JPH02501800A - 組換ｄｎａ産物及び方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 組換ＤＮＡ産物及び方法 本発明は、ヒンジ領域中に変更された数のシスティン残基を有する変更され抗体 分子（ａｌｔｅｒｅｄ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｍｏｌｅｃｕｌｅ　；　ＡＡＭ）、 及び組換ＤＮＡ技法を用いるその製造方法に関する。

本出願において： ｒ　ＭＡｂＪなる語はモノクローナル抗体を示すために用いられ； 「組換抗体分子Ｊ　（ＲＡＭ）なる語は、組換ＤＮＡ技仇を用いる任意の方法に より生産される抗体を記載するために用いられ、天然免疫グロブリンの任意の類 似体又はその断片を包含し；そして 「ヒト化抗体分子Ｊ　（ｈｕｍａｎｉｓｅｄ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｍｏｌｅｃｕ ｌｅ　；　ＨＡＭ）なる語は、ヒト以外の種の免疫グロブリンに由来する抗原結 合部位を有し、分子の残りの免疫グロブリン由来部分がヒトの免疫グロブリンに 由来する分子を記載するために用いられる。該抗原活性部位は定常ドメインに融 合した完全な可変ドメインであってもよく、又は可変ドメイン中の適切なフレー ムワーク領域に移植された（ｇｒａｆｔｅｄ）相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅ− ｍｅｎｔａｒｉｔｙ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ　ｒｅｇｉｏｎ　；　ＣＤＲ）の みであってもよい。

本明細書において、多くの刊行物に番号をもって言及する。

これらの刊行物は本明細書の末尾に番号順に記載する。

天然免疫グロブリンは多年にわたり、その種々の断片、例えばＦａｂ、（Ｆａｂ ’　）２及びＦｃ断片、を有するものとして知られており、これらは酵素的開裂 により誘導され得る。天然免疫グロブリンは一般に各アームの末端に抗原結合部 位を有するＹ形天然免疫グロブリン及びその断片は診断において、そしてより限 定された範囲では治療において使用されている。

しかしながら、この様な使用、特に治療における使用は、天然免疫グロブリンの ポリクローナル性により障害されている。

療法例として免疫グロブリン可能性の実現への有意な段階は定義された抗原特異 性のモノクローナル抗体の発見であった（１）。はとんどのＭＡｂは誓歯動物の 牌細胞と誓歯動物の骨髄腫細胞との融合により生産される。従ってこれらは本質 的に誓歯動物ＭＡｂである。ヒ）　ＭＡｂの生産の報告はほとんど無い。

ヒトにおいて抗原性の低い非−ヒ）　ＭＡｂを製造する提案がなされている。こ の様な技法を一般にＭＡｂを「ヒト化する」（ｈｕｍａｎｉｚｅ）と称すること ができる。これらの技法は一般に抗体分子のポリペプチド鎖をコードするＤＮＡ 配列を操作する組換ＤＮＡ技法の使用を含む。

この様な方法を実施するための幾つかの初期の方法がＢＰ−Ａ−０１７１４９６ （Ｒｅｓ、ｎｅｗ、Ｃｏｒｐ０日木、ＥＰ−Ａ−０１７３４９４（スタッフォー ド大学）　、ＥＰ−Ａ−０１９４２７６（セルチック・リミテッド）、及びＷＯ −Ａ−８７０２６７１（Ｉｎｔ、　Ｇｅｎ、Ｅｎｇ、　Ｉｎｃ、　）に記載され ている。

ＥＰ−Ａ−８７３０２６２０，７（Ｗｉｎｔｅｒ）に記載されテイル他ノ方法ニ オいて、マウスＭＡｂの相補性決定領域（ＣＤＲ）が、長いオリゴヌクレオチド を用いる部位特定変異誘発によりヒト免疫グロブリンの可変ドメインのフレーム ワーク領域に移植（ｇｒａｆｔ）された。

免疫グロブリン、そして特にＭＡｂが癌の診断及び治療において潜在的に非常に 有用であり得ることが広く示唆されている（２　、３）。従って、癌特異抗原に 対して向けられた免疫グロブリン又はＭＡｂの製造を試みる多くの活動が存在す る。

今まで、種々のヒト癌に対して向けられた１００を超えるＭＡｂが腫瘍の診断又 は治療の種々の観点において使用されている（４）。

本発明者らの同時に出願された出願Ｎα（ＰＡ　１４９）には、可変ドメインの 少なくとも相補性決定領域（ＣＤＲ）がマウスモノクローナル抗体８７２．３　 （８７２，３ＭＡｂ）に由来しそしてＨＡＭの残りの免疫グロブリン由来部分が ヒト免疫グロブリンに由来する。抗原結合部位を有するヒト化抗体分子（ＨＡＭ ）　、及びその製造方法が記載されている。

８７２．３　ＭＡｂは、乳癌のヒト肝臓転移癌の膜富化抽出物に対して生じたＩ ｇＧ１−カッパー型のマウスＭＡｂである（５）。

８７２．３ＭＡｂは多数の研究室において広範に研究されている。

このものは、分子量約１０１′のムチン（ｍｕｃｉｎ）様分子である腫瘍関連糖 蛋白質ＴＡＧ−７２を認識することが示されている（６）。

免疫組織化学的研究が示すところによれば、Ｂ７２．３　ＭＡｂは直腸結腸癌の 約９０％、乳癌の８５％及び卵巣癌の９５％を認識する。しかしながら、それは 広範囲の正常ヒト組織と交叉反応性を示さない（７〜１０）。

療法剤又は診断剤としての免疫グロブリン分子の効力を増加せしめるため、それ にエフェクター又はレボター分子を共有結合により連結すべきことが提案されて いる。しかしながら、これは常に実施できるとは限らない。例えば、結合の可能 性ある部位はチオール基である。チオール基は蛋白質中にシスティン残基として 自然に存在する。しかしながら、この様な残基は比較的に一般的ではなく、しば しば分子の内側に存在しそしてしばしば蛋白質分子内又は蛋白質分子間のジスル フィド橋の形成に関与する。従って、もし天然に存在するシスティン残基を結合 の部位として使用すれば蛋白質の正常なフォルディング及び安定化が妨害される であろうという危険が存在する。

従って、蛋白質分子」二の他の側鎖を修飾してチオール基を生成せしめることが 提案されている。例えば、リジン残基を化学的に修飾してそれらの側鎖上にチオ ール基を生成せしめることができる。しかしながらこの方法は、多数の又はすべ てのこの様な利用可能なりジン残基上にチオール基を生成せしめるであろう。従 って、多数の可能性ある結合部位が存在し、このため結合がどこに生ずるかをあ らかじめ決定することが不可能となるであろう。さらに、多数の結合は蛋白質の 生物学的活性を妨害するであろう。さらに、多数の余分なチオール基のため、新 たなチオール基が鋼量又は領内ジスルフィド結合を形成し、この結合が蛋白質の コンフィグレーション及び機能を変化せしめる可能性がある。

さらに、免疫グロブリンの炭水化物成分の特異的標識化によりエフアクタ−又は レポーター分子を付加することが提案されている（１１）。これは一般に、糖残 基の過ヨウ素酸酸化により活性アルデヒドを生成せしめることを含む。しかしな がら、この方法は、蛋白質鎖中のアミノ酸を酸化が変形せしめるという点で不利 である。例えば、メチオニン残基は容易に酸化される。さらに、炭水化物成分は すべて免疫グロブリン分子のＦｃ部分に位置する。従って、Ｆａｂ又は（Ｆａｂ ’　）、を標識するためにこの方法を用いることは不可能である。

従って、エフェクター又はレポーター分子を免疫グロブリン分子に再現性よく且 つ効果的に、部位特異的に結合せしめることができる方法を提供することが望ま しいであろう。

本発明の第一の観点に従えば、分子上の表面ポケット中の残基をシスティン残基 に変えることによって該表面ポケット中にチオール基が導入されている変更され た抗体分子を提供する。

あらゆる蛋白質分子がその自然状態において折りたたまれたコンフィグレーショ ンを採用することは当業者により理解されよう。従って、幾つかのアミノ酸残基 の側鎖は折りたたまれた蛋白質の内側にあり、そして幾つかは外側にある。外側 にあるものの内規つかは凸状表面上に位置し、幾かは平な表面上に位置し、そし て幾つかは凹状表面上に位置する。凹状表面はポケットとしても記載される。

平らな又は凸状の表面上の残基の側鎖はおそらく蛋白質の残りの部分上に突出し ていると、当業者は認識するであろう。

従って、この様な残基がシスティン残基に変えられたならそのチオール基はエフ ェクター又はレポーター分子への結合のために利用可能であると予想されよう。

驚くべきことに、そしてこの予想に反して、チオール基がこの様な部位に導入さ れた場合それらはその様な結合のために利用されないことが見出された。さらに 、ポケット中のアミノ酸上の側鎖として導入されたチオール基はその様な結合の ために利用可能でないと予想されよう。しかしながら、驚くべきことに、そして この予想に反して、この様なチオール基は利用可能であり、そして抗体分子にエ フェクター及びレポーター分子を結合せしめるために使用され得ることが見出さ れた。さらに、この様なチオール基の導入が蛋白質の巨大分子構造を大きく変化 せしめることが予想された。再び、驚くべき且つ予想外のことには、それは起ら ないことが見出される。

本発明の変更された抗体分子は、完全な長さの重鎮及び軽鎖を有する完全な抗体 分子；その断片、例えばＦａｂ断片又は（Ｆａｂ’　）　２断片；あるいは軽鎖 又は重鎮の二量体を含むことができる。但し、特定の部位に導入されており且つ 結合のために利用可能なチオール基をこの様な分子が有することを条件とする。

この発明に関して、「結合するＪ　（ｂｏｎｄｉｎｇ）とは、システィン残基の チオール基に共有結合を形成することを意味する。

変更された抗体分子は常用のペプチド合成によって製造することができることが 予想される。しかしながら、変更された抗体分子を組換ＤＮＡ技法により製造す るのが好ましい。

本発明の第二の観点に従えば、組換抗体分子の１つの鎖の結合能力を変えるため の方法が提供され、この方法は、（１）前記１つの釦をコードするオペロンを含 有するがしかし該鎖の表面ポケット中に位置するあらかじめ選択されたアミノ酸 残基をコードする配列がシスティン残基をコードする配列に変えられている発現 ベクターを生成せしめる：ことを含んで成る。

所望により、単一のポリペプチド鎖中０２個以上のアミノ酸残基を変えることが でき、あるいは２本の鎖のそれぞれに存在する１個又は複数個のアミノ酸残基を 変えることができる。

好ましくは、配列の変更は部位特異的変異誘発によって行われる。

本発明のこの観点の本質的特徴は、変更されるべきアミノ酸残基の位置の事前選 択である。エフェクター又はレポーター分子をＲＡＭに結合せしめる（ａｔｔａ ｃｈ）ことを可能にするためにシスティン残基の側鎖としてチオール基を導入す ることが望ましいから、次のことが望ましい。

（ｉ）変更されるべきアミノ酸の側鎖はシスティン残基に類似する大きさを有す べきであり； （ｉｉ）変更されるべき残基との領内水素結合が存在せず：（ｉｉｉ）システィ ン残基と共に生成するかもしれない領内水素結合が存在せず： （ｉｖ）該チオール基はＲＡＭの他の部分と相互作用すべきではなく、又は該部 分により隠されるべきではなく；そして（ｖ）該システィン残基は小分子、例え ば直径約（１１３ｎｍの分子によってのみ接近されることができそしてより大き なサイズの分子、例えば直径０．５　ｎｍより大きい分子によっては接近され得 ない。従って、システィン残基はエフェクター又はレポーター分子への結合のた めにのみ利用可能であり、そして同一の鎮又は他の鋼上の類似のシスティン残基 への結合のためには利用可能でない。

最初の３つの条件は、新たなアミノ酸残基への変更がＲＡＭのコンホーメーショ ン及び安定性になんらの不都合な効果を有しないことを可能な限り保証するであ ろう。第二の２つの規準は、チオール基がエフェクター又はレポーター分子゛の みへの結合のために利用可能でありそして他の同様に変異された鎖への結合のた めには利用可能でなく、従ってジスルフィド結合による架橋を回避することを可 能な限り保証する。

（ｉ）の要件を満足する残基はスレオニン及びセリンを包含する。従って、変更 される残基は免疫グロブリン分子の表面ポケット中のセリン又はスレオニン残基 である。

この様な変更を行うための好ましい部位はＣＨ１ドメインである。なぜなら、こ こでの変更及びここへの分子の結合は抗原の結合、及び変更された抗体分子のＦ ｃ部分（もし存在するとすれば）のエフェクター機能を妨害しないらしいからで ある。好ましくは、変更されるＣ）＋１ドメイン中の残基は５ｅｒ１５６又はＴ ｈｒ１７３　［Ｋａｂａｔ等（１４）に記載されている番号付与系による〕であ る。しかしながら、変更のための好ましい部位は抗体分子の任意のドメイン中に 見出し得る。

好ましくは、本発明の第二の観点の方法は、（ｂ）前記ベクターによりセルライ ンをトランスフェクトし；そして （Ｃ）該トランスフェクトされたセルラインを培養して結合能力の変化した組換 抗体分子を生産せしめる；段階を含んで成る。

所望により、変更されるべき抗体は、前記の方法のいずれかにより製造される「 ヒト化されたＪ　（ｈｕｍａｎｉｓｅｄ）抗体である。

本発明の第二の観点の方法において、ベクターが単一の抗体ポリペプチド鎖のみ をコードする場合、この方法の生成物は二量体分子であろう。天然免疫グロブリ ンの様に四量体分子が要求される場合、２つの代替可能な方策の１つを用いるこ とができる。

第一の方法においては、セルラインをさらに第二のベクターにより形質導入し、 第一のベクターは重鎮由来のポリペプチドをコードしそして第二のベクターは相 補的軽鎖由来のポリペプチドをコードする。好ましくは、各ポリペプチドが同程 度に発現されることを可能な限り保証するために、コード配列及び選択マーカー に関する場合を除き、ベクターは同一である。

第二の方法においては、相補的軽鎖由来のポリペプチド及び重鎮由来のポリペプ チドをコードする配列を含む。

ベクターが重鎮ポリペプチドのみをコードする場合、相補的軽鎖を天然に分泌す る宿主細胞を用いることにより組換抗体分子を製造することが可能である。

本発明はまた、本発明の方法において使用されるクローニングベクター及び発現 ベクター並びに形質導入されたセルライン、本発明の変更された分子を含んで成 る療法用及び診断片組成物、並びに療法及び診断におけるこの様な組成物の使用 を含む。

レポーター又はエフェクター分子は変更された抗体分子に任意の常法により結合 せしめることができる。例えば、放射能標識を抗体に結合せしめる方法は本発明 者等の先の英国特許出願Ｎα８８００８４３及びＮα８８１２２５７に記載され ている。

ベクターを作製するだめの一般的方法、形質導入法、及び培養方法はそれ自体よ く知られており、そして本発明の部分を構成しない。これらの方法は例えば参照 文献（１２）及び（１３）において示されている。

本発明をここに、例により、添付図面に言及しながら記載する。これらの図は、 ヒト化Ｂ　７２．３抗体分子のＢ７２．３　）ＩＡＭＣ）１１ドメインのＤＮＡ 及びアミノ酸配列を、部位特定変異誘発のために使用される８種類のオリゴヌク レオチドブライマーの配列と共に示している。

上に言及した本発明者らの係属中の出願Ｎα（ＰＡ　１４９）において、種々の ヒトＩｇＧ重鎮ドメインを有するヒト化Ｂ７２．３　ＭＡｂの製造が記載されて いる。その出願はまた、ヒト化８７２．３Ｆ　（ａｂ’　）　２断片の製造を示 している。本発明書で後記する結果は、該係属中の出願に示されているようなヒ ト化Ｂ７２．３　ＭＡｂの使用により得られた。

ヒト化８７２．３分子のＣＨＩドメインのヌクレオチド配列及びアミノ酸配列は 図に示されており、今これに言及する。ヒト化８７２．３抗体分子が共有結合を 介してエフェクター又はレポーター分子に結合されることを可能にするために、 表面ポケット中に位置しそして前に（ｉ）〜（ｖ）として記載した規準を満足さ せるセリン又はスレオニン残基の探索を行った。

比較のため、すべての規準に合致しない他のセリン又はスレオニン残基をも選択 した。

８７２．３分子のＣＨＩドメインはヒト抗体ＫＯＬのそれとかなりの配列相同性 を示す。ＫＯＬ抗体はＫａｂａｔ等（１４）により記載されている。ＫＯＬ抗体 の結晶構造はＸ−線結晶写真（ｃｒｙｓｔａｌ＝１ｏｇｒａｐｈｙ）により決定 されている。必要なアミノ酸置換を行うため、ＫＯＬＣＨｌ、ドメインの構造に 基いてＢ７２．３Ｃ）１１ドメインの構造を推定することが可能である。

この推定に基いて多くのセリン残基及びスレオニン残基を選択した。すべてがヒ ト化８７２．３分子の表面上に位置することが推定されたが、しかしながら幾つ かはポケット中にあり、幾つかは平らな表面上にあり、そして幾つかは凸状表面 上にあることが推定された。標的残基はＴｈｒ１５３　、５ｅｒ１５６　、５ｅ ｒ１６３　。

Ｔｈｒ１６７　、５ｅｒ１６８　、　Ｔｈｒ１７３　、　Ｔｈｒ２０５、及びＴ ｈｒ２１７と同定された。

ここで用いられる番号付与はＫａｂａｔ等（１４）により記載されているそれに 相当する。

ギヤｙプドーデコプレックス軸ａｐｐｅｄ−ｄｕｐｌｅｘ）法（１５）に従う部 位特定変異誘発実験において使用するためのオリゴヌクレオチドブライマーを調 製した。これらは図に示しである。

各場合において、上記のスレオニン残基又はセリン残基の１つをシスティン残基 に変えるように設計された。ここで変更されたＤＮＡベクターを生成せしめ、そ してチェインターミネーション法（１６）により配列決定した。

次に、すべての変更された遺伝子断片を、哺乳類細胞系での発現のためにプラス ミドＰＥＥ６．　ＨＣＭＶ　（ｉ７）に再クローン化した。このプラスミドはヒ ト・サイトメガロウィルスからの強力なプロモーター／エンハンサ−転写制御要 素を含有する（１７）。もとの８個の提案されたシスティン変異体の内５個、す なわちＮα１，３，４．６、及び７をこの段階で採用した。

変更されたヒト化Ｂ　７２．３抗体の合成及び集成をＣＯ３細胞での一時的（ｔ ｒａｎｓｉｅｎｔ）発現により分析した（１７）。５種類の重鎮変異体遺伝子の それぞれを、ヒト化Ｂ　７２．３軽鎖遺伝子と共に該細胞にトランスフェクトし た。細胞上清をＥＬＩＳＡ測定を用いて８７２．３抗原結合活性について測定し た。免疫グロブリンの分泌及び集成をさらに、トランスフェクトされたＣＯＳ細 胞の生合成標識化及び免疫沈澱により評価した。両タイプの分析の結果が示すと ころによれば、５種類すべてのチオール変異体遺伝子が十分に集成された４量体 抗体分子を生産し、その抗原結合性は変更されていないヒト化Ｂ　７２．３分子 と区別できなかった。どの変異体も凝集した分子を生成しないようであった。

この一時的発現系は、さらに詳細な生化学的特徴付けのために十分な量の抗体を 生産しなかった。従って、変更された８　７２、３抗体を発現する安定なセルラ インを樹立した。変異体重鎮遺伝子を、ヒト化Ｂ　７２．３軽鎮をすでに生産す るチャイニーズ・ハムスター卵ＪＫ（ＣＩＩＯ）セルラインに、工゛レクトロポ レ−ジョンによりトランスフェクトした。トランスフェクトされたセルラインを ｐＥＥ６．ｌ（ＣＭＶプラスミドに導入された薬剤耐性マーカーを用いて選択し 、そして変更された８７２．３抗体を生産する細胞をクローン化しそして拡張し た。

組換抗体（変更されていないもの及びチオール変異体の両者）をＣｌｌ０細胞上 清から、プロティンＡ−セファロース上でのアフィニティークロマトグラフィー により精製しそして限外濾過により濃縮した。精製された抗体は十分に集成され ておりそして凝集していないことが５ＯＳ−ポリアクリル゛アミドゲル電気泳動 及びゲル濾過ＨＰＬＣにより示され、一時的発現の実験の結果が確認された。抗 原結合がＥＬＩＳＡにより証明された。まとめると、これらの結果が示すところ によれば、重鎮のＣ）ＩＩドメインの表面の単一システィン残基の置換は変更さ れた抗体の合成、集成、及び抗原結合活性に影響を与えなかった。分析されたす べての変異体が同じ挙動を示したから、これは導入されたチオール基の地理的位 置とは無関係のようである。

各免疫グロブリン分子は２本の重鎮を含有するから、システィンが還元型のまま であれば変更された抗体は２個の遊離チオールを有するはずである。表面システ ィンの酸化還元状態を４．４′−ジチオジピリジンを用いるタイトレージョン（ ｔ　１ｔｒａｔ　１ｏｎ）により測定した。抗体サンプル（０，５ｍｇ／　ｍｌ ）を４．４′−ジチオピリジンに加え（最終濃度０．５ｍＭ）、そして遊離チオ ール基との反応を３２４ｎｍにおける吸光度の増加によりモニターした。結果を 下記の表に要約する。

聚 ヒト化Ｂ７２．３チオール変異体上の遊離−３Ｈ基の１　ポケット　０．９７ ３　凸状部　０．３０ ４　平面　０．３０ ６　ポケット　１．１０ ７　平面　０．３０ ８７２．３　対照　０．３０ 変異体３．４及び７は、遊離チオールの数について、変更されていないヒト化８ ７２．３対照とおよそ同じ値を有し、導入されたシスティンが結合のために利用 可能でないことを示している。これらは、同じようにして、例えば生体内又は生 体外でのグルタチオーンとの反応によりブロックされている可能性が最も高いと 推定される。他方、変異体１及び６は抗体分子当り少なくとも１個の遊離チオー ル基に相当する、対照より実質的に高い、タイトレージョンレベルを与えた。こ れと、分子当り２個のチオールの予想される値との喰い違いは、チオールの幾ら かの酸化が生じたことを示唆した。

しかしながら、この結果が示すところによれば、平らな表面（変異体４及び７） 又は凸状表面（変異体３）に存在する、すなわち比較的高い接解表面接近性を有 する、システィンは、それらのチオール基がブロックされているらしく、そのた め部位特異的結合のためには適当でないようである。これに対して、ポケット部 位に位置する２個のシスティンは抗体分子当り少なくとも１個の遊離チオールの 程度で結合のために利用可能な形態のままであった。

遊離チオール基を有することが示された変異体をエフェクター又はレポーター分 子の部位特異的結合のために使用することができるか否かを調るため、チオール 特異的リンカ−を合成した。チロシンアミド［０，５Ｍ　ＰＩＰＢＳ緩衝液（ｐ Ｈ６，８）中０．１　ｍＭ）をＮ−サクシニミジル−３−マレイミドプロピオネ ート（１，４〜ジオキサン中０．０１５ｍＭ）と反応せしめることにより２−、 （３−Ｎ−７レイミジル）−Ｎ−プロピルアミド−３−（４−ヒドロキシ）フェ ニルプロパノアミドを得た。

このリガンドをチロシンマレイミドと称し、これを、クロラミンＴを用いて＋２ ５ヨウ素により標識した。この放射性化合物を逆相ＨＰＬ（：’により精製した 。チオール変異体の１つ（Ｎα６）をヨウ素化プローブと共にインキュベートし た（ｐ）！５．５、室温にて１時間）。標識された抗体を未導入リガンドからゲ ル濾過又はプロティンＡ−セファロース沈澱により分離し、そして５Ｏ５−ポリ アクリルアミドゲル電気泳動／オートラジオグラフィーにより分析した。ヒト化 マウスＢ７２゜３及びハイブリドーマ由来マウス８７２．３の両者を陰性対照と して含めた。

リジン残基にチオール基を非選択的に導入する２−イミノチオランと反応したヒ ト化８７２．５を標識化法のための陽性対照として使用した。この分析の結果は 、予想通り、チオール特異的リガンドであるチロシンマレイミドがチオール変異 体８７２、３の重鎮のみを標識したことを示した。これに対して、非特異的に、 変形されたヒト化８７２．３は重鎮及び軽鎖の両者上で標識され、そしてさらに 多数の凝集した分子を生じさせた。従って、部位特異的に標識された抗体はより 均一な生成物を生成した。

前記の方法が示すところによれば、システィン残基を抗体分子の重鎮に、レポー ター分子が該抗体分子に導入されたチオールを介して部位特異的に結合され得る ような位置に、置換することができる。チオール基がエフェクター又はレポータ ー分子に効果的に結合することができるためには、該チオール基は表面ポケット に導入されなければならないことをそれは示している。

抗体分子の重鎮又は軽鎖の異るドメインに対して同じ方法を行うことができるこ とが予想されよう。適切なア、ミノ酸残基をその中に有する適当な表面ポケット が存在することが必要なすべてである。

本発明は例示的にのみ上に記載され、そして本発明の範囲を逸脱することなく詳 細な点の変更を行うことができることは明らかであろう。

参考文献 Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　５ｏｎｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　１９０６゜３、 　Ｌｅｖｙ　＆　Ｍｉｌｌｅｒ、　Ａｎｎ、ＲｅｖｏＭｅｄ、、　３４．１０７ −１１６．１９８３゜４、　Ｓｃｈｌｏｍ　＆　Ｗｅｅｋｓ、　Ｉｍｐｏｒｔａ ｎｔ　Ａｄｖａｎｃｅｓ　ｉｎ　Ｏｎｃｏｌｏｇｙ。

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Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ、　０ｘｆｏｒｄ、　１９８０゜１４、　Ｋａｂａｔ等、　 ５ｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ ａｌＩｎｔｅｒｅｓｔ、　Ｆｏｕｒｔｈ　Ｅｄｉｔｉｏｎ、　Ｌｌ、Ｓ、Ｄｅｐ ｔ、ｏｆ　Ｈｅａｌｔｈ　ａｎｄ）１ｕｍａｎ　５ｅｒｖｉｃｅｓ、　１９８７ ゜　”１７、　Ｗｈｉｔｔｌｅ等、　Ｐｒｏｔ、Ｅｎｇ、、　１．６．４９９− ５３０．１９８５゜３１１％　ＣＴＧＡＧＴＴＣＣＡＧＣＡＣＡＣＣＧＴＣＡＣ ボケ゛ソト＊３ＨＴＧＣＡＣＧＣＣＧＣＡＧＧＴＣＡＧＧＧＣＧ　凸　状（ＣＧ ＴＩ ＮＯＴＣＣＡＣＧＡＣＡＣＧＣＡＣＡＣＣＧＧＴＴＣＧ　平　面［ＧＴＪ ＊５）ｌ　ＣＡＣＧＣＣＧＣ了ＧＣＡＣ，！、ＧＧにＣＧＣＣＴ　凸　状＋ＧＴ ｌ ＊６ｍ　ＡＧＣＣＧＧＧＡＡＧＣＡＧτＧＣＡＣＧＣＣＧ　ポケット（ＧＴＪ ＊７ｘ　ＧＣＡＧＧτＧＴＡＧＣＡＣＴＴＣＧＴＧＣＣＣ平　面手続補正書（方 式） ％式％ １、　事件の表示 ＰＣＴ／ＧＢ８　Ｂ１００７２９ ２、　発明の名称 組換ＤＮＡ産物及び方法 ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 名称　セルチク　リミティド ４、代理人 住所　〒１０５東京都港区虎ノ門−丁目８番１０号６、補正の対象 （１）特許法第１８４条の５第１項の規定による書面の「特許出願人の代表者」 および「発明の名称」の欄 （２）明細書の翻訳文第１頁の「発明の名称」の欄（３）明細書及び請求の範囲 の翻訳文 （４）委任状 ７、補正の内容 （１）（２）（４）　別紙の通り （３）明細書、請求の範囲の翻訳文の浄書（内容に変更なし） ８、添付書類の目録 （］）訂正した特許法第１８４条の ５第１項の規定による書面　１通 （２）明細書の翻訳文第１頁　１通 （３）明細書及び請求の範囲の翻訳文　各１通（４）委任状およびその翻訳文　 各１通国際調査報告

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. １．分子上の表面ポケット中の残基をシステイン残基に変えることにより該表面 ポケット中にチオール基が導入されている、変更された抗体分子。
2. ２．組換ＤＮＡ技法により生産される請求項１に記載の変更された抗体分子。
3. ３．完全な抗体分子、Ｆａｂ断片、又はＦ（ａｂ′）２断片である、請求項１又 は２に記載の変更された抗体分子。
4. ４．前記変更がＣＨ１ドメイン中に存在する、請求項１〜３のいずれか１項に記 載の変更された抗体分子。
5. ５．前記変更される残基がＳｅｒ１５６又はＴｈｒ１７３である、請求項４に記 載の変更された抗体分子。
6. ６．組換抗体分子の１つの鎖の結合能力を変更する方法であって、 （ａ）前記１つの鎖をコードするオペロンを含有するが、該鎖の表面ポケット中 に位置するあらかじめ選択されたアミノ酸をコードする配列がシステイン残基を コードする配列に変えられている発現ベクターを調製することを含んで成る方法 。
7. ７．前記変化が部位特定変異誘発により行われる、請求項６に記載の方法。
8. ８．（ｂ）前記ベクターによりセルラインをトランスフェクトし；そして （ｃ）該トランスフェクトされたセルラインを培養して変化した結合能力を有す る組換抗体分子を生成せしめる；段階をさらに含んで成る方法。
9. ９．前記セルラインがさらに第二のベクターによりトランスフェクトされ、第一 のベクターが重鎖由来のポリペプチドをコードしており、そして第二のベクター が相補的軽鎖由来のポリペプチドをコードしている、請求項８に記載の方法。
10. １０．前記発現ベクターが、相補的軽鎖由来のポリペプチド及び重鎖由来のポリ ペプチドをコードする配列を含有する、請求項８に記載の方法。
11. １１．請求項２又はそれに従属する請求項に記載の変更された抗体分子を製造す るための、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。