JP3904238B2

JP3904238B2 - グリコシル化されたヒト化ｂ細胞特異的抗体

Info

Publication number: JP3904238B2
Application number: JP53358597A
Authority: JP
Inventors: リュン，シュイ―オン; ハンセン，ハンス; クー，ツェンシン
Original assignee: イムノメディクス，インコーポレイテッド
Priority date: 1996-03-20
Filing date: 1997-03-19
Publication date: 2007-04-11
Anticipated expiration: 2017-03-19
Also published as: US20030035800A1; EP0888125B1; EP0888125A1; WO1997034632A1; DE69729283T2; ATE267610T1; US6254868B1; US20040258682A1; AU705063B2; DE69729283D1; JP2000507818A; CA2249320A1; EP0888125A4; AU2531897A; CA2249320C

Description

発明の背景
本発明は、概して癌における診断および治療用の免疫複合体に関する。特に、本発明は組換えによって生成される、Ｂ細胞リンパ腫および白血病細胞に対するヒト化モノクローナル抗体に関しており、かかる抗体は、抗体結合および内在化（internalization）機能を失わずに、またヒト抗ネズミ抗体の産生を抑えて、診断あるいは治療試薬に共有結合することができる。
非ホジキン型リンパ腫（Non-Hodgkins lymphoma；ＮＨＬ）および慢性リンパ性白血病は、現在も癌の死亡率に大きく寄与し続けているＢ細胞の悪性疾患である。種々の形態の治療に対するこれらの悪性疾患の応答は多様である。化学療法には良く応答し、ＮＨＬの適切な臨床病期判定が可能な場合、限局性疾患の患者については、対象野放射線療法を用いて十分な治療を施すことができる（Hallら、Radiology for the Radilogist,Lippincott,Philadelphia、1989、365-376）。しかし、化学療法に関連する有害な副作用と局所ならびに全身放射線療法による造血系への毒性が、これらの治療方法の使用を制限している。患者の約半数が本疾患のために死亡している（Posnerら、Blood,61:705(1983)）。
放射性核種あるいは他の細胞毒性物質に複合したターゲティングモノクローナル抗体の使用は、そのような作用物質を直接腫瘍部位に供給送達し、それによって正常組織が毒性物質に接触するのを制限する可能性を提供する（Goldenberg,Semin.Nucl.Med.,19:333(1980)）。近年、抗体ベースの治療の潜在的可能性と腫瘍関連抗原の定位におけるその精度が、動物実験と臨床試験の両方で明らかにされた（例えば、Thorpe,TIBTECH,ll:42(1993);Goldenberg、Scientific American,Science ＆ Medicine,1:64(1994);Baldwinら.,米国特許第4,925,922号および第4,916,213号;Young,米国特許第4918163号;米国特許第5,204,095号;Irieら、米国特許第5,196,337号;Hellstromら、米国特許第5,134,075号および5,171,665号参照）。一般に、腫瘍関連マーカーに対する放射標識抗体あるいは抗体断片を腫瘍の位置確認のために使用することは、治療のための使用よりも成功を収めているが、これは一部には、腫瘍による抗体の摂取が概して低く、わずかに注入した全用量の０．０１％から０．００１％の範囲にとどまることによる（Vaughanら、Brit.J.Radiol.、60:567(1987)）。腫瘍への投与量を増やすために放射標識の濃度を上げることは、同時に健常組織の放射能への暴露も増大させることになるので一般には逆効果である。
ＬＬ２（ＥＰＢ２）は、極めて特異的な抗Ｂ細胞リンパ腫および抗リンパ性白血病細胞のネズミモノクローナル抗体（ｍＡｂ）であって、そのような細胞によって速やかに内在化され、前述した困難さの一部を克服することができる（Shihら、Int.J.Cancer、56:538(1994)）。ＩｇＧ２ａ抗体型であるＬＬ２は、ラジ（Raji）Ｂリンパ腫細胞系を抗原ソースとして用いて開発された（Pawlak-Byczkowskaら、Cancer Res.、49:4568(1989)）。ネズミＬＬ２（ｍＬＬ２）はＣＤ２２のエピトープと反応することが知られている（Belisleら、Proc.Amer.Assn.Clin.Res.、34:A2873(1993)）。ＣＤ２２分子は前駆細胞および初期プレＢ細胞の細胞質において発現され、成熟Ｂ細胞の細胞表面に現われる。
組織切片を免疫染色することにより、ｍＬＬ２が試験した５１のＢ細胞リンパ腫のうち５０と反応することが示された。ｍＬＬ２は、放射標識免疫検出法によって測定されたように（Murthyら、Eur.J.Nucl.Med.、19:394(1992)）、生体内で極めて感受性の高いＢ細胞リンパ腫細胞の検出手段を提供する。^99mＴｃで標識したｍＬＬ２のＦａｂ’断片は、Ｂ細胞リンパ腫患者での臨床フェイズＩＩ試験において６５の既知の病変のうち６３を定位した（Millsら、Proc.Amer.Assn.Cancer Res.、14:A2857(1993)）。さらに、¹³¹Ｉ標識ｍＬＬ２は、Ｂ細胞リンパ腫患者において治療上有効であった（Goldenbergら、J.Clin.Oncol.、9:548(1991)）。外毒素ＰＥ３８ＫＤＥＬに複合したｍＬＬ２Ｆａｂ’は、ヌードネズミにおいて成長する測定可能なヒトリンパ腫異種移植片（ＣＡ-４６）の完全な緩解を誘発した（Kreitmanら、Cancer Res.、53:819(1993)）。
ｍＬＬ２の臨床使用は、他のほとんどの有望なネズミ抗体と同様に、ヒトにおけるヒト抗ネズミ抗体応答（Human Anti Mouse Antibody response;ＨＡＭＡ）の発現によって制限されてきた。ＨＡＭＡ応答はｍＬＬ２の注入後常に認められるわけではないが、相当数の症例で患者はｍＬＬ２による単回治療後にＨＡＭＡを発現した。これは、潜在的なアナフィラキシーの問題だけではなく、循環複合体の大部分が循環抗ネズミ抗体によって複合体化され、分離されると考えられることから、そのような抗体複合体の診断および治療的有用性を制限しうる。このことは１つの試験によって例証されており、その試験では、患者の約３０％が約６ｍｇのｍＬＬ２ ¹³¹Ｉ-ＩｇＧの単回注射後に低レベルのＨＡＭＡ応答を発現し、追加注射によりほとんど全員が強いＨＡＭＡ応答を発現した。他方で、^99mＴｃで標識したｍＬＬ２Ｆａｂ’に関しては、ＨＡＭＡ応答を認めなかった。概してそのようなＨＡＭＡ応答は、ｍＬＬ２抗体の診断および治療上の潜在的可能性を十分に実現する上での潜在的な障害を課す。
上述したように、Ｆ（ａｂ’）²やＦａｂ’のようなｍＬＬ２断片の使用は、これらの免疫原性の問題を部分的に軽減／回避する。しかし、治療のために細胞免疫の誘発が意図される場合、あるいは生存期間の長い抗体が必要とされる場合のように、全ＩｇＧがより望ましい状況というのがある。
薬剤および放射性核種の供給送達賦形剤として機能するためのモノクローナル抗体にとっては、生じる免疫反応性の変動を最小限に抑えながら、それらの部位特異的な結合のための方法を開発することが最も重要である。通常、薬剤および放射性核種の複合は、アミノ酸残基の側鎖への共有結合を通して達成される。これらの残基の非部位制限的性格のゆえに、ＡＢＳの内部あるいはその付近に存在する残基への好ましくない連結を避けることが困難であり、そのような好ましくない連結は親和性の低下と異種抗原結合特性の低下を導く。その代わりとして、スルフヒドリル基における複合を指令することができる。しかし、直接標識はＳ-Ｓ結合の低下に依存しており、タンパク質切断の危険性を伴う。
米国特許出願番号第08／289,576号は、部位特異的な薬剤あるいはキレート結合のためのＬＬ２ＶＫ領域の１８〜２０位置のアミノ酸において認められる、天然に生じるＮ連結グリコシル化部位を持ったヒト化ｍＡｂを開示している。本引例は、参照することによりその開示全体を本明細書の一部とする。連結された炭水化物部分は、抗原結合部位（antigen binding site;ＡＢＳ）からは離れて位置し、物理的な接触を示さなかった。ＤＴＰＡのようなキレートが炭水化物に複合する時には、抗体の免疫反応性は影響を受けなかった。
しかし、この抗体の有用性には制限がある。ひとつは、免疫反応性が影響を受けずにどのような大きさと種類のキレートを連結することができるかが明らかではないということである。我々は、より大きなキレートの連結は結合親和性に影響を及ぼすことを認めた。例えば、ＬＬ２ＶＫ領域の１８〜２０位の炭水化物への１８ｋＤＤｏｘ-デキストランの連結は、免疫反応性を約５０％に低下させる。さらに、他の抗体を活性グリコシル化部位を含むように設計することは非常に有利であろう。グリコシル化配列が可変部に存在するように他の抗体を設計することは、各々の抗体について設計段階を繰り返す必要があるため、困難である。さらに、構築物の免疫反応性が影響を受ける可能性がある。
ＣＨ２Ｆｃ領域のＡｓｎ-２９７でのＩｇＧグリコシル化は、抗体の安定性の維持と正しいエフェクター機能のための適切な構造に重要なものとして十分に特徴づけられてきた。TaoとMorrison,J.Immunol.143:2595(1989)を参照。ＡＢＳからは遠位の免疫グロブリンのグリコシル化部位が限られて局在するため、モノクローナル抗体のオリゴ糖修飾を用いて複合体を調製した。チロシン含有ペプチドに連結した¹³¹Ｉ修飾複合体を、酸化したオリゴ糖に部位特異的に結合すると、チロシンで非選択的に修飾した複合体に比べてより大きなターゲティング効率を示した。Ａｓｎ-２９７連結炭水化物の使用は抗体のＦｃ部分の存在を必要とするので、その使用は限られている。Ｆｃ部分が存在しない抗体断片を用いたいくつかの適用がある。
発明の概要
本発明は、定常軽鎖領域である定常カッパ（ＣＫ）と定常重鎖（ＣＨ１）領域内にＮ結合グリコシル化部位を構築することによるアプローチに関する。これは次のような利点を持つ。
１．グリコシル化が、ＡＢＳを構成する可変領域から物理的により離れた異なる領域上で起こる。
２．ＣＫあるいはＣＨ１領域の微細構造に影響すると考えられるキレートあるいはさらに大きな基の多量の複合が、ＡＢＳを形成するＶＨとＶＫ領域に、もし影響するとしても、ごくわずかな影響しか及ぼさないことが予想される。
３．一部の臨床適用での好ましい形態である抗体断片はＣＨ１とＣＫ領域の両方を含み、複合部位は抗体断片（例えばＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）₂）における使用に適しているはずである。
４．基によって異なる抗体に導入しなければならない（例えば部位指定突然変異によって）ＶＫ付属のグリコシル化と異なり、炭水化物付加部位を含むＣＫあるいはＣＨ１領域は、ひとたび有効な複合ハンドルとして同定されれば、異なる抗原特異性を持った異なる可変領域に容易に連結することができる。
ＣＫあるいはＣＨ１領域にグリコシル化を持ち、抗原結合特異性を保持しているヒト化抗体を提供することが本発明の目的である。
治療あるいは診断様式を具備するグリコシル化ｍＡｂの複合体を提供することは本発明のもうひとつの目的である。
本発明のヒト化ｍＡｂを使用する治療および診断の方法を提供することは、本発明のさらにもうひとつの目的である。
これらの目的を達成するために、本発明のひとつの側面では、非Ｆｃ定常重鎖あるいは軽鎖領域にグリコシル化部位を含むように設計されたモノクローナル抗体あるいは抗体断片を提供した。好ましい具体例では、モノクローナル抗体あるいは抗体断片は、ヒト化抗体あるいは抗体断片である。もうひとつの好ましい具体例では、ヒト化特異的モノクローナル抗体はヒト化Ｂ細胞特異的抗体あるいは抗体断片である。さらにもうひとつの好ましい具体例では、グリコシル化は、図１２のＨＣＮ１、ＨＣＮ２、ＨＣＮ３、ＨＣＮ４、およびＨＣＮ５部位から成るグループから選択される部位に位置する。特に好ましい具体例では、グリコシル化部位は図１２のＨＣＮ５部位あるいはＨＣＮ１部位である。さらに好ましい具体例では、グリコシル化部位を含むように設計される抗体は、ｈＬＬ２抗体の特異性を有する抗体である。
本発明のもうひとつの側面では、ＣＨ１領域内に配列を有する抗体重鎖遺伝子を含む分離したＤＮＡ分子を提供する。かかるＤＮＡ分子は、前記の遺伝子がグリコシル化を支持する細胞において抗体重鎖に対する第二の遺伝子と同時発現される時、ＣＨ１領域でグリコシル化された抗体を生成する。
さらなる側面では、定常領域内に配列を有する抗体軽鎖遺伝子を含む分離したＤＮＡ分子を提供する。かかるＤＮＡ分子は、前記の遺伝子がグリコシル化を支持する細胞において抗体重鎖に対する第二の遺伝子と同時発現されるとき、定常Ｋ領域でグリコシル化された抗体を生成する。
本発明のさらにもうひとつの側面では、定常Ｋおよび／あるいはＣＨ１領域でグリコシル化された抗体あるいは抗体断片を生成する方法を提供する。かかる方法は、軽鎖および重鎖遺伝子あるいはその一部を同時発現し、グリコシル化を可能にする細胞において、前記の重鎖遺伝子あるいはその一部の定常Ｋ領域あるいはＣＨ１領域内にグリコシル化部位を作りだし、定常Ｋおよび／あるいはＣＨ１領域でグリコシル化された抗体あるいは抗体断片を生成するように突然変異によって前記の軽鎖および重鎖遺伝子を構築して、その抗体あるいは抗体断片を分離することを含む。
本発明のさらにもうひとつの側面では、モノクローナル抗体あるいは抗体断片を使用して特異性抗原を標的とし、かかる抗体あるいは抗体断片をそのままであるいは診断または治療薬剤と複合して使用する、患者の診断あるいは治療の方法、ならびに前記の抗体あるいは断片が、非Ｆｃ定常重鎖あるいは軽鎖領域内にグリコシル化部位を含むように構築されたヒト化モノクローナル抗体あるいは抗体断片である改良を提供した。好ましい具体例では、抗体あるいは抗体断片はＢ細胞特異的抗体あるいは抗体断片である。
図の簡単な説明
図１は、ネズミとヒトのＬＬ２ＶＫ（図１Ａ）とＶＨ（図１Ｂ）領域の比較を示す。ｍＦＲ配列（ネズミと称する）と異なるｈＦＲ配列（ＲＥＩＨｕＶＫおよびＥＵＨｕＶＨと称する）だけを示しており、星印で表わしている。ＣＤＲを枠で囲っている。ＣＤＲに接するようにコンピュータモデリングによって示したＦＲ残基には下線を付している。
図２は、ＬＬ２ＣＤＲのフレームワーク領域（ＦＲ）との近接関係を示す。ｍＬＬ２のＶＬおよびＶＨ領域についてのエネルギー最小モデルを別途に構築し、半径４．５Å以内のすべてのＦＲ残基あるいはＣＤＲ原子を潜在的なＣＤＲ-ＦＲ接触として同定した。軽鎖（Ｌ１、Ｌ２およびＬ３、図２Ａ）と重鎖（Ｈ１、Ｈ２およびＨ３、図２Ｂ）のＣＤＲを、各々の空間を埋めるＦＲの上に重ねた「ボールとスティック」の表現で示している。
図３Ａは軽鎖のステージングベクター（ＶＫｐＢＲ）と哺乳類の発現ベクター（ｐＫＨ）を示し、図３Ｂは重鎖のステージングベクター（ＶＨｐＢＳ）と哺乳類の発現ベクター（ｐＧ１ｇ）を示す。
図４は、ＬＬ２ＶＫ領域（図４Ａ）とＬＬ２ＶＨ領域（図４Ｂ）の二本鎖ＤＮＡとアミノ酸配列を示す。対応するＤＮＡ配列によってコードされるアミノ酸配列を一文字のコードとして示している。ＣＤＲのアミノ酸配列を枠で囲んでいる。ＬＬ２ＶＫ（図４Ａ）のＦＲ１に位置するＡｓｎ-グリコシル化部位を、下線を付したＮＶＴ配列として示している。
図５Ａは、ｈＬＬ２ＶＫ領域の二本鎖ＤＮＡと対応するアミノ酸残基を示す。ＣＤＲアミノ酸配列を枠で囲んでいる。ＶＨ領域についての対応するデータを図５Ｂに示す。
図６は、ヒト化ＶＨ領域のＰＣＲ／遺伝子合成と、ステージングベクター、ＶＨｐＢＳへのサブクローニングを概要一覧図として表わしたものである。
図７は、ｍＬＬ２と、トレーサー放射標識ｍＬＬ２に対する細胞結合に競合するｃＬＬ２抗体を含む、比較ラジ細胞競合抗体結合アッセイの結果を示す。
図８は、混合ヒト化／キメラＬＬ２をｃＬＬ２と比較した（図８Ａ）、およびｈＬＬ２の２つのバージョンをｃＬＬ２と比較した（図８Ｂ）、比較ラジ細胞競合抗体結合アッセイの結果を示す。
図９は、抗体内在化の比較を示す。すなわち、ｃＬＬ２、ｃＬＬ２（ＱからＶへの突然変異）、ｈＬＬ２およびｍＬＬ２抗体についての時間の関数としての表面結合率である。
図１０は、ｍＬＬ２の脱グリコシル化がラジ細胞への結合親和性に及ぼす影響を示す。
図１１は、ペルオキシダーゼ複合ｍＬＬ２のＷＮへの結合を測定した競合結合アッセイを示す。ｈＬＬ２と重鎖定常領域におけるグリコシル化誘導体を表示された濃度で使用してｍＬＬ２と競合させた。
図１２は、ｈＬＬ２のＣＨ₁とＣ_K領域に導入されたＮ-グリカンアクセプター配列と位置を示す。部位指定突然変異を用いてトリペプチドアクセプター配列（太い文字で示されている）を生成した。ｈＬＬ２のＣＨ１（Ｈ鎖）とＣＫ（Ｋ鎖）領域の部分的ペプチド配列が示されており、構築した潜在的Ｎ連結グリコシル化部位（ＨＣＮ１〜ＨＣＮ５とＫＣＮ１〜ＫＣＮ４）の位置を示す配列および構造相同性に従って並んでいる。β鎖配列（Ｃ-Ｆ）を枠で囲んでいる。残基をＫａｂａｔのシステムに従って番号付けした。星印（＊）は、その前のアミノ酸配列とは不連続に番号付けされた、これらの重鎖アミノ酸残基を示す。＊によって示されたａａ残基は、左から右に、各々１５６、１６２、１７１、１８２、２０３および２０５と番号付けされている。
好ましい具体例の詳細な説明
ＣＫおよびＣＨ１免疫グロブリン領域内にグリコシル化部位を構築し、ヒト免疫グロブリンに構築されたグリコシル化部位を与える。部位指定突然変異を用いて、重鎖および軽鎖の定常領域、特にＣＫとＣＨ１領域内にグリコシル化部位を構築する。次に、突然変異を生じたＣＫとＣＨ１ヌクレオチド配列を、各々軽鎖および重鎖の発現ベクターにサブクローニングする。ＣＨ１変異重鎖発現ベクターを軽鎖発現ベクターと同時発現させ、ＣＨ１領域に変化したグリコシル化部位を持つ突然変異ヒト抗体を生成する。同様の手順に従って、ＣＫ領域に変化したグリコシル化部位を持つ突然変異ヒト抗体を生成する。
必ずしもすべての潜在的炭水化物付加配列がオリゴ糖連結に使用できるわけではないことに留意しなければならない。各々抗デキストランおよび抗ダンシル抗体の重鎖相補性決定領域２（ＣＤＲ２）の領域に新規のＮ結合グリコシル化配列を導入することにより、一連のグリコシル化突然変異体を生成した。抗デキストラン抗体のＡｓｎ５４とＡｓｎ６０でグリコシル化が認められたが、抗ダンシル抗体の同様の位置（Ａｓｎ５５）にある炭水化物付加部位は使用されなかった。この「位置効果」はよく理解されていないが、タンパク質の立体配座とグリコリルトランスフェラーゼに対する炭水化物アクセプター配列の接触性に関係すると考えられる。
この明細書においては、「ｈＬＬ２」あるいは「ｈＬＬ２ｍＡｂ」の表現は、ネズミＶＫおよびＶＨ領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）をヒトフレームワーク領域（ＦＲ）に連結するかあるいはサブクローニングして、これらを各々ヒト定常軽鎖および重鎖に連結するかあるいはサブクローニングすることによって構築されたモノクローナル抗体を指すことが意図されている。
製薬学的に許容される賦形剤中に製剤された（例えば、Remington's Phamaceutical Sciences,18th ed.,Mack Publishing Co.,Easton,PA,1990参照）、本発明の突然変異抗体と診断あるいは化学療法試薬との共有複合体を調製することができる。ヒト化ｍＡｂを生じる、診断あるいは治療試薬に複合されたグリコシル化ＣＫおよびＣＨ１領域を含むＢ細胞リンパ腫および白血病特異的抗体は、標的細胞内に内在化され、速やかに細胞内で診断あるいは化学療法試薬を遊離する（それによって試薬の有効性を増大させる）能力と、ヒト患者におけるＨＡＭＡ応答の低下という追加的利点を持ち続ける。
構築された本発明の抗体の炭水化物部分は抗原の結合に関与しないので、試薬が炭水化物部分を通して抗体に複合している複合体を使用することができる。例えば、試薬を酸化炭水化物誘導体に複合することができる。そのような複合体の生成のための方法と、診断および治療におけるそれらの使用は、例えば、Ｓｈｉｈら、米国特許第5,057,313号、Shihら、Int.J.Cancer 41:832(1988)、および同時係属、共同所有のHansenら、米国特許出願番号第08／162,912号に述べられており、その内容は参照することにより本明細書の一部とする。ポリマー担体を使用しない、酸化炭水化物への試薬の直接連結が、ＭｃＫｅａｒｎら、米国特許第５，１５６，８４０号の中で述べられており、これも参照することにより本明細書の一部とする。
多様な診断および治療試薬を本発明の抗体に好都合に複合することができる。これらは次のものを含む。ドキソルビシン、メトトレキセート、タキソール等のような化学療法剤、蛍光分子のような検出可能な標識あるいは重金属または放射性核種のような細胞毒性物質が複合することのできる、ＤＴＰＡのようなキレーター、ならびにシュードモナス細菌外毒素のような毒素等。これらの複合体のいくつかの具体例を以下の実施例において述べる。
追加的あるいは代替的なグリコシル化部位（ＮＸＴ／Ｓ）をデザインし、本発明に従った抗体、例えばｈＬＬ２のＶＫ、ＣＫおよびＣＨ領域内に導入することができる（ここではＸはプロリンあるいはアスパラギン酸以外のアミノ酸を表わす）。有用なグリコシル化部位を調べるために、実験動物における生体内での結合特異性、生体内分布、ならびに薬剤およびキレートの複合効率へのグリコシル化部分の影響を検定することができる。可能性の高いグリコシル化部位は、異なる種あるいはアイソタイプの既知のＡｂからのグリコシル化部位との比較、接触位置を同定するためのコンピュータモデリングによるヒトＣＫおよびＣＨ１領域の既知の構造の分析、あるいは任意のショットガン突然変異によって同定しうる。
本発明において使用する細胞系および培地は、ＬＬ２（ＥＰＢ-２）ハイブリドーマ細胞（Pawlak-Byczkowskaら、1989、前出）、Ｓｐ２／０-Ａｇ１２骨髄腫細胞（ATCC,Rockville,ＭＤ）およびラジ細胞を含む。これらの細胞は、好ましくは１０％ＦＣＳ（Gibco／BRL,Gaithersburg,MA）、２ｍＭＬ-グルタミンおよび７５μｇ／ｍｌのゲンタマイシンを補足した（完全ＤＭＥＭ）ダルベッコ修正イーグル培地（ＤＭＥＭ）において培養する。形質転換体を、１０％ＦＣＳと７５μｇ／ｍｌのゲンタマイシンを含む（完全ＨＳＦＭ）ハイブリドーマ血清不含培地、ＨＳＦＭ（Gibco／BRL,Gaithersburg,MA）において、あるいは指示がある場合には、抗生物質だけを含むＨＳＦＭにおいて増殖させる。トランスフェクトーマの選択は、５００μｇ／ｍｌのヒグロマイシン（Calbiochem,San Diego,CA）を含む完全ＨＳＦＭにおいて実施しうる。すべての細胞系を、好ましくは５％ＣＯ₂中で３７℃に保持する。
ＣＨ１およびＣＫにおけるグリコシル化部位の配置
本発明のひとつの重要な側面は、抗体の立体配座がコンピュータモデリングによって設計できることであり（例えば、Goldenbergら編集のCancer Therapy With Radiolabelled Antibodiesの中のDion,CRC Press,Boca Raton,FL,1994参照）、前記の文献は参照することにより本明細書の一部とする。一般に、三次元構造は相同性によって最も良好に配置され、これは、Protein Data Bank（PDRコード1REI,Bernsteinら、J.Mol.Biol.112:535(1977)）からの結晶構造解析データが入手可能であることによって容易になる。本文献は、参照することにより本明細書の一部とする。同様に、抗体ＥＵ（ＶＨ）配列（Kabatら、SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST,第5版、US Dept.of Health and Human Services,US Gov.Printing Office(1991)）は、ｍＬＬ２重鎖のＦＲ１〜ＦＲ３についてのモデリングの対照物として選択することができる。ＦＲ４はＨＥＷＭ．Ｉｄ．に基づいた。ＥＵ配列に関して現在Ｘ線座標データが欠如しているので、ＦＲ１〜４についてのＮＥＷＭ構造データ（ＰＤＲコード３ＦＡＢ）が使用でき、アミノ酸側基を必要に応じてｍＬＬ２あるいはＥＵ（ｈＬＬ２）に対応するように置き換えることができる。軽鎖のＣＤＲは、１ＭＣＰＰｒｏｔｅｉｎＤａｔａＢａｎｋ（Ｌ１およびＬ２）と１ＲＥＩ（Ｌ３）の対応する配列から設計することができる。重鎖ＣＤＲについては、Ｈ１とＨ２は各々２ＨＦＬＰｒｏｔｅｉｎＤａｔａＢａｎｋおよび１ＭＣＰに基づくが、Ｈ３は新規に設計することができる。可能な場合にはいつでも、側基の置換はＣαとＣβの間の回転角度を維持するように実施しなければならない。エネルギーの最小化は、収束法を用いてＡＭＢＥＲフォースフィールド（Weinerら、J.Amer.Chem.Soc.106:765(1984)）によって達成することができる。潜在的に極めて重要なＦＲ-ＣＤＲ相互作用は、最初にｍＬＬ２の可変軽鎖と可変重鎖を設計することによって測定することができる。ＣＤＲ内の全原子の４．５Åの範囲内のすべてのＦＲ残基をそれによって同定し、ｈＬＬ２の最終デザインモデルに保持することができる。
ｈＬＬ２のＦａｂ断片の相同分子モデルを、ヒト化抗ｐ１８５ｈｅｒ２抗体断片（１ＦＶＤ）のＸ線構造を主要な鋳型として用いるＱＵＡＮＴＡタンパク質モデリングパッケージによって創造した。Carterら、Proc.Natl.Acad.Sci.89:4285(1992);Eizenbrotら、J.Mol.Biol.229:969(1993)を参照のこと。２つの抗体の配列同一性は約８０％である。挿入領域は、使用可能なタンパク質データライブラリーを検索することによって配置した。すべての座標を作成し、連結領域を調整した後、一連のエネルギー最小化をモデルに適用した。これは、側鎖原子だけのための１００段階の最急勾配下降（Steepest descent）（ＳＤ）および複合勾配（Conjugeted Gradient）（ＣＧ）ＥＭ、次にＣα原子を除くすべての原子のための１００段階ＳＤおよびＣＧＥＭ、そして最後にすべての原子のための１００段階ＳＤおよびＥＭを含む。静電相互作用のために距離関連誘電定数、４ｒ（ｒはÅでの原子-原子間距離である）を使用した。１ＦＶＤとｈＬＬ２間の等しい主鎖および側鎖原子についての原子位置のＲＭＳは、各々１．４６Åと２．１１Åであった。次にｈＬＬ２に点突然変異を適用して突然変異抗体のモデル、ｈＬＬ２ＨＣＮ１とｈＬＬ２ＨＣＮ５を生成した。炭水化物の配列決定から明らかにされた組成および構造と同じプログラムを用いて、複合体型オリゴ糖を設計した。
生成された各々のオリゴ糖鎖を、ＡｓｎのＮ０に重なる末端ＧｌｃＮａｃの０１およびＡｓｎのＮｄ-Ｈ結合のひとつと共に並ぶＧｌｃＮａｃの０１Ｃ１結合により、対応するＮ連結グリコシル化部位に固定した。続いて、連結したオリゴ糖鎖の立体配座を最長鎖がｈＬＬ２の重鎖の可変領域近くになるように操作した。各々の調整後、１００段階ＳＤおよびＣＧＥＭを固定したアンカー原子とｈＬＬ２原子と共に糖原子に適用した。
ＣＫおよびＣＨ１グリコシル化部位についてのデザインは次の原理に基づく：
１．ＮＸＳ／Ｔ配列を持つ炭水化物付加部位を選択した。Ｘはプロリンおよびアスパラギン酸以外のアミノ酸である。可能な場合にもいつでも、領域構造の変動を最小限にとどめるため、選択した位置に潜在的グリコシル化部位を据え付ける際には単一のアミノ酸だけを変更するように努めた。
２．潜在的なＣＫあるいはＣＨ１結合グリコシル化部位は、異なる種あるいはアイソタイプの既知の抗体配列から同定することができる。
３．潜在的Ａｓｎ-グリコシル化部位を据え付けることができる接触位置を同定するための、コンピュータモデリングによるヒトＣＫおよびＣＨ１領域の既知構造の分析。
コンピュータモデリング試験に基づくと、ＶＫ付属のオリゴ糖とＣＤＲ間の最短アプローチ距離は２０Åと推定された。４．１Å以上の距離では相互作用がないと考えられる。従って、抗原結合部位から４．１Åあるいはそれ以上離れたグリコシル化部位が、抗体断片の結合部位として使用するための候補であると考えられる。可能な場合にはいつでも、ＣＨ１およびＣＫ領域に導入された突然変異は、タンパク質領域の最終的な三次構造を維持するように、実際上保存的である。保存的突然変異は、一般に同様の大きさと臨床特性による相互置換を含む。特に、所望する配列はＮＸＴ／Ｓである。例えば、最初の配列中のグルタミン（Ｑ）をアスパラギン（Ｎ）で置き換えることは保存的置換とみなされるであろう。このように、発明の対象となるグリコシル化部位を生じるように様々なＣＨ１およびＣＫ領域の突然変異をデザインすることができる。
接触部位だけがグリコシル化される可能性を持つことになる。それ故、潜在的に好ましい位置である追加的部位を定位するのを助けるためコンピュータモデリングを用いた。グリコシル化部位ＨＣＮ５は、ＡＢ５からさらに離れて、表面の位置にあると予測された。ＨＣＮ５部位はＥとＦスタンドの間に形成されるボトムループに位置している。Ｃ_KおよびＣＨ₁領域の配列に沿って平らに広がる他の部位を無作為に選択した。すべての場合に、潜在的なグリコシル化部位となるために単一アミノ酸の置換だけしか必要としない配列を慎重に選択して、最終的三次構造に与える可能性のある変動を最小限に抑えた。合計５つのＣＨ₁（ＨＣＮ１〜５）と４つのＣ_K（ＫＣＮ１〜４）付属部位を各々ＣＨ₁とＣ_K領域に導入した。コンピューターモデリング分析によって確認されたように、これらの部位のうちで「埋もれた」あるいは２つの並列領域間の界面に位置するものはないと思われた。
Ｎグリコシル化は単に一例として述べたものである。当該原理はＯグリコシル化にも等しく適用できる。当業者はモデリングの適用、グリコシル化部位のデザイン、ならびにＰグリコシル化を可能にする定常Ｋ、ＣＨおよびＶＫ領域の変化を容易に理解するであろう。Ｏグリコシル化はトレオニンあるいはセリンのいずれかで起こることが知られている。Ｏ連結グリコシル化のためのアクセプター配列はあまり十分には定義されていない（Wilosonら、Biochem.J.275:526(1991)）。これらの領域のプロリン、セリンおよびトレオニンの含量が高い場合にはバイアスが生じることがあるが、正確な一次配列よりはむしろアクセシビリティーが、特定のトレオニンあるいはセリンがＯグリコシル化されるかどうかを決定する。それにもかかわらず、Ｏグリコシル化を有することが知られている他の抗体で同定されたもののように（Chandrashekarkanら、J.Biol.Chem.259:1549(1981);SmythとUtsumi,Nature 216:322(1967);Kimら、J.Biol.Chem.269:12345(1994)）、潜在的Ｏグリコシル化配列は、当該抗体中の異なる位置に植え付けるための標準配列として使用することができる。広汎なＯグリコシル化を含むことが確認されたものは、結合部位として検討することができる。
本発明のもうひとつの重要な側面は、ひとたび１つのグリコシル化部位が同定されれば、他の潜在的グリコシル化部位のその後の同定が容易になることである。これは２つの現象による。ひとつは、グリコシル化の成功は、関連領域を確認し、モデリングをさらに改善するのを助ける。第二に、定常ＫおよびＣＨ１領域はかなりの対称性を示すことが理解されている。従って、グリコシル化が起こる部位、例えばＣＨ１の同定は、相当するＣＫの位置が適切なグリコシル化部位であろうという期待を導く。
軽鎖突然変異。潜在的Ｎ連結グリコシル化配列を、ウサギ抗体のカッパ定常領域において１６１〜１６３と１７４〜１７６のアミノ酸位置と同定した。同様の部位をｈＬＬ２のＣＫ領域に導入することができる。例として図１２参照。
重鎖突然変異。ＣＨ１において、炭水化物付加配列、Ａｓｎ-Ａｓｎ-Ｓｅｒを、ヒトＩｇＭＣＨ１領域の一部で１６１-１６３のアミノ酸位置と同定した（Kabatの番号付け;Kabatら、1991）。同様に、配列Ａｓｎ-Ｖａｌ-Ｔｈｒは、ヒトＩｇＡのＣＨ１領域における１６８〜１７０のアミノ酸位置と同定した。グリコシル化部位の変更を生じさせるための修飾することができる配列の例は次の通りである：ヒトＩｇＧ１配列のＡｓｎ-Ｓｅｒ-Ｇｌｙを１６２〜１６４のアミノ酸位置でＡｓｎ-Ｓｅｒ-Ｖａｌに、Ａｌａ-Ｌｅｕ-Ｔｈｒを１６５〜１６７のアミノ酸位置でＡｓｎ-Ｌｅｕ-Ｔｈｒに、そしてＬｅｕ-Ｔｈｒ-Ｓｅｒを１６６〜１６８の位置でＡｓｎ-Ｔｈｒ-Ｓｅｒにそれぞれ突然変異させる。これらの３つの潜在的Ｎ結合グリコシル化部位は、ＩｇＭおよびＩｇＡのものと類似しており、生じる構造への干渉が極めて小さいという期待を持ってヒトＩｇＧ１のＣＨ１領域に導入することができる。そのようなグリコシル化部位は、従って、「天然の」位置のままである場合もある。同様の突然変異のデザインは、本明細書の教授するところに基づいて、十分に当業者の技術範囲内である。
部位特定突然変異導入法
オリゴヌクレオチド特定突然変異導入法についての詳細なプロトコールおよびクローン化ＤＮＡの突然変異導入法についての関連技術は、よく知られている。例えば、Sambrookら上述文献およびAusubelらの上述文献を参照のこと。
Ａｓｎ結合グリコシル化部位は、常套の部位特定オリゴヌクレオチド突然変異導入反応を用いて、抗原に導入されうる。例えば、Ａｓｎをカッパタンパク質の１８位に導入するために、コドン１８をＡＧＧからＡＡＣに変更できる。これを達成するために、抗体軽鎖配列を含む一本鎖ＤＮＡテンプレートは、チミジンの代わりに少量のウラシルを含有するＤＮＡ分子を得るために、大腸菌の適切な株（例えば、ｄｕｔ^-ｕｎｇ⁺）から製造される。このようなＤＮＡテンプレートは、Ｍ１３クローニングによるか、またはＳＰ６プロモーターを用いた生体外転写によって得ることができる。例えば、Ausubelら編、CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY、John Wiley ＆ Sons、ニューヨーク、(1987)を参照のこと。突然変異配列を包含する一本鎖ＤＮＡに相補的なオリゴヌクレオチドを、通常に合成し、一本鎖テンプレートにアニールし、そして生成物をＴ４ＤＮＡポリメラーゼおよびＴ４ＤＮＡリガーゼで処理して、二本鎖ＤＮＡ分子を生成する。二本鎖ＤＮＡで野生型大腸菌（ｄｕｔ⁺ｕｎｇ⁺）細胞を形質転換（トランスフォーメーション）すると、突然変異ＤＮＡが回収される。
代わりに、Ａｓｎ連結グリコシル化部位は、所望の突然変異を含有するオリゴヌクレオチドを用いて、抗体軽鎖に導入し、ＰＣＲによってオリゴヌクレオチドを任意に増幅すること、およびそれをＶＬ鎖のための可変部にクローニングすること、または目的の抗体をテンプレートとして生成する細胞から得たＲＮＡを用いることによって、導入することができる。さらに、（Huse ANTIBODY ENGINEERING:A PRACTICAL GUIDE、Boerrebaeck編、W.H.Freeman ＆ Co.、103−120、(1992)の参照のこと）。部位特定突然変異導入法は、例えば、製造業者の指示にしたがってＴＲＡＮＳＦＯＲＭＥＲ_TMキット（Clontech、Palo Alto,CA）を用いて行うことができる。
代わりに、グリコシル化部位は、オリゴヌクレオチドを相互にプライミングしながら抗体鎖を合成することによって導入でき、このようなものは、所望の突然変異を含む。例えば、（Uhlmann、Gene 71:29(1988);Wosnickら、Gene 60:115(1988);Ausubelら、上述参照）。これらは、参照することにより本明細書の一部とする。
上述の説明は、抗体の軽鎖の１８位置でＡｓｎグリコシル化部位を導入することに言及するが、軽鎖で、または重鎖の可変部で、または定常部のいずれかで、Ａｓｎ連結グリコシル化部位を導入することが可能であることは、習熟した技師には思い浮かぶ。
その部位がネズミの対照物でグリコシル化される場合、グリコシル化部位の存在またはそのような部位の不在は、抗体の結合親和性または特異性に影響するかもしれないし、しないかもしれない。したがって、グリコシル化部位は、上述の方法によって導入または除去できるが、活性についてのそれらの衝撃は測定する必要がある。上で論じられた理由により、ＣＨ１またはＣＫ領域でグリコシル化部位を遺伝子操作することが好まれる。
ＲＮＡ単離、ｃＤＮＡ合成および増幅についての一般的技術
ＲＮＡ単離、ｃＤＮＡ合成および増幅は、以下のとおり行うことができる。全細胞ＲＮＡは、Sambrookら、（Molecular Cloning:A Laboratory Manual）、第2版、Cold Spring Harbor Press、1989）にしたがって、総数約１０⁷細胞を用いて、ＬＬ２ハイブリドーマ細胞系列から製造できる。この文献は、参照することによって本明細書の一部とする。第一鎖ｃＤＮＡは、Super Script予備増幅系（Gibco／BRL.、Gaithersburg、MD）を用いることのように常套により全ＲＮＡから逆転写できる。簡単には、２μｌの１０×合成緩衝液［２００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．４）、５００ｍＭＫＣｌ、２５ｍＭＭｇＣｌ₂、１ｍｇ／ｍｌＢＳＡ］、１μｌの１０ｍＭｄＮＴＰミックス、２μｌの０．１ＭＤＴＴ、および２００単位のＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ逆転写酵素の存在下で、２０μｌの反応液量で、５０ｎｇのランダムプライマーを５μｇのＲＮＡにアニールできる。延長段階は、最初に室温で１０分間行い、続いて４２℃で５０分間インキュベートさせる。反応は、反応混合物を９０℃で５分間加熱することによって終了できる。
ＶＬおよびＶＨ領域中の遺伝子操作されたグリコシル化部位で抗体を構築すること
ｍＬＬ２ｍＡｂのＶＬおよびＶＨ領域をコードするｃＤＮＡを単離し、そしてヒト抗体のそれぞれ、カッパおよびＩｇＧ₁定常部をコードする遺伝子を含む哺乳類発現ベクターに組換えでサブクローニングした。これらの２つの組換えＤＮＡと哺乳類細胞との同時トランスフェクションが、親株ｍＬＬ２ｍＡｂと同様に、それに食欲に結合したｃＬＬ２ｍＡｂを発現させ、そしてＢリンパ腫細胞にすぐに取込まれた。
同様に、ＶＫおよびＶＨのＤＮＡｓのＣＤＲｓは、それぞれ、ヒトのＶＫおよびＶＨ領域のフレームワーク（ＦＲ）配列に組換えで連結され、続いて、それぞれヒト・カッパおよびＩｇＧ₁定常部に連結され、そして哺乳類細胞でｈＬＬ２を発現した。
ｈＬＬ２のＶＫおよびＶＨドメインについての配列がいったん設計されると、長鎖合成ＤＮＡオリゴヌクレオチドをテンプレートとして使用した遺伝子合成により、そして短鎖オリゴヌクレオチドをプライマーとして使用したＰＣＲによって長鎖オリゴヌクレオチドを増幅するによって、ＣＤＲ移植は達成される。ほとんどの場合、ＶＫまたはＶＨドメインをコードするＤＮＡは、およそ３５０塩基対（ｂｐ）長である。コドン縮重の利点を利用することによって、コードしたアミノ酸を変えることなく、Ｖ遺伝子ＤＮＡ配列の中央に近い領域に、特異的制限部位を容易に導入できる。例えば、当初に設計されたアミノ酸配列を維持しながら、ｈＬＬ２のＶＨドメインについてのＤＮＡヌクレオチド位置１５７〜１６２（アミノ酸位置５３および５４）に、特異的ＡｖｒＩＩ部位を導入できる（図４Ｂ）。ＡｖｒＩＩ部位の上流および下流の２つの長鎖のオーバーラップのない、一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド（−１５０ｂｐ）（例えば、以下の実施例３のオリゴＡおよびオリゴＢｉｎ）は、自動化ＤＮＡオリゴヌクレオチド合成機Cyclone Plus DNA Synthesizer,Milligen-Biosearch）によって製造できる。オリゴＡおよびオリゴＢのような全長ＤＮＡオリゴヌクレオチドの収量は、低いと予測されうる。しかし、それらは、ＰＣＲ反応で２対のブランキング・オリゴヌクレオチドによって増幅できる。次のサブクローニングを促進するのに必要な制限部位を有するプライマーを設計できる。オリゴＡおよびオリゴＢのためのプライマーは、ＡｖｒＩＩ部位にオーバーラップ配列を含み、そのためオリゴＡおよびＢについて生じたＰＣＲ産物は、それぞれ、ＡｖｒＩＩ部位で枠内に連結して、ｈＬＬ２ＶＨドメインをコードする全長ＤＮＡ配列（約３５０ｂｐ）を形成する。ＡｖｒＩＩ部位でのオリゴＡ（ＰｓｔＩとＡｖｒＩＩで制限的に消化された）およびＢ（ＡｖｒＩＩとＢｓｔＥＩＩで制限的に消化された）についてのＰＣＲ産物のライゲーションおよびそれらをステージング・ベクターＶＨｐＢＳのＰｓｔＩＩ／ＢｓｔＥＩＩ部位にサブクローニングするのは、一回の３断片ライゲーション段階で完了できる。実施例３を参照のこと。ＶＨｐＢＳに正しい配列をサブクローニングすることは、制限消化分析によって最初に分析でき、そして続いて、SangerらのProc.Natl.Acad.Sci.USA74:5463(1977)によるシークエンス反応によって確認できる。
Ｉｇプロモーター、リーダー配列およびｈＬＬ２ＶＨ配列を含むＨｉｎｄＩＩＩ／ＢａｍＨＩ断片は、ステージング・ベクターから切除し、そしてヒトＩｇＧ定常部のゲノム配列、Ｉｇエンハンサーおよびｇｐｔ選択マーカーを含むｐＳＶｇｐｔ基礎ベクターｐＧ１ｇ中の対応の部位にサブクローニングでき、その結果最終発現ベクターｈＬＬ２ｐＧ１ｇを形成する。ｈＬＬ２ＶＫ配列を構築するのに同様のストラテジーが使用できる。長鎖オリゴヌクレオチド（オリゴＣおよびＤ、以下の実施例参照）についてのＰＣＲ産物のライゲーションのために選択される制限部位は、この場合にはＮｒｕＩである可能性がある。
Ｉｇプロモーター、リーダー配列およびｈＬＬ２ＶＫ配列を含むＤＮＡ配列は、ＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで処理することによってステージング・ベクターから外に出すことができ、ヒト・カッパ鎖定常部のゲノム配列、ヒグロマイシン選択マーカー、Ｉｇおよびカッパ・エンハンサーを含むｐＳＶｈｙｇ基礎ベクターｐＫｈの対応部位にサブクローニングして、最終発現ベクターｈＬＬ２ｐＫｈを形成できる。
ヒト化は、しばしば抗体親和性を制限または消失さえする。したがって、初原の親和性を回復するために、さらなる修飾が必要とされるかもしれない。例えば、Tempestら、Bio/Technology 9:266(1991);Verhoeyenら、Science 239:1534(1988)を参照。これらの文献は参照することにより本明細書の一部とする。ｃＬＬ２が、そのネズミの対照物（以下の実施例５を参照のこと）のものと比較できる結合親和性を示すことを知ることで、もしあれば、ｈＬＬ２の当初のバージョンでの欠損のある設計物は、軽鎖および重鎖のｃＬＬ２をヒト化バージョンのものと混合し合せることによって同定できる。非還元下（ジスルフィドＬ−Ｈ鎖連結は無傷のままである）および還元条件（鎖は分離する）で、様々のミックス・アンド・マッチのヒト化キメラＬＬ２のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、分子の特性について、様々なタイプの軽鎖および重鎖の関係の分析を可能にする。例えば、複数のバンドである場合、または見掛けの分子サイズより高い場合の移動は、ＬＬ２のネズミのＶＫドメインのＦＲ１領域に見られるＮ連結グリコシル化部位にグリカン基が存在するためである可能性がある。約２５ｋＤａに移動する別個のバンドは、非グリコシル化軽鎖についての分子サイズと予測される。
一般に、ｃＬＬ２ｍＡｂを製造するために、ＤＮＡ産物およびプライマーを用いたＰＣＲクローニングによって、ｍＬＬ２のＶＨおよびＶＫ鎖を得ることができる。Ｏｒｌａｎｄｉら、ｉｎｆｒａ、およびＬｅｕｎｇら、ｉｎｆｒａ。ＶＫＰＲＣプライマーを、上述のとおり、ｐＢＲ３２７基礎のステージング・ベクター（ＶＫｐＢＲ）にサブクローニングしてもよい。ＶＨ・ＰＣＲ産物は、上述のとおり、同様のｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ基礎ステージングベクター（ＶＨｐＢＳ）にサブクローニングしてもよい。ＶＫおよびＶＨ配列を、プロモーターおよびシグナルペプチド配列と一緒に含む断片は、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩ制限エンドヌクレアーゼを用いてステージングベクターから切り取られる。約６００ｂｐであるＶＫ断片は、例えば常套の方法によって、哺乳類発現ベクターｐＫｈにサブクローニングできる。ｐＫｈは、ヒトのカッパ定常部のゲノム配列、Ｉｇエンハンサー、カッパ・エンハンサーおよびヒグロマイシン耐性遺伝子を含むｐＳＶｈｙｇ基礎発現ベクターである。同様に、約８００ｂｐのＨＶ断片は、ヒトのＩｇＧ１定常部のゲノム配列、Ｉｇエンハンサーおよびキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｇｐｔ）遺伝子を担持するｐＳＶｇｙｔ基礎発現ベクター、ｐＧｌｇにサブクローニングできる。２つのプラスミドを、エレクトロポレーションによって、Ｓｐ２／０−Ａｇ１４細胞のような哺乳類の発現細胞にトランスフェクションしてもよく、そしてヒグロマイシン耐性について選択されてもよい。選択に生き残るコロニーを拡大させ、そして上清液を、ＥＬＩＳＡ法によって、ｃＬＬ２ｍＡｂの生成について観察する。約１〜１０×１０⁶細胞のトランスフェクション効率が望ましい。０．１０と２．５μｇ／ｍｌの間の抗体発現濃度が、この系で予測できる。
ＲＮＡ単離、ｃＤＮＡ合成および増幅についての一般的技術
ＲＮＡ単離、ｃＤＮＡ合成、および増幅は、以下のとおり行うことができる。全細胞ＲＮＡは、Sambrookら、（Molecular Cloning:A Laboratory Manual、第2版、Cold Spring Harbor Press、1989）にしたがって、総数約１０⁷細胞を用いて、ＬＬ２ハイブリドーマ細胞系列から製造でき、この文献は、参照することにより本明細書の一部とする。第一鎖ｃＤＮＡは、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ予備増幅系（Gibco／BRL.、Gaithersburg、MD）を用いることのように、常套により全ＲＮＡから逆転写できる。簡単には、２μｌの１０×合成緩衝液［２００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．４）、５００ｍＭＫＣｌ、２５ｍＭＭｇＣｌ₂、１ｍｇ／ｍｌＢＳＡ］、１μｌの１０ｍＭｄＮＴＰミックス、２μｌの０．１ＭＤＴＴ、および２００単位のＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ逆転写酵素の存在下で、２０μｌの反応液量で、５０ｎｇのランダムプライマーを５μｇのＲＮＡにアニールできる。延長段階は、最初に室温で１０分間行い、続いて４２℃で５０分間インキュベートすることが許容される。反応は、反応混合物を９０℃で５分間加熱することによって終了できる。
ＶＨおよびＶＫ配列の増幅ｃＬＬ２またはｈＬＬ２についてのＶＫおよびＶＨ配列は、Orlandiら、（Proc.Natl.Acad.Sci.USA、86:3833(1989)）にしたがって、記載されたとおり、ＰＣＲによって増幅でる。この文献は、参照することにより本明細書の一部とする。ＶＫ配列は、プライマーＣＫ３ＢＨおよびＶＫ５〜３（Leungら、BioTechniques、15:286(1983)、この文献は参照することにより本明細書の一部とする）を用いて、増幅してよい一方で、ＶＨ配列は、ネズミのＩｇＧのＣＨ１領域にアニールするプライマーＣＨ１Ｂ、およびＶＨＩＢＡＣＫ（Ｏｒｌａｎｄｉら、上述（１９８９））を用いて増幅できる。１０μｌの第一鎖ｃＤＮＡ産物、９μｌの１０×ＰＣＲ緩衝液［５００ｍＭＫＣｌ、１００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、１５ｍＭＭｇＣ１₂、および０．０１％（ｗ／ｖ）ゼラチン］（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒＣｅｔｕｓ、Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ）を含むＰＣＲ反応混合物は、３０サイクルのＰＣＲにかけることができる。各ＰＣＲサイクルは、９４℃で、１分間の変性、５０℃で、１．５分間のアニーリング、および７２℃で、１．５分間の重合から構成されるのが好ましい。増幅ＶＫおよびＶＨ断片は、２％アガロース（BioRad、Richmond、CA）で精製できる。自動化ＣｙｃｌｏｎｅＰｌｕｓＤＮＡ合成機（Milligan−Biosearch）で、オリゴＡ（１４９ｍｅｒ）およびオリゴＢ（１４０ｍｅｒ）の合成の方法について例３を参照のこと。
Ｉｇプロモーター、シグナルペプチド配列、およびＶＫＰＣＲ産物の枠内ライゲーションを促進するのに都合のよい制限部位を含むｐＢＲ３２７基礎ステージング・ベクターＶＫｐＢＲのようなステージング・ベクターに、ＶＫについてのＰＣＲ産物を、サブクローニングできる。ＶＨについてのＰＣＲ産物を、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ基礎ＶＨｐＢＳのような同様のステージング・ベクターにサブクローニングできる。それぞれのＰＣＲ産物を含む個々のクローンを、例えば、Sangerら（Proc.Nat1.Acad.Sci.USA、74:5463(1977)、この文献は、参照することにより本明細書の一部とする）の方法によってシークェンスしてもよい。さらに、グリコシル化部位の、したがって付随の糖（ＣＨＯ）部分の存在が、薬剤とキレートの有効で優れた複合を起こすことが分かった。これは、特にＣＨ２付随ＣＨＯの欠けている抗体断片が利用されるものである場合に当てはまる。
ここで記載されたＤＮＡ配列としては、全ての対立遺伝子、天然に生じたかまたは実験的に作り出されたそれらの突然変異体および変異株が挙げられる。
突然変異されたＣＨ１およびＣＫ領域での抗体の産生
ＣＨ１およびＣＫのＤＮＡ配列を単離し、タンパク質配列をモデル化し、そしてそのＤＮＡをＶＫおよびＶＨ配列について記載されたものに類似する方法論によって突然変異させることができる。いったんＣＨ１またはＣＫヌクレオチド配列が、軽鎖または重鎖クローンから取出されグリコシル化部位が、部位特定突然変異導入法を介して挿入されると、突然変異したＣＨ１またはＣＫ配列を、対応の重鎖または軽鎖ベクターに再挿入することができる。ＣＨ１突然変異体の場合に、ｈＬＬ２ｐＫｈのようなカッパ鎖発現ベクターと一緒に、適切な細胞、例えば骨肉腫Ｓｐ２／０−Ａｇ１４に、同時発現させることができ、そしてコロニーを、ヒグロマイシン耐性に関して選択できる。例えば以下に記載したとおりのＥＬＩＳＡ法により、本発明にしたがって、非Ｆｃ定常部のグリコシル化部位で遺伝子操作されたｃＬＬ２、ｈＬＬ２またはＬＬ２の産生について、上清液を観察できる。
トランスフェクション、およびＥＬＩＳＡによりクローンを分泌する抗体についてのアッセイは、以下のとおりに行うことができる。(Coら、J.Immunol.、148:l149(1992)）（この文献は、参照することにより本明細書の一部とする）にしたがって、エレクトロポレーション（BioRad、Richmond、CA）によって、５×１０⁶ＳＰ２／０骨肉腫細胞のトランスフェクションに、約１０μｇのｈＬＬ２ｐＫｈ（軽鎖発現ベクター）および２０μｇのｈＬＬ２ｐＧ１ｇ（重鎖発現ベクター）を使用できる。ＤＮＡ導入に続いて、３７℃、５％ＣＯ₂で、完全ＨＳＦＭ培地（GIBCO、メリーランド州、Gaithersburg,MD）中の９６穴マイクロタイタープレートで細胞を育成できる。選択工程は、２日後、５００μｇ／ｍｌのヒグロマイシンの最終濃度で、ヒグロマイシン選択培地（Calbiochem、San Diego、CA）を添加することによって始めることができる。コロニーは、一般に、エレクトロポレーションの２〜３週後現れる。その後、培養物は、次の分析のために拡大できる。
クローンを含むＩｇ遺伝子の発現のレベルは、コピー数を増幅することによって増強できたであろう。これは、一般に、目的の遺伝子、ここではＩｇ遺伝子に連結した選択性マーカーについて選択することによって行われる。当業者は、このような選択を用いることに慣れている。たいてい、選択性マーカーは、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ｄｈｆｒ）である。特に、増幅されたコピー数の遺伝子を含むと見られるクローンは、その発現によって同定され、そして増幅は、核酸ハイブリダイゼーション試験によって確認される。多ラウンドの選択アッセイおよびハイブリダイゼーションによる確認が、一般に行われる。
本発明による非Ｆｃ定常部のグリコシル化部位で遺伝子操作されたｃＬＬ２、ｈＬＬ２またはＬＬ２の分泌に陽性であるトランスフェクトーマ・クローンは、ＥＬＩＳＡ法によって同定できる。簡単には、トランスフェクトーマ培養物から得た上清サンプル（１００μｌ）を、ヤギ抗ヒト（ＧＡＨ）−ＩｇＧ、Ｆ（ａｂ’）₂断片特異的抗体（Jackson ImmunoResearch、West Grove,PA）で予備被覆されたＥＬＩＳＡマイクロタイタープレートに、三部づつ添加する。プレートを、１時間室温でインキュベートする。洗浄緩衝液（０．０５％ポリソルベート２０を含有するＰＢＳ）で３回洗浄することによって、未結合タンパク質を除去する。西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）複合ＧＡＨ−ＩｇＧ、Ｆｃ断片特異的抗体（Jackson ImmunoResearch、West Grove,PA）をウェルに加え、（１００μｌの抗体保存液を×１０⁴に希釈し、未複合抗体で補足して、１．０μｇ／ｍｌの最終濃度にした。）１時間のインキュベーション後、一般的に３回プレートを洗浄する。反応溶液（ＰＢＳ中に１６７μｇのオルソフェニレン−ジアミン（ＯＰＤ）（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、０．０２５％過酸化水素を含有する１００μｌ）をそのウェルに添加する。暗所で３０分間、色を発生させる。自動化ＥＬＩＳＡリーダー（Ｂｉｏ−Ｔｅｋ装置、Ｗｉｎｏｏｓｋｉ、ＶＴ）で４９０ｎｍでの吸光度を測定する前に、５０μｌの４ＮＨＣｌ溶液を各ウェルに添加することによって、反応を停止させる。その後、無関連キメラ抗体株（Ｓｃｏｔｇｅｎ，Ｌｔｄ．スコットランド、Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈ，Ｓｃｏｔｌａｎｄ））に関して、結合抗体を決定する。
抗体は、以下のとおり、細胞培養の培地から単離できる。トランスフォーマ培養を、血清不含培地に適合させる。キメラ抗体の製造のために、ＨＳＦＭを用いてローラーボトルで、細胞を、５００ｍｌ培養として育成する。培養物を遠心分離し、そして上清を、０．２ミクロンの膜を通して濾過する。濾過した培地を、１ｍｌ／分の流速で、プロテインＡカラム（１×３ｃｍ）を通過させる。その後、その樹脂を約１０カラム容量のＰＢＳで洗浄し、そしてプロテインＡ結合抗体を、１０ｍＭのＥＤＴＡを含む０．１Ｍグリシン緩衝液（ｐＨ３．５）でカラムから溶出させる。１．０ｍｌの画分を、１０μｌの３ＭＴｒｉｓ（ｐＨ８．６）を含む試験管に収集し、そして２８０／２６０ｎｍでの吸光度から、タンパク質濃度を決定する。ピーク画分を貯蔵し、ＰＢＳで透析し、そして例えば、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ３０（Amicon、Beverly,MA）で抗体を濃縮させる。以前のとおり、ＥＬＩＳＡによって、抗体濃度を測定し、そしてＰＢＳを用いて、その濃度を約１ｍｇ／ｍｌに調節する。ナトリウムアジ化物（０．０１％（ｗ／ｖ））を、防腐剤として、都合よくサンプルに添加する。
このように単離した抗体の相対的結合親和性は、直接放射性免疫アッセイによって測定できる。本発明にしたがって、非Ｆｃ定常部のグリコシル化部位で遺伝子操作されたｃＬＬ２、ｈＬＬ２またはＬＬ２が使用できる。クロラミンＴ法（例えば、Greenwoodら、Biochem.J.,89:123(1963)を参照。この文献は、参照することにより本明細書の一部とする。）を用いて、抗体を、¹³¹Ｉまたは¹²⁵Ｉで標識できる。ヨウ素標識抗体の比活性は、一般に、約１０μＣｉ／μｇに調節する。反応培地（１％ウマ血清および１００μｇ／ｍｌゲンタマイシンで補足されたＨＳＦＭ）を用いて、未標識または標識抗体を、適切な濃度に希釈する。適切な濃度の標識および未標識の両方の抗体を、全容量１００μ１で、一緒に反応試験管に添加する。ラジ細胞の培養物をサンプリングし、そして細胞濃度を測定する。培養物を遠心分離し、そして収集した細胞を、反応培地で一度洗浄し、続いて反応培地で再懸濁して、最終濃度約１０⁷細胞／ｍｌにする。全手段を、４℃での冷所で行う。細胞懸濁液（１００μｌ）を反応試験管に添加する。４℃で、２時間、反応試験管を経時的に穏やかに振盪して細胞を再懸濁して、反応を行う。反応期間に続いて、５ｍｌの洗浄緩衝液（１％ＢＳＡを含むＰＢＳ）を各試験管に添加する。懸濁液を遠心分離し、そして細胞ペレットを、別の５ｍｌの洗浄緩衝液で２回洗浄する。遠心分離に続いて、細胞ペレットに残った残留放射能の量をガンマカウンター（Minaxi,Packard Instruments、Sterling,VA）で測定した。
本発明の抗体の抗原結合特性は、ＬＬ２抗イデオタイプ抗体（ＷＮ）について標識されたｍＬＬ２で競合結合により評価できる。
ミックス−アンド−マッチおよび十分にヒト化された抗体のラジ細胞表層抗原結合親和性は、フローサイトメトリーアッセイによって評価されるとおり、コンペティターとしてＦｃ部分を欠く、様々な濃度のｍＬＬ２Ｆ（ａｂ’）₂断片を用いたｃＬＬ２のものと比較できる。フローサイトメトリーアッセイでのＦＩＴＣ標識抗ヒトＦｃ特異的抗体によって、ヒトＦｃ部分（ｃＬＬ２およびミックス−アンド−マッチＬＬ２）を担持する残基表層結合ＬＬ２抗体を検出できる。ミックス−アンド−マッチＬＬ２抗体が、ｃＬＬ２のものに類似する抗原結合親和性を示す場合、軽鎖および重鎖の両方のヒト化に関する当初の設計は、ｍＬＬ２免疫反応性を保つと結論づけられる。
本発明による非Ｆｃ定常部のグリコシル化部位で遺伝子操作されたｃＬＬ２、ｈＬＬ２またはＬＬ２を、標的細胞に内在化することは、基本的に（Pirkerら、J.Clin.Invest.、76:1261(1985)）の手段にしたがって、蛍光標識することによって行われ、この文献は、参照することにより本明細書の一部とする。培養したラジ細胞を遠心分離し、そして細胞を、新たな培地で、再懸濁して、約５×１０⁶細胞／ｍｌの濃度にする。９６穴マイクロタイタープレートの各ウェルに、１００μｌの細胞懸濁液を添加する。全反応を同時に終了させるために、定間隔で、１００μｌの液量で、抗体（４０μｇ／ｍｌ）を反応ウェルに添加する。プレートを３７℃で、ＣＯ₂細胞培養インキュベーターで、インキュベートする。インキュベーションの終わりに、細胞を冷１％ＦＣＳ／ＰＢＳで３回洗浄することにより、未結合抗体を除去する。その後、細胞を、１５分間４℃で、１ｍｌのＦｏｒｍａｉｄ−Ｆｒｅｓｈ［１０％ホルマリン溶液Ｆｉｓｈｅｒ、ＦａｉｒＬａｗｎ，ＮＪ］で処理する。洗浄後、アッセイされるべき抗体が、それぞれネズミ、キメラまたはヒト化されたものであるかによって、ＦＩＴＣ標識ヤギ抗ネズミ抗体（Tago,Burlingame,CA）またはＦＩＴＣ標識ヤギ抗ヒト抗体（Jackson ImmunoResearch、West Grove,PA）で処理することによって、細胞表層または細胞の内側のいずれかに存在する抗体を検出する。ＢＨ−２蛍光顕微鏡（Olympus,Lake Success、NY）を用いて、蛍光分布を評価する。
抗体内在化の比率は、放射性ヨウ素で標識した抗体をトレーサーとして用いて、Opreskoら、（J.Biol.Chem.、262:4116(1987)）にしたがって、測定できる。簡単には、放射性標識抗体（１×１０⁴ｃｐｍ）を、１％ヒト血清を含む０．５ｍｌのＤＭＥＭ培地中で４℃で、２時間ラジ細胞（１×１０⁶細胞／ｍｌ）を用いてインキュベートする。反応間隔に続いて、０．５ｍｌのＤＭＥＭ培地で３回洗浄することによって、非特異的に結合した抗体を除去する。各々の反応試験管に、０．５ｍｌのＤＭＥＭ培地を添加し、そして内在化を測定するために、懸濁液を３７℃でインキュベートする。定間隔で、トリプリケートの細胞を取除き、そしてすぐに氷浴中で冷却して、さらなる内在化を停止する。１０００×ｇで、４℃で、５分間細胞を遠心分離する。上清を除去し、そして放射能を計数する。冷所で、８分間、ｐＨ３．０で、１ｍｌの０．１Ｍアセテート／０．１Ｍグリシン緩衝液で処理することによって、表層結合放射能を除去する。酸処理によって放射能を除去し、そして細胞に結合して残留するものを測定する。時間に対するＣＰＭ_{intracellular}／ＣＰＭ_surfaceの比をプロットして、その傾斜から内在化の比率を決定する。
以下に記載される代表的実施例は、単に、本発明を例示するのに使用される。当業者は、多様な本材料が、請求された発明の広範な属性の範囲内にあることを認識する。ここに記述された全文献の内容は、参照することにより本明細書の一部とする。
例１
ＬＬ２モノクローナル抗体のヒト化に関するヒトフレームワークおよび配列設計の選択
ＬＬ２のネズミの可変(V)領域フレームワーク(FR)配列を、Kabatデータベース（Kabatら、Sequences of Proteins of Immunological Interest、5版、米国厚生省、米国政府印刷局、Washington,D.C.、この文献は参照することにより本明細書の一部とする）の中のヒト抗体のものと比較することによって、ヒトＲＥＩ（図１Ａ）およびＥＵ（図１Ｂ）配列が、それぞれＬＬ２のＶＫおよびＶＨドメインのＦＲｓに高度な配列相同性を示すことが分かった。したがって、ＲＥＩおよびＥＵのＦＲｓは、ＬＬ２のＶＫおよびＶＨについてのＣＤＲｓがそれぞれ付けられたヒトフレームワークとして選択された。しかし、ＥＵの配列よりむしろ、ＮＥＷＭのＦＲ４配列が、ＬＬ２重鎖をヒト化するためＥＵのＦＲ４配列を置換するのに使用された。コンピューターのモデル化の研究（図２Ａおよび２Ｂ）の結果に基づいて、結果物である抗体の親和性と特異性に影響を及ぼす可能性のある強力なＣＤＲ接触を示すネズミのＦＲ残基が、ヒト化ＦＲ配列の設計物に保持された（図１）。
２つのバージョンのヒト化重鎖を構築した。第一のバージョン（ｈＬＬ２−１）では、アミノ酸位置５（Ｋａｂａｔの番号付け）にあるグルタミン（Ｑ）が導入されて、それがステージング・ベクター（図３）にサブクローニングするのを促進するＰｏｔＩ制限部位を包含した。オリゴ特定突然変異導入法によって、ｈＬＬ２−２中で、このネズミ残基をヒトＥＵ残基バリン（Ｖ）に変換した。当初のネズミ・カッパ鎖可変配列中で、強力なＮ連結グリコシル化部位を、位置１８〜２０に確認し、そして糖付加に使用されたことに注目すべきである。このグリコシル化部位は、ＬＬ２軽鎖ヒト化に使用されたＲＥＩＦＲ配列に含まれなかった。
例２
ＬＬ２の重鎖および軽鎖可変部についてのＰＣＲクローニングおよび配列封入
上記で一般に、そして以下の例３でさらに詳細に記載されたとおりのＤＮＡプライマーを用いたＰＣＲクローニングによって、ｍＬＬ２の重鎖（ＶＨ）および軽鎖（ＶＫ）の両方についての可変部（ＩｇＧ２ａ）を得た。ＰＣＲが突然変異する傾向にある場合、重鎖および軽鎖のいずれかに関する複数の個々のクローンの可変部配列を、６つのクローンについて測定し、そして一致すると確認してからキメラ抗体の構築に使用した。
ＶＫについてのＰＣＲ産物を、Ｉｇプロモーター、シグナルペプチド配列およびＶＫＰＣＲ産物の枠内ライゲーションを促進するのに都合のよい制限部位を含むｐＢＲ３２７基礎ステージングベクターＶＫｐＢＲに導入した（図３Ａ）。ＶＨについてのＰＣＲ産物を、同様のｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ基礎ステージングベクターＶＨｐＢＳに導入した（図３Ｂ）。
上で特記したとおり、Sangerら、上述(1977)の方法にしたがって、各々のＰＣＲ産物を含む少なくとも６つの個々のクローンをシークェンスした。全てが、相同な配列を有することが示され、そしてそれらの各々の配列は、ＬＬ２ＶＫについては図４Ａに、そしてＬＬ２ＶＨについては図４Ｂに示されるとおり、明らかにされた。不完全な突然変異は、ＶＫおよびＶＨ領域をコードする配列内には確認されなかった。ＬＬ２のＰＣＲ増幅可変部配列をＫａｂａｔデータベース（Ｋａｂａｔら、上述）と比較すると、ＬＬ２のＶＫおよびＶＨ配列が、それぞれサブグループ５と２Ｂに属することが示唆された。ドメイン内ジスルフィド連結についてのＣｙｓのような重要な残基は、適切な位置で保持される。
ＶＫのＦＲ１フレームワーク領域で、Ｎ連結糖付随部位、Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｓｅｒを１８〜２０位に確認し（図４Ａ）、それは、ＬＬ２のＶＫがグリコシル化されている可能性があることを示唆している。以下に詳細に説明されるとおり、還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、このＡｓｎグリコシル化部位が実際に糖付加に利用されていることを示した。しかし、可変部でのグリコシル化部位の存在は、抗体の免疫反応性に影響を及ぼしそうにない。競合ＲＩＡでのｍＬＬ２の免疫活性をｃＬＬ２のものとの比較は、２つの抗体がほとんど同一の活性を示すことを示した。
例３
ヒト化Ｖ遺伝子のＰＣＲ／遺伝子合成
ｈＬＬ２ＶＨドメインについて設計した配列、長鎖オリゴヌクレオチドとＰＣＲにより構築したｈＬＬ２ＶＨドメイン構築物ならびにｈＬＬ２ＶＨドメインを含むステージングベクターＶＨｐＢＳの略図を図６に示した。
ｈＬＬ２ＶＨドメインを構築するために、オリゴＡ（１４９ｍｅｒ）とオリゴＢ（１４０ｍｅｒ）を自動ＣＹＣＬＯＮＥＰＬＵＳ^TMＤＮＡ合成装置（Milligen Bioreseach）を利用して合成した。
オリゴＡはヌクレオチド２４から１７２に相補的なｈＬＬ２ＶＨドメインのマイナス鎖である。すなわち、５’−ＴＡＴＡＡＴＣＡＴＴＣＣＴＡＧＧＡＴＴＡＡＴＧＴＡＴＣＣＡＡＴＣＣＡＴＴＣＣＡＧＡＣＣＣＴＧＴＣＣＡＧＧＴＧＣＣＴＧＣＣＴＧＡＣＣＣＡＧＴＧＣＡＧＣＣＡＧＴＡＧＣＴＡＧＴＡＡＡＧＧＴＧＴＡＧＣＣＡＧＡＡＧＣＣＴＴＧＣＡＧＧＡＧＡＣＣＴＴＣＡＣＴＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＧＴＴＴＣＴＴＧＡＣＴＴＣＡＧＣＣ−３’に対して相補的である。
オリゴＢはｎｔ１８０から３２０に相補的なｈＬＬ２ＶＨドメインのマイナス鎖である：５’−ＣＣＣＣＡＧＴＡＧＡＡＣＧＴＡＡＴＡＴＣＣＣＴＴＧＣＡＣＡＡＡＡＡＴＡＡＡＡＴＧＣＣＧＴＧＴＣＣＴＣＡＧＡＣＣＴＣＡＧＧＣＴＧＣＴＣＡＧＣＴＣＣＡＴＧＴＡＧＧＣＴＧＴＡＴＴＧＧＴＧＧＡＴＴＣＧＴＣＴＡＣＧＧＴＴＡＴＴＧＴＧＧＣＣＴＴＧＴＣＣＴＴＧＡＡＧＴＴＣＴＧＡＴＴ−３’
オリゴＡとＢを支持体から切り離し、濃縮した水酸化アンモニウムで処理して脱保護化した。サンプルを真空乾燥（SpeedVac、Savant、Farmingdale,NY）してから１００μｌの水に再懸濁し、さらにＤＮＡオリゴマーをＰＣＲで増幅する前に遠心分離でＣＨＲＯＭＯＳＰＩＮ−１００^TMカラム（Clonetech,Palo Alto,CA）を通して不完全オリゴマー（１００ｍｅｒ以下）を除去した。分離増幅とオリゴＡとＢのＰＣＲクローニングに用いる全てのブランキングプライマーは前記のSambrookらの方法(1989)によりＳＤＳ−ＰＡＧＥを利用して精製した。ＣＨＲＯＭＡＳＰＩＮで精製したオリゴＡのサンプル保存液１μｌを、１０μｌの１０×ＰＣＲ緩衝液（５００ｍＭＫＣｌ、１００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８．３、１５ｍＭＭｇＣｌ₂）と５単位のＡＭＰＬＩＴＡＱ^TMＤＮＡポリメラーゼ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒＣｅｔｕｓ，Ｎｏｒｗａｌｋ，Ｃｔ）を含む液に５ｍＭのオリゴ：５’−ＣＣＡＧＣＴＧＣＡＧＣＡＡＴＣＡＧＧＧＧＣＴＧＡＡＧＴＣＡＡＧＡＡＡＣＣＴＧ−３’を５μｌとオリゴ：５’−ＡＡＧＴＧＧＡＴＣＣＴＡＴＡＡＴＣＡＴＴＣＣＴＡＧＧＡＴＴＡＡＴＧ−３’を５μｌを加え、１００μｌとした反応液中でＰＣＲ増幅した。この反応混合液を変性条件、９４℃１分間、アニーリング条件５０℃１．５分、重合条件７２℃１．５分から成るＰＣＲ反応サイクルを３０回実施した。
オリゴＢのＰＣＲ増幅は次のプライマーペアーを用いて前記同様の条件下に行った：５’−ＴＡＡＴＣＣＴＡＧＧＡＡＴＧＡＴＴＡＴＡＣＴＧＡＧＴＡＣＡＡＴＣＡＧＡＡＣＴＴＣＡＡＧＧＡＣＣＡＧ−３’と：５’−ＧＧＡＧＡＣＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＧＴＧＣＣＴＴＧＧＣＣＣＣＡＧＴＡＧＡＡＣＧＴＡＧＴＡＡ−３’
オリゴＡとＢの二重鎖ＰＣＲ増幅産物をゲルを用いて精製し、ＰｓｔＩ／ＡｖｒII（オリゴＡのＰＣＲ産物）とＢｓｔＥII／ＡｖｒII（オリゴＢのＰＣＲ産物）で制限酵素処理し、重鎖ステージングベクターであるＶＨｐＢＳの相補的ＰｓｔＩ／ＢｓｔＥIIサイトにサブクローニングした。ヒト化したＶＨ配列をｐＧ１ｇベクター内にサブクローニングし、最終的にヒトＩｇＧ１重鎖発現ベクターｈＬＬ２ｐＧｌｇを得る。
ヒト化ＶＫ配列の完全長ＤＮＡを構築するために、オリゴＥ（１５０ｍｅｒ）とオリゴＦ（１２１ｍｅｒ）を上記同様にして合成した。オリゴＥの配列は：５’−ＣＣＴＡＧＴＧＧＡＴＧＣＣＣＡＧＴＡＧＡＴＣＡＧＣＡＧＴＴＴＡＧＧＴＧＣＴＴＴＣＣＣＴＧＧＴＴＴＣＴＧＧＴＧＧＴＡＣＣＡＧＧＣＣＡＡＧＴＡＧＴＴＣＴＴＧＴＧＡＴＴＴＧＣＡＣＴＧＴＡＴＡＡＡＡＣＡＣＴＴＴＧＡＣＴＧＧＡＣＴＴＡＣＡＧＣＴＣＡＴＡＧＴＧＡＣＣＣＴＡＴＣＴＣＣＡＡＣＡＧＡＴＧＣＧＣＴＣＡＧ−３’である。この配列はｎｔ３１から１８０に相補的なヒト型ＶＫドメインのマイナス鎖であり、この配列はオリゴ：５’−ＧＡＣＡＡＧＣＴＴＣＡＧＣＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＣＡＴＣＡＴＣＴＣＴＧＡＧＣＧＣＡＴＣＴＧＴＴＧＧＡＧ−３’とオリゴ：５’−ＡＧＡＧＡＡＴＣＧＣＧＡＡＧＧＧＡＣＡＣＣＡＧＡＴＴＣＣＣＴＡＧＴＧＧＡＴＧＣＣＣＡＧＴＡ−３’を利用してＰＣＲ増幅した。
オリゴＦ配列は：５’−ＧＣＡＣＣＴＴＧＧＴＣＣＣＴＣＣＡＣＣＧＡＡＣＧＴＣＣＡＣＧＡＧＧＡＧＡＧＧＴＡＴＴＧＧＴＧＡＣＡＡＴＡＡＴＡＴＧＴＴＧＣＡＡＴＧＴＣＴＴＣＴＧＧＴＴＧＡＡＧＡＧＡＧＣＴＧＡＴＧＧＴＧＡＡＡＧＴＡＡＡＡＴＣＴＧＴＣＣＣＡＧＡＴＣＣＧＣＴＧＣＣ−３’である。この配列はｎｔ２０８から３２７に相補的なヒト型ＬＬ２ＶＫドメインのマイナス鎖であり、この配列はオリゴ：５’−ＧＡＣＡＡＧＣＴＴＴＣＧＣＧＡＴＴＣＴＣＴＧＧＣＡＧＣＧＧＡＴＣＴＧＧＧＡＣＡＧ−３’とオリゴ：５’−ＧＡＣＣＧＧＣＡＧＡＴＣＴＧＣＡＣＣＴＴＧＧＴＣＣＣＴＣＣＡＣＣＧ−３’を利用してＰＣＲ増幅した。
ゲル精製したオリゴＥとＦのＰＣＲ産物は、それぞれＰｖｕII／ＮｒｕＩならびにＮｒｕＩ／ＢｇｌIIIで制限酵素消化した。それからこの２つのＰＣＲ断片ＥおよびＦをＮｒｕＩ部位で接続してから、軽鎖ステージングベクター、ＶＫｐＢＲの相補的ＰｖｕＩ／ＢｃII部位につなげた。ヒト化ＶＫ配列をベクターｐＫｈ内にサブクローニングして最終的なヒトカッパ鎖発現ベクター、ｈＬＬ２ｐＫｈを作製した。
ヒト化抗体を発現させるために、およそ１０μｇの直鎖状ｈＬＬ２ｐＫｈと２０μｇの直鎖状ｈＬＬ２ｐＧ１ｇを用いてエレクトロポレーションにより５×１０⁶ＳＰ２／０細胞をトランスフェクションした。トランスフェクションされた細胞を５００μｇ／ｍｌのヒグロマイシンで選別してから、分泌された抗体を１×３ｃｍのプロテインＡカラムで精製した。精製抗体をＣｅｎｔｒｉｃｏｎ３０遠心分離装置で濃縮してからＥＬＩＳＡにより抗体濃度を測定した。抗体の最終濃度を０．０１％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウムを保存剤として含むＰＢＳ緩衝液で１ｍｇ／ｍｌに調整した。
図１はネズミとヒト化したＬＬ２ＶＫドメインのアミノ酸配列と（図１Ａ）ネズミとヒト化したＬＬ２ＶＨドメイン（図１Ｂ）のアミノ酸配列の比較である。ＶＫ鎖では、全てのＦＲｅにヒトＲＥＩフレームワーク配列を用いた。ＶＨ鎖の場合は、ＦＲ１−３にはヒトＥＵフレームワーク配列を、またＦＲ−４にはＮＥＷＭ配列を用いた。ヒトの配列についてはネズミ配列と異なる箇所のみ示した。星印はネズミＦＲ配列とヒトＦＲ配列とが異なる箇所を示している。この箇所のネズミ残基はヒト化構造体内でも保存された。ＣＤＲｓは四角で囲んだ。
図４Ａには、ヒト化ＬＬ２ＶＫドメインの二重鎖ＤＮＡと、それに対応したアミノ酸配列（一字コードにて示した）が示されている。ＣＤＲ１−３アミノ酸配列は四角で囲んでいる。ＶＨの同様のものにについては図４Ｂに示した。
図５Ａと図５Ｂには、ヒト化ＬＬ２ＶＫとＬＬ２ＶＨそれぞれの二重鎖ＤＮＡ配列とアミノ酸配列が示されている。アミノ酸配列は１字コードで示されており、ＣＤＲアミノ酸配列は四角で囲んだ。
例４
キメラＬＬ２抗体の構築、発現及び精製
ＬＬ２のＶＫとＶＨ配列を含む断片をプロモーターおよびシグナルペプチド配列と一緒に、それぞれＬＬ２ＶＫｐＢＲとＬＬ２ＶＨｐＢｓからＨｉｎｄIIIとＢａｍＨＩの二重制限酵素消化により切り出した。それから、およそ６００ｂｐのＶＫ断片をほ乳類発現ベクターであるｐＫｈ（図３Ａ）のＨｉｎｄIII／ＢａｍＨＩ部位にサブクローニングした。ｐＫｈはｐＳＶｈｙｇを基礎とした発現ベクターで、ヒトカッパ鎖の不変部領域のゲノム配列と、Ｉｇエンハンサー、カッパエンハンサー、ならびにヒグロマイシン耐性遺伝子を含んでいる。同様におよそ８００ｂｐのＶＨ断片をｐＳＶｇｐｔを基礎とした発現ベクターでありヒトＩｇＧ１の定常領域のゲノム配列とＩｇエンハンサー、キサンチン−グアニンフォスフォリボシルトランスフェラーゼ（ｇｐｔ）遺伝子を含むｐＣ１ｇ（図３Ｂ）のＨｉｎｄIII／ＢａｍＨＩ部位にサブクローニングした。出来上がった発現ベクターをそれぞれＬＬ２ｐＫｈとＬＬ２ｐＧｌｇと命名した。
この２種類のプラスミドをエレクトロポレーションによりＳｐ２／Ｏ−Ａｇ１４細胞内に一緒にトランスフェクションした。生き残り選別されたコロニーの上清について、キメラ抗体が分泌されているかＥＬＩＳＡ法（上記参照）によって調べた。トランスフェクションの効率はおよそ１〜１０×１０⁶細胞であった。抗体の発現レベルは最終培養体で＜０．１０から２．５／μｇ／ｍｌの範囲であった。
Ａ精製したタンパク質ｍＬＬ２とｃＬＬ２を還元条件下あるいは非還元条件下にＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。ｍＬＬ２とｃＬＬ２の軽鎖は予想される分子量より大きかった。ｃＬＬ２のヒトカッパ定常領域はグリコシル化される可能性のある部位を持たないことから、ＬＬ２ＶＫドメインのＦＲ１領域内に特定されたグリコシル化可能部位が修飾を受けたことが推測されす。別のｈＬＬ２とｃＬＬ２抗体についても還元条件下と非還元条件下にＳＤＳ-ＰＡＧＥを利用して解析を行った。その内の１のｈＬＬ２抗体がｈＬＬ２−１である（ＶＨドメイン中にネズミＦＲ残基を７つ有している）。別のｈＬＬ２がＶＨドメイン中にネズミＦＲ残基を６つ持つｈＬＬ２−２である。キメラ型軽鎖に比べるとヒト化軽鎖は泳動速度が速く、またバンドが広がり不鮮明である。
ミックスアンドマッチ型ｃＬＬ２とｈＬＬ２抗体を還元条件下と非還元条件下にＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて分析した。解析した混合−整合抗体は（ｈＬ／ｃＨ）ＬＬ２、（ｃＬ／ｈＨ）ＬＬ２−１、（ｃＬ／ｈＨ）ＬＬ２である。（ｃＬ／ｈＨ）ＬＬ２−１と（ｃＬ／ｈＨ）ＬＬ２はそれぞれ重鎖のＦＲ領域内に７つ、および６個のネズミ残基を持っている。（ｈＬ／ｃＨ）ＬＬ２について観察された移動度から、ヒト化したＬＬ２軽鎖はグリコシル化されていないことが示唆された。
例５
ｃＬＬ２抗体のラジ細胞表面抗原への結合
競合細胞結合試験を行い、親細胞であるｍＬＬ２と比較した時のｃＬＬ２の免疫反応性を調べた。¹³¹Ｉ標識ｍＬＬ２（０．０２５μｇ／ｍｌ）をプローブとして、ラジ細胞を抗体と反応させ、細胞に結合した標識ｍＬＬ２の量から細胞への相対結合度を調べた（上記参照）。図７に示す競合試験に示されるように、ｍＬＬ２もｃＬＬ２抗体も共に同じ様な結合活性を有していた。
上記結果はフローサイトメトリーを利用した別の競合試験でも確認された。簡単には、ラジ細胞を前記同様に用いて、１種類の抗体の濃度をもう一方の抗体に対して様々に変え、結合したｍＬＬ２あるいはｃＬＬ２抗体量を、サイトフローメトリー法によりＦＩＴＣ標識抗ネズミＦｃ抗体あるいは抗ヒト抗体を用いて測定した。
例６
ラジ細胞に対するｈＬＬ２抗体の結合
実施例５の実験と同様にサイトフローメトリーを用いて、３種類の混合−整合型抗体もしくはヒト化ＬＬ２の組み合わせの抗原結合親和性について、ｃＬＬ２の親和性と比較した。
簡単には、ｃＬＬ２１μｇ、混合−整合型ＬＬ２、ｈＬＬ２−１あるいはｈＬＬ２−２抗体を、様々な濃度のｍＬＬ２Ｆ（ａｂ’）₂断片が存在する条件下で、１％ＦＣＳと０．０１％アジ化ナトリウムｊを添加したＰＢＳ緩衝液最終容積１００μｌの中で１０⁸のラジ細胞と反応させた。この混合液を３０分間４℃で反応させ、３回ＰＢＳで洗浄して非結合の抗体を除いた。抗体中にあるヒトＦｃ部を活かすために、２０倍に希釈したＦＩＴＣ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ１、Ｆｃ断片特異抗体（Jackson ImmunoReseach,West Grove,PA）を加えて抗体の結合レベルを調べた。細胞を３回ＰＢＳで洗ってから、蛍光強度をＦＡＣＳＣＡＮ蛍光活性化セルソーター（Becton−Dickinson,Bedford、MA）により測定した。結果は図８Ａに示す。同様の方法を用いて、ｃＬＬ２と２種類のｈＬＬ２とを比較した（図８Ｂ）。
図８ＡおよびＢに示す結果より、ｃＬＬ２の免疫反応性はヒト化もしくは混合−整合型抗体の免疫反応性と近似しているか、あるいは同一であることが示された。ｃＬＬ２の比較結果とｍＬＬ２（図７）の結果をまとめると、得られたキメラ型ならびにヒト化ＶＫおよびＶＨの配列は正統なものであることが確認された。
例７
ラジ細胞によるｍＬＬ２とｃＬＬ２抗体の細胞内取り込み
ＬＬ２抗体のユニークな特徴の一つにラジ細胞に結合すると、直ぐに細胞内の取り込まれる性質がある（Shihら.,1994前記）。細胞内に取り込まれた後のネズミＬＬ２はすぐにゴルジ装置に運ばれ、そこから様々な化学物質の分解をつかさどるライソゾームに移されると考えられている（Keisariら.,Immunochem.,10:565(1973)）。
抗体の細胞内取り込み速度を前記のOpreskoらの方法、1987により調べた。ＣＰＭ_{intracellular}／ＣＰＭ_surfaceの比を時間の関数として求めた。ＬＬ２抗体の細胞内取り込み速度は放射線標識したＬＬ２抗体（１×１０⁶ｃｐｍ）と０．５×１０⁶ラジ細胞を、１％ヒト血清を含む０．５ｍｌのＤＭＥＭ緩衝液中で２時間、４℃で反応させて調べた。過剰量のヒト血清を加えてラジ細胞表面のＦｃ受容体を飽和させて、Ｆｃ受容体を介して起こる非抗原特異的細胞内取り込みを除いた。細胞を３回、４℃にて０．５ｍｌのＤＭＥＭ緩衝液で洗浄し、結合していない放射線標識ＬＬ２抗体を取り除いた。それから細胞を３７℃で反応させ、一定時間毎に細胞懸濁液の一部を氷上に移して、細胞内取り込みを停止させた。この細胞を１，０００×ｇ、４℃、５分間の遠心分離で単離し、表面に結合した放射線標識ＬＬ２を０．１Ｍの酢酸グリシン緩衝液、ｐＨ３、１ｍｌを８分間、４℃作用させて剥がした。こうして剥がれた放射活性（ＣＰＭｓｕｒｆａｃｅ：表面）と細胞に残った放射活性（ＣＰＭｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ：細胞内）を求めた。細胞内取り込みの速度は、細胞内放射活性：表面放射活性比の時間に関するプロットの傾斜から求めた。
図９に示す様に、ｍＬＬ２、ｃＬＬ２、ｃＬＬ２ＱならびにｈＬＬ２抗体の細胞内取り込み速度は近かった（Ｋｅ＝０．１０７（ｍＬＬ２）から０．１２２１（ｃＬＬ２Ｑ、ＮＶＴがＱＶＴに変異したもの〉。これらの数字から、表面に結合した抗体のおよそ５０％が１０分以内に細胞内に取り込まれることが示された。この結果より、キメラ化してもヒト化しても、あるいはｍＬＬ２抗体に突然変異を起こして脱グリコシル化しても細胞内取り込み速度に影響することは無いことが示された。
ｍＬＬ２、ｃＬＬ２ならびにｈＬＬ２の細胞内取り込みのパターンについても、明細書に記載した方法に従いＦＩＴＣ標識二次抗体プローブを用いた蛍光顕微鏡観察を時間をおって行い、モニターした。両抗体の細胞内取り込みは、測定した最初の時点で観察された。５分目では、抗体は細胞表面と細胞膜直下の領域に細胞質微小粒子として確認された。反応後１５分目では、膜内周辺に広がっていた細かな点が集まりゴルジ装置と思われる場所で塊を形成し始めていた。反応３０分後にはもっと多くの抗体が細胞内に取り込まれ、集合した抗体がライソゾームと思われる場所に移動していることが観察されたが、抗体はこの場所で分解されると考えられている。反応２時間後には大部分の抗体が細胞内部に観察された。ＬＬ２を氷上で２０分間反応させた場合にだけ、強く表面が染色されることが観察された。ｍＬＬ２やｃＬＬ２は共に同様のパターンで細胞内に取り込まれた。ＬＬ２の細胞内取り込みには抗原抗体結合が必ず伴ったのに対して、対照である無関係なヒト化抗体は表面を僅かに染色しただけであった。
Ａ１０３抗体（全てのヒト上皮細胞の表面に結合するが、細胞内取り込みの効率は悪いＩｇＧ２ａ抗体（Mattesら.,Hybridoma,2:253(1983)）は２時間目までは強く膜を染色したが、抗トランスフェリン受容体抗体（５Ｆ９）はＬＬ２同様に素早く細胞内に取り込まれた。
例８
ＬＬ２ＶＫ配列のＦＲ１領域内のグリコシル化部位の役割
特に発明として興味深い点は、Ａｓｎグリコシル化部位がＬＬ２ＮＶＴ軽鎖配列のＦＲ１領域内の１８〜２０であると特定されたことである（図４Ａ）。前記の通り、還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析から、このＡｓｎグリコシル化部位が炭水化物の付加に利用される部位であることが示唆された。本実施例では、１８〜２０位の炭水化物基が掲載の機能活性に影響するかを検証した。
エンドグリコシダーゼ処理をした場合と、しない場合のネズミならびにキメラＬＬ２軽鎖を、還元条件下および非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。電気泳動での挙動に関して、抗体の型による違いはなかった。いずれの場合もグリコシル化により軽鎖の移動速度は低下した。
ｍＬＬ２抗体のラジ細胞への結合親和度に及ぼす脱グリコシル化の作用を図１０に示した。エンドグリコシダーゼＦにより炭水化物を除去しても結合活性に変化は見られなかった。
軽鎖の１８の位置に突然変異を誘導し、ＡｓｎをＧｌｎに変えてＬＬ２ＱＶＫＦＲ１を作製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析より、このＮＶＴからＱＶＴへの突然変異により抗体がグリコシル化されなくなった。軽鎖ＶＫのグリコシル化があるｃＬＬ２と無いｃＬＬ２のラジ細胞への結合親和度を比較した結果、炭水化物基がこれらの細胞への抗体結合に影響しないことが示された。
可変領域内にある炭水化物基の存在は抗体の免疫反応性には影響しないと結論できる。コンピュータを利用したモデル化研究は、ＬＬ２のＶＫにある炭水化物基がＣＤＲｓから離れて位置しており、またＣＤＲを支えるＦＲ付随βバリアーの基部ループを覆う「キャップ」を形成していることを示唆している。元来あったグリコシル化部位を含まない形でヒト化した結果、免疫反応性が同種のネズミ抗体に同じであるＣＤＲ移植ＬＬ２抗体が生まれた。上記より、グリコシル化部位は、Ｂリンパ腫細胞あるいは白血病細胞に結合して細胞内に取り込まれる抗体の能力に影響することなく、ＬＬ２に治療あるいは診断を目的とする薬剤の結合に利用できることが示された。
例９
ＬＬ２のＶＫ領域の炭水化物含有部位でのＬＬ２の標識
可変域の炭水化物はｍＬＬ２、ｃＬＬ２、ｈＬＬ２のｍＡｂｓではその機能活性に関与していないことから、この炭水化物基が放射線核種や毒素といった細胞毒成分もしくは検出成分を結合する部位として利用することで、細胞機能を大きく妨げることなく細胞表面へこれら標識体を結合できることが示された。
抗体にある酸化された炭水化物基と、各種薬物、毒素、キレーター、検出可能な標識物を複数共有複合できる重合性担体の１次アルキルアミン基とを複合させた抗体を作製するＳｈｉｈらの方法、米国特許番号第５，０５７，３１３号（参照することにより本明細書の一部とする）を利用して、付随するグリカンを欠き、複数の薬剤を含むドキソルビシン−デキストラン−ＬＬ２抗体断片を作製した。ｃＬＬ２ＶＫＦＲ１域に含まれる炭水化物基は、Ａｓｎグリコシル化部位と共有結合する部位である。
合成では、まずＮａＩＯ₄による酸化、ＮＨ₂−ＣＨ₂−ＣＨＯＨ−ＣＨ₂−ＮＨ₂とのシッフ基形成、ＮａＢＨ₄による還元を通じてデキストラン（１８〜４０ｋＤａ）をアミノデキストランに転換する。さらにこのアミノデキストランを無水コハク酸と１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド存在下にドキソルビシン（ＤＯＸ）と縮合してＤＯＸ−アミノデキストランを作る。それから、このＤＯＸ−アミノデキストランと、ＮａＩＯ₄を利用して抗体断片の炭水化物基を酸化することでＬＬ２ＶＫＦＲ−１に導入したアルデヒド基とを縮合した。
ＤＯＸ−ＬＬ２の調整では、デキストランに複合したＤＯＸのモル数は１モルのデキストラン当たり１４モルであり、１モルのＦ（ａｂ’）₂当たりのドキソルビシンのモル数は８．９であった。前記のラジ細胞結合法での免疫反応性は対照のもののおよそ８０％であった。この標識系はｍＬＬ２抗体のみに限定されるものではない。比較試験では、１５〜１９モルのＤＯＸが１モルのｃＬＬ２に複合した。
この標識能は上記実施例に示した担体であるデキストラン使用時に限られるものではない。例えば、ＬＬ２ＶＫＦＲ１域の炭水化物基を酸化することでアルデヒド基を作ることができる。言い換えれば、これらの基はいずれの薬物のアミノ基とも反応してシッフ基を形成することが可能であり、この基を還元することでアルキルアミン基を介して複数の薬物を抗体に安定して複合させることができる。
例えば、薬物がアミノヘキシルＤＴＰＡ（キレート剤）である場合、キレート剤と共有結合したＬＬ２ができる。このキレート剤を利用して組織を標的とした薬物供給が可能であり、例えば核種もしくは常磁性体金属イオンを複合させて診断ならびに治療応用できる。ＤＴＰＡ−ＬＬ２標識体は抗体１モル当たり５．５モルのキレート剤を含む形で作られているが、こ：れは言い換えると当該標識体によりＹ−９０の４７．３％とＩｎ−１１１の９７．４％がキレートされる。
例１０
ヒト化抗Ｂ細胞リンパ腫抗体の産生促進
ヒト化したネズミＬＬ２（ｈＬＬ２）の臨床応用試験を通じて、非ホジキン型Ｂ細胞リンパ腫の治療と診断にネズミＬＬ２が有効であることが示されているが、通常の形質導入細胞のｈＬＬ２の生産性が低いことが問題となった（最終培養液でおよそ１ｍｇ／リッター）。ｈＬＬ２重鎖と軽鎖の非アデノシンキナーゼ列を増殖可能なジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子（ｄｈｆｒ）（ｈＬＬ２ｐｄＨＬ２）を含む発現ベクター中に再結合し、さらにエレクトロポレーションによりＳＰ２／０細胞内にこのベクターをトランスフェクションしてメトトレキセート（ＭＴＸ）耐性のｈＬＬ２産生クローンを得た。ＭＴＸ濃度が０．１μＭのとき、１リッターの最終培養液から１．４ｍｇのｈＬＬ２が精製できた。ｈＬＬ２の産生量は培養液中のＭＴＸ濃度を段階的に上げることで上昇し、３μＭのＭＴＸの時に７０＋／−５ｍｇ／リッターの産生量で定常化した。精製されたｈＬＬ２は免疫反応性を保持したまま１０．３のＰＩを有していた。さらに、ＭＴＸ選別を完全にのぞき、凍結融解しても得られたクローンの高い生産性に影響はなく、増幅された遺伝子が安定して染色体内に組み込まれたことが示唆された。
例１１
ｈＬＬ２抗体の定常域内へのＮ結合グリコシル化部位の構築
１．Ｎ結合グリコシル化部位への突然変異の誘導
（１）軽鎖の突然変異
ウサギ抗体のカッパ定常領域のなかでＮ結合グリコシル化配列となり得ると考えられるアミノ酸位置は１６１〜１６３と１７４〜１７６である。同様の配列をｈＬＬ２のＣＫドメイン内に誘導でき、それぞれＫＣＮ１とＫＣＮ２と命名した。さらに３ヶ所に別のＣＫ突然変異をＫＣＮ３、ＫＣＮ４，ＫＣＮ５と命名し、図１２に示した。
（２）重鎖の突然変異
ヒトＩｇＭは、ＣＨ１ドメインのアミノ酸配列の１６１〜１６３の位置に炭水化物付加配列と考えられる、ＮＮＳを含む。ヒトＩｇＡのドメイン、ＣＨの１６８〜１７０残基の位置には、同様の配列ＮＶＴがある。軽鎖での突然変異と同じ様にして命名した（図１２）。
炭水化物付加配列、Ａｓｎ−Ａｓｎ−ＳｅｒがヒトＩｇＭの複数のＣＨ１ドメイン中のアミノ酸配列位置１６１〜１６３（Ｋａｂａｔの番号付け;Kabatら.,1991)に認められいる。同様の配列、Ａｓｎ−Ｖａｌ−ＴｈｒがヒトＩｇＡのＣＨ１ドメインのアミノ酸位置１６８〜１７０に認められている。ヒトＩｇＧ１配列に突然変異を起こして、アミノ酸位置１６２〜１６４のＡｓｎ−Ｓｅｒ−ＧｌｙをＡｓｎ−Ｓｅｒ−Ｖａｌに、アミノ酸位置１６５〜１６７のＡｌａ−Ｌｅｕ−ＴｈｒをＡｓｎ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒに、アミノ酸位置１６６〜１６８のＬｅｕ−ＴＨｒ−ＳｅｒをＡｓｎ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒにそれぞれ変え、最終的な構造への影響を最小限に留めたかたちで、ＩｇＭとＩｇＡの場合と殆ど同じグリコシル化部位と考えられる３種類の配列をヒトＩｇＧ１のＣＨ１ドメイン中に導入した。これらのグリコシル化部位は、「天然」の位置に留まっていると考えられる。コンピューターモデル試験より表面受容性が推測された別のグリコシル化受容体配列（例えばＨＣＭ５）も導入した。その他の部位は、コンピューターモデル試験せずにその配列の変異し易すさから無作為に選んだ。
２．発現用の変異構築体の作製
（１）変異誘導用プライマーの設計と合成
オリゴヌクレオチド部位特異的突然変異誘導法によって、前もって設計されたＮ結合グリコシル化可能部位をｈＬＬ２抗体内に誘導した各ＣＫ。ならびにＣＨ１変異に合ったオリゴヌクレオチドプライマーを合成し、これを用いて試験管内突然変異誘導を行った。これらのプライマーはそれぞれ標的となるＤＮＡ断片内に制限酵素切断部位（表１、下線配列）も同時に提供し、これによってその後のスクリーニングを容易にしている。表１では変異した塩基箇所は太字で示した。

（２）発現ベクターの構築
生体外での部位特異的突然変異誘導により、Ｎ結合グリコシル化可能配列がｈＬＬ２の軽鎖と重鎖をコードする遺伝子内に導入された。ＤＮＡの配列を決定して、確かにこの導入配列があることを確認した。それから各変異遺伝子を対応する発現ベクター（カッパ鎖の場合はｈＬＬ２ｐＫｈ、重鎖の場合はｈＬＬ２ｐＧ１ｇ）内にサブクローニングした。
まず、ヒトＩｇＧ１のＣＨ１ドメインをヒトのゲノムＩｇＧ１定常域配列（Leungら.,1994b）を含む発現ベクターＬＬ２ｐＧ１ｇから、ＢａｍＨＩとＢｓｔＸＩによる制限酵素処理して切り出し、これをその後の操作のためにｐＢｌｕｅｓｒｃｉｐｔＳＫベクター（Stratagene,La Jolla,CA）の対応する位置にサブクローニングした。得られたベクターはＣＨ１ｐＢＳと命名した。
Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｒ^TMＳｉｔｅ−ＤｉｒｅｃｔｅｄＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓＫｉｔ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ，ＰａｌｏＡｌｔｏ、ＣＡ）をメーカーの取扱説明書に従い用いて突然変異を誘導した。全てのケースで、それぞれの突然変異プライマーと結合して用いるための選択プライマー、ＭｕｔＫＳ（５’−ＡＣＧＧＴＡＴＣＧＡＴＡＴＧＣＡＴＧＡＴＡＴＣＧＡＡＴＴ−３’）を設計した。この配列はｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔのクローニング配列内にあるＨｉｎｄIII制限酵素部位をＮｓｉＩ制限酵素部位（下線）に変える時に利用される。
１６２〜１６４アミノ酸位置にあるＡｓｎ−Ｓｅｒ−ＧｌｙをＡｓｎ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒに変異させるために、選択プライマーＭｕｔＫＳとプライマーＣＨＯ１６２（５’−ＧＴＧＴＣＧＴＧＧＡＡＴＴＣＡＡＣＣＧＣＣＣＴＧＡＣＣＡＧＣＧＧＣ−３’）を利用して、１６４の位置のＧｌｙをＴｈｒに変異した。検出のための部位として大腸菌（下線部）部位が変異プライマー内に含まれている。
１６５〜１６７アミノ酸の位置にあるＡｌａ−Ｌｅｕ−ＴｈｒをＡｓｎ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒに変異させるために、選択プライマーＭｕｔＫＳとプライマーＣＨＯ１６５（５’−ＧＴＧＴＣＧＴＧＧＡＡＴＴＣＡＧＧＣＡＡＣＣＴＧＡＣＣＡＧＣＧＧＣ−３’）を利用して、Ａｌａ−１６５をＴｈｒ−１６５に変異した。検出のための部位としてＥｃｏＲＩ（下線部）部位が変異プライマー内に含まれている。
１６６〜１６８アミノ酸の位置にあるＬｅｕ−Ｔｈｒ−ＳｅｒをＡｓｎ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒに変異させるために、選択プライマーＭｕｔＫＳとプライマーＣＨＯ１６６（５’−ＴＧＧＡＡＣＴＣＡＧＧＣＧＣＧＡＡＴＡＣＣＡＧＣＧＧＣＧＴＧＣＡＣ−３’）を利用して、Ｌｅｕ−１６６をＡｓｎ−１６６に変異した。検出のために、ヒトＩｇＧ１中では元々はＣＨ１配列中にあるＫａｓＩ部位（ＧＧＣＧＣＣ）を３’のＣをＧに変えて除いた。
それぞれ１００ｎｇのリン酸化プライマーからなるペアー（選択プライマーと各変異プライマー）をステージングベクターのＣＨ１ｐＢＳ１００ｎｇに、２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭＭｇＣｌ₂、５０ｍＭＮａＣｌを含む最終容積２０μｌの反応液中に３分間９５℃においてアニールしてから氷上に５分間放置した。この混合液に２から４単位のＴ４ＤＮＡポリメラーゼと、４から６単位のＴ４ＤＮＡライゲースを３リットルの１０×合成緩衝液（ＣＬＯＮＴＥＣＨ，ＰａｌｏＡｌｔｏ，ＣＡ）と一緒に加えた。２時間、３７℃反応後、３リットルの前もって加温しておいた停止液（０．２５％ＳＤＳ，５ｍＭＥＤＴＡ）中で５分間６５℃に加熱して重合およびライゲーション反応を停止した。この混合液のＤＡＮを用いて、エレクトロポレーション法によりエレクトロコンピテントな大腸菌細胞、ＢＭＨ７１−１８ｍｕｔｓ（修復欠損）に形質導入した。形質転換細胞を集めてから一晩、３７℃で５０ｇ／ｍｌのアンピシリンを添加したＳＯＣ（２０ｍｇ／ｍｌバクトトリプトファン、５ｍｇ／ｍｌバクト酵母抽出物、８．６ｍＭＮａＣｌ、２．５ｍＭＫＣｌ、２０ｍＭグルコース）中で培養した。集めた形質転換細胞から調整したミニプラスミドＤＮＡをＨｉｎｄIIIで消化して、選択プライマーで変異されなかったＤＮＡを直鎖状に変えた。フェノール抽出により酵素を取り除いた後に、そのＤＮＡを用いて２回目の形質転換をコンピテントＤＨ５細胞を用いて行った。ＨｉｎｄIIIで消化できなかったプラスミドＤＮＡについて、ＥｃｏＲＩ消化配列があるか（ＧｌｙがＴｈｒに、ＡｌａがＡｓｎに変わっている場合）、あるいはＫａｓＩ検出部位がないか（ＬｅｕがＡｓｎに変異している）調べた。突然変異の有無の最終的な確認はＳａｎｇｅｒのジデオキシ配列決定法（Ｓａｎｇｅｒら．，１９７７）を用いて行った。所望のの変異があることが確認されたＣＨ１領域をＢａｍＨＩ／ＢｓｔＸＩ酵素で切り出し、ｈＬＬ２の最終的な重鎖発現ベクターであるｈＬＬ２ｐＧ１ｇの対応する部位にサブクローニングした。
（３）遺伝子増幅のための発現ベクター
抗体産生の下工程を効率化するためには、遺伝子増幅システムを利用することが求められる。変異抗体が工業目的に耐えうる可能性があることが確認されたのち、遺伝子増幅法により高いレベルの製造を達成できた。このために、我々はこれらのｈＬＬ２ｐｄＨＬ２高レベル発現ベクターにＮ結合グリコシル化部位変異、ｄｈｆｒミニ遺伝子を基礎とした遺伝子増幅システムを構築することを計画した。重鎖の変異、ＨＣＮ３，ＨＣＮ４ならびにＨＣＮ５は発現に向けてこのベクターにサブクローニングした。
これら変異を発現する最終の構築体は、それぞれｈＬＬ２ＨＣＮ３ｐｄＨＬ２、ｈＬＬ２ＨＨＣＮ４、ならびにｈＬＬ２ＨＣＮ５ｐｄＨＬ２と命名された。
３．変異ｈＬＬ２の発現と構築部位のグリコシル化．構築されたグリコシル化部位を含む定常域をｈＬＬ２の各可変領域（Ｖ）に連結した。エレクトロポレーションにより重鎖と軽鎖の発現ベクターで形質転換されたネズミＳＰ２／０ミエローマ細胞では各種のグリコシル化変異が発現した。構築した抗体は安定した抗体産生細胞の培養液からプロテインＡカラムを用いて精製し、精製タンパク質は還元条件のＳＤＳ−ＰＡＧＥにて分析した。グリコシル化変異の重鎖は対照の抗体である、そのＣＨＩドメインにグリコシル化可能部位を持たないｈＬＬ２とは異なる移動速度を持っている。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの移動速度は構築したオリゴサッカライドの分子の大きさに逆比例することから、各部位のグリコシル化の強さは最も強くグリコシル化されている抗体であるｈＬＬ２ＨＣＮ５とｈＬＬ２ＨＣＮ１ではＨＣＮ５．ＨＣＮ１＞ＨＣＮ３＞ＨＣＮ２＞ＨＣＮ４の順である。逆に、変異ＫＣＮ１−４の軽鎖では移動の遅れがないことから考えて、これらＣＫ関連部位には全くグリコシル化されていないか、あるいはあってもそれほど大きくないと結論した。
４．ｈＬＬ２ＨＣＮ１とｈＬＬ２ＨＣＮ５はＣＨ₁ドメインでＮグリコシル化される。抗体ｈＬＬＨＣＮ１、ｈＬＬ２ＨＣＮ５、ｈＬＬ２をＮグリコシダーゼＦ（ＰＮＧａｓｅＦ）で処理して、ペプチドにあるあらゆるタイプのＡｓｎ結合を切断し、還元型ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。ＰＮＧａｓｅＦで処理すると、分子としては大きなｈＬＬ２ＨＣＮ１とｈＬＬ２ＨＣＮ５がｈＬＬ２の分子の大きさまで小さくなったことは、これらの抗体の分子の大きさの違いは、重鎖にＮ結合したＣＨＯｓによるものであることが示された。あらゆるヒトＩｇＧ₁抗体は天然にはＣＨ₂ドメインのＡｓｎ２９７がグリコシル化されていることに注意すべきである。観察された分子の大きさの違いは、構築した部位ではなく、むしろ培養条件の変動の結果生まれたＣＨ２部位のグリコシル化の違いによるもであろう。そのために我々はｈＬＬ２ＨＣＮ１、ｈＬＬ２ＨＣＮ５、ｈＬＬ２のＦ（ａｂ’）₂断片を調整し、これら断片を還元型ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。これら抗体間の大きさの差は、Ｆｃ部分がないオリゴサッカライドが結合しているＦｄ（ＶＨ−ＣＨ₁）断片の大きさと関係し、ｈＬＬ２ＨＣＮ５のＦｄ断片の大きさはｈＬＬ２ＨＣＮ１のものより大きい。断片をＰＮＧｃａｓｅＦで処理して脱グリコシル化すると、これらの大きさの違いは無くなり、全てのＦｄ断片はグリコシル化していないｈＬＬ２と同じ位置に泳動されることから、構築した部位は実際にグリコシル化され、ＨＣＮ５のグリコシル化の程度がＨＣＮ１のものよりも大きいことが示唆された。
ＨＬＬ２ＨＣＮ１のＣＨ₁、ドメインにあるＮ結合オリゴサッカライド基はＣＨＯ特異標識法により直接目で見ることができる。その場合、まず複合したオリゴサッカライド基を過ヨウ素酸塩で酸化する。それからでき上がったアルデヒド基に、プローブとして利用し、かつウェスタンブロツト分析でストレプトアビジン−ペルオキシダーゼを用いて発色させるためのビオチンを共有結合する。これまで強調している様に、ｈＬＬ２とｈＬＬ２ＨＣＮ１の重鎖だけがＣＨＯ標識で可視化され、軽鎖は可視化されない。密度計測計で定量化すると、標識されたｈＬＬ２ＨＣＮ１のＣＨＯの強度はｈＬＬ２に比べておよそ２．５倍である。クーマシーブルーで染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥで示す様に、調べた各種抗体のタンパク質含有量は同様であった。我々は強度に見られる差は構築されたＨＣＮ１部位にグリコシル化が追加されたためと考えている。この考えは、Ｆ（ａｂ’）₂断片を用いて同様の解析を行った結果から支持された：ｈＬＬ２ＨＣＮ１のＦｄ断片のみがＣＨＯ特異的な標識を受け、ｈＬＬ２のＦｄ断片は標識されなかった。逆に、ＣＫのグリコシル化可能部位はグリコシル化されていなかった。
グリコシル化の強さが不均一であるＶＫ付属のグリコシル化部位とは異なり、ｈＬＬ２（ＨＣＮ１）Ｆｄ断片のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析では１本の幅広のバンドだけが観察されたことを記しておく。このことから、ｈＬＬ２（ＨＣＮ１）のＦｄ断片の殆ど全てがグリコシル化されていると推測され、グリコシル化の強さは比較的均一で、その後の特性分析や応用に好適な性質を有していると考えられた。
５．ＷＮ競合結合法．これら２種類の抗体の抗原結合力を、ＬＬ２抗イディオタイプ抗体（ＷＮ）に対するｍＬＬ２による競合結合を利用して評価した。この方法より、ｈＬＬ２ＨＣＮ１とＬＬ２ＨＣＮ２のＷＮに対する結合活性がｈＬＬ２のものと同じであることが示された（図１１）
例１２
アミノベンジルＤＴＰＡとデキストラン−ドキソルビシンのｈＬＬ２ＨＣＮ１とｈＬＬ２ＨＣＮ５への部位特定的結合ＤＴＰＡを用いた抗体のＦ（ａｂ’）₂断片の部位特異的修飾は既報の通り行った。Leungら.,J.Immunol.154:5919(1995)を参照のこと。Ｆ（ａｂ’）₂断片（−１ｍｇ／ｍｌ）を１５ｍＭのナトリウムメタロペルオキシダーゼを用いて４℃で１時間酸化した。酸化したものを精製し、５４５倍モルの過剰のアミノベンジルＤＴＰＡと混合し、ｐＨを５．９７に調整した。混合液を暗所、室温で５時間反応させてから、４℃に１８時間置いた。複合を１０ｍＭのナトリウムシアンボロヒドリドで安定化し、精製してから濃縮した。金属複合法と¹¹¹Ｉｎでスパイクした酢酸インジウムを用いて、キレート剤：Ｆ（ａｂ’）₂比を決めた。Ｍｅａｒｅｓら．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１４２：６８（１９８４）を参照のこと。放射線標識は本方法に従って行った。Leungら．，（１９９５）、supra参照。Ｆ（ａｂ’）₂断片に複合したＤＴＰＡ分子の数はＩｎ／Ｉｎ−１１１システムを用いた複合法にて決定した。簡単に説明すると、複合体４０μｇを３０分間、酢酸１ｎ−１１１でスパイクした過剰の酢酸インジウムと反応させた。これを１０ｍＭのＥＤＴＡで液化し、さらに１０分間反応させた。標識体は１０ｍＭのＥＤＴＡを展開液とするＩＴＬＣで分析した。ＤＯＸ−デキストラン複合体はShihら.,Cancer Res.51:4192(1991)の方法に従い、分子量１８ＫＤａのアミノデキストランを中間担体として用いて調製した。中間複合体にはデキストランポリマー当たり１０．５分子のＤＯＸが置換標識されていた。それからＤＯＸ−デキストランをｈＬＬ２ＨＣＮ１あるいはｈＬＬ２ＨＣＮ５のＦ（ａｂ’）₂断片に複合した。簡単には、この抗体断片を０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液、ＰＨ５．５を用いて１０ｍｇ／ｍｌに濃度調整し、２０ｍＭのメタペルオキシダーゼと暗所、４℃で６０分間反応させた。酸化した抗体を、前もって０．１ＭのＮａＣｌを含む０．０５ＭのＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ８．０で平衡化しておいたＢｉｏ−Ｓｐｉｎカラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で精製してから、ＤＯＸ−デキストラン（４当量）と室温で２４時間処理した。ナトリウムボロ水素化物で還元してから、複合産物をＢｉｏ−ｇｅｌＡ−０．５ｍゲルカラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で精製した。タンパク質分画を集め、Ｃｅｔｒｉｃｏｎ５０濃縮装置（Amicon、Beverly,MA）を用いて濃縮した。タンパク質複合体中の中間体の残存物は、Ｂｉｏ−ＳｉｌＳｅｃｓｅｉｚｅｅｘｃｌｕｓｉｏｎカラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いたＨＰＬＣで確認しながら結合緩衝液で繰り返し洗浄して取り除いた。
例１３
ＣＨ₁に結合するオリゴサッカライドはキレート剤および／又は薬物の効率的な複合部位として利用できる。
緩やかな化学条件下では、ｈＬＬ２ＨＣＮ１とｈＬＬ２ＨＣＮ５のＦ（ａｂ’）₂断片に複合するＤＴＰＡの分子数はそれぞれ１．６と２．９７である（表２）。いずれの複合体も¹¹¹Ｉｎの取り込みでは高い効率を示した（ｈＬＬ２ＨＣＮ１で９２％、ｈＬＬ２ＨＣＮ５で９１％）。ＷＮ競合阻止アセーでしらべた限り、ＤＴＰＡをグリコシル化変異部位に複合させた前後で免疫反応性には大きな変化は認められなかった。ＨＣＮ５結合ＣＨＯはＨＣＮ１に結合したＣＨＯに比べて、キレート剤複合にはより活性である。おおよそ２倍でＨＣＮ５部位無いに多くのＥＴＰＡ分子を取り込むことができる。
Leungら.,(1995)（前記）はネズミＬＬ２内のＶＫに結合しているＣＨＯが、抗体の抗原への結合特性を低下させることなく小分子のキレート剤の複合部位として利用可能なことを示した。このＶＫに結合しているＣＨＯをデキストラン−ＤＯＸと複合させたことによる免疫反応性への影響について調べた。デキストラン−ＤＯＸ複合体は１８ＫＤａのアミノデキストランポリマー上に平均して１０分子のＤＯＸを化学的に取り込ませて作製した。ＤＯＸ向け担体としてアミノデキストランを利用した場合には、平均しておよそ５．１個のＤＯＸ分子がネズミＬＬ２のＶＫ結合ＣＨＯに取り込まれること、そして細胞結合法とＥＬＩＳＡ法により免疫反応性はおよそ６０％減少することが観察された。表３参照。ＨＣＮ１ＣＨＯには若干多めのＤＯＸ分子（６．８）が複合するが、免疫反応性に対する有害作用という観点では、先の例に比べて比較的低かった。結合親和性の低下は３０％のみであった。逆に、ＨＣＮ５ＣＨＯにほぼ同数（７．２）のＤＯＸ分子を複合させた場合でも、抗原結合特性には差は現れなかった。表３参照。
ｈＬＬ２、ｈＬＬ２ＨＣＮ１，ｈＬＬ２ＨＣＮ５のＦ（ａｂ’）₂断片の分子の大きさをマススペクトリー（Mass Consortium,San Diego,CA）分析で決定したところ、それぞれ９９，０００，１０２，４００，１０３，８００であり、これら断片のアミノ酸配列は構築部位（１アミノ酸の違い）以外同一であり、断片にはグリコシル化されたＦｃ断片を有していないことから、このｈＬＬとグリコシル化変異のＦ（ａｂ’）₂の分子の大きさの差は、それぞれのＣＨ１に結合したＣＨＯの分子量の違いを反映したものである。即ち、ＨＣＮ１とＨＣＮ５のＣＨＯの分子量はそれぞれ３．４と４．８ｋＤである。
ＰＮＧａｓｅＦ消化により、ｈＬＬ２ＨＣＮ１とｈＬＬ２ＨＣＮ５のＣＨ１結合ＣＨＯｓを切り出してから、フルオロポア支援炭水化物電気泳動（ＦＡＣＥ）を用いてプロファイルならびに配列の分析を行った。ＣＨ１結合ＣＨＯは異なる種類の集団であることが判明した。ＨＣＮ５部位のオリゴサッカライドのおよそ６０％は大きな三突起構造を示したが、一方ＨＣＮ１では殆どが２突起構造（＞９０％）であった。これらの結果はＨＣＮ５のＣＨＯ部位の平均分子サイズがＨＣＮ１のものに比べて大きいことを示したマススペクトロメーターの結果と一致している。
上記実施例は本発明の幾つかの特定の実施態様について記載したものであり、これらの実施例により本発明の請求の範囲が限定されるものではないことを強調する。
また本明細書に引用された文献と特許とを、参照することにより本明細書の一部とする。

ａｈＭＮ１４Ｆ（ａｂ’）₂（グリコシル化されていない）を用いた対照実験ではキレート剤／Ｆ（ａｂ’）₂比は０．０７５で、これは無視できる値であり、複合体が炭水化物基に有ることが確認された。
ｂコバルト／コバルト−５７あるいはインジウム／インジウム−１１１法にて測定（Mearesら.,Ana1.Biochem.142:68,1984）。
ｃＩＴＬＣ解析を用いることにより、いずれのケースのＨＰＬＣ収量、標識％も高くなった。また全ての標識体中のコロイド金属は１％以下であった。
ｄ競合結合法による未修飾の対照Ｆ（ａｂ’）₂のＩＤ₅₀との比較による。
ＮＤ：未決定

ａ分光光度計計測により測定。
ｂ分光光度計計測より測定し計算。
ｃ既述の細胞表面結合法により活性を測定し、ＩＤ５０値から計算した。
ｄＩＤ５０値より計算した免疫活性。

Claims

Ｂ細胞特異的モノクローナル抗体または抗体断片であって、非Ｆｃ定常域の重鎖領域にグリコシル化部位を含むように操作され、前記グリコシル化部位が、ヒトＩｇＧ１に由来する図１２の太字で示されたＨＣＮ１およびＨＣＮ５からなる群から選択されるアミノ酸配列に位置することを特徴とする、抗体または抗体断片。
ヒト化抗体またはヒト化抗体断片である請求項１に記載の抗体または抗体断片。
該グリコシル化部位が、図１２において太字で示されるＨＣＮ５配列に位置する請求項１または２に記載のヒト化Ｂ細胞モノクローナル抗体または抗体断片。
該グリコシル化部位が、図１２において太字で示されるＨＣＮ１配列に位置する請求項１または２に記載のヒト化Ｂ細胞モノクローナル抗体または抗体断片。
ＬＬ２抗体の特異性を有する請求項１または２に記載の抗体または抗体断片。
ヒトＩｇＧ１に由来する図１２において太字で示されるＨＣＮ１およびＨＣＮ５からなる群から選択されたアミノ酸配列に位置するグリコシル化部位を定常重鎖領域内に含む抗体重鎖をコードする遺伝子を含む単離されたＤＮＡ分子。
定常ＣＨ１領域をグリコシル化された抗体又は抗体断片を製造する方法であって、
軽鎖遺伝子及び重鎖遺伝子又はそれらの部分を、グリコシル化可能な細胞内で共発現させて、定常ＣＨ１領域がグリコシル化された前記抗体または抗体断片を生成するステップであって、前記重鎖はヒトＩｇＧ１に由来する図１２において太字で示されるＨＣＮ１およびＨＣＮ５からなる群から選択されたアミノ酸配列においてグリコシル化部位を含むステップと、
前記抗体または抗体断片を単離するステップと
を含む方法。
モノクローナル抗体又は抗体断片を、特定の抗原を標的とするために用いて、抗体又は抗体断片を診断剤若しくは治療剤と複合させた形で使用する、患者の診断又は治療方法に使用するための医薬を製造するための抗体または抗体断片の使用であって、
該抗体又は断片は、請求項２のモノクローナル抗体又は抗体断片であることを特徴とする使用。
該患者がＢ細胞悪性腫瘍患者であり、該ヒト化モノクローナル抗体または抗体断片がＢ細胞特異的抗体または抗体断片である請求項８に記載の使用。
該診断剤または治療剤が、該モノクローナル抗体又は抗体断片の炭水化物に複合している請求項８に記載の使用。