、得られた形質転換体を培養す
ることにより、Ｌ鎖のＣ末端に隣接して荷電性アミノ酸
残基を含むアミノ酸配列が付加され、且つＣＨ１領域の
Ｃ末端に隣接してＬ鎖との結合に関与しないシステイン
残基を含むアミノ酸配列が形成された、等電点均一化Ｆ
ａｂ’抗体を得る第５の工程と、前記第５の工程で得ら
れた等電点均一化Ｆａｂ’抗体におけるＬ鎖との結合に
関与しないシステイン残基に発蛍光団色素を結合させる
第６の工程とを含む製造方法である。
抗体のＶＨ領域、ＣＨ１領域、および該ＣＨ１領域のＣ
末端に隣接しＬ鎖との結合に関与しないシステイン残基
を含むアミノ酸配列をコードするＦｄ鎖遺伝子を提供す
る第１の工程と、前記Ｆｄ鎖遺伝子において、前記ＣＨ
１領域のアミド基含有アミノ酸残基をコードするコドン
の少なくとも一つを、システインを除くアミド基非含有
アミノ酸残基をコードするコドンに部位特異的変異させ
て、改変Ｆｄ鎖遺伝子を得る第２の工程と、前記改変Ｆ
ｄ鎖遺伝子と、前記Ｆａｂ’抗体のＬ鎖をコードするＬ
鎖遺伝子とを発現可能な状態で連結させ、改変Ｆａｂ’
抗体発現遺伝子を得る第３の工程と、前記改変Ｆａｂ’
抗体発現遺伝子を、前記Ｌ鎖のＣ末端に隣接して荷電性
アミノ酸残基を含むアミノ酸配列が発現するように改変
し、荷電性付与改変Ｆａｂ’抗体発現遺伝子を得る第４
の工程と、前記荷電性付与改変Ｆａｂ’抗体発現遺伝子
で宿主細胞を形質転換し、得られた形質転換体を培養す
ることにより、Ｌ鎖のＣ末端に隣接して荷電性アミノ酸
残基を含むアミノ酸配列が付加され、且つＣＨ１領域の
Ｃ末端に隣接してＬ鎖との結合に関与しないシステイン
残基を含むアミノ酸配列が形成された、等電点均一化Ｆ
ａｂ’抗体を得る第５の工程と、前記第５の工程で得ら
れた等電点均一化Ｆａｂ’抗体におけるＬ鎖との結合に
関与しないシステイン残基に発蛍光団色素を結合させる
第６の工程とを含む製造方法である。
第１の工程において、Ｆａｂ’抗体のＶＨ領域、ＣＨ
１領域、および該ＣＨ１領域のＣ末端に隣接しＬ鎖との
結合に関与しないシステイン残基を含むアミノ酸配列を
コードするＦｄ鎖遺伝子を提供する方法には特に制限は
なく、例えば、以下に述べるような方法により得ること
ができる。
１領域、および該ＣＨ１領域のＣ末端に隣接しＬ鎖との
結合に関与しないシステイン残基を含むアミノ酸配列を
コードするＦｄ鎖遺伝子を提供する方法には特に制限は
なく、例えば、以下に述べるような方法により得ること
ができる。
すなわち、抗原で動物を免疫した後、例えば、Autibo
dies : A Laboratory Manual, Chapter 6, Cold Spring
harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1988に
記載の方法に準じて、モノクローナル抗体生産細胞（ハ
イブリドーマ）を調製し、このモノクローナル抗体生産
細胞から、例えば、BioMag mRNA purification kit (Pe
rSeptive社)のプロトコールに従って全ｍＲＮＡを抽出
して、このｍＲＮＡを用いて１本鎖ｃＤＮＡを合成する
（例えば、アマシャム ファルマシアバイオテク社製、
ｃＤＮＡ合成システム・プラスを好適に使用することが
できる)。
dies : A Laboratory Manual, Chapter 6, Cold Spring
harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1988に
記載の方法に準じて、モノクローナル抗体生産細胞（ハ
イブリドーマ）を調製し、このモノクローナル抗体生産
細胞から、例えば、BioMag mRNA purification kit (Pe
rSeptive社)のプロトコールに従って全ｍＲＮＡを抽出
して、このｍＲＮＡを用いて１本鎖ｃＤＮＡを合成する
（例えば、アマシャム ファルマシアバイオテク社製、
ｃＤＮＡ合成システム・プラスを好適に使用することが
できる)。
次いで、この１本鎖ｃＤＮＡを鋳型にして、ＣＨ１領
域のＣ末端に隣接する部分にＬ鎖との結合に関与しない
システイン残基を含むアミノ酸配列を導入するように設
計したＦｄ鎖遺伝子単離用のＤＮＡプライマーを用いて
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行うことによりＦｄ
鎖遺伝子を得ることができる。このＦｄ鎖遺伝子単離用
のＤＮＡプライマーは、例えば、Kabatらの分類した可
変領域（Ｖ領域）と定常領域（Ｃ領域）の核酸塩基配列
（Sequences of Proteins of Immunological Interest
5th ed., Public Health Service, NIH, Washington D
C, 1991）を参考にすることができる。また、ＣＨ１領
域のＣ末端に隣接する部分にＬ鎖との結合に関与しない
システイン残基を含むアミノ酸配列を導入するためのプ
ライマーの設計には、Hoogenboom HR et al. (Nucleic
Acids Res 1991 Aug 11;19(15):4133-7) , Kang AS et
al. (Methods (San Diego) (1991), 2(2), 111 -18）等
の各種文献を参考にすることができる。
域のＣ末端に隣接する部分にＬ鎖との結合に関与しない
システイン残基を含むアミノ酸配列を導入するように設
計したＦｄ鎖遺伝子単離用のＤＮＡプライマーを用いて
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行うことによりＦｄ
鎖遺伝子を得ることができる。このＦｄ鎖遺伝子単離用
のＤＮＡプライマーは、例えば、Kabatらの分類した可
変領域（Ｖ領域）と定常領域（Ｃ領域）の核酸塩基配列
（Sequences of Proteins of Immunological Interest
5th ed., Public Health Service, NIH, Washington D
C, 1991）を参考にすることができる。また、ＣＨ１領
域のＣ末端に隣接する部分にＬ鎖との結合に関与しない
システイン残基を含むアミノ酸配列を導入するためのプ
ライマーの設計には、Hoogenboom HR et al. (Nucleic
Acids Res 1991 Aug 11;19(15):4133-7) , Kang AS et
al. (Methods (San Diego) (1991), 2(2), 111 -18）等
の各種文献を参考にすることができる。
ＣＨ１領域のＣ末端に隣接する部分に導入するアミノ
酸配列のアミノ酸残基の数は１以上であればよく特に制
限されないが、その数は１〜３０であることが好まし
い。また、当該アミノ酸配列中のシステイン残基の数も
特に制限されないが、その数は１〜３であることが好ま
しく、１であることがより好ましい。
酸配列のアミノ酸残基の数は１以上であればよく特に制
限されないが、その数は１〜３０であることが好まし
い。また、当該アミノ酸配列中のシステイン残基の数も
特に制限されないが、その数は１〜３であることが好ま
しく、１であることがより好ましい。
なお、モノクローナル抗体生産細胞を調製するにあた
り、動物を免疫する抗原の種類、および抗原で免疫され
る動物の種類には特に制限はない。抗体遺伝子として
は、例えば、マウス、ラット、ウサギ由来のものが使用
できる。抗体のクラスおよびサブクラスについても特に
制限はないが、全抗体中に占める割合が多いことからＩ
ｇＧ抗体を構成する配列を用いることが好ましい。
り、動物を免疫する抗原の種類、および抗原で免疫され
る動物の種類には特に制限はない。抗体遺伝子として
は、例えば、マウス、ラット、ウサギ由来のものが使用
できる。抗体のクラスおよびサブクラスについても特に
制限はないが、全抗体中に占める割合が多いことからＩ
ｇＧ抗体を構成する配列を用いることが好ましい。
第２の工程では、前記Ｆｄ鎖遺伝子において、前記Ｃ
Ｈ１領域のアミド基含有アミノ酸残基をコードするコド
ンの少なくとも一つを、システインを除くアミド基非含
有アミノ酸残基をコードするコドンに部位特異的変異さ
せるが、この変異の方法については特に制限はない。例
えば、遺伝子のヌクレオチド配列の変異法として多用さ
れる部位特異的突然変異誘発（site-specific mutagene
sis）が適用可能である。部位特異的突然変異誘発の方
法に関しては、例えば、Sambrook et al., Molecular C
loning : A Laboratory Manual 2nd Edition, 15.2- 1
5.113, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbo
r, NY, 1989を参考にすることができる。
Ｈ１領域のアミド基含有アミノ酸残基をコードするコド
ンの少なくとも一つを、システインを除くアミド基非含
有アミノ酸残基をコードするコドンに部位特異的変異さ
せるが、この変異の方法については特に制限はない。例
えば、遺伝子のヌクレオチド配列の変異法として多用さ
れる部位特異的突然変異誘発（site-specific mutagene
sis）が適用可能である。部位特異的突然変異誘発の方
法に関しては、例えば、Sambrook et al., Molecular C
loning : A Laboratory Manual 2nd Edition, 15.2- 1
5.113, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbo
r, NY, 1989を参考にすることができる。
上記の部位特異的変異は、ＣＨ１領域のアミド基含有
アミノ酸残基の少なくとも一つをシステインを除くアミ
ド基非含有アミノ酸残基に置換するように設計されたＣ
Ｈ１領域増幅用プライマーを用いて、ポリメラーゼ連鎖
反応により実施されることが好ましい。このＣＨ１領域
増幅用プライマーは、Ｆｄ鎖のＣＨ１領域における少な
くとも一つのアミド基含有アミノ酸残基を含む領域をコ
ードする塩基配列に相補的な塩基配列を有するプライマ
ーであって、該塩基配列におけるアミド基含有アミノ酸
をコードするコドンに相補的なコドンの少なくとも一つ
が、システインを除くアミド基非含有アミノ酸をコード
するコドンに相補的なコドンに置換されたプライマーで
ある。
アミノ酸残基の少なくとも一つをシステインを除くアミ
ド基非含有アミノ酸残基に置換するように設計されたＣ
Ｈ１領域増幅用プライマーを用いて、ポリメラーゼ連鎖
反応により実施されることが好ましい。このＣＨ１領域
増幅用プライマーは、Ｆｄ鎖のＣＨ１領域における少な
くとも一つのアミド基含有アミノ酸残基を含む領域をコ
ードする塩基配列に相補的な塩基配列を有するプライマ
ーであって、該塩基配列におけるアミド基含有アミノ酸
をコードするコドンに相補的なコドンの少なくとも一つ
が、システインを除くアミド基非含有アミノ酸をコード
するコドンに相補的なコドンに置換されたプライマーで
ある。
上記のアミド基含有アミノ酸残基とは、側鎖にアミド
基を有するアミノ酸残基を意味し、このようなアミノ酸
残基としては、アスパラギン残基およびグルタミン残基
が挙げられる。第２の工程においては、これらのアミノ
酸残基をコードするコドンの少なくとも一つを、システ
インを除くアミド基非含有アミノ酸残基をコードするコ
ドンに部位特異的変異させる。ここで、アミド基非含有
アミノ酸残基とは、側鎖にアミド基を有しないアミノ酸
残基を意味する。システインを除くアミド基非含有アミ
ノ酸残基としては、天然アミノ酸残基および非天然アミ
ノ酸残基のいずれも適用可能である。天然アミノ酸残基
としては、グリシン残基、アラニン残基、バリン残基、
ロイシン残基、イソロイシン残基、セリン残基、トレオ
ニン残基、メチオニン残基、アスパラギン酸残基、グル
タミン酸残基、リシン残基、アルギニン残基、フェニル
アラニン残基、チロシン残基、プロリン残基、ヒスチジ
ン残基、およびトリプトファン残基が挙げられる。ま
た、非天然アミノ酸残基としては、天然アミノ酸の側鎖
を芳香環等で置換したアミノ酸、化学合成したアミノ酸
等の人工アミノ酸の残基等が挙げられる。
基を有するアミノ酸残基を意味し、このようなアミノ酸
残基としては、アスパラギン残基およびグルタミン残基
が挙げられる。第２の工程においては、これらのアミノ
酸残基をコードするコドンの少なくとも一つを、システ
インを除くアミド基非含有アミノ酸残基をコードするコ
ドンに部位特異的変異させる。ここで、アミド基非含有
アミノ酸残基とは、側鎖にアミド基を有しないアミノ酸
残基を意味する。システインを除くアミド基非含有アミ
ノ酸残基としては、天然アミノ酸残基および非天然アミ
ノ酸残基のいずれも適用可能である。天然アミノ酸残基
としては、グリシン残基、アラニン残基、バリン残基、
ロイシン残基、イソロイシン残基、セリン残基、トレオ
ニン残基、メチオニン残基、アスパラギン酸残基、グル
タミン酸残基、リシン残基、アルギニン残基、フェニル
アラニン残基、チロシン残基、プロリン残基、ヒスチジ
ン残基、およびトリプトファン残基が挙げられる。ま
た、非天然アミノ酸残基としては、天然アミノ酸の側鎖
を芳香環等で置換したアミノ酸、化学合成したアミノ酸
等の人工アミノ酸の残基等が挙げられる。
本発明においては、アミド基含有アミノ酸残基の少な
くとも一つをシステインを除くアミド基非含有アミノ酸
残基に変異させることが好ましいが、アミド基非含有ア
ミノ酸残基としてシステイン残基を用いた場合は、得ら
れるＦａｂ’抗体の等電点は均一になるものの、Ｌ鎖と
の結合に関与しないシステイン残基が多数導入されるこ
ととなり、システイン残基を介して発蛍光団色素を結合
させた場合、発蛍光団色素の数と位置が不特定となり、
複数の等電点を示す混合物となってしまう。このため
に、本発明においては、アミド基非含有アミノ酸残基と
してシステイン残基を用いないことが好ましい。
くとも一つをシステインを除くアミド基非含有アミノ酸
残基に変異させることが好ましいが、アミド基非含有ア
ミノ酸残基としてシステイン残基を用いた場合は、得ら
れるＦａｂ’抗体の等電点は均一になるものの、Ｌ鎖と
の結合に関与しないシステイン残基が多数導入されるこ
ととなり、システイン残基を介して発蛍光団色素を結合
させた場合、発蛍光団色素の数と位置が不特定となり、
複数の等電点を示す混合物となってしまう。このため
に、本発明においては、アミド基非含有アミノ酸残基と
してシステイン残基を用いないことが好ましい。
本発明においては、得られる等電点均一化Ｆａｂ’抗
体の等電点の均一性が優れることから、上記のアミド基
含非有アミノ酸残基は、アスパラギン酸残基、グルタミ
ン酸残基、グリシン残基、またはセリン残基であること
が好ましい。また、用いるＦａｂ’抗体が、カバットの
番号付けによるＨ鎖第１６２番にアスパラギン残基を有
するＦａｂ’抗体であって、このアスパラギン残基をシ
ステインを除くアミド基非含有アミノ酸残基に部位特異
的変異させることが好ましい。本発明においては、カバ
ットの番号付けによるＨ鎖第１６２番のアスパラギン残
基を、アスパラギン酸残基に変異させることが更に好ま
しい。カバットの番号付けによるＨ鎖第１６２番にアス
パラギン残基を有するＦａｂ’抗体としては、マウスＩ
ｇＧ抗体由来のＦａｂ’抗体や、ヒトＩｇＧ抗体由来の
Ｆａｂ’抗体が挙げられる。マウスＩｇＧ抗体およびヒ
トＩｇＧ抗体には様々なサブクラスが存在するが、サブ
クラスが異なるものであっても、これらの抗体由来のＦ
ａｂ’抗体はカバットの番号付けによるＨ鎖第１６２番
にアスパラギン残基を有している。ここで、カバットの
番号付けによるＨ鎖１６２番のアミノ酸残基とは、Ｆａ
ｂ’抗体のＨ鎖（Ｆｄ鎖）における１６２番目のアミノ
酸残基を意味し、この１６２番は、Elvin A Kabatによ
る、Sequences of Proteins of Immunological Interes
t (Paperback 5th edition (September 1992)) に記載
の方法に基づいて特定されるアミノ酸残基の位置を意味
する。なお、Ｆａｂ’抗体のカバットの番号付けによる
Ｈ鎖第１６２番はＦｄ鎖のＣＨ１領域中に存在する。
体の等電点の均一性が優れることから、上記のアミド基
含非有アミノ酸残基は、アスパラギン酸残基、グルタミ
ン酸残基、グリシン残基、またはセリン残基であること
が好ましい。また、用いるＦａｂ’抗体が、カバットの
番号付けによるＨ鎖第１６２番にアスパラギン残基を有
するＦａｂ’抗体であって、このアスパラギン残基をシ
ステインを除くアミド基非含有アミノ酸残基に部位特異
的変異させることが好ましい。本発明においては、カバ
ットの番号付けによるＨ鎖第１６２番のアスパラギン残
基を、アスパラギン酸残基に変異させることが更に好ま
しい。カバットの番号付けによるＨ鎖第１６２番にアス
パラギン残基を有するＦａｂ’抗体としては、マウスＩ
ｇＧ抗体由来のＦａｂ’抗体や、ヒトＩｇＧ抗体由来の
Ｆａｂ’抗体が挙げられる。マウスＩｇＧ抗体およびヒ
トＩｇＧ抗体には様々なサブクラスが存在するが、サブ
クラスが異なるものであっても、これらの抗体由来のＦ
ａｂ’抗体はカバットの番号付けによるＨ鎖第１６２番
にアスパラギン残基を有している。ここで、カバットの
番号付けによるＨ鎖１６２番のアミノ酸残基とは、Ｆａ
ｂ’抗体のＨ鎖（Ｆｄ鎖）における１６２番目のアミノ
酸残基を意味し、この１６２番は、Elvin A Kabatによ
る、Sequences of Proteins of Immunological Interes
t (Paperback 5th edition (September 1992)) に記載
の方法に基づいて特定されるアミノ酸残基の位置を意味
する。なお、Ｆａｂ’抗体のカバットの番号付けによる
Ｈ鎖第１６２番はＦｄ鎖のＣＨ１領域中に存在する。
第３の工程において、上述した第２の工程により得ら
れた改変Ｆｄ鎖遺伝子を、Ｆａｂ’抗体のＬ鎖をコード
するＬ鎖遺伝子と発現可能な状態で連結させ、改変Ｆａ
ｂ’抗体発現遺伝子を得る。
れた改変Ｆｄ鎖遺伝子を、Ｆａｂ’抗体のＬ鎖をコード
するＬ鎖遺伝子と発現可能な状態で連結させ、改変Ｆａ
ｂ’抗体発現遺伝子を得る。
Ｆａｂ’抗体のＬ鎖をコードするＬ鎖遺伝子は、第１
の工程においてＦｄ鎖遺伝子を得る方法と同様の方法に
より得ることができる。すなわち、抗原で動物を免疫し
た後、モノクローナル抗体生産細胞（ハイブリドーマ）
を調製し、このモノクローナル抗体生産細胞から、全ｍ
ＲＮＡを抽出して、このｍＲＮＡを用いて１本鎖ｃＤＮ
Ａを合成し、このｃＤＮＡを鋳型としてＬ鎖遺伝子単離
用ＤＮＡプライマーを用いてＰＣＲを行えばよい。Ｌ鎖
遺伝子は、第１の工程においてＦｄ鎖遺伝子を単離する
のと同時に得ることもできる。この場合は、第１の工程
において、Ｆｄ鎖遺伝子単離用ＤＮＡプライマーとＬ鎖
遺伝子単離用ＤＮＡプライマーを併用し、ｃＤＮＡを鋳
型としてＰＣＲを行えばよい。
の工程においてＦｄ鎖遺伝子を得る方法と同様の方法に
より得ることができる。すなわち、抗原で動物を免疫し
た後、モノクローナル抗体生産細胞（ハイブリドーマ）
を調製し、このモノクローナル抗体生産細胞から、全ｍ
ＲＮＡを抽出して、このｍＲＮＡを用いて１本鎖ｃＤＮ
Ａを合成し、このｃＤＮＡを鋳型としてＬ鎖遺伝子単離
用ＤＮＡプライマーを用いてＰＣＲを行えばよい。Ｌ鎖
遺伝子は、第１の工程においてＦｄ鎖遺伝子を単離する
のと同時に得ることもできる。この場合は、第１の工程
において、Ｆｄ鎖遺伝子単離用ＤＮＡプライマーとＬ鎖
遺伝子単離用ＤＮＡプライマーを併用し、ｃＤＮＡを鋳
型としてＰＣＲを行えばよい。
本発明においては、Ｆｄ鎖遺伝子におけるＣＨ１領域
のアミド基含有アミノ酸残基をコードするコドンの少な
くとも一つをシステインを除くアミド基非含有アミノ酸
残基をコードするコドンに部位特異的変異させることに
加え、上記のようにして得られたＬ鎖遺伝子における、
ＣＬ領域のアミド基含有アミノ酸残基（アスパラギン残
基および／またはグルタミン残基）をコードするコドン
の少なくとも一つを、システインを除くアミド基非含有
アミノ酸残基をコードするコドンに部位特異的変異させ
てもよい。この部位特異的変異は、改変Ｆｄ鎖遺伝子と
発現可能な状態で連結させる前もしくは後に行うことが
できる。この場合、用いるＦａｂ’抗体が、カバットの
番号付けによるＬ鎖第１５７番、Ｌ鎖第１６１番、Ｌ鎖
第１９０番（いずれもＣＬ領域中に存在）の少なくとも
１つにアスパラギン残基を有するＦａｂ’抗体であるこ
とが好ましく、このアスパラギン残基の少なくとも一つ
を、システインを除くアミド基非含有アミノ酸残基に部
位特異的変異させることが好ましい。なかでも、カバッ
トの番号付けによるＬ鎖第１６１番のアスパラギン残基
を、システインを除くアミド基非含有アミノ酸残基に部
位特異的変異させることが好ましく、Ｌ鎖第１６１番の
アスパラギン残基をアスパラギン酸残基に変異させるこ
とが更に好ましい。部位特異的変異の方法に関しては、
上記のように、Sambrook et al., Molecular Cloning :
A Laboratory Manual 2nd Edition, 15.2- 15.113, Co
ld Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 19
89を参考にすることができる。また、ＣＨ１領域の場合
と同様に、ＣＬ領域の部位特異的変異は、ＣＬ領域のア
ミド基含有アミノ酸残基の少なくとも一つをシステイン
を除くアミド基非含有アミノ酸残基に置換するＣＬ領域
増幅用プライマーを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応によ
り実施されることが好ましい。
のアミド基含有アミノ酸残基をコードするコドンの少な
くとも一つをシステインを除くアミド基非含有アミノ酸
残基をコードするコドンに部位特異的変異させることに
加え、上記のようにして得られたＬ鎖遺伝子における、
ＣＬ領域のアミド基含有アミノ酸残基（アスパラギン残
基および／またはグルタミン残基）をコードするコドン
の少なくとも一つを、システインを除くアミド基非含有
アミノ酸残基をコードするコドンに部位特異的変異させ
てもよい。この部位特異的変異は、改変Ｆｄ鎖遺伝子と
発現可能な状態で連結させる前もしくは後に行うことが
できる。この場合、用いるＦａｂ’抗体が、カバットの
番号付けによるＬ鎖第１５７番、Ｌ鎖第１６１番、Ｌ鎖
第１９０番（いずれもＣＬ領域中に存在）の少なくとも
１つにアスパラギン残基を有するＦａｂ’抗体であるこ
とが好ましく、このアスパラギン残基の少なくとも一つ
を、システインを除くアミド基非含有アミノ酸残基に部
位特異的変異させることが好ましい。なかでも、カバッ
トの番号付けによるＬ鎖第１６１番のアスパラギン残基
を、システインを除くアミド基非含有アミノ酸残基に部
位特異的変異させることが好ましく、Ｌ鎖第１６１番の
アスパラギン残基をアスパラギン酸残基に変異させるこ
とが更に好ましい。部位特異的変異の方法に関しては、
上記のように、Sambrook et al., Molecular Cloning :
A Laboratory Manual 2nd Edition, 15.2- 15.113, Co
ld Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 19
89を参考にすることができる。また、ＣＨ１領域の場合
と同様に、ＣＬ領域の部位特異的変異は、ＣＬ領域のア
ミド基含有アミノ酸残基の少なくとも一つをシステイン
を除くアミド基非含有アミノ酸残基に置換するＣＬ領域
増幅用プライマーを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応によ
り実施されることが好ましい。
このようにして得られたＬ鎖遺伝子と上記の改変Ｆｄ
鎖遺伝子とを、リンカー塩基配列等を介して連結させる
ことにより、両遺伝子が発現可能な改変Ｆａｂ’抗体発
現遺伝子を得ることができる。より詳しくは、Ｌ鎖遺伝
子、改変Ｆｄ鎖遺伝子およびリンカー塩基配列を、例え
ば低融点アガロースゲル電気泳動で精製し、適当な制限
酵素を用いてこれらを消化させ、改変Ｆｄ鎖遺伝子、リ
ンカー塩基配列、Ｌ鎖遺伝子の順番に並ぶようにしてラ
イゲーションすることにより、Ｌ鎖遺伝子と改変Ｆｄ鎖
遺伝子とが発現可能な状態で連結した改変Ｆａｂ’抗体
発現遺伝子を得ることができる。なお、リンカー塩基配
列は、例えば、タンパク質発現用プラスミドベクターを
鋳型とし、リンカー塩基配列単離用のＤＮＡプライマー
を用いてＰＣＲにより得ることができる。
鎖遺伝子とを、リンカー塩基配列等を介して連結させる
ことにより、両遺伝子が発現可能な改変Ｆａｂ’抗体発
現遺伝子を得ることができる。より詳しくは、Ｌ鎖遺伝
子、改変Ｆｄ鎖遺伝子およびリンカー塩基配列を、例え
ば低融点アガロースゲル電気泳動で精製し、適当な制限
酵素を用いてこれらを消化させ、改変Ｆｄ鎖遺伝子、リ
ンカー塩基配列、Ｌ鎖遺伝子の順番に並ぶようにしてラ
イゲーションすることにより、Ｌ鎖遺伝子と改変Ｆｄ鎖
遺伝子とが発現可能な状態で連結した改変Ｆａｂ’抗体
発現遺伝子を得ることができる。なお、リンカー塩基配
列は、例えば、タンパク質発現用プラスミドベクターを
鋳型とし、リンカー塩基配列単離用のＤＮＡプライマー
を用いてＰＣＲにより得ることができる。
上記の第３の工程に続く第４の工程において、前記改
変Ｆａｂ’抗体発現遺伝子を、Ｌ鎖のＣ末端に隣接して
荷電性アミノ酸残基を含むアミノ酸配列が発現するよう
に改変し、荷電性付与改変Ｆａｂ’抗体発現遺伝子を得
る。
変Ｆａｂ’抗体発現遺伝子を、Ｌ鎖のＣ末端に隣接して
荷電性アミノ酸残基を含むアミノ酸配列が発現するよう
に改変し、荷電性付与改変Ｆａｂ’抗体発現遺伝子を得
る。
この改変の方法は特に制限されないが、例えば、改変
Ｆａｂ’抗体発現遺伝子を鋳型として、Ｆａｂ’抗体の
Ｌ鎖のＣ末端に隣接する部分に荷電性アミノ酸残基を含
むアミノ酸配列を付加するように設計されたプライマー
を用いてＰＣＲを行うことにより得ることが可能であ
る。
Ｆａｂ’抗体発現遺伝子を鋳型として、Ｆａｂ’抗体の
Ｌ鎖のＣ末端に隣接する部分に荷電性アミノ酸残基を含
むアミノ酸配列を付加するように設計されたプライマー
を用いてＰＣＲを行うことにより得ることが可能であ
る。
第５の工程においては、前記荷電性付与改変Ｆａｂ’
抗体発現遺伝子で宿主細胞を形質転換し、得られた形質
転換体を培養することにより、Ｌ鎖のＣ末端に隣接して
荷電性アミノ酸残基を含むアミノ酸配列が付加され、且
つＣＨ１領域のＣ末端に隣接してＬ鎖との結合に関与し
ないシステイン残基を含むアミノ酸配列が形成された、
等電点均一化Ｆａｂ’抗体を得る。
抗体発現遺伝子で宿主細胞を形質転換し、得られた形質
転換体を培養することにより、Ｌ鎖のＣ末端に隣接して
荷電性アミノ酸残基を含むアミノ酸配列が付加され、且
つＣＨ１領域のＣ末端に隣接してＬ鎖との結合に関与し
ないシステイン残基を含むアミノ酸配列が形成された、
等電点均一化Ｆａｂ’抗体を得る。
すなわち、第４の工程で得られた荷電性付与改変Ｆａ
ｂ’抗体発現遺伝子を適当なベクターに連結し、それを
宿主細胞に導入し形質転換する。ベクターとしては、プ
ラスミドに由来するもの、ファージに由来するもの、コ
スミド等様々な公知のベクターを使用することができ
る。宿主細胞としては、例えば、原核細胞すなわち、大
腸菌（SOLR,JM109,XL1-BlueKRF',BL21(DE3),HB2151)、
枯草菌、バチルス・ブレビス（Bacillus brevis）菌、
真核細胞すなわち、酵母、動物由来の細胞（HB101、CHO
細胞、 COS 細胞、COP-5 、 C127、 3T3細胞等）を挙げ
ることができる。宿主細胞としては、Ｆａｂ’抗体が分
解されにくい点から、タンパク質分解酵素非生産菌を使
用することが好ましい。
ｂ’抗体発現遺伝子を適当なベクターに連結し、それを
宿主細胞に導入し形質転換する。ベクターとしては、プ
ラスミドに由来するもの、ファージに由来するもの、コ
スミド等様々な公知のベクターを使用することができ
る。宿主細胞としては、例えば、原核細胞すなわち、大
腸菌（SOLR,JM109,XL1-BlueKRF',BL21(DE3),HB2151)、
枯草菌、バチルス・ブレビス（Bacillus brevis）菌、
真核細胞すなわち、酵母、動物由来の細胞（HB101、CHO
細胞、 COS 細胞、COP-5 、 C127、 3T3細胞等）を挙げ
ることができる。宿主細胞としては、Ｆａｂ’抗体が分
解されにくい点から、タンパク質分解酵素非生産菌を使
用することが好ましい。
ベクターを宿主細胞に導入する方法としては、マイク
ロインジェクション法、エレクトロポレーション法等を
含む公知の方法が適用可能である。形質転換体の培養方
法に関しても特に制限はなく、形質転換体の培養に適し
た培地を選択すればよい。また、形質転換体の培養によ
り生産された等電点均一化Ｆａｂ’抗体を抽出する方法
としては、細胞をホモジナイズする方法、ＳＤＳ等の界
面活性剤や酵素を用いて細胞膜を溶解させる方法、超音
波処理等がある。抽出された等電点均一化Ｆａｂ’抗体
の精製法としては、例えば、超遠心や密度勾配遠心を利
用した遠心分離法、アフィニティーカラム等を利用した
カラム分離法、ポリアクリルアミドゲル等を利用したゲ
ル分離法等が挙げられる。
ロインジェクション法、エレクトロポレーション法等を
含む公知の方法が適用可能である。形質転換体の培養方
法に関しても特に制限はなく、形質転換体の培養に適し
た培地を選択すればよい。また、形質転換体の培養によ
り生産された等電点均一化Ｆａｂ’抗体を抽出する方法
としては、細胞をホモジナイズする方法、ＳＤＳ等の界
面活性剤や酵素を用いて細胞膜を溶解させる方法、超音
波処理等がある。抽出された等電点均一化Ｆａｂ’抗体
の精製法としては、例えば、超遠心や密度勾配遠心を利
用した遠心分離法、アフィニティーカラム等を利用した
カラム分離法、ポリアクリルアミドゲル等を利用したゲ
ル分離法等が挙げられる。
第６の工程では、第５の工程で得られた等電点均一化
Ｆａｂ’抗体のＬ鎖との結合に関与しないシステイン残
基に発蛍光団色素を結合させる。
Ｆａｂ’抗体のＬ鎖との結合に関与しないシステイン残
基に発蛍光団色素を結合させる。
発蛍光団色素としては上述したようなものを用いるこ
とができ、発蛍光団色素と等電点均一化Ｆａｂ’抗体と
を反応させたときに生じる結合としては、上述のよう
に、チオエステル結合、ジチオエステル結合、チオエー
テル結合からなる群より選ばれる少なくとも１つの結合
であることが好ましい。このとき、等電点均一化Ｆａ
ｂ’抗体のＣＨ１領域のＣ末端に隣接するアミノ酸配列
中のシステイン残基のＳＨ基に発蛍光団色素を直接反応
させてもよいが、発蛍光団色素中の官能基に反応性の官
能基と、等電点均一化Ｆａｂ’抗体の前記ＳＨ基に反応
性の官能基とをそれぞれ少なくとも１個有した多官能化
合物を介して結合させてもよい。
とができ、発蛍光団色素と等電点均一化Ｆａｂ’抗体と
を反応させたときに生じる結合としては、上述のよう
に、チオエステル結合、ジチオエステル結合、チオエー
テル結合からなる群より選ばれる少なくとも１つの結合
であることが好ましい。このとき、等電点均一化Ｆａ
ｂ’抗体のＣＨ１領域のＣ末端に隣接するアミノ酸配列
中のシステイン残基のＳＨ基に発蛍光団色素を直接反応
させてもよいが、発蛍光団色素中の官能基に反応性の官
能基と、等電点均一化Ｆａｂ’抗体の前記ＳＨ基に反応
性の官能基とをそれぞれ少なくとも１個有した多官能化
合物を介して結合させてもよい。
以上述べた遺伝子工学的手法による第１の製造方法で
は、第３の工程において改変Ｆｄ鎖遺伝子とＬ鎖遺伝子
を発現可能な状態で連結させた後に、第４の工程におい
て、Ｌ鎖のＣ末端に隣接して荷電性アミノ酸残基を含む
アミノ酸配列が発現するように改変したが、改変Ｆｄ鎖
遺伝子とＬ鎖遺伝子を連結させる前に、Ｌ鎖のＣ末端に
隣接して荷電性アミノ酸残基を含むアミノ酸配列が発現
するように、Ｌ鎖遺伝子を改変してもよい（この手法
を、遺伝子工学的手法による第２の製造方法と呼ぶ）。
は、第３の工程において改変Ｆｄ鎖遺伝子とＬ鎖遺伝子
を発現可能な状態で連結させた後に、第４の工程におい
て、Ｌ鎖のＣ末端に隣接して荷電性アミノ酸残基を含む
アミノ酸配列が発現するように改変したが、改変Ｆｄ鎖
遺伝子とＬ鎖遺伝子を連結させる前に、Ｌ鎖のＣ末端に
隣接して荷電性アミノ酸残基を含むアミノ酸配列が発現
するように、Ｌ鎖遺伝子を改変してもよい（この手法
を、遺伝子工学的手法による第２の製造方法と呼ぶ）。
すなわち、遺伝子工学的手法による第２の製造方法に
おいては、第１の工程において、Ｆａｂ’抗体のＶＨ領
域、ＣＨ１領域、および該ＣＨ１領域のＣ末端に隣接し
Ｌ鎖との結合に関与しないシステイン残基を含むアミノ
酸配列をコードするＦｄ鎖遺伝子を提供し、第２の工程
において、前記Ｆｄ鎖遺伝子の前記ＣＨ１領域のアミド
基含有アミノ酸残基をコードするコドンの少なくとも一
つを、システインを除くアミド基非含有アミノ酸残基を
コードするコドンに部位特異的変異させて、改変Ｆｄ鎖
遺伝子を得る。
おいては、第１の工程において、Ｆａｂ’抗体のＶＨ領
域、ＣＨ１領域、および該ＣＨ１領域のＣ末端に隣接し
Ｌ鎖との結合に関与しないシステイン残基を含むアミノ
酸配列をコードするＦｄ鎖遺伝子を提供し、第２の工程
において、前記Ｆｄ鎖遺伝子の前記ＣＨ１領域のアミド
基含有アミノ酸残基をコードするコドンの少なくとも一
つを、システインを除くアミド基非含有アミノ酸残基を
コードするコドンに部位特異的変異させて、改変Ｆｄ鎖
遺伝子を得る。
この第１の工程および第２の工程は、上記の遺伝子工
学的手法による第１の製造方法における第１の工程およ
び第２の工程と同様に行うことができる。なお、ＣＨ１
領域のＣ末端に隣接する部分に導入するアミノ酸配列の
アミノ酸残基の数の好適な範囲、および当該アミノ酸配
列中のシステイン残基の数の好適な範囲、抗原や抗体の
種類は、遺伝子工学的手法による第１の製造方法の第１
の工程に記載と同様である。また、用いることのできる
アミド基含有アミノ酸残基およびアミド基非含有アミノ
酸残基の種類や好適な残基は、遺伝子工学的手法による
第１の製造方法の第２の工程に記載の方法と同様であ
る。
学的手法による第１の製造方法における第１の工程およ
び第２の工程と同様に行うことができる。なお、ＣＨ１
領域のＣ末端に隣接する部分に導入するアミノ酸配列の
アミノ酸残基の数の好適な範囲、および当該アミノ酸配
列中のシステイン残基の数の好適な範囲、抗原や抗体の
種類は、遺伝子工学的手法による第１の製造方法の第１
の工程に記載と同様である。また、用いることのできる
アミド基含有アミノ酸残基およびアミド基非含有アミノ
酸残基の種類や好適な残基は、遺伝子工学的手法による
第１の製造方法の第２の工程に記載の方法と同様であ
る。
第３の工程において、Ｆａｂ’抗体のＬ鎖をコードす
るＬ鎖遺伝子を提供するが、Ｌ鎖遺伝子は、上記の遺伝
子工学的手法による第１の製造方法における第３の工程
に記載の方法と同様にして得ることができる。また、Ｌ
鎖遺伝子は、本製造方法の第１の工程においてＦｄ鎖遺
伝子を得るのと同時に得ることもできる。
るＬ鎖遺伝子を提供するが、Ｌ鎖遺伝子は、上記の遺伝
子工学的手法による第１の製造方法における第３の工程
に記載の方法と同様にして得ることができる。また、Ｌ
鎖遺伝子は、本製造方法の第１の工程においてＦｄ鎖遺
伝子を得るのと同時に得ることもできる。
第３の工程に続く第４の工程においては、Ｌ鎖遺伝子
を、Ｌ鎖のＣ末端に隣接して荷電性アミノ酸残基を含む
アミノ酸配列が発現するように改変し、荷電性付与Ｌ鎖
遺伝子を得る。この工程における改変は、上記の遺伝子
工学的手法による第１の製造方法における第４の工程に
記載の方法と同様に行うことができる。なお、Ｌ鎖遺伝
子における、ＣＬ領域のアミド基含有アミノ酸残基をコ
ードするコドンの少なくとも一つを、システインを除く
アミド基非含有アミノ酸残基をコードするコドンに部位
特異的変異させてもよい。この部位特異的変異は第３の
工程において行うこともできる。
を、Ｌ鎖のＣ末端に隣接して荷電性アミノ酸残基を含む
アミノ酸配列が発現するように改変し、荷電性付与Ｌ鎖
遺伝子を得る。この工程における改変は、上記の遺伝子
工学的手法による第１の製造方法における第４の工程に
記載の方法と同様に行うことができる。なお、Ｌ鎖遺伝
子における、ＣＬ領域のアミド基含有アミノ酸残基をコ
ードするコドンの少なくとも一つを、システインを除く
アミド基非含有アミノ酸残基をコードするコドンに部位
特異的変異させてもよい。この部位特異的変異は第３の
工程において行うこともできる。
第５の工程においては、上記改変Ｆｄ鎖遺伝子と、上
記荷電性付与Ｌ鎖遺伝子を発現可能な状態で連結させ、
荷電性付与改変Ｆａｂ’抗体発現遺伝子を得る。この工
程において、発現可能な状態で連結させる条件に関して
は、上記の遺伝子工学的手法による第１の製造方法にお
ける第３の工程に記載の方法と同様である。
記荷電性付与Ｌ鎖遺伝子を発現可能な状態で連結させ、
荷電性付与改変Ｆａｂ’抗体発現遺伝子を得る。この工
程において、発現可能な状態で連結させる条件に関して
は、上記の遺伝子工学的手法による第１の製造方法にお
ける第３の工程に記載の方法と同様である。
次いで、第６の工程において、前記荷電性付与改変Ｆ
ａｂ’抗体発現遺伝子で宿主細胞を形質転換し、得られ
た形質転換体を培養することにより、Ｌ鎖のＣ末端に隣
接して荷電性アミノ酸残基を含むアミノ酸配列が付加さ
れ、且つＣＨ１領域のＣ末端に隣接してＬ鎖との結合に
関与しないシステイン残基を含むアミノ酸配列が形成さ
れた、等電点均一化Ｆａｂ’抗体を得て、第７の工程に
おいて、等電点均一化Ｆａｂ’抗体におけるＬ鎖との結
合に関与しないシステイン残基に発蛍光団色素を結合さ
せる。この第６の工程および第７の工程は、上記の遺伝
子工学的手法による第１の製造方法における第５の工程
および第６の工程にそれぞれ記載の方法と同様である。
ａｂ’抗体発現遺伝子で宿主細胞を形質転換し、得られ
た形質転換体を培養することにより、Ｌ鎖のＣ末端に隣
接して荷電性アミノ酸残基を含むアミノ酸配列が付加さ
れ、且つＣＨ１領域のＣ末端に隣接してＬ鎖との結合に
関与しないシステイン残基を含むアミノ酸配列が形成さ
れた、等電点均一化Ｆａｂ’抗体を得て、第７の工程に
おいて、等電点均一化Ｆａｂ’抗体におけるＬ鎖との結
合に関与しないシステイン残基に発蛍光団色素を結合さ
せる。この第６の工程および第７の工程は、上記の遺伝
子工学的手法による第１の製造方法における第５の工程
および第６の工程にそれぞれ記載の方法と同様である。
以上述べた遺伝子工学的手法による第１および第２の
製造方法では、Ｆｄ鎖遺伝子の部位特異的変異を行った
後に、Ｌ鎖遺伝子と連結を行ったが、遺伝子工学的手法
による第３の製造方法として、Ｆｄ鎖遺伝子とＬ鎖遺伝
子とを連結した後に、Ｆｄ鎖遺伝子の部位特異的変異を
行うことも可能である。
製造方法では、Ｆｄ鎖遺伝子の部位特異的変異を行った
後に、Ｌ鎖遺伝子と連結を行ったが、遺伝子工学的手法
による第３の製造方法として、Ｆｄ鎖遺伝子とＬ鎖遺伝
子とを連結した後に、Ｆｄ鎖遺伝子の部位特異的変異を
行うことも可能である。
すなわち、まず、第１の工程として、Ｆａｂ’抗体の
ＶＨ領域、ＣＨ１領域、および該ＣＨ１領域のＣ末端に
隣接しＬ鎖との結合に関与しないシステイン残基を含む
アミノ酸配列をコードするＦｄ鎖遺伝子と、該Ｆａｂ’
抗体のＬ鎖をコードするＬ鎖遺伝子とを提供する工程を
実施し、それに続く第２の工程において、このＦｄ鎖遺
伝子とＬ鎖遺伝子とを発現可能な状態で連結させ、Ｆａ
ｂ’抗体発現遺伝子を得る。ここで、Ｆｄ鎖遺伝子は、
上述の遺伝子工学的手法による第１の製造方法における
第１の工程に記載の方法と同様にして得ることができ、
Ｌ鎖遺伝子は、遺伝子工学的手法による第１の製造方法
における第３の工程に記載の方法と同様にして得ること
ができる。Ｆｄ鎖遺伝子およびＬ鎖遺伝子を発現可能な
状態で連結させる方法も、遺伝子工学的手法による第１
の製造方法における第３の工程に記載の方法と同様であ
る。すなわち、タンパク質発現用プラスミドベクターを
鋳型とし、リンカー塩基配列単離用のＤＮＡプライマー
を用いてリンカー塩基配列を得て、このリンカー塩基配
列とＦｄ鎖遺伝子およびＬ鎖遺伝子をライゲーションす
ればよい。なお、ＣＨ１領域のＣ末端に隣接する部分に
導入するアミノ酸配列のアミノ酸残基の数の好適な範
囲、および当該アミノ酸配列中のシステイン残基の数の
好適な範囲も、遺伝子工学的手法による第１の製造方法
と同様である。
ＶＨ領域、ＣＨ１領域、および該ＣＨ１領域のＣ末端に
隣接しＬ鎖との結合に関与しないシステイン残基を含む
アミノ酸配列をコードするＦｄ鎖遺伝子と、該Ｆａｂ’
抗体のＬ鎖をコードするＬ鎖遺伝子とを提供する工程を
実施し、それに続く第２の工程において、このＦｄ鎖遺
伝子とＬ鎖遺伝子とを発現可能な状態で連結させ、Ｆａ
ｂ’抗体発現遺伝子を得る。ここで、Ｆｄ鎖遺伝子は、
上述の遺伝子工学的手法による第１の製造方法における
第１の工程に記載の方法と同様にして得ることができ、
Ｌ鎖遺伝子は、遺伝子工学的手法による第１の製造方法
における第３の工程に記載の方法と同様にして得ること
ができる。Ｆｄ鎖遺伝子およびＬ鎖遺伝子を発現可能な
状態で連結させる方法も、遺伝子工学的手法による第１
の製造方法における第３の工程に記載の方法と同様であ
る。すなわち、タンパク質発現用プラスミドベクターを
鋳型とし、リンカー塩基配列単離用のＤＮＡプライマー
を用いてリンカー塩基配列を得て、このリンカー塩基配
列とＦｄ鎖遺伝子およびＬ鎖遺伝子をライゲーションす
ればよい。なお、ＣＨ１領域のＣ末端に隣接する部分に
導入するアミノ酸配列のアミノ酸残基の数の好適な範
囲、および当該アミノ酸配列中のシステイン残基の数の
好適な範囲も、遺伝子工学的手法による第１の製造方法
と同様である。
第３の工程では、前記Ｆａｂ’抗体発現遺伝子を、前
記Ｌ鎖のＣ末端に隣接して荷電性アミノ酸残基を含むア
ミノ酸配列が発現するように改変し、且つ、前記Ｆａ
ｂ’抗体発現遺伝子における前記ＣＨ１領域のアミド基
含有アミノ酸残基をコードするコドンの少なくとも一つ
を、システインを除くアミド基非含有アミノ酸残基をコ
ードするコドンに部位特異的変異させて、荷電性付与改
変Ｆａｂ’抗体発現遺伝子を得る。
記Ｌ鎖のＣ末端に隣接して荷電性アミノ酸残基を含むア
ミノ酸配列が発現するように改変し、且つ、前記Ｆａ
ｂ’抗体発現遺伝子における前記ＣＨ１領域のアミド基
含有アミノ酸残基をコードするコドンの少なくとも一つ
を、システインを除くアミド基非含有アミノ酸残基をコ
ードするコドンに部位特異的変異させて、荷電性付与改
変Ｆａｂ’抗体発現遺伝子を得る。
ここで、Ｌ鎖のＣ末端に隣接して荷電性アミノ酸残基
を含むアミノ酸配列が発現するようにする改変と、ＣＨ
１領域のアミド基含有アミノ酸残基をコードするコドン
の少なくとも一つを、システインを除くアミド基非含有
アミノ酸残基をコードするコドンに部位特異的変異する
改変とを行う順には特に制限はない。
を含むアミノ酸配列が発現するようにする改変と、ＣＨ
１領域のアミド基含有アミノ酸残基をコードするコドン
の少なくとも一つを、システインを除くアミド基非含有
アミノ酸残基をコードするコドンに部位特異的変異する
改変とを行う順には特に制限はない。
例えば、Ｆａｂ’抗体発現遺伝子を、Ｌ鎖のＣ末端に
隣接して荷電性アミノ酸残基を含むアミノ酸配列が発現
するように改変し、荷電性付与Ｆａｂ’抗体発現遺伝子
を得て、該荷電性付与Ｆａｂ’抗体発現遺伝子におけ
る、ＣＨ１領域のアミド基含有アミノ酸残基をコードす
るコドンの少なくとも一つを、システインを除くアミド
基非含有アミノ酸残基をコードするコドンに部位特異的
変異し、荷電性付与改変Ｆａｂ’抗体発現遺伝子を得て
もよく、Ｆａｂ’抗体発現遺伝子における、ＣＨ１領域
のアミド基含有アミノ酸残基をコードするコドンの少な
くとも一つを、システインを除くアミド基非含有アミノ
酸残基をコードするコドンに部位特異的変異し、改変Ｆ
ａｂ’抗体発現遺伝子を得て、該改変Ｆａｂ’抗体発現
遺伝子を、Ｌ鎖のＣ末端に隣接して荷電性アミノ酸残基
を含むアミノ酸配列が発現するように改変し、荷電性付
与改変Ｆａｂ’抗体発現遺伝子を得てもよい。
隣接して荷電性アミノ酸残基を含むアミノ酸配列が発現
するように改変し、荷電性付与Ｆａｂ’抗体発現遺伝子
を得て、該荷電性付与Ｆａｂ’抗体発現遺伝子におけ
る、ＣＨ１領域のアミド基含有アミノ酸残基をコードす
るコドンの少なくとも一つを、システインを除くアミド
基非含有アミノ酸残基をコードするコドンに部位特異的
変異し、荷電性付与改変Ｆａｂ’抗体発現遺伝子を得て
もよく、Ｆａｂ’抗体発現遺伝子における、ＣＨ１領域
のアミド基含有アミノ酸残基をコードするコドンの少な
くとも一つを、システインを除くアミド基非含有アミノ
酸残基をコードするコドンに部位特異的変異し、改変Ｆ
ａｂ’抗体発現遺伝子を得て、該改変Ｆａｂ’抗体発現
遺伝子を、Ｌ鎖のＣ末端に隣接して荷電性アミノ酸残基
を含むアミノ酸配列が発現するように改変し、荷電性付
与改変Ｆａｂ’抗体発現遺伝子を得てもよい。
第３の工程における、部位特異的変異の方法は、上記
の遺伝子工学的手法による第１の製造方法における第２
の工程に記載の方法と同様に行うことができる。用いる
ことのできるアミド基含有アミノ酸およびアミド基非含
有アミノ酸残基の種類や好適な残基に関しても、上記の
遺伝子工学的手法による第１の製造方法と同様である。
また、Ｌ鎖のＣ末端に隣接して荷電性アミノ酸残基を含
むアミノ酸配列が発現するようにする改変は、上記の遺
伝子工学的手法による第１の製造方法における第４の工
程に記載の方法と同様に行うことができる。
の遺伝子工学的手法による第１の製造方法における第２
の工程に記載の方法と同様に行うことができる。用いる
ことのできるアミド基含有アミノ酸およびアミド基非含
有アミノ酸残基の種類や好適な残基に関しても、上記の
遺伝子工学的手法による第１の製造方法と同様である。
また、Ｌ鎖のＣ末端に隣接して荷電性アミノ酸残基を含
むアミノ酸配列が発現するようにする改変は、上記の遺
伝子工学的手法による第１の製造方法における第４の工
程に記載の方法と同様に行うことができる。
なお、第３の工程において、Ｆａｂ’抗体発現遺伝子
におけるＣＬ領域のアミド基含有アミノ酸残基をコード
するコドンの少なくとも一つを、システインを除くアミ
ド基非含有アミノ酸残基をコードするコドンに部位特異
的変異させてもよい。この部位特異的変異は第１の工程
において行うこともできる。
におけるＣＬ領域のアミド基含有アミノ酸残基をコード
するコドンの少なくとも一つを、システインを除くアミ
ド基非含有アミノ酸残基をコードするコドンに部位特異
的変異させてもよい。この部位特異的変異は第１の工程
において行うこともできる。
第４の工程においては、第３の工程において得られた
荷電性付与改変Ｆａｂ’抗体発現遺伝子で宿主細胞を形
質転換し、得られた形質転換体を培養することにより、
Ｌ鎖のＣ末端に隣接して荷電性アミノ酸残基を含むアミ
ノ酸配列が付加され、且つＣＨ１領域のＣ末端に隣接し
てＬ鎖との結合に関与しないシステイン残基を含むアミ
ノ酸配列が形成された、等電点均一化Ｆａｂ’抗体を得
る。このとき用いられる宿主細胞の種類、宿主細胞に導
入されるベクターの種類、ベクターを宿主細胞に導入す
る方法、および形質転換体の培養により生産された等電
点均一化Ｆａｂ’抗体を抽出する方法に関しては、上記
の遺伝子工学的手法による第１の製造方法における第５
の工程に記載の方法と同様である。
荷電性付与改変Ｆａｂ’抗体発現遺伝子で宿主細胞を形
質転換し、得られた形質転換体を培養することにより、
Ｌ鎖のＣ末端に隣接して荷電性アミノ酸残基を含むアミ
ノ酸配列が付加され、且つＣＨ１領域のＣ末端に隣接し
てＬ鎖との結合に関与しないシステイン残基を含むアミ
ノ酸配列が形成された、等電点均一化Ｆａｂ’抗体を得
る。このとき用いられる宿主細胞の種類、宿主細胞に導
入されるベクターの種類、ベクターを宿主細胞に導入す
る方法、および形質転換体の培養により生産された等電
点均一化Ｆａｂ’抗体を抽出する方法に関しては、上記
の遺伝子工学的手法による第１の製造方法における第５
の工程に記載の方法と同様である。
第５の工程においては、第４の工程で得られた等電点
均一化Ｆａｂ’抗体におけるＬ鎖との結合に関与しない
システイン残基に発蛍光団色素を結合させる。用いられ
る発蛍光団色素および好適なものの種類、システイン残
基と発蛍光団色素との結合に関しては、上記の遺伝子工
学的手法による第１の製造方法における第６の工程に記
載の方法と同様である。
均一化Ｆａｂ’抗体におけるＬ鎖との結合に関与しない
システイン残基に発蛍光団色素を結合させる。用いられ
る発蛍光団色素および好適なものの種類、システイン残
基と発蛍光団色素との結合に関しては、上記の遺伝子工
学的手法による第１の製造方法における第６の工程に記
載の方法と同様である。
上記の遺伝子工学的手法による第１〜第３の製造方法
に加えて、以下に述べる遺伝子工学的手法による第４の
製造方法も適用可能である。
に加えて、以下に述べる遺伝子工学的手法による第４の
製造方法も適用可能である。
すなわち、まず、第１の工程として、第１のＦａｂ’
抗体のＣＨ１領域、および該ＣＨ１領域のＣ末端に隣接
しＬ鎖との結合に関与しないシステイン残基を含むアミ
ノ酸配列をコードするＣＨ１遺伝子と、該第１のＦａ
ｂ’抗体のＣＬ領域をコードするＣＬ遺伝子とを提供す
る工程を行う。
抗体のＣＨ１領域、および該ＣＨ１領域のＣ末端に隣接
しＬ鎖との結合に関与しないシステイン残基を含むアミ
ノ酸配列をコードするＣＨ１遺伝子と、該第１のＦａ
ｂ’抗体のＣＬ領域をコードするＣＬ遺伝子とを提供す
る工程を行う。
第１の工程におけるＣＨ１遺伝子は、例えば、上述の
ように、モノクローナル抗体生産細胞（ハイブリドー
マ）細胞から、全ｍＲＮＡを抽出して、このｍＲＮＡを
用いて１本鎖ｃＤＮＡを合成し、このｃＤＮＡを鋳型と
してＣＨ１領域をカバーするプライマーであって、ＣＨ
１領域のＣ末端に隣接する部分にＬ鎖との結合に関与し
ないシステイン残基を含むアミノ酸配列を導入するため
のプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより得ること
ができる。ＣＨ１遺伝子はＣＨ１領域を含む領域をコー
ドするものであればよく、ＣＨ１領域のみをコードする
ものでも、ＣＨ１領域とＶＨ領域をコードするものでも
よい。また、ＣＨ１領域とヒンジ領域をコードするもの
でも、ＣＨ１領域とＶＨ領域とヒンジ領域とをコードす
るものでもよい。なお、ＶＨ領域およびヒンジ領域に関
してはその少なくとも一部をコードすればよい。なお、
ＣＨ１領域のＣ末端に隣接する部分に導入するアミノ酸
配列のアミノ酸残基の数の好適な範囲、および当該アミ
ノ酸配列中のシステイン残基の数の好適な範囲、抗原や
抗体の種類は、遺伝子工学的手法による第１の製造方法
の第１の工程に記載の方法と同様である。
ように、モノクローナル抗体生産細胞（ハイブリドー
マ）細胞から、全ｍＲＮＡを抽出して、このｍＲＮＡを
用いて１本鎖ｃＤＮＡを合成し、このｃＤＮＡを鋳型と
してＣＨ１領域をカバーするプライマーであって、ＣＨ
１領域のＣ末端に隣接する部分にＬ鎖との結合に関与し
ないシステイン残基を含むアミノ酸配列を導入するため
のプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより得ること
ができる。ＣＨ１遺伝子はＣＨ１領域を含む領域をコー
ドするものであればよく、ＣＨ１領域のみをコードする
ものでも、ＣＨ１領域とＶＨ領域をコードするものでも
よい。また、ＣＨ１領域とヒンジ領域をコードするもの
でも、ＣＨ１領域とＶＨ領域とヒンジ領域とをコードす
るものでもよい。なお、ＶＨ領域およびヒンジ領域に関
してはその少なくとも一部をコードすればよい。なお、
ＣＨ１領域のＣ末端に隣接する部分に導入するアミノ酸
配列のアミノ酸残基の数の好適な範囲、および当該アミ
ノ酸配列中のシステイン残基の数の好適な範囲、抗原や
抗体の種類は、遺伝子工学的手法による第１の製造方法
の第１の工程に記載の方法と同様である。
第１の工程におけるＣＬ遺伝子は、上記のＣＨ１遺伝
子を得るのと同時にまたは別に、モノクローナル抗体生
産細胞細胞由来のｍＲＮＡを用いて合成された１本鎖ｃ
ＤＮＡを鋳型として、ＣＬ遺伝子単離用プライマーを用
いてＰＣＲを行うことにより得ることができる。
子を得るのと同時にまたは別に、モノクローナル抗体生
産細胞細胞由来のｍＲＮＡを用いて合成された１本鎖ｃ
ＤＮＡを鋳型として、ＣＬ遺伝子単離用プライマーを用
いてＰＣＲを行うことにより得ることができる。
なお、第１の工程で得られたＣＬ遺伝子におけるアミ
ド基含有アミノ酸残基をコードするコドンの少なくとも
一つを、システインを除くアミド基非含有アミノ酸残基
をコードするコドンに部位特異的変異させてもよい。
ド基含有アミノ酸残基をコードするコドンの少なくとも
一つを、システインを除くアミド基非含有アミノ酸残基
をコードするコドンに部位特異的変異させてもよい。
上記の第１の工程に続く第２の工程では、前記ＣＨ１
遺伝子において、ＣＨ１領域のアミド基含有アミノ酸残
基をコードするコドンの少なくとも一つを、システイン
を除くアミド基非含有アミノ酸残基をコードするコドン
に部位特異的変異させて、改変ＣＨ１遺伝子を得る。
遺伝子において、ＣＨ１領域のアミド基含有アミノ酸残
基をコードするコドンの少なくとも一つを、システイン
を除くアミド基非含有アミノ酸残基をコードするコドン
に部位特異的変異させて、改変ＣＨ１遺伝子を得る。
この部位特異的変異の方法は、上記の遺伝子工学的手
法による第１の製造方法における第２の工程に記載の方
法と同様に行うことができる。用いることのできるアミ
ド基含有アミノ酸残基およびアミド基非含有アミノ酸残
基の種類や好適な残基に関しても、上記の遺伝子工学的
手法による第１の製造方法と同様である。
法による第１の製造方法における第２の工程に記載の方
法と同様に行うことができる。用いることのできるアミ
ド基含有アミノ酸残基およびアミド基非含有アミノ酸残
基の種類や好適な残基に関しても、上記の遺伝子工学的
手法による第１の製造方法と同様である。
次いで、第３の工程において、前記改変ＣＨ１遺伝子
を制限酵素で切断しＣＨ１領域をコードする遺伝子を含
む遺伝子断片を得る。ここで用いられる制限酵素に関し
ては特に制限はないが、制限酵素としては、例えば、Ba
mHI、BglIを挙げることができる。
を制限酵素で切断しＣＨ１領域をコードする遺伝子を含
む遺伝子断片を得る。ここで用いられる制限酵素に関し
ては特に制限はないが、制限酵素としては、例えば、Ba
mHI、BglIを挙げることができる。
第４の工程において、第２のＦａｂ’抗体のＶＨ領域
をコードするＶＨ遺伝子と、該第２のＦａｂ’抗体のＶ
Ｌ領域をコードするＶＬ遺伝子とを提供する。ここで第
２のＦａｂ’抗体のＶＨ遺伝子とＶＬ遺伝子は、例え
ば、第２のＦａｂ’抗体が由来する抗体のｍＲＮＡを用
いて１本鎖ｃＤＮＡを合成し、このｃＤＮＡを鋳型とし
てＶＨ鎖遺伝子単離用ＤＮＡプライマーおよびＶＬ遺伝
子単離用ＤＮＡプライマーを用いてＰＣＲを行うことに
より得ることができる。なお、第２のＦａｂ’抗体は、
そのクラスやサブクラスが第１のＦａｂ’抗体のものと
異なっていても同一であってもよい。例えば、第２のＦ
ａｂ’抗体がマウスＩｇＡ抗体であり、第１のＦａｂ’
抗体がマウスＩｇＧ抗体であってもよい。更に、第２の
Ｆａｂ’抗体が由来する動物種は、第１のＦａｂ’抗体
のものと異なっていても同一であってもよい。例えば、
第２のＦａｂ’抗体がヒトＩｇＧ抗体であり、第１のＦ
ａｂ’抗体がマウスＩｇＧ抗体であってもよい。
をコードするＶＨ遺伝子と、該第２のＦａｂ’抗体のＶ
Ｌ領域をコードするＶＬ遺伝子とを提供する。ここで第
２のＦａｂ’抗体のＶＨ遺伝子とＶＬ遺伝子は、例え
ば、第２のＦａｂ’抗体が由来する抗体のｍＲＮＡを用
いて１本鎖ｃＤＮＡを合成し、このｃＤＮＡを鋳型とし
てＶＨ鎖遺伝子単離用ＤＮＡプライマーおよびＶＬ遺伝
子単離用ＤＮＡプライマーを用いてＰＣＲを行うことに
より得ることができる。なお、第２のＦａｂ’抗体は、
そのクラスやサブクラスが第１のＦａｂ’抗体のものと
異なっていても同一であってもよい。例えば、第２のＦ
ａｂ’抗体がマウスＩｇＡ抗体であり、第１のＦａｂ’
抗体がマウスＩｇＧ抗体であってもよい。更に、第２の
Ｆａｂ’抗体が由来する動物種は、第１のＦａｂ’抗体
のものと異なっていても同一であってもよい。例えば、
第２のＦａｂ’抗体がヒトＩｇＧ抗体であり、第１のＦ
ａｂ’抗体がマウスＩｇＧ抗体であってもよい。
第４の工程に続く第５の工程においては、上記遺伝子
断片、上記ＣＬ遺伝子、上記ＶＨ遺伝子、および上記Ｖ
Ｌ遺伝子を発現可能な状態で連結し、改変Ｆａｂ’抗体
発現遺伝子を得る。発現可能な状態で連結させる方法
は、遺伝子工学的手法による第１の製造方法における第
３の工程に記載の方法と同様である。
断片、上記ＣＬ遺伝子、上記ＶＨ遺伝子、および上記Ｖ
Ｌ遺伝子を発現可能な状態で連結し、改変Ｆａｂ’抗体
発現遺伝子を得る。発現可能な状態で連結させる方法
は、遺伝子工学的手法による第１の製造方法における第
３の工程に記載の方法と同様である。
第６の工程として、前記改変Ｆａｂ’抗体発現遺伝子
を、前記Ｆａｂ’抗体のＬ鎖のＣ末端に隣接して荷電性
アミノ酸残基を含むアミノ酸配列が発現するように改変
し、荷電性付与改変Ｆａｂ’抗体発現遺伝子を得る。第
６の工程における改変は、上記の遺伝子工学的手法によ
る第１の製造方法における第４の工程に記載の方法と同
様に行うことができる。
を、前記Ｆａｂ’抗体のＬ鎖のＣ末端に隣接して荷電性
アミノ酸残基を含むアミノ酸配列が発現するように改変
し、荷電性付与改変Ｆａｂ’抗体発現遺伝子を得る。第
６の工程における改変は、上記の遺伝子工学的手法によ
る第１の製造方法における第４の工程に記載の方法と同
様に行うことができる。
次いで第７の工程において、前記荷電性付与改変Ｆａ
ｂ’抗体発現遺伝子で宿主細胞を形質転換し、得られた
形質転換体を培養することにより、Ｌ鎖のＣ末端に隣接
して荷電性アミノ酸残基を含むアミノ酸配列が付加さ
れ、且つＣＨ１領域のＣ末端に隣接してＬ鎖との結合に
関与しないシステイン残基を含むアミノ酸配列が形成さ
れた、等電点均一化Ｆａｂ’抗体を得る。
ｂ’抗体発現遺伝子で宿主細胞を形質転換し、得られた
形質転換体を培養することにより、Ｌ鎖のＣ末端に隣接
して荷電性アミノ酸残基を含むアミノ酸配列が付加さ
れ、且つＣＨ１領域のＣ末端に隣接してＬ鎖との結合に
関与しないシステイン残基を含むアミノ酸配列が形成さ
れた、等電点均一化Ｆａｂ’抗体を得る。
このとき用いられる宿主細胞の種類、宿主細胞に導入
されるベクターの種類、ベクターを宿主細胞に導入する
方法、および形質転換体の培養により生産された等電点
均一化Ｆａｂ’抗体を抽出する方法に関しては、上記の
遺伝子工学的手法による第１の製造方法における第５の
工程に記載の方法と同様である。
されるベクターの種類、ベクターを宿主細胞に導入する
方法、および形質転換体の培養により生産された等電点
均一化Ｆａｂ’抗体を抽出する方法に関しては、上記の
遺伝子工学的手法による第１の製造方法における第５の
工程に記載の方法と同様である。
第８の工程において、第７の工程で得られた等電点均
一化Ｆａｂ’抗体におけるＬ鎖との結合に関与しないシ
ステイン残基に発蛍光団色素を結合させる。用いられる
発蛍光団色素および好適なものの種類、システイン残基
と発蛍光団色素との結合に関しては、上記の遺伝子工学
的手法による第１の製造方法における第６の工程に記載
の方法と同様である。
一化Ｆａｂ’抗体におけるＬ鎖との結合に関与しないシ
ステイン残基に発蛍光団色素を結合させる。用いられる
発蛍光団色素および好適なものの種類、システイン残基
と発蛍光団色素との結合に関しては、上記の遺伝子工学
的手法による第１の製造方法における第６の工程に記載
の方法と同様である。
以上述べた遺伝子工学的手法による第４の製造方法で
は、第５の工程において改変ＣＨ１遺伝子の遺伝子断
片、ＣＬ遺伝子、ＶＨ遺伝子およびＶＬ遺伝子を発現可
能な状態で連結させた後に、第６の工程において、ＣＬ
領域のＣ末端に隣接して荷電性アミノ酸残基を含むアミ
ノ酸配列が発現するように改変したが、ＣＬ遺伝子をそ
の他の遺伝子（または遺伝子断片）と連結させる前に、
Ｌ鎖のＣ末端に隣接して荷電性アミノ酸残基を含むアミ
ノ酸配列が発現するように改変してもよい（この手法
を、遺伝子工学的手法による第５の製造方法と呼ぶ）。
は、第５の工程において改変ＣＨ１遺伝子の遺伝子断
片、ＣＬ遺伝子、ＶＨ遺伝子およびＶＬ遺伝子を発現可
能な状態で連結させた後に、第６の工程において、ＣＬ
領域のＣ末端に隣接して荷電性アミノ酸残基を含むアミ
ノ酸配列が発現するように改変したが、ＣＬ遺伝子をそ
の他の遺伝子（または遺伝子断片）と連結させる前に、
Ｌ鎖のＣ末端に隣接して荷電性アミノ酸残基を含むアミ
ノ酸配列が発現するように改変してもよい（この手法
を、遺伝子工学的手法による第５の製造方法と呼ぶ）。
すなわち、遺伝子工学的手法による第５の製造方法に
おいては、第１の工程において、第１のＦａｂ’抗体の
ＣＨ１領域、および該ＣＨ１領域のＣ末端に隣接しＬ鎖
との結合に関与しないシステイン残基を含むアミノ酸配
列をコードするＣＨ１遺伝子と、該第１のＦａｂ’抗体
のＣＬ領域をコードするＣＬ遺伝子とを提供し、第２の
工程では、前記ＣＨ１遺伝子において、ＣＨ１領域のア
ミド基含有アミノ酸残基をコードするコドンの少なくと
も一つを、システインを除くアミド基非含有アミノ酸残
基をコードするコドンに部位特異的変異させて、改変Ｃ
Ｈ１遺伝子を得る。さらに、第３の工程において、前記
改変ＣＨ１遺伝子を制限酵素で切断しＣＨ１領域をコー
ドする遺伝子を含む遺伝子断片を得る。
おいては、第１の工程において、第１のＦａｂ’抗体の
ＣＨ１領域、および該ＣＨ１領域のＣ末端に隣接しＬ鎖
との結合に関与しないシステイン残基を含むアミノ酸配
列をコードするＣＨ１遺伝子と、該第１のＦａｂ’抗体
のＣＬ領域をコードするＣＬ遺伝子とを提供し、第２の
工程では、前記ＣＨ１遺伝子において、ＣＨ１領域のア
ミド基含有アミノ酸残基をコードするコドンの少なくと
も一つを、システインを除くアミド基非含有アミノ酸残
基をコードするコドンに部位特異的変異させて、改変Ｃ
Ｈ１遺伝子を得る。さらに、第３の工程において、前記
改変ＣＨ１遺伝子を制限酵素で切断しＣＨ１領域をコー
ドする遺伝子を含む遺伝子断片を得る。
遺伝子工学的手法による第５の製造方法における第１
〜第３の工程は、遺伝子工学的手法による第４の製造方
法における第１〜第３の工程と同様に行うことができ
る。また、第１の工程で得られたＣＬ遺伝子におけるア
ミド基含有アミノ酸残基をコードするコドンの少なくと
も一つを、システインを除くアミド基非含有アミノ酸残
基をコードするコドンに部位特異的変異させてもよい。
〜第３の工程は、遺伝子工学的手法による第４の製造方
法における第１〜第３の工程と同様に行うことができ
る。また、第１の工程で得られたＣＬ遺伝子におけるア
ミド基含有アミノ酸残基をコードするコドンの少なくと
も一つを、システインを除くアミド基非含有アミノ酸残
基をコードするコドンに部位特異的変異させてもよい。
次いで、第４の工程において、前記ＣＬ遺伝子を、前
記ＣＬ領域のＣ末端に隣接して荷電性アミノ酸残基を含
むアミノ酸配列が発現するように改変し、荷電性付与Ｃ
Ｌ遺伝子を得る。第４の工程における改変は、上記の遺
伝子工学的手法による第１の製造方法における第４の工
程に記載の方法と同様に行うことができる。なお、この
第４の工程は、第２の工程の前に行うこともできる。
記ＣＬ領域のＣ末端に隣接して荷電性アミノ酸残基を含
むアミノ酸配列が発現するように改変し、荷電性付与Ｃ
Ｌ遺伝子を得る。第４の工程における改変は、上記の遺
伝子工学的手法による第１の製造方法における第４の工
程に記載の方法と同様に行うことができる。なお、この
第４の工程は、第２の工程の前に行うこともできる。
次いで、第５の工程として、第２のＦａｂ’抗体のＶ
Ｈ領域をコードするＶＨ遺伝子と、該第２のＦａｂ’抗
体のＶＬ領域をコードするＶＬ遺伝子を提供する工程を
行い、第６の工程として、前記遺伝子断片、前記荷電性
付与ＣＬ遺伝子、前記ＶＨ遺伝子および前記ＶＬ遺伝子
を発現可能な状態で連結し、荷電性付与改変Ｆａｂ’抗
体発現遺伝子を得る。
Ｈ領域をコードするＶＨ遺伝子と、該第２のＦａｂ’抗
体のＶＬ領域をコードするＶＬ遺伝子を提供する工程を
行い、第６の工程として、前記遺伝子断片、前記荷電性
付与ＣＬ遺伝子、前記ＶＨ遺伝子および前記ＶＬ遺伝子
を発現可能な状態で連結し、荷電性付与改変Ｆａｂ’抗
体発現遺伝子を得る。
ＶＨ遺伝子およびＶＬ遺伝子を提供する工程は、遺伝
子工学的手法による第４の製造方法における第４の工程
と同様にして行うことができ、発現可能な状態で連結さ
せる方法は、遺伝子工学的手法による第１の製造方法に
おける第３の工程に記載の方法と同様にして行うことが
できる。
子工学的手法による第４の製造方法における第４の工程
と同様にして行うことができ、発現可能な状態で連結さ
せる方法は、遺伝子工学的手法による第１の製造方法に
おける第３の工程に記載の方法と同様にして行うことが
できる。
次いで第７の工程において、前記荷電性付与改変Ｆａ
ｂ’抗体発現遺伝子で宿主細胞を形質転換し、得られた
形質転換体を培養することにより、Ｌ鎖のＣ末端に隣接
して荷電性アミノ酸残基を含むアミノ酸配列が付加さ
れ、且つＣＨ１領域のＣ末端に隣接してＬ鎖との結合に
関与しないシステイン残基を含むアミノ酸配列が形成さ
れた、等電点均一化Ｆａｂ’抗体を得る。
ｂ’抗体発現遺伝子で宿主細胞を形質転換し、得られた
形質転換体を培養することにより、Ｌ鎖のＣ末端に隣接
して荷電性アミノ酸残基を含むアミノ酸配列が付加さ
れ、且つＣＨ１領域のＣ末端に隣接してＬ鎖との結合に
関与しないシステイン残基を含むアミノ酸配列が形成さ
れた、等電点均一化Ｆａｂ’抗体を得る。
このとき用いられる宿主細胞の種類、宿主細胞に導入
されるベクターの種類、ベクターを宿主細胞に導入する
方法、および形質転換体の培養により生産された等電点
均一化Ｆａｂ’抗体を抽出する方法に関しては、上記の
遺伝子工学的手法による第１の製造方法における第５の
工程に記載の方法と同様である。
されるベクターの種類、ベクターを宿主細胞に導入する
方法、および形質転換体の培養により生産された等電点
均一化Ｆａｂ’抗体を抽出する方法に関しては、上記の
遺伝子工学的手法による第１の製造方法における第５の
工程に記載の方法と同様である。
第８の工程において、第７の工程で得られた等電点均
一化Ｆａｂ’抗体におけるＬ鎖との結合に関与しないシ
ステイン残基に発蛍光団色素を結合させる。用いられる
発蛍光団色素および好適なものの種類、システイン残基
と発蛍光団色素との結合に関しては、上記の遺伝子工学
的手法による第１の製造方法における第６の工程に記載
の方法と同様である。
一化Ｆａｂ’抗体におけるＬ鎖との結合に関与しないシ
ステイン残基に発蛍光団色素を結合させる。用いられる
発蛍光団色素および好適なものの種類、システイン残基
と発蛍光団色素との結合に関しては、上記の遺伝子工学
的手法による第１の製造方法における第６の工程に記載
の方法と同様である。
（実施例）
以下、本発明の好適な実施例についてさらに詳細に説
明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるもので
はない。なお、実施例において、遺伝子工学的手法に関
して特に記載のないものはSambrook et al., Molecular
Cloning : A Laboratory Manual 2nd Edition, Cold S
pring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989に
従った。また、特に、記載のない試薬類は宝酒造株式会
社または和光純薬工業株式会社より購入の試薬を使用し
た。
明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるもので
はない。なお、実施例において、遺伝子工学的手法に関
して特に記載のないものはSambrook et al., Molecular
Cloning : A Laboratory Manual 2nd Edition, Cold S
pring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989に
従った。また、特に、記載のない試薬類は宝酒造株式会
社または和光純薬工業株式会社より購入の試薬を使用し
た。
本実施例において使用する略語の名称を以下に示す。
ＰＣＲ ： ポリメラーゼ連鎖反応（遺伝子増幅法）
ＢＡＰ ： bacterial alkaline phospbatase
ＩＰＴＧ ： isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside
ＰＢＳ ： phosphate buffered saline
ＢＳＡ ： bovine serum albumin
（１）ハイブリドーマの樹立
ヒト アルファ１アンチトリプシン（カルビオケム-ノ
バビオケム社製）を免疫抗原として用い、抗ヒト アル
ファ１アンチトリプシン抗体を産生するハイブリドーマ
を以下に示す方法により作製した。
バビオケム社製）を免疫抗原として用い、抗ヒト アル
ファ１アンチトリプシン抗体を産生するハイブリドーマ
を以下に示す方法により作製した。
上記免疫原でBALB/cマウスを４回免疫後、脾細胞を採
取し、培養マウス骨髄細胞［X63Ag8］とポリエチレング
リコールを用いて細胞融合を行い、クローニングした。
得られたクローンの培養上清中の抗体の前述の免疫原へ
の結合活性を酵素抗体法にて測定し、反応が陽性と思わ
れるクローンについて、さらに、間接蛍光法を用いて確
認し、抗アルファ１アンチトリプシン抗体を産生するハ
イブリドーマを９種類確立した。これらハイブリドーマ
産出の抗体はヒト アルファ１アンチトリプシンに結合
するものである。以下に述べる等電点均一化Ｆａｂ’抗
体のＦｄ鎖遺伝子、Ｌ鎖（κ鎖）遺伝子の調製には、抗
アルファ１アンチトリプシン活性を有するこれらの抗ヒ
ト アルファ１アンチトリプシン抗体を産生する細胞を
使用した。
取し、培養マウス骨髄細胞［X63Ag8］とポリエチレング
リコールを用いて細胞融合を行い、クローニングした。
得られたクローンの培養上清中の抗体の前述の免疫原へ
の結合活性を酵素抗体法にて測定し、反応が陽性と思わ
れるクローンについて、さらに、間接蛍光法を用いて確
認し、抗アルファ１アンチトリプシン抗体を産生するハ
イブリドーマを９種類確立した。これらハイブリドーマ
産出の抗体はヒト アルファ１アンチトリプシンに結合
するものである。以下に述べる等電点均一化Ｆａｂ’抗
体のＦｄ鎖遺伝子、Ｌ鎖（κ鎖）遺伝子の調製には、抗
アルファ１アンチトリプシン活性を有するこれらの抗ヒ
ト アルファ１アンチトリプシン抗体を産生する細胞を
使用した。
（２）抗ヒト アルファ１アンチトリプシンＦａｂ’抗
体発現遺伝子の単離 ヒト アルファ１アンチトリプシンに対するＩｇＧ１
抗体を産出するハイブリドーマより抗ヒト アルファ１
アンチトリプシンＦａｂ’抗体発現遺伝子を以下のよう
に単離した。
体発現遺伝子の単離 ヒト アルファ１アンチトリプシンに対するＩｇＧ１
抗体を産出するハイブリドーマより抗ヒト アルファ１
アンチトリプシンＦａｂ’抗体発現遺伝子を以下のよう
に単離した。
すなわち、抗ヒト アルファ１アンチトリプシンＦａ
ｂ’抗体を産生する細胞からBioMag mRNA purification
kit (PerSeptive) のプロトココールに従って全ＲＮ
Ａを抽出し、ｃＤＮＡ合成システム・プラス（アマシャ
ム ファルマシアバイオテク社製）を用いて1本鎖ｃＤＮ
Ａを合成した。Kabatら（Sequences of Proteins of Im
munological Interest 5th ed., Public Health Servic
e, NIH,Washington DC, 1991）の分類した可変領域（Ｖ
領域）と定常領域（Ｃ領域）の核酸塩基配列をもとにし
て合成した、Ｆｄ鎖遺伝子単離用ＤＮＡプライマーおよ
びＬ鎖遺伝子単離用ＤＮＡプライマーを用いて、上記１
本鎖ｃＤＮＡを鋳型としてポリメレース連鎖反応（ＰＣ
Ｒ）を行った。ここで、プライマー設計には、Hoogenbo
om HR ら（Nucleic Acids Res 1991 Aug 11;19(15);413
3-7)、及びKang AS ら（Methods (San Diego) (1991),
2(2),111 -18）の文献を参考にした。
ｂ’抗体を産生する細胞からBioMag mRNA purification
kit (PerSeptive) のプロトココールに従って全ＲＮ
Ａを抽出し、ｃＤＮＡ合成システム・プラス（アマシャ
ム ファルマシアバイオテク社製）を用いて1本鎖ｃＤＮ
Ａを合成した。Kabatら（Sequences of Proteins of Im
munological Interest 5th ed., Public Health Servic
e, NIH,Washington DC, 1991）の分類した可変領域（Ｖ
領域）と定常領域（Ｃ領域）の核酸塩基配列をもとにし
て合成した、Ｆｄ鎖遺伝子単離用ＤＮＡプライマーおよ
びＬ鎖遺伝子単離用ＤＮＡプライマーを用いて、上記１
本鎖ｃＤＮＡを鋳型としてポリメレース連鎖反応（ＰＣ
Ｒ）を行った。ここで、プライマー設計には、Hoogenbo
om HR ら（Nucleic Acids Res 1991 Aug 11;19(15);413
3-7)、及びKang AS ら（Methods (San Diego) (1991),
2(2),111 -18）の文献を参考にした。
ヒト アルファ１アンチトリプシンに対して結合する
抗体は、Ｆａｂ’抗体として発現させるため、重鎖（Ｈ
鎖)、軽鎖（Ｌ鎖）ともに定常領域を含むようにＤＮＡ
プライマーを設計した。すなわち、Ｆｄ鎖遺伝子単離用
ＤＮＡプライマーとして、５’側プライマー（以下に示
すＦ５−１プライマー）および３’側プライマー（以下
に示すＦ３プライマー）を設計し、Ｌ鎖遺伝子単離用Ｄ
ＮＡプライマーとして、５’側プライマー（以下に示す
Ｋａｐｐｅｒ５プライマー）および３’側プライマー
（以下に示すＫ３−１プライマー）を設計した。
抗体は、Ｆａｂ’抗体として発現させるため、重鎖（Ｈ
鎖)、軽鎖（Ｌ鎖）ともに定常領域を含むようにＤＮＡ
プライマーを設計した。すなわち、Ｆｄ鎖遺伝子単離用
ＤＮＡプライマーとして、５’側プライマー（以下に示
すＦ５−１プライマー）および３’側プライマー（以下
に示すＦ３プライマー）を設計し、Ｌ鎖遺伝子単離用Ｄ
ＮＡプライマーとして、５’側プライマー（以下に示す
Ｋａｐｐｅｒ５プライマー）および３’側プライマー
（以下に示すＫ３−１プライマー）を設計した。
Ｆｄ鎖遺伝子単離用の５’側プライマーであるＦ５−
１プライマーは、以下に示す配列（配列番号１）を有す
るものを用い、Ｆｄ鎖遺伝子単離用の３’側プライマー
であるＦ３プライマーは、以下に示す配列（配列番号
２）を有するものを用いた。なお、以下の配列におい
て、５’、３’は、それぞれプライマーの５’側、３’
側を表し、ＳはＣまたはＧ、ＭはＡまたはＣ、ＲはＡま
たはＧ、ＷはＡまたはＴを示す。
１プライマーは、以下に示す配列（配列番号１）を有す
るものを用い、Ｆｄ鎖遺伝子単離用の３’側プライマー
であるＦ３プライマーは、以下に示す配列（配列番号
２）を有するものを用いた。なお、以下の配列におい
て、５’、３’は、それぞれプライマーの５’側、３’
側を表し、ＳはＣまたはＧ、ＭはＡまたはＣ、ＲはＡま
たはＧ、ＷはＡまたはＴを示す。
なお、Ｆ３プライマーは、ＣＨ１領域のＣ末端に隣接
する部分にＬ鎖とのジスルフィド結合に関与しないシス
テイン残基を含む塩基配列を導入可能なように設計し、
また、リンカーを介してＬ鎖と連結させるため、Xba I
サイトが付加するように設計した。
する部分にＬ鎖とのジスルフィド結合に関与しないシス
テイン残基を含む塩基配列を導入可能なように設計し、
また、リンカーを介してＬ鎖と連結させるため、Xba I
サイトが付加するように設計した。
Ｌ鎖遺伝子単離用の５’側プライマーであるＫａｐｐ
ｅｒ５プライマーは、以下に示す配列（配列番号３）を
有するものを用い、Ｌ鎖遺伝子単離用の３’側プライマ
ーであるＫ３−１プライマーは、以下に示す配列（配列
番号４）を有するものを用いた。なお、ＷはＡまたは
Ｔ、ＳはＣまたはＧ、ＢはＡ以外の塩基、ＮはＡ，Ｔ，
Ｇ，Ｃ、ＭはＡまたはＣ、ＤはＣ以外の塩基、ＹはＣま
たはＴ、ＨはＧ以外の塩基をそれぞれ表す。
ｅｒ５プライマーは、以下に示す配列（配列番号３）を
有するものを用い、Ｌ鎖遺伝子単離用の３’側プライマ
ーであるＫ３−１プライマーは、以下に示す配列（配列
番号４）を有するものを用いた。なお、ＷはＡまたは
Ｔ、ＳはＣまたはＧ、ＢはＡ以外の塩基、ＮはＡ，Ｔ，
Ｇ，Ｃ、ＭはＡまたはＣ、ＤはＣ以外の塩基、ＹはＣま
たはＴ、ＨはＧ以外の塩基をそれぞれ表す。
ＰＣＲの条件は、９４℃１分、５５℃１分、７２℃１
分で３０サイクル行った。ＰＣＲ後、得られたＦｄ鎖、
リンカー塩基配列、Ｌ鎖（κ鎖）のＤＮＡ断片を、低融
点アガロースゲル電気泳動で精製し、Ｆｄ鎖をXbaIで、
リンカー塩基配列をXbaI、SacIで、Ｌ鎖（κ鎖）をSacI
で消化した。リンカー塩基配列を挟んで、Ｆｄ鎖、リン
カー塩基配列、Ｌ鎖（κ鎖）の順番に並ぶように、各Ｄ
ＮＡ断片をライゲーションした。ライゲーション産物を
フェーノール／クロロフォルム／イソアミルアルコール
（25/24/1）で抽出した。これをTEバッファーに溶解し
鋳型として、Ｆｄ鎖の５’側にSfiIサイト、Ｌ鎖の３’
側にNot Iサイトを付加するように設計されたプライマ
ーで再度、ＰＣＲを行った。ＰＣＲは、９４℃１分、５
５℃１分、７２℃２．５分で２５サイクル行った。
分で３０サイクル行った。ＰＣＲ後、得られたＦｄ鎖、
リンカー塩基配列、Ｌ鎖（κ鎖）のＤＮＡ断片を、低融
点アガロースゲル電気泳動で精製し、Ｆｄ鎖をXbaIで、
リンカー塩基配列をXbaI、SacIで、Ｌ鎖（κ鎖）をSacI
で消化した。リンカー塩基配列を挟んで、Ｆｄ鎖、リン
カー塩基配列、Ｌ鎖（κ鎖）の順番に並ぶように、各Ｄ
ＮＡ断片をライゲーションした。ライゲーション産物を
フェーノール／クロロフォルム／イソアミルアルコール
（25/24/1）で抽出した。これをTEバッファーに溶解し
鋳型として、Ｆｄ鎖の５’側にSfiIサイト、Ｌ鎖の３’
側にNot Iサイトを付加するように設計されたプライマ
ーで再度、ＰＣＲを行った。ＰＣＲは、９４℃１分、５
５℃１分、７２℃２．５分で２５サイクル行った。
得られたＰＣＲ増幅産物を精製後、SfiI (20U per re
action）で５０℃にて４時間、Not I (40U per reactio
n）で３７℃にて４時間で消化した。これをpCANTAB5Eプ
ラスミドベクター(アマシャム ファルマシアバイオテク
社製)にクローニングした（図２ＡおよびＢ参照)。pCAN
TAB5Eプラスミドベクターは、ベクターに組み込まれた
遺伝子を発現し、大腸菌のペリブラズム外に遺伝子由来
の蛋白質を分泌するシグナルペプチドを含有している。
ベクター構築の手順および方法に関しては、遺伝子工学
の分野で慣用されているものを用いることができる。
action）で５０℃にて４時間、Not I (40U per reactio
n）で３７℃にて４時間で消化した。これをpCANTAB5Eプ
ラスミドベクター(アマシャム ファルマシアバイオテク
社製)にクローニングした（図２ＡおよびＢ参照)。pCAN
TAB5Eプラスミドベクターは、ベクターに組み込まれた
遺伝子を発現し、大腸菌のペリブラズム外に遺伝子由来
の蛋白質を分泌するシグナルペプチドを含有している。
ベクター構築の手順および方法に関しては、遺伝子工学
の分野で慣用されているものを用いることができる。
（３）抗ヒト アルファ１アンチトリプシンＦａｂ’抗
体発現のための形質転換 抗ヒト アルファ１アンチトリプシンＦａｂ’抗体発
現遺伝子をpCANTAB5Eプラスミドベクターにクローニン
グした抗ヒト アルファ１アンチトリプシンＦａｂ’抗
体発現プラスミドを、市販の大腸菌HB2151(アマシャム
ファルマシアバイオテク社製)に形質転換した。大腸菌H
B2151のコンピテント細胞化はExpression Module/Recom
binant Pharge Autbody System（アマシャム ファルマ
シアバイオテク社製)のプロトコールに従った。形質転
換した大腸菌HB2151をSOBAG培地に播き、３０℃でオー
バーナイトでインキュベーションした。生じたコロニー
でHRP/Auti-E tag Conjugate(アマシャム ファルマシア
バイオテク社製)のプロトコールに従いコロニーリフト
アッセイ（colony lift assay）を行ない、ヒト アルフ
ァ１アンチトリプシンに対して抗原抗体反応を起すＦａ
ｂ’抗体発現菌をスクリーニングした。
体発現のための形質転換 抗ヒト アルファ１アンチトリプシンＦａｂ’抗体発
現遺伝子をpCANTAB5Eプラスミドベクターにクローニン
グした抗ヒト アルファ１アンチトリプシンＦａｂ’抗
体発現プラスミドを、市販の大腸菌HB2151(アマシャム
ファルマシアバイオテク社製)に形質転換した。大腸菌H
B2151のコンピテント細胞化はExpression Module/Recom
binant Pharge Autbody System（アマシャム ファルマ
シアバイオテク社製)のプロトコールに従った。形質転
換した大腸菌HB2151をSOBAG培地に播き、３０℃でオー
バーナイトでインキュベーションした。生じたコロニー
でHRP/Auti-E tag Conjugate(アマシャム ファルマシア
バイオテク社製)のプロトコールに従いコロニーリフト
アッセイ（colony lift assay）を行ない、ヒト アルフ
ァ１アンチトリプシンに対して抗原抗体反応を起すＦａ
ｂ’抗体発現菌をスクリーニングした。
スクリーニングしたＦａｂ’抗体発現菌を複数個選択
してExpression Module/Recombinant Pharge Antbody S
ystem（アマシャム ファルマシアバイオテク社製)のプ
ロトコールに従い、2YT-AG培地に接種し、３０℃で一夜
振盪培養した。振盪培養した培養液を１０倍量の2YT-AG
培地に加え、３０℃でA600が、0.5になるまで振盪培養
した。室温で遠心分離して、集菌し、上清を除いた。菌
を同量の、2YT-AI（グルコース不含、100μｇ/ｍｌアン
ピシリン、1ｍＭ IPTGを含む）培地に懸濁して、３０℃
で終夜振盪培養し、抗体を誘導した。次いで、遠心分離
で菌を沈殿化して、上清を取り、IPTGにより誘導された
抗ヒト アルファ１アンチトリプシンＦａｂ’抗体を含
む培養上清を１００ μｌ用い、マイクロタイタープレ
ートを抗原吸着プレートとして、ヒト アルファ１アン
チトリプシン（カルビオケム-ノバビオケム社製）を固
定化し、HRP/Anti-E tag Conjugate(アマシャム ファル
マシアバイオテク社製)のプロトコールに従い、ＥＬＩ
ＳＡを行い抗ヒト アルファ１アンチトリプシンＦａ
ｂ’抗体発現菌をスクリーニングした。
してExpression Module/Recombinant Pharge Antbody S
ystem（アマシャム ファルマシアバイオテク社製)のプ
ロトコールに従い、2YT-AG培地に接種し、３０℃で一夜
振盪培養した。振盪培養した培養液を１０倍量の2YT-AG
培地に加え、３０℃でA600が、0.5になるまで振盪培養
した。室温で遠心分離して、集菌し、上清を除いた。菌
を同量の、2YT-AI（グルコース不含、100μｇ/ｍｌアン
ピシリン、1ｍＭ IPTGを含む）培地に懸濁して、３０℃
で終夜振盪培養し、抗体を誘導した。次いで、遠心分離
で菌を沈殿化して、上清を取り、IPTGにより誘導された
抗ヒト アルファ１アンチトリプシンＦａｂ’抗体を含
む培養上清を１００ μｌ用い、マイクロタイタープレ
ートを抗原吸着プレートとして、ヒト アルファ１アン
チトリプシン（カルビオケム-ノバビオケム社製）を固
定化し、HRP/Anti-E tag Conjugate(アマシャム ファル
マシアバイオテク社製)のプロトコールに従い、ＥＬＩ
ＳＡを行い抗ヒト アルファ１アンチトリプシンＦａ
ｂ’抗体発現菌をスクリーニングした。
（４）塩基配列決定用の形質転換と抗体遺伝子の塩基配
列の決定 スクリーニングにより得られた抗ヒト アルファ１ア
ンチトリプシンＦａｂ’抗体発現菌よりプラスミドＤＮ
Ａを抽出し、塩基配列決定用に、市販の大腸菌XL10-GOL
D(Stratagene社製)に形質転換した。抗ヒト アルファ１
アンチトリプシンＦａｂ’抗体発現遺伝子で形質転換し
たXL10-GOLDはEpicurian Coli XL10-Gold ultracompete
nt Cells (Stratagene社製)に従い、抗体遺伝子を発現
するベクターのＤＮＡ（約１０ｎｇ）を混合し、３０分
間氷中に放置した。次いで４２℃で３０秒間 熱処理を
行った後、NZY培地（NZアミン１０ｇ、酵母エキス5ｇ、
塩化ナトリウム5ｇ、塩化マグネシウム12.5ｍＭ、硫酸
マグネシウム12.5ｍＭ、グルコース20ｍＭ：、ｐＨ7,
5：１リットルあたり）９００μＬを加え、３７℃で約
１時間振盪培養した。５０μｇ/ｍｌアンピシリンを含
むＬＢ寒天培地（トリプシン１０ｇ、酵母エキス５ｇ、
塩化ナトリウム５ｇ、寒天１５ｇ〔ｐＨ７〕：１リット
ルあたり）に塗り広げ、形質転換された抗ヒト アルフ
ァ１アンチトリプシンＦａｂ’抗体発現遺伝子を含む耐
性株を選抜した。
列の決定 スクリーニングにより得られた抗ヒト アルファ１ア
ンチトリプシンＦａｂ’抗体発現菌よりプラスミドＤＮ
Ａを抽出し、塩基配列決定用に、市販の大腸菌XL10-GOL
D(Stratagene社製)に形質転換した。抗ヒト アルファ１
アンチトリプシンＦａｂ’抗体発現遺伝子で形質転換し
たXL10-GOLDはEpicurian Coli XL10-Gold ultracompete
nt Cells (Stratagene社製)に従い、抗体遺伝子を発現
するベクターのＤＮＡ（約１０ｎｇ）を混合し、３０分
間氷中に放置した。次いで４２℃で３０秒間 熱処理を
行った後、NZY培地（NZアミン１０ｇ、酵母エキス5ｇ、
塩化ナトリウム5ｇ、塩化マグネシウム12.5ｍＭ、硫酸
マグネシウム12.5ｍＭ、グルコース20ｍＭ：、ｐＨ7,
5：１リットルあたり）９００μＬを加え、３７℃で約
１時間振盪培養した。５０μｇ/ｍｌアンピシリンを含
むＬＢ寒天培地（トリプシン１０ｇ、酵母エキス５ｇ、
塩化ナトリウム５ｇ、寒天１５ｇ〔ｐＨ７〕：１リット
ルあたり）に塗り広げ、形質転換された抗ヒト アルフ
ァ１アンチトリプシンＦａｂ’抗体発現遺伝子を含む耐
性株を選抜した。
選抜した耐性株より、抗ヒト アルファ１アンチトリ
プシンＦａｂ’抗体発現遺伝子を含むpCANTAB5Eプラス
ミドを抽出して、ジデオキシヌクレオチド（パーキンエ
ルマー社製）を用いたチェーンターミネータ法により抗
ヒト アルファ１アンチトリプシンＦａｂ’抗体発現遺
伝子の各部の塩基配列を決定したところ発現可能なオー
プンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をとっていた。ま
た、単離された抗ヒト アルファ１アンチトリプシンＦ
ａｂ’抗体発現遺伝子は、Ｆｄ鎖遺伝子（ＶＨ領域およ
びＣＨ１領域の遺伝子）およびＬ鎖遺伝子（ＶＬ領域お
よびＣＬ領域の遺伝子）を含むものであった。
プシンＦａｂ’抗体発現遺伝子を含むpCANTAB5Eプラス
ミドを抽出して、ジデオキシヌクレオチド（パーキンエ
ルマー社製）を用いたチェーンターミネータ法により抗
ヒト アルファ１アンチトリプシンＦａｂ’抗体発現遺
伝子の各部の塩基配列を決定したところ発現可能なオー
プンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をとっていた。ま
た、単離された抗ヒト アルファ１アンチトリプシンＦ
ａｂ’抗体発現遺伝子は、Ｆｄ鎖遺伝子（ＶＨ領域およ
びＣＨ１領域の遺伝子）およびＬ鎖遺伝子（ＶＬ領域お
よびＣＬ領域の遺伝子）を含むものであった。
（５）大腸菌産出抗ヒト アルファ１アンチトリプシン
Ｆａｂ’抗体の誘導と精製 大腸菌産出抗ヒト アルファ１アンチトリプシンＦａ
ｂ’抗体を以下に示す実験に使用するべく、スクリーニ
ングした細胞株を用い、培養スケールを拡大して抗体を
誘導し、精製した。すなわち、RPAS Purification Modu
le（アマシャム ファルマシアバイオテク社製）のプロ
トコールに従い以下の手順で抗ヒト アルファ１アンチ
トリプシンＦａｂ’抗体の誘導および精製を行った。
Ｆａｂ’抗体の誘導と精製 大腸菌産出抗ヒト アルファ１アンチトリプシンＦａ
ｂ’抗体を以下に示す実験に使用するべく、スクリーニ
ングした細胞株を用い、培養スケールを拡大して抗体を
誘導し、精製した。すなわち、RPAS Purification Modu
le（アマシャム ファルマシアバイオテク社製）のプロ
トコールに従い以下の手順で抗ヒト アルファ１アンチ
トリプシンＦａｂ’抗体の誘導および精製を行った。
スクリーニングした抗ヒト アルファ１アンチトリプ
シンＦａｂ’抗体発現遺伝子を含む大腸菌HB2151細胞株
より、単一コロニーを拾い、Expression Module/Recomb
inant Pharge Antbody System（アマシャム ファルマシ
アバイオテク社製)のプロトコールに従い、2YT-AG培地
に接種し、３０℃で一夜振盪培養した。振盪培養した培
養液を１０倍量の2YT-AG培地に加え、３０℃でA600が、
0.5になるまで振盪培養した。室温で遠心分離して、集
菌し、上清を除いた。菌を同量の、2YT-AI（グルコース
不含）培地に懸濁して、３０℃で終夜振盪培養した。遠
心分離で菌を沈殿化して、上清を取り、0.45umのフィル
ター（ミリポア社製）で濾過したあと、ｐＨを７に調整
して、培養上清とした。
シンＦａｂ’抗体発現遺伝子を含む大腸菌HB2151細胞株
より、単一コロニーを拾い、Expression Module/Recomb
inant Pharge Antbody System（アマシャム ファルマシ
アバイオテク社製)のプロトコールに従い、2YT-AG培地
に接種し、３０℃で一夜振盪培養した。振盪培養した培
養液を１０倍量の2YT-AG培地に加え、３０℃でA600が、
0.5になるまで振盪培養した。室温で遠心分離して、集
菌し、上清を除いた。菌を同量の、2YT-AI（グルコース
不含）培地に懸濁して、３０℃で終夜振盪培養した。遠
心分離で菌を沈殿化して、上清を取り、0.45umのフィル
ター（ミリポア社製）で濾過したあと、ｐＨを７に調整
して、培養上清とした。
IPTGにより誘導された抗ヒト アルファ１アンチトリ
プシンＦａｂ’抗体を含む培養上清を抗E-tagアフィニ
ティカラムを使用し、5ml/分の流速でカラムに結合さ
せ、添付の洗浄バッファー（Binding buffer) 25ml (5m
l/分の流速）を流して、抗体を含まない培養上清を洗い
出し、添付の溶出バッファー(Elution buffer）１０ｍ
ｌにて大腸菌産出抗ヒト アルファ1アンチトリプシンＦ
ａｂ’抗体を溶出（5ml/分の流速）させた。溶出した抗
ヒト アルファ１アンチトリプシンＦａｂ’抗体に、た
だちに、中和バッファー(Neutralization buffer)を溶
出バッファー(Elution buffer）に対して１０分の1量加
えて、中和した。以上のように、抗E-tag抗体をリガン
ドとして用いたアフィニティークロマトグラフィーによ
り精製を行った。中和された抗ヒト アルファ１アンチ
トリプシンＦａｂ’抗体はマイクロコン（画分 分子量3
0000用) (ミリポア社製）を用いて、濃縮した後、PBSバ
ッファー1mlに溶解して−80℃に保存した。
プシンＦａｂ’抗体を含む培養上清を抗E-tagアフィニ
ティカラムを使用し、5ml/分の流速でカラムに結合さ
せ、添付の洗浄バッファー（Binding buffer) 25ml (5m
l/分の流速）を流して、抗体を含まない培養上清を洗い
出し、添付の溶出バッファー(Elution buffer）１０ｍ
ｌにて大腸菌産出抗ヒト アルファ1アンチトリプシンＦ
ａｂ’抗体を溶出（5ml/分の流速）させた。溶出した抗
ヒト アルファ１アンチトリプシンＦａｂ’抗体に、た
だちに、中和バッファー(Neutralization buffer)を溶
出バッファー(Elution buffer）に対して１０分の1量加
えて、中和した。以上のように、抗E-tag抗体をリガン
ドとして用いたアフィニティークロマトグラフィーによ
り精製を行った。中和された抗ヒト アルファ１アンチ
トリプシンＦａｂ’抗体はマイクロコン（画分 分子量3
0000用) (ミリポア社製）を用いて、濃縮した後、PBSバ
ッファー1mlに溶解して−80℃に保存した。
（６）大腸菌産出抗ヒト アルファ１アンチトリプシン
Ｆａｂ’抗体の蛍光標識化 蛍光色素（蛍光標識剤）であるテトラメチルローダミ
ン−５−ヨードアセタミドの調製は以下のように行っ
た。すなわち、テトラメチルローダミン−６−ヨードア
セタミド（モレキュラーブローブス社製）１ｍｇを５０
％アセトニトリル０．６ｍｌに溶解し、１０，０００ｒ
ｐｍ、５分間遠心分離を行い、沈澱を除去した。上澄を
２５％アセトニ トリル−0.1％トリフルオロ酢酸溶液で
平衡化した逆相クロマトグラフカラム（東ソ−ODS-80T
s、直径4.6mm、長さ25cm）にかけ、３０分間にわたって
２５〜５５％の アセトニトリルの濃度直線勾配をかけ
て溶出し、２８０ｎｍの吸収をモニターすることで検出
を行った。最も大きなピークを分取し、５４３ｎｍにお
けるモル吸光係数を87,000として吸光度測定によってそ
の濃度を決定した。これを精製テトラメチルローダミン
−５−ヨードアセタミドとして、精製した抗ヒト アル
ファ１アンチトリプシンＦａｂ’抗体の蛍光標識に用い
た。
Ｆａｂ’抗体の蛍光標識化 蛍光色素（蛍光標識剤）であるテトラメチルローダミ
ン−５−ヨードアセタミドの調製は以下のように行っ
た。すなわち、テトラメチルローダミン−６−ヨードア
セタミド（モレキュラーブローブス社製）１ｍｇを５０
％アセトニトリル０．６ｍｌに溶解し、１０，０００ｒ
ｐｍ、５分間遠心分離を行い、沈澱を除去した。上澄を
２５％アセトニ トリル−0.1％トリフルオロ酢酸溶液で
平衡化した逆相クロマトグラフカラム（東ソ−ODS-80T
s、直径4.6mm、長さ25cm）にかけ、３０分間にわたって
２５〜５５％の アセトニトリルの濃度直線勾配をかけ
て溶出し、２８０ｎｍの吸収をモニターすることで検出
を行った。最も大きなピークを分取し、５４３ｎｍにお
けるモル吸光係数を87,000として吸光度測定によってそ
の濃度を決定した。これを精製テトラメチルローダミン
−５−ヨードアセタミドとして、精製した抗ヒト アル
ファ１アンチトリプシンＦａｂ’抗体の蛍光標識に用い
た。
精製した抗ヒト アルファ１アンチトリプシンＦａ
ｂ’抗体は以下のようにして蛍光標識化した。すなわ
ち、抗ヒト アルファ１アンチトリプシンＦａｂ’抗体
濃縮液（１００μｌ）を１０倍量の0.1Mリン酸バッファ
ー、５ｍＭ EDTA入り（ｐＨ7.0）で希釈し、マイクロコ
ン（画分分子量30000用) (ミリポア社製）で遠心分離し
てバッファーを交換した。この操作を２回繰返した。抗
ヒト アルファ１アンチトリプシンＦａｂ’抗体２００
μｌに対して１００ｍＭメルカプトエチルアミン（ナカ
ライテスク社製）を２０μｌ加え、攪拌して３７℃で３
０分インキュベートした。マイクロコン（画分分子量30
000用) (ミリポア社製）で再び、２０μｌに濃縮して、
２００μｌの0.1Mリン酸バッファー、５ｍＭ EDTA入り
（ｐＨ7.5）で限外濾過を行った。
ｂ’抗体は以下のようにして蛍光標識化した。すなわ
ち、抗ヒト アルファ１アンチトリプシンＦａｂ’抗体
濃縮液（１００μｌ）を１０倍量の0.1Mリン酸バッファ
ー、５ｍＭ EDTA入り（ｐＨ7.0）で希釈し、マイクロコ
ン（画分分子量30000用) (ミリポア社製）で遠心分離し
てバッファーを交換した。この操作を２回繰返した。抗
ヒト アルファ１アンチトリプシンＦａｂ’抗体２００
μｌに対して１００ｍＭメルカプトエチルアミン（ナカ
ライテスク社製）を２０μｌ加え、攪拌して３７℃で３
０分インキュベートした。マイクロコン（画分分子量30
000用) (ミリポア社製）で再び、２０μｌに濃縮して、
２００μｌの0.1Mリン酸バッファー、５ｍＭ EDTA入り
（ｐＨ7.5）で限外濾過を行った。
２５n molのテトラメチルローダミン−５−ヨードア
セタミド（モレキュラープローブス社製）を、５μｌの
N,N-ジメチルホルムアミド（シグマ社製）に溶解させ、
７５μｌの0.1Mリン酸バッファー５ｍＭ（EDTA入り（ｐ
Ｈ7.5)) を加え、１ｍＭ メルカプトエチルアミン（ナ
カライテスク社製）を５μｌ加え、３７℃で１０分間イ
ンキュベートした。これをメルカプトエチルアミンで処
理した抗ヒト アルファ１アンチトリプシンＦａｂ’抗
体と混合し、暗所で一夜反応させた。反応産物は Sepha
dex G-25（アマシャム ファルマシアバイオテク社製）
で、反応していない蛍光色素と、蛍光標識した抗ヒト
アルファ１アンチトリプシンＦａｂ’抗体（蛍光色素１
分子により標識されているため、以下場合により一分子
蛍光標識抗ヒト アルファ１アンチトリプシンＦａｂ’
抗体と呼ぶことがある）を分離して、以下の実験に用い
た。一分子蛍光標識抗ヒト アルファ１アンチトリプシ
ンＦａｂ’抗体の濃度は、５４３ｎｍにおけるモル吸光
係数を87,000として、吸光度測定によって決定した。
セタミド（モレキュラープローブス社製）を、５μｌの
N,N-ジメチルホルムアミド（シグマ社製）に溶解させ、
７５μｌの0.1Mリン酸バッファー５ｍＭ（EDTA入り（ｐ
Ｈ7.5)) を加え、１ｍＭ メルカプトエチルアミン（ナ
カライテスク社製）を５μｌ加え、３７℃で１０分間イ
ンキュベートした。これをメルカプトエチルアミンで処
理した抗ヒト アルファ１アンチトリプシンＦａｂ’抗
体と混合し、暗所で一夜反応させた。反応産物は Sepha
dex G-25（アマシャム ファルマシアバイオテク社製）
で、反応していない蛍光色素と、蛍光標識した抗ヒト
アルファ１アンチトリプシンＦａｂ’抗体（蛍光色素１
分子により標識されているため、以下場合により一分子
蛍光標識抗ヒト アルファ１アンチトリプシンＦａｂ’
抗体と呼ぶことがある）を分離して、以下の実験に用い
た。一分子蛍光標識抗ヒト アルファ１アンチトリプシ
ンＦａｂ’抗体の濃度は、５４３ｎｍにおけるモル吸光
係数を87,000として、吸光度測定によって決定した。
（７）蛍光検出等電点電気泳動による評価
得られた一分子蛍光標識抗ヒト アルファ１アンチト
リプシンＦａｂ’抗体をベックマン社製キャピラリー電
気泳動装置P/ACE5510を用いて分離・検出を行った。キ
ャピラリーとしては内壁をポリアクリルアミドで共有結
合的に被覆した内径0.05ｍｍ、外径0.375ｍｍ、全長２
７ｃｍの溶解シリカキャピラリー（ジーエルサイエンス
社製） を使用し、陽極側から２０ｃｍの位置でレーザ
ー励起による蛍光検出を行った。キャピラリーをPharma
lyte3-10（アマシャム ファルマシアバイオテク社製、
原液の４０倍希釈)、ヒドロキシプロピルメチルセルロ
ース（Sigma社製、以下HPMCと略、終濃度0.125%)、N,N,
N',N'-テトラメチルエチレンジアミン（TEMED、ファル
マシアバイオテク社製、終濃度0.6%）を含む両性担体液
で満たした後、一分子蛍光標識抗ヒト アルファ１アン
チトリプシンＦａｂ’抗体を2 X 10E-8 M含む両性担体
液を陽極より高圧モードにて３０秒間注入した。
リプシンＦａｂ’抗体をベックマン社製キャピラリー電
気泳動装置P/ACE5510を用いて分離・検出を行った。キ
ャピラリーとしては内壁をポリアクリルアミドで共有結
合的に被覆した内径0.05ｍｍ、外径0.375ｍｍ、全長２
７ｃｍの溶解シリカキャピラリー（ジーエルサイエンス
社製） を使用し、陽極側から２０ｃｍの位置でレーザ
ー励起による蛍光検出を行った。キャピラリーをPharma
lyte3-10（アマシャム ファルマシアバイオテク社製、
原液の４０倍希釈)、ヒドロキシプロピルメチルセルロ
ース（Sigma社製、以下HPMCと略、終濃度0.125%)、N,N,
N',N'-テトラメチルエチレンジアミン（TEMED、ファル
マシアバイオテク社製、終濃度0.6%）を含む両性担体液
で満たした後、一分子蛍光標識抗ヒト アルファ１アン
チトリプシンＦａｂ’抗体を2 X 10E-8 M含む両性担体
液を陽極より高圧モードにて３０秒間注入した。
陽極液としてHPMC（終濃度0.1％）を含む２０ｍＭリ
ン酸、陽極液として２０ｍＭNaOHを用い、13.5KV（５０
０V/cm）の電圧を１０分間印荷した後、同じ電圧を維持
したまま、陽極側に低圧モードで陽極液を注入し、ｐＨ
勾配中に焦点化した一分子蛍光標識抗ヒト アルファ１
アンチトリプシンＦａｂ’抗体を検出した。蛍光色素の
励起はアルゴンイオンレーザー（ベックマン社製、Lase
r Module 488）波長４８８ｎｍを用い、フィルターハウ
ジングユニットには４８８ｎｍノッチフィルター（ベッ
クマン社製）とローダミン用バンドパスフィルター（旭
分光社製、特注品）をセットして検出を行った。得られ
た結果を図３に示す。図３からわかるように、大腸菌産
出の一分子蛍光標識抗ヒト アルファ１アンチトリプシ
ンＦａｂ’抗体の等電点は不均一であった。
ン酸、陽極液として２０ｍＭNaOHを用い、13.5KV（５０
０V/cm）の電圧を１０分間印荷した後、同じ電圧を維持
したまま、陽極側に低圧モードで陽極液を注入し、ｐＨ
勾配中に焦点化した一分子蛍光標識抗ヒト アルファ１
アンチトリプシンＦａｂ’抗体を検出した。蛍光色素の
励起はアルゴンイオンレーザー（ベックマン社製、Lase
r Module 488）波長４８８ｎｍを用い、フィルターハウ
ジングユニットには４８８ｎｍノッチフィルター（ベッ
クマン社製）とローダミン用バンドパスフィルター（旭
分光社製、特注品）をセットして検出を行った。得られ
た結果を図３に示す。図３からわかるように、大腸菌産
出の一分子蛍光標識抗ヒト アルファ１アンチトリプシ
ンＦａｂ’抗体の等電点は不均一であった。
（８）部位特異的変異法による等電点不均一性の是正
抗ヒト アルファ１アンチトリプシンＦａｂ’抗体の
等電点は不均一性を是正するために、以下に述べるよう
な、ＣＨ１領域に部位特異的変異を生じせしめるＤＮＡ
プライマーを設計して、抗体の改変を行った。なお、以
下の実施例において、例えば、カバットの番号付けによ
るＨ鎖第１６２番のＮ(アスパラギン)をＤ（アスパラギ
ン酸）に変換する（または、変換した）ことを表す場合
は、「Ｈ−Ｎ１６２Ｄ」なる記載を用いる場合がある。す
なわち、カバットの番号付けによるＨ鎖第１６２番のＮ
(アスパラギン)をＤ（アスパラギン酸）に変換したＦａ
ｂ’抗体を「Ｈ−Ｎ１６２Ｄ改変Ｆａｂ’抗体」のよう
に表し、この抗体を発現する遺伝子を「Ｈ−Ｎ１６２Ｄ
改変Ｆａｂ’抗体発現遺伝子」のように表す場合があ
る。
等電点は不均一性を是正するために、以下に述べるよう
な、ＣＨ１領域に部位特異的変異を生じせしめるＤＮＡ
プライマーを設計して、抗体の改変を行った。なお、以
下の実施例において、例えば、カバットの番号付けによ
るＨ鎖第１６２番のＮ(アスパラギン)をＤ（アスパラギ
ン酸）に変換する（または、変換した）ことを表す場合
は、「Ｈ−Ｎ１６２Ｄ」なる記載を用いる場合がある。す
なわち、カバットの番号付けによるＨ鎖第１６２番のＮ
(アスパラギン)をＤ（アスパラギン酸）に変換したＦａ
ｂ’抗体を「Ｈ−Ｎ１６２Ｄ改変Ｆａｂ’抗体」のよう
に表し、この抗体を発現する遺伝子を「Ｈ−Ｎ１６２Ｄ
改変Ｆａｂ’抗体発現遺伝子」のように表す場合があ
る。
ＤＮＡプライマーとしては、以下の塩基配列を有する
Ｆ５−１プライマー（配列表における配列番号５）およ
びＨ−Ｎ１６２Ｄ−ＢａｍＨＩプライマー（配列表にお
ける配列番号６）を用いた。なお、以下の配列におい
て、５’、３’は、それぞれプライマーの５’側、３’
側を表し、ＳはＣまたはＧ、ＭはＡまたはＣ、ＲはＡま
たはＧ、ＷはＡまたはＴを示す。
Ｆ５−１プライマー（配列表における配列番号５）およ
びＨ−Ｎ１６２Ｄ−ＢａｍＨＩプライマー（配列表にお
ける配列番号６）を用いた。なお、以下の配列におい
て、５’、３’は、それぞれプライマーの５’側、３’
側を表し、ＳはＣまたはＧ、ＭはＡまたはＣ、ＲはＡま
たはＧ、ＷはＡまたはＴを示す。
これらのプライマーを用いて、（２）で得られた抗ヒ
ト アルファ１アンチトリプシンＦａｂ’抗体発現遺伝
子を鋳型として、ＰＣＲを行うことにより、カバットの
番号付けによるＨ鎖第: ６２番のＮ(アスパラギン)がＤ
（アスパラギン酸）に変換された遺伝子断片を調製し、
これをBamHIで消化した。この消化産物に、抗ヒト アル
ファ１アンチトリプシンＦａｂ’抗体発現遺伝子のBamH
I消化産物を低融点アガロース電気泳動から回収した遺
伝子断片をライゲーションした。
ト アルファ１アンチトリプシンＦａｂ’抗体発現遺伝
子を鋳型として、ＰＣＲを行うことにより、カバットの
番号付けによるＨ鎖第: ６２番のＮ(アスパラギン)がＤ
（アスパラギン酸）に変換された遺伝子断片を調製し、
これをBamHIで消化した。この消化産物に、抗ヒト アル
ファ１アンチトリプシンＦａｂ’抗体発現遺伝子のBamH
I消化産物を低融点アガロース電気泳動から回収した遺
伝子断片をライゲーションした。
ライゲーションした産物を、（２）で用いたものと同
じpCANTAB5Eプラスミドベクターに連結させるために、
以下の塩基配列を有するＦ５−２プライマーおよびＫ３
−２プライマーを用いてＰＣＲを行い、SfiI、Not Iの
制限酵素を用いて消化した後、pCANTAB5Eプラスミドベ
クターにライゲーションし、Ｈ−Ｎ１６２Ｄ改変Ｆａ
ｂ’抗体発現遺伝子を含む発げベクターを作製した。
じpCANTAB5Eプラスミドベクターに連結させるために、
以下の塩基配列を有するＦ５−２プライマーおよびＫ３
−２プライマーを用いてＰＣＲを行い、SfiI、Not Iの
制限酵素を用いて消化した後、pCANTAB5Eプラスミドベ
クターにライゲーションし、Ｈ−Ｎ１６２Ｄ改変Ｆａ
ｂ’抗体発現遺伝子を含む発げベクターを作製した。
上記発現ベクターを、大腸菌HB2151に形質転換した。
上記と同様にして抗体を誘導し、ELISAによるスクリー
ニングをおこなった。陽性反応を示す菌からプラスミド
を抽出して、大腸菌XL10菌へ形質転換した。形質転換さ
れたXL10菌からシークエンス反応に使用する量のプラス
ミドを抽出して、Ｈ−Ｎ１６２Ｄ改変Ｆａｂ’抗体発現
遺伝子の塩基配列を確認した。改変体作製においては、
ポリメラーゼとしては、適合度（fidelity）の高いPyro
bestポリメラーゼ（宝酒造社製）を用いた。塩基配列を
確認した後、上記発現ベクターで形質転換された大腸菌
HB2151の培養スケールを拡大して、Ｈ−Ｎ１６２Ｄ改変
Ｆａｂ’抗体を産出させ、該抗体をアフィニティーカラ
ムにより精製し、Ｈ−Ｎ１６２Ｄ改変Ｆａｂ’抗体の精
製物を得た。
上記と同様にして抗体を誘導し、ELISAによるスクリー
ニングをおこなった。陽性反応を示す菌からプラスミド
を抽出して、大腸菌XL10菌へ形質転換した。形質転換さ
れたXL10菌からシークエンス反応に使用する量のプラス
ミドを抽出して、Ｈ−Ｎ１６２Ｄ改変Ｆａｂ’抗体発現
遺伝子の塩基配列を確認した。改変体作製においては、
ポリメラーゼとしては、適合度（fidelity）の高いPyro
bestポリメラーゼ（宝酒造社製）を用いた。塩基配列を
確認した後、上記発現ベクターで形質転換された大腸菌
HB2151の培養スケールを拡大して、Ｈ−Ｎ１６２Ｄ改変
Ｆａｂ’抗体を産出させ、該抗体をアフィニティーカラ
ムにより精製し、Ｈ−Ｎ１６２Ｄ改変Ｆａｂ’抗体の精
製物を得た。
上記の方法により確認された、Ｈ−Ｎ１６２Ｄ改変Ｆ
ａｂ’抗体のＣＨ１領域およびＣＨ１領域のＣ末端に隣
接する部分の配列（配列表における配列番号９）を以下
に示す。
ａｂ’抗体のＣＨ１領域およびＣＨ１領域のＣ末端に隣
接する部分の配列（配列表における配列番号９）を以下
に示す。
この配列において、Ｃ末端側（右側）のVPRDCGCSRの
配列が、ＣＨ１領域のＣ末端に隣接する部分に導入され
たＬ鎖との結合に関与しないシステイン残基（Ｃ）を含
むアミノ酸配列である。なお、Ｌ鎖との結合に関与しな
いシステイン残基はVPRDCGCSRの配列におけるＣ末端側
のシステイン残基である。また、VPRDCGCSRの配列を除
く部分はＣＨ１領域の配列である。
配列が、ＣＨ１領域のＣ末端に隣接する部分に導入され
たＬ鎖との結合に関与しないシステイン残基（Ｃ）を含
むアミノ酸配列である。なお、Ｌ鎖との結合に関与しな
いシステイン残基はVPRDCGCSRの配列におけるＣ末端側
のシステイン残基である。また、VPRDCGCSRの配列を除
く部分はＣＨ１領域の配列である。
なお、Ｈ−Ｎ１６２Ｄ改変を行う前のＦａｂ’抗体に
おける同様の部分の配列（配列表における配列番号１
０）は以下のとおりである。
おける同様の部分の配列（配列表における配列番号１
０）は以下のとおりである。
上記２つの配列を比較すると、Ｈ−Ｎ１６２Ｄ改変を
行う前のＦａｂ’抗体における、カバットの番号付けに
よるＨ鎖第１６２番のアスパラギン残基（下線を付した
Ｎ）が、改変後にはアスパラギン酸（下線を付したＤ）
になっていることがわかる。また、本実施例において
は、Ｈ−Ｎ１６２Ｄ改変Ｆａｂ’抗体におけるＣＨ１領
域のＣ末端に隣接する部分の配列（VPRDCGCSR）は、Ｈ
−Ｎ１６２Ｄ改変を行う前のＦａｂ’抗体におけるＣＨ
１領域のＣ末端に隣接する部分の配列（VPRDCGCSR）と
同一となっている。
行う前のＦａｂ’抗体における、カバットの番号付けに
よるＨ鎖第１６２番のアスパラギン残基（下線を付した
Ｎ）が、改変後にはアスパラギン酸（下線を付したＤ）
になっていることがわかる。また、本実施例において
は、Ｈ−Ｎ１６２Ｄ改変Ｆａｂ’抗体におけるＣＨ１領
域のＣ末端に隣接する部分の配列（VPRDCGCSR）は、Ｈ
−Ｎ１６２Ｄ改変を行う前のＦａｂ’抗体におけるＣＨ
１領域のＣ末端に隣接する部分の配列（VPRDCGCSR）と
同一となっている。
（９）蛍光標識等電点均一化Ｆａｂ’抗体の蛍光検出キ
ャピラリー等電点電気泳動による分離・検出 （８）で得られたＨ−Ｎ１６２Ｄ改変Ｆａｂ’抗体
を、（６）に記載の方法と同様にして、テトラメチルロ
ーダミン−５−ヨードアセタミド（モレキュラープロー
ブス社製）で蛍光標識して、一分子蛍光標識Ｆａｂ’抗
体を得た。この一分子蛍光標識Ｆａｂ’抗体を、（７）
と同様にしてベックマン社製キャピラリー電気泳動装置
P/ACE5510を用いて分離・検出を行った。その結果を図
４に示す。
ャピラリー等電点電気泳動による分離・検出 （８）で得られたＨ−Ｎ１６２Ｄ改変Ｆａｂ’抗体
を、（６）に記載の方法と同様にして、テトラメチルロ
ーダミン−５−ヨードアセタミド（モレキュラープロー
ブス社製）で蛍光標識して、一分子蛍光標識Ｆａｂ’抗
体を得た。この一分子蛍光標識Ｆａｂ’抗体を、（７）
と同様にしてベックマン社製キャピラリー電気泳動装置
P/ACE5510を用いて分離・検出を行った。その結果を図
４に示す。
図４からわかるように、一分子蛍光標識されたＨ−Ｎ
１６２Ｄ改変Ｆａｂ’抗体をキャピラリー電気泳動した
場合は、移動時間２９分付近に一つの大きなピークが現
われ、他の部分には実質的にピークが現われなかった。
これは、Ｈ−Ｎ１６２Ｄ改変Ｆａｂ’抗体の等電点が均
一であることを意味する。
１６２Ｄ改変Ｆａｂ’抗体をキャピラリー電気泳動した
場合は、移動時間２９分付近に一つの大きなピークが現
われ、他の部分には実質的にピークが現われなかった。
これは、Ｈ−Ｎ１６２Ｄ改変Ｆａｂ’抗体の等電点が均
一であることを意味する。
（１０）荷電性アミノ酸残基を含むアミノ酸配列の付加
（８）で得られたＨ−Ｎ１６２Ｄ改変Ｆａｂ’抗体の
Ｌ鎖のＣ末端に隣接して荷電性アミノ酸残基を含むアミ
ノ酸配列を付加するため、荷電性アミノ酸残基を含むア
ミノ酸配列挿入用のＤＮＡプライマーを設計して、上述
のＨ−Ｎ１６２Ｄ改変Ｆａｂ’抗体発現遺伝子を鋳型と
して用い、ＰＣＲを行うことにより、Ｌ鎖のＣ末端に隣
接して荷電性アミノ酸残基を含むアミノ酸配列が付加さ
れたＨ−Ｎ１６２Ｄ改変Ｆａｂ’抗体を発現する遺伝子
（以下、場合により、荷電性付与Ｈ−Ｎ１６２Ｄ改変Ｆ
ａｂ’抗体発現遺伝子と呼ぶ）を得た。ＤＮＡプライマ
ーとしては、上述のＦ５−１プライマー（配列番号
５)、Ｆ５−２プライマー（配列番号７)、および以下に
示すＫ３＋５ＲＰＳプライマー（配列番号１１）を用い
た。
Ｌ鎖のＣ末端に隣接して荷電性アミノ酸残基を含むアミ
ノ酸配列を付加するため、荷電性アミノ酸残基を含むア
ミノ酸配列挿入用のＤＮＡプライマーを設計して、上述
のＨ−Ｎ１６２Ｄ改変Ｆａｂ’抗体発現遺伝子を鋳型と
して用い、ＰＣＲを行うことにより、Ｌ鎖のＣ末端に隣
接して荷電性アミノ酸残基を含むアミノ酸配列が付加さ
れたＨ−Ｎ１６２Ｄ改変Ｆａｂ’抗体を発現する遺伝子
（以下、場合により、荷電性付与Ｈ−Ｎ１６２Ｄ改変Ｆ
ａｂ’抗体発現遺伝子と呼ぶ）を得た。ＤＮＡプライマ
ーとしては、上述のＦ５−１プライマー（配列番号
５)、Ｆ５−２プライマー（配列番号７)、および以下に
示すＫ３＋５ＲＰＳプライマー（配列番号１１）を用い
た。
荷電性付与Ｈ−Ｎ１６２Ｄ改変Ｆａｂ’抗体発現遺伝
子を、制限酵素である SfiI、または SfiI および Not
I を用いて、消化した後、タンパク質発現プラスミドベ
クター（pCANTAB5E プラスミドベクター等）にライゲー
ションを行い、荷電性付与Ｈ−Ｎ１６２Ｄ改変Ｆａｂ’
抗体発現遺伝子をを含む発現ベクターを作製した。
子を、制限酵素である SfiI、または SfiI および Not
I を用いて、消化した後、タンパク質発現プラスミドベ
クター（pCANTAB5E プラスミドベクター等）にライゲー
ションを行い、荷電性付与Ｈ−Ｎ１６２Ｄ改変Ｆａｂ’
抗体発現遺伝子をを含む発現ベクターを作製した。
この発現ベクターを、大腸菌 HB2151 に形質転換し
た。上記と同様にして抗体を誘導し、ELISA によるスク
リーニングをおこなった。陽性反応を示す菌からプラス
ミドを抽出して、大腸菌 XL10 菌へ形質転換した。形質
転換された XL10 菌からシークエンス反応に使用する量
のプラスミドを抽出して、荷電性付与Ｈ−Ｎ１６２Ｄ改
変Ｆａｂ’抗体発現遺伝子の塩基配列を確認した。改変
体作製においては、ポリメラーゼとしては、適合度（fi
delity）の高い Pyrobest ポリメラーゼ（宝酒造社製）
を用いた。塩基配列を確認した後、上記発現ベクターで
形質転換された大腸菌 HB2151 の培養スケールを拡大し
て、Ｌ鎖のＣ末端に隣接して荷電性アミノ酸残基を含む
アミノ酸配列が付加されたＨ−Ｎ１６２Ｄ改変Ｆａｂ’
抗体（以下、場合により、荷電性付与Ｈ−Ｎ１６２Ｄ改
変Ｆａｂ’抗体と呼ぶ）を産出させ、該抗体をアフィニ
ティーカラムにより精製し精製物を得た。
た。上記と同様にして抗体を誘導し、ELISA によるスク
リーニングをおこなった。陽性反応を示す菌からプラス
ミドを抽出して、大腸菌 XL10 菌へ形質転換した。形質
転換された XL10 菌からシークエンス反応に使用する量
のプラスミドを抽出して、荷電性付与Ｈ−Ｎ１６２Ｄ改
変Ｆａｂ’抗体発現遺伝子の塩基配列を確認した。改変
体作製においては、ポリメラーゼとしては、適合度（fi
delity）の高い Pyrobest ポリメラーゼ（宝酒造社製）
を用いた。塩基配列を確認した後、上記発現ベクターで
形質転換された大腸菌 HB2151 の培養スケールを拡大し
て、Ｌ鎖のＣ末端に隣接して荷電性アミノ酸残基を含む
アミノ酸配列が付加されたＨ−Ｎ１６２Ｄ改変Ｆａｂ’
抗体（以下、場合により、荷電性付与Ｈ−Ｎ１６２Ｄ改
変Ｆａｂ’抗体と呼ぶ）を産出させ、該抗体をアフィニ
ティーカラムにより精製し精製物を得た。
上記の方法により確認された、荷電性付与Ｈ−Ｎ１６
２Ｄ改変Ｆａｂ’抗体のＣＬ領域およびＣＬ領域のＣ末
端（Ｌ鎖のＣ末端）に隣接する部分の配列（配列表にお
ける配列番号１２）を以下に示す。
２Ｄ改変Ｆａｂ’抗体のＣＬ領域およびＣＬ領域のＣ末
端（Ｌ鎖のＣ末端）に隣接する部分の配列（配列表にお
ける配列番号１２）を以下に示す。
この配列において、Ｃ末端側（右側）の SRPSRPSRPSR
PSRP の配列が、ＣＬ領域のＣ末端（Ｌ鎖のＣ末端）に
隣接して付加された、荷電性アミノ酸残基を含むアミノ
酸配列である。この配列は、ＳＲＰなる配列が５回繰り
返したものであり、Ｒ（アルギニン）が荷電性アミノ酸
残基である。また、SRPSRPSRPSRPSRPの配列を除く部分
の配列は以下のようであり、 この配列は、ＣＬ領域の配列（配列番号１３）である。
PSRP の配列が、ＣＬ領域のＣ末端（Ｌ鎖のＣ末端）に
隣接して付加された、荷電性アミノ酸残基を含むアミノ
酸配列である。この配列は、ＳＲＰなる配列が５回繰り
返したものであり、Ｒ（アルギニン）が荷電性アミノ酸
残基である。また、SRPSRPSRPSRPSRPの配列を除く部分
の配列は以下のようであり、 この配列は、ＣＬ領域の配列（配列番号１３）である。
（１１）免疫複合体の蛍光検出キャピラリー等電点電気
泳動による分離・検出 （８）で得られた、Ｈ−Ｎ１６２Ｄ改変Ｆａｂ’抗体
を（６）に記載の方法と同様にして、テトラメチルロー
ダミン−５−ヨードアセタミド（モレキュラープローブ
ス社製）で一分子蛍光標識した（蛍光標識して得られた
ものを、以下、蛍光標識等電点均一化Ｆａｂ’抗体と呼
ぶ場合がある)。一方、(１０）で得られた荷電性付与Ｈ
−Ｎ１６２Ｄ改変Ｆａｂ’抗体に関しても、(６）に記
載の方法と同様にして、テトラメチルコーダミン−５−
ヨードアセタミド（モレキュラープローブス社製）で一
分子蛍光標識した（蛍光標識して得られたものを、以
下、荷電性が付与された蛍光標識等電点均一化Ｆａｂ’
抗体と呼ぶ場合がある)。
泳動による分離・検出 （８）で得られた、Ｈ−Ｎ１６２Ｄ改変Ｆａｂ’抗体
を（６）に記載の方法と同様にして、テトラメチルロー
ダミン−５−ヨードアセタミド（モレキュラープローブ
ス社製）で一分子蛍光標識した（蛍光標識して得られた
ものを、以下、蛍光標識等電点均一化Ｆａｂ’抗体と呼
ぶ場合がある)。一方、(１０）で得られた荷電性付与Ｈ
−Ｎ１６２Ｄ改変Ｆａｂ’抗体に関しても、(６）に記
載の方法と同様にして、テトラメチルコーダミン−５−
ヨードアセタミド（モレキュラープローブス社製）で一
分子蛍光標識した（蛍光標識して得られたものを、以
下、荷電性が付与された蛍光標識等電点均一化Ｆａｂ’
抗体と呼ぶ場合がある)。
あらかじめ５４３ｎｍにおけるモル吸光係数を87,000
として濃度を測定した、蛍光標識等電点均一化Ｆａｂ’
抗体および荷電性が付与された蛍光標識等電点均一化Ｆ
ａｂ’抗体溶液は、それぞれ、マイクロコン−１０（分
画分子量10,000）（ミリポア社製）で遠心分離して濃縮
後、高圧蒸気滅菌したMilliQ水を加えて遠心分離する操
作を計２回繰り返して脱塩を行い、最終的に80nMとなる
よう高圧蒸気滅菌したMilliQ水に溶解した。
として濃度を測定した、蛍光標識等電点均一化Ｆａｂ’
抗体および荷電性が付与された蛍光標識等電点均一化Ｆ
ａｂ’抗体溶液は、それぞれ、マイクロコン−１０（分
画分子量10,000）（ミリポア社製）で遠心分離して濃縮
後、高圧蒸気滅菌したMilliQ水を加えて遠心分離する操
作を計２回繰り返して脱塩を行い、最終的に80nMとなる
よう高圧蒸気滅菌したMilliQ水に溶解した。
ヒト アルファ１アンチトリプシン（カルビオケム社
製）は高圧蒸気滅菌したMilliQ水を加えて溶解後、マイ
クロコン−１０（分画分子量10,000) (ミリポア社製）
で遠心分離して濃縮後、高圧蒸気滅菌したMilliQ水を加
えて遠心分離する操作を計２回繰り返して脱塩を行い、
最終的に8μMとなるよう高圧蒸気滅菌したMilliQ水に溶
解した。
製）は高圧蒸気滅菌したMilliQ水を加えて溶解後、マイ
クロコン−１０（分画分子量10,000) (ミリポア社製）
で遠心分離して濃縮後、高圧蒸気滅菌したMilliQ水を加
えて遠心分離する操作を計２回繰り返して脱塩を行い、
最終的に8μMとなるよう高圧蒸気滅菌したMilliQ水に溶
解した。
蛍光標識等電点均一化Ｆａｂ’抗体溶液とヒトアルフ
ァ１アンチトリプシン溶液を等量混合し、混合溶液と等
量のPhrmalyte3-10（アマシャム ファルマシアバイオテ
ク社製、原液の２０倍希釈)、ヒドロキシプロピルメチ
ルセルロース（シグマ社製、終濃度0.8%）を含む両性担
体溶液を混合し、遮光化、室温にて１０分間反応させ免
疫複合体を形成させた。荷電性が付与された蛍光標識等
電点均一化Ｆａｂ’抗体溶液に関しても、同様にして反
応を行い免疫複合体を形成させた。得られた反応溶液
を、それぞれ、ベックマン社製キャピラリー電気泳動装
置P/ACE5510を用いて分離・検出を行った。
ァ１アンチトリプシン溶液を等量混合し、混合溶液と等
量のPhrmalyte3-10（アマシャム ファルマシアバイオテ
ク社製、原液の２０倍希釈)、ヒドロキシプロピルメチ
ルセルロース（シグマ社製、終濃度0.8%）を含む両性担
体溶液を混合し、遮光化、室温にて１０分間反応させ免
疫複合体を形成させた。荷電性が付与された蛍光標識等
電点均一化Ｆａｂ’抗体溶液に関しても、同様にして反
応を行い免疫複合体を形成させた。得られた反応溶液
を、それぞれ、ベックマン社製キャピラリー電気泳動装
置P/ACE5510を用いて分離・検出を行った。
蛍光標識等電点均一化Ｆａｂ’抗体を用いた場合の結
果を図５に示し、荷電性が付与された蛍光標識等電点均
一化Ｆａｂ’抗体を用いた場合の結果を図６に示す。図
５においては、移動時間が約２２分の大きなピークが、
２０分〜２５分の範囲における多くのピークと重なり合
っているために、十分な分離ができていないのに対し
て、図６においては、移動時間が２２分付近の大きなピ
ークと、移動時間が２４分より大きい領域に現われたピ
ークが十分分離されている。
果を図５に示し、荷電性が付与された蛍光標識等電点均
一化Ｆａｂ’抗体を用いた場合の結果を図６に示す。図
５においては、移動時間が約２２分の大きなピークが、
２０分〜２５分の範囲における多くのピークと重なり合
っているために、十分な分離ができていないのに対し
て、図６においては、移動時間が２２分付近の大きなピ
ークと、移動時間が２４分より大きい領域に現われたピ
ークが十分分離されている。
以上説明した本発明の抗原の定量的検出方法を、等電
点均一化Ｆａｂ’抗体を製造する工程を含めて模式的に
表すと図７Ａ〜Ｄのようになる。図７Ａは等電点均一化
Ｆａｂ’抗体を発現する遺伝子を組み込んだ大腸菌を示
し、この大腸菌に対してIPTG (isopropyl-β-D-thiogal
actopyranoside）を作用させることにより抗体を誘導す
る。図７Ｂは、この抗体誘導により生じた本発明の等電
点均一化Ｆａｂ’抗体を示す。この等電点均一化Ｆａ
ｂ’抗体は、アフィニティカラム等で精製した後、蛍光
標識される。図７Ｃは、この蛍光標識された等電点均一
化Ｆａｂ’抗体を示す。蛍光標識された等電点均一化Ｆ
ａｂ’抗体と抗原とからなる免疫複合体を電気泳動した
結果、図７Ｄに示すような移動時間と蛍光強度の関係図
が得られる。
点均一化Ｆａｂ’抗体を製造する工程を含めて模式的に
表すと図７Ａ〜Ｄのようになる。図７Ａは等電点均一化
Ｆａｂ’抗体を発現する遺伝子を組み込んだ大腸菌を示
し、この大腸菌に対してIPTG (isopropyl-β-D-thiogal
actopyranoside）を作用させることにより抗体を誘導す
る。図７Ｂは、この抗体誘導により生じた本発明の等電
点均一化Ｆａｂ’抗体を示す。この等電点均一化Ｆａ
ｂ’抗体は、アフィニティカラム等で精製した後、蛍光
標識される。図７Ｃは、この蛍光標識された等電点均一
化Ｆａｂ’抗体を示す。蛍光標識された等電点均一化Ｆ
ａｂ’抗体と抗原とからなる免疫複合体を電気泳動した
結果、図７Ｄに示すような移動時間と蛍光強度の関係図
が得られる。
一方、特表平８−５０６１８２号公報に開示の従来技
術による抗原の定量的検出方法を、等電点均一化Ｆａ
ｂ’抗体を製造する工程を含めて模式的に表すと図８Ａ
〜Ｇのようになる。図７Ａ〜Ｄと図８Ａ〜Ｇを比較して
明らかなように、従来技術の検出方法は、等電点均一化
Ｆａｂ’抗体を得るまでの工程が非常に多く煩雑である
ことがわかる。これに加えて、上述したように従来技術
の検出方法では、測定対象である抗原の等電点と等電点
均一化Ｆａｂ’抗体の等電点が近い場合、電気泳動の結
果、免疫複合体と、余剰の抗原および／または等電点均
一化Ｆａｂ’抗体がほぼ等しい移動時間で検出されるた
めに、ピークが重なってしまい精度の高い検出ができな
い。一方、図７Ａ〜Ｄに示す本発明の検出方法は、等電
点均一化Ｆａｂ’抗体を得るまでの工程が簡潔であり、
測定対象である抗原の等電点と等電点均一化Ｆａｂ’抗
体の等電点が近い場合であっても、ピークを分離して検
出することができるため高精度な検出が可能となる。
術による抗原の定量的検出方法を、等電点均一化Ｆａ
ｂ’抗体を製造する工程を含めて模式的に表すと図８Ａ
〜Ｇのようになる。図７Ａ〜Ｄと図８Ａ〜Ｇを比較して
明らかなように、従来技術の検出方法は、等電点均一化
Ｆａｂ’抗体を得るまでの工程が非常に多く煩雑である
ことがわかる。これに加えて、上述したように従来技術
の検出方法では、測定対象である抗原の等電点と等電点
均一化Ｆａｂ’抗体の等電点が近い場合、電気泳動の結
果、免疫複合体と、余剰の抗原および／または等電点均
一化Ｆａｂ’抗体がほぼ等しい移動時間で検出されるた
めに、ピークが重なってしまい精度の高い検出ができな
い。一方、図７Ａ〜Ｄに示す本発明の検出方法は、等電
点均一化Ｆａｂ’抗体を得るまでの工程が簡潔であり、
測定対象である抗原の等電点と等電点均一化Ｆａｂ’抗
体の等電点が近い場合であっても、ピークを分離して検
出することができるため高精度な検出が可能となる。
産業上の利用可能性
以上説明したように、本発明によれば、測定対象であ
る抗原の等電点と蛍光標識された抗体の等電点が近い場
合であっても、高精度で抗原を分析することが可能な、
抗原の定量的検出方法を提供することが可能となる。
る抗原の等電点と蛍光標識された抗体の等電点が近い場
合であっても、高精度で抗原を分析することが可能な、
抗原の定量的検出方法を提供することが可能となる。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(72)発明者 志村 清仁
静岡県浜北市平口5000番地 株式会社分
子バイオホトニクス研究所内
(72)発明者 笠井 献一
静岡県浜北市平口5000番地 株式会社分
子バイオホトニクス研究所内
(56)参考文献 特開 平５−322892（ＪＰ，Ａ)
特表 平８−506182（ＪＰ，Ａ)
生物物理化学 第39巻、第６号
（1995） 第349−353頁
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
G01N 33/53 - 33/579
Claims (10)
- 【請求項１】 荷電性アミノ酸残基を含むアミノ酸配列
が付加され、発蛍光団色素で標識されており、且つ分析
用試料に含まれる抗原と免疫複合体を形成する等電点均
一化Ｆａｂ’抗体を提供する第１の工程と、 前記等電点均一化Ｆａｂ’抗体と、前記抗原を含む前記
分析用試料とを混合し、前記免疫複合体を含む混合物を
得る第２の工程と、 前記混合物を担体中で電気泳動させ、前記混合物を分離
させる第３の工程と、 前記第３の工程で分離された前記混合物に、前記発蛍光
団色素を励起可能な励起光を照射して、前記免疫複合体
に蛍光を生じせしめる第４の工程と、 前記蛍光を検出する第５の工程と、 を含む、抗原の定量的検出方法。 - 【請求項２】前記アミノ酸配列が、前記等電点均一化Ｆ
ａｂ’抗体のＬ鎖のＣ末端に隣接するように付加されて
いる、請求の範囲第１項記載の方法。 - 【請求項３】前記発蛍光団色素が、前記等電点均一化Ｆ
ａｂ’抗体のＣＨ１領域のＣ末端に隣接するアミノ酸配
列におけるＬ鎖との結合に関与しないシステイン残基に
結合している、請求の範囲第１項記載の方法。 - 【請求項４】 前記電気泳動が、等電点電気泳動法によ
り実施される、請求の範囲第１項記載の方法。 - 【請求項５】 前記電気泳動が、キャピラリー電気泳動
法により実施される、請求の範囲第１項記載の方法。 - 【請求項６】 前記等電点均一化Ｆａｂ’抗体が、 Ｆａｂ’抗体のＶＨ領域、ＣＨ１領域、および該ＣＨ１
領域のＣ末端に隣接しＬ鎖との結合に関与しないシステ
イン残基を含むアミノ酸配列をコードするＦｄ鎖遺伝子
を提供する第１の工程と、 前記Ｆｄ鎖遺伝子において、前記ＣＨ１領域のアミド基
含有アミノ酸残基をコードするコドンの少なくとも一つ
を、システインを除くアミド基非含有アミノ酸残基をコ
ードするコドンに部位特異的変異させて、改変Ｆｄ鎖遺
伝子を得る第２の工程と、 前記改変Ｆｄ鎖遺伝子と、前記Ｆａｂ’抗体のＬ鎖をコ
ードするＬ鎖遺伝子とを発現可能な状態で連結させ、改
変Ｆａｂ’抗体発現遺伝子を得る第３の工程と、 前記改変Ｆａｂ’抗体発現遺伝子を、前記Ｌ鎖のＣ末端
に隣接して荷電性アミノ酸残基を含むアミノ酸配列が発
現するように改変し、荷電性付与改変Ｆａｂ’抗体発現
遺伝子を得る第４の工程と、 前記荷電性付与改変Ｆａｂ’抗体発現遺伝子で宿主細胞
を形質転換し、得られた形質転換体を培養することによ
り、Ｌ鎖のＣ末端に隣接して荷電性アミノ酸残基を含む
アミノ酸配列が付加され、且つＣＨ１領域のＣ末端に隣
接してＬ鎖との結合に関与しないシステイン残基を含む
アミノ酸配列が形成された、等電点均一化Ｆａｂ’抗体
を得る第５の工程と、 前記第５の工程で得られた等電点均一化Ｆａｂ’抗体に
おけるＬ鎖との結合に関与しないシステイン残基に発蛍
光団色素を結合させる第６の工程と、 を含む方法により製造されたものである、請求の範囲第
１項記載の方法。 - 【請求項７】 前記等電点均一化Ｆａｂ’抗体が、 Ｆａｂ’抗体のＶＨ領域、ＣＨ１領域、および該ＣＨ１
領域のＣ末端に隣接しＬ鎖との結合に関与しないシステ
イン残基を含むアミノ酸配列をコードするＦｄ鎖遺伝子
を提供する第１の工程と、 前記Ｆｄ鎖遺伝子において、前記ＣＨ１領域のアミド基
含有アミノ酸残基をコードするコドンの少なくとも一つ
を、システインを除くアミド基非含有アミノ酸残基をコ
ードするコドンに部位特異的変異させて、改変Ｆｄ鎖遺
伝子を得る第２の工程と、 前記Ｆａｂ’抗体のＬ鎖をコードするＬ鎖遺伝子を提供
する第３の工程と、 前記Ｌ鎖遺伝子を、前記Ｌ鎖のＣ末端に隣接して荷電性
アミノ酸残基を含むアミノ酸配列が発現するように改変
し、荷電性付与Ｌ鎖遺伝子を得る第４の工程と、 前記改変Ｆｄ鎖遺伝子と、前記荷電性付与Ｌ鎖遺伝子を
発現可能な状態で連結させ、荷電性付与改変Ｆａｂ’抗
体発現遺伝子を得る第５の工程と、 前記荷電性付与改変Ｆａｂ’抗体発現遺伝子で宿主細胞
を形質転換し、得られた形質転換体を培養することによ
り、Ｌ鎖のＣ末端に隣接して荷電性アミノ酸残基を含む
アミノ酸配列が付加され、且つＣＨ１領域のＣ末端に隣
接してＬ鎖との結合に関与しないシステイン残基を含む
アミノ酸配列が形成された、等電点均一化Ｆａｂ’抗体
を得る第６の工程と、 前記第６の工程で得られた等電点均一化Ｆａｂ’抗体に
おけるＬ鎖との結合に関与しないシステイン残基に発蛍
光団色素を結合させる第７の工程と、 を含む方法により製造されたものである、請求の範囲第
１項記載の方法。 - 【請求項８】 前記等電点均一化Ｆａｂ’抗体が、 Ｆａｂ’抗体のＶＨ領域、ＣＨ１領域、および該ＣＨ１
領域のＣ末端に隣接しＬ鎖との結合に関与しないシステ
イン残基を含むアミノ酸配列をコードするＦｄ鎖遺伝子
と、該Ｆａｂ’抗体のＬ鎖をコードするＬ鎖遺伝子とを
提供する第１の工程と、 前記Ｆｄ鎖遺伝子と前記Ｌ鎖遺伝子とを発現可能な状態
で連結させ、Ｆａｂ’抗体発現遺伝子を得る第２の工程
と、 前記Ｆａｂ’抗体発現遺伝子を、前記Ｌ鎖のＣ末端に隣
接して荷電性アミノ酸残基を含むアミノ酸配列が発現す
るように改変し、且つ、前記Ｆａｂ’抗体発現遺伝子に
おける前記ＣＨ１領域のアミド基含有アミノ酸残基をコ
ードするコドンの少なくとも一つを、システインを除く
アミド基非含有アミノ酸残基をコードするコドンに部位
特異的変異させて、荷電性付与改変Ｆａｂ’抗体発現遺
伝子を得る第３の工程と、 前記荷電性付与改変Ｆａｂ’抗体発現遺伝子で宿主細胞
を形質転換し、得られた形質転換体を培養することによ
り、Ｌ鎖のＣ末端に隣接して荷電性アミノ酸残基を含む
アミノ酸配列が付加され、且つＣＨ１領域のＣ末端に隣
接してＬ鎖との結合に関与しないシステイン残基を含む
アミノ酸配列が形成された、等電点均一化Ｆａｂ’抗体
を得る第４の工程と、 前記第４の工程で得られた等電点均一化Ｆａｂ’抗体に
おけるＬ鎖との結合に関与しないシステイン残基に発蛍
光団色素を結合させる第５の工程と、 を含む方法により製造されたものである、請求の範囲第
１項記載の方法。 - 【請求項９】 前記等電点均一化Ｆａｂ’抗体が、 第１のＦａｂ’抗体のＣＨ１領域、および該ＣＨ１領域
のＣ末端に隣接しＬ鎖との結合に関与しないシステイン
残基を含むアミノ酸配列をコードするＣＨ１遺伝子と、
該第１のＦａｂ’抗体のＣＬ領域をコードするＣＬ遺伝
子とを提供する第１の工程と、 前記ＣＨ１遺伝子において、ＣＨ１領域のアミド基含有
アミノ酸残基をコードするコドンの少なくとも一つを、
システインを除くアミド基非含有アミノ酸残基をコード
するコドンに部位特異的変異させて、改変ＣＨ１遺伝子
を得る第２の工程と、 前記改変ＣＨ１遺伝子を制限酵素で切断しＣＨ１領域を
コードする遺伝子を含む遺伝子断片を得る第３の工程
と、 第２のＦａｂ’抗体のＶＨ領域をコードするＶＨ遺伝子
と、該第２のＦａｂ’抗体のＶＬ領域をコードするＶＬ
遺伝子を提供する第４の工程と、 前記遺伝子断片、前記ＣＬ遺伝子、前記ＶＨ遺伝子およ
び前記ＶＬ遺伝子を発現可能な状態で連結し、改変Ｆａ
ｂ’抗体発現遺伝子を得る第５の工程と、 前記改変Ｆａｂ’抗体発現遺伝子を、前記ＣＬ領域のＣ
末端に隣接して荷電性アミノ酸残基を含むアミノ酸配列
が発現するように改変し、荷電性付与改変Ｆａｂ’抗体
発現遺伝子を得る第６の工程と、 前記荷電性付与改変Ｆａｂ’抗体発現遺伝子で宿主細胞
を形質転換し、得られた形質転換体を培養することによ
り、Ｌ鎖のＣ末端に隣接して荷電性アミノ酸残基を含む
アミノ酸配列が付加され、且つＣＨ１領域のＣ末端に隣
接してＬ鎖との結合に関与しないシステイン残基を含む
アミノ酸配列が形成された、等電点均一化Ｆａｂ’抗体
を得る第７の工程と、 前記第７の工程で得られた等電点均一化Ｆａｂ’抗体に
おけるＬ鎖との結合に関与しないシステイン残基に発蛍
光団色素を結合させる第８の工程と、 を含む方法により製造されたものである、請求の範囲第
１項記載の方法。 - 【請求項１０】 前記等電点均一化Ｆａｂ’抗体が、 第１のＦａｂ’抗体のＣＨ１領域、および該ＣＨ１領域
のＣ末端に隣接しＬ鎖との結合に関与しないシステイン
残基を含むアミノ酸配列をコードするＣＨ１遺伝子と、
該第１のＦａｂ’抗体のＣＬ領域をコードするＣＬ遺伝
子とを提供する第１の工程と、 前記ＣＨ１遺伝子において、ＣＨ１領域のアミド基含有
アミノ酸残基をコードするコドンの少なくとも一つを、
システインを除くアミド基非含有アミノ酸残基をコード
するコドンに部位特異的変異させて、改変ＣＨ１遺伝子
を得る第２の工程と、 前記改変ＣＨ１遺伝子を制限酵素で切断しＣＨ１領域を
コードする遺伝子を含む遺伝子断片を得る第３の工程
と、 前記ＣＬ遺伝子を、前記ＣＬ領域のＣ末端に隣接して荷
電性アミノ酸残基を含むアミノ酸配列が発現するように
改変し、荷電性付与ＣＬ遺伝子を得る第４の工程と、 第２のＦａｂ’抗体のＶＨ領域をコードするＶＨ遺伝子
と、該第２のＦａｂ’抗体のＶＬ領域をコードするＶＬ
遺伝子を提供する第５の工程と、 前記遺伝子断片、前記荷電性付与ＣＬ遺伝子、前記ＶＨ
遺伝子および前記ＶＬ遺伝子を発現可能な状態で連結
し、荷電性付与改変Ｆａｂ’抗体発現遺伝子を得る第６
の工程と、 前記荷電性付与改変Ｆａｂ’抗体発現遺伝子で宿主細胞
を形質転換し、得られた形質転換体を培養することによ
り、Ｌ鎖のＣ末端に隣接して荷電性アミノ酸残基を含む
アミノ酸配列が付加され、且つＣＨ１領域のＣ末端に隣
接してＬ鎖との結合に関与しないシステイン残基を含む
アミノ酸配列が形成された、等電点均一化Ｆａｂ’抗体
を得る第７の工程と、 前記第７の工程で得られた等電点均一化Ｆａｂ’抗体に
おけるＬ鎖との結合に関与しないシステイン残基に発蛍
光団色素を結合させる第８の工程と、 を含む方法により製造されたものである、請求の範囲第
１項記載の方法。
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PCT/JP2000/000903 WO2001061351A1 (fr) | 2000-02-17 | 2000-02-17 | Detection d'antigene par voie quantitative |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP3439195B2 true JP3439195B2 (ja) | 2003-08-25 |
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Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000620173A Expired - Fee Related JP3439195B2 (ja) | 2000-02-17 | 2000-02-17 | 抗原の定量的検出方法 |
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| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US7153701B1 (ja) |
| JP (1) | JP3439195B2 (ja) |
| WO (1) | WO2001061351A1 (ja) |
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|---|---|---|---|---|
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| GB8720833D0 (en) * | 1987-09-04 | 1987-10-14 | Celltech Ltd | Recombinant dna product |
| US5019521A (en) | 1990-03-12 | 1991-05-28 | Photest Diagnostics, Inc. | Paired polypeptides |
| US5348633A (en) * | 1993-01-22 | 1994-09-20 | Northeastern University | Method for quantitating trace amounts of an analyte in a sample by affinity capillary electrophoresis |
| US5630924A (en) * | 1995-04-20 | 1997-05-20 | Perseptive Biosystems, Inc. | Compositions, methods and apparatus for ultrafast electroseparation analysis |
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