TW201702271A - 治療代謝病症之抗－ａｐ２抗體及抗原結合劑 - Google Patents

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Abstract

本發明係關於改良之抗-aP2抗體及抗原結合劑以及其組合物，該等抗體靶向脂質伴護蛋白aP2/FABP4(稱為「aP2」)，尤其用於治療諸如糖尿病、肥胖、心血管疾病、脂肪肝及/或癌症之病症。在一個態樣中，揭示改良之aP2介導之病症治療，其中使用低結合親和力之aP2單株抗體，靶向血清aP2且中和或調節aP2之生物活性，提供較低空腹血糖含量、改善全身性葡萄糖代謝、增加全身性胰島素敏感性、降低脂肪量、降低肝臟脂肪變性、減少心血管疾病及/或降低出現心血管疾病之風險。

Description

治療代謝病症之抗-AP2抗體及抗原結合劑
本發明係關於改良之抗-aP2抗體及抗原結合劑以及其組合物，該等抗體靶向脂質伴護蛋白aP2/FABP4(稱為「aP2」)，尤其用於治療諸如糖尿病、肥胖、心血管疾病、脂肪肝及/或癌症之病症。在一個態樣中，揭示改良之aP2介導之病症治療，其中使用低結合親和力之aP2單株抗體，靶向血清aP2且中和或調節aP2之生物活性，提供較低空腹血糖含量、改善全身性葡萄糖代謝、增加全身性胰島素敏感性、降低脂肪量、降低肝臟脂肪變性、減少心血管疾病及/或降低出現心血管疾病之風險。
人類脂肪細胞脂質結合蛋白(aP2)屬於與脂質輸送及儲存有關之細胞內脂質結合蛋白家族(Banzszak等人，(1994)Adv.Protein Chem.45,89-151)。aP2蛋白質與脂肪分解及脂肪生成有關且已在諸如糖尿病、動脈粥樣硬化及代謝症候群之脂質及能量代謝疾病中指示。aP2亦已在代謝及發炎反應系統之整合中指示。(Ozcan等人，(2006)Science 313(5790)：1137-40；Makowski等人，(2005)J Biol Chem.280(13)：12888-95；及Erbay等人，(2009)Nat Med.15(12)：1383-91)。最近，已展示aP2在諸如某些脂肪肉瘤之某些軟組織腫瘤中有差異地表現(Kashima等人，(2013)Virchows Arch.462,465-472)。
aP2在脂肪細胞中高度表現且藉由過氧化體增殖物活化受體-γ(PPARγ)促效劑、胰島素及脂肪酸調控(Hertzel等人，(2000)Trends Endocrinol.Metab.11,175-180；Hunt等人，(1986)PNAS USA 83,3786-3790；Melki等人，(1993)J.Lipid Res.34,1527-1534；Distel等人，(1992)J.Biol.Chem.267,5937-5941)。在缺乏aP2之小鼠(aP2-/-)中的研究表明防止與遺傳或飲食誘發之肥胖相關之胰島素抗性出現及脂肪組織中脂質型態改善且C16：1n7-棕櫚油酸酯之含量增加，脂肪肝減少以及肝葡萄糖產生之控制及周圍葡萄糖處置改善(Hotamisligil等人，(1996)Science 274,1377-1379；Uysal等人，(2000)Endocrinol.141,3388-3396；Cao等人，(2008)Cell 134,933-944)。
另外，aP2之遺傳缺乏或藥理學阻斷減少缺乏載脂蛋白E(ApoE-/-)小鼠模型中早期與晚期動脈粥樣硬化病變(Furuhashi等人，(2007)Nature,6月21日；447(7147)：959-65；Makowski等人，(2001)Nature Med.7,699-705；Layne等人，(2001)FASEB 15,2733-2735；Boord等人，(2002)Arteriosclerosis,Thrombosis,and Vas.Bio.22,1686-1691)。此外，aP2缺乏在缺乏載脂蛋白E(ApoE-/-)小鼠模型中顯著預防早期及晚期動脈粥樣硬化(Makowski等人，(2001)Nature Med.7,699-705；Fu等人，(2000)J.Lipid Res.41,2017-2023)。因此，aP2在臨床前模型中代謝疾病出現之許多態樣中起關鍵作用。
在過去二十年間，一般FABP及尤其aP2之生物功能主要歸因於其作為細胞內蛋白質之作用。因為脂肪細胞中aP2蛋白質之豐度極高，佔據總細胞蛋白質高達數百分比(Cao等人，(2013)Cell Metab.17(5)：768-78)，所以用傳統方法治療性靶向aP2具挑戰性，且在臨床前模型中獲得之有希望之成功(Furuhashi等人，(2007)Nature 447,959-965；Won等人，(2014)Nature Mat.13,1157-1164；Cai等人，(2013)Acta Pharm.Sinica 34,1397-1402；Hoo等人，(2013)J.of Hepat.58, 358-364)進展至臨床轉變已減慢。
除其在細胞質中存在之外，近來已展示aP2自脂肪組織經由非經典調控路徑主動分泌(Cao等人，(2013)Cell Metab.17(5),768-778；Ertunc等人，(2015)J.Lipid Res.56,423-424)。aP2之分泌形式充當新穎脂肪細胞活素且回應於空腹及空腹相關信號而調控小鼠中肝葡萄糖產生及全身性葡萄糖穩態。血清aP2含量在肥胖小鼠中顯著升高，且阻斷循環aP2改善患有飲食誘發之肥胖的小鼠中葡萄糖穩態(Cao等人，(2013)Cell Metab.17(5)：768-78)。重要地，在多個獨立人類研究中在其中分泌aP2含量在肥胖中增加且與代謝及心血管病非常相關的人類群體中亦觀測到相同模式(Xu等人，(2006)Clin.Chem.53,405-413；Yoo等人，(2011)J.Clin.Endocrin.& Metab.96,E488-492；von Eynatten等人，(2012)Arteriosclerosis,Thrombosis,and Vas.Bio.32,2327-2335；Suh等人，(2014)Scandinavian J.Gastro.49,979-985；Furuhashi等人，(2011)PloS One 6,e27356；Ishimura等人，(2013)PloS One 8,e81318；Karakas等人，(2009)Metabolism：Clinical and Experimental 58,1002-1007；Kaess等人，(2012)J.Endocrin.& Metab.97,E1943-1947；Cabre等人，(2007)Atherosclerosis 195,e150-158)。最終，保護攜帶單倍劑量不足對偶基因，導致aP2表現減少之人類避免糖尿病及心血管疾病(Tuncman等人，(2006)PNAS USA 103,6970-6975；Saksi等人，(2014)Circulation,Cardiovascular Genetics 7,588-598)。
Cao等人使用兔抗小鼠aP2多株抗體展示經抗體處理之肥胖小鼠中血漿aP2含量減少，此在脂肪組織中aP2蛋白質含量無任何改變下發生(Cao等人，(2013)Cell Metab.17(5)：768-778；PCT公開案WO 2010/102171)。雖然在肥胖小鼠中投與抗體不改變體重，但與用免疫前IgG處理之對照相比，在處理兩週內確實引起空腹血糖含量顯著降 低。在葡萄糖耐受性測試中，接收aP2多株抗體之小鼠展現與對照動物相比顯著改善之葡萄糖處置曲線。
Miao等人報導在接受高脂肪飲食之經抗體處理之小鼠中使用高親和性小鼠抗人類aP2單株抗體(鑑別為mAb 2E4)實現改善之高脂肪飲食(HFD)誘發之發炎(Miao等人，(2015)Molecular and Cellular Endocrinology 403,1-9)。然而，與對照動物相比，用高親和性mAb 2E4處理引起體重大幅度增加，且在處理六週之後未觀測到基礎葡萄糖含量顯著改變。此外，mAb 2E4處理未能影響HFD誘發之胰島素耐受性。
本發明之一個目標為鑑別用於治療代謝病症之新化合物、方法及組合物。
本發明之一個目標尤其為鑑別用於降低空腹血糖含量、改善全身性葡萄糖代謝、改善葡萄糖耐受性、增加全身性胰島素敏感性、減少脂肪量、減少脂肪細胞脂肪分解、減少肝葡萄糖產生、減少高胰島素血症及/或減少肝臟脂肪變性之新化合物、方法及組合物。
本發明之一個目標亦為鑑別用於治療糖尿病、肥胖及血脂異常之新化合物、方法及組合物。
本發明之另一個目標為鑑別用於治療發炎誘發之病症，例如動脈粥樣硬化之新化合物、方法及組合物。
本發明之另一個目標為鑑別用於治療腫瘤、癌症或其他贅瘤之新化合物、方法及組合物。
提供抗-aP2單株抗體及抗原結合劑，其具有用於治療aP2介導之病症的優良及意外活性。在一個實施例中，提供抗-aP2單株抗體及抗原結合劑，其含有具有可變區之輕鏈或輕鏈片段，其中該可變區包含一個、兩個或三個獨立地選自Seq.ID No.7、Seq.ID No.8及Seq.ID No.9之互補決定區(CDR)。在另一個實施例中，提供抗-aP2單株抗體及抗原結合劑，其包含具有可變區之輕鏈或輕鏈片段，其中該可變區包含一個、兩個或三個獨立地選自Seq.ID No.10、Seq.ID No.11、Seq.ID No.12、Seq.ID No.13、Seq.ID No.597、Seq.ID No.598或Seq.ID No.599之CDR。在再一個實施例中，提供抗-aP2單株抗體及抗原結合劑，其包含具有可變區之輕鏈或輕鏈片段，其中該可變區包含一個、兩個或三個獨立地選自Seq.ID No.7、Seq.ID No.8及Seq.ID No.9、Seq.ID No.10、Seq.ID No.11、Seq.ID No.12、Seq.ID No.13、Seq.ID No.597、Seq.ID No.598或Seq.ID No.599之CDR。在一個實施例中，提供抗-aP2單株抗體及抗原結合劑，其包含具有可變區之輕鏈或輕鏈片段，其中該可變區包含Seq.ID No.7、Seq.ID.No.8及至少一個選自Seq.ID.No.9、Seq.ID No.10、Seq.ID No.11、Seq.ID No.12、Seq.ID No.13、Seq.ID No.597、Seq.ID No.598或Seq.ID No.599之CDR。或者，所揭示及選擇之CDR中之一或多者可藉由不會不利地影響抗體或抗原結合劑之特性或改善該等特性之一或多個胺基酸的取代來改變，如本文中進一步描述。在一個實施例中，所選擇之CDR置於人類免疫球蛋白構架中。在一個實施例中，人類免疫球蛋白構架經進一步修飾或改變以維持移植CDR區之結合親和力特異性。
本文揭示之意外發現之一為所述抗體及抗原結合劑不緊密結合aP2蛋白質。通常，尋求具有緊密結合親和力(極低KD)之抗體及抗原結合劑，如Miao等人(參見發明背景)所報導。已發現以約10-7M之KD之較弱結合親和力結合於呈分泌(非胞質)狀態之aP2蛋白質的抗體或抗原結合劑中和分泌aP2之能力改善且對aP2介導之病症產生顯著抑制作用。在某些實施例中，抗-aP2單株抗體或抗原結合劑對人類aP2之KD在約10-4至10-6M之間。在其他實例中，抗-aP2單株抗體或抗原 結合劑對人類aP2之KD約>500nM，例如約500nM至約10μM。在另一個實施例中，抗-aP2單株抗體或抗原結合劑對人類aP2之KD為約1μM至約7μM或2μM至約5μM。在一替代實施例中，抗-aP2單株抗體對呈天然構形形式之小鼠aP2具有例如在以上指定範圍內之低結合親和力。
本發明人亦意外地發現用本文中描述之抗體處理之小鼠維持總循環aP2含量於類似於或略微低於在經對照處理之動物中看到之水準的水準下。此等發現與在更高親和力抗體，包括H3下觀測到形成對比，其中用此高親和力抗體處理小鼠引起總循環aP2含量大幅度增加10倍。在用高親和力抗體處理之小鼠中看到的aP2含量大幅度增加可歸因於一般具有短半衰期之aP2蛋白質在與高親和力aP2抗體複合時半衰期增加。
當投與有需要之宿主時，此等抗-aP2抗體及抗原結合劑中和分泌aP2之活性且與具有更高結合親和力之抗-aP2單株抗體相比，在宿主中提供較低空腹血糖含量、改善全身性葡萄糖代謝、增加全身性胰島素敏感性、減少脂肪量、肝臟脂肪變性、改善血清脂質型態及減少動脈粥樣硬化斑形成。因此，藉由向有需要之宿主、通常人類投與有效量，本文中描述之抗-aP2抗體及抗原結合劑特別適用於治療代謝病症，包括(但不限於)糖尿病(1型與2型)、高血糖症、肥胖、脂肪肝、血脂異常、多囊性卵巢症候群(POS)、增生性病症(諸如腫瘤或贅瘤，包括(但不限於)例如移行膀胱癌、卵巢癌及脂肪肉瘤)、動脈粥樣硬化及其他心血管病症。
在一個實施例中，抗-aP2抗體或抗原結合劑包括至少一個選自Seq.ID No.7-13或Seq.ID No.597-599之CDR及至少一個選自CDRH1(Seq.ID NO.14)、CDRH1變異體1(Seq.ID No.15)、CDRH1變異體2(Seq.ID No.600)、CDRH2(Seq.ID No.16)、CDRH2變異體1(Seq.ID No.17)、CDRH2變異體2(Seq.ID No.18)、CDRH2變異體3(Seq.ID No.601)、CDHR3(Seq.ID No.19)、CDHR3變異體1(Seq.ID No.20)、CDRH3變異體2(Seq.ID No.21)或CDRH3變異體3(Seq.ID No.602)之CDR，其中CDR序列移植至人類免疫球蛋白構架中。在一個實施例中，人類免疫球蛋白構架經進一步修飾或改變以維持移植CDR區之結合親和力特異性。
在某些實施例中，抗-aP2抗體或抗原結合劑至少包括輕鏈可變序列909 gL1(Seq.ID No.446)、輕鏈序列909 gL1 VL+CL(Seq.ID No.447)、輕鏈可變序列909 gL10(Seq.ID No.448)、輕鏈序列909 gL10VL+CL(Seq.ID No.449)、輕鏈可變序列909 gL13(Seq.ID No.487)、輕鏈序列909 gL13 VL+CL(Seq.ID No.489)、輕鏈可變序列909 gL50(Seq.ID No.488)、輕鏈序列909 gL50 VL+CL(Seq.ID No.490)、輕鏈可變序列909 gL54(Seq.ID No.450)、輕鏈序列909 gL54VL+CL(Seq.ID No.451)、輕鏈可變序列909 gL55(Seq.ID No.452)或輕鏈序列909 gL55 VL+CL(Seq.ID No.453)。
在其他實施例中，抗-aP2抗體或抗原結合劑包括選自909 gL1(Seq.ID No.446)、909 gL10(Seq.ID No.448)、909 gL13(Seq.ID No.487)、909 gL50(Seq.ID No.488)、909 gL54(Seq.ID No.450)或909 gL55(Seq.ID No.452)之輕鏈可變序列及選自909 gH1(Seq.ID No.455)、909 gH14(Seq.ID No.457)、909 gH15(Seq.ID No.459)、909 gH61(Seq.ID No.461)及909 gH62(Seq.ID No.463)之重鏈可變序列。舉例而言，抗體或抗原結合劑可至少包括輕鏈可變序列909 gL1(Seq.ID No.446)及重鏈可變序列909 gH1(Seq.ID.No.455)。在一個實施例中，抗-aP2抗體或抗原結合劑至少包括輕鏈可變序列909 gL10(Seq.ID No.448)及重鏈可變序列909 gH1(Seq.ID No.455)。在一個實施例中，抗-aP2抗體或抗原結合劑至少包括輕鏈可變序列909 gL10(Seq.ID No.448)及重鏈可變序列909 gH15(Seq.ID No.459)。在一個實施例中，抗-aP2抗體或抗原結合劑至少包括輕鏈可變序列909 gL1(Seq.ID No.446)及重鏈可變序列909 gH15(Seq.ID No.459)。在一個實施例中，抗-aP2抗體或抗原結合劑至少包括輕鏈可變序列909 gL13(Seq.ID No.487)及重鏈可變序列909 gH1(Seq.ID No.455)。在一個實施例中，抗-aP2抗體或抗原結合劑至少包括輕鏈可變序列909 gL13(Seq.ID No.487)及重鏈可變序列909 gH15(Seq.ID No.459)。在一個實施例中，抗-aP2抗體或抗原結合劑至少包括輕鏈可變序列909 gL50(Seq.ID No.488)及重鏈可變序列909 gH1(Seq.ID No.455)。在一個實施例中，抗-aP2抗體或抗原結合劑至少包括輕鏈可變序列909 gL50(Seq.ID No.488)及重鏈可變序列909 gH15(Seq.ID No.459)。在一個實施例中，抗-aP2抗體或抗原結合劑至少包括輕鏈可變序列909 gL54(Seq.ID No.450)及重鏈可變序列909 gH1(Seq.ID No.455)。在一個實施例中，抗-aP2抗體或抗原結合劑至少包括輕鏈可變序列909 gL54(Seq.ID No.450)及重鏈可變序列909 gH15(Seq.ID No.459)。在一個實施例中，抗-aP2抗體或抗原結合劑至少包括輕鏈可變序列909 gL55(Seq.ID No.452)及重鏈可變序列909 gH1(Seq.ID No.455)。在一個實施例中，抗-aP2抗體或抗原結合劑至少包括輕鏈可變序列909 gL55(Seq.ID No.452)及重鏈可變序列909 gH15(Seq.ID No.459)。在一個實施例中，抗-aP2抗體或抗原結合劑可至少包括輕鏈可變序列909 gL1(Seq.ID No.446)及重鏈可變序列909 gH14(Seq.ID.No.457)。在一個實施例中，抗-aP2抗體或抗原結合劑至少包括輕鏈可變序列909 gL10(Seq.ID No.448)及重鏈可變序列909 gH14(Seq.ID No.457)。在一個實施例中，抗-aP2抗體或抗原結合劑至少包括輕鏈可變序列909 gL13(Seq.ID No.487)及重鏈可變序列909 gH14(Seq.ID No.457)。在一個實施例中，抗-aP2抗體或抗原結合劑至少包括輕 鏈可變序列909 gL50(Seq.ID No.488)及重鏈可變序列909 gH14(Seq.ID No.457)。在一個實施例中，抗-aP2抗體或抗原結合劑至少包括輕鏈可變序列909 gL54(Seq.ID No.450)及重鏈可變序列909 gH14(Seq.ID No.457)。在一個實施例中，抗-aP2抗體或抗原結合劑至少包括輕鏈可變序列909 gL55(Seq.ID No.452)及重鏈可變序列909 gH14(Seq.ID No.457)。在一個實施例中，抗-aP2抗體或抗原結合劑可至少包括輕鏈可變序列909 gL1(Seq.ID No.446)及重鏈可變序列909 gH61(Seq.ID.No.461)。在一個實施例中，抗-aP2抗體或抗原結合劑至少包括輕鏈可變序列909 gL10(Seq.ID No.448)及重鏈可變序列909 gH61(Seq.ID No.461)。在一個實施例中，抗-aP2抗體或抗原結合劑至少包括輕鏈可變序列909 gL13(Seq.ID No.487)及重鏈可變序列909 gH61(Seq.ID No.461)。在一個實施例中，抗-aP2抗體或抗原結合劑至少包括輕鏈可變序列909 gL50(Seq.ID No.488)及重鏈可變序列909 gH61(Seq.ID No.461)。在一個實施例中，抗-aP2抗體或抗原結合劑至少包括輕鏈可變序列909 gL54(Seq.ID No.450)及重鏈可變序列909 gH61(Seq.ID No.461)。在一個實施例中，抗-aP2抗體或抗原結合劑至少包括輕鏈可變序列909 gL55(Seq.ID No.452)及重鏈可變序列909 gH61(Seq.ID No.461)。在一個實施例中，抗-aP2抗體或抗原結合劑可至少包括輕鏈可變序列909 gL1(Seq.ID No.446)及重鏈可變序列909 gH62(Seq.ID.No.463)。在一個實施例中，抗-aP2抗體或抗原結合劑至少包括輕鏈可變序列909 gL10(Seq.ID No.448)及重鏈可變序列909 gH62(Seq.ID No.463)。在一個實施例中，抗-aP2抗體或抗原結合劑至少包括輕鏈可變序列909 gL13(Seq.ID No.487)及重鏈可變序列909 gH62(Seq.ID No.463)。在一個實施例中，抗-aP2抗體或抗原結合劑至少包括輕鏈可變序列909 gL50(Seq.ID No.488)及重鏈可變序列909 gH62(Seq.ID No.463)。在一個實施例中，抗-aP2抗體或 抗原結合劑至少包括輕鏈可變序列909 gL54(Seq.ID No.450)及重鏈可變序列909 gH62(Seq.ID No.463)。在一個實施例中，抗-aP2抗體或抗原結合劑至少包括輕鏈可變序列909 gL55(Seq.ID No.452)及重鏈可變序列909 gH62(Seq.ID No.463)。本文中描述的含有含本文中描述之CDR之可變輕鏈及/或可變重鏈序列的抗-aP2單株抗體及必要時抗原結合劑可進一步包含針對抗體分子之所提議功能及尤其可能需要之效應功能選擇的恆定區結構域。舉例而言，恆定區結構域可為人類IgA、IgD、IgE、IgG或IgM結構域。詳言之，當抗體分子意欲用於治療性用途且需要抗體效應功能時可使用人類IgG恆定區結構域，尤其例如IgG1及IgG3同型。或者，當抗體分子意欲用於達成治療目的且不需要抗體效應功能時可使用IgG2及IgG4同型。應瞭解亦可使用此等恆定區結構域之序列變異體。舉例而言，可使用如Angal等人，Molecular Immunology,1993,30(1),105-108中所述，位置241之絲胺酸(IgG4P)已變成脯胺酸之IgG4分子且涵蓋於本文中。
在一個實施例中，抗-aP2抗體包含輕鏈可變序列兔Ab 909 VL區(Seq.ID No.445)，且進一步視情況包含重鏈可變序列兔Ab 909 VH區(Seq.ID No.454)。
在一個實施例中，描述低結合親和力單株抗-aP2抗體CA33，一種兔-小鼠雜交抗-aP2單株抗體，其包括兔909 VH(Seq.ID No.454)及909 VL(Seq.ID No.445)，其降低空腹血糖含量、改善全身性葡萄糖代謝、增加全身性胰島素敏感性且減少肥胖小鼠中脂肪量及肝臟脂肪變性。
已發現CA33以類似親和力結合於脂質結合之aP2與不含脂質之aP2(分別參見圖2H及2I)。此等資料表明CA33之功效不藉由其結合僅僅apo-aP2或僅僅攜帶特定脂質之aP2分子介導。亦已發現，CA33抗原決定基不與鉸鏈區(其含有E15、N16及F17)重疊且似乎CA33結合不 改變配位體對aP2之疏水性袋之接近。實際上，在中性pH下，在CA33存在或不存在下十八碳四烯酸結合於aP2類似，支持抗體結合於aP2不阻斷整體脂質結合之結論(參見圖2G)。
此外，已發現外源性aP2處理引起肝細胞中由叉頭框蛋白質O1(FoxO1)及轉錄共抑制物C端結合蛋白2(CtBP2)構成之新穎轉錄全複合物的解離，引起葡萄糖異生基因表現。活體內，雖然在瘦弱小鼠肝臟中容易偵測到FoxO1/CtBP2相互作用，但在肥胖之情況下(循環aP2含量顯著增加之環境)顯著減少。本文中展示，投與重組aP2減少FoxO1/CtBP2相互作用，而在aP2遺傳缺乏及抗體介導之中和之環境下相互作用增加。本文中已進一步展示肥胖小鼠肝臟中CtBP2過度表現經由抑制葡萄糖異生及脂肪生成基因表現而顯著改善葡萄糖不耐性以及肝脂肪變性。在本發明之一個實施例中，投與抗-aP2抗體用於治療包括人類之宿主中與FoxO1/CtBP2路徑誤調控相關之病症。在一個實施例中，揭示改良的FoxO1介導之病症或CtBP2介導之病症治療，其中使用本文中描述之低結合親和力aP2單株抗體靶向血清aP2且中和或調節aP2之生物活性，其中一或多種FoxO1調控或CtBP2調控之基因的表現量減少。在一個實施例中，本文提供一種調節FoxO1及/或CtBP2調控之基因之表現的方法，該方法包含向宿主投與本文中描述之低結合親和力aP2單株抗體。參見Jack等人「C-terminal binding protein：A metabolic sensor implicated in regulating adipogenesis.」Int J Biochem Cell Biol.2011年5月；43(5)：693-6；Vernochet C等人，「C/EBPalpha and the corepressors CtBP1 and CtBP2 regulate repression of select visceral white adipose genes during induction of the brown phenotype in white adipocytes by peroxisome proliferator-activated receptor gamma agonists.」Mol Cell Biol.2009年9月；29(17)：4714-28；Kajimura,S.等人「Regulation of the brown and white fat gene programs through a PRDM16/CtBP transcriptional complex.」Genes Dev.2008年5月15日；22(10)：1397-409。
抗原結合劑可呈提供所需結果之任何形式。作為非限制性實例，結合劑之形式可包括單鏈片段、Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、scFv、scAb、單域輕鏈、單域重鏈、在兩個或兩個以上片段之間包括天然存在或非天然存在之連接部分的合成抗原結合劑(例如連接兩個或兩個以上本文中描述之輕鏈CDR或具有一或多個胺基酸取代之其變異體的化合物)、結合用於靶向傳遞之抗原結合劑以及自此類抗體獲得或來源於此類抗體之任何肽。
在一個態樣中，本發明提供編碼如本文所述之抗體或片段的聚核苷酸，諸如DNA，例如如表12中所提供。亦提供一種包含該聚核苷酸之宿主細胞。
特定言之，本發明包括投與有效量之本文中描述之抗-aP2抗體或其醫藥學上可接受之組合物，其能夠降低例如血液或血清之宿主體液中分泌aP2(亦即細胞外aP2)之活性，使得例如aP2介導之病症之嚴重程度減弱，該等病症包括(但不限於)代謝、心血管、發炎、肝臟或贅生性病症或症狀。
在本發明之一個態樣中，純化之抗-aP2單株抗體或抗原結合劑以3-4埃內之接觸點獨特模式結合於人類aP2蛋白質(Seq ID.No.1)。
在一個實施例中，抗-aP2單株抗體結合具有以下胺基酸序列或其天然存在之變異體之人類aP2： (Seq.ID No.1)。
在一替代實施例中，抗-aP2單株抗體結合於具有與Seq.ID No.1至少95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的人類aP2蛋白 質。在一個實施例中，抗-aP2單株抗體結合於具有與Seq.ID No.1相比具有一或多個(例如1、2、3或4個)胺基酸取代、添加及/或缺失之胺基酸序列的人類aP2蛋白質。
在一個實施例中，抗-aP2單株抗體或抗原結合劑結合於選自以上Seq.ID No.1中加下劃線之胺基酸序列的抗原決定基。在一個實施例中，抗-aP2單株抗體直接與以上Seq.ID No.1中加粗之一或多個、例如1、2、3、4、5、6、7、8或9個胺基酸相互作用。在一個實例中，抗-aP2單株抗體或抗原結合劑結合於包含Seq.ID No.1之胺基酸9-17、胺基酸20-28或胺基酸118-132中之至少一者、例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多者的人類aP2蛋白質之抗原決定基，且視情況具有至少約10-7M之KD。
在另一實例中，抗-aP2單株抗體或其抗原結合劑結合包含一或多個、例如1、2、3、4、5、6、7、8或9或更多個選自10K、11L、12V、13S、37A、38K、57T、130E、132A(以上Seq.ID No.1中加粗)之胺基酸殘基或在10K、11L、12V、13S、37A、38K、57T、130E及132A任一者之約4埃內之胺基酸殘基的人類aP2之抗原決定基，視情況對分泌aP2之KD為約10-7M。
在一個實施例中，抗體之輕鏈結合包含一或多個、例如1、2、3、4、5、6、7、8或9或更多個選自10K、11L、12V、13S、37A、38K、57T、130E或132A之胺基酸殘基或在其約4埃內之胺基酸殘基的人類aP2之抗原決定基。在一個實施例中，抗體之輕鏈結合包含一或多個、例如1、2、3、4、5、6、7、8或9或更多個選自10K、11L、12V、13S、37A、38K、57T、130E或132A之胺基酸殘基或在其約4埃內之胺基酸殘基的人類aP2之抗原決定基，且具有至少約10-7M之KD。
在一個實施例中，抗-aP2單株抗體或抗原結合劑僅僅經由或主要 經由輕鏈CDR結合於aP2。在一替代實施例中，抗-aP2單株抗體或抗原結合劑具有以比其重鏈CDR結合於aP2大的親和力結合於aP2之輕鏈CDR。作為一個實例，抗體或抗原結合劑特異性結合aP2，且不特異性結合於FABP5/Mal1。
本文提供產生所揭示之抗-aP2抗體及抗原結合劑的方法以及將抗體或片段結合於諸如PEG之聚合物的方法。
本發明亦包括醫藥組合物，其包含有效量之抗-aP2抗體及/或抗原結合劑之一與醫藥學上可接受之載劑組合。抗-aP2單株抗體或抗原結合劑可藉由任何所需途徑，包括靜脈內、全身性、局部透皮、舌下、經頰、經口、主動脈內、局部、鼻內、眼內或經由吸入投與宿主。在一個實施例中，抗-aP2單株抗體或抗原結合劑經由控制釋放傳遞投與宿主。
呈現一種預防諸如人類之宿主中aP2介導之病症或減弱其嚴重程度之方法，其包括投與有效量之人類化抗體，例如本文中描述之抗-aP2單株抗體或抗原結合劑，使得分泌aP2之生物活性降低或減弱。藉由向有需要之宿主投與有效量的所述抗-aP2抗體及抗原結合劑之用途之非限制性實例包括以下一者或組合：(i)減少總膽固醇；(ii)減少高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)、極低密度脂蛋白(VLDL)及/或三酸甘油酯；(iii)減少空腹血糖含量；(iv)降低脂肪量水準；(v)減少肝葡萄糖產生；(vi)減少脂肪細胞之脂肪分解；(vii)減少高胰島素血症；(viii)減少肝臟脂肪變性； (ix)改善葡萄糖代謝；(x)增加胰島素敏感性；及/或(xi)預防β-細胞死亡、功能障礙或喪失。
本發明之其他特徵及優勢將自以下實施方式及申請專利範圍顯而易知。
圖1-8在以下實例1中進一步論述。
圖1A為列出如藉由生物分子相互作用分析，使用Biacore T200系統所測定，抗-aP2單株抗體(CA33、CA13、CA15、CA23及H3)對人類及小鼠aP2之結合親和力(KD(m))的表。
圖1B為描述用媒劑或抗-aP2抗體治療肥胖小鼠(高脂肪飲食(HFD)餵食)之活體內研究設計及抗體方案的示意圖。小鼠(21週齡)在抗體投與前餵食HFD15週(各組n=10)。抗-aP2抗體藉由皮下注射投與，濃度為33mg/kg，每週兩次。
圖1C為展示用媒劑或抗-aP2單株抗體CA33、CA13、CA15、CA23或H3處理之小鼠中第0週(空心柱)或第4週(實心柱)血漿胰島素含量(ng/ml)的柱狀圖。*p<0.05。
圖1D為展示用媒劑或抗-aP2單株抗體CA33、CA13、CA15、CA23或H3處理之高脂肪飲食(HFD)肥胖小鼠中第0週(空心柱)或第4週(實心柱)血糖含量(mg/dl)的柱狀圖。在白天取回食物之後6小時量測血糖含量。* p<0.05，** p<0.01。
圖1E為展示在葡萄糖耐受性測試(GTT)期間葡萄糖含量(mg/dl)相對於時間(分鐘)之線圖。測試在HFD肥胖小鼠中用媒劑(菱形)或抗-aP2單株抗體(0.75g/kg葡萄糖)(CA33；正方形)(CA15；三角形)處理2週之後進行。* p<0.05。
圖1F為展示在胰島素耐受性測試(ITT)期間胰島素含量(mg/dl)相 對於時間(分鐘)之線圖。此測試在HFD肥胖小鼠中用媒劑(菱形)或抗-aP2單株抗體(0.75IU/kg胰島素)(CA33；正方形)(CA15；三角形)處理3週之後進行。** p<0.01。
圖1G為展示用媒劑或抗-aP2單株抗體CA33、CA13、CA15、CA23或H3處理之小鼠中第0週(空心柱)或第4週(實心柱)體重(g)之柱狀圖。體重在餵食狀態下量測。* p<0.05。
圖2A為如藉由octet分析所測定，與相關蛋白質FABP3(灰色柱)及FABP5/Mal1(淡灰色柱)相比，抗-aP2抗體CA33及H3針對aP2(黑色柱)之信號相互作用(nm)的柱狀圖。
圖2B為如藉由ELISA所測定，在用媒劑、CA33或H3處理3週之HFD餵食小鼠中血漿aP2含量(ng/ml)之柱狀圖(每組n=10隻小鼠)。在實驗開始前，小鼠進行HFD 12週。偵測來自各組(媒劑、CA33或H3)之三隻小鼠之血清中aP2的西方墨點法展示在插圖中。** p<0.01。
圖2C為如藉由Biacore分析所測定，H3相對於CA33、CA13、CA15及CA23之抗體交叉阻斷的表。++=完全阻斷；+=部分阻斷；-=無交叉阻斷。
圖2D展示如藉由氫-氘交換質譜分析(HDX)鑑別，涉及與CA33及H3之相互作用中之aP2殘基的抗原決定基序列。相互作用殘基加下劃線。
圖2E為與aP2共結晶之CA33之Fab及與aP2共結晶之H3之Fab的疊加影像。
圖2F為aP2上CA33抗原決定基之高解析度定位。指示兩種分子中之相互作用殘基。氫鍵展示為短劃線。aP2中K10之側鏈與Y92之苯基側鏈形成疏水相互作用。
圖2G為展示在IgG對照抗體(圓圈)或CA33抗體(正方形)存在下十八碳四烯酸結合於aP2(相對螢光)相對於pH之線圖。
圖2H為展示回應於增加濃度之脂質負載之aP2，CA33結合於aP2(共振單位)相對於時間(秒)之圖。
圖2I為展示回應於增加濃度之去脂質化aP2，CA33結合於aP2(共振單位)相對於時間(秒)之圖。
圖3A為展示在CA33抗體或媒劑處理三週之前(空心柱)及之後(實心柱)HFD誘發之肥胖aP2-/-小鼠中空腹血糖(mg/dl)的柱狀圖。
圖3B為展示在CA33抗體或媒劑處理三週之前(空心柱)及之後(實心柱)HFD誘發之肥胖aP2-/-小鼠中體重(g)的柱狀圖。
圖3C為展示在葡萄糖耐受性測試(GTT)期間HFD誘發之肥胖aP2-/-小鼠中葡萄糖含量(mg/dl)相對於時間(分鐘)的線圖。測試在aP2-/-小鼠中2週媒劑(三角形)或CA33抗體處理(正方形)之後進行。
圖3D為展示ob/ob小鼠中在CA33抗體或媒劑處理3週之前(空心柱)及之後(實心柱)體重(g)的柱狀圖(每組n=10隻小鼠)。** p<0.01。
圖3E為展示ob/ob小鼠中在CA33抗體或媒劑處理3週之前(空心柱)及之後(實心柱)空腹血糖含量(mg/dl)的柱狀圖(每組n=10隻小鼠)。** p<0.01。
圖3F為展示ob/ob小鼠中在媒劑(空心柱)或CA33抗體處理(實心柱)三週後血漿胰島素含量(ng/ml)的柱狀圖。** p<0.01。
圖3G為展示在葡萄糖耐受性測試(GTT)期間ob/ob小鼠中葡萄糖含量(mg/dl)相對於時間(分鐘)之線圖。測試在aP2-/-小鼠中2週媒劑(三角形)或CA33抗體處理(正方形)之後進行。* p<0.05。
圖4A為在用媒劑或CA33處理5週之後來自HFD誘發之肥胖小鼠的蘇木精及曙紅(H&E)染色肝臟之代表性影像。比例尺為50μm。
圖4B為在用媒劑(空心柱)或CA33抗體(實心柱)處理5週之後HFD誘發之肥胖小鼠中肝臟三酸甘油酯(TG)含量(mg/g組織)之柱狀圖。* p<0.05。
圖4C為展示在媒劑(黑色柱)或CA33處理(灰色柱)5週之後來自HFD誘發之肥胖小鼠之肝臟樣品中脂肪生成基因硬脂醯基-CoA去飽和酶(Scd1)、脂肪酸合成酶(Fasn)及乙醯基-CoA羧化酶(Acc1)之mRNA表現的柱狀圖。** p<0.01。
圖4D為展示在媒劑(空心柱)或CA33處理(實心柱)5週之後HFD誘發之肥胖小鼠中血漿非酯化脂肪酸(NEFA)之含量(mg/ml)的柱狀圖。** p<0.01。
圖4E為展示在媒劑(空心柱)或CA33處理(實心柱)5週之後HFD誘發之肥胖小鼠中血漿丙三醇之含量(mg/ml)的柱狀圖。* p<0.05。
圖4F為展示在媒劑(空心柱)或CA33處理(實心柱)5週之後HFD誘發之肥胖小鼠中血漿總膽固醇之含量(mg/dl)的柱狀圖。* p<0.05。
圖4G為展示在媒劑(空心柱)或CA33處理(實心柱)5週之後HFD誘發之肥胖小鼠中血漿三酸甘油酯之含量(mg/dl)的柱狀圖。
圖4H為展示在媒劑(空心柱)或CA33處理(實心柱)5週之後HFD誘發之肥胖小鼠中FABP3或FABP5(Mal1)之含量(ng/ml)的柱狀圖。
圖4I為展示在媒劑(空心柱)或CA33處理(實心柱)5週之後HFD誘發之肥胖小鼠中血漿升糖素之含量(pg/ml)的柱狀圖。
圖4J為展示在媒劑(空心柱)或CA33處理(實心柱)5週之後HFD誘發之肥胖小鼠中血漿脂聯素之含量(μg/ml)的柱狀圖。
圖5A為在媒劑或CA33處理5週之後，如藉由雙能X射線吸光測定法(DEXA)所測定，體脂量(g)(空心柱)及肌肉量(g)(灰色柱)之柱狀圖。(每組n=10)。* p<0.05。
圖5B為展示在媒劑(空心柱)或CA33處理(實心柱)5週之後肥胖小鼠之肝臟重量(g)及體重%的柱狀圖。** p<0.01。
圖5C為展示在媒劑(空心柱)或CA33處理(實心柱)5週之後光中或黑暗中小鼠之身體活動(活性單元-AU)之柱狀圖。
圖5D為展示在小鼠經媒劑(空心柱)或CA33處理5週(實心柱)之後HFD肥胖小鼠中總食物攝入(g)的柱狀圖(每組n=8)。
圖5E為展示與媒劑(空心柱)相比，用CA33(實心柱)處理八週之小鼠中在光及黑暗週期期間按體積計VO2濃度的柱狀圖。
圖5F為展示與媒劑(空心柱)相比，用CA33(實心柱)處理八週之小鼠中在光及黑暗週期期間計算之呼吸交換比率(RER)的柱狀圖。
圖5G為展示與媒劑(空心柱)相比，用CA33(實心柱)處理八週之小鼠中棕色脂肪組織(BAT)之重量的柱狀圖。
圖5H展示與媒劑(空心柱)相比，用CA33(實心柱)處理八週之後小鼠中BAT之代表性H&E染色切片。
圖5I為展示在小鼠經媒劑(空心柱)或CA33處理5週(實心柱)之後肥胖小鼠中圍生殖腺白色脂肪組織(PGWAT)之重量的柱狀圖。** p<0.01。
圖5J為在用媒劑(左側影像)或CA33(右側影像)處理5週之後蘇木精及曙紅(H&E)染色之附睾脂肪組織之代表性影像。比例尺為200μm。
圖5K為展示在小鼠經媒劑(空心柱)或CA33(實心柱)處理5週之後，藉由FACS測定之脂肪組織中F4/80+Mac細胞(%)的柱狀圖。
圖5L為展示在小鼠經媒劑(空心柱)或CA33(實心柱)處理5週之後，藉由FACS分析測定之脂肪組織中CD11b+細胞(%)的柱狀圖。
圖5M為展示在小鼠經媒劑(空心柱)或CA33(實心柱)處理5週之後，圍生殖腺白色脂肪組織(PG-WAT)中TNF、IL-1β、IL-6、CCL2、CXCL1、F4/80或CD68之mRNA含量(mRNA/Tbp)的柱狀圖。
圖5N為展示用媒劑或CA33處理3週之小鼠中脂肪組織aP2/FABP4蛋白質含量的西方墨點法。包括來自aP2-/-、mal1-/-及aP2/mal1-/-動物之脂肪組織樣品作為蛋白質對照。β-微管蛋白展示為內參考物。
圖5O為展示用媒劑或CA33處理3週之小鼠中脂肪組織Mal1/FABP5蛋白質含量的西方墨點法。包括來自aP2-/-、mal1-/-及aP2/mal1-/-動物之脂肪組織樣品作為蛋白質對照。β-微管蛋白展示為內參考物。
圖5P為用媒劑或CA33處理3週之小鼠中aP2或mal1之相對蛋白質含量的柱狀圖。圖5P中展示之結果定量圖5N及5O中所示之西方墨點。
圖6A為展示葡萄糖異生基因磷酸烯醇丙酮酸羧激酶1(Pck1)及葡萄糖-6-磷酸酶(G6pc)之mRNA表現的柱狀圖。在白天取回食物6小時之後，自用媒劑(空心柱)或CA33(實心柱)處理4週之肥胖小鼠收集肝臟樣品(各組n=10)。* p<0.05。
圖6B為展示肝臟樣品中Pck1酶活性(nM/min/g)之柱狀圖。在白天取回食物6小時之後，自用媒劑(空心柱)或CA33(實心柱)處理4週之肥胖小鼠收集肝臟樣品(各組n=10)。* p<0.05。
圖6C為展示用媒劑(空心柱)或CA33(實心柱)處理四週之小鼠的肝臟微粒體部分中葡萄糖-6-磷酸酶(G6pc)之酶活性(U/mg)的柱狀圖(各組n=10)。* p<0.05。
圖6D為展示在高胰島素-正常血糖鉗夾術期間血糖(mg/dl)相對於時間的線圖。在高脂肪飲食(HFD)之肥胖小鼠中在用媒劑(菱形)或CA33(正方形)處理五週之後進行鉗夾研究(各組n=7)。
圖6E為展示在高脂肪飲食(HFD)之肥胖小鼠中在用媒劑(空心柱)或CA33(實心柱)處理五週之後葡萄糖輸注速率(GIR)(mg/kg/min)的柱狀圖。* p<0.05。
圖6F為展示在高脂肪飲食(HFD)之肥胖小鼠中在用媒劑(空心柱)或CA33(實心柱)處理五週之後鉗夾肝葡萄糖產生(c-HGP)(mg/kg/min)的柱狀圖。* p<0.05。
圖6G為展示在高脂肪飲食(HFD)之肥胖小鼠中在用媒劑(空心柱)或CA33(實心柱)處理五週之後全身葡萄糖消失速率(RD)(mg/kg/min)的柱狀圖。* p<0.05。
圖6H為展示HFD肥胖小鼠中在用媒劑(空心柱)或CA33(實心柱)處理五週之後小腿三頭肌中葡萄糖吸收(mg/kg/min)之柱狀圖。* p<0.05。
圖6I為展示高脂肪飲食(HFD)肥胖小鼠中在用媒劑(空心柱)或CA33(實心柱)處理五週之後全身糖酵解之柱狀圖。* p<0.05。
圖7A為展示在使用高親和力抗體(CA13、CA15、CA23及H3)相對於媒劑對照進行選擇性抗體處理兩週之後，在葡萄糖耐受性測試(GTT)中葡萄糖含量(mg/dl)相對於時間(分鐘)之線圖。
圖7B為展示在使用高親和力抗體(CA13、CA15、CA23及H3)相對於媒劑對照進行選擇性抗體處理三週之後，在胰島素耐受性測試(ITT)中葡萄糖含量(mg/dl)相對於時間(分鐘)之線圖。
圖8A為展示在HFD小鼠之高胰島素-正常血糖鉗夾術期間媒劑對照(空心柱)或CA33(實心柱)處理之小鼠中基礎肝葡萄糖產生(mg/kg/min)之柱狀圖。
圖8B為展示在HFD小鼠之高胰島素-正常血糖鉗夾術期間CA33小鼠(實心柱)或媒劑對照小鼠(空心柱)之血清胰島素含量(ng/ml)之柱狀圖。** p<0.01。
圖8C為展示在HFD小鼠之高胰島素-正常血糖鉗夾術期間媒劑對照小鼠(空心柱)或CA33處理小鼠(實心柱)中性腺白色脂肪組織(GWAT)中葡萄糖吸收(mg/kg/min)之柱狀圖。
圖9-16進一步論述於以下實例2中。
圖9為說明1型糖尿病之NOD小鼠模型中糖尿病發病率(%)相對於時間(處理週數)之線圖。NOD小鼠用媒劑(菱形)或aP2單株抗體CA33 (正方形)處理。
圖10為說明1型糖尿病之NOD小鼠模型中死亡速率(%)相對於時間(處理週數)之線圖。NOD小鼠用媒劑(菱形)或aP2單株抗體CA33(正方形)處理。
圖11A及11B：NOD aP2+/+及NOD aP2-/-小鼠經受葡萄糖耐受性測試(GTT)(圖11A)及胰島素耐受性測試(ITT)(圖11B)。
圖12為展示在用低或高葡萄糖刺激之後來自NOD aP2+/+及NOD aP2-/-小鼠胰島之胰島素(ng/ml/μg DNA)分泌的柱狀圖。
圖13說明在胰臟切開之後，與NOD aP2+/+小鼠相比，NOD aP2-/-小鼠中可見之胰島數目。
圖14A及圖14B：說明染色β細胞(圖14A)，隨後在NOD aP2+/+及NOD aP2-/-小鼠中定量其(圖14B)。
圖15A及圖15B：在用低或高葡萄糖刺激之後來自Ins-1 β細胞(圖15A)或自aP2-/-小鼠分離之初級胰島(圖15B)之胰島素(ng/ml/μg DNA)分泌的柱狀圖。
圖16為小鼠中1型糖尿病之誘導模型之圖(大鼠胰島素啟動子-淋巴細胞性脈絡叢腦膜炎病毒-醣蛋白，或RIP-LCMV-GP，小鼠)。小鼠注射LCMV，引起β-細胞之破壞及糖尿病出現。
圖17為展示一組aP2-/-小鼠(組C)及每週注射33mg/kg CA33(組B)或PBS對照(組A)兩次且餵食正常飲食之aP2-正常小鼠中1型糖尿病誘發之小鼠模型(RIP-LCMV-GP小鼠)中aP2-抗體投與時程的示意圖。
圖18為展示一組aP2-/-(三角形)小鼠及每週注射33mg/kg CA33(正方形)或對照(PBS)(圓圈)兩次且餵食正常飲食之aP2-正常小鼠中1型糖尿病誘發之小鼠模型(RIP-LCMV-GP小鼠)中6小時空腹血糖量測值(mg/dl)相對於時間(天)的線圖。與媒劑處理之動物相比，CA33處理及aP2缺乏之動物在LCMV投與之後具有顯著較低之空腹血糖。* p< 0.05，** p<0.01，*** p<0.005。
圖19為展示一組aP2-/-(三角形)小鼠及每週注射33mg/kg CA33(正方形)或對照(PBS)(圓圈)兩次且餵食高脂肪飲食之aP2-正常小鼠中1型糖尿病誘發之小鼠模型(RIP-LCMV-GP小鼠)中1型糖尿病發病率的柱狀圖。糖尿病定義為6小時空腹血糖量測值超過250mg/dl。類似於在aP2遺傳缺乏之動物中所觀測，CA33處理使RIP-LCMV-GP模型避免出現1型糖尿病。
圖20A為展示GP+對照小鼠、GP+ aP2-/-小鼠或用CA33處理之GP+小鼠中在注射LCMV 14天之後胰島浸潤(%；無胰島炎(空心柱)；胰島周炎(格紋柱)；輕度胰島炎(灰色柱)；嚴重胰島炎(黑色柱))的柱狀圖。藉由在LCMV感染前14天開始，每週注射兩次將小鼠用1.5mg CA33或媒劑處理。對H&E染色之胰臟切片進行胰島炎評分。各胰島評分為「無胰島炎」、「胰島周炎」、「輕度胰島炎」或「嚴重胰島炎」。柱狀圖代表各分析動物中各胰島類型之百分比。
圖20B為展示幾乎無胰島炎之胰島的代表性圖像。
圖20C為展示嚴重胰島炎之胰島的代表性圖像。
圖20D為展示GP+對照小鼠、GP+ aP2-/-小鼠或用CA33處理之GP+小鼠中在注射LCMV 14天之後具有輕度胰島炎之胰島(%)的柱狀圖。藉由在LCMV感染前14天開始，每週注射兩次將小鼠用1.5mg CA33或媒劑處理。* p<0.05；** p<0.01。
圖20E為展示GP+對照小鼠、GP+ aP2-/-小鼠或用CA33處理之GP+小鼠中在注射LCMV 14天之後具有嚴重胰島炎之胰島(%)的柱狀圖。藉由在LCMV感染前14天開始，每週注射兩次將小鼠用1.5mg CA33或媒劑處理。** p<0.01；*** p<0.005。
圖21A為GP+對照小鼠、GP+ aP2-/-小鼠或用CA33處理之GP+小鼠中在注射LCMV 14天之後針對ATF6(左欄)或XBP1(右欄)染色之胰 島的一系列代表性影像。藉由在LCMV感染前14天開始，每週注射兩次將小鼠用1.5mg CA33或媒劑處理。
圖21B為展示來自GP+對照小鼠、GP+ aP2-/-小鼠或用CA33處理之GP+小鼠在注射LCMV 14天之後的胰臟樣品中ATF6含量(相對螢光強度，RFI)之柱狀圖。藉由在LCMV感染前14天開始，每週注射兩次將小鼠用1.5mg CA33或媒劑處理。** p<0.01；*** p<0.005。
圖21C為展示來自GP+對照小鼠、GP+ aP2-/-小鼠或用CA33處理之GP+小鼠在注射LCMV 14天之後的胰臟樣品中sXBP1含量(相對螢光強度，RFI)之柱狀圖。藉由在LCMV感染前14天開始，每週注射兩次將小鼠用1.5mg CA33或媒劑處理。** p<0.01；*** p<0.005。
圖22-26在以下實例3中進一步論述。
圖22A為提供抗體劑量(μg)及注射體積(μl)計算以在指示時間點(週)，基於ApoE基因剔除小鼠(動脈粥樣硬化小鼠模型)之平均體重實現33mg/kg劑量之表。
圖22B為展示用PBS(圓圈)、CA33(正方形)或CA15(三角形)處理之ApoE基因剔除小鼠中動脈粥樣硬化病變區域(%)的圖。將來自處死之ApoE基因剔除小鼠的主動脈自近端主動脈至髂分叉剝離，且在縱向製劑中引出主動脈。縱向引出之主動脈用Sudan IV染色。使用NIH研發之ImageJ軟體定量病變區域。在軟體中界定引出之主動脈的外周以建立主動脈之總區域為白色背景。接著量測用Sudan IV染紅之病變區域百分比且藉由軟體計算。* p<0.05。
圖22C為來自餵食西方飲食且用媒劑處理十二週的ApoE基因敲除小鼠之縱向引出之主動脈的代表性影像。
圖22D為來自餵食西方飲食且用CA33(33mg/kg)處理十二週的ApoE基因敲除小鼠之縱向引出之主動脈的代表性影像。
圖22E為來自餵食西方飲食且用CA15(33mg/kg)處理十二週的 ApoE基因敲除小鼠之縱向引出之主動脈的代表性影像。
圖22F為展示用PBS(圓圈)、CA33(正方形)或CA15(三角形)處理十二週之小鼠中ApoE基因剔除小鼠之平均體重(g)相對於年齡(週齡)的線圖。ApoE基因剔除小鼠餵食西方飲食且用媒劑或抗體(33mg/kg)處理十二週。
圖23A為展示用PBS(黑色柱)、CA33(淡灰色柱)或CA15(灰色柱)處理十二週之ApoE基因剔除小鼠之平均體重(g)的柱狀圖。ApoE基因剔除小鼠餵食西方飲食且用媒劑或抗體(33mg/kg)處理十二週。經CA33處理之小鼠展示比經媒劑處理之小鼠統計學上顯著更低之平均體重。* p<0.05。
圖23B為展示用PBS(黑色柱)、CA33(淡灰色柱)或CA15(灰色柱)處理十二週之ApoE基因剔除小鼠之肝臟重量(g)的柱狀圖。ApoE基因剔除小鼠餵食西方飲食且用媒劑或抗體(33mg/kg)處理十二週。經CA33處理之小鼠展示比經媒劑處理之小鼠統計學上顯著更低之平均肝臟重量。* p<0.05。
圖23C為展示用PBS(黑色柱)、CA33(淡灰色柱)或CA15(灰色柱)處理十二週之ApoE基因剔除小鼠之減去肝臟重量之體重(g)的柱狀圖。ApoE基因剔除小鼠餵食西方飲食且用媒劑或抗體(33mg/kg)處理十二週。經CA33處理之小鼠展示比經媒劑處理之小鼠更低之減去肝臟重量之平均體重。
圖23D為展示經PBS(黑色柱)、CA33(淡灰色柱)或CA15(灰色柱)處理十二週之ApoE基因剔除小鼠之平均體重、肌肉量或脂肪量(g)的柱狀圖。ApoE基因剔除小鼠餵食西方飲食且用媒劑或抗體(33mg/kg)處理十二週，且藉由雙X射線吸光(DEXA)光譜分析量測體重、肌肉量及脂肪量。
圖24A為在用PBS(黑色柱)、CA33(淡灰色柱)或CA15(灰色柱) 處理之ApoE基因剔除小鼠中葡萄糖耐受性測試前空腹基礎葡萄糖含量(mg/dl)之柱狀圖。ApoE基因剔除小鼠餵食西方飲食且用媒劑或抗體(33mg/kg)處理十二週。經CA33處理之小鼠具有比經媒劑處理之小鼠統計學上顯著更低之空腹血糖。* p<0.05。
圖24B為在用PBS(三角形)、CA33(正方形)或CA15(圓圈)處理之ApoE基因剔除小鼠中葡萄糖耐受性測試期間葡萄糖含量(mg/dl)相對於時間(分鐘)之線圖。ApoE基因剔除小鼠餵食西方飲食且用媒劑或抗體(33mg/kg)處理十二週。葡萄糖耐受性測試藉由在空腹隔夜(16h)之後對有意識之小鼠經口投與葡萄糖(1.0g/kg)來進行。
圖25A為在用PBS(三角形)、CA33(正方形)或CA15(圓圈)處理六週之ApoE基因剔除小鼠中脂蛋白部分(mg/dl)(總脂蛋白、極低密度脂蛋白(VLDL)、低密度脂蛋白(LDL)或高密度脂蛋白(HDL))中膽固醇的柱狀圖。藉由快速高效液相層析法(FPLC)，使用彙集之血漿樣品測定脂蛋白之粒徑分佈。* p<0.05。
圖25B為在用PBS(三角形)、CA33(正方形)或CA15(圓圈)處理十二週之ApoE基因剔除小鼠中脂蛋白部分(mg/dl)(總脂蛋白、極低密度脂蛋白(VLDL)、低密度脂蛋白(LDL)或高密度脂蛋白(HDL))中膽固醇的柱狀圖。藉由快速高效液相層析法(FPLC)，使用彙集之血漿樣品測定脂蛋白之粒徑分佈。* p<0.05。
圖26A為在用PBS(三角形)、CA33(正方形)或CA15(圓圈)處理六週之ApoE基因剔除小鼠中脂蛋白部分(mg/dl)(總脂蛋白、極低密度脂蛋白(VLDL)、低密度脂蛋白(LDL)或高密度脂蛋白(HDL))中三酸甘油酯的柱狀圖。藉由快速高效液相層析法(FPLC)，使用彙集之血漿樣品測定脂蛋白之粒徑分佈。* p<0.05。
圖26B為在用PBS(三角形)、CA33(正方形)或CA15(圓圈)處理十二週之ApoE基因剔除小鼠中脂蛋白部分(mg/dl)(總脂蛋白、極低密 度脂蛋白(VLDL)、低密度脂蛋白(LDL)或高密度脂蛋白(HDL))中三酸甘油酯的柱狀圖。藉由快速高效液相層析法(FPLC)，使用彙集之血漿樣品測定脂蛋白之粒徑分佈。* p<0.05。
圖27-28進一步論述於以下實例4中。
圖27提供抗人類aP2人類化κ輕鏈可變區抗體片段，其中909序列為兔可變輕鏈序列，且909 gL1、gL10、gL13、gL50、gL54及gL55序列為使用IGKV1-17人類生殖系作為接受體構架的909可變輕鏈之人類化移植物。CDR以粗體/下劃線展示，而適用供體殘基以粗體/斜體展示且突出顯示：2V、3V、63K及70D。CDRL3中移除半胱胺酸殘基之突變以粗體/下劃線展示且突出顯示：90A。
圖28提供抗人類aP2人類化重鏈可變區抗體片段，其中909序列為兔可變重鏈序列，且909gH1、gH14、gH15、gH61及gH62序列為使用IGHV4-4人類生殖系作為接受體構架的909可變重鏈之人類化移植物。CDR以粗體/下劃線展示。β片股D與E之間的環中構架3中之兩殘基間隙在gH1中突出顯示：75及76。適用供體殘基以粗體/斜體展示且突出顯示：23T、67F、71K、72A、73S、74T、77T、78V、79D、89T及91F。CDRH2中移除半胱胺酸殘基之突變以粗體/下劃線展示且突出顯示：59S。CDRH3中移除潛在天冬胺酸鹽異構化位點之突變以粗體/下劃線展示且突出顯示：98E。N端麩醯胺酸殘基經麩胺酸置換，且以粗體展示及突出顯示：1E。
圖29-31進一步論述於以下實例5中。
圖29為表示aP2與鼠類來源之抗-aP2抗體之間的關鍵接觸點之圖示。如圖中所示，重鏈及輕鏈之CDR區下特定胺基酸殘基之取代引起改變抗體之親和力與親本抗體H3相比減少。
圖30A提供用於誘導鼠類來源之抗-aP2抗體中與親本抗體H3相比結合親和力減少的胺基酸取代，其中g1=野生型親本H3。展示CA33之 結合親和力(μM)及兩種親和力減少之H3樣抗體。
圖30B提供詳述用於誘導鼠類來源之抗-aP2抗體中與親本抗體H3相比結合親和力減少之胺基酸取代的重鏈之蛋白質序列，其中g1=野生型親本H3。CDR加下劃線且胺基酸取代以粗體展示。
圖30C提供詳述用於誘導鼠類來源之抗-aP2抗體中與親本抗體H3相比結合親和力減少之胺基酸取代的輕鏈之蛋白質序列，其中g1=野生型親本H3。CDR加下劃線且胺基酸取代以粗體展示。
圖31為指示已突變以減少結合親和力之鼠類來源之抗-aP2抗體對人類及小鼠aP2的親和力資料的表。展示各抗體(APP5168/PB1172及APP5169/PB1171)對兩種純系之結合親和力(KD)且展示平均結合親和力(KD)(μM)。
圖32-45在以下實例6中進一步論述。
圖32說明aP2以FoxO1依賴性方式調控葡萄糖異生基因表現。將初級肝細胞與或不與50μg/ml aP2一起在2μM弗斯可林(forskolin，fsk)存在或不存在下培育3小時(圖32A、32B、32C、32D及32E)或6小時(圖32F)。圖32A及32B展示弗斯可林刺激對aP2對肝細胞中葡萄糖異生基因表現(分別G6pc及Pck1)之作用的影響，以及在此過程中aP2脂質結合之作用(n=4)。mut：脂質結合突變體，delip：去脂質化aP2，WT：脂質負載之aP2。圖32C說明藉由siRNA介導之基因表現阻斷及對弗斯可林及aP2刺激之G6pc表現的作用篩選轉錄因子(n=4)。圖32D說明腺病毒介導之FoxO1基因表現阻斷對aP2介導之G6pc表現的作用(n=4)。圖32E說明蛋白質層面下FoxO1之基因表現阻斷功效。圖32F說明初級肝細胞中FHRE螢光素酶活性之aP2刺激作用(n=6)。圖32G說明在腺病毒介導之FoxO1基因表現阻斷及aP2刺激之後葡萄糖自肝細胞之產生(n=5)。資料表示為平均值±SEM。*、**及NS分別表示p<0.05，p<0.01及無顯著差異，藉由史都登氏t檢驗(Student's t-test)測 定。
圖33說明aP2改變脂肪酸代謝以調控葡萄糖異生基因表現。圖33A及圖33B分別展示來自與媒劑或50μM乙莫克舍(Etomoxir)一起預培育30分鐘且在2μM弗斯可林(fsk)存在或不存在下用50μg/ml aP2刺激3小時之初級肝細胞的G6pc及Pck1表現之列表結果(n=4)。圖33C及圖33D展示當初級肝細胞用50μg/ml aP2刺激2小時且用150μM棕櫚酸酯(圖33C)或150μM油酸酯(圖33D)刺激指示時間量時獲得的結果以量測耗氧速率(OCR，圖33C,n=6)或脂肪酸攝入(圖33D，n=5)。圖33E及圖33F分別說明當初級肝細胞用50μg/ml aP2刺激2小時且細胞在2μM弗斯可林(fsk)/100μM棕櫚酸酯存在或不存在下用50μg/ml aP2進一步刺激3小時時G6pc及Pck1所獲得之mRNA含量(n=4)。圖33G及圖33H分別說明當初級肝細胞與5μM三氮菌素C一起預培育30分鐘且在相同濃度三氮菌素C存在或不存在下如圖33D中進一步處理時G6pc及Pck1所獲得之mRNA含量(n=4)。圖33I說明初級肝細胞中在其用媒劑或aP2處理之後核脂肪醯基-CoA含量(pmol/106個細胞)。資料表示為平均值±SEM。*、**及NS分別表示p<0.05，p<0.01及無顯著差異，藉由史都登氏t檢驗測定。
圖34證實藉由aP2調控之新穎FoxO1/CtBP2轉錄複合物的存在。初級肝細胞在2μM弗斯可林(fsk)存在或不存在下用50μg/ml aP2(圖34A、圖34B、圖34H、圖34L、圖34M及圖34N)刺激3小時(圖34A及圖34B)或90分鐘(圖34H、圖34K、圖34M及圖34N)。圖34A及圖34B分別展示腺病毒介導之CtBP1及CtBP2基因表現阻斷對aP2誘發之G6pc及Pck1表現的作用(n=4)。圖34C展示如矩形所指示，人類及小鼠FoxO序列中PxDLS樣基元。圖34D及圖34E分別展示藉由CtBP或FoxO1之往復免疫共沈澱所示的初級肝細胞中內源性FoxO1/CtBP複合物。圖34F及圖34G說明FoxO1/CtBP2複合物中PxDL基元之關鍵作用。將 HEK293細胞用對照質體、FLAG野生型FoxO1或突變FLAG-FoxO1(Mut：PSDL>PSAS，△psdl：PxDL基元缺失)以及CtBP2表現質體轉染。複合物用FLAG瓊脂糖珠粒免疫沈澱。圖34H展示藉由aP2處理，天然FoxO1/CtBP2複合物解離。內源性FoxO1/CtBP2複合物自初級肝細胞免疫沈澱。圖34I及圖34J展示FoxO1/CtBP2複合物之營養感測能力。HEK293細胞經FLAG野生型FoxO1及CtBP2轉染。遞增濃度之油醯基-CoA(0、50、150、500μM)(圖34I)或NADH(0、10、30、100μM)(圖34J)添加至細胞溶解物中且用FLAG瓊脂糖珠粒免疫沈澱。圖34K展示胞質氧化還原狀態對FoxO1/CtBP2複合物之作用。HEK293細胞經FLAG野生型FoxO1及CtBP2轉染且與不同比率之乳酸鹽及丙酮酸鹽一起培育1小時。圖34L說明弗斯可林及aP2處理對FoxO1及CtBP2之核/質定位之作用。NE：核提取物。圖34M及34N分別展示在G6pc啟動子，FoxO1或CtBP2之染色質免疫沈澱(ChIP)分析(n=4)。資料表示為平均值±SEM。*及**分別表示p<0.05且p<0.01，藉由史都登氏t檢驗測定。
圖35展示CtBP2對葡萄糖異生基因表現之細微調控。在CtBP2之基因表現阻斷(圖35A、圖35B)或過度表現(圖35C、圖35D、圖35E、圖35F)之後初級肝細胞用媒劑或2μM弗斯可林(fsk)刺激3小時(圖35A、圖35D及圖35E)或6小時(圖35B、圖35F)。圖35A展示CtBP2及/或FoxO1基因表現阻斷對G6pc表現之作用(n=5)。y軸比例在插圖中展開以更清晰地展示在fsk不存在下之資料。圖35B展示CtBP2基因表現阻斷之後FHRE螢光素酶活性(n=8)。圖35C展示初級肝細胞中GUS及CtBP2過度表現。圖35D及35E展示CtBP2過度表現對葡萄糖異生基因表現之調控(n=4)。圖35F展示CtBP2過度表現之後FHRE螢光素酶活性(n=8)。圖35G展示胰島素及cAMP信號傳導之急性活化對FoxO1/CtBP2複合物之作用。經FLAG-FoxO1及CtBP2轉染之HEK293 細胞用媒劑、100nM胰島素(ins)或50μM弗斯可林(fsk)刺激30分鐘。
圖36展示活體內內源性FoxO1/CtBP2複合物之調控。圖36A、圖36C、圖36E、圖36G及圖36J：來自以下各組小鼠之肝臟勻漿經受免疫共沈澱以分析內源性FoxO1/CtBP2複合物。所有小鼠在4-6小時空腹之後處死。密度量測術定量展示在各墨點右側；參見圖36B、圖36D、圖36F、圖36H及圖36K。圖36A及圖36B：遺傳肥胖ob/ob小鼠及其對照瘦弱小鼠。圖36C及圖36D：飲食誘發之肥胖小鼠(高脂肪飲食(HFD)16週)及其對照瘦弱小鼠(正常食物(NC))。圖36E及圖36F：正常食物(NC)或高脂肪飲食(HFD)16週之aP2基因敲除(KO)或其對照野生型(WT)小鼠。圖36G及圖36H：用單株aP2抗體(CA33)或媒劑處理的飲食誘發之肥胖小鼠(HFD)及對照瘦弱小鼠(NC)。圖36I、圖36J、圖36K、圖36L及圖36M：重組aP2投與野生型瘦弱小鼠5天。分析血清aP2含量(圖36I)及FoxO1/CtBP2複合物(圖36J及圖36K)、肝臟中基因表現(圖36L及圖36M)(n=4)。圖36N展示在轉導5天之後野生型瘦弱小鼠之肝臟中CtBP2之腺病毒介導之基因表現阻斷的結果(n=6)。*及**分別表示p<0.05且p<0.01，藉由史都登氏t檢驗測定。
圖37：肝臟中CtBP2功能獲得改善葡萄糖耐受性且改善肥胖小鼠之脂肪變性。藉由腺病毒轉導，CtBP2在飲食誘發之肥胖小鼠(14週該飲食)之肝臟中過度表現。HFD：高脂肪飲食，NC：正常食物。圖37A及圖37B分別列出在空腹隔夜之後體重及血糖含量之量測值(n=4-5)。圖37C、圖37D及圖37Q：用AdGUS或AdCtBP2轉導的飲食誘發之肥胖小鼠進行葡萄糖耐受性測試(GTT，圖37C)、胰島素耐受性測試(ITT，圖37D)及丙酮酸鹽耐受性測試(PTT，圖37Q)(n=10-12)。圖37E、圖37F及圖37G：分別為肝臟G6pc、Pck1或Alb mRNA之基因表現(n=4-5)。圖37H說明肝臟之代表性蘇木精及曙紅染色切片。圖37I展示列表之肝臟三酸甘油酯含量(n=10)。圖37J展示列表之血清ALT含 量(n=10)。圖37K、圖37L、圖37M、圖37N及圖37O展示肝臟中Mlxipl/Srebf1c表現(圖37K及圖37L)及脂肪生成基因表現(圖37M、圖37N及圖37O)(n=10)。小鼠在空腹隔夜之後處死。圖37P為展示潛在調控機制之示意圖。ACSL；醯基-CoA合成酶。資料表示為平均值±SEM。*、**及NS分別表示p<0.05，p<0.01及無顯著差異，藉由史都登氏t檢驗測定。
圖38：cAMP刺激擴增aP2誘發之葡萄糖異生基因表現。圖38A及圖38B分別展示當初級肝細胞在2μM弗斯可林(fsk)不存在或存在下用或不用50μg/ml aP2刺激3小時時G6pc mRNA及Pck1 mRNA含量(n=4)。y軸比例在插圖中展開以更清晰地展示在fsk不存在下之資料。圖38C及圖38D中，初級肝細胞以與圖38A中相同之方式用或不用PKA抑制劑(H89，20μM)處理(n=4)；量測G6pc mRNA及Pck1 mRNA含量且列表。資料表示為平均值±SEM。**表示p<0.01，藉由史都登氏t檢驗測定。
圖39展示負責aP2介導之葡萄糖異生基因上調的轉錄因子之篩選。圖39A、圖39B及圖39C展示在mRNA層面下對應於圖32C中所示之實驗的基因表現阻斷功效(n=4)。圖39D、圖39E、圖39F及圖39G展示負責aP2依賴性葡萄糖異生基因上調之轉錄因子的篩選。在Hif1a、Ppargc1a或Stat3基因表現阻斷之後初級肝細胞以與圖32A相同之方式處理(n=4)。圖39H展示如圖32中之Foxo1表現量(n=4)。資料表示為平均值±SEM。*及**分別表示p<0.05且p<0.01，藉由史都登氏t檢驗測定。
圖40：藉由aP2之CtBP2依賴性轉錄活化。圖40A、圖40B、圖40C及圖40D展示在mRNA及蛋白質層面下對應於圖34之基因表現阻斷功效(n=4)。圖40E、圖40F及圖40G展示在腺病毒介導之HNF4α基因表現阻斷之後初級肝細胞中葡萄糖異生基因表現(n=4)。G6pc及Pck1之 基因表現型態分別展示於圖40E及圖40F中，且在蛋白質層面下基因表現阻斷功效展示於圖40G中。資料表示為平均值±SEM。*及**分別表示p<0.05且p<0.01，藉由史都登氏t檢驗測定。
圖41：FoxO1/CtBP複合物之表徵。圖41A及圖41B展示FoxO1/CtBP1相互作用之突變誘發研究的結果。將經野生型FLAG FoxO1(WT)或突變FoxO1(Mut：PSDL>PSAS，△psdl：PxDL基元缺失)轉染之HEK293細胞以及CtBP1表現質體溶解且進行免疫共沈澱。圖41C展示在弗斯可林(fsk，2μM)存在或不存在下初級肝細胞與50μg/ml aP2一起培育2小時之結果且天然FoxO1/CtBP2複合物免疫沈澱。圖41D展示細胞乳酸鹽/丙酮酸鹽比率。初級肝細胞如圖33E中處理。圖41E展示對應於圖34L之免疫細胞化學。圖41F展示FoxO1之磷酸化及乙醯化程度。初級肝細胞用弗斯可林(fsk，2μM)及/或50μg/ml aP2處理30分鐘。
圖42展示CtBP2過度表現對特定基因表現之作用。初級肝細胞如圖35D中處理且分析基因表現型態。
圖43說明活體內投與重組aP2之結果。重組aP2投與野生型瘦弱小鼠5天(n=4)。圖43A、圖43B、圖43C、圖43D及圖43E分別展示在腹膜內注射aP2之前(第0天)及之後(第5天)體重、胰島素、升糖素、丙三醇及游離脂肪酸(FFA)之血清含量的結果。圖43F及43G分別展示用重組aP2處理的野生型或肝臟特異性FoxO1 KO小鼠中Pck1及Foxo1之mRNA含量(n=7-8)。資料表示為平均值±SEM。NS表示藉由史都登氏t檢驗測定，無顯著差異。
圖44：活體內CtBP2過度表現。圖44A說明肝臟中GUS及CtBP2之過度表現的蛋白質含量。圖44B說明ITT研究中不相對於基線校正下之血糖含量(圖37D，n=10-12)。圖44C展示GUS或CtBP2過度表現之肝臟中血清胰島素含量。資料表示為平均值±SEM。*及**分別表示 p<0.05且p<0.01，藉由史都登氏t檢驗測定。
圖45：肝脂肪變性之發病機制中CtBP2之參與。圖45A、圖45B、圖45C、圖45D、圖45E及圖45F展示野生型初級肝細胞(圖45A、圖45B、圖45C及圖45D，n=4)或FoxO1基因敲除肝細胞(圖45E及45F，圖n=5)中CtBP2過度表現對脂肪生成基因表現之作用。圖45G、圖45H、圖45I及圖45J展示野生型瘦弱小鼠中Ad/shCtBP2轉導14天之後分析之肝臟樣品的結果。圖45G展示代表性蘇木精及曙紅染色肝臟切片。圖45H展示肝臟三酸甘油酯含量(n=6)。圖45I及45J分別展示肝臟硬酯醯基-CoA去飽和酶-1(Scd1)及脂肪酸合成酶(Fasn)表現(n=6)。小鼠在空腹隔夜之後處死。資料表示為平均值±SEM。*及**分別表示p<0.05且p<0.01，藉由史都登氏t檢驗測定。
提供抗-aP2單株抗體及抗原結合劑，其具有用於治療aP2介導之病症的優良及意外活性。舉例而言，提供抗-aP2單株抗體及抗原結合劑，其包含具有可變區之輕鏈或輕鏈片段，其中該可變區包含一個、兩個或三個獨立地選自Seq.ID No.7、Seq.ID No.8及Seq.ID No.9、Seq.ID No.10、Seq.ID No.11、Seq.ID No.12及Seq.ID No.13之CDR。或者，所揭示及選擇之CDR中之一或多者可藉由不會不利地影響抗體或抗原接合劑之特性或改善該等特性之一或多個胺基酸的取代來改變，如本文中進一步描述。在一個實施例中，所選擇之CDR置於人類免疫球蛋白構架中。在一個實施例中，人類免疫球蛋白構架經進一步修飾或改變以維持移植CDR區之結合親和力特異性。
本文揭示之意外發現之一為所述抗體及抗原結合劑不緊密結合aP2蛋白質。通常，尋求具有緊密結合親和力(極低KD)之抗體及其他抗原結合劑，如Miao等人(參見發明背景)所報導。
因此，在另一個實施例中，已發現以約10-7M之KD之較弱結合 親和力結合於呈分泌(非胞質)狀態之aP2蛋白質的抗體或抗原結合劑中和分泌aP2之能力改善且當以有效量提供給有需要之宿主時對aP2介導之病症產生顯著抑制作用。此外，已發現使用低親和力結合之抗-aP2抗體減少在使用高親和力抗-aP2抗體下所看到之不良作用，例如體重增加及aP2血清含量增加。
或者，本發明之抗-aP2抗體及抗原結合劑藉由抗體或抗原結合劑與aP2蛋白質之抗原決定基之間的接觸點描述。已知aP2具有不連續之抗原決定基，其中胺基酸在摺疊蛋白質中緊鄰，但當蛋白質展開或延伸時不靠近(參見WO 2010/102171)。因此，在一個實施例中，抗-aP2單株抗體或其抗原結合劑視情況以約10-7M之對分泌aP2之KD結合包含一或多個、例如1、2、3、4、5、6、7、8或9個選自10K、11L、12V、13S、37A、38K、57T、130E、132A(以上Seq.ID No.1中加粗)之胺基酸殘基或在10K、11L、12V、13S、37A、38K、57T、130E及132A任一者之約3或4埃內之胺基酸殘基的人類aP2之抗原決定基。在一特定實施例中，抗體與此等胺基酸中之每一者在3或4埃範圍內接觸。在另一個實施例中，本發明之抗體或抗原結合劑與所列胺基酸殘基中之至少6、7或8個具有3或4埃範圍接觸。
在一個實施例中，抗-aP2單株抗體或抗原結合劑僅僅經由或主要經由輕鏈互補決定區(CDR)結合於aP2。在一替代實施例中，抗-aP2單株抗體或抗原結合劑具有以比其重鏈CDR結合於aP2大的親和力結合於aP2之輕鏈CDR。作為一個實例，抗體或抗原結合劑特異性結合aP2，且不特異性結合於FABP5/Mal1。
當投與有需要之宿主時，此等抗-aP2抗體及抗原結合劑中和aP2之活性且與具有更高結合親和力之抗-aP2單株抗體相比，在宿主中提供較低空腹血糖含量、改善全身性葡萄糖代謝、增加全身性胰島素敏感性、減少脂肪量、肝臟脂肪變性、改善血清脂質型態及/或減少動 脈粥樣硬化斑形成。因此，藉由向有需要之宿主、通常人類投與有效量，本文中描述之抗-aP2抗體及抗原結合劑特別適用於治療代謝病症，包括(但不限於)糖尿病(1型與2型)、高血糖症、肥胖、脂肪肝、血脂異常、多囊性卵巢症候群(POS)、增生性病症(諸如腫瘤或贅瘤，包括例如移行膀胱癌、卵巢癌及脂肪肉瘤)、動脈粥樣硬化及其他心血管病症。
因此本發明提供至少以下各者：
(a)如本文所述之單株抗-aP2抗體或抗原結合劑或其所述變異體或結合物。
(b)如本文所述之人類化單株抗-aP2抗體或抗原結合劑或其所述變異體或結合物。
(c)如本文所述之單株抗-aP2抗體或抗原結合劑或其所述變異體或結合物，其中抗體或抗體結合物之特徵為以下至少一者：i. 結構包括Seq.ID 7-13中所述之一或多個CDR或具有不會不利地影響如Seq.ID 7-13中所述之CDR區之結合特性的胺基酸取代的其變異體；ii. 對人類aP2之KD結合親和力10-7M；及/或iii. 如本文中進一步指定，與人類或小鼠aP2蛋白質之接觸點在3或4埃內。
(d)如本文所述之單株抗-aP2抗體或抗原結合劑或其所述變異體或結合物，用於治療患有aP2介導之病症的宿主及尤其人類。
(e)如本文所述之單株抗-aP2抗體或抗原結合劑或其變異體或結合物的用途，其用於治療患有aP2介導之病症的宿主及尤其人類。
(f)如本文所述之單株抗-aP2抗體或抗原結合劑或其變異體或結合物的用途，其用於製造治療患有aP2介導之病症的宿主及尤其人類之藥劑。
(g)一種製造意欲用於醫療用途中治療aP2介導之病症之藥劑的方法，其特徵在於在製造中使用如本文所述之單株抗-aP2抗體或抗原結合劑或其變異體或結合物
(h)一種醫藥組合物，其包括有效量之如本文所述之單株抗-aP2抗體或抗原結合劑或其所述變異體或結合物。
一般定義
除非另外規定，否則本文中所用之所有技術及科學術語均具有與本發明所屬領域之一般技術者通常所理解相同之含義。儘管類似或等效於本文所描述之彼等方法及材料之方法及材料可用於實踐或測試本發明，但下文描述適合方法及材料。所有公開案、專利申請案、專利及本文提及之其他參考案以全文引用之方式併入本文中。倘若有衝突，本說明書(包括定義)將為主。此外，材料、方法以及實例僅為說明性的且並不欲限制。
除非另外為情形所需，否則單數術語應包括複數且複數術語應包括單數。在本申請案中，除非另外規定，否則「或」之使用意謂「及/或」。此外，使用術語「包括(including)」以及其他形式(諸如「包括(includes)」及「包括(included)」)不具限制性。此外，除非另外具體規定，否則諸如「元件」或「組件」之術語涵蓋包含一個單元之元件及組件以及包含一個以上子單元之元件及組件兩者。
一般而言，本文中所描述之與細胞及組織培養、分子生物學、免疫學、微生物學、遺傳學及蛋白與核酸化學及雜交結合使用的命名法及其技術為此項技術中熟知且常用的命名法及技術。除非另外指明，否則本發明之方法及技術一般根據此項技術中熟知之習知方法且如本說明書通篇所引用及討論之各種一般及更特定文獻中所描述來進行。酶促反應及純化技術可根據製造商之說明書或如通常在此項技術中所實現或如本文所描述來進行。本文中所述之與分析化學、合成有 機化學及藥物與醫藥化學結合使用的命名法及其實驗室程序與技術為在此項技術中熟知且常用之命名法及實驗室程序與技術。標準技術係用於化學合成、化學分析、醫藥製備、調配及傳遞及治療患者。
為更容易地理解本發明，下文定義所選術語。
如本文所用，術語「宿主」通常係指人類個體，且尤其在人類或人類化構架用作接受體結構之情況下。在治療另一宿主之情況下，熟習此項技術者應瞭解抗體或抗原結合劑可需要針對宿主調整以避免排斥或使其更相容性。已知針對一系列宿主之所需傳遞及功能，如何在本發明中使用CDR且將其工程改造至適當構架或肽序列中。其他宿主可包括其他哺乳動物或脊椎動物物種。因此，術語「宿主」或者可指諸如小鼠、猴、狗、豬、兔、家養豬(豬及肉豬)、反芻動物、馬類動物、家禽、貓科動物、鼠類動物、牛類動物、犬科動物及其類似動物之動物，其中必要時抗體或抗原結合劑經適當設計以與宿主相容。
如本文所用，術語「多肽」係指胺基酸之任何聚合鏈。術語「肽」及「蛋白質」可與術語多肽互換使用且亦指胺基酸之聚合鏈。術語「多肽」涵蓋天然或人工蛋白質、蛋白質片段及蛋白質序列之多肽類似物。多肽可為單體或聚合物。
如本文所用，術語「回收」係指藉由分離，例如使用此項技術中熟知之蛋白質純化技術，使得諸如多肽之化學物質基本上不含天然相關組分之過程。
如本文所用，術語「人類aP2蛋白質」或「人類FABP4/aP2蛋白質」係指如Baxa,C.A.,Sha,R.S.,Buelt,M.K.,Smith,A.J.,Matarese,V.,Chinander,L.L.,Boundy,K.L.,Bernlohr,A.Human adipocyte lipid-binding protein：purification of the protein and cloning of its complementary DNA.Biochemistry 28：8683-8690,1989所描述，由Seq.ID.No.1編碼之蛋白質及其天然變異體。
如本文所用，術語「小鼠aP2蛋白質」或「小鼠FAB4P/aP2蛋白質」係指由Seq.ID.No.2編碼之蛋白質及其天然變異體。小鼠蛋白質以編號P04117登記在Swiss-Prot。
如本文所用，在提及抗體、蛋白質或肽與第二化學物質之相互作用時，術語「特異性結合(specific binding)」或「特異性結合(specifically binding)」意謂相互作用視化學物質上之特定結構(例如如下所定義之「抗原決定子」或「抗原決定基」)存在而定；例如，抗體識別且結合於特定蛋白質結構而非一般蛋白質。若抗體對抗原決定基「A」具有特異性，則在含經標記「A」及該抗體之反應中，含抗原決定基A(或未經標記之游離A)之分子的存在將減少結合於該抗體之經標記A的量。
如本文所用，術語「抗體」泛指由四條多肽鏈，兩條重鏈(H)鏈及兩條輕(L)鏈構成之任何免疫球蛋白(Ig)分子或保留Ig分子之抗原決定基結合特徵之至少一部分，以允許特異性結合於aP2的其任何功能片段、突變體、變異體或衍生物。此類突變體、變異體或衍生物抗體格式為此項技術中已知且下文描述。下文論述其非限制性實施例。若抗體能夠特異性地與分子反應使得將該分子結合於抗體，則稱該抗體「能夠結合」分子。
如本文所用，「單株抗體」意欲指相比於含有不同抗體之混合物的「多株」抗體製劑，共享通用重鏈及通用輕鏈胺基酸序列之抗體分子製劑，或至少保留Ig分子之輕鏈抗原決定基結合特徵的其任何功能片段、突變體、變異體或衍生物。單株抗體可藉由若干已知技術產生，該等技術如噬菌體、細菌、酵母或核糖體呈現以及經典方法，例如融合瘤來源之抗體(例如藉由融合瘤技術，諸如標準Kohler及Milstein融合瘤方法((1975)Nature 256：495-497)製備之融合瘤所分泌的抗體)。
在全長抗體中，每一重鏈由重鏈可變區(本文中縮寫為HCVR或VH)及重鏈恆定區(CH)構成。重鏈恆定區由四個結構域-CH1、鉸鏈、CH2及CH3(重鏈γ、α及δ)或CH1、CH2、CH3及CH4(重鏈μ及ε)構成。每個輕鏈由輕鏈可變區(本文中縮寫為LCVR或VL)及輕鏈恆定區(CL)構成。輕鏈恆定區由一個結構域CL構成。VH及VL區可進一步再分成高變區，稱為互補決定區(CDR)，穿插稱為構架區(FR)之更保守區。每個VH及VL由自胺基端至羧基端按以下順序排列之三個CDR及四個FR構成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。免疫球蛋白分子可具有任何同型/類別(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA及IgY)、類別(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2)或子類。
如本文所用，術語「抗原結合劑」係指保留特異性結合於抗原(例如aP2)之能力的抗體之一或多個片段或部分，或保留與抗原之所需結合能力的抗體片段之合成變異體。已展示抗體之抗原結合功能可藉由全長抗體之片段或某些部分或其變異體進行。實施例包括可特異性結合於兩種或兩種以上不同抗原或抗原之若干抗原決定基或不連續抗原決定基區域的雙特異性、雙重特異性及多特異性格式。抗原結合劑之非限制性實例包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL及CH1結構域組成之單價片段；(ii)F(ab')2片段，包含在鉸鏈區藉由二硫橋鍵連接之兩個Fab片段之二價片段；(iii)由VH及CH1結構域組成之Fd片段；(iv)由抗體單臂之VL及VH域組成之Fv片段；(v)dAb片段(Ward等人，(1989)Nature 341：544-546；Winter等人，PCT公開案WO 90/05144 A1，以引用的方式併入本文中)，其包含單一可變域；(vi)經分離之互補決定區(CDR)；(vii)抗體片段之融合物，諸如特徵為免疫球蛋白之抗體片段融合物，例如雙功能抗體、scab、雙特異性、三鏈抗體、Fab-Fv、Fab-Fv-Fv、三功能抗體、(Fab-Fv)2-Fc；及(viii)移植至諸如纖維結合蛋白或白胺酸拉鏈之非免疫球蛋白構架上之抗體部分，諸如 CDR或抗體環(參見Binz等人(2005)Nat.Biotech.23：1257-1268，併入本文中)。此外，雖然Fv片段之兩個結構域VL及VH藉由分開基因編碼，但其可使用重組或其他方法，藉由合成或天然存在之連接子接合，該等連接子使其製備成其中VL及VH區配對形成單價分子之單一蛋白質鏈(稱為單鏈Fv(scFv)；參見例如Bird等人(1988)Science 242：423-426；以及Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883)。亦希望此類單鏈抗體涵蓋於術語抗原結合劑內。亦涵蓋單鏈抗體之其他形式，諸如雙功能抗體。雙功能抗體為二價雙特異性抗體，其中VH及VL域表現於單一多肽鏈上，但使用太短以致不允許兩個域之間於同一鏈上配對的連接子，從而迫使域與另一鏈之互補域配對且產生兩個抗原結合位點(參見例如Holliger,P.等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448；Poljak,R.J.等人(1994)Structure 2：1121-1123)。此類抗體結合部分為此項技術中已知(Kontermann及Dubel編輯，Antibody Engineering(2001)Springer-Verlag.New York.790頁(ISBN 3-540-41354-5)。
如本文所用，術語「抗體構築體」係指包含一或多個本發明之抗原結合部分連接於連接子多肽或免疫球蛋白恆定域的多肽。連接多肽包含兩個或兩個以上由肽鍵接合之胺基酸殘基，且用於連接一或多個抗原結合部分。此類連接子多肽為此項技術中熟知(參見例如Holliger,P.等人，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448；Poljak,R.J.等人，(1994)Structure 2：1121-1123)。免疫球蛋白恆定域係指重鏈或輕鏈恆定域，例如人類IgA、IgD、IgE、IgG或IgM恆定域。重鏈及輕鏈恆定域胺基酸序列為此項技術中已知。Ig重鏈γ1恆定區及Ig輕鏈λ及κ鏈之非限制性實例分別提供於表8及6。
再此外，抗體或其抗原結合部分可為較大免疫黏附分子之一部分，所述免疫黏附分子藉由抗體或抗體部分與一或多種其他蛋白質或 肽之共價或非共價締合而形成。此類免疫黏附分子之實例包括使用抗生蛋白鏈菌素核心區域製備四聚體scFv分子(Kipriyanov,S.M.等人(1995)Human Antibodies and Hybridomas 6：93-101)及使用半胱胺酸殘基、標記物肽及C端聚組胺酸標籤製備二價及生物素標記之scFv分子(Kipriyanov,S.M.等人(1994)Mol.Immunol.31：1047-1058)。諸如Fab及F(ab')2片段之抗體部分可由全抗體，使用習知技術，諸如對全抗體分別進行木瓜蛋白酶或胃蛋白醇消化來製備。此外，抗體、抗體部分及免疫黏附分子可使用如本文中所述之標準重組DNA技術獲得。
如本文所用，「分離之抗體」意欲指實質上不含其他具有不同抗原特異性之抗體的抗體(例如特異性結合aP2之分離之抗體實質上不含特異性結合除aP2以外的抗原之抗體)。然而，特異性結合例如人類aP2之分離抗體可與諸如來自其他物種之aP2分子的其他抗原具有交叉反應性。另外，分離之抗體可實質上不含其他細胞物質及/或化學物質。
術語「CDR移植抗體」係指包含來自一種物種之重鏈及輕鏈可變區序列，但其中VH及/或VL之一或多個CDR區之序列經另一物種之CDR序列置換的抗體，諸如具有其中一或多個人類CDR(例如CDR3)已經鼠類CDR序列置換之人類重鏈及輕鏈可變區的抗體。
術語「Kabat編號」、「Kabat定義」及「Kabat標記」在本文中可互換使用。此項技術中公認之此等術語係指抗體或其抗原結合部分之重鏈及輕鏈可變區中比其他胺基酸殘基更可變(亦即高變)之胺基酸殘基的編號系統(Kabat等人(1971)Ann.NY Acad,Sci.190：382-391及Kabat,E.A.等人(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，U.S.Department of Health and Human Services,NIH公開案第91-3242號)。對於重鏈可變區，根據Kabat編號系統，高變區在胺基酸位置31-35(CDR-H1)、殘基50-65(CDR-H2)及殘基95-102 (CDR-H3)範圍內。然而，根據Chothia(Chothia等人，(1987)J.Mol.Biol.,196,901-917(1987))，等同於CDR-H1之環自殘基26延伸至殘基32。因此，除非另外規定，否則如本文所採用之「CDR-H1」意欲指如Kabat編號系統與Chothia拓撲環定義之組合所描述，殘基26至35。對於輕鏈可變區，高變區範圍就CDR1而言自胺基酸位置24至34，就CDR2而言自胺基酸位置50至56，且就CDR3而言自胺基酸位置89至97。
如本文所用，術語「接受體」及「接受體抗體」係指提供或編碼一或多個構架區之胺基酸序列之至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或100%的抗體或核酸序列。在一些實施例中，術語「接受體」係指提供或編碼恆定區之抗體胺基酸或核酸序列。在另一實施例中，術語「接受體」係指提供或編碼構架區及恆定區中之一或多者的抗體胺基酸或核酸序列。在一特定實施例中，術語「接受體」係指提供或編碼一或多個構架區之胺基酸序列之至少80%、較佳至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或100%的人類抗體胺基酸或核酸序列。根據此實施例，接受體可含有至少1個、至少2個、至少3個、至少4個、至少5個或至少10個不出現於人類抗體之一或多個特定位置之胺基酸殘基。接受體構架區及/或一或多個接受體恆定區可例如源自或獲自生殖系抗體基因、成熟抗體基因、功能性抗體(例如此項技術中熟知之抗體、處於研發中之抗體或市售抗體)。
如本文所用，術語「CDR」係指在抗體可變序列內之互補決定區。重鏈及輕鏈之各可變區中存在三個CDR，對於重鏈CDR而言其稱為CDRH1、CDRH2及CDRH3，且對於輕鏈CDR而言其稱為CDRL1、CDRL2及CDRL3。如本文所用，術語「CDR組」係指存在於能夠結合抗原之單一可變區中之一組三個CDR。此等CDR之準確邊界已根據不同系統不同地加以界定。由Kabat(Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1987)及(1991))描述之系統不僅提供適用於抗體之任何可變區之明確的殘基編號系統，且亦提供界定三個CDR之精確殘基邊界。此等CDR可稱為Kabat CDR。Chothia及同事(Chothia及Lesk,J.Mol.Biol.196：901-917(1987)及Chothia等人，Nature 342：877-883(1989))發現，Kabat CDR內之某些子部分採用幾乎一致的肽主鏈構形，儘管在胺基酸序列層面下具有極大差異。此等子部分稱為L1、L2及L3或H1、H2及H3，其中「L」及「H」分別表示輕鏈及重鏈區。此等區可稱為Chothia CDR，其具有與Kabat CDR重疊之邊界。界定與Kabat CDR重疊之CDR的其他邊界已由Padlan(FASEB J.9：133-139(1995))及MacCallum(J Mol Biol 262(5)：732-45(1996))描述。其他CDR邊界界定可不嚴格遵循以上系統中之一者，但仍然將與Kabat CDR重疊，不過其可根據特定殘基或殘基組或甚至全部CDR不顯著影響抗原結合之預測或實驗發現進行縮短或延長。本文中使用之方法可利用根據此等系統任一者所界定之CDR，不過較佳實施例使用Kabat或Chothia或其混合物界定之CDR。
如本文所用，術語「典型」殘基係指CDR或構架中界定如Chothia等人(J.Mol.Biol.196：901-907(1987)；Chothia等人，J.Mol.Biol.227：799(1992)，均以引用的方式併入本文中)所定義的特定典型CDR結構之殘基。根據Chothia等人，多種抗體之CDR之重要部分具有幾乎一致的肽主鏈構形，儘管在胺基酸序列層面下具有極大差異。各典型結構主要為形成環之胺基酸殘基之相鄰區段指定一組肽主鏈扭轉角。
如本文所用，術語「供體」及「供體抗體」係指提供一或多個CDR之抗體。在一個較佳實施例中，供體抗體為來自不同於獲得或產生構架區之抗體的物種之抗體。在人類化抗體之情況下，術語「供體 抗體」係指提供一或多個CDR之非人類抗體。
如本文所用，術語「構架」或「構架序列」係指可變區減去CDR之剩餘序列。因為CDR序列之準確定義可藉由不同系統確定，所以構架序列之含義相對應地經歷不同解釋。六個CDR(輕鏈之CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3及重鏈之CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3)亦將輕鏈及重鏈上之構架區分成各鏈上四個子區(FR1、FR2、FR3及FR4)，其中CDR1位於FR1與FR2之間，CDR2位於FR2與FR3之間，且CDR3位於FR3與FR4之間。不指定特定子區為FR1、FR2、FR3或FR4，如他人所提及，構架區表示單一天然存在之免疫球蛋白鏈之可變區內之組合FR。如本文所用，一個FR表示四個子區之一，且多個FR表示構成構架區之四個子區中的兩個或更多個。
人類重鏈及輕鏈接受體序列為此項技術中已知。在本發明之一個實施例中，人類輕鏈及重鏈接受體序列係選自表4、5及7中所述之序列。人類構架序列FR1至FR4之不同組合描述於該等表中。
如本文所用，術語「生殖系抗體基因」或「基因片段」係指由未經歷導致遺傳重排及突變以供特定免疫球蛋白表現之成熟過程的非淋巴細胞編碼的免疫球蛋白序列。參見例如Shapiro等人，Crit.Rev.Immunol.22(3)：183-200(2002)；Marchalonis等人，Adv Exp Med Biol.484：13-30(2001)。本發明之各種實施例提供的優點之一利用以下認識：生殖系抗體基因比成熟抗體基因更可能保存作為個體在物種中之特徵的基礎胺基酸序列結構，因此當在治療學上用於該物種中時不大可能識別為來自外來來源。
如本文所用，術語「關鍵」殘基係指可變區內對抗體、尤其人類化抗體之結合特異性及/或親和力更具影響的某些殘基。關鍵殘基包括(但不限於)以下中之一或多者：與CDR相鄰之殘基、潛在糖基化位點(可為N-或O-糖基化位點)、稀少殘基、能夠與抗原相互作用之殘 基、能夠與CDR相互作用之殘基、典型殘基、重鏈可變區與輕鏈可變區之間的接觸殘基、維尼爾區(Vernier zone)內之殘基及在可變重鏈CDR1之Chothia定義與第一重鏈構架之Kabat定義之間重疊的區域中之殘基。
術語「人類化抗體」一般係指包含來自非人類物種(例如兔、小鼠等)之重鏈及輕鏈可變區序列，但其中VH及/或VL序列之至少一部分已改變成更「人類樣」，亦即更類似於人類生殖系可變序列的抗體。一種類型人類化抗體為其中人類CDR序列引入非人類VH及VL序列中以替換對應非人類CDR序列的CDR移植抗體。另一類型人類化抗體為其中至少一個非人類CDR插入人類構架中之CDR移植抗體。後者通常為本發明之焦點。
詳言之，如本文所用，術語「人類化抗體」為免疫特異性結合於相關抗原且包含具有實質上人類抗體之胺基酸序列之構架(FR)區及具有實質上非人類抗體之胺基酸序列之互補決定區(CDR)的抗體或其變異體、衍生物、類似物或片段。如本文所用，在CDR之情況下術語「實質上」係指胺基酸序列與非人類抗體CDR之胺基酸序列至少50%、55%、60%、65%、70%、75%或80%、較佳至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致的CDR。在一個實施例中，人類化抗體具有與非人類抗體CDR相比，具有一或多個(例如1、2、3或4個)胺基酸取代、添加及/或缺失之CDR區。此外，非人類CDR可使用已知技術進行工程改造以更「人類樣」或與人體相容。人類化抗體包含至少一個及通常兩個可變結構域(Fab、Fab'、F(ab')2、F(ab')c、Fv)的實質上所有，其中所有或實質上所有CDR區對應於非人類免疫球蛋白(亦即供體抗體)之CDR區且所有或實質上所有構架區為人類免疫球蛋白共同序列之構架區。較佳地，人類化抗體亦包含至少一部分免疫球蛋白恆定區(Fc)，通常人類免疫球蛋白之恆定區。在 一些實施例中，人類化抗體含有輕鏈以及至少重鏈之可變域。抗體亦可包括重鏈之CH1、鉸鏈、CH2及CH3，或CH1、CH2、CH3及CH4。在一些實施例中，人類化抗體僅僅含有人類化輕鏈。在一些實施例中，人類化抗體僅僅含有人類化重鏈。在特定實施例中，人類化抗體僅僅含有輕鏈及/或人類化重鏈之人類化可變域。
人類化抗體可選自任何類別免疫球蛋白，包括IgY、IgM、IgG、IgD、IgA及IgE及任何同型，包括(但不限於)IgA1、IgA2、IgG1、IgG2、IgG3及IgG4。人類化抗體可包含來自超過一種類別或同型的序列，且可使用此項技術中熟知之技術選擇特定恆定域以最佳化所需效應功能。
人類化抗體之構架及CDR區無需準確對應於親本序列，例如供體抗體CDR或共同構架可藉由至少一個胺基酸殘基取代、插入及/或缺失而誘變，使得該位點之CDR或構架殘基不準確對應於供體抗體或共同構架。然而，在一較佳實施例中，此類突變將不為大規模的。通常，人類化抗體殘基之至少50%、55%、60%、65%、70%、75%或80%、較佳至少85%、更佳至少90%且最佳至少95%、98%或99%將對應於親本FR及CDR序列之殘基。在一個實施例中，與親本FR及CDR序列相比，一或多個(例如1、2、3或4個)胺基酸取代、添加及/或缺失可存在於人類化抗體中。如本文所用，術語「共同構架」係指共同免疫球蛋白序列中之構架區。如本文所用，術語「共同免疫球蛋白序列」係指相關免疫球蛋白序列家族中由最頻繁出現之胺基酸(或核苷酸)形成之序列(參見例如Winnaker,From Genes to Clones(Verlagsgesellschaft,Weinheim,Germany 1987)。在免疫球蛋白家族中，共同序列中之各位置由該家族中最頻繁出現於該位置之胺基酸佔據。若兩個胺基酸同等頻繁地出現，則共同序列中可包括任一個。
如本文所用，「維尼爾」區係指如Foote及Winter(1992,J.Mol. Biol.224：487-499，其以引用的方式併入本文中)所描述，可調整CDR結構且微調與抗原之合適度的構架殘基子集。維尼爾區殘基形成在CDR下面且可影響CDR結構及抗體親和力之層。
如本文所用，術語「中和」係指當本文中描述之抗體特異性結合aP2蛋白質時中和aP2蛋白質，例如分泌aP2蛋白質之生物活性。中和可為該抗體與aP2之不同結合方式之結果。較佳地，中和抗體為結合於aP2，中和aP2生物活性之抗體。較佳地，中和結合蛋白結合aP2且將aP2生物活性降低至少約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、50%、60%、80%、85%或更多。中和抗體對aP2生物活性之中和可藉由量測本文中描述之aP2生物活性之一或多個指示物來評估。
如本文所用，「中和單株抗體」意欲指在結合於aP2時能夠部分或完全抑制或降低aP2生物活性的抗體分子製劑。
如本文所用，術語「減弱(attenuation)」、「減弱(attenuate)」及其類似術語係指由血清aP2含量升高所引起之症狀或病狀的嚴重程度減輕或降低。
術語「抗原決定基」或「抗原決定子」包括能夠特異性結合於免疫球蛋白或T細胞受體之任何多肽決定子。在某些實施例中，抗原決定基決定子包括分子之化學活性表面分組(諸如胺基酸、糖側鏈、磷醯基或磺醯基)，且在某些實施例中，可具有特定三維結構特徵及/或特定電荷特徵。抗原決定基為抗體所結合之抗原區域。在某些實施例中，在蛋白質及/或大分子之複雜混合物中，當抗體優先識別其標靶抗原時，稱該抗體特異性結合抗原。
如本文所用，術語「Kon」意欲指抗體與抗原締合以形成如此項技術中已知之抗體/抗原複合物的締合速率常數。
如本文所用，術語「Koff」意欲指抗體自如此項技術中已知之抗 體/抗原複合物解離的解離速率常數。
如本文所用，術語「Kd」意欲指如此項技術中已知的特定抗體-抗原相互作用之解離常數。
免疫結合相互作用之強度或親和力可根據相互作用之解離常數(Kd)表示，其中kd愈小，代表親和力愈大或愈高。所選多肽之免疫結合特性可使用此項技術中熟知之方法定量。一種此類方法包括量測抗原結合位點/抗原複合物形成及解離之速率，其中彼等速率視複合搭配物之濃度、相互作用之親和力及同等影響兩個方向上速率之幾何結構參數而定。因此，「締合速率常數」(「Kon」)及「解離速率常數」(「Koff」)可藉由計算濃度及締合與解離之實際速率來確定。(Nature 361：186-87(1993))。Koff/Kon之比率能夠抵消不與親和力相關之所有參數，且等於解離常數Kd。Davies等人(1990)Annual Rev Biochem 59：439-473。
如本文所用，術語「KD」意欲指親和力(或親和力常數)，其為抗體與抗原之間的結合(締合及解離)速率之量度，決定抗體結合反應之內源性結合強度。
術語「抗體結合物」係指化學上連接於諸如治療劑或細胞毒性劑之第二化學部分之結合蛋白，諸如抗體或抗體片段或其結合部分。術語「藥劑」在本文中用以表示化合物、化合物之混合物、生物大分子或由生物材料製成之提取物。
如本文所用，術語「晶體」及「結晶」係指呈晶體形式存在之抗體或其抗原結合部分。晶體為物質之一種固態形式，其不同於諸如非晶形固態或液晶態之其他形式。晶體由原子、離子、分子(例如蛋白質，諸如抗體)或分子集合體(例如，抗原/抗體複合物)之規則、重複、三維陣列構成。此等三維陣列係根據本領域中充分瞭解之特定數學關係排列。在晶體中重複之基本單元或建構嵌段稱為不對稱單元。 不對稱單元以符合給定之良好定義的晶體學對稱性之排列重複提供晶體之「單位晶胞」。單位晶胞在所有三個維度上藉由規則變換進行重複提供晶體。參見Giege,R.及Ducruix,A.Barrett,Crystallization of Nucleic Acids and Proteins,a Practical Approach，第2版，第20頁1-16,Oxford University Press,New York,N.Y.,(1999)」。
如本文中所提及，術語「聚核苷酸」意謂兩種或兩種以上核苷酸，核糖核苷酸或去氧核苷酸或任一核苷酸類型之修飾形式的聚合物形式。術語包括DNA之單股及雙股形式，但較佳為雙股DNA。
如本文所用，術語「經分離之聚核苷酸」意謂一種聚核苷酸(例如基因組、cDNA或合成來源，或其某種組合)，根據其來源，該「經分離之聚核苷酸」與在自然界中與「經分離之聚核苷酸」一起發現的聚核苷酸之全部或一部分不相關；與在自然界中不與之連接的聚核苷酸可操作地連接；或不作為較大序列之一部分存在於自然界中。
如本文所用，術語「載體」意欲指能夠運輸其已連接之另一種核酸的核酸分子。一種載體類型為「質體」，其係指其中可連接其他DNA區段的環形雙股DNA環。另一類型之載體為病毒載體，其中其他DNA片段可接合至病毒基因組。某些載體能夠在引入其之宿主細胞中自發複製(例如具有細菌複製起點之細菌載體及游離型哺乳動物載體)。其他載體(例如非游離型哺乳動物載體)當引入至宿主細胞中時可整合至宿主細胞之基因組中，且進而與宿主基因組一起複製。此外，某些載體能夠引導其以可操作方式連接之基因表現。此類載體在本文中稱作「重組表現載體」(或簡稱為「表現載體」)。一般而言，用於重組DNA技術中之表現載體常常呈質體形式。在本說明書中，由於質體為最常用之載體形式，因此「質體」與「載體」可互換使用。然而，本發明意欲包括提供同等功能之此類其他形式表現載體，諸如病毒載體(例如複製缺陷型反轉錄病毒、腺病毒及腺相關病毒)。
術語「可操作地連接」係指所描述之組分處於准許其以其預期方式作用之關係中的並置。「可操作地連接」至編碼序列之控制序列係以使編碼序列之表現在與控制序列相容之條件下達成的方式接合。「可操作地連接」之序列包括與相關基因相鄰之表現控制序列及以反式作用或以一定距離作用以控制相關基因之表現控制序列。如本文所用，術語「表現控制序列」係指實現所接合之編碼序列的表現及加工所需之聚核苷酸序列。表現控制序列包括適當轉錄起始、終止、啟動子及強化子序列；有效RNA加工信號，諸如剪接及聚腺苷酸化信號；使細胞質mRNA穩定之序列；增強轉譯功效之序列(亦即克紮克共同序列(Kozak consensus sequence))；增強蛋白質穩定性之序列；及必要時增強蛋白質分泌之序列。此類控制序列之性質視宿主生物體而不同；在原核生物中，此類控制序列一般包括啟動子、核糖體結合位點及轉錄終止序列；在真核生物中，此類控制序列一般包括啟動子及轉錄終止序列。術語「控制序列」意欲包括存在對表現及加工而言至關重要之組件，且亦可包括存在有利之其他組件，例如前導序列及融合搭配物序列。
如本文所定義，「轉型」係指外源性DNA進入宿主細胞之任何過程。轉型可在天然或人工條件下使用此項技術中熟知之各種方法進行。轉型可依賴於將外來核酸序列插入原核或真核宿主細胞中之任何已知方法。方法係基於轉化之宿主細胞選擇且可包括(但不限於)病毒感染、電穿孔、脂質體轉染及粒子轟擊。此類「轉型」細胞包括插入之DNA能夠作為自主複製質體或作為宿主染色體之一部分複製的穩定轉型細胞。其亦包括短暫表現插入之DNA或RNA持續有限時間段之細胞。
如本文所用，術語「重組宿主細胞」(或簡稱為「宿主細胞」)意欲指已引入外源性DNA之細胞。應瞭解，此類術語不僅意指特定個體 細胞，而且指此類細胞之後代。因為某些修飾可能因突變或環境影響而出現在後代中，所以此類後代可能實際上不與親本細胞一致，但仍包括於如本文所使用之術語「宿主細胞」範疇內。較佳地，宿主細胞包括選自任一生命界之原核及真核細胞。較佳真核細胞包括原生生物、真菌、植物及動物細胞。最佳地，宿主細胞包括(但不限於)原核細胞株大腸桿菌；哺乳動物細胞株CHO、HEK 293及COS；昆蟲細胞株Sf9；以及真菌細胞釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。
對重組DNA、寡核苷酸合成及組織培養及轉型可使用標準技術(例如電穿孔、脂質體轉染)。酶促反應及純化技術可根據製造商之說明書或如通常在此項技術中所實現或如本文所描述來進行。前述技術及程序一般可根據此項技術中熟知及如在本說明書通篇中所引用及論述之各種一般及更特定參考文獻中所描述之習知方法進行。參見例如Sambrook等人Molecular Cloning：A Laboratory Manual(第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989))，其以引用的方式併入本文中以達成任何目的。
如本文所用，術語「有效量」係指療法足以降低或改善病症或其一或多種症狀之嚴重程度及/或持續時間；阻止病症進展；引起病症消退；防止與病症相關之一或多種症狀復發、出現、發作或進展；偵測病症；或增強或改善另一療法(例如預防劑或治療劑)之預防或治療效果的量。
aP2蛋白質
脂肪酸結合蛋白(FABP)為脂質結合蛋白超家族之成員(LBP)。迄今已鑑別九種不同FABP，各展示相對組織富集：L(肝臟)、I(腸)、H(肌肉及心臟)、A(脂肪細胞)、E(表皮)、Il(迴腸)、B(大腦)、M(髓鞘)及T(睪丸)。所有FABP家族成員之主要作用為調控脂肪酸攝入及細胞內輸送。所有FABP之結構類似-表徵此等蛋白質之基礎基元為β- 桶，且單一配位體(例如脂肪酸、膽固醇或類視黃素)結合在其內部水填充之空腔中。
脂肪細胞脂肪酸結合蛋白aP2調控全身葡萄糖及脂質代謝，且已與許多免疫代謝疾病，諸如糖尿病及動脈粥樣硬化之病理學相關。雖然傳統上認為aP2為胞質蛋白質，但已發現其為藉由促進肝葡糖新生而引起高血糖症之活性脂肪細胞激素。已發現血清aP2含量在肥胖小鼠及人類中顯著升高。
人類aP2蛋白質為14.7kDa細胞內及細胞外(分泌)脂質結合蛋白，其由包含表1之胺基酸序列(Seq ID No.1))之132個胺基酸組成。人類aP2之cDNA序列先前描述於Baxa,C.A.,Sha,R.S.,Buelt,M.K.,Smith,A.J.,Matarese,V.,Chinander,L.L.,Boundy,K.L.,Bernlohr,A.Human adipocyte lipid-binding protein：purification of the protein and cloning of its complementary DNA.Biochemistry 28：8683-8690,1989中，且提供於Seq.ID No.5。人類蛋白質以編號P15090登記在Swiss-Prot。
小鼠aP2蛋白質序列包含表1之Seq.ID No.2之胺基酸序列。小鼠aP2之cDNA序列提供於Seq.ID No.6中。小鼠蛋白質以編號PO4117登記在Swiss-Prot。
人類與小鼠aP2蛋白質包括至少兩個主要保守結構域：11胺基酸之核定位信號(aa22-32：kevgvgfatrk(Seq.ID No.3))；以及三胺基酸脂肪酸結合區(aa127-129：rvy(Seq.ID No.4))。
aP2結合抗原決定基
在本發明之一個態樣中，提供抗-aP2單株抗體分子，包括人類化單株抗體及抗原結合劑，該等抗體分子在aP2分子呈其天然構形形式摺疊或與其天然結合搭配物複合時在aP2分子內經鑑別之特定胺基酸特異性結合於人類aP2或小鼠aP2。
在一個實施例中，抗-aP2單株抗體結合具有以下胺基酸序列之人類aP2： (Seq.ID.No1)，或其天然存在之變異體。
在一替代實施例中，抗-aP2單株抗體或抗原結合劑結合於胺基酸序列與Seq.ID No.1至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致之人類aP2。在一個實施例中，抗體對aP2之KD10-7M。 在一個實施例中，抗體結合於選自以上Seq.ID No.1中加下劃線之胺基酸序列的抗原決定基且對aP2之KD約10-7M。在一個實施例中，抗體結合於與Seq.ID.No.1相比具有一或多個(例如1、2、3或4個)胺基酸取代、添加或缺失之抗原決定基。
如藉由X射線結晶學所測定之aP2結合抗原決定基
在一個實施例中，抗-aP2抗體或抗原結合劑在3或4埃距離內直接與以上Seq.ID No.1中加粗之一或多個、例如1、2、3、4、5、6、7、8或9個胺基酸相互作用。在另一個實施例中，抗-aP2單株抗體或抗原結合劑在3或4埃距離內接觸以上Seq.ID No.1中所有九個加粗胺基酸。
在一個實施例中，經純化之抗-aP2單株抗體結合包含至少一或多個，例如1、2、3、4、5、6、7、8或9個選自10K、11L、12V、13S、37A、38K、57T、130E及132A(以上Seq.ID No.1中加粗)之胺基酸殘基，或在10K、11L、12V、13S、37A、38K、57T、130E及132A任一者約4埃內之胺基酸殘基的人類及/或小鼠aP2之非相鄰抗原決定基。在一個實施例中，經純化之抗-aP2單株抗體結合包含至少一或多個，例如1、2、3、4、5、6、7、8或9個選自10K、11L、12V、13S、37A、38K、57T、130E及132A(以上Seq.ID No.1中加粗)之胺基酸殘基或在10K、11L、12V、13S、37A、38K、57T、130E及132A任一者約4埃內之胺基酸殘基的人類aP2之抗原決定基，且對aP2之KD10-7M。
在一替代實施例中，經純化之抗-aP2單株抗體結合包含至少一或多個，例如1、2、3、4、5、6或7個選自10K、11L、12V、13S、38K、130E或132A(以上Seq.ID No.1中加粗)之胺基酸殘基或在10K、11L、12V、13S、38K、130E或132A任一者約4埃內之胺基酸殘基的人類及/或小鼠aP2之抗原決定基。在一個實施例中，經純化之抗 -aP2單株抗體結合包含至少一或多個，例如1、2、3、4、5、6或7個選自10K、11L、12V、13S、38K、130E或132A(以上Seq.ID No.1中加粗)之胺基酸殘基或在10K、11L、12V、13S、38K、130E或132A任一者約4埃內之胺基酸殘基的人類aP2之抗原決定基，且對aP2之KD10-7M。在一個實施例中，抗體進一步結合37A及/或57T。
在一個實施例中，抗體之輕鏈結合包含至少一或多個，例如1、2、3、4、5、6、7、8或9個選自10K、11L、12V、13S、37A、38K、57T、130E或132A之胺基酸殘基或在其約4埃內之胺基酸殘基的人類aP2之抗原決定基，且具有至少約10-7M之KD。在一個實施例中，抗體之輕鏈結合包含至少一或多個，例如1、2、3、4、5、6或7個選自10K、11L、12V、13S、37A、38K、57T、130E或132A之胺基酸殘基或在其約4埃內之胺基酸殘基的人類aP2之抗原決定基，且具有至少約10-7M之KD。
在一個實施例中，抗體之輕鏈結合包含至少一或多個，例如1、2、3、4、5、6、7、8或9個選自10K、11L、12V、13S、37A、38K、57T、130E或132A之胺基酸殘基或在其約4埃內之胺基酸殘基的人類aP2之抗原決定基，且抗體之重鏈結合包含10K及132A中之至少一者或在其約4埃內之胺基酸的人類aP2之抗原決定基。在一個實施例中，抗體具有至少約10-7M之KD。
在一個實施例中，抗體之輕鏈結合包含至少一或多個，例如1、2、3、4、5、6或7個選自10K、11L、12V、13S、38K、130E或132A之胺基酸殘基或在其約4埃內之胺基酸殘基的人類aP2之抗原決定基，且抗體之重鏈結合包含10K及132A中之至少一者或在其約4埃內之胺基酸的人類aP2之抗原決定基，且具有至少約10-7M之KD。
在一個實施例中，抗體至少在10K結合於呈天然構形之人類aP2蛋白質。在一個實施例中，抗體至少在38K結合於呈天然構形之人類 aP2蛋白質。在一個實施例中，抗體至少在12V結合於呈天然構形之人類aP2蛋白質。在一個實施例中，抗體至少在11L結合於呈天然構形之人類aP2蛋白質。在一個實施例中，抗體至少在130E結合於呈天然構形之人類aP2蛋白質。在一個實施例中，抗體至少在132A結合於呈天然構形之人類aP2蛋白質。在一個實施例中，抗體至少在13S結合於呈天然構形之人類aP2蛋白質。在一個實施例中，抗體至少在11L及12V結合於呈天然構形之人類aP2蛋白質。在一個實施例中，抗體至少在130E及132A結合於呈天然構形之人類aP2蛋白質。在一個實施例中，抗體在上述特定胺基酸結合於呈天然構形之人類aP2蛋白質且具有約10-7M之KD。
在一個實施例中，抗體至少在10K及38K結合於呈天然構形之人類aP2蛋白質。在一個實施例中，抗體至少在10K、38K及12V結合於呈天然構形之人類aP2蛋白質。在一個實施例中，抗體至少在10K、38K、12V及11L結合於呈天然構形之人類aP2蛋白質。在一個實施例中，抗體至少在10K、38K、12V、11L及57T結合於呈天然構形之人類aP2蛋白質。在一個實施例中，抗體至少在10K、38K、12V、11L、57T及37A結合於呈天然構形之人類aP2蛋白質。在一個實施例中，抗體至少在10K、38K、12V、11L、57T、37A及130E結合於呈天然構形之人類aP2蛋白質。在一個實施例中，抗體至少在10K、38K、12V、11L、57T、37A、130E及132A結合於呈天然構形之人類aP2蛋白質。在一個實施例中，抗體至少在10K、38K、12V、11L、57T、37A、130E、132A及13S結合於呈天然構形之人類aP2蛋白質。
本文亦提供由本發明提供之抗體結合的人類aP2之特定區域或抗原決定基，尤其由包含輕鏈可變序列909gL1(Seq.ID No.446)、909gL10(Seq.ID No.448)、909gL13(Seq.ID No.487)、909gL50(Seq.ID No.488)、909gL54(Seq.ID No.450)或909gL55(Seq.ID No. 452)及/或重鏈可變序列909gH1(Seq.ID No.455)、909gH14(Seq.ID No.457)、909gH15(Seq.ID No.459)、909gH61(Seq.ID No.461)或909gH62(Seq.ID No.463)之抗體結合的抗原決定基。
本文提供之人類aP2蛋白質的此特定區域或抗原決定基可藉由此項技術中已知之任何適合之抗原決定基定位方法以及本發明提供之任一抗體來鑑別。此類方法之實例包括針對與本發明之抗體之結合，篩選來源於aP2之變化長度之肽，其中可特異性結合於抗體之最小片段含有抗體所識別之抗原決定基之序列。aP2肽可以合成方式或藉由蛋白分解消化aP2蛋白質產生。結合抗體之肽可藉由例如質譜分析來鑑別。在另一實例中，NMR光譜分析或X射線結晶學可用於鑑別本發明之抗體所結合之抗原決定基。用於確定aP2結構及aP2蛋白質與其天然結合搭配物，例如中鏈及長鏈脂肪酸之特定相互作用的結晶及X射線結晶學技術描述於Marr等人，Expression,purification,crystallization and structure of human adipocyte lipid-binding protein(aP2),Acta Cryst.(2006),F62,1058-1060中。一旦鑑別，結合本發明之抗體的抗原決定基片段必要時可用作免疫原以獲得結合相同抗原決定基之其他抗體。
在一個實例中，抗體分子之抗原決定基藉由X射線結晶學，使用aP2蛋白質(Seq.ID No.1)測定。
在一個實施例中，本發明之抗體在如表2中所定義之CDR域內包含在表2中定義之胺基酸接觸點與呈天然構形之小鼠或人類aP2蛋白質相互作用的至少一或多個特定胺基酸。
*指示如藉由Kabat編號所測定，在CDR區域外之接觸點
本發明之抗-aP2單株抗體可藉由CDR內在結合期間接觸呈天然構形形式之aP2蛋白質的特定胺基酸進一步界定。在一個實施例中，提供一種經純化之抗-aP2單株抗體，其包含在鑑別之特定位置包含以下胺基酸之輕鏈：CDRL1-27Glu、28Asp、30Ser；CDRL3-92Tyr、93Gly、94Thr、95Tyr、96Ala；以及100Phe。在一個實施例中，抗體結合於呈天然構形之人類aP2蛋白質且具有約10-7M之KD。在一個實施例中，抗-aP2單株抗體經人類化。
在一個實施例中，提供一種經純化之抗-aP2單株抗體，其包含在鑑別之位置包含以下胺基酸之輕鏈：CDRL1-27Glu、28Asp、30Ser；CDRL3-92Tyr、93Gly、94Thr、95Tyr、96Ala；以及100Phe；以及在鑑別之位置包含以下胺基酸之重鏈：104Leu。在一個實施例中，抗體結合於呈天然構形之人類aP2蛋白質且具有約10-7M之KD。在一個實施例中，抗-aP2單株抗體經人類化。
在一個實施例中，提供一種經純化之抗-aP2單株抗體，其包含在鑑別之位置包含以下胺基酸之輕鏈：CDRL3-91Ala；以及在鑑別之位置包含以下胺基酸之重鏈：CDRH1-33Ala；CDRH2-52Ser。在一個實施例中，重鏈在鑑別之位置下進一步包含以下胺基酸：CDRH3-98Phe。在一個實施例中，抗體結合於呈天然構形之人類aP2蛋白質且具有約10-7M之KD。在一個實施例中，抗-aP2單株抗體經人類化。
在一個實施例中，經純化之抗-aP2單株抗體僅僅經由或主要經由其輕鏈CDR結合於aP2。在一替代實施例中，經純化之抗-aP2單株抗體具有以比其重鏈CDR結合於aP2大的親和力結合於aP2之輕鏈CDR。
在一個實施例中，經純化之抗-aP2單株抗體之特徵為對呈天然構形形式之人類aP2具有低親和力。在一個實施例中，經純化之抗-aP2單株抗體對人類aP2之KD約10-7M之。在一個實施例中，經純化之 抗-aP2單株抗體對人類aP2之KD在約10-4至10-6M之間。在一個實施例中，經純化之抗-aP2單株抗體對人類aP2之KD約>500nM。在一個實施例中，經純化之抗-aP2單株抗體對人類aP2之KD為約500nM至約10μM。在一個實施例中，經純化之抗-aP2單株抗體對人類aP2之KD為約1μM至約7μM。在一個實施例中，經純化之抗-aP2單株抗體對人類aP2之KD為約2μM至約5μM。
在一替代實施例中，經純化之抗-aP2單株抗體對呈天然構形形式之小鼠aP2具有低結合親和力。在一個實施例中，經純化之抗-aP2單株抗體對小鼠aP2之KD約10-7M。在一個實施例中，經純化之抗-aP2單株抗體對小鼠aP2之KD在約10-4至10-6M之間。在一個實施例中，經純化之抗-aP2單株抗體對小鼠aP2之KD約>500nM。在一個實施例中，經純化之抗-aP2單株抗體對小鼠aP2之KD為約500nM至約10μM。在一個實施例中，經純化之抗-aP2單株抗體對小鼠aP2之KD為約1μM至約7μM。在一個實施例中，經純化之抗-aP2單株抗體對小鼠aP2之KD為約2μM至約5μM。
在一個實施例中，抗體特異性結合aP2，且不特異性結合於FABP5/Mal1。
在一個實施例中，提供一種經純化之抗-aP2單株抗體，及其製備方法，其中藉由鑑別對aP2之KD至少<10-7M的抗-aP2抗體，改變抗-aP2抗體之CDR區或FR區中之至少一個胺基酸來降低對aP2之親和力，其中該改變產生具有至少約10-7M之KD的抗-aP2抗體。在一個實施例中，改變之抗體能夠結合於呈天然構形形式之人類aP2。在一替代實施例中，改變之抗體能夠結合於呈天然構形形式之小鼠aP2。在一個實施例中，提供一種降低KD<10-7M之抗-aP2抗體之親和力的方法，其包含1)鑑別對aP2蛋白質之親和力至少<10-7M之單株抗體，2)鑑別CDR區內接觸呈天然構形形式之aP2蛋白質的胺基酸，及3)一 或多個接觸胺基酸經選自丙胺酸、苯丙胺酸及絲胺酸之胺基酸取代，其中該取代使得抗體之親和力降低至約10-7M之KD。在一個實施例中，CDRL3中之半胱胺酸殘基經取代。在一個實施例中，半胱胺酸殘基經選自丙胺酸、麩醯胺酸及組胺酸之胺基酸取代。
如藉由氫-氘交換所測定之aP2結合抗原決定基
在本發明之一個態樣中，經純化之單株抗體結合於如藉由氫-氘交換(HDX)所測定，包含Seq.ID No.1之胺基酸9-17、胺基酸20-28或胺基酸118-132中至少一個、例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個或更多個的人類aP2蛋白質之抗原決定基。在一個實施例中，經純化之單株抗體結合於包含Seq.ID No.1之胺基酸9-17(WKLVSSENF)(Seq.ID No.22)、胺基酸20-28(YMKEVGVGF)(Seq.ID No.23)或胺基酸118-132(CVMKGVTSTRVYERA)(Seq.ID No.24)中至少一個、例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個或更多個的人類aP2蛋白質之抗原決定基，且具有至少約10-7M之KD。在一個實施例中，當人類aP2蛋白質呈天然構形形式時，經純化之抗-aP2單株抗體結合於在Seq.ID No.1之胺基酸9-17、胺基酸20-28或胺基酸118-132中至少一者、例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10或更多者3-4埃之接觸點內的人類aP2蛋白質之抗原決定基。在一個實施例中，當人類aP2蛋白質呈天然構形形式時，經純化之抗-aP2單株抗體結合於在Seq.ID No.1之胺基酸9-17、胺基酸20-28或胺基酸118-132中至少一者、例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10或更多者3-4埃之接觸點內的人類aP2蛋白質之抗原決定基，且具有至少約10-7M之KD。測定結合相互作用及抗體-抗原決定基圖譜之氫-氘交換(HDX)為此項技術中所熟知，例如如Pandit等人(2012)J.Mol.Recognit.3月；25(3)：114-24(以引用的方式併入本文中))所描述。
抗-aP2抗體及抗原結合劑結構
已發現具有治療aP2介導之病症之優良及意外活性的抗-aP2單株抗體及抗原結合劑。在一個實施例中，提供抗-aP2單株抗體及片段，其含有具有可變區之輕鏈或輕鏈片段，其中該可變區包含一個、兩個或三個獨立地選自Seq.ID No.7、Seq.ID No.8及Seq.ID No.9、Seq.ID No.10、Seq.ID No.11、Seq.ID No.12及Seq.ID No.13之CDR。或者，所揭示及選擇之CDR中之一或多者可藉由不會不利地影響抗體或抗原接合劑之特性或改善該等特性之一或多個胺基酸(例如1、2、3、4、5、6、7或8個胺基酸)的取代來改變，如本文中進一步描述。在一個實施例中，所選擇之CDR置於人類免疫球蛋白構架中。在一個實施例中，人類免疫球蛋白構架經進一步修飾或改變以維持移植CDR區之結合親和力特異性。
因此，在另一個實施例中，已發現以約10-7M之KD之較弱結合親和力結合於呈分泌(非胞質)狀態之aP2蛋白質的抗體或抗原結合劑中和分泌aP2之能力改善且當以有效量提供給有需要之宿主時對aP2介導之病症產生顯著抑制作用。
在抗體分子中，存在兩條重鏈及兩條輕鏈。各重鏈及各輕鏈在其N端具有可變域。各可變域由四個構架區(FR)與三個互補決定區(CDR)交替構成。可變域中之殘基習知根據Kabat等人(上文)設計之系統或如上針對CDR-H1所述Kabat與Chothia之組合編號。除外另外指示，否則此編號系統用於本說明書中。
免疫球蛋白(Ig)為B細胞之抗原識別分子。Ig分子由2條相同重鏈及2條相同輕鏈κ或λ組成，該等重鏈及輕鏈藉由二硫鍵接合，使得各重鏈連接於輕鏈且2個重鏈連接在一起。κ及λ輕鏈無明顯功能差異。各Ig κ及λ輕鏈具有含有抗原結合位點之N端可變(V)區及由C區基因(IGKC或IGLC)編碼之提供信號傳導功能之C端恆定(C)區。κ及λ輕鏈V區由2種類型基因編碼：V基因及接合(J)基因。隨機選擇各類型僅1個 基因以組裝V區解釋Ig分子之間V區之巨大多樣性。人類染色體2上κ輕鏈基因座含有大約40個功能性V基因，接著為大約5個功能性J基因。人類染色體22上λ輕鏈基因座含有大約30個功能性V基因，接著為大約4個功能性J基因。由於多形現象，功能性V及J基因之數目在個體之間不同。
各Ig重鏈具有含有抗原結合位點之N端可變(V)區及由C區基因編碼之提供效應或信號傳導功能的C端恆定(C)區。重鏈V區由3種類型基因編碼：V基因、接合(J)基因及多樣性(D)基因。隨機選擇各類型僅1個基因以組裝V區解釋Ig分子之間V區之巨大多樣性。人類染色體14上重鏈基因座含有大約40個功能性V基因，接著為大約25個功能性D基因及大約6個功能性J基因。由於多形現象，功能性V、J及D基因之數目在個體之間不同。存在五種類型哺乳動物免疫球蛋白重鏈：γ、δ、α、μ及ε。其界定免疫球蛋白類別：分別為IgG、IgD、IgA、IgM及IgE。重鏈γ、α及δ具有由三個串聯(呈彼此緊挨之線)免疫球蛋白結構域構成之恆定區，但亦在CH1與CH2區之間具有鉸鏈區以添加可撓性。重鏈μ及ε具有由四個結構域構成之恆定區。
Kabat殘基名稱不總是直接與胺基酸殘基之線性編號對應。實際線性胺基酸序列可含有比對應於基礎可變域結構之結構組分(無論構架還是CDR)縮短或插入的嚴格Kabat編號中少之胺基酸或額外胺基酸。對於既定抗體，可藉由將抗體序列之同源殘基與「標準」Kabat編號序列比對來確定殘基之正確Kabat編號。
重鏈可變域之CDR位於根據Kabat編號殘基31-35(CDRH1)、殘基50-65(CDRH2)及殘基95-102(CDRH3)。然而，根據Chothia(Chothia等人，(1987)J.Mol.Biol.,196,901-917)，等同於CDR-H1之環自殘基26延伸至殘基32。因此，除非另外指示，否則如本文所採用之「CDR-H1」意欲指如Kabat編號系統與Chothia拓撲環定義之組合所 描述，殘基26至35。
輕鏈可變域之CDR位於根據Kabat編號殘基24-34(CDRL1)、殘基50-56(CDRL2)及殘基89-97(CDRL3)。用於本發明之抗體可使用此項技術中已知之任何適合方法獲得。包括融合蛋白之aP2蛋白質或表現該蛋白質之細胞(重組或天然)可用於產生特異性識別aP2之抗體。使用之aP2蛋白質可為完全生物活性蛋白質或其片段或衍生物。
用於免疫接種宿主之aP2蛋白質或肽可藉由此項技術中熟知之方法，自包含表現系統之基因工程改造之宿主細胞製備，或其可自天然生物來源回收。在一些情況下，aP2蛋白質可為諸如融合蛋白之更大蛋白質之一部分，例如與親和力標籤或類似物融合或與其天然存在之生物搭配物複合。
在需要將動物免疫接種下，藉由使用熟知及常規方案，向動物、較佳非人類動物投與蛋白質，可獲得針對aP2蛋白質產生之抗體，參見例如Handbook of Experimental Immunology,D.M.Weir(編輯)，第4卷，Blackwell Scientific Publishers,Oxford,England,1986)。諸如兔、小鼠、大鼠、羊、牛、駱駝或豬之許多溫血動物可經免疫接種。然而，小鼠、兔、豬及大鼠一般最適合。單株抗體可藉由此項技術中已知之任何方法，諸如融合瘤技術(Kohler及Milstein,1975,Nature,256：495-497)、三源融合瘤技術、人類B細胞融合瘤技術(Kozbor等人，1983,Immunology Today,4：72)及EBV-融合瘤技術(Cole等人，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，第77-96頁，Alan R Liss,Inc.,1985)製備。
用於本發明之抗體亦可使用單一淋巴細胞抗體方法，藉由選殖及表現免疫球蛋白可變區cDNA產生，免疫球蛋白可變區cDNA自針對特異性抗體產生所選擇之單一淋巴細胞，藉由例如Babcook,J.等人，1996,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93(15)：7843-78481；WO92/02551； WO2004/051268及國際專利申請案第WO2004/106377號描述之方法產生。可使用量測與人類aP2結合之分析及/或量測阻斷aP2與其天然受體結合之能力的分析篩選抗體。結合分析之一實例為ELISA，詳言之，使用人類aP2與人類Fc之融合蛋白，其固定在培養盤上，且採用二級抗體偵測結合至融合蛋白的抗-aP2抗體。適合拮抗及阻斷分析之實例描述於本文中之實例中。
人類化抗體(其包括CDR移植抗體)為具有一或多個來自非人類物種(例如兔或小鼠)之互補決定區(CDR)及來自人類免疫球蛋白分子之構架區的抗體分子(參見例如US 5,585,089；WO91/09967)。應瞭解可能僅僅需要轉變CDR之特異性決定殘基而非整個CDR(參見例如Kashmiri等人，2005,Methods,36,25-34)。人類化抗體可視情況進一步包含一或多個來源於CDR所來源之非人類物種的構架殘基。後者常常稱為供體殘基。本發明之抗體分子宜具有約10-7M、尤其在微莫耳(μM)範圍內之結合親和力。親和力可使用此項技術中已知之任何適合方法，包括如本文中之實例中所述之BIAcore，使用經分離之天然或重組aP2或適合融合蛋白/多肽量測。在本文中描述之一個實施例中，本文中描述之抗-aP2單株抗體之結合親和力可包括具有約10-7M之KD的抗體。在一個實施例中，經純化之抗-aP2單株抗體對人類aP2之KD在約10-4至10-6之間。在一個實施例中，經純化之抗-aP2單株抗體對人類aP2之KD為約2至約5μM。
在一個實例中，本發明之抗體不結合FABP5/Mal1。在一個實例中，本發明之抗體結合呈天然非線性結構構形之aP2。
本發明之抗體或抗原結合劑之親和力以及結合劑(諸如抗體)抑制結合之程度可藉由一般技術者，使用習知技術，例如Scatchard等人描述之技術(Ann.KY.Acad.Sci.51：660-672(1949))或藉由表面電漿子共振(SPR)，使用諸如BIAcore之系統測定。對於表面電漿子共振，標靶 分子係固定於固相上且在沿流槽流動之移動相中暴露於配位體。若發生配位體結合於固定標靶，則局部折射率改變，導致SPR角變化，其可藉由偵測反射光強度之變化而進行即時監測。可分析SPR信號之變化速率以針對結合反應之締合及解離相產生表觀速率常數。此等值之比率產生表觀平衡常數(親和力)(參見例如Wolff等人，Cancer Res.53：2560-65(1993))。
在本發明中，測試抗體分子之親和力通常使用SPR如下測定。測試抗體分子捕捉在固相上且人類aP2在移動相中流過捕捉抗體，且測定測試抗體分子對人類aP2之親和力。測試抗體分子可使用任何適當方法，例如使用抗-Fc或抗Fab'特異性捕捉試劑捕捉在固相晶片表面上。在一個實例中，親和力在pH 6下測定。在一個實例中，親和力在pH 7.4下測定。
應瞭解本發明提供之抗體之親和力可使用此項技術中已知之任何適合方法改變。因此，本發明亦關於本發明之抗體分子之變異體，其具有改善之對aP2之親和力。如本文中進一步描述，亦涵蓋高親和力抗人類aP2抗體之修飾，以降低KD至至少約10-7M。此類變異體可藉由許多親和力成熟方案獲得，包括使CDR突變(Yang等人，J.Mol.Biol.,254,392-403,1995)、鏈改組(Marks等人，Bio/Technology,10,779-783,1992)、使用大腸桿菌之增變基因菌株(Low等人，J.Mol.Biol.,250,359-368,1996)、DNA改組(Patten等人，Curr.Opin.Biotechnol.,8,724-733,1997)、噬菌體呈現(Thompson等人，J.Mol.Biol.,256,77-88,1996)及性PCR(Crameri等人，Nature,391,288-291,1998)。Vaughan等人(上文)論述此等親和力成熟方法。
CDR區
在本發明之一個態樣中，提供結合於呈天然構形之aP2蛋白質的抗-aP2單株抗體或抗原結合劑，其中該抗體包含至少一個或超過一個 表3中提供之CDR區。
在一個態樣中，提供一種經純化之抗-aP2單株抗體或抗原結合片段，其包含輕鏈，其中該可變域包含一個、兩個或三個獨立地選自CDRL1(QASEDISRYLV)(Seq.ID No.7)、CDRL1變異體1(SVSSSISSSNLH)(Seq.ID No.597)、CDRL2(KASTLAS)(Seq.ID No.8)、CDRL2變異體1(GTSNLAS)(Seq.ID No.598)、CDRL3(QCTYGTYAGSFFYS)(Seq.ID.No.9)、CDRL3變異體1(QATYGTYAGSFFYS)(Seq.ID No.10)、CDRL3變異體2(QQTYGTYAGSFFYS)(Seq.ID No.11)、CDRL3變異體3(QHTYGTYAGSFFYS)(Seq.ID No.12)、CDRL3變異體4(QQASHYPLT)(Seq.ID No.13)或CDRL3變異體5(QQWSHYPLT)(Seq.ID No.599)的CDR。在一個實施例中，本文提供一種抗體或抗原結合劑，其包含含有CDRL1(Seq.ID No.7)、CDRL2(Seq.ID No.8)及CDRL3(Seq.ID No. 9)的輕鏈可變區。在一個實施例中，本文提供一種抗體或抗原結合劑，其包含含有CDRL1(Seq.ID No.7)、CDRL2(Seq.ID No.8)及CDRL3變異體1(Seq.ID No.10)的輕鏈可變區。在一個實施例中，本文提供一種抗體或抗原結合劑，其包含含有CDRL1(Seq.ID No.7)、CDRL2(Seq.ID No.8)及CDRL3變異體2(Seq.ID No.11)的輕鏈可變區。在一個實施例中，本文提供一種抗體或抗原結合劑，其包含含有CDRL1(Seq.ID No.7)、CDRL2(Seq.ID No.8)及CDRL3變異體3(Seq.ID No.12)的輕鏈可變區。
在一個實施例中，本文提供一種抗體或抗原結合劑，其包含含有CDRL3變異體4(Seq.ID No.13)的輕鏈可變區，其中該抗體具有約10-7M之KD。在一個實施例中，本文提供一種抗體或抗原結合劑，其包含含有CDRL1變異體1(Seq.ID No.597)、CDRL2變異體1(Seq.ID No.598)及CDRL3變異體4(Seq.ID No.13)的輕鏈可變區。在一個實施例中，本文提供一種抗體或抗原結合劑，其包含含有CDRL3變異體4(Seq.ID No.13)之輕鏈可變區及含有CDHR1變異體1(GYTFTSNAIT)(Seq.ID No.15)、CDRH2變異體2(DISPGSGSTTNNEKFKS)(Seq.ID No.18)及在一個實施例中CDRH3變異體2(LRGFYDYFDF)(Seq.ID No.21)之重鏈可變區。
在一個實施例中，抗體或抗原結合劑包含一個、兩個或三個選自CDRL1(Seq.ID No.7)、CDRL2(Seq.ID No.8)、CDRL3(Seq.ID No.9)、CDRL3變異體1(Seq.ID No.10)、CDRL3變異體2(Seq.ID No.11)、CDRL3變異體3(Seq.ID No.12)及CDRL3變異體4(Seq.ID No.13)之CDR，且具有約10-7M之KD。在一個實施例中，以上鑑別之CDR序列移植至人類免疫球蛋白構架中。在一個實施例中，人類免疫球蛋白構架經進一步修飾或改變，例如在維尼爾區內，以維持移植CDR區之結合親和力特異性。
在一個實施例中，提供經純化之抗-aP2單株抗體或抗原結合劑，其包含輕鏈，其中可變域包含一個、兩個或三個獨立地選自與CDRL1(Seq.ID No.7)、CDRL2(Seq.ID No.8)、CDRL3(Seq.ID No.9)、CDRL3變異體1(Seq.ID No.10)、CDRL3變異體2(Seq.ID No.11)、CDRL3變異體3(Seq.ID No.12)或CDRL3變異體4(Seq.ID No.13)至少80%、85%、90%或95%同源之胺基酸序列的CDR。在一個實施例中，抗體或抗原結合劑具有約10-7M之KD。在一個實施例中，以上鑑別之CDR序列移植至人類免疫球蛋白構架中。在一個實施例中，人類免疫球蛋白構架經進一步修飾或改變，例如在維尼爾區內，以維持移植CDR區之結合親和力特異性。在一個實施例中，提供經純化之抗-aP2單株抗體或抗原結合劑，其包含輕鏈，其中可變域包含一個、兩個或三個獨立地選自如與CDRL1(Seq.ID No.7)、CDRL2(Seq.ID No.8)、CDRL3(Seq.ID No.9)、CDRL3變異體1(Seq.ID No.10)、CDRL3變異體2(Seq.ID No.11)、CDRL3變異體3(Seq.ID No.12)或CDRL3變異體4(Seq.ID No.13)相比具有一個或多個(例如1、2、3或4個)胺基酸取代、添加或缺失之胺基酸序列的CDR。
在一個態樣中，提供一種經純化之抗-aP2單株抗體或抗原結合劑，其包含輕鏈，其中可變域包含一個、兩個或三個選自CDRL1(Seq.ID No.7)、CDRL2(Seq.ID No.8)、CDRL3(Seq.ID No.9)、CDRL3變異體1(Seq.ID No.10)、CDRL3變異體2(Seq.ID No.11)、CDRL3變異體3(Seq.ID No.12)或CDRL3變異體4(Seq.ID No.13)的CDR，及一個、兩個或三個選自CDRH1(GFSLSTYYMS)(Seq.ID NO.14)、CDRH1變異體1(Seq.ID No.15)、CDRH1變異體2(GYTFTSNWIT)(Seq.ID No.600)、CDRH2(IIYPSGSTYCASWAKG)(Seq.ID No.16)、CDRH2變異體1(IIYPSGSTYSASWAKG)(Seq.ID No.17)、CDRH2變異體2(Seq.ID No.18)、CDRH2變異體3 (DIYPGSGSTTNNEKFKS)(Seq.ID No.601)、CDHR3(PDNDGTSGYLSGFGL)(Seq.ID No.19)、CDRH3變異體1(PDNEGTSGYLSGFGL)(Seq.ID No.20)、CDRH3變異體2(Seq.ID No.21)或CDRH3變異體3(LRGYYDYFDFW)(Seq.ID No.602)的CDR。在一個實施例中，本文提供一種抗體或抗原結合劑，其包含含有CDRH1變異體1(Seq.ID No.15)、CDRH2變異體2(Seq.ID No.18)及CDRH3變異體3(Seq.ID No.602)之重鏈可變區。在一個實施例中，本文提供一種抗體或抗原結合劑，其包含含有CDRH1變異體1(Seq.ID No.15)、CDRH2變異體2(Seq.ID No.18)及CDRH3變異體2(Seq.ID No.21)之重鏈可變區。在一個實施例中，抗體或抗原結合劑具有約10-7M之KD。在一個實施例中，以上鑑別之CDR序列移植至人類免疫球蛋白構架中。在一個實施例中，人類免疫球蛋白構架經進一步修飾或改變，例如在維尼爾區內，以維持移植CDR區之結合親和力特異性。
在一個實施例中，抗體或抗原結合劑包含一個、兩個或三個選自CDRH1(Seq.ID NO.14)、CDRH1變異體1(Seq.ID No.15)、CDRH2(Seq.ID No.16)、CDRH2變異體1(Seq.ID No.17)、CDRH2變異體2(Seq.ID No.18)、CDRH3(Seq.ID No.19)、CDRH3變異體1(Seq.ID No.20)或CDRH3變異體2(Seq.ID No.21)的CDR，且具有約10-7M之KD。在一個實施例中，抗體或抗原結合劑包含CDR CDRH1(Seq.ID No.14)、CDRH2(Seq.ID No.16)及CDRH3(Seq.ID No.19)。在一個實施例中，抗體或抗原結合劑包含CDR CDRH1(Seq.ID No.14)、CDRH2變異體1(Seq.ID No.17)及CDHR3變異體1(Seq.ID No.20)。在一個實施例中，抗體包含CDR CDRH1變異體1(Seq.ID No.15)及CDRH2變異體2(Seq.ID No.18)。在一個實施例中，抗體包含CDR CDRH1變異體1(Seq.ID No.15)及CDRH2變異體2(Seq.ID No.18)及CDRH3變異體2(Seq.ID No.21)。在一個實施例中，以上鑑別之CDR序列移植至人類免疫球蛋白構架中。在一個實施例中，人類免疫球蛋白構架經進一步修飾或改變，例如在維尼爾區內，以維持移植CDR區之結合親和力特異性。在一個實施例中，抗體或抗原結合劑包含一個、兩個或三個選自與CDRH1(Seq.ID NO.14),CDRH1變異體1(Seq.ID No.15)、CDRH2(Seq.ID No.16)、CDRH2變異體1(Seq.ID No.17)、CDRH2變異體2(Seq.ID No.18)、CDRH3(Seq.ID No.19)、CDRH3變異體1(Seq.ID No.20)或CDRH3變異體2(Seq.ID No.21)相比具有一或多個(例如1、2、3或4個)胺基酸取代、添加或缺失之胺基酸序列的CDR。
在一個實施例中，提供一種經純化之抗-aP2單株抗體或抗原結合劑，其包含重鏈，其中可變域包含一個、兩個或三個選自與CDRH1(Seq.ID No.14)、CDRH1變異體1(Seq.ID No.15)、CDRH2(Seq.ID No.16)、CDRH2變異體1(Seq.ID No.17)、CDRH2變異體2(Seq.ID No.18)、CDRH3(Seq.ID No.19)、CDRH3變異體1(Seq.ID No.20)或CDRH3變異體2(Seq.ID No.21)至少80%、85%、90%或95%同源之胺基酸序列的CDR。在一個實施例中，抗體或抗原結合劑具有約10-7M之KD。在一個實施例中，以上鑑別之CDR序列移植至人類免疫球蛋白構架中。在一個實施例中，人類免疫球蛋白構架經進一步修飾或改變，例如在維尼爾區內，以維持移植CDR區之結合親和力特異性。
CDR可經改變或修飾以提供改善之結合親和力，將移植至不同主鏈中時結合親和力之喪失降至最低，或減少CDR與雜交構架之間的不必要相互作用，如下文進一步描述。
人類化抗體及抗原結合劑
在本發明之一個態樣中，本文提供人類化抗-aP2單株抗體及抗原結合劑。人類化抗體為其中重鏈及/或輕鏈含有一或多個來自供體抗 體(例如非人類抗體，諸如鼠類或兔單株抗體)之CDR(包括必要時一或多個經修飾之CDR)移植至接受體抗體(例如人類抗體)之重鏈及/或輕鏈可變區構架中的抗體。評論參見Vaughan等人，Nature Biotechnology,16,535-539,1998。
在一個實施例中，不是轉移整個CDR，僅僅來自以上本文所述之任一CDR的一或多個特異性決定殘基轉移至人類抗體構架(參見例如Kashmiri等人，2005,Methods,36,25-34)。在一個實施例中，僅僅來自本文中描述之一或多個CDR的特異性決定殘基轉移至人類抗體構架。在另一個實施例中，僅僅來自本文中描述之各CDR的特異性決定殘基轉移至人類抗體構架。
當移植CDR或特異性決定殘基時，關於CDR來源於之供體抗體的類別/類型，可使用任何適當接受體可變區構架序列，包括小鼠、兔、靈長類動物及人類構架區。
適當地，根據本發明之人類化抗體具有包含人類受體構架區以及一或多個本文中特定提供之CDR的可變域。因此，一實施例中提供一種結合人類aP2之人類化單株抗體，其中可變域包含人類受體構架區及非人類供體CDR。
CDR移植抗體之構築一般描述於歐洲專利申請案EP-A-0239400中，該專利申請案揭示一種方法，其中藉由定點突變誘發，使用長寡核苷酸將小鼠單株抗體之CDR移植至人類免疫球蛋白之可變域的構架區上，且併入本文中。CDR決定抗體之抗原結合特異性且為可變結構域之構架區上攜帶之相對較短之肽序列。
關於藉由CDR移植將單株抗體人類化之最早工作在識別諸如NP之合成抗原之單株抗體進行。然而，Verhoeyen等人(Science,239,1534-1536,1988)及Riechmann等人(Nature,332,323-324,1988)已分別描述其中識別溶菌酶之小鼠單株抗體及識別人類T細胞上抗原之大鼠 單株抗體藉由CDR移植人類化的實例。抗體人類化藉由諸如小鼠、大鼠、山羊或兔抗體之非人類抗體之CDR移植至「類似」人類構架(接受體)上且選擇最少數目之人工選自供體單株抗體且併入人類接受體構架中的關鍵構架殘基(回復突變)以維持原始CDR構形來實現。此類方法為此項技術中已知，且包括以下中描述之彼等方法：Jones等人，Nature 321：522(1986)；Verhoeyen等人，Science 239：1534(1988))；Sims等人，J.Immunol.151：2296(1993)；Chothia及Lesk,J.Mol.Biol.196：901(1987)；Carter等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89：4285(1992)；Presta等人，J.Immunol.151：2623(1993),Padlan,Molecular Immunology 28(4/5)：489-498(1991)；Studnicka等人，Protein Engineering 7(6)：805-814(1994)；Roguska.等人，PNAS 91：969-973(1994)；PCT公開案WO 91/09967、PCT/：US98/16280、US96/18978、US91/09630、US91/05939、US94/01234、GB89/01334、GB91/01134、GB92/01755；WO90/14443、WO90/14424、WO90/14430、EP 229246、EP 592,106；EP 519,596、EP 239,400、U.S.Pat.Nos.5,565,332、5,723,323、5,976,862、5,824,514、5,817,483、5,814,476、5,763,192、5,723,323、5,766,886、5,714,352、6,204,023、6,180,370、5,693,762、5,530,101、5,585,089、5,225,539；4,816,567，其併入本文中。
人類可變重鏈及輕鏈生殖系子家族分類可來源於Kabat生殖系亞群名稱：特定VH序列為VH1、VH2、VH3、VH4、VH5、VH6或VH7，以及構架4之特定可變重鏈接合組為JH1、JH2、JH3、JH4、JH5及JH6；構架1、2及3之特定VL κ序列為VK1、VK2、VK3、VK4、VK5或VK6，以及構架4之特定κ接合組為JK1、JK2、JK3、JK4或JK5；或構架1、2及3之特定VLλ序列為VL1、VL2、VL3、VL4、VL5、VL6、VL7、VL8、VL9或VL10，以及構架4之特定λ接合組為 JL1、JL2、JL3或JL7。
在一個實施例中，本文中涵蓋之輕鏈之一般構架包含選自FR1-CDRL1-FR2-CDRL2-FR3-CDRL3-FR4及FR1-CDRL1-FR2-CDRL2-FR3-CDRL3-FR4-CL之結構，及其變異體，其中CDR區係選自至少一個選自Seq.ID No.7-13之可變輕鏈CDR，構架區係選自例如如表4(Seq.ID No.25-149)中提供之免疫球蛋白κ輕鏈可變構架區，或例如如表5(Seq.ID No.150-246)中提供之免疫球蛋白λ輕鏈可變構架區，且當構架區為κ輕鏈可變構架區時免疫球蛋白輕鏈恆定區來自κ輕鏈恆定區(Seq.ID No.247)，或當構架區為一種輕鏈可變構架區時免疫球蛋白輕鏈恆定區來自λ輕鏈恆定區(Seq.ID No.248)。
在一個實施例中，本文中涵蓋之重鏈區之一般構架包含選自FR1-CDRH1-FR2-CDRH2-FR3-CDRH3-FR4、FR1-CDRH1-FR2-CDRH2-FR3-CDRH3-FR4-CH1；IgG、IgD及IgA免疫球蛋白類別為FR1-CDRH1-FR2-CDRH2-FR3-CDRH3-FR4-CH1-鉸鏈-CH2；以及IgM及IgE免疫球蛋白類別為FR1-CDRH1-FR2-CDRH2-FR3-CDRH3-FR4-CH1-CH2；IgG、IgD及IgA免疫球蛋白類別為FR1-CDRH1-FR2-CDRH2-FR3-CDRH3-FR4-CH1-鉸鏈-CH2-CH3；IgM及IgE免疫球蛋白類別為FR1-CDRH1-FR2-CDRH2-FR3-CDRH3-FR4-CH1-CH2-CH3；以及IgM及IgE免疫球蛋白類別為FR1-CDRH1-FR2-CDRH2-FR3-CDRH3-FR4-CH1-CH2-CH3-CH4，以及其變異體，其中CDR區係選自至少一個選自Seq.ID No.14-21之可變重鏈CDR，且構架區係選自表7中描述之重鏈可變構架區(Seq.ID No.249-407)，且重鏈恆定區係選自例如表8中提供之重鏈恆定區(Seq.ID No.408-443)。IgA及IgM類別可進一步包含表9中提供之用以分別將IgM或IgA之兩個單體單元連接在一起的接合多肽(Seq.ID No.444)。在IgM之情況下，J鏈接合之二聚體為IgM五聚體之成核單元，且在IgA之情況下，其誘導更大聚合物。
本發明之抗體分子之恆定區結構域若存在則可根據抗體分子之所提議功能及尤其可能需要之效應功能選擇。舉例而言，恆定區結構域可為人類IgA、IgD、IgE、IgG或IgM結構域。在特定實施例中，當抗體分子意欲用於治療性用途且需要抗體效應功能時，可使用人類IgG恆定區結構域，尤其IgG1及IgG3同型。或者，當抗體分子意欲用於達成治療目的且不需要抗體效應功能時可使用IgG2及IgG4同型。應瞭解亦可使用此等恆定區結構域之序列變異體。舉例而言，可使用如Angal等人，Molecular Immunology,1993,30(1),105-108中所述，其中位置241之絲胺酸已改變成脯胺酸的IgG4分子。熟習此項技術者亦瞭解抗體可進行多種轉譯後修飾。此等修飾之類型及程度常常視用於表現抗體之宿主細胞株以及培養條件而定。此類修飾可包括糖基化變化、甲硫胺酸氧化、二酮哌嗪形成、天冬胺酸鹽異構化及天冬醯胺去醯胺。常見修飾為由於羧基肽酶作用而喪失羧基端基礎殘基(諸如離胺酸或精胺酸)(如Harris,RJ.Journal of Chromatography 705：129-134,1995中所述)。因此，可缺乏抗體重鏈之C端離胺酸。
在一個實施例中，抗-aP2單株抗體包含至少一個選自CDRL1(Seq.ID No.7)、CDRL2(Seq.ID No.8)、CDRL3(Seq.ID No.9)或CDRL3變異體1(Seq.ID No.10)、CDRL3變異體2(Seq.ID No.11)、CDRL3變異體3(Seq.ID NO.12)及CDRL3變異體4(Seq.ID No.13)之輕鏈CDR，及/或至少一個選自CDRH1(Seq.ID No.14)、CDRH1變異體1(Seq.ID No.15)、CDRH2(Seq.ID No.16)、CDRH2變異體1(Seq.ID No.17)、CDRH2變異體2(Seq.ID No.18)、CDRH3(Seq.ID No.19)、CDRH3變異體1(Seq.ID No 20)或CDRH3變異體2(Seq.ID No.21)之重鏈CDR，或其組合或變異體，其中CDR分別移植至人類輕鏈或重鏈可變構架中。
在一個實施例中，抗-aP2單株抗體包含一個、兩個或三個選自 CDRL1(Seq.ID No.7)、CDRL2(Seq.ID No.8)、CDRL3(Seq.ID No.9)、CDRL3變異體1(Seq.ID No.10)、CDRL3變異體2(Seq.ID No.11)、CDRL3變異體3(Seq.ID NO.12)及CDRL3變異體4(Seq.ID No.13)或其組合或變異體之輕鏈CDR，其移植至人類接受體輕鏈構架中。在一個實施例中，抗-aP2單株抗體包含含有CDRL1(Seq.ID No.7)、CDRL2(Seq.ID No.8)及CDRL3(Seq.ID No.9)或CDRL3變異體1(Seq.ID No.10)或CDRL3變異體2(Seq.ID No.11)或CDRL3變異體3(Seq.ID No.12)或其組合或變異體的可變輕鏈，其移植至人類接受體輕鏈構架中。在一個實施例中，人類接受體輕鏈構架來源於由構架1、2及3之人類IGKV(VLκ)基因及構架4之IGKJ基因編碼的胺基酸序列。在一個實施例中，人類接受體輕鏈構架來源於由構架1、2及3之人類IGLV(VLλ)基因及構架4之IGLJ基因編碼的胺基酸序列。人類輕鏈IGKV及IGKJ接受體構架區之非限制性實例提供於例如表4中，且人類輕鏈IGLV及IGLJ接受體構架區之非限制性實例提供於例如表5中。
用於本發明之免疫球蛋白恆定輕鏈區由移植CDR之可變輕鏈決定。舉例而言，若可變輕鏈FR區來源於免疫球蛋白κ輕鏈可變區，則來自免疫球蛋白κ輕鏈恆定區(IGKC)之恆定輕鏈區可用於產生輕鏈VL-CL鏈。可用於本發明中之IGKC包括以下表6中之Seq.ID No.247。相反，當構架區為免疫球蛋白λ輕鏈可變區時，免疫球蛋白λ輕鏈恆定區(IGLC)可用於產生λ VL-CL輕鏈。可用於本發明中之免疫球蛋白λ輕鏈恆定區包括以下表6中之(Seq.ID No.248)及其對偶基因變異體，其一般為此項技術中已知，如例如OMIM條目147200中關於IGKC變異體及OMIM條目147220中關於IGLC變異體所鑑別。
在一個實施例中，抗-aP2單株抗體具有至少一個選自CDRH1(Seq.ID No.14)、CDRH1變異體1(Seq.ID No.15)、CDRH2(Seq.ID No.16)、CDRH2變異體1(Seq.ID No.17)、CDRH2變異體2(Seq.ID No.18)、CDRH3(Seq.ID No 19)、CDRH3變異體1(Seq.ID No.20)、CHRH3變異體2(Seq.ID No.21)或其組合或變異體之重鏈CDR，其移植至人類接受體重鏈構架中。在一個實施例中，抗-aP2單株抗體包含CDR CDRH1(Seq.ID No.14)、CDRH2(Seq.ID No.16)、CDRH3(Seq.ID No.19)或其變異體，其移植至人類接受體重鏈構架中。在一 個實施例中，抗-aP2單株抗體包含CDR CDRH1(Seq.ID No.14)、CDRH2變異體1(Seq.ID No.17)或CDRH3變異體1(Seq.ID No 20)或其變異體，其移植至人類接受體重鏈構架中。在一個實施例中，抗-aP2單株抗體包含CDR CDRH1變異體1(Seq.ID No.15)及CDRH2變異體2(Seq.ID No.18)或其變異體，其移植至人類接受體重鏈構架中。在一個實施例中，抗-aP2單株抗體包含CDR CDRH1變異體1(Seq.ID No.15)、CDRH2變異體2(Seq.ID No.18)或CDRH3變異體2(Seq.ID No 21)或其變異體，其移植至人類接受體重鏈構架中。在一個實施例中，人類接受體重鏈構架來源於由人類IGHV基因(構架1、2及3)及IGHJ基因(構架4)編碼之胺基酸序列。人類重鏈IGHV及IGHJ接受體構架區之非限制性實例提供於例如表7中。
用於本發明之免疫球蛋白重鏈恆定區對所需免疫球蛋白類別為決定性的。免疫球蛋白之所有類別-IgG、IgD、IgA、IgM及IgE涵蓋於本文中。舉例而言，若所需免疫球蛋白為IgG，則可使用編碼IgG重鏈恆定區(IGGH)之胺基酸序列。可用於本發明中之免疫球蛋白重鏈恆定區包括以下表8中提供之IGGH、IGDH、IGAH、IGMH及IGEH(Seq.ID No.408-443)之重鏈恆定區及其對偶基因變異體，其一般為此項技術中已知，如例如OMIM條目147100中關於IGGH1變異體、OMIM條目147110中關於IGGH2變異體、OMIM條目147120中關於IGGH3變異體、OMIM條目147130中關於IGGH4變異體、OMIM條目146900中關於IGAH1變異體、OMIM條目147000中關於IGAH2變異體、OMIM條目147180中關於IGEH變異體、OMIM條目147020中關於IGMH變異體、OMIM條目147170中關於IGDH變異體所鑑別，均以引用的方式併入本文中。在某一實施例中，特定免疫球蛋白類別之鉸鏈區可用於構築本文中涵蓋之抗體。在一個實施例中，鉸鏈區可來源於如表8中所述之天然鉸鏈區胺基酸序列(Seq.ID No.409、413、417、425、429、433及437)或其變異體。在一個實施例中，鉸鏈區可以合 成方式產生。本文中進一步涵蓋免疫球蛋白類別IgA及IgM之抗體，在一個實施例中，其可與表9中描述之接合多肽或其變異體複合。
表9. IgA及IgM類別抗體之接合多肽
CDR及人類構架修飾
Riechmann等人發現單獨CDR之轉移(如Kabat(Kabat等人(上文))及Wu等人，J.Exp.Med.,132,211-250,1970)所定義)不足以在CDR移植產物中提供令人滿意之抗原結合活性。發現許多構架殘基必須作出改變，使得其對應於供體構架區之殘基。用於選擇哪些構架殘基需要作出改變之所提議準則描述於國際專利申請案WO 90/07861中，該專利申請案併入本文中。
若人類可變域構架採用與CDR所來源之非人類可變構架相同或類似的構形，則非人類CDR取代至人類可變域構架中最可能保留CDR正確空間取向。此藉由自構架序列展現與CDR所來源之非人類可變構架域高度序列一致性的人類抗體獲得人類可變結構域來實現。如上所述，重鏈及輕鏈可變構架區可來源於相同或不同人類抗體序列。人類抗體序列可為天然存在之人類抗體之序列或可為若干人類抗體之共同序列。參見Kettleborough等人，Protein Engineering 4：773(1991)；Kolbinger等人，Protein Engineering 6：971(1993)及Carter等人，WO 92/22653。
已鑑別非人類供體免疫球蛋白及適當人類接受體免疫球蛋白之互補決定區，下一步為確定來自此等組件之哪些殘基(若存在)應經取代以最佳化所得人類化抗體之特性。一般而言，人類胺基酸殘基經非人類胺基酸殘基取代應減至最少，因為非人類殘基之引入增加人類中抗體引發人類-抗供體-抗體(HADA)反應之風險。可進行此項技術中公認之確定免疫反應之方法以監測特定宿主中或臨床試驗期間之HADA反應。在該療法投與開始及整個過程中，可給予投與人類化抗體之宿主免疫原性評估。例如藉由使用熟習此項技術者已知之方法， 包括表面電漿子共振技術(BIACORE)及/或固相ELISA分析，偵測來自宿主之血清樣品中人類化治療試劑之抗體來量測HADA反應
部分藉由電腦模型化來選擇用於取代之胺基酸殘基。在本文中描述用於產生免疫球蛋白分子之三維影像之電腦硬體及軟體。一般而言，分子模型自免疫球蛋白鏈或其結構域之解析結構開始產生。比較待模型化之鏈與解析之三維結構之鏈或結構域的胺基酸序列類似性，且選擇展示最大序列類似性之鏈或結構域作為構築分子模型之起點。選擇共享至少50%序列一致性之鏈或結構域用於模型化，且較佳選擇共享至少60%、70%、80%、90%序列一致性或更大序列一致性的鏈或結構域用於模型化。解析之起始結構經修飾以允許模型化之免疫球蛋白鏈或結構域中實際胺基酸與起始結構中之胺基酸之間的差異。接著經修飾之結構組裝成複合免疫球蛋白。最終，模型藉由能量最小化及藉由驗證所有原子在彼此適當距離內且鍵長及鍵角在化學上可接受之限度內來改進。
選擇胺基酸殘基用於取代亦可部分藉由檢查特定位置之胺基酸的特徵，或特定胺基酸之取代或突變誘發之作用的實驗觀測結果來確定。舉例而言，當供體可變區構架殘基與所選人類可變區構架殘基之間胺基酸不同時，當合理地預期胺基酸如下時人類構架胺基酸通常應經來自供體抗體之同等構架胺基酸取代：(1)直接非共價結合抗原，(2)與CDR區相鄰，(3)另外與CDR區(例如如藉由電腦模型化所測定，CDR區之約3-6埃內)相互作用，或(4)參與VL-VH界面。
「直接非共價結合抗原」之殘基包括構架區中根據已確立之化學力，例如藉由氫鍵、凡得瓦爾力(Van der Waal force)、疏水相互作 用及其類似作用，很可能直接與抗原上胺基酸相互作用之位置中的胺基酸。CDR及構架區如藉由上文Kabat等人或Chothia等人所定義。當如藉由上文Kabat等人所定義之構架殘基構成如上文Chothia等人所定義之結構環殘基時，可選擇存在於供體抗體中之胺基酸用於取代至人類化抗體中。「與CDR區相鄰」之殘基包括緊鄰人類化免疫球蛋白鏈之一級序列中一或多個CDR之位置中，例如緊鄰如Kabat所定義之CDR或如Chothia所定義之CDR之位置中的胺基酸殘基(參見例如Chothia及Lesk 1MB 196：901(1987))。此等胺基酸尤其可能與CDR中之胺基酸相互作用，且若選自接受體，則使供體CDR變形且降低親和力。此外，相鄰胺基酸可直接與抗原相互作用(Amit等人，Science,233：747(1986)，其以引用的方式併入本文中)且可希望自供體選擇此等胺基酸保持提供原始抗體中親和力之所有抗原接觸。
「另外與CDR區相互作用」之殘基包括藉由二級結構分析確定呈足夠實現CDR區之空間取向的殘基。在一個實施例中，「另外與CDR區相互作用」之殘基藉由分析供體免疫球蛋白之三維模型(例如電腦產生之模型)鑑別。通常原始供體抗體之三維模型展示在CDR外之某些胺基酸接近CDR且很可能與CDR中之胺基酸藉由氫鍵、凡得瓦爾力、疏水相互作用等相互作用。在彼等胺基酸位置，可選擇供體免疫球蛋白胺基酸而非接受體免疫球蛋白胺基酸。根據此標準之胺基酸一般將在CDR中一些原子約3埃單位(A)內具有側鏈原子，且必須含有可與CDR原子根據已確立之化學力、諸如上列化學力相互作用的原子。在可形成氫鍵之原子之情況下，在其核之間量測3Å，但對於未形成一鍵之原子，在其凡得瓦爾力表面之間量測3Å。因此，在後一情況下，對於認為能夠相互作用之原子，核必須在約6Å內(3Å加凡得瓦爾力半徑總和)。在多數情況下，核將相隔4或5至6Å。在確定胺基酸是否可與CDR相互作用時，較佳不考慮重鏈CDR 2之最後8個胺基酸座 位CDR之一部分，因為出於結構之觀點，此8胺基酸更多表現為構架之一部分。
能夠與CDR中胺基酸相互作用之胺基酸可用又一種方式鑑別。各構架胺基酸之溶劑可及表面積以兩種方式計算：(1)完整抗體中，及(2)由移除CDR之抗體組成的假設分子中。此等數目之間約10平方埃或更多的顯著差異展示溶劑對構架胺基酸之接近至少部分由CDR阻斷，且因此胺基酸與CDR接觸。胺基酸之溶劑可及表面積可基於抗體之三維模型，使用此項技術中已知之演算法計算(例如Connolly,J.Appl.Cryst.16：548(1983)及Lee及Richards,J.Mol.Biol.55：379(1971)，均以引用的方式併入本文中)。構架胺基酸偶爾亦可與CDR，藉由影響又接觸CDR之另一構架胺基酸之構形而間接相互作用。
已知許多抗體中構架中若干位置之特定胺基酸能夠與CDR相互作用(Chothia及Lesk，上文；Chothia等人，上文及Tramontano等人，J.Mol.Biol.215：175(1990)，均以引用的方式併入本文中)。特別地，已知許多抗體中輕鏈之位置2、48、64及71之胺基酸及重鏈之位置71及94的胺基酸(根據Kabat編號)能夠與CDR相互作用。輕鏈中位置35及重鏈中93及103之胺基酸亦可能與CDR相互作用。在所有此等編號位置，在人類化免疫球蛋白中選擇供體胺基酸而非接受體胺基酸(當其不同時)為較佳。另一方面，在人類化免疫球蛋白中不喪失親和力下能夠與CDR區相互作用之某些殘基，諸如輕鏈之頭5個胺基酸有時可選自接受體免疫球蛋白。
在一個實施例中，提供aP2之人類化抗體，其包含至少一個選自Seq.ID No.7-13之輕鏈CDR、至少一個選自Seq.ID No.14-21之重鏈CDR及至少一個在人類接受體構架內的取代，其中該取代來源於供體殘基。
在一個實例中，提供一種人類化抗體，其中至少重鏈可變域之 位置23、67、71、72、73、74、76、77、78、79、88、89、91、93及94之一的殘基(Kabat編號)為供體殘基。在一個實施例中，至少重鏈可變域之位置23、67、71、72、73、74、77、78、79、89及91之一的殘基(Kabat編號)為供體殘基。在一個實施例中，至少重鏈可變域之位置23、67、71、72、73、74、77、78、79、88、89、91、93及94(Kabat編號)之一的殘基為供體殘基，但視情況(及任何排列)位置23、67、71、72、73、74、77、78、79、88、89、91、93及94之一或多個殘基可使用人類接受體序列。參見例如Seq.ID No.455、457、459、461及463中給出之序列。
在一個實施例中，CDR為Seq.ID No.14、Seq.ID No.16或Seq.ID No.17及Seq.ID No.19或Seq.ID No.20，且重鏈可變域之殘基1經例如麩胺酸之替代胺基酸置換。
在一個實施例中，CDR為Seq.ID No.14、Seq.ID No.16或Seq.ID No.17及Seq.ID No.19或Seq.ID No.20，且重鏈可變域之殘基23經例如蘇胺酸之替代胺基酸置換。
在一個實施例中，CDR為Seq.ID No.14、Seq.ID No.16或Seq.ID No.17及Seq.ID No.19或Seq.ID No.20，且重鏈之殘基23為丙胺酸。
在一個實施例中，CDR為Seq.ID No.14、Seq.ID No.16或Seq.ID No.17及Seq.ID No.19或Seq.ID No.20，且重鏈可變域之殘基67經例如苯丙胺酸之替代胺基酸置換。
在一個實施例中，CDR為Seq.ID No.14、Seq.ID No.16或Seq.ID No.17及Seq.ID No.19或Seq.ID No.20，且重鏈可變域之殘基67為纈胺酸。
在一個實施例中，CDR為Seq.ID No.14、Seq.ID No.16或Seq.ID No.17及Seq.ID No.19或Seq.ID No.20，且重鏈可變域之殘基71 經例如離胺酸之替代胺基酸置換。
在一個實施例中，CDR為Seq.ID No.14、Seq.ID No.16或Seq.ID No.17及Seq.ID No.19或Seq.ID No.20，且重鏈可變域之殘基71為纈胺酸。
在一個實施例中，CDR為Seq.ID No.14、Seq.ID No.16或Seq.ID No.17及Seq.ID No.19或Seq.ID No.20，且重鏈可變域之殘基72經例如丙胺酸之替代胺基酸置換。
在一個實施例中，CDR為Seq.ID No.14、Seq.ID No.16或Seq.ID No.17及Seq.ID No.19或Seq.ID No.20，且重鏈可變域之殘基72為天冬胺酸。
在一個實施例中，CDR為Seq.ID No.14、Seq.ID No.16或Seq.ID No.17及Seq.ID No.19或Seq.ID No.20，且重鏈可變域之殘基73經例如絲胺酸之替代胺基酸置換。
在一個實施例中，CDR為Seq.ID No.14、Seq.ID No.16或Seq.ID No.17及Seq.ID No.19或Seq.ID No.20，且重鏈可變域之殘基73為離胺酸。
在一個實施例中，CDR為Seq.ID No.14、Seq.ID No.16或Seq.ID No.17及Seq.ID No.19或Seq.ID No.20，且重鏈可變域之殘基74經例如蘇胺酸之替代胺基酸置換。
在一個實施例中，CDR為Seq.ID No.14、Seq.ID No.16或Seq.ID No.17及Seq.ID No.19或Seq.ID No.20，且重鏈可變域之殘基74為絲胺酸。
在一個實施例中，CDR為Seq.ID No.14、Seq.ID No.16或Seq.ID No.17及Seq.ID No.19或Seq.ID No.20，且重鏈可變域之殘基77經例如蘇胺酸之替代胺基酸置換。
在一個實施例中，CDR為Seq.ID No.14、Seq.ID No.16或Seq. ID No.17及Seq.ID No.19或Seq.ID No.20，且重鏈可變域之殘基77為麩醯胺酸。
在一個實施例中，CDR為Seq.ID No.14、Seq.ID No.16或Seq.ID No.17及Seq.ID No.19或Seq.ID No.20，且重鏈可變域之殘基78經例如纈胺酸之替代胺基酸置換。
在一個實施例中，CDR為Seq.ID No.14、Seq.ID No.16或Seq.ID No.17及Seq.ID No.19或Seq.ID No.20，且重鏈可變域之殘基78為苯丙胺酸。
在一個實施例中，CDR為Seq.ID No.14、Seq.ID No.16或Seq.ID No.17及Seq.ID No.19或Seq.ID No.20，且重鏈可變域之殘基79經例如天冬胺酸之替代胺基酸置換。
在一個實施例中，CDR為Seq.ID No.14、Seq.ID No.16或Seq.ID No.17及Seq.ID No.19或Seq.ID No.20，且重鏈可變域之殘基79為絲胺酸。
在一個實施例中，CDR為Seq.ID No.14、Seq.ID No.16或Seq.ID No.17及Seq.ID No.19或Seq.ID No.20，且重鏈可變域之殘基89經例如蘇胺酸之替代胺基酸置換。
在一個實施例中，CDR為Seq.ID No.14、Seq.ID No.16或Seq.ID No.17及Seq.ID No.19或Seq.ID No.20，且重鏈可變域之殘基89為纈胺酸。
在一個實施例中，CDR為Seq.ID No.14、Seq.ID No.16或Seq.ID No.17及Seq.ID No.19或Seq.ID No.20，且重鏈可變域之殘基91經例如苯丙胺酸之替代胺基酸置換。
在一個實施例中，CDR為Seq.ID No.14、Seq.ID No.16或Seq.ID No.17及Seq.ID No.19或Seq.ID No.20，且重鏈可變域之殘基91為酪胺酸。
在一個實施例中，CDR為Seq.ID No.14、Seq.ID No.16或Seq.ID No.17及Seq.ID No.19或Seq.ID No.20，且殘基23為丙胺酸，殘基67為纈胺酸，殘基71為纈胺酸，殘基72為天冬胺酸，殘基73為離胺酸，殘基74為絲胺酸，殘基77為麩醯胺酸，殘基78為苯丙胺酸，殘基79為絲胺酸，殘基89為纈胺酸，且殘基91為酪胺酸。
因此，在一個實例中，提供一種人類化抗體，其中至少輕鏈可變域之位置2、3、36、37、58、63或70(Kabat編號)之一的殘基為供體殘基。在一個實施例中，至少輕鏈可變域之位置2、3、63或70(Kabat編號)之一的殘基為供體殘基。參見例如Seq.ID No.446、448、450及452中給出之序列。
在一個實施例中，CDR為Seq.ID No.7、Seq.ID No.8及Seq.ID No.9、Seq.ID No.10、Seq.ID No.11或Seq.ID No.12，且輕鏈可變域之殘基2經例如纈胺酸之替代物胺基酸置換。
在一個實施例中，CDR為Seq.ID No.7、Seq.ID No.8及Seq.ID No.9、Seq.ID No.10、Seq.ID No.11或Seq.ID No.12，且輕鏈可變域之殘基2為異白胺酸。
在一個實施例中，CDR為Seq.ID No.7、Seq.ID No.8及Seq.ID No.9、Seq.ID No.10、Seq.ID No.11或Seq.ID No.12，且輕鏈可變域之殘基3經例如纈胺酸之替代胺基酸置換。
在一個實施例中，CDR為Seq.ID No.7、Seq.ID No.8及Seq.ID No.9、Seq.ID No.10、Seq.ID No.11或Seq.ID No.12，且輕鏈可變域之殘基3為麩醯胺酸。
在一個實施例中，CDR為Seq.ID No.7、Seq.ID No.8及Seq.ID No.9、Seq.ID No.10、Seq.ID No.11或Seq.ID No.12，且輕鏈可變域之殘基63經例如離胺酸之替代胺基酸置換。
在一個實施例中，CDR為Seq.ID No.7、Seq.ID No.8及Seq.ID No.9、Seq.ID No.10、Seq.ID No.11或Seq.ID No.12，且輕鏈可變域之殘基63為絲胺酸。
在一個實施例中，CDR為Seq.ID No.7、Seq.ID No.8及Seq.ID No.9、Seq.ID No.10、Seq.ID No.11或Seq.ID No.12，且輕鏈可變域之殘基70經例如天冬胺酸之替代胺基酸置換。
在一個實施例中，CDR為Seq.ID No.7、Seq.ID No.8及Seq.ID No.9、Seq.ID No.10、Seq.ID No.11或Seq.ID No.12，且輕鏈可變域之殘基70為麩胺酸。
在一個實施例中，CDR為Seq.ID No.7、Seq.ID No.8及Seq.ID No.9、Seq.ID No.10、Seq.ID No.11或Seq.ID No.12，且殘基2為異白胺酸，殘基3為麩醯胺酸，殘基63為絲胺酸，殘基70為麩胺酸。
「參與VL-VH界面」之殘基或「填充殘基」包括在如例如Novotny及Haber,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82：4592-66(1985)或Chothia等人，上文所定義之VL與VH之間的界面的彼等殘基。一般而言，若異常填充殘基不同於人類構架中之填充殘基，則其應保留在人類化抗體中。
一般而言，滿足以上準則之一或多個胺基酸經取代。在一些實施例中，所有或大部分滿足以上準則之胺基酸經取代。有時，關於以下存在一些不明確性：是否特定胺基酸符合以上準則，且產生替代變異免疫球蛋白，其中一種具有特定取代，其他不具有。可在本文中關於所需活性描述之任一分析中測試由此產生之替代變異免疫球蛋白，且選擇較佳免疫球蛋白。
通常人類化抗體中CDR區與供體抗體之對應CDR區實質上一致，且更通常一致。雖然通常不希望，有時可在不明顯影響所得人類化免疫球蛋白之結合親和力下對CDR殘基進行一或多個保守胺基酸取代。保守或類似取代為所欲組合，諸如白胺酸取代異白胺酸或纈胺酸。常 可彼此取代之其他胺基酸包括(但不限於)：苯丙胺酸、酪胺酸及色胺酸(具有芳族側鏈之胺基酸)；離胺酸、精胺酸及組胺酸(具有鹼性側鏈之胺基酸)；天冬胺酸鹽及麩胺酸鹽(具有酸性側鏈之胺基酸)；天冬醯胺及麩醯胺酸(具有醯胺側鏈之胺基酸)；以及半胱胺酸及甲硫胺酸(具有含硫側鏈之胺基酸)。
用於取代之其他候選胺基酸為人類免疫球蛋白在該位置異常或「稀少」之接受體人類構架胺基酸。此等胺基酸可經來自供體抗體之同等位置之胺基酸或來自更典型人類免疫球蛋白之同等位置之胺基酸取代。舉例而言，當接受體免疫球蛋白之人類構架區中胺基酸為該位置稀少且供體免疫球蛋白中對應胺基酸為人類免疫球蛋白序列中該位置常用時；或當相對於其他人類序列，接受體免疫球蛋白中胺基酸為該位置稀少且供體免疫球蛋白中對應胺基酸亦稀少時，可希望取代。此等準則幫助確保人類構架中之非典型胺基酸不破壞抗體結構。此外，藉由用來自供體抗體之人類抗體典型之胺基酸替換異常人類接受體胺基酸，可使人類化抗體免疫原性較低。
如本文所用，術語「稀少」指示該位置出現之胺基酸小於序列之代表性樣品中序列約20%，但通常小於約10%，且如本文所用，術語「常用」指示出現之胺基酸超過代表性樣品中序列之約25%，但通常超過約50%。舉例而言，所有人類輕鏈及重鏈可變區序列分別分組成尤其彼此同源且在某些關鍵位置具有相同胺基酸之序列「子組」(Kabat等人，上文)。當確定人類接受體序列中之胺基酸在人類序列之間為「稀少」還是「常用」時，常常較佳僅僅考慮相同子組中之彼等人類序列為接受體序列。
用於取代之其他候選胺基酸為根據Chothia等人，上文所提議之替代定義，將鑑別為CDR區之一部分的接受體人類構架胺基酸。用於 取代之其他候選胺基酸為根據如本文所述之Seq.ID No.7-21之CDR及/或本文中描述之接觸定義，鑑別為CDR區之一部分的接受體人類構架胺基酸。
用於取代之其他候選殘基為對應於稀少或異常供體構架殘基之受體構架殘基。稀少或異常供體構架殘基為供體抗體在該位置稀少或異常(如本文所定義)之殘基。對於供體抗體，可根據Kabat確定子組且鑑別不同於共同序列之殘基位置。此等供體特定之差異可指出供體序列中增強活性之體細胞突變。保留預測影響結合之異常殘基，而預測對於結合而言不重要的殘基可經取代。
用於取代之其他候選殘基為在接受體構架區域中出現之非生殖系殘基。舉例而言，當接受體抗體鏈(亦即與供體抗體鏈共享顯著序列一致性之人類抗體鏈)與生殖系抗體鏈(同樣與供體鏈共享顯著序列一致性)對準時，在接受體鏈構架與生殖系鏈構架之間不匹配的殘基可經來自生殖系序列之對應殘基取代。
除如上文所述之特定胺基酸取代外，人類化免疫球蛋白之構架區通常與其所來源之人類抗體之構架區實質上一致及更通常一致。當然，構架區中許多胺基酸對抗體之特異性或親和力幾乎無直接作用。因此，可在不明顯改變所得人類化免疫球蛋白之特異性或親和力下容許構架殘基之許多個別保守取代。因此，在一個實施例中，人類化免疫球蛋白之可變構架區與此類序列之人類可變構架區序列或共同序列共享至少85%序列類似性或一致性。在另一個實施例中，人類化免疫球蛋白之可變構架區與此類序列之人類可變構架區序列或共同序列共享至少90%、較佳95%、更佳96%、97%、98%或99%序列類似性或一致性。然而，一般而言，此類取代非所希望。
如本文所用，一致性及類似性程度容易例如如以下中所述計算：Computational Molecular Biology,Lesk,A.M.編輯，Oxford University Press,New York,1988；Biocomputing.Informatics and Genome Projects,Smith,D.W.編輯，Academic Press,New York,1993；Computer Analysis of Sequence Data,Part 1,Griffin,A.M.，及Griffin,H.G.編輯，Humana Press,New Jersey,1994；Sequence Analysis in Molecular Biology,von Heinje,G.,Academic Press,1987,Sequence Analysis Primer,Gribskov,M.及Devereux,J.編輯，M Stockton Press,New York,1991；BLASTTM軟體，得自NCBI(Altschul,S.F.等人，1990,J.Mol.Biol.215：403-410；Gish,W.及States,D.J.1993,Nature Genet.3：266-272；Madden,T.L.等人，1996,Meth.Enzymol.266：131-141；Altschul,S.F.等人，1997,Nucleic Acids Res.25：3389-3402；Zhang,J.及Madden,T.L.1997,Genome Res.7：649-656，其以引用的方式併入本文中。
已公開論述CDR移植抗體之許多評述，包括Vaughan等人(Nature Biotechnology,16,535-539,1998)，其以引用的方式併入本文中。
本發明之抗-aP2抗體可包括例如按照分子DVD-Ig，如WO 2007/024715中揭示之其他結合結構域，或WO2011/030107中描述之所謂(FabFv)2Fc。因此，如本文所採用之抗體包括二價、三價或四價全長抗體。
抗原結合劑
抗原結合劑包括單鏈抗體(亦即全長重鏈及輕鏈)；Fab、經修飾之Fab、Fab'、經修飾之Fab'、F(ab')2、Fv、Fab-Fv、Fab-dsFv、單域抗體(例如VH或VL或VHH)(例如如WO 2001090190中所述)、scFv、二價、三價或四價抗體、雙-scFv、雙功能抗體、三功能抗體、三鏈抗體、四功能抗體及以上任一者之抗原決定基-抗原結合劑(參見例如Holliger及Hudson,2005,Nature Biotech.23(9)：1126-1136；Adair及Lawson,2005,Drug Design Reviews-Online 2(3),209-217)。用於產生 及製造此等抗體片段之方法為此項技術中所熟知(參見例如Verma等人，1998,Journal of Immunological Methods,216,165-181)。Fab-Fv格式首先在WO2009/040562中揭示且其二硫化物穩定型式Fab-dsFv首先在WO2010/035012中揭示。用於本發明之其他抗體片段包括國際專利申請案WO2005/003169、WO2005/003170及WO2005/003171中描述之Fab及Fab'片段。多價抗體可包含多特異性，例如雙特異性，或可為單特異性(參見例如WO 92/22583及WO05/113605)。後者之一種此類實例為如WO92/22583中所述之Tri-Fab(或TFM)。
典型Fab'分子包含重鏈及輕鏈對，其中重鏈包含可變區VH、恆定域CH1及天然或經修飾之鉸鏈區且輕鏈包含可變區VL及恆定域CL。
在一個實施例中，提供根據本發明之Fab'之二聚體，產生F(ab')2，例如二聚可經由本文中描述之天然鉸鏈序列或其衍生物或合成鉸鏈序列。
抗體結合域一般將包含6個CDR，三個來自重鏈且三個來自輕鏈。在一個實施例中，CDR在構架中且一起形成可變區。因此，在一個實施例中，抗原結合劑包括對aP2具有特異性之包含輕鏈可變區及重鏈可變區之結合域。
應瞭解在不顯著改變抗體結合於aP2之能力下，如以上或以下所述，可對本發明提供之CDR或其他序列(例如可變結構域)進行一或多個(例如1、2、3或4個)胺基酸取代、添加及/或缺失。熟習此項技術者例如藉由使用本文、尤其實例中所描述之方法，容易測試任何胺基酸取代、添加及/或缺失之作用。
在一個實施例中，可對本發明提供之抗體或片段中採用的CDR或構架區進行一或多個(例如1、2、3或4個)胺基酸取代、添加及/或缺失，使得對aP2之結合親和力保留、增加或減少至約10-7M之親和 力。在一個實施例中，提供一種經修飾之人類化抗體，其中對CDR、構架區或兩者進行修飾，以降低結合親和力例如至約10-7M。
兔供體CDR/人類接受體構架抗-aP2單株抗體
在本發明之一個態樣中，提供一種來源於抗-aP2兔CDR/小鼠構架雜交供體單株抗體之人類化抗-aP2單株抗體，其中來自抗人類aP2蛋白質單株抗體之CDR移植至人類輕鏈及重鏈構架區中。
在一個實施例中，可變輕鏈Ab 909 VL(Seq.ID No.445(以下表10及圖27))為用於隨後移植至人類構架中的供體輕鏈序列，其中隨後CDR及構架修飾可視情況進行。在一個實施例中，來源於Seq.ID No.445中提供之可變輕鏈的Seq.ID No.7、8及9中提供之CDR移植至人類免疫球蛋白IGKVA30-JK4之人類免疫球蛋白κ輕鏈可變域中，產生包含A30 FR1(Seq.ID No.40)-CDRL1(Seq.ID.No.7)-A30 FR2(Seq.ID No.41)-CDRL2(Seq.ID No.8)-A30 FR3(Seq.ID No.41)-CDRL3(Seq.ID.No.9)-JK4(Seq.ID No.148)之人類化輕鏈可變區。
在一個實施例中，來源於Seq.ID No.445中提供之可變輕鏈的Seq.ID No.7、8及10中提供之CDR移植至人類免疫球蛋白IGKVA30-JK4之人類免疫球蛋白κ輕鏈可變域中，產生包含A30 FR1(Seq.ID No.40)-CDRL1(Seq.ID.No.7)-A30 FR2(Seq.ID No.41)-CDRL2(Seq.ID No.8)-A30 FR3(Seq.ID No.41)-CDRL3(Seq.ID.No.10)-JK4(Seq.ID No.148)之人類化輕鏈可變區，產生Ab 909 gL13(Seq.ID No.487)。
在一個實施例中，提供人類化κ輕鏈可變區909 gL1(Seq.ID No.446(以下表10及圖27))，其中來自Ab 909 VL(Seq.ID No.445)之輕鏈可變區供體殘基2V、3V、63K及70D用作IGKV30-JK4胺基酸2I、3Q、63S、70E之胺基酸替代物，產生人類化κ輕鏈909 gL1(Seq.ID No.446(以下表10及圖27))。
在一個實施例中，提供人類化κ輕鏈可變區909 gL1 VL+CL(Seq.ID No.447(以下表10))，其中人類化κ輕鏈可變區909 gL1(Seq.ID No.446(以下表10及圖27))進一步包含人類κ輕鏈恆定區。
在一個實施例中，提供人類化κ輕鏈909 gL10(Seq.ID No.448(以下表10及圖27))，其中來自Ab 909 VL(Seq.ID No.445)之輕鏈可變區供體殘基2V、3V、63K及70D用作IGKV30-JK4胺基酸2I、3Q、63S、70E之胺基酸替代物且提供丙胺酸代替CDRL3(CDRL3變異體1(Seq.ID No.10))第二位置中之半胱胺酸的取代，產生人類化κ輕鏈909 gL10(Seq.ID No.448(以下表10及圖27))。或者，提供FR3中包含C88A之另一取代，產生Ab 909 gL50(Seq.ID No.488)。
在一個實施例中，提供人類化κ輕鏈909 gL10 VL+CL(Seq.ID No.449(以下表10))，其中人類化κ輕鏈可變區909 gL10(Seq.ID No.448(以下表10及圖27))進一步包含人類κ輕鏈恆定區。或者，提供FR3中包含C88A之另一取代，產生Ab909 gL50VL+CL(Seq.ID.No.490)。
在一個實施例中，提供人類化κ輕鏈909 gL54(Seq.ID No.450(以下表10))，其中來自Ab 909 VL(Seq.ID No.445)之輕鏈可變區供體殘基2V、3V、63K及70D用作IGKV30-JK4胺基酸2I、3Q、63S、70E之胺基酸替代物且提供麩醯胺酸代替CDRL3(CDRL3變異體2(Seq.ID No.11))第二位置中之半胱胺酸的取代，產生人類化κ輕鏈909 gL54(Seq.ID No.450(以下表10))。
在一個實施例中，提供人類化κ輕鏈909 gL54 VL+CL(Seq.ID No.451(以下表10))，其中人類化κ輕鏈可變區909 gL54(Seq.ID No.450(以下表10))進一步包含人類κ輕鏈恆定區。
在一個實施例中，提供人類化κ輕鏈909 gL55(Seq.ID No.452(以下表10))，其中來自Ab 909 VL(Seq.ID No.445)之輕鏈可變區供 體殘基2V、3V、63K及70D用作IGKV30-JK4胺基酸2I、3Q、63S、70E之胺基酸替代物且提供組胺酸代替CDRL3(CDRL3變異體2(Seq.ID No.12))第二位置中之半胱胺酸的取代，產生人類化κ輕鏈909 gL55(Seq.ID No.452(以下表10))。
在一個實施例中，提供人類化κ輕鏈909 gL55 VL+CL(Seq.ID No.453(以下表10))，其中人類化κ輕鏈可變區909 gL55(Seq.ID No.452(以下表10))進一步包含人類κ輕鏈恆定區。
舉例而言，可變重鏈Ab 909 VH(Seq.ID No.454(以下表11及圖28))為用於隨後移植至人類構架中之供體重鏈序列，其中隨後CDR及構架修飾可視情況進行。在一個實施例中，來源於Seq.ID No.454中提供之可變重鏈的Seq.ID No.14、16及19中提供之可變重鏈CDR移植至人類免疫球蛋白IGHV4-04-JH4之人類免疫球蛋白重鏈可變域(Seq.ID No.481(圖28))中，產生包含4-04 FR1(Seq.ID No.357)-CDRH1(Seq.ID No.14)-4-04 FR2(Seq.ID No.358)-CDRH2(Seq.ID No.16)-4-04 FR3(Seq.ID No.359)-CDRH3(Seq.ID No.19)-JH4(Seq.ID No.405)之人類化重鏈可變區。
在一個實施例中，提供人類化重鏈可變區909 gH1可變區(Seq.ID No.455(以下表11及圖28))，其中來自Ab 909 VH(Seq.ID No.454)之重鏈可變區供體殘基23T、67F、71K、72A、73S、74T、77T、78V、79D、89T、91F用作IGHV4-04-JK4胺基酸23A、67V、71V、72D、73K、74S、77Q、78F、79S、89V、91Y之胺基酸替代物，且1E取代IGHV4-04-JK4胺基酸1Q，且維持構架3中、β片股D與E之間的環形中胺基酸75及76之兩個胺基酸殘基胺基酸間隙，產生人類化重鏈909 gH1(Seq.ID No.455(以下表11及圖28))。
在一個實施例中，提供人類化IgG4重鏈909 gH1 VH+IgG4P恆定(Seq.ID No.456(以下表11))，其中人類化重鏈可變區909 gH1(Seq.ID No.455(以下表11及圖28))進一步包含人類IgG4P恆定區。如本文所採用之IgG4P為野生型IgG4同型之突變，其中胺基酸241經脯胺酸 置換，參見例如如Angal等人，Molecular Immunology,1993,30(1),105-108中所述，其中位置241之絲胺酸已改變成脯胺酸。
在一個實施例中，提供人類化重鏈可變區909 gH14可變區(Seq.ID No.457(以下表11及圖28))，其中來自Ab 909 VH(Seq.ID No.454)之重鏈可變區供體殘基67F、71K、72A、73S、74T、77T、78V、79D、89T、91F用作IGHV4-04-JK4胺基酸67V、71V、72D、73K、74S、77Q、78F、79S、89V、91Y之胺基酸替代物，且1E取代IGHV4-04-JK4胺基酸1Q，產生人類化重鏈909 gH14(Seq.ID No.457(以下表11及圖28))。
在一個實施例中，提供人類化IgG4重鏈909 gH14 VH+IgG4P恆定(Seq.ID No.458(以下表11))，其中人類化重鏈可變區909 gH14(Seq.ID No.457(以下表11及圖28))進一步包含人類IgG4P恆定區。如本文所採用之IgG4P為野生型IgG4同型之突變，其中胺基酸241經脯胺酸置換，參見例如如Angal等人，Molecular Immunology,1993,30(1),105-108中所述，其中位置241之絲胺酸已改變成脯胺酸。
在一個實施例中，提供人類化重鏈可變區909 gH15可變區(Seq.ID No.459(以下表11及圖28))，其中來自兔Ab 909 VH(Seq.ID No.454)之重鏈可變區供體殘基23T、67F、71K、72A、73S、74T、77T、78V、79D、89T、91F用作IGHV4-04-JK4胺基酸23A、67V、71V、72D、73K、74S、77Q、78F、79S、89V、91Y之胺基酸替代物，且1E取代IGHV4-04-JK4胺基酸1Q，且絲胺酸代替CDRH2(CDRH2變異體1(Seq.ID No.17))第十位置中之半胱胺酸且麩胺酸代替CDRH3(CDRH3變異體1(Seq.ID No.20))第四位置中之天冬胺酸，產生人類化重鏈909 gH15 VH區(Seq.ID No.459(以下表11及圖28))。
在一個實施例中，提供人類化IgG4重鏈909 gH15 VH+IgG4P恆定(Seq.ID No.460(以下表11))，其中人類化重鏈可變區909 gH15 VH (Seq.ID No.459(以下表11及圖28))進一步包含人類IgG4P恆定區。如本文所採用之IgG4P為野生型IgG4同型之突變，其中胺基酸241經脯胺酸置換，參見例如如Angal等人，Molecular Immunology,1993,30(1),105-108中所述，其中位置241之絲胺酸已改變成脯胺酸。
在一個實施例中，提供人類化重鏈可變區909 gH61可變區(Seq.ID No.461(以下表11及圖28))，其中來自兔Ab 909 VH(Seq.ID No.454)之重鏈可變區供體殘基71K、73S、78V用作IGHV4-04-JK4胺基酸71V、73K、78F之胺基酸替代物，且1E取代IGHV4-04-JK4胺基酸1Q，產生人類化重鏈909 gH61 VH區(Seq.ID No.461(以下表11及圖28))。
在一個實施例中，提供人類化IgG4重鏈909 gH61 VH+IgG4P恆定(Seq.ID No.462(以下表11))，其中人類化重鏈可變區909 gH61 VH(Seq.ID No.461(以下表11及圖28))進一步包含人類IgG4P恆定區。如本文所採用之IgG4P為野生型IgG4同型之突變，其中胺基酸241經脯胺酸置換，參見例如如Angal等人，Molecular Immunology,1993,30(1),105-108中所述，其中位置241之絲胺酸已改變成脯胺酸。
在一個實施例中，提供人類化重鏈可變區909 gH62可變區(Seq.ID No.463(以下表11及圖28))，其中來自兔Ab 909 VH(Seq.ID No.454)之重鏈可變區供體殘基71K、73S、78V用作IGHV4-04-JK4胺基酸71V、73K、78F之胺基酸替代物，且1E取代IGHV4-04-JK4胺基酸1Q，且絲胺酸代替CDRH2(CDRH2變異體1(Seq.ID No.17))第十位置中之半胱胺酸且麩胺酸代替CDRH3(CDRH3變異體1(Seq.ID No.20))第四位置中之天冬胺酸，產生人類化重鏈909 gH62 VH區(Seq.ID No.463(以下表11及圖28))。
在一個實施例中，提供人類化IgG4重鏈909 gH62 VH+IgG4P恆定(Seq.ID No.464(以下表11))，其中人類化重鏈可變區909 gH62 VH (Seq.ID No.463(以下表11及圖28))進一步包含人類IgG4P恆定區。如本文所採用之IgG4P為野生型IgG4同型之突變，其中胺基酸241經脯胺酸置換，參見例如如Angal等人，Molecular Immunology,1993,30(1),105-108中所述，其中位置241之絲胺酸已改變成脯胺酸。
在一個實施例中，本發明提供一種抗體序列，其在部分或整個相關序列，例如可變域序列、CDR序列或除CDR外之可變域序列上與本文揭示之序列80%類似或一致，例如85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%。在一個實施例中，相關序列係選自Seq.ID No.446、447、448、487、488、489、490、449、450、451、452、453、455、456、457、458、459、460、461、462、463或464。在一個實施例中，本發明提供一種抗體序列，其在相關序列，例如可變域序列、CDR序列或除CDR外之可變域序列中具有一或多個(例如1、2、3或4個)胺基酸取代、添加或缺失，該相關序列選自Seq.ID No.446、447、448、487、488、489、490、449、450、451、452、453、455、456、457、458、459、460、461、462、463或464。
在一個實施例中，本發明提供一種結合人類aP2之抗體分子，其包含輕鏈，其中輕鏈之可變域包含與選自Seq.ID No.446、448、487、488、450或452之序列具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%96%、97%、98%或99%一致性或類似性的序列。在一個實施例中，本發明提供一種結合人類aP2之抗體分子，其包含輕 鏈，其中輕鏈之可變域包含與Seq.ID No.446、448、487、488、450或452相比，在序列中具有一或多個(例如1、2、3或4個)胺基酸取代、添加或缺失之序列。
在一個實施例中，本發明提供一種結合人類aP2之抗體分子，其中該抗體具有與選自Seq.ID No.455、457、459、461或463之序列至少80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%類似或一致的重鏈可變域。在一個實施例中，本發明提供一種結合人類aP2之抗體分子，其中該抗體具有與Seq.ID No.455、467、459、461或463與相比，具有一或多個(例如1、2、3或4個)胺基酸取代、添加或缺失的重鏈可變域。
適用於本發明之人類化抗體之輕鏈的構架區來源於人類生殖系子組IgKV1-17(A30)(Seq.ID No.40-42)以及JK4(Seq.ID No.148)。因此，在一個實例中，提供一種人類化抗體，其包含Seq.ID No.7中給出之關於CDR-L1之序列、Seq.ID No.8中給出之關於CDR-L2之序列及選自Seq.ID No.9、10、11或12之關於CDRL3之序列，其中輕鏈構架區來源於人類子組IGKV1-17(A30)(Seq.ID No.40-42)以及JK4(Seq.ID No.148)。JK4序列如下：FGGGTKVEIK(Seq.ID No.148)。在一個實例中，抗體之輕鏈可變域包含選自Seq.ID No.446、448、487、488、450及452之序列。
適用於本發明之人類化抗體之重鏈可變區的構架區來源於人類生殖系子組IGHV4-04(Seq.ID No.357、358及359)以及JH4(Seq.ID No.405)。因此，在一個實例中，提供一種人類化抗體，其包含Seq.ID No.14中給出之關於CDR-H1之序列、選自Seq.ID No.16或17之關於CDR-H2之序列及選自Seq.ID No.19或20之關於CDR-H3之序列，其中重鏈構架區來源於人類子組IGHV 4-04(Seq.ID No.357、358及359)以及JH4(Seq.ID No.405)。JH4序列如下：WGQGTLVTVSS (Seq.ID No.405)。
在一個實施例中，本發明之抗體分子為一種Fab、Fab'或F(ab')2抗體片段，其包含選自Seq.ID No.446、448、487、488、450或452之輕鏈可變區及選自Seq.ID No.455、457、459、461或463之重鏈可變區。在一個實施例中，本發明之抗體分子為一種Fab、Fab'或F(ab')2抗體片段，其包含Seq.ID No.446中給出之輕鏈可變區及Seq.ID No.455中給出之重鏈可變區。在一個實施例中，本發明之抗體分子為一種Fab、Fab'或F(ab')2抗體片段，其包含Seq.ID No.448中給出之輕鏈可變區及Seq.ID No.455中給出之重鏈可變區。在一個實施例中，本發明之抗體分子為一種Fab、Fab'或F(ab')2抗體片段，其包含Seq.ID No.450中給出之輕鏈可變區及Seq.ID No.455中給出之重鏈可變區。在一個實施例中，本發明之抗體分子為一種Fab、Fab'或F(ab')2抗體片段，其包含Seq.ID No.452中給出之輕鏈可變區及Seq.ID No.455中給出之重鏈可變區。在一個實施例中，本發明之抗體分子為一種Fab、Fab'或F(ab')2抗體片段，其包含Seq.ID No.487中給出之輕鏈可變區及Seq.ID No.455中給出之重鏈可變區。在一個實施例中，本發明之抗體分子為一種Fab、Fab'或F(ab')2抗體片段，其包含Seq.ID No.488中給出之輕鏈可變區及Seq.ID No.455中給出之重鏈可變區。在一個實施例中，本發明之抗體分子為一種Fab、Fab'或F(ab')2抗體片段，其包含Seq.ID No.446中給出之輕鏈可變區及Seq.ID No.459中給出之重鏈可變區。在一個實施例中，本發明之抗體分子為一種Fab、Fab'或F(ab')2抗體片段，其包含Seq.ID No.448中給出之輕鏈可變區及Seq.ID No.459中給出之重鏈可變區。在一個實施例中，本發明之抗體分子為一種Fab、Fab'或F(ab')2抗體片段，其包含Seq.ID No.450中給出之輕鏈可變區及Seq.ID No.459中給出之重鏈可變區。在一個實施例中，本發明之抗體分子為一種Fab、Fab'或 F(ab')2抗體片段，其包含Seq.ID No.452中給出之輕鏈可變區及Seq.ID No.459中給出之重鏈可變區。在一個實施例中，本發明之抗體分子為一種Fab、Fab'或F(ab')2抗體片段，其包含Seq.ID No.487中給出之輕鏈可變區及Seq.ID No.459中給出之重鏈可變區。在一個實施例中，本發明之抗體分子為一種Fab、Fab'或F(ab')2抗體片段，其包含Seq.ID No.488中給出之輕鏈可變區及Seq.ID No.459中給出之重鏈可變區。在一個實施例中，本發明之抗體分子為一種Fab、Fab'或F(ab')2抗體片段，其包含Seq.ID No.446中給出之輕鏈可變區及Seq.ID No.457中給出之重鏈可變區。在一個實施例中，本發明之抗體分子為一種Fab、Fab'或F(ab')2抗體片段，其包含Seq.ID No.448中給出之輕鏈可變區及Seq.ID No.457中給出之重鏈可變區。在一個實施例中，本發明之抗體分子為一種Fab、Fab'或F(ab')2抗體片段，其包含Seq.ID No.450中給出之輕鏈可變區及Seq.ID No.457中給出之重鏈可變區。在一個實施例中，本發明之抗體分子為一種Fab、Fab'或F(ab')2抗體片段，其包含Seq.ID No.452中給出之輕鏈可變區及Seq.ID No.457中給出之重鏈可變區。在一個實施例中，本發明之抗體分子為一種Fab、Fab'或F(ab')2抗體片段，其包含Seq.ID No.487中給出之輕鏈可變區及Seq.ID No.457中給出之重鏈可變區。在一個實施例中，本發明之抗體分子為一種Fab、Fab'或F(ab')2抗體片段，其包含Seq.ID No.488中給出之輕鏈可變區及Seq.ID No.457中給出之重鏈可變區。在一個實施例中，本發明之抗體分子為一種Fab、Fab'或F(ab')2抗體片段，其包含Seq.ID No.446中給出之輕鏈可變區及Seq.ID No.461中給出之重鏈可變區。在一個實施例中，本發明之抗體分子為一種Fab、Fab'或F(ab')2抗體片段，其包含Seq.ID No.448中給出之輕鏈可變區及Seq.ID No.461中給出之重鏈可變區。在一個實施例中，本發明之抗體分子為一種Fab、Fab'或F(ab')2抗體片段，其包含 Seq.ID No.450中給出之輕鏈可變區及Seq.ID No.461中給出之重鏈可變區。在一個實施例中，本發明之抗體分子為一種Fab、Fab'或F(ab')2抗體片段，其包含Seq.ID No.452中給出之輕鏈可變區及Seq.ID No.461中給出之重鏈可變區。在一個實施例中，本發明之抗體分子為一種Fab、Fab'或F(ab')2抗體片段，其包含Seq.ID No.487中給出之輕鏈可變區及Seq.ID No.461中給出之重鏈可變區。在一個實施例中，本發明之抗體分子為一種Fab、Fab'或F(ab')2抗體片段，其包含Seq.ID No.488中給出之輕鏈可變區及Seq.ID No.461中給出之重鏈可變區。在一個實施例中，本發明之抗體分子為一種Fab、Fab'或F(ab')2抗體片段，其包含Seq.ID No.446中給出之輕鏈可變區及Seq.ID No.463中給出之重鏈可變區。在一個實施例中，本發明之抗體分子為一種Fab、Fab'或F(ab')2抗體片段，其包含Seq.ID No.448中給出之輕鏈可變區及Seq.ID No.463中給出之重鏈可變區。在一個實施例中，本發明之抗體分子為一種Fab、Fab'或F(ab')2抗體片段，其包含Seq.ID No.450中給出之輕鏈可變區及Seq.ID No.463中給出之重鏈可變區。在一個實施例中，本發明之抗體分子為一種Fab、Fab'或F(ab')2抗體片段，其包含Seq.ID No.452中給出之輕鏈可變區及Seq.ID No.463中給出之重鏈可變區。在一個實施例中，本發明之抗體分子為一種Fab、Fab'或F(ab')2抗體片段，其包含Seq.ID No.487中給出之輕鏈可變區及Seq.ID No.463中給出之重鏈可變區。在一個實施例中，本發明之抗體分子為一種Fab、Fab'或F(ab')2抗體片段，其包含Seq.ID No.488中給出之輕鏈可變區及Seq.ID No.463中給出之重鏈可變區。
在一個實施例中，本發明之抗體分子為一種全長IgG1抗體，其包含Seq.ID No.446、448、487、488、450或452中關於輕鏈及Seq.ID No.455、457、459、461或463中關於重鏈展示之可變區。
在一個實施例中，本發明之抗體分子為一種全長IgG4抗體，其包含Seq.ID No.446、448、487、488、450或452中關於輕鏈及Seq.ID No.455、457、459、461或463中關於重鏈展示之可變區。
在一個實施例中，本發明之抗體分子為一種全長IgG4P抗體，其包含Seq.ID No.446、448、487、488、450或452中關於輕鏈及Seq.ID No.455、457、459、461或463中關於重鏈展示之可變區。在一個實施例中，抗體分子具有包含選自Seq.ID.No.447、449、489、490、451或453之序列用於輕鏈之輕鏈及選自Seq.ID No.456、458、460、462或464用於重鏈之序列。在一個實施例中，根據本發明之抗體作為aP2結合抗體融合蛋白提供，該融合蛋白包含免疫球蛋白部分，例如Fab或Fab'片段及直接或間接連接於其之一種或兩種單域抗體(dAb)，例如如WO2009/040562、WO2010035012、WO2011/030107、WO2011/061492及WO2011/086091(均以引用的方式併入本文中)中所述。
在一個實施例中，融合蛋白包含視情況藉由二硫鍵連接之兩種域抗體，例如呈可變重鏈(VH)及可變輕鏈(VL)對。
本發明之抗體片段包括Fab、Fab'、F(ab')2、scFv、雙功能抗體、scFAb、dFv、單域輕鏈抗體、dsFv、包含CDR之肽及其類似物。
Fab為具有約50,000之分子量及抗原結合活性之抗體片段，其中在藉由用蛋白酶木瓜蛋白酶(在H鏈之位置224之胺基酸殘基切割)處理IgG獲得之片段之間，H鏈之N端側的約一半與整個L鏈經由二硫鍵結合在一起。
本發明之Fab可藉由用蛋白酶木瓜蛋白酶處理與aP2特異性反應之本發明之人類CDR移植抗體來獲得。此外，Fab可藉由將編碼抗體之Fab的DNA插入原核生物之表現載體或真核生物之表現載體中且將載體引入原核生物或真核生物中以表現Fab來產生。
F(ab')2為具有約100,000之分子量及抗原結合活性之抗體片段，在藉由用蛋白酶胃蛋白酶處理IgG獲得之片段中，其略微大於經由鉸鏈區之二硫鍵結合的Fab。
本發明之F(ab')2可藉由用蛋白酶胃蛋白酶處理與aP2特異性反應之人類CDR移植抗體來獲得。此外，F(ab')2可藉由經由硫醚鍵或二硫鍵結合下文所述之Fab'產生。
Fab'為具有約50,000之分子量及抗原結合活性之抗體片段，其藉由切割F(ab')2之鉸鏈區之二硫鍵獲得。
本發明之Fab'可藉由用還原劑二硫蘇糖醇處理與aP2特異性反應之F(ab')2獲得。此外，本發明之Fab'可藉由將編碼與aP2特異性反應之本發明之人類CDR移植抗體之Fab'的DNA插入原核生物之表現載體或真核生物之表現載體中且將載體引入至原核生物或真核生物中以表現Fab'來產生。
scFv為一種VH-P-VL或VL-P-VH多肽，其中一條鏈VH及一條鏈VL使用12或更多個殘基之適當肽連接子(P)連接，且具有抗原結合活性。
本發明之scFv可藉由獲得編碼與aP2特異性反應的本發明之人類CDR移植抗體之VH及VL的cDNA，構築編碼scFv之DNA，將DNA插入原核生物之表現載體或真核生物之表現載體中且接著將表現載體引入原核生物或真核生物中以表現scFv來產生。
雙功能抗體為一種抗體片段，其中具有相同或不同抗原結合特異性之scFv形成二聚體，且具有與相同抗原之二價抗原結合活性或與不同抗原之兩種特定抗原結合活性。
本發明之雙功能抗體，例如與aP2特異性反應之二價雙功能抗體，可藉由獲得編碼與aP2特異性反應的抗體之VH及VL的cDNA，構築編碼具有3至10個殘基之多肽連接子之scFv的DNA，將DNA插入原 核生物之表現載體或真核生物之表現載體中且接著將表現載體引入原核生物或真核生物中以表現雙功能抗體來產生。
dsFv藉由其中VH及VL各自一個胺基酸殘基經半胱胺酸殘基取代的多肽經由半胱胺酸殘基之間的二硫鍵結合來獲得。經半胱胺酸殘基取代之胺基酸殘基可基於抗體之三維結構估計根據Reiter等人(Protein Engineering,7,697(1994))展示之方法選擇。
本發明之dsFv可藉由獲得編碼與aP2特異性反應的本發明之人類CDR移植抗體之VH及VL的cDNA，構築編碼dsFv之DNA，將DNA插入原核生物之表現載體或真核生物之表現載體中且接著將表現載體引入原核生物或真核生物中以表現dsFv來產生。
包含CDR之肽由包括H鏈及L鏈CDR之至少一個區域構成。複數個CDR可直接或經由適當肽連接子結合。
本發明之包含CDR之肽可藉由獲得編碼與aP2特異性反應的人類CDR移植抗體之VH及VL之CDR的cDNA，構築編碼CDR之DNA，將DNA插入原核生物之表現載體或真核生物之表現載體中且接著藉由將表現載體引入原核生物或真核生物中以表現該肽來產生。此外，包含CDR之肽亦可藉由化學合成方法，諸如Fmoc方法(茀基甲氧羰基法)、tBoc方法(第三丁氧基羰基法)或其類似方法來產生。
本發明之抗體包括其中放射性同位素、蛋白質、試劑或其類似物與本發明之抗體化學或基因上結合之抗體衍生物。
本發明之抗體衍生物可藉由將放射性同位素、蛋白質或試劑化學結合於與aP2特異性反應的抗體或抗體片段之H鏈或L鏈之N端側或C端側、抗體或抗體片段之適當取代基或側鏈或者抗體或抗體片段中之糖鏈來產生(Antibody Engineering Handbook,Osamu Kanemitsu編輯，Chijin Shokan公開(1994))。
此外，其可藉由將編碼與aP2特異性反應之本發明之抗體或抗體 片段的DNA與編碼待結合之蛋白質的其他DNA連接，將DNA插入表現載體中且將表現載體引入宿主細胞中而遺傳上產生。
放射性同位素包括131I、125I及其類似物，且其可藉由例如氯胺T方法結合於抗體。
試劑較佳為低分子量化合物。實例包括抗癌劑，諸如烷基化劑(例如氮芥(nitrogen mustard)、環磷醯胺(cyclophosphamide))、代謝拮抗劑(例如5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)、甲胺喋呤(methotrexate))、抗生素(例如道諾黴素(daunomycin)、博萊黴素(bleomycin)、絲裂黴素C(mitomycin C)、道諾比星、小紅莓(doxorubicin))、植物鹼(例如長春新鹼(vincristine)、長春鹼(vinblastine)、長春地辛(vindesine))、激素藥物(例如他莫昔芬(tamoxifen)、地塞米松(dexamethasone))及其類似物(Clinical Oncology,Japanese Society of Clinical Oncology編輯，Cancer and Chemotherapy公開(1996))；消炎劑，諸如類固醇劑(例如羥皮質酮(hydrocortisone)、潑尼松(prednisone))、非類固醇藥(例如阿司匹林(aspirin)、吲哚美辛(indomethacin))、免疫調節劑(例如硫金蘋果酸鹽、青黴胺(penicillamine))、免疫抑制劑(例如環磷醯胺、硫唑嘌呤(azathioprine))及抗組胺劑(例如氯芬尼拉明順丁烯二酸鹽(chlorpheniramine maleate)、氯馬斯汀(clemastine))(Inflammation and Anti-inflammatory Therapy,Ishiyaku Shuppan(1982))；及其類似物。道諾黴素結合於抗體之方法包括其中道諾黴素與抗體之胺基經由戊二醛結合的方法、其中道諾黴素之胺基與抗體之羧基經由水溶性碳化二亞胺結合的方法及其類似方法。
此外，為直接抑制癌細胞，可使用諸如蓖麻毒素、白喉毒素及其類似物之毒素。舉例而言，與蛋白質之融合抗體可藉由將編碼抗體或抗體片段之cDNA連接於編碼蛋白質之其他cDNA，構築編碼融合抗體之DNA，將DNA插入原核生物之表現載體或真核生物之表現載體 中且接著將其引入原核生物或真核生物中以表現融合抗體來產生。
本文中進一步涵蓋抗體片段或抗原結合劑，包括結合劑之融合物，例如免疫球蛋白樣片段及試劑，諸如雙功能抗體、scAb、雙特異性片段、三鏈抗體、Fab-Fv-Fv、Fab-Fv、三功能抗體、(Fab-Fv)2-Fc及抗體片段或部分，諸如CDR或包括CDR之抗體環，其移值至諸如纖維結合蛋白或白胺酸拉鏈之非Ig構架上，如全文併入本文中之Binz等人，(2005)Nat.Biotech.23：1257-1268中所述。
結合之抗-aP2單株抗體及抗原結合劑
必要時，用於本發明之抗體或抗原結合劑可結合於一或多個效應分子。應瞭解效應分子可包含單個效應分子或兩個或兩個以上經連接以形成可附接於本發明抗體之單一部分的此類分子。在需要獲得連接於效應分子之抗體片段下，此可藉由其中抗體片段直接或經由偶合劑連接於效應分子之標準化學或重組DNA程序來製備。用於此類效應分子結合於抗體之技術為此項技術中所熟知(參見Hellstrom等人，Controlled Drug Delivery，第2版，Robinson等人編輯，1987，第623-53頁；Thorpe等人，1982,Immunol.Rev.,62：119-58及Dubowchik等人，1999,Pharmacology and Therapeutics,83,67-123)。特定化學程序包括例如WO 93/06231、WO 92/22583、WO 89/00195、WO 89/01476及WO 03/031581中描述之程序。或者，在效應分子為蛋白質或多肽之情況下，連接可使用重組DNA程序，例如如WO 86/01533及EP0392745中所述來實現。
如本文所用，術語效應分子包括例如抗腫瘤劑、藥物、毒素、生物活性蛋白質(例如酶)、其他抗體或抗體片段、抗原結合劑、合成(包括PEG)或天然存在之聚合物、核酸及其片段(例如DNA、RNA及其片段)、放射性核素、尤其放射性碘化物、放射性同位素、螯合金屬、奈米粒子及報導基團，諸如螢光化合物或可藉由NMR或ESR光譜 分析偵測到之化合物。
效應分子之實例可包括細胞毒素或細胞毒性劑，包括任何對細胞不利(例如殺死)之試劑。實例包括康普瑞汀(combrestatin)、海兔毒素(dolastatin)、埃博黴素(epothilone)、星形孢菌素(staurosporin)、類美登素(maytansinoid)、海綿素(spongistatin)、根瘤菌素(rhizoxin)、軟海綿素(halichondrin)、桿孢菌素(roridin)、海米斯林(hemiasterlin)、紫杉醇(taxol)、細胞遲緩素B(cytochalasin B)、短桿菌素D(gramicidin D)、溴化乙錠(ethidium bromide)、吐根素(emetine)、絲裂黴素(mitomycin)、依託泊苷(etoposide)、特諾波賽(tenoposide)、長春新鹼(vincristine)、長春鹼(vinblastine)、秋水仙鹼(colchicin)、小紅莓(doxorubicin)、道諾比星、二羥基炭疽菌素二酮(dihydroxy anthracin dione)、米托蒽醌(mitoxantrone)、光神黴素(mithramycin)、放線菌素D(actinomycin D)、1-去氫睪固酮、糖皮質激素、普魯卡因(procaine)、四卡因(tetracaine)、利多卡因(lidocaine)、普萘洛爾(propranolol)及嘌呤黴素(puromycin)及其類似物或同源物。
效應分子亦包括(但不限於)抗代謝物(例如甲胺喋呤、6-巰基嘌呤(6-mercaptopurine)、6-硫代鳥嘌呤(6-thioguanine)、阿糖胞苷(cytarabine)、5-氟尿嘧啶、達卡巴嗪(decarbazine))、烷基化劑(例如甲氮芥(mechlorethamine)、噻替派(thioepa)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、美法侖(melphalan)、卡莫司汀(carmustine，BSNU)及洛莫司汀(lomustine，CCNU)、環硫磷醯胺(cyclothosphamide)、白消安(busulfan)、二溴甘露醇(dibromomannitol)、鏈佐黴素(streptozotocin)、絲裂黴素C及順式-二氯二胺鉑(II)(DDP)、順鉑(cisplatin))、蒽環黴素(anthracycline)(例如道諾比星(以前為道諾黴素)及小紅莓)、抗生素(例如放線菌素d(以前為放射菌素)、博萊黴素(bleomycin)、光神黴素、安麯黴素(anthramycin，AMC)、卡奇黴素或 倍癌黴素(duocarmycin))及抗有絲分裂劑(例如長春新鹼及長春鹼)。
其他效應分子可包括螯合放射性核素，諸如111In及90Y、Lu177、鉍213、鐦252、銥192及鎢188/錸188；或藥物，諸如(但不限於)烷基磷酸膽鹼、拓撲異構酶I抑制劑、類紫杉醇及蘇拉明(suramin)。
其他效應分子包括蛋白質、肽及酶。相關酶包括(但不限於)蛋白水解酶、水解酶、裂解酶、異構酶、轉移酶。相關蛋白質、多肽及肽包括(但不限於)免疫球蛋白、毒素(諸如相思子毒素、蓖麻毒素A、綠膿桿菌外毒素或白喉毒素)、蛋白質(諸如胰島素、腫瘤壞死因子、α-干擾素、β-干擾素、神經生長因子、血小板衍生生長因子或組織纖維蛋白溶酶原活化因子)、血栓性劑或抗血管生成劑(例如血管生長抑素或內皮生長抑素)或生物反應調節劑(諸如淋巴激素、介白素-1(IL-1)、介白素-2(IL-2)、顆粒球巨噬細胞群落刺激因子(GM-CSF)、粒細胞群落刺激因子(G-CSF)、神經生長因子(NGF)或其他生長因子及免疫球蛋白)。
其他效應分子可包括可用於例如診斷中之可偵測物質。可偵測物質之實例包括各種酶、輔基、螢光物質、發光物質、生物發光物質、放射性核素、正電子發射金屬(用於正電子發射斷層攝影法)及非放射性順磁性金屬離子。關於金屬離子，一般參見美國專利第4,741,900號，其可結合於抗體用於診斷學。適合酶包括辣根過氧化酶、鹼性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙醯膽鹼酯酶；適合輔基包括抗生蛋白鏈菌素、抗生物素蛋白及生物素；適合螢光物質包括傘酮、螢光素、異硫氰酸螢光素、若丹明、二氯三嗪基胺螢光素、丹磺醯氯及藻紅素；適合發光材料包括魯米諾(luminol)；適合生物發光材料包括螢光素酶、螢光素及水母素；且適合放射性核素包括125I、131I、111In及99Tc。
在另一實例中，效應分子可增加抗體在活體內之半衰期，及/或降低抗體之免疫原性及/或增強抗體跨越上皮障壁傳遞至免疫系統。此類型適合效應分子之實例包括聚合物、白蛋白、白蛋白結合蛋白或白蛋白結合化合物，諸如WO05/117984中描述之彼等化合物。
在一個實施例中，藉由與aP2或抗人類aP2抗體無關的效應分子提供之半衰期為有利的。
在效應分子為聚合物之情況下，其一般可為合成或天然存在之聚合物，例如視情況經取代之直鏈或分支鏈聚伸烷基、聚伸烯基或聚氧化烯聚合物或分支鏈或未分支多醣(例如均多醣或雜多醣)。
可存在於以上提及之合成聚合物上的視情況選用之特定取代基包括一或多個羥基、甲基或甲氧基。
合成聚合物之特定實例包括視情況經取代之直鏈或分支鏈聚(乙二醇)、聚(丙二醇)、聚(乙烯醇)或其衍生物，尤其視情況經取代之聚(乙二醇)，諸如甲氧基聚(乙二醇)或其衍生物。
特定天然存在之聚合物包括乳糖、直鏈澱粉、聚葡萄糖、肝糖或其衍生物。
在一個實施例中，聚合物為白蛋白或其片段，諸如人類血清白蛋白或其片段。在一個實施例中，聚合物為PEG分子。
如本關於結合物文所用，「衍生物」意欲包括反應性衍生物，例如硫醇選擇性反應基，諸如順丁烯二醯亞胺及其類似物。反應性基團可直接或經由連接子區段連接於聚合物。應瞭解此類基團之殘基在一些情況下將作為抗體片段與聚合物之間的鍵聯基團形成產物之一部分。
天然或合成聚合物之尺寸可按需要變化，但一般將在500Da至50000Da、例如5000至40000Da，諸如20000至40000Da之平均分子量範圍內。聚合物尺寸可尤其基於產物之意欲用途，例如定位至某些 組織，諸如腫瘤或延長循環半衰期之能力而選擇(評述參見Chapman,2002,Advanced Drug Delivery Reviews,54,531-545)。因此，舉例而言，在產物意欲離開循環且滲透組織，例如用於治療腫瘤之情況下，宜使用例如分子量為大約5000Da之小分子量聚合物。對於產物仍然在循環中之應用，宜使用較高分子量聚合物，例如分子量在20000Da至40000Da範圍內
適合聚合物包括聚伸烷基聚合物，諸如聚(乙二醇)或尤其甲氧基聚(乙二醇)或其衍生物，且尤其分子量在約15000Da至約40000Da範圍內。
在一個實例中，用於本發明之抗體附接於聚(乙二醇)(PEG)部分。在一個特定實例中，抗體為抗體片段且PEG分子可經由位於抗體片段中的任何可用之胺基酸側鏈或末端胺基酸官能基，例如任何游離胺基、亞胺基、硫醇、羥基或羧基附接。此類胺基酸可天然存在於抗體片段中或可使用重組DNA方法經工程改造至片段中(參見例如US 5,219,996；US 5,667,425；WO98/25971、WO2008/038024)。在一個實例中，本發明之抗體分子為經修飾之Fab片段，其中該修飾為一或多個胺基酸添加至其重鏈之C端以允許效應分子附接。適當地，附加之胺基酸形成含有一或多個效應分子可附接之半胱胺酸殘基的經修飾之鉸鏈區。多個位點可用於附接兩個或兩個以上PEG分子。
適當地，PEG分子經由位於抗體片段中的至少一個半胱胺酸殘基之硫醇基共價連接。各附接於經修飾之抗體片段的聚合物分子可共價連接於位於片段中之半胱胺酸殘基之硫原子。共價鍵一般將為二硫鍵或尤其硫-碳鍵。在硫醇基用作附接點之情況下，可使用適當活化之效應分子，例如硫醇選擇性衍生物，諸如順丁烯二醯亞胺及半胱胺酸衍生物。活化聚合物可用作製備如上所述之經聚合物修飾之抗體片段中的起始物質。
活化聚合物可為含有硫醇反應性基團之任何聚合物，諸如α-鹵基羧酸或酯，例如碘乙醯胺、醯亞胺(例如順丁烯二醯亞胺)、乙烯基碸或二硫化物。此類起始物質可購得(例如自Nektar，以前為Shearwater Polymers Inc.,Huntsville,AL,USA)或可使用習知化學程序由市售起始物質製備。特定PEG分子包括20K甲氧基-PEG-胺(可獲自Nektar，以前為Shearwater；Rapp Polymere；以及SunBio)及M-PEG-SPA(可獲自Nektar，以前為Shearwater)。
在一個實施例中，抗體為經修飾之Fab片段、Fab'片段或diFab，其例如根據EP 0948544或EP1090037中揭示之方法聚乙二醇化，亦即PEG(聚(乙二醇))共價附接[亦參見「Poly(ethyleneglycol)Chemistry,Biotechnical and Biomedical Applications」,1992,J.Milton Harris(編輯)，Plenum Press,New York,「Poly(ethyleneglycol)Chemistry and Biological Applications」,1997,J.Milton Harris及S.Zalipsky(編輯)，American Chemical Society,Washington DC and「Bioconjugation Protein Coupling Techniques for the Biomedical Sciences」,1998,M.Aslam及A.Dent,Grove Publishers,New York；Chapman,A.2002,Advanced Drug Delivery Reviews 2002,54：531-545]。在一個實例中，PEG附接於鉸鏈區中之半胱胺酸。在一個實例中，經PEG修飾之Fab片段具有共價連接於經修飾之鉸鏈區中單一硫醇基的順丁烯二醯亞胺基團。離胺酸殘基可共價連接於順丁烯二醯亞胺基且離胺酸殘基上之各胺基可附接分子量為大約20,000Da之甲氧基聚(乙二醇)聚合物。因此附接於Fab片段之PEG的總分子量可為大約40,000Da。
特定PEG分子包括經N,N'-雙(甲氧基聚(乙二醇)MW 20,000)修飾之離胺酸的2-[3-(N-順丁烯二醯亞胺基)丙醯胺基]乙基醯胺，亦稱為PEG2MAL40K(可獲自Nektar，以前為Shearwater)。
PEG連接子之替代來源包括NOF，其供應GL2-400MA3(其中以 下結構中之m為5)及GL2-400MA(其中m為2)且n大約為450：
m為2或5。
換言之，各PEG為約20,000Da。
因此，在一個實施例中，PEG為2,3-雙(甲基聚氧乙烯-氧基)-1-{[3-(6-順丁烯二醯亞胺基-1-側氧基己基)胺基]丙基氧基}己烷(2臂分支鏈PEG，-CH2)3NHCO(CH2)5-MAL，Mw 40,000，稱為SUNBRIGHT GL2-400MA3。
以下類型之其他替代PEG效應分子：
獲自Dr Reddy、NOF及Jenkem。
在一個實施例中，提供一種經聚乙二醇化之抗體(例如具有本文中描述之PEG)，其在或約在鏈中胺基酸229、例如重鏈之胺基酸229(藉由依序編號)、例如Seq.ID No.456、460、458、462或464之胺基酸229經由半胱胺酸胺基酸殘基附接。
在一個實施例中，本發明提供一種Fab'PEG分子，其包含一或多個PEG聚合物，例如1或2個聚合物，諸如40kDa聚合物或聚合物。
根據本發明之Fab'-PEG分子尤其有利，因為其具有與Fc片段無關之半衰期。在一個實例中，本發明提供一種治療藉由調節人類aP2生物活性而改善之疾病的方法，其包含投與治療有效量之抗-aP2抗體或 其抗原結合劑，其中抗體或其抗原結合劑具有與Fc結合於aP2無關之半衰期。
在一個實施例中，提供結合於諸如PEG分子、澱粉分子或白蛋白分子之聚合物之Fab'。
在一個實施例中，提供結合於諸如PEG分子、澱粉分子或白蛋白分子之聚合物之scFv。
在一個實施例中，抗體或片段結合於澱粉分子，例如以增加半衰期。澱粉結合於蛋白質之方法如US 8,017,739中所述，以引用的方式併入本文中。
聚核苷酸
本發明亦提供一種經分離之DNA序列，其編碼本發明之抗體分子的重鏈及/或輕鏈。適當地，DNA序列編碼本發明之抗體分子之重鏈或輕鏈。本發明之DNA序列可包含合成DNA，例如藉由化學加工、cDNA、基因組DNA或其任何組合產生。
編碼本發明之抗體分子的DNA序列可藉由熟習此項技術者熟知之方法獲得。舉例而言，編碼抗體重鏈及輕鏈部分或所有之DNA序列可按需要自確定之DNA序列或基於對應胺基酸序列合成。
編碼接受體構架序列之DNA為熟習此項技術者廣泛可獲得且容易基於其已知之胺基酸序列合成。
分子生物學之標準技術可用於製備編碼本發明之抗體分子的DNA序列。所需DNA序列可使用寡核苷酸合成技術完全或部分合成。適當時可使用定點突變誘發及聚合酶鏈反應(PCR)技術。
適合cDNA序列之實例提供於以下表12中。
編碼人類化輕鏈可變區之適合cDNA序列之實例提供於Seq.ID No.467、469、491、493、471及473中。編碼人類化重鏈可變區之適合DNA序列之實例提供於Seq.ID No.475、507、477、509及511中。
編碼輕鏈(可變及恆定)之適合cDNA序列之實例提供於Seq.ID No.468、470、492、494、472及474中。
編碼重鏈(可變及恆定)之適合cDNA序列之實例提供於Seq.ID No.476、508、478、510及512中。
本發明亦關於一種選殖或表現載體，其包含本發明之一或多個DNA序列。因此，提供一種選殖或表現載體，其包含編碼本發明之抗體的一或多個DNA序列。適當地，選殖或表現載體包含分別編碼本發明之抗體分子之輕鏈及重鏈的兩個DNA序列，及適合信號序列。在一個實例中，載體在重鏈與輕鏈之間包含基因間序列(參見WO03/048208)。
可構築載體之一般方法、轉染方法及培養方法為熟習此項技術者所熟知。在此方面，參考「Current Protocols in Molecular Biology」,1999,F.M.Ausubel(編輯)，Wiley Interscience,Cold Spring Harbour Publishing出版之New York and the Maniatis Manual。
表現抗-aP2抗體或其片段之宿主細胞
亦提供一種宿主細胞，其包含一或多種選殖或表現載體，該選殖或表現載體包含編碼本發明之抗體的一或多種DNA序列。任何適合之宿主細胞/載體系統可用於表現編碼本發明之抗體分子的DNA序 列。可使用細菌，例如大腸桿菌及其他微生物系統，或亦可使用真核，例如哺乳動物、宿主細胞表現系統。適合哺乳動物宿主細胞包括CHO、骨髓瘤或融合瘤細胞。
用於本發明之中國倉鼠卵巢(CHO細胞)的適合類型可包括CHO及CHO-K1細胞，包括dhfr-CHO，諸如可用於DHFR可選標記物之CHO-DG44細胞及CHO-DXB11細胞或可用於麩醯胺酸合成酶可選標記物之CHOK1-SV細胞。用於表現抗體之其他細胞類型包括淋巴細胞性細胞株，例如NSO骨髓瘤細胞及SP2細胞、COS細胞。其他適合之細胞可包括此項技術中已知之人胚腎(hek)纖維母細胞，例如hek293F及ExpiHek細胞。
在一個實施例中，提供一種宿主細胞，其包含含有選自以下之DNA序列的選殖或表現載體：Seq.ID No.467、469、491、493、471、473、475、507、477、509、511、468、470、492、494、472、474、476、508、478、510或512。
抗-aP2抗體或其片段之產生
本發明亦提供一種用於產生根據本發明之抗體分子的方法，其包含在適合於自編碼本發明之抗體分子的DNA表現蛋白質之條件下培養含有本發明之載體的宿主細胞且分離抗體分子。
抗體分子可僅僅包含重鏈或輕鏈多肽，在此情況下僅僅重鏈或輕鏈多肽編碼序列需要用於轉染宿主細胞。為產生包含重鏈與輕鏈之產物，細胞株可經兩種載體轉染，第一載體編碼輕鏈多肽且第二載體編碼重鏈多肽。或者，可使用單一載體，該載體包括編碼輕鏈及重鏈多肽之序列。
提供一種培養宿主細胞且表現抗體或其片段、分離後者且視情況純化其以提供分離之抗體或片段的方法。在一個實施例中，該方法進一步包含將效應分子結合於分離之抗體或片段，例如結合於尤其如 本文所述之PEG聚合物的步驟。
在一個實施例中，提供一種用於純化抗體(尤其根據本發明之抗體或片段)的方法，其包含以下步驟：以非結合模式進行陰離子交換層析法，使得雜質保留在管柱上且抗體溶離。
在一個實施例中，純化採用蛋白A管柱上親和力捕捉且接著滴定。在一個實施例中，純化採用蛋白G管柱上親和力捕捉，且接著HPLC滴定。在一個實施例中，純化採用aP2管柱上親和力捕捉，且接著滴定。
在一個實施例中，純化採用汽巴藍或類似者，用於純化白蛋白融合物或結合物分子。
適用於該方法之離子交換樹脂包括Q.FF樹脂(由GE-Healthcare供應)。步驟可例如在約pH 8下進行。
該方法可進一步包含採用陽離子交換層析之初始捕捉步驟，例如在約pH 4至5、諸如4.5下進行。陽離子交換層析可例如採用樹脂，諸如CaptoS樹脂或SP瓊脂糖凝膠FF(GE-Healthcare供應)。接著抗體或片段可自樹脂溶離，採用諸如氯化鈉之離子鹽溶液，例如濃度為200mM。
因此，適當時，層析步驟可包括一或多個洗滌步驟。
純化方法亦可包含一或多個過濾步驟，諸如透濾步驟或HPLC過濾步驟。
因此，在一個實施例中，提供一種經純化之抗-aP2抗體或片段，例如人類化抗體或片段，尤其根據本發明之抗體或片段，其實質上自內毒素及/或宿主細胞蛋白質或DNA純化、尤其不含或實質上不含內毒素及/或宿主細胞蛋白質或DNA。
如上文使用之純化意指至少90%純，諸如91%w/w、92%w/w、93%w/w、94%w/w、95%w/w、96%w/w、97%w/w、98%w/w、 99%w/w或更純。
實質上不含內毒素一般意指每毫克抗體產物1EU之內毒素含量或更低，諸如每毫克產物0.5或0.1EU。
實質上不含宿主細胞蛋白質或DNA一般意指每毫克抗體產物400μg宿主細胞蛋白質及/或DNA含量或更低，諸如每毫克100μg或更低，尤其適當時每毫克20μg。
醫藥組合物
因為本發明之抗體適用於治療及/或預防病理性病狀，所以本發明亦提供一種醫藥或診斷組合物，其包含本發明之抗體或抗原結合劑與一或多種醫藥學上可接受之賦形劑、稀釋劑或載體組合。因此，提供本發明之抗體或抗原結合劑用於製造藥劑之用途。組合物通常將作為通常包括醫藥學上可接受之載劑的無菌醫藥組合物之一部分供應。本發明之醫藥組合物可另外包含醫藥學上可接受賦形劑。
本發明亦提供一種用於製備醫藥或診斷組合物之方法，其包含添加及混合本發明之抗體或抗原結合劑連同一或多種醫藥學上可接受之賦形劑、稀釋劑或載體。
抗體或抗原結合劑可為醫藥或診斷組合物中之唯一活性成分或可伴隨有其他活性成分，包括其他抗體成分或非抗體成分，諸如類固醇或其他藥物分子，尤其半衰期與aP2結合無關之藥物分子。
醫藥組合物宜包含治療有效量之本發明之抗體或抗原結合劑。如本文所用，術語「治療有效量」係指治療、改善或預防靶向疾病或病狀或展現可偵測之治療或預防效果所需要的治療劑之量。對於任何揭示之抗體或抗原結合劑，可最初在細胞培養分析中或在動物模型中，通常在嚙齒動物、兔、狗、豬或靈長類動物中估計治療有效量。動物模型亦可用於確定投與之適當濃度範圍及途徑。該等資訊可隨後用於確定適用於投與人類之劑量及途徑。
人類個體之精確治療有效量將視疾病病況之嚴重程度、個體之整體健康、個體之年齡、重量及性別、飲食、投與之時間及頻率、藥物組合、反應敏感性及對療法之耐受性/反應而定。此量可藉由常規實驗確定且在臨床醫師之判斷內。一般而言，治療有效量為0.01mg/kg至500mg/kg，例如0.1mg/kg至200mg/kg，諸如100mg/Kg。醫藥組合物宜呈每劑含有預定量之本發明之活性劑的單位劑型呈現。
根據本發明之抗體或抗原結合劑之治療劑量未展示活體內明顯毒理學作用。
有利地，藉由投與連續劑量之根據本發明之抗體或結合劑，活體內aP2活性之含量可維持在適當減少之程度下。
組合物可個別投與患者或可與其他藥劑、藥物或激素組合投與(例如同時、連續或分開)。
醫藥組合物亦可含有醫藥學上可接受之載劑以投與抗體或抗原結合劑。載體本身不應誘發對接收組合物之個體有害之抗體產生且不應具有毒性。適合載劑可為大的緩慢代謝之巨分子，諸如蛋白質、多肽、脂質體、多醣、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合胺基酸、胺基酸共聚物及不活化病毒粒子。
可使用醫藥學上可接受之鹽，例如無機酸鹽，諸如鹽酸鹽、氫溴酸鹽、磷酸鹽及硫酸鹽，或有機酸之鹽，諸如乙酸鹽、丙酸鹽、丙二酸鹽及苯甲酸鹽。
治療組合物中醫藥學上可接受之載劑可另外含有液體，諸如水、生理食鹽水、丙三醇及乙醇。另外，諸如潤濕劑或乳化劑或pH緩衝物質之輔助物質可存在於此類組合物中。此等載劑使得醫藥組合物能夠調配成錠劑、丸劑、糖衣藥丸、膠囊、液體、凝膠、糖漿、漿液及懸浮液，以便患者攝入。
較佳投與形式包括適合於非經腸投與之形式，例如藉由注射或 輸注，例如藉由快速注射或連續輸注。在產物用於注射或輸注下，其可呈於油性或水性媒劑中之懸浮液、溶液或乳液之形式且其可含有調配試劑，諸如懸浮劑、防腐劑、穩定化劑及/或分散劑。或者，抗體分子可呈乾燥形式，在使用之前用適當無菌液體復原。
一旦調配，本發明之組合物可直接投與個體。待治療之個體可為動物。然而，組合物較佳適合於投與人類個體。
本發明之醫藥組合物可藉由多種途徑投與，包括(但不限於)經口、靜脈內、肌肉內、動脈內、髓內、鞘內、室內、透皮、經皮(例如參見WO98/20734)、皮下、腹膜內、鼻內、經腸、局部、舌下、陰道內或直腸途徑。亦可使用無針注射器投與本發明之醫藥組合物。通常，治療組合物可製備成呈液體溶液或懸浮液形式之可注射劑。亦可製備適合於在注射前溶解或懸浮於液體媒劑中之固體形式。組合物之直接傳遞將一般藉由皮下、腹膜內、經靜脈內或肌肉內注射實現，或傳遞至組織之胞間隙。組合物亦可投至病變中。劑量治療可為單劑量時程或多劑量時程。
應瞭解組合物中之活性成分將為抗體分子。因而，將易在胃腸道中降解。因此，若組合物藉由使用胃腸道之途徑投與，則組合物將需要含有保護抗體免於降解但一旦自胃腸道吸收則釋放抗體的試劑。
醫藥學上可接受之載劑的充分論述可得自Remington's Pharmaceutical Sciences(Mack Publishing Company,N.J.1991)。
在一個實施例中，本文中描述之抗-aP2單株抗體作為控制釋放調配物投與，包括插入物、透皮貼片及微膠囊化傳遞系統。可使用可生物降解之生物相容性聚合物，諸如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、膠原蛋白、聚原酸酯及聚乳酸。製備此等調配物之多種方法描述於例如Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems,J.R.Robinson編輯，Marcel Dekker,Inc.,New York,1978.Pharmaceutical compositions are preferably manufactured under GMP conditions。
在一個實施例中，抗-aP2單株抗體不斷投與，例如抗體可用無針皮下注射裝置，諸如美國專利第5,399,163號、第5,383,851號、第5,312,335號、第5,064,413號、第4,941,880號、第4,790,824號或第4,596,556號中揭示之裝置投與。適用於本發明之植入物及模塊之實例包括：美國專利第4,487,603號，其揭示一種可植入之微輸注泵，用於以控制速率分配藥物；美國專利第4,486,194號，其揭示一種治療裝置，用於投與藥物穿過皮膚；美國專利第4,447,233號，其揭示一種藥物輸注泵，用於以精確輸注速率傳遞藥物；美國專利第4,447,224號，其揭示一種可變流量的可植入輸注設備，用於連續傳遞藥物；美國專利第4,439,196號，其揭示一種具有多腔室隔室之滲透藥物傳遞系統；以及美國專利第4,475,196號，其揭示一種滲透藥物傳遞系統。許多其他此類植入物、傳遞系統及模塊為已知。
治療應用
本文所述之抗-aP2單株抗體化合物，包括抗人類aP2人類化抗體化合物以及所揭示之抗原結合劑靶向脂質伴護蛋白aP2/FABP4蛋白質，且適用於治療代謝病症，包括(但不限於)糖尿病(例如2型糖尿病)、肥胖及脂肪肝、癌症(包括脂肪肉瘤、膀胱癌及卵巢癌)及心血管病症。已意外地發現，本文所述之抗-aP2抗體化合物能夠以低結合親和力結合於分泌aP2，其在投與有需要之宿主時，中和aP2活性且當與具有更高結合親和力之抗-aP2單株抗體相比時在宿主中提供較低空腹血糖含量、改善全身性葡萄糖代謝、增加全身性胰島素敏感性、減少脂肪量、肝臟脂肪變性、改善血清脂質型態及/或減少致動脈粥樣硬化斑形成。
在本發明之一個態樣中，提供一種治療宿主之aP2介導之病症的方法，其藉由投與有效量之本文中描述之抗-aP2單株抗體或抗原結合 劑。在一個實施例中，病症為代謝病症。在一個實施例中，病症為糖尿病。在一個實施例中，病症為I型糖尿病。在一個實施例中，病症為II型糖尿病。在一個實施例中，病症為高血糖症。在一個實施例中，病症為肥胖。在一個實施例中，病症為血脂異常。在一個實施例中，病症為脂肪肝。在一個實施例中，病症為心血管病症。在一個實施例中，病症為動脈粥樣硬化。在一個實施例中，病症為發炎性病症。在一個實施例中，病症為哮喘。在一個實施例中，病症為增生性病症，例如腫瘤或贅瘤。在一個實施例中，腫瘤係選自移行膀胱癌、卵巢癌及脂肪肉瘤。在一個實施例中，病症為多囊性卵巢症候群(POS)。
代謝病症
在本發明之一個態樣中，提供一種用於治療宿主之代謝病症的方法，其藉由投與有效量之本文中描述之抗-aP2單株抗體。代謝病症包括個體中由異常代謝(亦即為重要過程及活性提供能量之活細胞中化學改變)引起或特徵為異常代謝之病症、疾病或病狀。代謝病症包括與高血糖症或異常脂肪細胞(例如棕色或白色脂肪細胞)表現型或功能相關之疾病、病症或病狀。代謝病症可不利地影響細胞功能，諸如細胞增殖、生長、分化或遷移、細胞穩態調節、細胞間或細胞內通信；組織功能，諸如肝功能、腎功能或脂肪細胞功能；生物體中全身性反應，諸如激素反應(例如胰島素反應)。代謝病症之實例包括肥胖、糖尿病、暴食、內分泌異常、三酸甘油酯儲存病、巴迪特-別鐸症候群(Bardet-Biedl syndrome)、勞倫斯-莫因症候群(Laurence-Moon syndrome)、普拉德-拉伯哈特-威利症候群(Prader-Labhart-Willi syndrome)及脂質代謝病症。
糖尿病
糖尿病為全世界最常見之代謝疾病。每天在美國診斷出1700例 新糖尿病，且1600萬患有糖尿病之美國人中至少三分之一不清楚其。糖尿病為成年人中失明、腎衰竭及下肢截肢之主要原因且為心血管疾病及中風之主要風險因素。
在本發明之一個態樣中，提供一種治療糖尿病之方法，其藉由向宿主投與有效量之本文中描述之抗-aP2單株抗體。在一個實施例中，病症為I型糖尿病。在一個實施例中，病症為II型糖尿病。
I型糖尿病由胰臟β細胞之自體免疫破壞，引起胰島素缺乏產生。II型或非胰島素依賴型糖尿病(NIDDM)佔病例>90%且特徵為對周圍組織、尤其骨胳肌肉及脂肪細胞中葡萄糖吸收之胰島素作用的抗性、抑制肝葡萄糖產生之胰島素作用減弱及誤調節之胰島素分泌。
在本發明之一個實施例中，本文提供一種治療宿主之I型糖尿病的方法，其藉由向宿主投與有效量之本文中描述之抗-aP2單株抗體與胰島素組合或交替。在本發明之一個實施例中，本文提供一種治療宿主之I型糖尿病的方法，其藉由向宿主投與有效量之本文中描述之抗-aP2單株抗體與合成胰島素類似物組合或交替。
患有II型糖尿病之一些人可僅藉由飲食及運動實現其目標血糖含量，但許多亦需要糖尿病藥物治療或胰島素療法。在本發明之一個實施例中，本文提供一種治療宿主之II型糖尿病的方法，其藉由向宿主投與有效量之本文中描述之抗-aP2單株抗體與選自以下之化合物組合或交替：二甲雙胍(metformin)(Glucophage、Glumetza)；磺醯脲，包括格列本脲(glyburide)(DiaBeta、Glynase)、格列吡嗪(glipizide)(Glucotrol)及格列美脲(glimepiride)(Amaryl)；美格替耐(Meglitinide)，例如瑞格列奈(repaglinide)(Prandin)及那格列奈(nateglinide)(Starlix)；噻唑啶二酮，例如羅格列酮(rosiglitazone)(Avandia)及吡格列酮(pioglitazone)(Actos)；DPP-4抑制劑，例如西他列汀(sitagliptin)(Januvia)、沙格列汀 (saxagliptin)(Onglyza)及利格列汀(linagliptin)(Tradjenta)；GLP-1受體促效劑，例如艾塞那肽(Exenatide)(Byetta)及利拉魯肽(liraglutide)(Victoza)；SGLT2抑制劑，例如卡格列淨(canagliflozin)(Invokana)及達格列淨(dapagliflozin)(Farxiga)；或胰島素療法。胰島素之非限制性實例包括賴麩胰島素(Apidra)；賴脯胰島素(Humalog)；門冬胰島素(Novolog)；甘精胰島素(Lantus)；地特胰島素(Levemir)；魚精蛋白胰島素(Humulin N、Novolin N)。
在一個實施例中，本文提供一種治療與糖尿病相關之疾病或病狀的方法，其藉由向宿主投與有效量之本文中描述之抗-aP2單株抗體。與糖尿病相關之疾病及病狀可包括但不限於高血糖症、高胰島素血症、高脂質血症、胰島素抗性、減弱之葡萄糖代謝、肥胖、糖尿病性視網膜病變、黃斑變性、白內障、糖尿病性腎病、腎小球硬化、糖尿病性神經病變、勃起功能障礙、經前症候群、血管再狹窄及潰瘍性結腸炎。此外，與糖尿病相關之疾病及病狀包含但不限於：冠心病、高血壓、心絞痛、心肌梗塞、中風、皮膚及結締組織病症、足部潰瘍、代謝性酸中毒、關節炎、骨質疏鬆及尤其糖耐量減低之病狀。
體重病症
在本發明之一個實施例中，提供一種用於治療宿主之肥胖的方法，其藉由投與有效量之本文中描述之抗-aP2單株抗體。肥胖代表最普遍之體重病症，影響估計西方世界中年群體30%至50%。
在本發明之一個實施例中，提供一種用於治療宿主之肥胖的方法，其藉由投與有效量之本文中描述之抗-aP2單株抗體或抗原結合劑與用於治療肥胖之第二治療劑組合或交替。肥胖治療之實例包括(但不限於)苯丁胺、Belviq(氯卡色林(lorcaserin))、安非拉酮(diethylpropion)、苯二甲嗎啉酒石酸鹽、Xenical(奧利司他(orlistat))、Contrave、奧利司他、甲基安非他明(methamphetamine)、 Desoxyn、Didrex、Bontril PDM、Suprenza、苄非他明(benzphetamine)、Qsymia(苯丁胺-托吡酯(topiramat))、Regimex、納曲酮(naltrexone)-安非他酮(bupropion)、Evekeo、氯卡色林及安非他明硫酸鹽。
在一個實施例中，提供一種減少或抑制宿主體重增加之方法，其藉由投與有效量之本文中描述之抗-aP2單株抗體或抗原結合劑。
脂肪肝
需要用於治療及預防脂肪肝及源於脂肪肝之病狀，諸如非酒精性脂肪變性肝炎(NASH)、肝臟發炎、肝硬化及肝衰竭出現的組合物及方法。在本發明之一個實施例中，提供一種治療宿主之脂肪肝的方法，其藉由投與有效量之如本文所述之抗-aP2單株抗體或結合劑。
在一個實施例中，本文中描述之抗-aP2單株抗體或抗原結合劑與Ω-3脂肪酸或過氧化體增殖劑活化受體(PPAR)促效劑組合或交替投與。
已知Ω-3脂肪酸藉由抑制DGAT及藉由刺激過氧化體及粒線體β氧化而降低血清三酸甘油酯。已發現兩種Ω-3脂肪酸，二十碳五烯酸(EPA)及二十二碳六烯酸(DHA)對PPAR-α及PPAR-γ具有高親和力。例如魚油之海洋油為EPA及DHA之良好來源，已發現其調節脂質代謝。已發現Ω-3脂肪酸對心血管病、尤其輕度高血壓、高三酸甘油酯血症之風險因子以及對凝血因子VII磷脂複合物活性具有有益作用。Ω-3脂肪酸降低血清三酸甘油酯，增加血清HDL-膽固醇，降低收縮及舒張血壓及脈衝速率，且降低血液凝血因子VII-磷脂複合物之活性。此外，Ω-3脂肪酸似乎耐受性良好，不產生任何嚴重副作用。Ω-3脂肪酸之一種此類形式為來自含有DHA及EPA之魚油的Ω-3長鏈多不飽和脂肪酸之濃縮物且以商標Omacor®出售。Ω-3脂肪酸之此類形式描述於例如美國專利第5,502,077號、第5,656,667號及第5,698,594號，其 揭示內容以引用的方式併入本文中。
過氧化體增殖劑活化受體(PPAR)為與類視黃素、類固醇及甲狀腺激素受體相關的核激素受體超家族配位體活化轉錄因子之成員。存在三個不同PPAR亞型，其為不同基因之產物且通常稱為PPAR-α、PPAR-β/δ(或僅僅δ)及PPAR-γ。刺激過氧化體活性之一般類別藥理學藥劑稱為PPAR促效劑，例如PPAR-α促效劑、PPAR-γ促效劑及PPAR-δ促效劑。一些藥理學藥劑為PPAR促效劑之組合，諸如α/γ促效劑等，且一些其他藥理學藥劑具有雙重促效劑/拮抗劑活性。諸如非諾貝特(fenofibrate)、苯紮貝特(bezafibrate)、氯貝特(clofibrate)及吉非羅齊(gemfibrozil)之纖維酸酯為PPAR-α促效劑且用於患者中以降低富含三酸甘油酯之脂蛋白、增加HDL及降低致動脈粥樣硬化密集之LDL。纖維酸酯通常經口投與此類患者。已知非諾貝特或2-[4-(4-氯苯甲醯基)苯氧基]-2-甲基-丙酸1-甲基乙基酯作為醫學活性成分多年，因為其有效降低血液三酸甘油酯及膽固醇含量。
心血管疾病
在本發明之一個實施例中，提供一種治療宿主之心血管疾病的方法，其藉由投與有效量之本文中描述之抗-aP2單株抗體。本發明之抗-aP2抗體適用於預防、抑制或降低由動脈粥樣硬化引起之心血管及腦血管疾病，諸如心肌及/或大腦缺血、心肌梗塞、絞痛、周邊血管疾病及中風的風險。
在一個實施例中，提供一種預防、抑制或降低宿主中由動脈粥樣硬化引起之心血管及腦血管疾病之風險的方法，其藉由向宿主投與有效量之本文中描述之抗-aP2單株抗體與抗動脈粥樣硬化劑組合或交替。
抗動脈粥樣硬化劑之實例包括(但不限於)HMG CoA還原酶抑制劑、微粒體三酸甘油酯轉移蛋白質(MTP)抑制劑、纖維酸衍生物、角 鯊烯合成酶抑制劑及其他已知之膽固醇降低劑、脂肪加氧酶抑制劑、ACAT抑制劑及如下文中揭示之PPAR α/γ雙重促效劑。
抗動脈粥樣硬化劑可為HMG CoA還原酶抑制劑，其包括(但不限於)如美國專利第3,983,140號中揭示之美伐他汀(mevastatin)及相關化合物、如美國專利第4,231,938號中揭示之洛伐他汀(lovastatin)(梅奴靈(mevinolin))及相關化合物、諸如美國專利第4,346,227號中揭示之普伐他汀(pravastatin)及相關化合物、如美國專利第4,448,784號及第4,450,171號中揭示之辛伐他汀(simvastatin)及相關化合物，其中普伐他汀、洛伐他汀或辛伐他汀為較佳。可用於本文中之其他HMG CoA還原酶抑制劑包括(但不限於)美國專利第5,354,772號中揭示之氟伐他汀(fluvastatin)、美國專利第5,006,530號及第5,177,080號中揭示之西立伐他汀(cerivastatin)、美國專利第4,681,893號、第5,273,995號、第5,385,929號及第5,686,104號中揭示之阿托伐他汀(atorvastatin)、如美國專利第4,613,610號中揭示之甲羥戊酸內酯衍生物之吡唑類似物、如PCT申請案WO 86/03488中揭示之甲羥戊酸內酯衍生物之茚類似物、如美國專利第4,647,576號中揭示之6-(2-(經取代之吡咯-1-基)-烷基)哌喃-2-酮及其衍生物、Searle之SC-45355(3-經取代之戊二酸衍生物)二氯乙酸鹽、如PCT申請案WO 86/07054中揭示之甲羥戊酸內酯之咪唑類似物、如法國專利第2,596,393號中揭示之3-羧基-2-羥基-丙烷-膦酸衍生物、如歐洲專利申請案第0221025號中揭示之2,3-二取代之吡咯、呋喃及噻吩衍生物、如美國專利第4,686,237號中揭示之甲羥戊酸內酯之萘基類似物、諸如美國專利第4,499,289號中揭示之八氫萘、如歐洲專利申請案第0142146A2號中揭示之梅奴靈(洛伐他汀)之酮基類似物以及其他已知之HMG CoA還原酶抑制劑。另外，適用於抑制HMG CoA還原酶的適用於本文中之一元膦酸化合物揭示於GB 2205837中。
適用於本文中之角鯊烯合成酶抑制劑包括(但不限於)美國專利第5,712,396號中揭示之α-膦醯基-磺酸酯；Biller等人，J.Med.Chem.,1988，第31卷，第10q期，第1869-1871頁揭示者，包括類異戊二烯(氧膦基甲基)膦酸酯以及如美國專利第4,871,721號及第4,924,024號中揭示之其他角鯊烯合成酶抑制劑。另外，適用於本文中之其他角鯊烯合成酶抑制劑包括P.Ortiz de Montellano等人，J.Med.Chem.,1977,20,243-249揭示之類萜焦磷酸鹽；如Corey及Volante,J.Am.Chem.Soc.,1976,98,1291-1293揭示之法呢基二磷酸酯類似物A及原角鯊烯焦磷酸鹽(PSQ-PP)類似物；McClard,R.W.等人，J.A.C.S.,1987,109,5544報導之氧膦基膦酸酯及Capson,T.L.,PhD dissertation,1987年6月，Dept.Med.Chem.U of Utah,abstract,Table of Contents，第16、17、40-43、48-51頁，Summary報導之環丙烷。
其他適用於本文中之膽固醇降低藥物包括(但不限於)抗高脂蛋白藥，諸如纖維酸衍生物，諸如非諾貝特(fenofibrate)、吉非羅齊(gemfibrozil)、氯貝特(clofibrate)、苯紮貝特(bezafibrate)、環丙貝特(ciprofibrate)、克利貝特(clinofibrate)及其類似物、普羅布可(probucol)及如美國專利第3,674,836號中揭示之相關化合物、普羅布可及吉非羅齊為較佳；膽汁酸螯合劑，諸如消膽胺(cholestyramine)、考來替潑(colestipol)及DEAE-葡聚糖凝膠(Secholex®、Polidexide®)以及氯貝特、脂妥(lipostabil)(Rhone-Poulenc)、Eisal E-5050(N上經取代之乙醇胺衍生物)、伊瑪西(imanixii)(HOE-402)、四氫利普司他汀(tetrahydrolipstatin)(THL)、豆甾烷磷脂醯膽鹼(istigmastanylphosphorylcholine)(SPC,Roche)、胺基環糊精(Tanabe Seiyoku)、Ajinomoto AJ-814(甘菊環衍生物)、甲亞油醯胺(Sumitomo)、Sandoz 58-035、American Cyanamid CL-277,082及CL-283,546(二取代脲衍生物)、菸酸、阿昔莫司(acipimox)、阿昔呋喃 (acifran)、新黴素(neomycin)、對胺基水楊酸、阿司匹林、聚(二烯丙基甲胺)衍生物(諸如美國專利第4,759,923號中揭示)、四級胺聚(氯化二烯丙基甲基銨)及紫羅烯(諸如美國專利第4,027,009號中揭示)及其他已知之血清膽固醇降低劑。
抗動脈粥樣硬化劑亦可為PPAR α/γ雙重促效劑，諸如以下揭示：Murakami等人，「A Novel Insulin Sensitizer Acts As a Coligand for Peroxisome Proliferator-Activated Receptor Alpha(PPAR alpha)and PPAR gamma.Effect on PPAR alpha Activation on Abnormal Lipid Metabolism in Liver of Zucker Fatty Rats」,Diabetes 47,1841-1847(1998)。
抗動脈粥樣硬化劑可為ACAT抑制劑，諸如以下所揭示：「The ACAT inhibitor,Cl-1011 is effective in the prevention and regression of aortic fatty streak area in hamsters」,Nicolosi等人，Atherosclerosis(Shannon,Irel).(1998),137(1),77-85；「The pharmacological profile of FCE 27677：a novel ACAT inhibitor with potent hypolipidemic activity mediated by selective suppression of the hepatic secretion of ApoB100-containing lipoprotein」,Ghiselli,Giancarlo,Cardiovasc.Drug Rev.(1998),16(1),16-30；「RP 73163：a bioavailable alkylsulfinyl-diphenylimidazole ACAT inhibitor」,Smith,C.，等人，Bioorg.Med.Chem.Lett.(1996),6(1),47-50；「ACAT inhibitors：physiologic mechanisms for hypolipidemic and anti-atherosclerotic activities in experimental animals」,Krause等人，編輯：Ruffolo,Robert R.,Jr.；Hollinger,Mannfred A.,Inflammation：Mediators Pathways(1995),173-98,Publisher：CRC,Boca Raton,Fla.；「ACAT inhibitors：potential anti-atherosclerotic agents」,Sliskovic等人，Curr.Med.Chem.(1994),1(3),204-25；「Inhibitors of acyl-CoA：cholesterol O-acyl transferase(ACAT) as hypocholesterolemic agents.6.The first water-soluble ACAT inhibitor with lipid-regulating activity.Inhibitors of acyl-CoA：cholesterol acyltransferase(ACAT).7.Development of a series of substituted N-phenyl-N'-[(1-phenylcyclopentyl)methyl]ureas with enhanced hypocholesterolemic activity」,Stout等人，Chemtracts：Org.Chem.(1995),8(6),359-62。
其他抗動脈粥樣硬化劑亦可為脂肪加氧酶抑制劑，包括15-脂肪加氧酶(15-LO)抑制劑，諸如如WO 97/12615中揭示之苯并咪唑衍生物、如WO 97/12613中揭示之15-LO抑制劑、如WO 96/38144中揭示之異噻唑酮及如以下揭示之15-LO抑制劑：Sendobry等人「Attenuation of diet-induced atherosclerosis in rabbits with a highly selective 15-lipoxygenase inhibitor lacking significant antioxidant properties,Brit.J.Pharmacology(1997)120,1199-1206，及Cornicelli等人，「15-Lipoxygenase and its Inhibition：A Novel Therapeutic Target for Vascular Disease」,Current Pharmaceutical Design,1999,5,11-20。
在一個實施例中，本文提供一種預防、緩解或治療宿主之心臟病的方法，其中宿主在圍停經期或停經後期。已知aP2在圍停經期或停經後期女性中增加，該等女性之心臟病發病率高於停經前女性。因此，投與本文中描述之抗-aP2單株抗體或抗原結合劑可用於緩解、預防或治療處於出現與循環aP2含量升高相關之心臟病風險下或已出現與循環aP2含量升高相關之心臟病的圍停經期或停經後期女性。
發炎性疾病
本文中描述之抗-aP2抗體及抗原結合劑可投與用於治療個體之發炎性病症。發炎可作為對由物理、化學或生物劑所引起之損傷或異常刺激之反應出現。發炎反應可包括局部反應及所引起之形態改變、諸如感染性生物體之有害物質之破壞或移除以及引起修復及癒合之反 應。當關於病症使用時術語「發炎性」係指由發炎引起、產生或導致發炎的不當或不以正常方式消散之病理過程。發炎性病症可為全身性或侷限於特定組織或器官。
已知發炎存在於許多病症中，包括(但不限於)：全身性發炎反應(SIRS)；阿茲海默氏病(Alzheimer's Disease)及相關病狀及症狀，包括：慢性神經發炎、神經膠質活化；增加之微神經膠質細胞；神經斑形成；肌肉萎縮性側索硬化(ALS)、關節炎(及相關病狀及症狀包括(但不限於)：急性關節發炎、抗原誘發之關節炎、與慢性淋巴細胞性甲狀腺炎相關之關節炎、膠原蛋白誘發之關節炎、幼年期關節炎、類風濕性關節炎、骨關節炎、預後及鏈球菌屬誘發之關節炎、脊椎關節病及痛風性關節炎)、哮喘(及相關病狀及症狀，包括：支氣管哮喘；慢性阻塞性呼吸道疾病、慢性阻塞性肺病、幼年型哮喘及職業性哮喘)；心血管病(及相關病狀及症狀，包括動脈粥樣硬化、自體免疫心肌炎、慢性心肌低氧、充血性心臟衰竭、冠狀動脈疾病、心肌病及心肌細胞功能障礙，包括：主動脈平滑肌細胞活化、心肌細胞細胞凋亡及心肌細胞功能之免疫調節)；糖尿病(及相關病狀，包括自體免疫性糖尿病、胰島素依賴型(I型)糖尿病、糖尿病性齒根骨膜炎、糖尿病性視網膜病變及糖尿病性腎病)；腸胃發炎(及相關病狀及症狀，包括乳糜瀉、相關骨質減少、慢性結腸炎、克羅恩氏病(Crohn's disease)、發炎性腸病及潰瘍性結腸炎)；胃潰瘍；肝發炎，諸如病毒及其他類型之肝炎、膽固醇膽石及肝纖維化；HIV感染(及相關病狀，包括退化性反應、神經退化性反應及HIV相關霍奇金氏病)；川崎氏症候群(Kawasaki's Syndrome)(及相關疾病及病狀，包括黏膜皮膚淋巴結症候群、子宮頸淋巴結病、冠狀動脈病變、水腫、發熱、增加之白細胞、輕度貧血、皮膚剝離、疹、結膜發紅、血小板增多)；腎病變(及相關疾病及病狀，包括糖尿病性腎病、晚期腎病、急性及慢性絲球體腎 炎、急性及慢性間質性腎炎、狼瘡腎炎、古德巴士德氏症候群(Goodpasture's syndrome)、血液透析存活期及腎局部缺血性再灌注損傷)；神經退化性疾病或神經病理學病狀(及相關疾病及病狀，包括急性神經退化、老化及神經退化性疾病中IL-I之誘發、IL-I誘發之下丘腦神經元可塑性及慢性應力高反應性、脊髓病)；眼病(及相關疾病及病狀，包括糖尿病性視網膜病變、格雷夫氏眼病(Graves' ophthalmopathy)、與角膜損傷或感染相關之發炎(包括角膜潰瘍)及葡萄膜炎)、骨質疏鬆(及相關疾病及病狀，包括肺泡、股骨、橈骨、椎骨或手腕骨質流失或骨折發生率、停經後骨質流失、骨折發生率或骨質流失速率)；中耳炎(成人或兒科)；胰臟炎或胰臟腺泡炎；牙周病(及相關疾病及病狀，包括成人、早期發作及糖尿病)；肺病，包括慢性肺疾病、慢性鼻竇炎、透明膜疾病、低氧及SIDS中肺部疾病；冠狀或其他血管移植物再狹窄；風濕病，包括類風濕性關節炎、風濕病阿孝夫小體(rheumatic Aschoff body)、風濕性疾病及風濕性心肌炎；甲狀腺炎，包括慢性淋巴細胞性甲狀腺炎；泌尿道感染，包括慢性前列腺炎、慢性骨盆疼痛症候群及尿石病；免疫病症，包括自體免疫疾病，諸如斑禿、自體免疫性心肌炎、格雷夫斯氏病、格雷夫斯氏眼病、苔癬硬化、多發性硬化症、牛皮癬、全身性紅斑性狼瘡症、全身性硬化症、甲狀腺疾病(例如淋巴瘤性甲狀腺腫(橋本氏甲狀腺炎、淋巴結樣甲狀腺腫)；肺損傷(急性出血性肺損傷、古德巴士德氏症候群、急性缺血再灌注)、由職業性及環境污染物引起之心肌功能障礙(例如對毒油症候群矽肺病之敏感性)、輻射外傷及傷口癒合反應之功效(例如灼傷或熱創傷、慢性創傷、手術創傷及脊髓損傷)、敗血病、急性期反應(例如發熱反應)、一般發炎反應、急性呼吸窘迫反應、急性全身性發炎反應、傷口癒合、黏著性、免疫發炎反應、神經內分泌反應、發熱出現及抗性、急性期反應、壓力反應、疾病敏感性、重複 運動應力、網球肘及疼痛管理及反應。
在本發明之一個實施例中，本文提供一種治療宿主之I型糖尿病的方法，其藉由向宿主投與有效量之本文中描述之抗-aP2單株抗體與消炎劑組合或交替。消炎劑可為類固醇消炎劑、非類固醇消炎劑或其組合。在一些實施例中，消炎藥包括(但不限於)阿氯芬酸(alclofenac)、阿氯米松二丙酸鹽(alclometasone dipropionate)、阿爾孕酮縮丙酮化物(algestone acetonide)、α澱粉酶(alpha amylase)、安西法爾(amcinafal)、安西非特(amcinafide)、胺芬酸鈉(amfenac sodium)、胺普立糖鹽酸鹽(amiprilose hydrochloride)、阿那白滯素(anakinra)、阿尼羅酸(anirolac)、阿尼紮芬(anitrazafen)、阿帕宗(apazone)、巴柳氮二鈉(balsalazide disodium)、苄達酸(bendazac)、苯惡洛芬(benoxaprofen)、苄達明鹽酸鹽(benzydamine hydrochloride)、菠蘿蛋白酶(bromelains)、溴哌莫(broperamole)、布地奈德(budesonide)、卡洛芬(carprofen)、環洛芬(cicloprofen)、辛噴他宗(cintazone)、克利洛芬(cliprofen)、氯倍他索丙酸鹽(clobetasol propionate)、氯倍他松丁酸鹽(clobetasone butyrate)、氯吡酸(clopirac)、氯硫卡松丙酸鹽(cloticasone propionate)、可美薩松乙酸鹽(cormethasone acetate)、可托多松(cortodoxone)、地夫可特(deflazacort)、地奈德(desonide)、去羥米松(desoximetasone)、地塞米松二丙酸鹽(dexamethasone dipropionate)、雙氯芬酸鉀(diclofenac potassium)、雙氯芬酸鈉(diclofenac sodium)、二氟拉松二乙酸鹽(diflorasone diacetate)、二氟米酮鈉(diflumidone sodium)、二氟尼柳(diflunisal)、二氟潑尼酯(difluprednate)、地弗他酮(diftalone)、二甲亞碸、羥西奈德(drocinonide)、恩甲羥松(endrysone)、恩莫單抗(enlimomab)、依諾利康鈉(enolicam sodium)、依匹唑(epirizole)、依託度酸(etodolac)、依託芬那酯(etofenamate)、聯苯乙酸(felbinac)、非那莫(fenamole)、芬 布芬(fenbufen)、芬氯酸(fenclofenac)、苯克洛酸(fenclorac)、芬度柳(fendosal)、奮匹帕隆(fenpipalone)、芬替酸(fentiazac)、夫拉紮酮(flazalone)、氟紮可特(fluazacort)、氟芬那酸(flufenamic acid)、氟咪唑(flumizole)、氟尼縮松乙酸鹽(flunisolide acetate)、氟尼辛(flunixin)、氟尼辛葡甲胺(flunixin meglumine)、丁基氟可丁(fluocortin butyl)、氟米龍乙酸鹽(fluorometholone acetate)、氟喹宗(fluquazone)、氟比洛芬(flurbiprofen)、氟瑞托芬(fluretofen)、丙酸氟替卡松(fluticasone propionate)、呋喃洛芬(furaprofen)、呋羅布芬(furobufen)、哈西奈德(halcinonide)、鹵貝他索丙酸鹽(halobetasol propionate)、鹵潑尼松乙酸鹽(halopredone acetate)、異丁芬酸(ibufenac)、布洛芬(ibuprofen)、布洛芬鋁(ibuprofen aluminum)、布洛芬吡啶甲醇(ibuprofen piconol)、伊洛達普(ilonidap)、吲哚美辛(indomethacin)、吲哚美辛鈉(indomethacin sodium)、吲哚洛芬(indoprofen)、吲哚克索(indoxole)、吲四唑(intrazole)、異氟潑尼龍乙酸鹽(isoflupredone acetate)、伊索克酸(isoxepac)、伊索昔康(isoxicam)、酮基布洛芬(ketoprofen)、洛非咪唑鹽酸鹽(lofemizole hydrochloride)、氯諾昔康(lomoxicam)、氯替潑諾(loteprednol etabonate)、甲氯芬那酸鈉(meclofenamate sodium)、甲氯芬那酸(meclofenamic acid)、甲氯松二丁酸鹽(meclorisone dibutyrate)、甲芬那酸(mefenamic acid)、美沙拉嗪(mesalamine)、美西拉宗(meseclazone)、磺庚甲潑尼龍(methylprednisolone suleptanate)、莫尼氟酯(morniflumate)、萘丁美酮(nabumetone)、萘普生(naproxen)、萘普生鈉(naproxen sodium)、萘普索(naproxol)、尼馬宗(nimazone)、奧沙拉嗪鈉(olsalazine sodium)、奧古蛋白(orgotein)、奧帕諾辛(orpanoxin)、奧沙普嗪(oxaprozin)、羥布宗(oxyphenbutazone)、瑞尼托林鹽酸鹽(paranyline hydrochloride)、戊聚糖聚硫酸鈉(pentosan polysulfate sodium)、保泰松甘油酸鈉(phenbutazone sodium glycerate)、吡非尼酮(pirfenidone)、吡羅昔康(piroxicam)、吡羅昔康肉桂酸鹽(piroxicam cinnamate)、吡羅昔康乙醇胺(piroxicam olamine)、吡洛芬(pirprofen)、潑那紮特(prednazate)、普立非酮(prifelone)、普羅度酸(prodolic acid)、普羅喹宗(proquazone)、普羅沙唑(proxazole)、普羅沙唑檸檬酸鹽(proxazole citrate)、利美索龍(rimexolone)、氯馬紮利(romazarit)、柳膽來司(salcolex)、沙那西定(salnacedin)、雙水楊酸酯(salsalate)、血根氯銨(sanguinarium chloride)、司克拉宗(seclazone)、絲美辛(sermetacin)、舒多昔康(sudoxicam)、舒林酸(sulindac)、舒洛芬(suprofen)、他美辛(talmetacin)、他尼氟酯(talniflumate)、他洛柳酯(talosalate)、特丁非隆(tebufelone)、替尼達普(tenidap)、替尼達普鈉(tenidap sodium)、替諾昔康(tenoxicam)、替昔康(tesicam)、替西米德(tesimide)、四氫達明(tetrydamine)、硫平酸(tiopinac)、替可的松特戊酸鹽(tixocortol pivalate)、托美丁(tolmetin)、托美丁鈉(tolmetin sodium)、三氯奈德(triclonide)、三氟米酯(triflumidate)、齊多美辛(zidometacin)、佐美酸鈉(zomepirac sodium)、阿司匹林(乙醯水楊酸)、水楊酸、皮質類固醇、糖皮質激素、他克莫司(tacrolimus)、匹美克莫司(pimecorlimus)、其前藥、其複合藥以及其組合。
癌症
本發明進一步提供一種投與本文揭示之抗-aP2抗體或抗原結合劑以治療癌症的方法。在一個實施例中，癌症係選自脂肪肉瘤、隔膜混合性苗勒氏瘤(mesentery mixed-mullerian tumor)、脊椎神經鞘瘤、膽囊癌、前列腺癌、大腦星形細胞瘤、肺癌、卵巢癌、膀胱癌、結腸癌、食道癌、停經後乳癌、子宮內膜癌、腎癌、肝癌及胰臟癌。
在本發明之一個實施例中，提供一種治療宿主之增生性病症、 例如腫瘤或贅瘤的方法，其藉由投與有效量之本文中描述之抗-aP2單株抗體或抗原結合劑。在一個實施例中，腫瘤係選自移行膀胱癌、卵巢癌及脂肪肉瘤。
在一個實施例中，癌症為膀胱癌。在一個實施例中，癌症為膀胱之移行細胞癌。在本發明之一個實施例中，提供一種治療宿主之膀胱癌的方法，其藉由投與有效量之本文中描述之抗-aP2單株抗體或抗原結合劑。
在本發明之一個實施例中，提供一種治療宿主之膀胱癌的方法，其藉由投與有效量之本文中描述之抗-aP2單株抗體或抗原結合劑與其他化學治療劑組合或交替。用於治療膀胱癌之其他化學治療劑包括(但不限於)甲胺喋呤、長春鹼、小紅莓、順鉑、吉西他濱、卡鉑、太平洋紫杉醇及表柔比星。
在一個實施例中，癌症為卵巢癌。在本發明之一個實施例中，提供一種治療宿主之卵巢癌的方法，其藉由投與有效量之本文中描述之抗-aP2單株抗體或抗原結合劑。
在本發明之一個實施例中，提供一種治療宿主之卵巢癌的方法，其藉由投與有效量之本文中描述之抗-aP2單株抗體與其他化學治療劑組合或交替。用於治療卵巢癌之其他化學治療劑包括(但不限於)順鉑、卡鉑、太平洋紫杉醇、多烯紫杉醇、白蛋白結合之太平洋紫杉醇、六甲蜜胺、卡培他濱、環磷醯胺、依託泊苷(etoposide)、吉西他濱(gemcitabine)、異環磷醯胺(ifosfamide)、伊立替康(irinotecan)、脂質體小紅莓、美法侖(melphalan)、培美曲塞(pemetrexed)、拓朴替康(topotecan)及長春瑞賓(vinorelbine)。
在本發明之一個實施例中，本文提供一種治療宿主之脂肪肉瘤的方法，其藉由投與有效量之本文中描述之抗-aP2單株抗體或抗原結合劑。在一個實施例中，脂肪肉瘤為分化良好型脂肪肉瘤、黏液脂肪 肉瘤、多形性脂肪肉瘤或去分化型脂肪肉瘤。在一個實施例中，本文提供一種治療肉瘤、例如(但不限於)纖維組織細胞瘤、滑膜肉瘤或平滑肌肉瘤之方法。在一個實施例中，抗-aP2單株抗體或抗原結合劑與化學治療劑及或輻射劑組合投與。
在一個實施例中，贅瘤為良性脂肪瘤，例如腺脂瘤、血管脂肪平滑肌瘤、血管脂肪瘤、小腦腦橋角及內耳道脂肪瘤、軟骨樣脂肪瘤、胼胝體脂肪瘤、蟄伏脂瘤、皮內梭形細胞脂肪瘤、神經纖維脂肪瘤、多形性脂肪瘤、梭形細胞脂肪瘤及淺表皮下脂肪瘤。
減弱aP2介導之病症之嚴重程度的方法
提供預防或治療宿主、通常人類之由aP2含量異常引起之疾病或病症的方法，其藉由向該宿主投與治療有效量之如本文所述之單株抗體或抗原結合劑。單株抗體或片段以足夠部分或完全抑制或降低aP2之生物活性的劑量投與。
在一個態樣中，提供預防或減弱宿主之aP2介導之病症的嚴重程度之方法，其藉由投與有效量之本文中描述之抗-aP2單株抗體，從而降低或減弱分泌aP2之生物活性且降低升高aP2血清含量之相關生理作用，例如降低總膽固醇、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)、極低密度脂蛋白(VLDL)及/或三酸甘油酯、空腹血糖含量、脂肪量含量、肝葡萄糖產生、脂肪細胞脂肪分解、高胰島素血症及/或肝臟脂肪變性。在一個實施例中，分泌aP2之生物活性的減弱引起胰島素敏感性、葡萄糖代謝增加，及/或預防β-細胞死亡、功能障礙或喪失。
在本發明之一個態樣中，提供減少宿主中總膽固醇之方法，其藉由投與有效量之如本文所述之抗-aP2單株抗體或抗原結合劑。在一個實施例中，本文提供一種減少宿主中總膽固醇、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)、極低密度脂蛋白(VLDL)及/或三酸甘油 酯的方法，其藉由投與有效量之本文中描述之抗-aP2單株抗體。
在本發明之其他態樣中，提供用於達成以下之方法：降低空腹血糖含量；降低脂肪量含量；減少肝葡萄糖產生；減少脂肪細胞脂肪分解；減少高胰島素血症；減少肝臟脂肪變性；增加葡萄糖代謝；增加胰島素敏感性；預防β-細胞死亡、功能障礙或喪失；及/或確定宿主中循環分泌aP2含量；其包含向有需要之宿主、通常人類投與有效量之本文中描述之抗-aP2抗體或抗原結合劑。
實例
脂質伴護蛋白aP2/FABP4已與許多免疫代謝疾病、諸如糖尿病及動脈粥樣硬化之病理學相關。雖然多條證據亦證明其與人類疾病相關，但尚未實現用於治療應用之靶向aP2。近期研究展示aP2不僅僅為一種細胞內蛋白質，且亦為一種藉由促進肝葡糖新生及干擾周圍胰島素作用而影響高血糖症的活性脂肪細胞激素。肥胖小鼠及人類中血清aP2含量顯著升高，且與代謝併發症強烈相關。作為例示性實施例，描述一種低結合親和力單株抗-aP2抗體CA33(兔至小鼠雜交抗-aP2單株抗體)，其包括兔909VH(Seq.ID No.454)及909VL(Seq.ID No.445)，其降低空腹血糖含量、改善全身性葡萄糖代謝、增加全身性胰島素敏感性且減少肥胖小鼠中脂肪量及肝臟脂肪變性。檢驗aP2-CA33複合物之結構且與缺乏活體內功效之另一單株抗體(抗-aP2單株 抗體H3)相比，藉由結晶研究解析標靶抗原決定基。在高胰島素-正常血糖鉗夾研究中，CA33之抗糖尿病作用主要與肝葡萄糖輸出及周圍葡萄糖利用之調節相關。重要地，此抗體在aP2缺乏小鼠中未展現生物作用，證實其標靶特異性。
實例1：製備靶向分泌aP2之例示性單株抗體 動物
在哈佛大學動物護理委員會(animal care committees of Harvard University)批准下進行動物護理及實驗程序。雄性小鼠(具有C57BL/6J背景之缺乏瘦素(ob/ob)及飲食誘發之肥胖(DIO)小鼠)購自The Jackson Laboratory(Bar Harbor,ME)且保持12小時光/黑暗週期。在開始處理前具有C57BL/6J背景之DIO小鼠維持高脂肪飲食(60% kcal脂肪，Research Diets,Inc.,D12492i)12至15週，除了鉗夾研究中其維持HFD 20週。缺乏瘦素(ob/ob)小鼠維持規則飲食(RD，PicoLab 5058 Lab Diet)。飲食模型使用之動物為18至31週齡且ob/ob模型使用之動物為9至12週齡。在所有實驗中，除非本文中另有說明，否則各組中使用至少7隻小鼠。將小鼠用150μl PBS(媒劑)或150μl PBS中1.5毫克/小鼠(約33mg/kg)抗-aP2單株抗體處理，一週兩次，皮下注射3至5週(圖1B)。在處理前後，在白天食物取回6小時之後自尾部收集血液樣品。餵食狀態下每週量測體重一次。在取回食物6小時之後或在空腹隔夜16小時之後，每週量測血糖含量一次在處理2週之後，藉由腹膜內葡萄糖注射(DIO為0.75g/kg，ob/ob小鼠為0.5g/kg)進行葡萄糖耐受性測試。在處理3週之後，在DIO小鼠中藉由腹膜內胰島素注射(0.75IU/kg)進行胰島素耐受性測試。在處理5週之後，在DIO小鼠中如先前所描述(Furuhashi等人(2007)Nature 447,959-965；Maeda等人(2005)Cell metabolism 1,107-119)進行高胰島素-正常血糖鉗夾實驗。
代謝籠(Oxymax,Columbus Instruments)及藉由雙能X射線吸光測 定法(DEXA；PIXImus)量測總體脂肪如先前所描述進行(Furuhashi等人，(2007)Nature 447,959-965)。
抗-aP2抗體之產生及投與
CA13、CA15、CA23及CA33(兔Ab 909)藉由UCB產生及純化。將紐西蘭白兔經含有重組人類及小鼠aP2(在大腸桿菌中內部產生：寄存編號分別為CAG33184.1及CAJ18597.1)之混合物免疫接種。將脾細胞、外周血單核細胞(PBMC)及骨髓自經免疫接種之兔收穫且隨後儲存在-80℃下。使用類似於Zubler等人(「Mutant EL-4 thymoma cells polyclonally activate murine and human B cells via direct cell interaction」,J Immunol 134,3662-3668(1985))描述之方法的方法，製備來自經免疫接種之動物的B細胞培養物。在培育7天之後，使用均質螢光連接之免疫吸附分析，使用固定在SuperavidinTM珠粒(Bangs Laboratories)上之生物素標記之小鼠或人類aP2及山羊抗兔IgG Fcγ特異性Cy-5結合物(Jackson ImmunoResearch)，鑑別含抗原特異性抗體之孔。為自相關孔鑑別、分離及回收抗原特異性B細胞，使用螢光聚焦法(Clargo等人，(2014)mAbs 6,143-159)。此方法包括自陽性孔收穫B細胞，且與用生物素標記之小鼠及人類aP2塗佈之順磁性抗生蛋白鏈菌素珠粒(New England Biolabs)及山羊抗兔Fc片段特異性FITC結合物(Jackson ImmunoResearch)混合。在37℃下靜態培育1小時之後，抗原特異性B細胞可由於在該B細胞周圍存在螢光暈圈而鑑別出。使用Olympus IX70顯微鏡觀看個別分泌抗原特異性抗體之B細胞，且用Eppendorf顯微操縱器挑選且沈積至PCR管中。來自此等單一B細胞之可變區基因藉由RT-PCR，使用對重鏈及輕鏈可變區具有特異性之引子回收。進行兩輪PCR，其中巢式2° PCR併入限制位點在3'及5'端，允許選殖可變區至多種表現載體中；小鼠γ1 IgG、小鼠Fab、兔γ1 IgG(VH)或小鼠κ及兔κ(VL)。重鏈及輕鏈構築體使用Fectin 293 (Invitrogen)轉染至HEK-293細胞中且重組抗體在6孔培養盤中表現。在表現5天之後，收穫上清液且抗體藉由生物分子相互作用分析，使用BiaCore系統測定親和力及抗原決定基箱來進行進一步篩選。
小鼠抗-aP2單株抗體H3藉由Dana Farber Cancer Institute Antibody Core Facility產生。藉由注射全長人類aP2/FABP4-Gst重組蛋白，將4-6週齡雌性C57BL/6 aP2-/-小鼠免疫接種，該重組蛋白懸浮於達爾伯克磷酸鹽緩衝鹽水(PBS；GIBCO,Grand Island,NY)中且用相同體積之完全弗氏佐劑(Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO)乳化。自經免疫接種之小鼠收穫脾臟且製備細胞懸浮液且用PBS洗滌。將脾臟細胞計數且與SP 2/0骨髓瘤細胞(ATCC No.CRL8-006,Rockville,MD)以2：1之脾臟：骨髓瘤比率混合，該等骨髓瘤細胞不能分泌重鏈或輕鏈免疫球蛋白(Kearney等人，(1979)Journal of Immunology 123,1548-1550)。根據標準程序(Kohler等人，(1975)Nature 256,495-497)，將細胞與聚乙二醇1450(ATCC)融合於12個96孔組織培養盤中HAT選擇培養基中。在融合之後10天與21天之間，融合瘤菌落變得可見且收穫培養物上清液，接著藉由西方墨點法，在鏈黴素-His-人類-aP2/FABP4上篩選。使用高蛋白質結合96孔EIA培養盤(Costar/Corning,Inc.Corning,NY)進行17個所選陽性孔之二級篩選，該培養盤用50微升/孔2μg/ml溶液(0.1微克/孔)鏈黴素-His-人類-aP2/FABP4或不相關Gst-蛋白質塗佈且在4℃下培育隔夜。陽性融合瘤藉由限制稀釋法次選殖且藉由ELISA篩選。上清液融合物用Isostrip套組(RocheDiagnostic Corp.,Indianapolis,IN)進行同型分析。
使用UCB專用CHOSXE細胞株及電穿孔表現平台進行大規模瞬時轉染。細胞在補充有8% CO2之震盪器培育箱(Kuhner AG,Birsfelden,Switzerland)中在140rpm下在補充有2mM格魯塔瑪(Glutamax)之CDCHO培養基(LifeTech)中在37℃下維持在對數生長期。在轉染前， 使用CEDEX細胞計數器(Innovatis AG.Bielefeld,Germany)測定細胞數目及存活力且2×108個細胞/毫升在1400rpm下離心10分鐘。粒化細胞在Hyclone MaxCyte緩衝液(Thermo Scientific)中洗滌且再離心10分鐘且球粒以2×108個細胞/毫升再懸浮於新鮮緩衝液中。使用QIAGEN Plasmid Plus Giga Kit®純化之質體DNA接著以400μg/ml添加。在使用MAxcyte STX®流動電穿孔儀器電穿孔後，將細胞轉移在含有2mM格魯塔瑪及抗生素抗有絲分裂溶液之ProCHO培養基(Lonza)中且在置於生物反應器平台組上之波形袋(Cell Bag,GE Healthcare)中在37℃及5% CO2下培養，其中波浪運動藉由25rpm擺動誘發。
轉染二十四小時後，添加丸料且溫度減少至320℃且維持培養時間段之持續時間(12-14天)。在第4天，將3mM丁酸鈉(n-BUTRIC ACID鈉鹽，Sigma B-5887)添加至培養物中。在第14天，培養物在4000rpm下離心30分鐘，且保留之上清液先後經由0.22μm SARTO BRAN-P(Millipore)與0.22μm Gamma gold過濾器過濾。藉由添加NaCl(至4M)調節表現小鼠單株抗體(mAb)之CHOSXE收穫物。將樣品以15ml/min負載至經0.1M甘胺酸+4M NaCl pH8.5平衡之蛋白A MabSelect Sure填充管柱(GE-healthcare)上。將樣品用0.1M甘胺酸+4M NaCl pH8.5洗滌且用0.15M Na2HPO4 pH 9進行另一洗滌步驟。在使用0.1M檸檬酸鈉pH 3.4溶離緩衝液自管柱溶離期間收集A280 nm下UV吸收峰且接著藉由添加2M Tris-HCl pH 8.5中和至pH 7.4。接著來自蛋白A之mAb池使用minisette切向流過濾裝置濃縮至適合體積，接著在HiLoad XK 50/60 Superdex 200製備級別凝膠過濾管柱(GE-healthcare)上進一步純化。接著藉由分析型凝膠過濾技術針對單體峰分析收集之溶離份，且乾淨單體溶離份彙集為最終產物。接著藉由還原性及非還原性SDS-PAGE及藉由分析型凝膠過濾表徵最終產物樣品以進行最終純度檢查。亦使用用於量測內毒素之LAL分析法測試樣品 且發現對內毒素呈陰性。所有測試之mAb的最終緩衝液均為PBS。對於活體內分析，將純化之抗體在生理食鹽水中稀釋至10mg/ml且以1.5毫克/小鼠(33mg/kg)之劑量注射至高脂肪飲食之ob/ob及WT小鼠中。
量測抗體親和力
抗-aP2結合於aP2(如下所述在大腸桿菌中重組產生)之親和力藉由生物分子相互作用分析，使用Biacore T200系統(GE Healthcare)測定。使用HBS-EP+(GE Healthcare)作為操作緩衝液，10mM NaAc pH 5緩衝液中Fc片段特異性之Affinipure F(ab')2片段山羊抗小鼠IgG(Jackson ImmunoResearch Lab,Inc.)經由胺偶合化學固定在CM5感測器晶片上至4500-6000反應單位(RU)之間的捕捉程度。抗-aP2 IgG在操作緩衝液中稀釋至1-10μg/ml之間。抗-aP2 IgG以10μl/min注射60s用於固定之抗小鼠IgG Fc捕捉，接著在捕捉之抗-aP2上aP2以30μl/min自25nM至3.13nM滴定180s，接著為300s解離。表面藉由2×60s 40mM HCl及1×30s 5mM NaOH以10μl/min再生。使用Biacore T200評估軟體(1.0版)，使用1：1結合模型，利用局部Rmax，分析資料。對於CA33，抗體以10μl/min注射60s用於固定之抗小鼠IgG Fc捕捉，接著在捕捉之抗-aP2上aP2以30μl/min自40μM至0.625μM滴定180s，接著為300s解離。表面藉由1×60s 40mM HCl、1×30s 5mM NaOH及1×60s 40mM HCl以10μl/min再生。穩態擬合用於確定親和力值。
抗體交叉阻斷
藉由在小鼠抗-aP2 IgG存在或不存在下在捕捉之兔抗-aP2 IgG上注射小鼠aP2來進行分析。使用Biacore T200(GE Healthcare Bio-Sciences AB)進行生物分子相互作用分析。使用10μl/min之流速及60s注射，抗-aP2兔IgG瞬時上清液捕捉在固定之抗-兔Fc表面(每個流槽一種上清液)上，以得到超過200RU之反應水準。接著100nM、0nM 小鼠aP2或100nM小鼠aP2加500nM小鼠抗-aP2 IgG通過120s，接著解離120s。表面用2×60s 40mM HCl及1×30s 5mM NaOH再生。
FABP交叉反應性
重組人類蛋白質aP2(在UCB在大腸桿菌中產生(參見以下方法))、hFABP3(Sino Biological Inc.)及hFABP5/hMal1(Sino Biological Inc.)在5倍莫耳濃度過量之EZ-Link®磺酸基-NHS-LC-生物素(Thermo Fisher Scientific)中生物素標記且使用Zeba脫鹽管柱(Thermo Fisher Scientific)自未結合之生物素純化。所有結合研究在25℃下使用FortéBio Octet RED384系統(Pall FortéBio Corp.)進行。在含有0.05% Tween 20 pH 7.4之PBS(PBS-T)中120s基線步驟之後，將Dip and ReadTM抗生蛋白鏈菌素(SA)生物感測器(Pall FortéBio Corp.)負載60nM的生物素標記之重組haP2、hFABP3或hFABP5/hMal1，歷時90s。在PBS-T中60s穩定化步驟之後，將各FABP負載之生物感測器轉移至800nM之單株抗體樣品且量測締合，歷時5min。接著將生物感測器轉移回至PBS-T，歷時5min，以量測解離。使用未負載之生物感測器尖端監測抗體之非特異性結合。對於各抗體/FABP組合，繪製最大締合結合，亦即信號達到平台期，減去背景結合。
aP2表現及純化
針對在大腸桿菌中表現最佳化之小鼠(或人類)aP2 cDNA購自DNA 2.0(Menlo Park,California)，且直接次選殖至含有框內N端10His-標籤、接著菸草蝕刻病毒(TEV)蛋白酶位點之經修飾之pET28a載體(Novagen)中。蛋白質在大腸桿菌菌株BL21DE3中表現且如下純化。通常，細胞用每公升補充有完全蛋白酶抑制劑混合片之無EDTA之大腸桿菌培養物(Roche,Burgess Hill)50ml溶解緩衝液(含有20mM咪唑之PBS(pH 7.4))中冷卻之細胞瓦解劑(Constant Systems Ltd.)溶解。接著藉由高速離心(60000g，30分鐘，4℃)使溶解產物澄清。每 100ml澄清之溶解產物添加4ml/Ni-NTA珠粒(Qiagen)且在4℃下滾揉1小時。珠粒填充在附接於AKTA FPLC(GE Life Sciences)之Tri-Corn管柱(GE Healthcare)中且蛋白質在含有250mM咪唑之緩衝液中溶離。如藉由4-12% Bis/Tris NuPage(Life Technologies Ltd.)凝膠電泳所判斷，含有相關蛋白質之溶離份進行透析以移除咪唑且用TEV蛋白酶以每100mg蛋白質1mg之比率處理。在4℃下培育隔夜之後，樣品再次通過Tri-Corn管柱中之Ni/NTA珠粒。未標記(亦即TEV裂解)之aP2蛋白質不結合於珠粒且收集在流動穿過之管柱中。濃縮蛋白質，且負載至在PBS、1mM DTT中預先平衡之S75 26/60凝膠過濾管柱(GE healthcare)上。將峰溶離份彙集且濃縮至5mg/ml。接著提取六毫升此蛋白質且用乙腈以2：1之比率沈澱以移除任何脂質。在16000g下離心15min後，移除乙腈+緩衝液以分析原始脂質含量。接著變性蛋白質之球粒再懸浮於6ml 6M GuHCl PBS+2微莫耳棕櫚酸(5：1比率之棕櫚酸：aP2)中且接著在4℃下針對5L PBS透析兩次，歷時20小時，以允許再摺疊。在離心以移除沈澱(16000g，15分鐘)後，使用PBS中S75 26/20管柱，將蛋白質凝膠過濾以移除聚集體。將峰溶離份彙集且濃縮至13mg/ml。
aP2結晶學
如下使純化之小鼠aP2與CA33及H3 Fab(藉由習知方法在UCB產生)複合。藉由將0.5ml 13mg/ml aP2與0.8ml 21.8mg/ml CA33 Fab或1.26ml 13.6mg/ml H3 Fab(aP2：Fab莫耳比1.2：1)混合來製備複合物。蛋白質於室溫下培育30分鐘，接著在50mM Tris pH7.2、150mM NaCl+5%丙三醇中S75 16/60凝膠過濾管柱(GE Healthcare)上操作。將峰溶離份彙集且濃縮至10mg/ml以用於結晶學。
使用市售篩選套組(QIAGEN)建立坐滴結晶試驗。直接在初級結晶篩選中獲得繞射品質晶體，無需最佳化結晶條件。對於aP2/CA33 複合物，孔溶液含有0.1M Hepes pH 7.5、0.2M(NH4)2SO4、16% PEG 4K及10%異丙醇。對於aP2/H3複合物，孔溶液含有0.1M MES pH5.5、0.15M(NH4)2SO4及24% PEG 4K。資料在鑽石同步加速器在i02(λ=0.97949)上收集，得到aP2/CA33 2.9Å數據集及aP2/H3 2.3Å數據集。結構藉由分子替換，使用Phaser(44)(CCP4)，利用AP2及Fab結構域起始模型來確定。發現兩種複合物aP2/CA33在不對稱單元中及aP2/H3在一個中。使用CNS(Brunger等人，(2007)Nature Protocols 2,2728-2733)及coot(Emsley等人，(2004)Acta crystallographica.Section D,Biological crystallography 60,2126-2132)(CCP4)進行優化及模型建構週期，直至兩種模型彙聚所有優化統計資料。藉由考慮aP2/Fab接觸面上4Å距離內的原子，產生上述抗原決定基資訊。資料收集及優化統計資料展示如下。括弧中之值係指高解析度殼。
括弧中之值係指高解析度殼。
R sym=Σ|(I-<I>)|/Σ(I)，其中I為觀測到之整合強度，<I>為自多次量測獲得之平均整合強度，且總和係在所有觀測之反射上。R work=Σ||F obs|-k|F calc||/Σ|F obs|，其中F obs及F calc分別為觀測及計算之結構因子。使用任意選擇且自優化計算省去之反射資料的5%，R free計算為R work。藉由考慮aP2/Fab接觸面上4Å距離內的原子，產生抗原決定基資訊。
高胰島素-正常血糖鉗夾研究及肝生物化學分析
高胰島素-正常血糖鉗夾藉由報導程序(Cao等人，(2013)Cell Metab.17,768-778)之修改來進行。特定言之，在空腹5小時之後將小鼠夾持且輸注5mU/kg/min胰島素。血液樣品以10分鐘時間間隔收集，以即刻量測血漿葡萄糖濃度，且25%葡萄糖以可變速率輸注以維持血漿葡萄糖在基礎濃度下。在連續輸注[3-3H]-葡萄糖(0.05μCi/min)下估計基線全身葡萄糖處置。此後測定胰島素刺激之全身葡萄糖處置，其中[3-3H]-葡萄糖以0.1μCi/min輸注。
根據Bligh-Dyer方案(Bligh等人，(1959)Canadian J.Biochem.and Phys.37,911-917)提取肝臟中之總脂質，且藉由市售套組，根據製造商之說明書(Sigma Aldrich)，比色法用於量測三酸甘油酯含量。藉由報導方法(Petrescu等人，(1979)Analytical Biochem.96,279-281)之修改量測葡萄糖異生酶Pck1活性。葡萄糖-6-磷酸酶(G6pc)活性藉由Sigma方案[EC 3.1.3.9]之修改量測。簡言之，肝在含有250mM蔗糖、Tris HCl及EDTA之溶解緩衝液中均質化。溶解物以全速離心15分鐘且分離上清液(主要細胞質)。接著藉由細胞質樣品超速離心來分離微粒體溶離份。藉由市售BCA套組(Thermo Scientific Pierce)量測微粒體蛋白質濃度。200mM葡萄糖-6-磷酸鹽(Sigma Aldrich)在Bis-Tris中預先培育。添加150μg微粒體蛋白質或重組G6Pase之連續稀釋液且在該溶 液中在37℃下培育20分鐘。接著添加20% TCA，混合且在室溫下培育5分鐘。樣品在4℃下以全速離心10分鐘，且上清液轉移至另一UV盤。添加顯色試劑且量測660nm下吸光度且相對於用重組葡萄糖-6-磷酸酶(G6pc)之連續稀釋液製備的標準曲線校正。
血漿aP2、mal1、FABP3、脂聯素、升糖素及胰島素ELISA
在白天食物取回6小時或隔夜16小時之後，藉由尾部抽血自小鼠收集血液。藉由心肌穿刺收集末端血液樣品或自尾靜脈收集。樣品在微量離心機中在4℃下以3,000rpm旋轉15分鐘。根據製造商之說明書，量測血漿aP2(Biovendor R&D)、mal1(Circulex Mouse Mal1 ELISA,CycLex Co.,Ltd.,Japan)、FABP3(Hycult Biotech,Plymouth Meeting,PA)升糖素、脂聯素(Quantikine ELISA,R&D Systems,Minneapolis,MN)及胰島素(胰島素-小鼠超敏ELISA,Alpco Diagnostics,Salem,NH)。
定量即時PCR分析
在白天食物取回6小時之後收集組織，立即冷凍，且儲存在-80℃下。使用Trizol(Invitrogen,Carlsbad,CA)，根據製造商方案，進行RNA分離。對於第一股cDNA合成，使用0.5-1ng RNA及5x iScript RT Supermix(BioRad Laboratories,Herculus,CA)。定量即時PCR(Q-PCR)使用Power SYBR Green PCR主混合物(Applied Biosystems,Life Technologies,Grand Island,NY)進行且樣品使用ViiA7 PCR機(Applied Biosystems,Life Technologies,Grand Island,NY)分析。用於Q-PCR之引子如下：
統計分析
結果呈現為平均值±SEM。藉由重複量測ANOVA或史都登氏t檢驗，測定統計顯著性。*表示p<0.05下顯著性，**表示p<0.01下顯著性。
抗-aP2單株抗體研發及篩選
肥胖與循環aP2之含量增加相關聯，其引起肝葡萄糖產生升高，及周圍葡萄糖處置減少及胰島素抗性(2型糖尿病之特徵)。因此，中和血清aP2代表一種有效治療糖尿病及可能其他代謝疾病之方法。
產生及篩選針對人類及小鼠aP2肽培養的小鼠及兔-小鼠雜交單株抗體。藉由生物分子相互作用分析，使用Biacore系統對結合親和力之評估證實此等抗體自微莫耳至低奈莫耳範圍之廣泛親和力(圖1A)。作為此等抗體在活體內潛在作用之初始測試，抗體皮下投與患有高脂肪飲食(HFD)誘發之肥胖的小鼠，歷時4週(圖1B)。在實驗期間HFD餵 食引起血清胰島素含量上升，此作用藉由用小鼠抗體H3處理減弱且藉由雜交抗體CA33逆轉，但藉由其他三種測試之雜交抗體未改變(圖1C)。有趣地，CA33亦顯著降低空腹血糖(圖1D)，而測試之其他抗體不提高血糖，表明CA33減少與HFD相關之胰島素抗性且改善葡萄糖代謝。使用葡萄糖耐受性測試(GTT)進一步檢驗葡萄糖代謝之全身性改善。CA33療法顯著改善葡萄糖耐受性(圖1E)，而其他抗體不改善葡萄糖耐受性且葡萄糖處置曲線與媒劑相比沒有不同(圖7A)。此外，如胰島素耐受性測試中證實，僅僅CA33處理顯著提高胰島素敏感性，而其他測試抗體類似於媒劑(圖1F、圖7B)。在抗體處理組中除一個以外的所有中，體重增加中度降低(CA15)(圖1G)，不過此確實不與葡萄糖代謝改善相關。綜合而言，此等結果證實CA33獨有抗糖尿病特性。
CA33為中和aP2之低親和力抗體
對CA33進一步表徵以更好地瞭解其獨特治療性質。在octet結合分析中，所有測試抗體均證實可飽和結合於aP2。與相關蛋白質FABP3之相互作用可量測但低(aP2/FABP4相互作用之約25%)，且與Mal1/FABP5之相互作用僅僅輕微，類似於對照IgG(圖2A)。有趣地，亦發現經CA33處理之小鼠中葡萄糖穩態之改善與此抗體對循環aP2含量之獨特作用相關。在處理4週之後，經CA33處理之小鼠維持循環aP2含量在類似於或略微低於在對照處理動物中所看到的程度下，而包括H3之所有其他抗體引起循環aP2含量顯著增加10倍(圖2B)。實際上，在對照與CA-33處理小鼠中循環aP2藉由西方墨點法不可偵測，但在H3處理後血清中非常明顯(圖2B，插圖)。
在開始表徵標靶位點之交叉阻斷實驗中，發現CA33部分阻斷無效小鼠抗體H3與aP2之結合，而雜交抗體CA13及CA15完全阻斷H3結合(圖2C)。此等資料表明CA33識別之抗原決定基僅僅與H3識別之抗 原決定基部分重疊。在進一步分析中，例如如Pandit等人(2012)J.Mol.Recognit.3月；25(3)：114-24(以引用的方式併入本文中)所描述，基於氫-氘交換質譜分析實驗鑑別抗原決定基表明CA33與aP2之第一α螺旋及第一β片在殘基9-17、20-28及118-132上的相互作用，該等抗原決定基與針對H3鑑別之抗原決定基部分重疊(圖2D)。為準確瞭解此等抗原決定基，接著將CA33及H3之Fab片段與aP2共結晶(圖2E)。晶體分析展示CA33結合在二級結構元件β1及β10以及連接α2至β2及β3至β4之隨機線圈區展開的抗原決定基，且包括aP2胺基酸57T、38K、11L、12V、10K及130E(圖2F)。儘管CA33部分阻斷H3，但觀測到其抗原決定基實際上無直接重疊。實情為，在競爭實驗中aP2 Phe58周圍之區域的顯著移動可部分阻斷一種抗體與另一種抗體之結合。另外，可藉由晶體結構解釋CA33 Fab之低親和力。不尋常地，CA33重鏈中僅僅一個胺基酸與aP2接觸，且大部分接觸經由輕鏈(圖2E、2F)。相比之下，H3-aP2接觸更傳統，其中兩個Fab鏈與aP2相互作用。該結構亦展示CA33不結合於β-圓筒之『蓋』(14S至37A)，已假定CA33控制脂質對結合袋或含有E15 N16及F17之『鉸鏈』的接近。另外，發現CA33之存在實質上不改變脂質(十八碳四烯酸)與aP2之結合(圖2G)。H3直接結合於『蓋』，但活性有限。亦使用生物化學分析(Biacore)檢驗CA33與脂質結合之aP2或無脂質之aP2的結合。如圖2H及2I中所見，CA33以以下親和力結合於脂質結合之aP2及無脂質之aP2：
累積而言，此等結果表明CA33活性可能與aP2脂質結合無關。
假定CA33對aP2之親和力相對較低，檢驗脫靶效應。測試aP2-/- 小鼠中CA33處理之作用。在此等實驗中，抗體療法未能在此模型中誘發重量或空腹葡萄糖之任何改變(圖3A、3B)。此外，CA33不影響肥胖aP2-/-小鼠中葡萄糖耐受性(圖3C)，清晰證實抗體之作用係歸因於靶向aP2。
最後，使用缺乏瘦素之ob/ob小鼠檢驗CA33在嚴重遺傳肥胖及胰島素抗性之第二模型中的作用。在3週處理過程中，CA33與媒劑處理組增加重量，但CA33處理組中程度較小(圖3D)。驚人地，與對照相比，ob/ob小鼠中之高血糖症在CA33處理小鼠中正常化(圖3E)。高胰島素血症之程度在經CA33處理之動物中亦部分降低(圖3F)。正常葡萄糖及較低胰島素含量表明在中和aP2時葡萄糖代謝獲得改善。實際上，在投與外源性葡萄糖後，經CA33處理之ob/ob小鼠亦展現與經媒劑處理之小鼠相比顯著改善之葡萄糖耐受性，儘管存在過度肥胖(圖3G)。此等資料強調在獨立臨床前模型中aP2中和可廣泛應用於代謝疾病且與在飲食及遺傳肥胖背景下獲得之結果一致。
CA33處理改善肥胖小鼠中脂質代謝及抑制脂肪肝
已鑑別及物理上表徵可產生代謝益處之候選單株抗體，進行HFD模型中之詳細功能研究。為進一步探究CA33處理之代謝作用，用CA33或媒劑處理HFD誘發之肥胖小鼠五週且檢驗對肝臟之作用。正如期望，長期高脂肪餵食誘發經媒劑處理之小鼠中脂肪變性及三酸甘油酯累積，然而，此等作用藉由CA33處理顯著改善(圖4A、4B)。另外，肝臟脂質穩態之改善伴隨有與重新脂肪生成有關之關鍵基因的肝表現減少(圖4C)。類似於遺傳aP2缺乏，經CA33處理之小鼠具有中度較高之血漿游離脂肪酸含量(圖4D)及較低丙三醇含量(圖4E)。在CA33處理組中總膽固醇含量亦較低(圖4F)，不過血漿三酸甘油酯無顯著差異(圖4G)。特別地，雖然完全的全身遺傳aP2缺乏與組織mal1(FABP5/Mal1)表現實質上調相關聯，但未偵測到表明缺乏補償性改變 的在CA33處理時循環mal1含量之顯著改變(圖4H)。另外，CA33處理不顯著改變FABP3蛋白質之循環量(圖4H)。經CA33處理之小鼠中升糖素或脂聯素之血清含量亦無改變(圖4I-4J)。
CA33處理對脂肪組織及身體組成之作用
亦檢驗CA33處理對脂肪組織及身體組成之影響。雙能X射線吸光測定法(DEXA)掃描展示CA33處理顯著減少脂肪量(圖5A)；而肌肉量亦略微減少，此可能反映實體器官、尤其肝臟中脂質累積減少(圖4A、4B)。實際上，CA33處理顯著降低肝臟重量，且此降低在表示為體重百分比時仍然顯著(圖5B)。經CA33處理之肥胖小鼠中體重降低使人聯想到具有aP2缺乏及組合aP2/mal1缺乏之HFD小鼠的表現型，且提出抗體療法直接改變代謝參數之可能性。在代謝籠分析中，身體活動、食物攝入及熱產生在媒劑及經抗體處理之小鼠中類似(圖5C、5D)。
CA33可增加脂肪酸氧化
對於其他代謝量測，將餵食HFD之肥胖小鼠置於間接開路量熱計(Oxymax System,Columbus Instruments)中。在部分密封腔室之入口及出口部分監測按體積計氧氣及二氧化碳濃度，經由此，將已知流量之周圍空氣強制性換氣。在該等部分之間量測的濃度差異用於計算耗氧量(VO2)及二氧化碳產生(VCO2)及計算呼吸交換率(VCO2/VO2)。在代謝籠分析中，餵食HFD且用CA33處理八週之肥胖小鼠展示與經媒劑處理之小鼠相比VO2利用增加(圖5E)，產生與0.7更接近之呼吸交換率(RER)(圖5F)，表明抗體增加脂質利用。
組織學分析揭露正如期望，長期HFD餵食引起棕色脂肪組織(BAT)中大量脂質累積。然而，用CA33處理引起BAT組織重量顯著降低且脂滴尺寸顯著降低(圖5G、5H)。
一般而言，在抗體處理及對照組之間脂肪組織儲槽呈現類似； 不過圍生殖腺脂肪墊之尺寸顯著減小(PGWAT；圖5I)。PGWAT之H&E染色切片之分析揭露，經CA33及媒劑處理之小鼠中發炎性細胞浸潤之程度類似。(圖5J)。實際上，藉由FACS分析之脂肪組織製劑中F4/80及CD11b陽性骨髓細胞之浸潤指示各組之間此等免疫細胞之數目類似(圖5K、5L)。另外，未觀測到自經CA33處理之小鼠分離的圍生殖腺白色脂肪組織(PG-WAT)中發炎性標記物TNF、IL-1β、CCL2、CXCL1、F4/80或CD68之表現改變且IL-6 mRNA含量僅僅適度增加(圖5M)。脂肪組織aP2蛋白質含量展示在抗體處理時略微增加(圖5N及圖5P)，且未觀測到mal1之補償性調節(圖5O及圖5P)，表明成年小鼠中中和循環aP2不藉由其他FABP同功異型物產生分子補償，且以此方式，不同於遺傳缺乏。
CA33減少肝臟葡萄糖產生及增加周圍胰島素敏感性
肝葡萄糖產生及周圍葡萄糖利用在維持血糖濃度正常及適應餵食及空腹反應中均為關鍵的。近期研究證實肝葡萄糖產生及肝臟葡萄糖異生活性藉由aP2調控(Cao等人，(2013)Cell Metab.17,768-778)，且表明此反應單獨或與周圍作用組合，在調節aP2阻斷之抗糖尿病作用中可為關鍵的。為確定此是否為CA33治療性質之基礎，在CA33或媒劑處理5週之後自HFD餵食小鼠收集肝。觀測到來自經CA33處理之肥胖小鼠的樣品中葡萄糖異生基因磷酸烯醇丙酮酸羧激酶1(Pck1)及葡萄糖-6-磷酸酶(G6pc)之表現顯著降低(圖6A)。另外，在來自經CA33處理之小鼠之樣品中細胞質PCK1及微粒體葡萄糖-6-磷酸酶之酶活性顯著降低(圖6B、6C).此等發現與先前aP2在肝臟上之功能的研究(Cao等人，(2013)Cell Metab.17,768-778)一致。
接著藉由高胰島素-正常血糖鉗夾研究檢驗全身葡萄糖通量(圖6D)。對於此等實驗，在抗體處理前小鼠保持HFD 20週，且在抗體介入5週之後進行鉗夾研究。在鉗夾研究期間，經CA33處理之肥胖小鼠 需要顯著更高之葡萄糖輸注速率來維持血糖正常(圖6E)且展示降低之鉗夾肝葡萄糖產生(圖6F)，以及基礎肝葡萄糖產生降低之不顯著傾向(圖8A，p=0.07)。CA33處理亦顯著增加全身鉗夾葡萄糖處置速率(RD)(圖6G)，不過與對照相比，血漿胰島素含量降低，儘管胰島素輸注相等(5mU/kg/min)(圖8B)。綜合而言，此等資料指示CA33亦增加全身的全身性胰島素敏感性且增加胰島素刺激之葡萄糖利用。為進一步評估葡萄糖利用，在鉗夾實驗之後收集周圍組織且進行14 C2-去氧葡萄糖吸收分析。胰島素刺激之葡萄糖吸收在自經CA33處理之肥胖小鼠分離的肌肉組織中顯著更高(圖4H)，且圍生殖腺白色脂肪組織(PGWAT)中葡萄糖吸收傾向增加(圖8C，p=0.1)。此外，量測為作為糖酵解副產物之血漿[3H2O]之增加速率的全身糖酵解亦藉由CA33處理而增加(圖6I)。此等資料支持CA33之葡萄糖降低作用主要經由減少肝臟中葡萄糖產生及增加諸如肌肉之周圍組織中葡萄糖利用進行的結論。
實例2. 用於治療1型糖尿病之抗-aP2單株抗體(CA33) 在1型糖尿病之NOD小鼠模型中CA33處理預防高血糖症及死亡
糖尿病發作為自發性之1型糖尿病(T1D)模型NOD小鼠(S.Makino,K.Kunimoto,Y.Murakoa,Y.Mizushima,K.Katagiri,Y.Tochino.Breeding of a non-obese,diabetic strain of mice.Jikken-dobutsu,Experimental animals 29,1-13(1980))用於檢查CA33處理對糖尿病發生率及死亡率之作用。在哈佛大學動物護理委員會批准下進行動物護理及實驗程序。八週齡雌性NOD小鼠皮下注射媒劑或CA33。對於處理頭6週，經CA33處理之小鼠注射1毫克/注射，對應於約45mg/kg劑量，每週兩次。在研究第七週開始，經CA33處理之小鼠注射30mg/kg劑量之CA33，每週兩次。每週量測六小時空腹血糖一次。糖尿病發生率定義為連續2週之6小時空腹血糖>200mg/dL。
如圖9中所見，用抗-aP2單株抗體(CA33)處理NOD小鼠預防高血糖症出現。因此，在此實驗中用CA33處理亦降低NOD小鼠之死亡率(圖10)。
aP2缺乏由於增強胰島素分泌及擴大β-細胞塊而改善NOD小鼠中葡萄糖耐受性
先前已報導經由遺傳缺失、小分子抑制或抗體介導之中和阻斷aP2功能在肥胖誘發之葡萄糖不耐之小鼠模型中具有保護性(Hotamisligil等人，2006；Uysal等人.，1996；Furuhashi等人，2007；Cao等人，2013；Burak等人，2015)。研究aP2缺失，看其是否將類似地在瘦弱NOD小鼠中改善葡萄糖穩態。實際上，NOD aP2-/-小鼠顯示在斷奶(資料未示出)及7-8週齡時(圖11A)，與aP2+/+對照相比，葡萄糖耐受性顯著改善。特別地，至小鼠達到11週齡之時間，此對葡萄糖穩態之作用喪失，符合此模型中預測之胰島炎發作。
在肥胖環境下，阻斷aP2與胰島素敏感性提高相關聯。然而，未觀測到與對照相比瘦弱NOD aP2-/-小鼠中胰島素敏感性改變(圖11B)。此提出NOD aP2-/-小鼠中葡萄糖耐受性改善與aP2缺乏之β細胞內源性作用相關的可能性。為評估aP2遺傳缺失對β細胞功能之作用，自NOD aP2+/+及NOD aP2-/-小鼠在4、7及12週齡分離胰島。在基線，基因型不與胰島素分泌差異相關。然而，在用高葡萄糖刺激時，aP2-/-胰島每個細胞分泌之胰島素比aP2+/+對照顯著更多(圖12)。有趣地，此增強之胰島素分泌開始隨著年齡而下降，且未觀測到自19週齡小鼠分離之胰島的顯著胰島素分泌差異(資料未示出)。此符合年幼NOD aP2-/-小鼠中葡萄糖耐受性瞬時改善之發現，且表明在NOD aP2-/-小鼠中在胰島炎發作前，增強之β細胞反應至少部分為葡萄糖穩態表現型之基礎。
在aP2缺乏環境下觀測到之葡萄糖控制改善亦與β細胞塊之改變 相關。明顯地，在胰臟切開期間，在NOD aP2-/-小鼠中比aP2+/+對照中可見更多胰島(圖13)。此觀測結果藉由定量NOD aP2-/-小鼠及對照中β細胞塊進一步證實。在7週齡動物中，aP2缺乏與β細胞塊顯著(約35%)增加相關(圖14A及14B)。
激素aP2增強葡萄糖刺激之胰島素分泌
假定aP2為一種主動分泌之激素的近期發現及抗體介導之aP2中和在1型糖尿病模型中具有保護性的發現，進一步研究aP2之循環形式以嘗試且瞭解此分子是否直接作用於β細胞以調控其功能、存活或增殖。在初始實驗中，測試外源性重組aP2暴露於Ins-1β細胞以及自aP2-/-小鼠分離之初級胰島的作用。在兩種環境下，aP2顯著增強葡萄糖刺激之胰島素分泌(圖15A及15B)。
靶向aP2之單株抗體(CA33)有效降低1型糖尿病之RIP-LCMV-GP小鼠模型中糖尿病之發生率
中和分泌aP2在亦稱為幼年型糖尿病之1型糖尿病中提供有益作用。單株抗體CA33靶向aP2有效降低1型糖尿病在此項技術中公認之大鼠胰島素啟動子-淋巴細胞性脈絡叢腦膜炎病毒-醣蛋白(RIP-LCMV-GP)模型中糖尿病之發生率。
1型糖尿病之RIP-LCMV-GP小鼠模型之特徵為由病毒介導之β細胞破壞引起的糖尿病高外顯率及快速發作(圖16)(Oldstone等人，(1991)Cell 65：319-331)。RIP-LCMV-GP小鼠為Seattle之Washington University的K.Bornfeldt's laboratory所贈予。所有雜交小鼠模型之遺傳背景藉由用ABI 3130分析器進行同源基因分型(對於C57BL/6，288個基因座)檢驗。在RIP-LCMV-GP中，糖尿病藉由投與LCMV(2×103PFU/ml)誘發。在哈佛大學動物護理委員會批准下進行動物護理及實驗程序。
實驗在三組小鼠上進行(圖17)。組A由8隻在第-14天開始，每週 腹膜內注射媒劑(PBS)兩次之RIP-LCMV-GP(GP+)小鼠組成。組B由8隻在第-14天開始，每週腹膜內注射1.5毫克/注射之劑量的CA33兩次之RIP-LCMV-GP(GP+)小鼠組成。組C由8隻在第-14天開始，每週腹膜內注射媒劑兩次之RIP-LCMV-GP(GP+)、aP2-/-小鼠組成。在第0天，糖尿病藉由投與LCMV(2×103PFU/ml)誘發。在投與LCMV之後用媒劑或CA33處理持續兩週(圖17)。
定期量測六小時空腹血糖含量，且糖尿病發作定義為6小時空腹血糖超過250mg/dL。GP+媒劑處理動物展示空腹血糖含量顯著上升(圖18)且在自LCMV處理14天內糖尿病發生率超過75%(圖19)。在LCMV處理之後GP+、aP2-/-小鼠展示總體上血糖含量比GP+媒劑處理小鼠顯著低(圖18)。GP+、aP2-/-小鼠亦經歷比GP+媒劑處理小鼠低得多之糖尿病發生率，15%對比75%發生率(圖19)。單株抗體處理之GP+小鼠展示血糖含量比媒劑處理之對照小鼠顯著低(圖18)且在單株抗體處理組中未觀測到糖尿病表現型發生(圖19)。
此等結果證實在此病毒誘發之1型糖尿病模型中經由遺傳缺乏或藉由單株抗體中和降低aP2含量均具有強抗糖尿病作用。
單株抗體靶向aP2(CA33)有效降低1型糖尿病之RIP-LCMV-GP小鼠模型中發炎
以上描述1型糖尿病之RIP-LCMV-GP小鼠模型。藉由測定三組小鼠中胰島炎含量檢驗發炎。組A由8隻在第-14天開始，每週腹膜內注射媒劑(PBS)兩次之RIP-LCMV-GP(GP+)小鼠組成。組B由8隻在第-14天開始，每週腹膜內注射1.5毫克/注射之劑量的CA33兩次之RIP-LCMV-GP(GP+)小鼠組成。組C由8隻在第-14天開始，每週腹膜內注射媒劑兩次之RIP-LCMV-GP(GP+)、aP2-/-小鼠組成。在第0天，糖尿病藉由投與LCMV(2×103PFU/ml)誘發。在投與LCMV之後用媒劑或CA33處理持續兩週。
對蘇木精及曙紅(H&E)染色之胰臟切片進行胰島炎評分。各胰島評分為「無胰島炎」、「胰島周炎」、「輕度胰島炎」或「嚴重胰島炎」。柱狀圖呈現各分析動物中各胰島類型之百分比(圖20A)。
對於抗體染色，來自RIP-LCMV-GP小鼠之胰臟經福馬林固定及石蠟包埋。接著，產生胰臟之5μm連續切片，且根據已確立之方案，用針對胰島素(Linco)、ATF6(Santa Cruz Biotechnology)、磷酸化-eIF2α(Biosource)、sXBP1(內部)之抗體及Alexa Fluor 488及Alexa Fluor 568(Invitrogen)進行染色。
在染色之後，藉由使用MATLAB(The MathWorks Inc.)中研發之常規軟體進行影像分析。簡言之，胰島區域鑑別為胰島素染色(綠色通道)處於或高於跨越多個影像最佳化之臨限強度值的相鄰區域(連接像素)。胰島素(綠色通道)及sXBP1或ATF6(紅色通道)之平均螢光強度計算為所有像素之強度總和除以胰島內像素數目。
如圖20A中所示，GP+媒劑處理動物展示高程度發炎，其中大部分胰島展示輕度或嚴重胰島炎。GP+、aP2-/-小鼠展示降低程度之發炎，其中大部分胰島展示輕度胰島炎(圖20A及20D)。單株抗體(CA33)處理之GP+小鼠亦展示降低程度之發炎，其中降低數目之胰島展示嚴重胰島炎(圖20A及20E)。
如圖21A中之影像中所示，在aP2缺乏及經CA33處理之RIP-LCMV-GP小鼠中，如ATF6及sXBP1染色之水準增加所示，保留胰島形態及內質網(ER)適應能力。在GP+、aP2-/-小鼠與單株抗體(CA33)處理之GP+小鼠中ATF6水準顯著增加(圖21B)。另外，在GP+、aP2-/-小鼠與單株抗體(CA33)處理之GP+小鼠中sXBP1水準亦顯著增加(圖21C)。
此等結果證實在此病毒誘發之1型糖尿病模型中經由遺傳缺乏或藉由單株抗體中和降低aP2活性程度減少發炎且保留胰島形態。
實例3：抗-aP2單株抗體用於治療、減少或預防動脈粥樣硬化 動物
在哈佛大學動物護理委員會批准下進行動物護理及實驗程序。C57BL/6J背景之雄性ApoE-/-小鼠(Jackson Laboratory)保持12h光週期且隨意餵食高膽固醇致動脈粥樣硬化西方飲食(D12079B：21%脂肪、0.21%膽固醇；Research Diets)，在4-5週齡開始。藉由在6週齡開始，皮下投與媒劑或抗體(33mg/kg)12週，來處理小鼠。
評估動脈粥樣硬化病變
處死小鼠且藉由注射穿過左心室，用生理食鹽水且接著10%中性緩衝福馬林溶液沖洗。自近端主動脈至髂分叉剝離主動脈，且在縱向製劑中引出主動脈。縱向引出之主動脈用Sudan IV染色。
使用NIH研發之ImageJ軟體定量病變區域。在軟體中界定引出之主動脈的外周以建立主動脈之總區域為白色背景。接著量測用Sudan IV染紅之病變區域百分比且藉由軟體計算。
如圖22B中所示，用CA33處理之ApoE基因剔除小鼠具有減少之動脈粥樣硬化病變區域。相比之下，用CA15處理之ApoE基因剔除小鼠與對照相比，未展示動脈粥樣硬化病變區域之顯著差異。來自ApoE基因剔除小鼠的縱向引出之主動脈的代表性影像展示在圖22C(媒劑處理小鼠)、圖22D(經CA33處理之小鼠)及圖22E(經CA15處理之小鼠)中。
體重及肝臟重量
在4-5週齡開始，ApoE基因剔除小鼠餵食西方飲食，直至小鼠為18週齡。藉由在6週齡開始，皮下投與媒劑或抗體(33mg/kg)12週，來處理小鼠。藉由雙重X射線吸收(DXA)光譜分析量測體重、肌肉量及脂肪量。
如圖23A中所示，用CA33抗體處理之ApoE基因剔除小鼠展示體 重顯著下降。另外，用CA33處理之ApoE基因剔除小鼠亦展示肝臟重量顯著下降(圖23B)。相比之下，用CA15處理之ApoE基因剔除小鼠未展示體重或肝臟重量之任何顯著差異(圖23A、23B及23C)。
如圖23D中所示，用CA33抗體處理之ApoE基因剔除小鼠未展現肌肉量或脂肪量之任何顯著減少。另外，用CA15抗體處理之ApoE基因剔除小鼠未展示肌肉量或脂肪量之任何顯著差異(圖23D)。
葡萄糖耐受性測試
葡萄糖耐受性測試藉由在空腹隔夜(16h)之後對有意識之小鼠經口投與葡萄糖(1.0g/kg)來進行。藉由快速高效液相層析法(FPLC)，使用在6或12週媒劑或抗體處理(33mg/kg)之後彙集的血漿樣品測定脂蛋白之粒徑分佈。
如圖24A中所示，經CA33處理之小鼠具有比媒劑處理小鼠統計學上顯著低之空腹血糖。然而，在葡萄糖耐受性測試(GTT)中經CA33處理之小鼠未展示回應於葡萄糖之任何差異(圖24B)。
脂蛋白溶離份中膽固醇及三酸甘油酯之量測
在用PBS、CA33(33mg/kg)或CA15(33mg/kg)處理六週或十二週之ApoE基因剔除小鼠中脂蛋白溶離份(總脂蛋白、極低密度脂蛋白(VLDL)、低密度脂蛋白(LDL)或高密度脂蛋白(HDL))中量測膽固醇及三酸甘油酯。藉由快速高效液相層析法(FPLC)，使用彙集之血漿樣品測定脂蛋白之粒徑分佈。
如圖25A中所示，用CA33處理六週之ApoE基因剔除小鼠展示總脂蛋白、極低密度脂蛋白(VLDL)、低密度脂蛋白(LDL)及高密度脂蛋白(HDL)中膽固醇含量顯著減少。另外，用CA33處理十二週之ApoE基因剔除小鼠展示總脂蛋白、極低密度脂蛋白(VLDL)、低密度脂蛋白(LDL)及高密度脂蛋白(HDL)中膽固醇含量顯著減少(圖25B)。用CA15處理ApoE基因剔除小鼠六週未產生膽固醇含量之任何顯著差異 (圖25A)，而與經CA33處理之動物相比，用CA15處理ApoE基因剔除小鼠十二週使得總脂蛋白、低密度脂蛋白(LDL)及高密度脂蛋白(HDL)中膽固醇減少更少(圖25B)。
如圖26A中所示，用CA33處理六週之ApoE基因剔除小鼠展示總脂蛋白及極低密度脂蛋白(VLDL)中三酸甘油酯含量顯著減少。另外，用CA33處理十二週之ApoE基因剔除小鼠展示總脂蛋白、極低密度脂蛋白(VLDL)、低密度脂蛋白(LDL)及高密度脂蛋白(HDL)中三酸甘油酯含量顯著減少(圖26B)。相比之下，與用PBS處理之對照動物相比，用CA15處理ApoE基因剔除小鼠六週或十二週未產生三酸甘油酯含量之任何顯著差異(圖26A及26B)。
實例4：CA33之人類化
兔抗體909(CA33)藉由自兔CDR/小鼠構架雜交抗體V區CDR移植CDR至人類生殖系抗體V區構架上來人類化。為恢復抗體活性，來自兔/小鼠雜交V區之許多構架殘基亦保留在人類化序列中。使用Adair等人(1991)(Humanised antibodies.WO91/09967)概述之方案選擇此等殘基。兔/小鼠雜交抗體(供體)V區序列與人類生殖系(接受體)V區序列之比對以及設計之人類化序列展示在圖27(VL)及圖28(VH)中。自供體移植至接受體序列之CDR如Kabat(Kabat等人，1987)所定義，其中使用組合之Chothia/Kabat定義之CDRH1除外(參見Adair等人，1991 Humanised antibodies.WO91/09967)。
藉由DNA 2.0 Inc.之自動化合成方法，設計及構築編碼許多變異重鏈及輕鏈V區序列之基因。藉由寡核苷酸指向之突變誘發，包括在一些情況下CDR內修飾潛在天冬胺酸異構化位點或移除不成對半胱胺酸殘基之突變，修飾VH及VK基因，來產生重鏈與輕鏈V區之其他變異體。將此等基因選殖至載體中以能夠在哺乳動物細胞中表現人類化909 IgG4P(含有鉸鏈穩定化突變S241P之人類IgG4，Angal等人，Mol Immunol.1993,30(1)：105-8)抗體。表現變異人類化抗體鏈以及其組合，且評估其相對於親本抗體之效能、其生物物理特性及後續加工之適合性，以選擇圖24及25中所示之重鏈及輕鏈移植物。
人類V區IGKV1-17(A30)加JK4 J區選為抗體909輕鏈CDR之接受體。移植物gL1(Seq.ID No.446)、gL10(Seq.ID No.448)、gL54(Seq.ID No.450)及gL55(Seq.ID No.452)中輕鏈構架殘基均來自人類生殖系，殘基2、3、63及70(Kabat編號)除外，其中分別保留供體殘基纈胺酸(2V)、纈胺酸(3V)、離胺酸(63K)及天冬胺酸(70D)。殘基2、3、63及70之保留為人類化抗體完全效能所不可缺少的。gL10移植物、gL54移植物及gL55移植物之CDRL3中殘基90分別自半胱胺酸(90C)突變成絲胺酸(90S)、麩醯胺酸(90Q)及組胺酸(H90)，因此自gL10、gL54及gL55序列移除不成對之半胱胺酸殘基。
人類V區IGHV4-4加JH4 J區選為抗體909之重鏈CDR之接受體。與許多兔抗體相同，抗體909之VH基因比所選人類接受體短。當與人類接受體序列比對時，來自抗體909之VH區(Seq.ID No.454)之構架1缺乏N端殘基，人類化抗體中保留該N端殘基(圖28)。909兔VH區之構架3亦缺乏β片股D及E之間的環中的兩個殘基(75及76)：移植物gH1(Seq.ID No.455)中，構架3中之間隙保守，而在移植物gH14(Seq.ID No.457)、gH15(Seq.ID No.459)、gH61(Seq.ID No.461)及gH62(Seq.ID No.463)中間隙填充有來自所選人類接受體序列之對應殘基(離胺酸75、75K；天冬醯胺76、76N)(圖28)。移植物gH1及gH15中重鏈構架殘基均來自人類生殖系基因，其中殘基23、67、71、72、73、74、77、78、79、89及91(Kabat編號)除外，其中分別保留供體殘基蘇胺酸(23T)、苯丙胺酸(67F)、離胺酸(71K)、丙胺酸(72A)、絲胺酸(73S)、蘇胺酸(74T)、蘇胺酸(77T)、纈胺酸(78V)、天冬胺酸(79D)、蘇胺酸(89T)及苯丙胺酸(91F)。移植物gH14中之重鏈構架殘基來自人 類生殖系基因，其中殘基67、71、72、7374、77、78、79、89及91(Kabat編號)除外，其中分別保留供體殘基蘇胺酸(23T)、苯丙胺酸(67F)、離胺酸(71K)、丙胺酸(72A)、絲胺酸(73S)、蘇胺酸(74T)、蘇胺酸(77T)、纈胺酸(78V)、天冬胺酸(79D)、蘇胺酸(89T)及苯丙胺酸(91F)。移植物gH61及gH62中重鏈構架殘基來自人類生殖系基因，其中殘基71、73及78(Kabat編號)除外，其中分別保留供體殘基離胺酸(71K)、絲胺酸(73S)及纈胺酸(78V)。人類構架位置1之麩醯胺酸殘基經麩胺酸(1E)置換，提供均質產物之表現及純化：廣泛報導在抗體及抗體片段之N端麩醯胺酸轉變成焦麩胺酸鹽。gH15移植物及gH62移植物之CDRH2(Seq.ID No.19)中殘基59自半胱胺酸(59C)突變成絲胺酸(59S)殘基，因此自gH15序列移除不成對之半胱胺酸殘基。移植物gH15及移植物gH62之CDRH3(Seq.ID No.20)中殘基98自天冬胺酸(98D)至麩胺酸(98E)殘基突變，因此自gH15序列移除潛在天冬胺酸異構化位點。
對於哺乳動物細胞中人類化Ab 909之表現，人類化輕鏈V區基因與編碼人類C-κ恆定區(K1m3異型)之DNA序列接合，產生相鄰輕鏈基因。人類化重鏈V區基因與編碼具有鉸鏈穩定化突變S241P之人類γ-4重鏈恆定區(Angal等人，Mol Immunol.1993,30(1)：105-8)之DNA序列接合，產生相鄰重鏈基因。重鏈及輕鏈基因選殖至哺乳動物表現載體1235-pGL3a(1)-SRHa(3)-SRLa(3)-DHFR(3)(Cellca GmbH)中。
實例5. 降低高親和力抗-aP2單株抗體之親和力
考慮到低親和力抗-aP2單株抗體CA33之治療活性，研究高親和力抗-aP2單株鼠類抗體(H3 gL1/gH1)中胺基酸殘基取代以研發具有潛在aP2調節治療活性之低親和力抗體。H3 gL1/gH1之原始胺基酸及cDNA序列以及其突變序列提供於以下表13中。
表13：高親和力H3抗-aP2抗體之修飾
為將H3(gL1/gH1)之親和力降至CA33之親和力，藉由目視檢查晶體結構(圖29)鑑別可能形成與鼠類aP2關鍵接觸之H3殘基，且突變成丙胺酸、苯丙胺酸或絲胺酸。最初，產生跨越9個位置之一組11個點突變且使用SPR分析分級。將展示親和力顯著減少之突變組合且接著使用Octet分級。產生進一步組合，直至大致匹配CA33之親和力。
藉由輕鏈親本CDRL3區中胺基酸殘基W91取代成Ala、重鏈 CDRH1區中W33取代成Ala及重鏈CDRH2區中Y52取代成Ser(H3 gL11/gH19)，親和力自<0.07μM減少。藉由重鏈CDRH1區中胺基酸殘基W33取代成Ala、重鏈CDRH2區中Y52取代成Ser及重鏈CDRH3區中Y98取代成Phe(H3 gL1/gH20)，親和力自<0.07μM減少。所得抗體之完整可變鏈及其比對提供於圖30B及30C中。
檢查已突變以降低結合親和力之抗-aP2抗體(5251.mIgG1168(PB1172)及5252.mIgG1.169(PB1171))的結合親和力的其他實驗展示在圖31中。PB1172包含在g11輕鏈及g19重鏈上(參見圖30B及30C)且PB1171包含在g1輕鏈及g20重鏈(參見圖30B及30C)上。PB1172及PB1171抗體對人類aP2之結合親和力分別為6.03μM及5.82μM。PB1172及PB1171抗體對小鼠aP2之結合親和力分別為4.57μM及5.12μM。
實例6. 脂肪細胞激素aP2藉由破壞抑制FoxO1/CtBP2轉錄複合物調控肝葡萄糖產生 動物
缺乏瘦素之ob/ob小鼠(10週齡)及高脂肪飲食誘發之肥胖小鼠(高脂肪飲食12-16週)購自Jackson Laboratories(Bar Harbor,ME)。所有使用小鼠均為雄性且維持12小時黑暗/光週期。所有涉及動物之實驗程序均根據Harvard School of Public Health之機構動物護理及使用委員會之準則進行。
1)高脂肪飲食研究之aP2基因剔除小鼠
自8週齡，C57BL6/J背景之野生型或缺乏aP2之小鼠[參見Hotamisligil,G.S.等人，Uncoupling of obesity from insulin resistance through a targeted mutation in aP2,the adipocyte fatty acid binding protein.Science 274,1377-1379(1996)]餵食高脂肪飲食(60kcal%,Research Diets,Inc.,NJ,D12492i)或正常飲食(RD,PicoLab 5058 Lab Diet)16週。
2)用aP2抗體處理飲食誘發之肥胖小鼠
野生型小鼠餵食高脂肪飲食12週以誘發飲食肥胖，且此後一週兩次用媒劑或單株aP2抗體(每隻小鼠1.5mg CA33)處理4週，飲食相同。
3)重組aP2蛋白質注射研究
野生型小鼠(10-12週齡)每日接收媒劑或重組aP2蛋白質(每隻小鼠100μg)腹膜內注射兩次，歷時5天。FoxO1flox/flox小鼠由Domenico Accili(Columbia University,NY)慷慨提供且與Albumin-Cre小鼠(Jackson Laboratories,Bar Harbor,ME)雜交以產生肝臟特異性FoxO1基因剔除小鼠。野生型小鼠或FoxO1肝臟特異性基因剔除小鼠用重組aP2以相同方式處理。
4)腺病毒轉導研究
編碼β-葡糖醛酸酶(AdGUS)、CtBP2(AdCtBP2)、sh-對照(Ad/shControl)、sh-FoxO1(Ad/shFoxO1)或sh-CtBP2(Ad/shCtBP2)之重組腺病毒以1.5×1011粒子/小鼠之力價傳遞至小鼠中。藉由在空腹隔夜之後腹膜內注射葡萄糖(0.75g/kg)進行葡萄糖耐受性測試，且藉由在空腹6小時之後腹膜內注射胰島素(0.5U/kg)進行胰島素耐受性測試。使用以下系統分析血清參數：aP2；小鼠FABP4 ELISA(BioVendor)，胰島素；小鼠超敏胰島素ELISA(ALPCO)，升糖素；升糖素Quantikine ELISA套組(R&D Systems)，FFA；NEFA-HR(2)(Wako Chemicals)，丙三醇；游離丙三醇測定套組(Sigma)，丙胺酸轉胺酶(ALT)；ALT活性分析套組(Sigma)。藉由氯仿-甲醇方法提取肝臟三酸甘油酯，且藉由比色分析(Sigma)測定。
重組蛋白產生及純化
將具有N端聚組胺酸標籤、接著TEV蛋白酶裂解位點之小鼠aP2 cDNA選殖至pET28載體(EMD bioscience)中且質體轉型至大腸桿菌之BL21AI菌株(Invitrogen)中。在親和力純化及大規模內毒素移除之後，藉由用TEV蛋白酶(Sigma)裂解移除N端His標籤。按照相同策略產生脂質結合突變體(R126L、Y128F)[參見Erbay,E.等人，Reducing endoplasmic reticulum stress through a macrophage lipid chaperone alleviates atherosclerosis.Nature Medicine 15,1383-1391(2009)]。為將重組蛋白去脂質化，利用疏水性配位體與Lipidex1000(Perkin-Elmer,Norwalk,CT)之溫度依賴性結合，Lipidex1000為Sephadex G-25之10%取代之羥基烷氧基丙基衍生物。在37℃下，Lipidex 1000自水溶液移除非蛋白質結合及蛋白質相關之脂質，而在0℃下其僅僅移除非蛋白質結合之脂質[參見Glatz,J.F.及Veerkamp,J.H.Removal of fatty acids from serum albumin by Lipidex 1000 chromatography.Journal of Biochemical and Biophysical Methods 8,57-61(1983)]。在37℃下將重組aP2蛋白質用Lipidex1000去脂質兩次。此後，所得蛋白質藉由Sephadex G-25(PD-10,GE Healthcare)凝膠過濾進一步純化。
初級肝細胞分離、轉錄因子篩選、亞細胞分級分離及腺病毒轉導
初級小鼠肝細胞如先前所描述分離，參見Sekiya,M.等人，SREBP-1-independent regulation of lipogenic gene expression in adipocytes.Journal of Lipid Research 48,1581-1591(2007)。在血清饑餓隔夜之後，除非另外指明，否則細胞在具有50μg/ml重組aP2之威利姆培養基E(William's medium E)(Invitrogen)中在弗斯可林(2μM,Sigma)存在或不存在下處理3小時。為篩選轉錄因子，中靶+siRNA購自Dharmacon且藉由RNAiFect(QIAGEN)瞬時轉染至初級肝細胞中。對於亞細胞分級分離，細胞如上所指出處理90分鐘，且利用NE-PER細胞分級分離系統(Pierce)分級分離。對於腺病毒轉導，將shRNA寡核苷酸選殖至pENTR/U6載體中，接著與pAd/BLOCK-it-DEST載體 (Invitrogen)重組。shRNA之靶向序列設計如下。對照：5'-GTCTCCACGCGCAGTACATTT-3'，Seq.ID No.541 Foxo1；5'-GCATGTTTATTGAGCGCTTGG-3'，Seq.ID No.542 CtBP1；5'-GCAGCGGGTTTGACAATATCG-3'，Seq ID No.543 CtBP2；5'-GGGAAGACTAGGACGTGATTA-3' Seq.ID No.544及5'-GCCACATTCTCAATCTGTATC-3'，Seq.ID No.545 HNF4a；5'-GCTGCAGATTGATGACAATGA-3' Seq.ID No.546。將叉頭反應元件(FHRE)螢光素酶(Addgene,Cambridge,MA)選殖至pAd/PL-DEST載體(Invitrogen)中。編碼海腎螢光素酶之腺病毒購自Vector Biolabs(Philadelphia,PA)。腺病毒在HEK293A細胞中擴增且藉由CsCl梯度離心來純化。為量測FoxO轉錄活性，使初級肝細胞感染表現FHRE螢光素酶及海腎螢光素酶之腺病毒24小時。此後，細胞進行血清饑餓隔夜，且與50μg/ml aP2蛋白質一起在2μM弗斯可林不存在或存下培育6小時。使細胞溶解在被動溶解緩衝液中且使用Dual-Glo螢光素酶報導系統(Promega)分析。螢火蟲螢光素酶信號相對於海腎螢光素酶校正。
定量即時RT-PCR
使用Trizol Reagent(Invitrogen)分離總RNA且用iScript Reverse Transcription Supermix(Bio-Rad)合成cDNA。使用ViiA 7即時PCR系統(Applied Biosystems)中SYBR Green進行定量即時PCR分析。資料相對於酸性核糖體磷蛋白P0(Rplp0,36B4)表現校正。用於Q-PCR之引子如下：
核脂肪醯基-CoA含量
初級肝細胞(每個樣品6×106個細胞)用50μg/ml aP2刺激2小時。細胞用PBS洗滌且核在無清潔劑下經如先前所描述分離：T.Nakamura等人，A critical role for PKR complexes with TRBP in Immunometabolic regulation and eIF2alpha phosphorylation in obesity.Cell Rep 11,295-307(2015)。經分離之核中脂質基本上藉由Bligh-Dyer方法使用用乙酸酸化之水提取。收集分配至甲醇/水相中之脂肪醯基-CoA。脂肪醯基-CoA藉由脂肪醯基-CoA氧化酶(Wako,Japan)氧化，產生2,3-反式-烯醯基-CoA及過氧化氫。藉由螢光偵測系統(Enzo Life Sciences,NY)定量過氧化氫。
葡萄糖產生分析
使初級肝細胞感染Ad/shControl或Ad/shFoxO1 24小時，且在具有5% FBS之新鮮威利姆E培養基中進一步培育12小時。此後，細胞進行血清饑餓隔夜且與對照或重組aP2(50μg/ml)一起在弗斯可林(2μM)存在或不存在下培育5小時。細胞用補充有10mM HEPES之不具有葡萄糖之DMEM(Sigma)洗滌兩次且與具有20mM丙三醇之不具有葡萄糖之相同DMEM一起在相同濃度媒劑、aP2及/或弗斯可林存在下培育2小時。培養基中葡萄糖濃度藉由使用Amplex Red葡萄糖/葡萄糖氧化酶分析套組(Invitrogen)測定。
西方墨點分析及共同免疫沈澱實驗
用具有完全蛋白酶抑制劑(Sigma-Aldrich)之緩衝液A(50mM Tris-HCl pH 7.4、150mM NaCl、1% Nonidet P-40、1mM EDTA、10mM NaF、2mM Na3VO4)自細胞或肝臟樣品提取蛋白質，且進行SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳。為偵測乙醯化FoxO1，在緩衝液A中包括5μM曲古黴素A(trichostatin A，TSA)及5mM菸醯胺以阻斷FoxO1蛋白質之去乙醯化。膜與抗-FoxO1(Cell Signaling,C29H4)、抗-CtBP(Santa Cruz,E-12)、抗-CtBP1(BD)、抗-CtBP2(BD)、抗-FLAG(Clontech)、抗-GAPDH(Santa Cruz，FL-335)、抗-Lamin A/C(Cell Signaling，4C11)、抗-磷酸化PKA受質(Cell signaling，#9621)、抗-GUS(Invitrogen)、抗-pAkt(Ser473,Cell Signaling，#9271)、抗-Akt(Santa Cruz,H-136)、抗-Ac-FKHR(Santa Cruz，D-19)、抗-pFoxO1(Ser 256，Cell Signaling，#9461)及抗-HNF4a(Santa Cruz，C-19)一起培育。膜與結合辣根過氧化酶之二級抗體(Santa Cruz)一起培育且使用增強之化學發光系統(Roche Diagnostics)目測。為偵測FoxO1及CtBP之內源性結合，抗-FoxO1抗體(Santa Cruz,C-9)、抗-CtBP抗體(Santa Cruz,E-12)、抗-CtBP2(Santa Cruz,E-16)、對照小鼠IgG(內部產生)或對照山羊IgG(Santa Cruz)與蛋白質G戴諾磁珠(Invitrogen)在50mM庚二亞胺酸二甲酯(Sigma-Aldrich)下交聯。初級肝細胞或肝臟樣品用緩衝液A溶解且蛋白質複合物在4℃下在具有減少濃度之NP40(0.5%)的緩衝液A(50mM Tris-HCl pH 7.4、150mM NaCl、0.5% Nonidet P-40、1mM EDTA、10mM NaF、2mM Na3VO4)中免疫沈澱4小時。珠粒用具有0.5% NP40且不具有EDTA之緩衝液A洗滌四次，用SDS加樣緩衝液溶離且藉由西方墨點分析來分析。FLAG-標籤共同免疫沈澱研究如下進行。編碼FLAG野生型FoxO1及CtBP1之質體分別由Domenico Accili(Columbia University,NY)及Pere Puigserver(Harvard Medical School,MA)慷慨贈予。CtBP2 cDNA藉由PCR擴增且選殖至pcDNA3.1(+)(Invitrogen)中。FoxO1中PSDL基元藉由基因調整定點突變誘發系統(Invitrogen)突變成PSAS或缺失。使用脂染胺LTX(Invitrogen)將HEK293細胞用對照質體、FLAG野生型FoxO1或突變FLAG FoxO1以及CtBP1或CtBP2瞬時轉染。細胞用具有1% NP40之緩衝液A溶解且在4℃下用FLAG M2磁性珠粒(Sigma)在具有0.5% NP40之緩衝液A中免疫沈澱4小時。珠粒用具有0.5% NP40之緩衝液A洗滌 四次，且用0.5mg/ml 3x FLAG肽(Sigma)溶離。為評估油醯基-CoA及NADH之作用，在4℃下細胞溶解物用FLAG M2磁性珠粒在遞增濃度之油醯基-CoA或NADH下免疫沈澱4小時。此後，溶離FoxO1/CtBP2複合物且以相同方式分析。
脂肪酸攝入分析
[1-14C]油酸酯(59.0mCi/mmol，PerkinElmer)與BSA(無脂肪酸，Sigma，BSA：油酸酯=1：6)結合。初級肝細胞與重組aP2(50μg/ml)一起培育2小時且添加[1-14C]油酸酯-BSA複合物，產生150μM之最終濃度。在指示時段之後，細胞置放在冰上，用冷PBS洗滌五次且用0.1N NaOH溶解以量測放射能及蛋白質濃度。
脂肪酸氧化
初級肝細胞在I型膠原蛋白(Sigma)塗佈之XF96細胞培養物微孔盤(Seahorse Bioscience)上以7×103個/孔之密度接種。細胞在不具有血清之威利姆E培養基中用重組aP2(50μg/ml)處理2小時，此後培養基改變成Krebs-Henseleit緩衝液(111mM NaCl、4.7mM KCl、1.25mM CaCl2、2mM MgSO4、1.2mM NaH2PO4、2.5mM葡萄糖、0.5mM肉鹼、5mM HEPES pH 7.4)，媒劑或重組aP2之濃度相同。在暴露於150μM與BSA結合之棕櫚酸酯(Seahorse Bioscience)前後量測氧(O2)消耗速率(OCR)。
免疫細胞化學
初級肝細胞如上所述培育90分鐘，且在室溫下在4%多聚甲醛中固定10分鐘。細胞經0.1% Triton X-100滲透10分鐘，且用10%驢血清(Sigma)阻斷1小時。用以偵測CtBP2及FoxO1之初級抗體分別為山羊多株CtBP2抗體E-16(Santa Cruz,1：50)及含有ab39670(Abcam®，1：100)、C29H4(Cell Signaling,1：100)及H-128(Santa Cruz,1：100)之兔多株FoxO1抗體的混合物。Alexa Fluor® 568結合之驢抗山羊IgG及 Alexa Fluor® 647結合之驢抗兔IgG用作二次抗體(Life Technologies，1：200)。
染色質免疫沈澱(ChIP)
初級肝細胞如上所述培育90分鐘，且在室溫下在1%甲醛中固定10分鐘。交聯藉由添加甘胺酸至125mM之最終濃度來淬滅。此後，使用Magna ChIP HiSens染色質免疫沈澱套組(EMD Millipore)在輕微修改下進行ChIP分析：藉由微球菌核酸酶(Cell Signaling)實現染色質剪切。染色質用對照IgG、抗-FoxO1(Abcam®，ab39670)或抗-CtBP2(Santa Cruz，E-16)免疫沈澱。免疫沈澱之DNA及輸入DNA藉由即時PCR，利用對G6pc基因啟動子具有特異性之引子定量。參見Hall,J.A.,Tabata,M.,Rodgers,J.T.及Puigserver,P.USP7 attenuates hepatic gluconeogenesis through modulation of FoxO1 gene promoter occupancy.Molecular endocrinology 28,912-924(2014)。
細胞乳酸鹽/丙酮酸鹽量測
為估計胞質NAD+/NADH比率，細胞乳酸鹽及丙酮酸鹽內含物用套組(Cayman Chemical)量測。當丙酮酸鹽/NADH與乳酸鹽/NAD之間的轉化處於平衡下時，胞質NAD+/NADH比率可藉由乳酸鹽/丙酮酸鹽比率估計。參見Williamson,D.H.,Lund,P.及Krebs,H.A.The redox state of free nicotinamide-adenine dinucleotide in the cytoplasm and mitochondria of rat liver.The Biochemical Journal 103,514-527(1967)。
aP2以FoxO1依賴性方式上調葡萄糖異生基因表現
充當脂肪細胞激素，aP2直接上調葡萄糖異生基因在肝臟中活體內及肝細胞中活體外表現。參見Cao,H.等人，Adipocyte lipid chaperone AP2 is a secreted adipokine regulating hepatic glucose production.Cell metabolism 17,768-778(2013)。
因為細胞培養系統中上調程度中等，所以檢驗其他實驗環境以獲得此等基因之穩固性上調。已發現模擬空腹之信號的存在增加aP2對基因表現之作用。舉例而言，弗斯可林(腺苷酸環化酶之活化劑)及升糖素(資料未示出)增強初級肝細胞中aP2上調G6pc及Pck1基因表現之能力(圖38A及38B)。相反，用H89阻斷cAMP-PKA信號傳導消除aP2之作用(圖38C及38D)。
此外，在此環境中藉由aP2調節葡萄糖異生基因之分子基礎已如本文中所描述鑑別。去脂質化aP2與缺乏脂質結合能力之aP2之突變形式(R126L、Y128F)(Erbay,E.等人，Reducing endoplasmic reticulum stress through a macrophage lipid chaperone alleviates atherosclerosis.Nature Medicine 15,1383-1391(2009))未能在弗斯可林存在下上調葡萄糖異生基因表現(圖32A及32B)，表明aP2脂質負荷為此活性之重要介體。
siRNA阻斷基因表現用於針對消除aP2對基因表現之作用的能力，篩選若干關鍵肝轉錄因子及輔因子，諸如FoxO1、低氧誘導因子1α(Hif1α)、信號轉導與轉錄活化因子3(Stat3)、過氧化體增殖物活化受體1α(PGC-1α，Ppargcla)、CCAAT-強化子-結合蛋白α(C/EBPα，Cebpa)及糖皮質激素受體(GR，核受體子族3組C成員1，Nr3c1)。其中，先前已展示在葡萄糖異生基因表現之轉錄調控中起關鍵作用之FoxO1基因表現阻斷(參見Lin,H.V.及Accili,D.Hormonal regulation of hepatic glucose production in health and disease.Cell metabolism 14,9-19(2011))最顯著地減弱aP2對G6pc表現之作用(圖32C、39A-39H)。
此發現藉由腺病毒介導之shRNA傳遞進一步證實。再次，腺病毒介導之FoxO1基因表現阻斷顯著減弱aP2誘發之G6pc基因表現上調(圖32D及32E)。與此發現一致，aP2增加FoxO反應性螢光素酶報導子(FHRE)在初級肝細胞中之活性，且此作用在弗斯可林存在下更明顯 (圖32F)。用aP2處理不影響Foxo1之表現量(圖39H)。此外，aP2以FoxO1依賴性方式增加葡萄糖自肝細胞之產生(圖32G)。
細胞外aP2改變肝細胞中脂肪酸代謝
因為aP2為脂肪酸結合蛋白且已知aP2之遺傳缺乏及抗體介導之中和改變全身性脂肪酸代謝(Hotamisligil,G.S.等人，Uncoupling of obesity from insulin resistance through a targeted mutation in aP2,the adipocyte fatty acid binding protein.Science(New York,N.Y.)274,1377-1379(1996)；Maeda,K.等人，Adipocyte/macrophage fatty acid binding proteins control integrated metabolic responses in obesity and diabetes.Cell metabolism 1,107-119(2005)；Cao,H.等人，Regulation of metabolic responses by adipocyte/macrophage Fatty Acid-binding proteins in leptin-deficient mice.Diabetes 55,1915-1922(2006))，所以評估外源性aP2處理對肝細胞中脂肪酸代謝之作用。aP2之作用在乙莫克舍(一種脂肪酸氧化抑制劑)存在下顯著減弱(圖33A及33B)。此資料表明aP2藉由抑制脂肪酸氧化調控葡萄糖異生基因表現。與此發現一致，aP2減少棕櫚酸酯刺激之脂肪酸氧化增加，如藉由注射棕櫚酸酯之後耗氧速率所量測(圖33C)。此外，aP2穩固地增加肝細胞中脂肪酸攝入(圖33D)，表明觀測到之aP2抑制脂肪酸氧化之程度(圖33C)可能低估。此外，外源供應之棕櫚酸酯增加aP2誘發之葡萄糖異生基因表現程度(圖33E及33F)。
一旦吸收至細胞中，脂肪酸與CoA酯化以形成脂肪醯基-CoA硫酯，且輸送至諸如粒線體及內質網之細胞器，在該等細胞器中其用於氧化及脂質合成。參見Mashek,D.G.及Coleman,R.A.Cellular fatty acid uptake：the contribution of metabolism.Current opinion in lipidology 17,274-278(2006)以及Anderson,C.M.及Stahl,A.SLC27 fatty acid transport proteins.Molecular aspects of medicine 34,516-528 (2013)。aP2處理後，脂肪酸攝入增加同時脂肪酸氧化下降將可能引起胞質脂肪醯基-CoA累積，已展示脂肪醯基-CoA在代謝疾病中起調控作用。參見DeFronzo,R.A.Insulin resistance,lipotoxicity,type 2 diabetes and atherosclerosis：the missing links.The Claude Bernard Lecture 2009.Diabetologia 53,1270-1287(2010)。為測試棕櫚酸酯對aP2誘發之葡萄糖異生基因表現的作用是否涉及胞質醯基-CoA，使用醯基-CoA合成酶抑制劑三氮菌素C。參見Mashek,D.G.及Coleman,R.A.Cellular fatty acid uptake：the contribution of metabolism.Current opinion in lipidology 17,274-278(2006)。醯基-CoA合成酶之化學抑制顯著減弱外源性棕櫚酸酯增強aP2對基因表現之作用的能力(圖33G及33H)。此外，用aP2處理初級肝細胞誘發核脂肪醯基-CoA之累積顯著增加(圖33I)。綜合而言，此等資料表明肝臟細胞中脂質通量與周轉均由aP2調節，且此為aP2對葡萄糖異生基因表現之作用的基礎。
新穎抑制複合物FoxO1/CtBP2藉由aP2調節
FoxO1先前尚未展示藉由細胞內脂質環境調控。因此，檢驗可能將脂質信號傳導與FoxO1活化相連之分子。C端結合蛋白(CtBP)為已展示不僅結合於菸醯胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+/NADH)，且亦結合於脂肪醯基-CoA之轉錄抑制因子。參見Nardini,M.等人，CtBP/BARS：a dual-function protein involved in transcription co-repression and Golgi membrane fission.The EMBO journal 22,3122-3130(2003)。重要地，NAD+/NADH結合誘發CtBP之構形改變，且促進活性抑制因子形式之均二聚及形成，而醯基-CoA結合誘發單體構形。參見Nardini,M.等人，CtBP/BARS：a dual-function protein involved in transcription co-repression and Golgi membrane fission.The EMBO journal 22,3122-3130(2003)。在吾人之實驗系統中，檢驗兩種CtBP同功異型物各自對aP2介導之基因表現的作用。雖然CtBP1之基因表現阻斷對aP2誘發 之基因表現無影響，但CtBP2基因表現阻斷將aP2之作用阻斷(參見圖34A、34B、40A、40B、40C及40D)。特別地，雖然肝細胞核因子4α(HNF4α)為一種對長鏈脂肪醯基-CoA具有結合親和力之熟知葡萄糖異生轉錄因子(Hertz,R.,Magenheim,J.,Berman,I.及Bar-Tana,J.Fatty acyl-CoA thioesters are ligands of hepatic nuclear factor-4alpha.Nature 392,512-516(1998))，但未觀測到HNF4α基因表現阻斷對aP2介導之基因表現的作用(圖40E及40F)。
CtBP結合DNA結合蛋白中PxDLx基元。參見Chinnadurai,G.Transcriptional regulation by C-terminal binding proteins.The international journal of biochemistry & cell biology 39,1593-1607(2007)及Turner,J.及Crossley,M.The CtBP family：enigmatic and enzymatic transcriptional co-repressors.BioEssays：news and reviews in molecular,cellular and developmental biology 23,683-690(2001)。序列分析揭露多種小鼠及人類FoxO蛋白質中之PxDLx基元(圖34C)，表明FoxO與CtBP之間的直接相互作用之可能性。共同免疫沈澱實驗揭露初級肝細胞中內源性FoxO1/CtBP複合物(圖34D及34E)。雖然FoxO1中PSDL基元之突變或缺失特異性減少FoxO1與CtBP2之間的相互作用，但未減輕FoxO1與CtBP1或另一結合搭配物β-連環蛋白之間的相互作用(圖34F、34G、41A及41B)，表明CtBP2經由其PxDLx基元直接結合於FoxO1，而CtBP1可間接或經由其他相互作用位點結合於FoxO1。明顯地，在用aP2刺激初級肝細胞時，自CtBP2解離FoxO1(參見圖34H及41C)。
雖然已澈底研究NAD+/NADH對CtBP抑制轉錄之作用，[Zhang,Q.,Piston,D.W.及Goodman,R.H.Regulation of corepressor function by nuclear NADH.Science(New York,N.Y.)295,1895-1897(2002)；Kumar,V.等人，Transcription corepressor CtBP is an NAD(+)-regulated dehydrogenase.Molecular cell 10,857-869(2002)；Fjeld,C.C.,Birdsong,W.T.及Goodman,R.H.Differential binding of NAD+ and NADH allows the transcriptional corepressor carboxyl-terminal binding protein to serve as a metabolic sensor.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 100,9202-9207(2003)；以及Thio,S.S.,Bonventre,J.V.及Hsu,S.I.The CtBP2 co-repressor is regulated by NADH-dependent dimerization and possesses a novel N-terminal repression domain.Nucleic Acids Research 32,1836-1847(2004))，尚未研究脂肪醯基-CoA對CtBP之轉錄抑制活性的作用。參見Valente,C.,Spano,S.,Luini,A.及Corda,D.Purification and functional properties of the membrane fissioning protein CtBP3/BARS.Methods In Enzymology 404,296-316(2005)。為闡明此，將遞增濃度之油醯基-CoA添加至細胞溶解物中且發現此處理引起FoxO1/CtBP2複合物以劑量依賴性方式解離(圖34I)。相比之下，亦觀測在外源性NADH存在下FoxO1/CtBP2複合物形成增加(參見圖34J)。已報導CtBP為感測NAD+/NADH比率之氧化還原感測器(Zhang,Q.,Piston,D.W.及Goodman,R.H.Regulation of corepressor function by nuclear NADH.Science(New York,N.Y.)295,1895-1897(2002)；Chinnadurai,G.Transcriptional regulation by C-terminal binding proteins.The International Journal Of Biochemistry & Cell Biology 39,1593-1607(2007))，因此檢驗FoxO1/CtBP2複合物是否可對胞質氧化還原狀態或NAD+/NADH比率起反應。經FLAG-FoxO1及CtBP2轉染之HEK293細胞用不同比率之細胞外乳酸鹽/丙酮酸鹽處理以改變胞質氧化還原狀態。在具有高細胞外乳酸鹽/丙酮酸鹽比率(低胞質NAD+/NADH比率)之細胞中FoxO1/CtBP2複合物之形成增強(參見圖34K)。此等資料表明FoxO1/CtBP2複合物不僅藉由脂肪醯基-CoA調控，且亦藉由 NAD+/NADH調控。因此，接著詢問aP2處理是否直接改變胞質NAD+/NADH比率。假設乳酸脫氫酶平衡，因為胞質NAD+/NADH比率反映在細胞丙酮酸鹽/乳酸鹽比率，所以在與圖33E及33F相同之實驗環境中量測細胞乳酸鹽/丙酮酸鹽比率。在棕櫚酸酯存在或不存在下，藉由aP2，乳酸鹽/丙酮酸鹽比率傾向於增加，但差異不顯著(參見圖41D)。報導脂肪酸氧化之抑制增加乳酸鹽產生。參見Pike,L.S.,Smift,A.L.,Croteau,N.J.,Ferrick,D.A.及Wu,M.Inhibition of fatty acid oxidation by etomoxir impairs NADPH production and increases reactive oxygen species resulting in ATP depletion and cell death in human glioblastoma cells.Biochimica Et Biophysica Acta 1807,726-734(2011)。因此，乳酸鹽/丙酮酸鹽比率增加之此傾向可由脂肪酸氧化抑制所致。此處，在相對急性實驗環境中研究aP2之直接作用。因此，aP2主要藉由調節細胞脂肪醯基-CoA含量來調控FoxO1/CtBP2複合物形成，不過在長期過程中aP2可其次影響NADH/NAD+比率。FoxO活性藉由經由諸如磷酸化及乙醯化之轉譯後修飾進行核質穿梭來部分調控。參見Eijkelenboom,A.及Burgering,B.M.FOXOs：signalling integrators for homeostasis maintenance.Nature Reviews.Molecular Cell Biology 14,83-97(2013)。發現aP2處理傾向增加肝細胞中FoxO1之核含量，不過胞質含量之改變可忽略(參見圖34L及41E)。另外，未觀測到CtBP2藉由此等刺激之核質穿梭。有趣地，aP2及弗斯可林處理不明顯地改變FoxO1磷酸化及乙醯化程度(參見圖41F)(已知調控蛋白質核質穿梭之修飾)。
藉由染色質免疫沈澱(ChIP)分析進一步研究CtBP2以及FoxO1之啟動子佔用。在弗斯可林不存在或存在下，暴露於aP2引起CtBP2自G6pc啟動子解離(圖34M及34N)。藉由aP2處理，FoxO1募集至G6pc啟動子，不過作用微小(圖34M及34N)。
CtBP2緊密調控葡萄糖異生基因表現
進一步研究此最新鑑別之轉錄系統的特徵。雖然已知CtBP為抑制因子，但其在一些情況下充當活化劑。參見Fang,M.等人，C-terminal-binding protein directly activates and represses Wnt transcriptional targets in Drosophila.The EMBO journal 25,2735-2745(2006)。因此，檢驗CtBP2對FoxO1介導之葡萄糖異生基因表現的作用。CtBP2基因表現阻斷上調初級肝細胞中G6pc(圖35A)及Pck1(資料未示出)之表現，且此作用在弗斯可林存在下增強，此亦為aP2介導之此等基因上調下的情況。此外，FoxO1同時基因表現阻斷減弱CtBP2基因表現阻斷對此等基因之上調(圖35A)。CtBP2基因表現阻斷亦活化FoxO反應性螢光素酶報導子(圖35B)。相反，CtBP2過度表現下調G6pc表現於基線下且與β-葡糖醛酸酶(GUS)過度表現相比，CtBP2過度表現穩固地遏制弗斯可林誘發之G6pc及Pck1上調(參見圖35C、35D及35E)。為排除在CtBP2過度表現時出現之整體轉錄抑制的可能性，評估多個肝細胞基因之表現。一些調節細胞代謝之基因上調(例如Acadm)，其他不變(例如Alb、Creb1)(參見圖36A-36N)且資料未示)，表明CtBP2之特定作用。亦藉由FoxO反應性螢光素酶報導活性檢驗CtBP2過度表現後FoxO1標靶基因之下調(圖35F)。
亦研究胰島素及cAMP信號傳導是否調控FoxO1/CtBP2轉錄複合物，因為先前已展示此等路徑調控FoxO1轉錄活性。參見Brunet,A.等人，Akt promotes cell survival by phosphorylating and inhibiting a Forkhead transcription factor.Cell 96,857-868(1999)；Nakae,J.等人，Regulation of insulin action and pancreatic beta-cell function by mutated alleles of the gene encoding forkhead transcription factor Foxo1.Nature Genetics 32,245-253(2002)；以及Mihaylova,M.M.等人，Class IIa histone deacetylases are hormone-activated regulators of FOXO and mammalian glucose homeostasis.Cell 145,607-621(2011)。如本文所示，此等路徑之急性活化不穩固地改變FoxO1/CtBP2複合物之形成，不過觀測到FoxO1/CtBP2複合物藉由胰島素處理而輕度增加(圖35G)，其可藉由經由糖酵解通量增強使NADH/NAD+比率增加而引起。
循環aP2活性使FoxO1/CtBP2複合物在活體內解離
為進一步探究FoxO1/CtBP2複合物之aP2調節的相關性，活體內分析轉錄複合物形成。因為已報導肥胖小鼠之肝臟中NAD+減少及脂肪醯基-CoA含量增加(Samuel,V.T.等人，Mechanism of hepatic insulin resistance in non-alcoholic fatty liver disease.The Journal of Biological Chemistry 279,32345-32353(2004)；Hammond,L.E.等人，Mitochondrial glycerol-3-phosphate acyltransferase-1 is essential in liver for the metabolism of excess acyl-CoAs.The Journal of Biological Chemistry 280,25629-25636(2005)；Cheng,Z.等人，Foxo1 integrates insulin signaling with mitochondrial function in the liver.Nature Medicine 15,1307-1311(2009)；及Eckel-Mahan,K.L.等人，Reprogramming of the circadian clock by nutritional challenge.Cell 155,1464-1478(2013))，所以CtBP之功能異常共抑制因子活性可為肥胖中不受調控之肝葡糖新生的基礎。在循環aP2含量升高之遺傳誘發與飲食誘發之肥胖小鼠的肝臟中，(Cao,H.等人，Adipocyte lipid chaperone aP2 is a secreted adipokine regulating hepatic glucose production.Cell Metabolism 17,768-778(2013))，FoxO1/CtBP2締合與瘦弱對照相比顯著減少(參見圖36A、36B、36C及36D)。另外，aP2之遺傳缺乏與aP2之抗體介導之中和(使用抗-aP2單株CA33)穩固地增強FoxO1/CtBP2複合物之形成(圖36E、36F、36G及36H)，與此等動物中肝葡萄糖產生減少一致。參見Maeda,K.等人，Adipocyte/macrophage fatty acid binding proteins control integrated metabolic responses in obesity and diabetes.Cell Metabolism 1,107-119(2005)；Cao,H.等人，Adipocyte lipid chaperone aP2 is a secreted adipokine regulating hepatic glucose production.Cell Metabolism 17,768-778(2013)。
為確定升高之循環aP2是否足夠破壞FoxO1/CtBP2複合物，藉由IP注射至野生型瘦弱小鼠中5天，投與重組aP2，其引起血清aP2含量輕度增加(圖36I)，類似於肥胖小鼠中觀測到之程度[Cao,H.等人，Adipocyte lipid chaperone aP2 is a secreted adipokine regulating hepatic glucose production.Cell Metabolism 17,768-778(2013)]。循環aP2之此短期增加引起肝臟中FoxO1/CtBP2相互作用顯著減少(圖36J及36K)，此導致G6pc表現選擇性增加(圖36L)。重要地，此急性處理不影響體重或血清代謝參數，諸如胰島素、升糖素、游離脂肪酸或丙三醇(圖43A、43B、43C、43D、43E、43F及43G)。
因為肝細胞中CtBP2過度表現穩固地下調葡萄糖異生基因表現(圖35D及35E)，所以藉由腺病毒介導之基因傳遞在飲食誘發之肥胖小鼠之肝臟中過度表現CtBP2，在活體內研究此信號傳導路徑之治療潛能。在腺病毒轉導三天後，CtBP2過度表現使肥胖小鼠中空腹血糖含量正常，未誘發重量減輕(圖37A、37B及45A)。在獨立群組中，肥胖小鼠中3天腺病毒CtBP2過度表現引起葡萄糖耐受性顯著改善(圖37C)。此改善並非因為胰島素敏感性之改變，如藉由在腺病毒轉導5天之後胰島素耐受性測試所測定(圖37D、45E及45F)。為更直接地評估此模型中肝葡萄糖產生，進行丙酮酸鹽耐受性測試，且觀測到在注射丙酮酸鹽後CtBP2過度表現引起葡萄糖漂移顯著減弱(圖37Q)。與此發現一致，肝臟中G6pc表現在CtBP2過度表現動物中穩固下調，而Alb基因表現不受影響(圖37E、37F及37G)。
此外，觀測到在CtBP2過度表現7天後肥胖小鼠肝脂質累積減少(圖37H)。肝臟脂肪變性之顯著改善為aP2之遺傳缺失及抗體介導之中 和的另一特徵。參見Maeda,K.等人，Adipocyte/macrophage fatty acid binding proteins control integrated metabolic responses in obesity and diabetes.Cell Metabolism 1,107-119(2005)；Cao,H.等人，Regulation of metabolic responses by adipocyte/macrophage Fatty Acid-binding proteins in leptin-deficient mice.Diabetes 55,1915-1922(2006)。亦藉由量測肝臟三酸甘油酯(37I)檢驗脂肪變性藉由CtBP2過度表現之減少，其此伴隨有血清丙胺酸轉胺酶(ALT)含量減少(圖37J)。與此等發現一致，CtBP2過度表現穩固地下調脂肪生成基因表現(圖37K、37L、37M、37N及37O)。此表現型態亦在初級肝細胞中觀測，呈細胞自主方式(圖45A、45B、45C及45D)。CtBP2過度表現減少此等基因在FoxO1基因敲除肝細胞中之表現量(圖45E及45F)，此表明CtBP2以FoxO1獨立方式調控脂肪生成基因表現。CtBP2功能缺失亦展示CtBP2在抑制肝脂肪變性中之作用。在Ad/shCtBP2轉導十四天之後，CtBP2基因表現阻斷引起正常飲食之瘦弱小鼠之肝臟中三酸甘油酯累積(圖45G及45H)，其伴隨有脂肪生成基因之表現增加(圖45I及45J)。
概言之，研究作為循環aP2蛋白質之作用基礎的分子機制，且鑑別由FoxO1及CtBP2構成之新穎轉錄全複合物，該複合物感測諸如脂肪醯基-CoA及NAD+/NADH之細胞營養素。藉由調節脂肪酸代謝，aP2介導FoxO1 CtBP2複合物之解離，釋出FoxO1以驅動葡萄糖異生基因表現(圖37P)。
本說明書已參考本發明之實施例描述。然而，一般技術者瞭解，可在不偏離如以下申請專利範圍中所闡述之本發明範疇的情況下進行各種修改及變化。因此，本說明書應以說明性而非限制性意義來看待，且所有此類修改意欲包括在本發明範疇內。
<110> 哈佛大學校長及研究員協會 比利時商UCB生物製藥公司
<120> 治療代謝病症之抗-AP2抗體及抗原結合劑
<130> 15020-001US1
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<212> PRT
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<212> PRT
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<212> PRT
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<212> PRT
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<220>
<223> Igλ恆定區(IGLC)
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<212> PRT
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<212> PRT
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<212> PRT
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<212> PRT
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<212> PRT
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<212> PRT
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<212> PRT
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<212> PRT
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<220>
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<212> PRT
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<212> PRT
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<220>
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<212> PRT
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<220>
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<212> PRT
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<212> PRT
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<212> PRT
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<212> PRT
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<212> PRT
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<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<212> PRT
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<220>
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<213> 人工序列
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<223> 5-51 FR3
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 5-a FR1
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<220>
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<213> 人工序列
<220>
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IGDH鉸鏈
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<212> PRT
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<212> PRT
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<212> PRT
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<220>
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IGEH CH3
<400> 422
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<212> PRT
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<220>
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<212> PRT
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<212> PRT
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<212> PRT
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<212> PRT
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<220>
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IGGH3鉸鏈
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IGGH3 CH2
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IGGH3 CH3
<400> 435
<210> 436
<211> 98
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IGGH4 CH1
<400> 436
<210> 437
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IGGH4鉸鏈
<400> 437
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<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IGGH4 CH2
<400> 438
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<211> 105
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IGGH4 CH3
<400> 439
<210> 440
<211> 104
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IGMH CH1
<400> 440
<210> 441
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IGMH CH2
<400> 441
<210> 442
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IGMH CH3
<400> 442
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IGMH CH4
<400> 443
<210> 444
<211> 137
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接合多肽
<400> 444
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<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 兔Ab 909 VL區
<400> 445
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<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 909gL1 VL區
<400> 446
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<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 909gL1 VL+CL區
<400> 447
<210> 448
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 909gL10 VL區
<400> 448
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<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 909gL10 VL+CL區
<400> 449
<210> 450
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 909gL54 VL區
<400> 450
<210> 451
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 909gL54 VL+CL區
<400> 451
<210> 452
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 909gL55 VL區
<400> 452
<210> 453
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 909gL55 VL+CL區
<400> 453
<210> 454
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 兔Ab 909 VH區
<400> 454
<210> 455
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 909gH1 VH區
<400> 455
<210> 456
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 909gH1 IgG4 VH+人類？-4p恆定
<400> 456
<210> 457
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 909gH14 VH區
<400> 457
<210> 458
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 909gH14 IgG4 VH+人類？-4P恆定
<400> 458
<210> 459
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 909gH15 VH區
<400> 459
<210> 460
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 909gH15 IgG4 VH+人類？-4P恆定
<400> 460
<210> 461
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 909gH61 VH區
<400> 461
<210> 462
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 909gH61 IgG4 VH+人類？-4P恆定
<400> 462
<210> 463
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 909gH62 VH區
<400> 463
<210> 464
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 909gH62 IgG4 VH+人類？-4P恆定
<400> 464
<210> 465
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 兔Ab 909 VL區(Seq.ID No.445)cDNA
<400> 465
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<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 兔Ab 909 VH區(Seq.ID No.454)cDNA
<400> 466
<210> 467
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 909gL1 V區(Seq.ID No.446)cDNA
<400> 467
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<211> 657
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 909gL1輕鏈(V+恆定)(Seq.ID No.447)cDNA
<400> 468
<210> 469
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 909gL10 V區(Seq.ID No.448)cDNA
<400> 469
<210> 470
<211> 657
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 909gL10輕鏈(V+恆定)(Seq.ID No.449)cDNA
<400> 470
<210> 471
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 909gL54 V區(Seq.ID No.450)cDNA
<400> 471
<210> 472
<211> 657
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 909gL54輕鏈(V+恆定)(Seq.ID No.451)cDNA
<400> 472
<210> 473
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 909gL55 V區(Seq.ID No.452)cDNA
<400> 473
<210> 474
<211> 657
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 909gL55輕鏈(V+恆定)(Seq.ID No.453)cDNA
<400> 474
<210> 475
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 909gH1 V區(Seq.ID No.455)cDNA
<400> 475
<210> 476
<211> 1344
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 909gH1 IgG4重鏈(V+人類？-4P恆定)Seq.ID No.456)cDNA
<400> 476
<210> 477
<211> 369
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 909gH15 V區(Seq.ID.No.457)cDNA
<400> 477
<210> 478
<211> 1350
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 909gH15 IgG4重鏈(V+人類γ-4P恆定)(Seq.ID No.458)cDNA
<400> 478
<210> 479
<211> 320
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類IGKV1-17(A30)-JK4接受體構架cDNA
<400> 479
<210> 480
<211> 339
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類IGHV4-4 JH4接受體構架cDNA
<400> 480
<210> 481
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IGHV4-4
<400> 481
<210> 482
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> H3 gH1重鏈可變區
<400> 482
<210> 483
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> H3 gH19重鏈可變區
<400> 483
<210> 484
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> H3 gH20重鏈可變區
<400> 484
<210> 485
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> H3 gL1輕鏈可變區
<400> 485
<210> 486
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> H3 gL11輕鏈可變區
<400> 486
<210> 487
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 909gL13 VL區
<400> 487
<210> 488
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 909gL50 VL區
<400> 488
<210> 489
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 909gL13 VL+CL區
<400> 489
<210> 490
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 909gL50 VL+CL區
<400> 490
<210> 491
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 909gL13 V區(Seq.ID No.487)cDNA
<400> 491
<210> 492
<211> 657
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 909gL13輕鏈(V+恆定)(Seq.ID No.489)cDNA
<400> 492
<210> 493
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 909gL50 V區(Seq.ID No.488)cDNA
<400> 493
<210> 494
<211> 657
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 909gL50輕鏈(v+恆定)(Seq.ID No.490)cDNA
<400> 494
<210> 495
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> H3 gH20重鏈可變區(Seq.ID No.484)cDNA
<400> 495
<210> 496
<211> 102
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重鏈Fabγ1恆定區
<400> 496
<210> 497
<211> 306
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 重鏈Fabγ1恆定區(Seq.ID No.496)cDNA
<400> 497
<210> 498
<211> 324
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重鏈全長γ1恆定區
<400> 498
<210> 499
<211> 1044
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 重鏈全長γ1恆定區(Seq.ID No.498)cDNA
<400> 499
<210> 500
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 輕鏈κ恆定
<400> 500
<210> 501
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 輕鏈κ恆定(Seq.ID No.500)cDNA
<400> 501
<210> 502
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> H3 gL1輕鏈可變區(Seq.ID No.485)cDNA
<400> 502
<210> 503
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> H3 gL11輕鏈可變區(Seq.ID No.486)cDNA
<400> 503
<210> 504
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> H3 gH1重鏈可變區(Seq.ID No.482)cDNA
<400> 504
<210> 505
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> H3 gH19重鏈可變區(Seq.ID No.483)cDNA
<400> 505
<210> 506
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IGKV1-17
<400> 506
<210> 507
<211> 369
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 909gH14 V區(Seq.ID No.457)cDNA
<400> 507
<210> 508
<211> 1350
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 909gH14 IgG4重鏈(V+人類γ-4P恆定)(Seq.ID No.457)cDNA
<400> 508
<210> 509
<211> 369
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 909gH61 V區(Seq.ID.No.461)cDNA
<400> 509
<210> 510
<211> 1350
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 909gH61 IgG4重鏈(V+人類γ-4P恆定)(Seq.ID No.462)cDNA
<400> 510
<210> 511
<211> 369
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 909gH62 V區(Seq.ID.No.463)cDNA
<400> 511
<210> 512
<211> 1350
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 909gH62 IgG4重鏈(V+人類γ-4P恆定)(Seq.ID No.464)cDNA
<400> 512
<210> 513
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 36B4引子1
<400> 513
<210> 514
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 36B4引子2
<400> 514
<210> 515
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> FAS引子1
<400> 515
<210> 516
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> FAS引子2
<400> 516
<210> 517
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SCD1引子1
<400> 517
<210> 518
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SCD1引子2
<400> 518
<210> 519
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Pck1引子1
<400> 519
<210> 520
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Pck1引子2
<400> 520
<210> 521
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> G6pc引子1
<400> 521
<210> 522
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> G6pc引子2
<400> 522
<210> 523
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ACC1引子1
<400> 523
<210> 524
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ACC1引子2
<400> 524
<210> 525
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TNF引子1
<400> 525
<210> 526
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TNF引子2
<400> 526
<210> 527
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IL-1β引子1
<400> 527
<210> 528
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IL-1β引子2
<400> 528
<210> 529
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IL-6引子1
<400> 529
<210> 530
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IL-6引子2
<400> 530
<210> 531
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CCL2引子1
<400> 531
<210> 532
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CCL2引子2
<400> 532
<210> 533
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CXCL1引子1
<400> 533
<210> 534
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CXCL1引子2
<400> 534
<210> 535
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> F4/80引子1
<400> 535
<210> 536
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> F4/80引子2
<400> 536
<210> 537
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CD68引子1
<400> 537
<210> 538
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CD68引子2
<400> 538
<210> 539
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TBP引子1
<400> 539
<210> 540
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TBP引子2
<400> 540
<210> 541
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 對照標靶序列
<400> 541
<210> 542
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Foxo1標靶序列
<400> 542
<210> 543
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CtBP1標靶序列
<400> 543
<210> 544
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CtBP2標靶序列1
<400> 544
<210> 545
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CtBP2標靶序列2
<400> 545
<210> 546
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HNF4a標靶序列
<400> 546
<210> 547
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Rplp0正向引子
<400> 547
<210> 548
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Rplp0反向引子
<400> 548
<210> 549
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Pck1正向引子
<400> 549
<210> 550
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Pck1反向引子
<400> 550
<210> 551
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> G6pc正向引子
<400> 551
<210> 552
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> G6pc反向引子
<400> 552
<210> 553
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Foxo1正向引子
<400> 553
<210> 554
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Foxo1反向引子
<400> 554
<210> 555
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Foxo3正向引子
<400> 555
<210> 556
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Foxo3反向引子
<400> 556
<210> 557
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Foxo4正向引子
<400> 557
<210> 558
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Foxo4反向引子
<400> 558
<210> 559
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cebpa正向引子
<400> 559
<210> 560
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cebpa反向引子
<400> 560
<210> 561
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Nr3c1正向引子
<400> 561
<210> 562
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Nr3c1反向引子
<400> 562
<210> 563
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CtBP1正向引子
<400> 563
<210> 564
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CtBP1反向引子
<400> 564
<210> 565
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CtBP2正向引子
<400> 565
<210> 566
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CtBP2反向引子
<400> 566
<210> 567
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Alb正向引子
<400> 567
<210> 568
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Alb反向引子
<400> 568
<210> 569
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Gpam正向引子
<400> 569
<210> 570
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Gpam反向引子
<400> 570
<210> 571
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Fasm正向引子
<400> 571
<210> 572
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Fasn反向引子
<400> 572
<210> 573
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Scd1正向引子
<400> 573
<210> 574
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Scd1反向引子
<400> 574
<210> 575
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Hif1a正向引子
<400> 575
<210> 576
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Hif1a反向引子
<400> 576
<210> 577
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Ppargc1a正向引子
<400> 577
<210> 578
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Ppargc1a反向引子
<400> 578
<210> 579
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Stat3正向引子
<400> 579
<210> 580
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Stat3反向引子
<400> 580
<210> 581
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<330>
<223> Srebf1c正向引子
<400> 581
<210> 582
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Srebf1c反向引子
<400> 582
<210> 583
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Mlxip1正向引子
<400> 583
<210> 584
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Mlxip1反向引子
<400> 584
<210> 585
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Pklr正向引子
<400> 585
<210> 586
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Pklr反向引子
<400> 586
<210> 587
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Acly正向引子
<400> 587
<210> 588
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Acly反向引子
<400> 588
<210> 589
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Crp正向引子
<400> 589
<210> 590
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Crp反向引子
<400> 590
<210> 591
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Apcs正向引子
<400> 591
<210> 592
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Apcs反向引子
<400> 592
<210> 593
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CD36正向引子
<400> 593
<210> 594
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CD36反向引子
<400> 594
<210> 595
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Acadm正向引子
<400> 595
<210> 596
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Acadm反向引子
<400> 596
<210> 597
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRL1變異體1
<400> 597
<210> 598
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRL2變異體1
<400> 598
<210> 599
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRL3變異體5
<400> 599
<210> 600
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH1變異體2
<400> 600
<210> 601
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH2變異體3
<400> 601
<210> 602
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRH3變異體3
<400> 602

Claims (74)

  1. 一種人類化抗-aP2單株抗體或抗原結合劑，其包含：(a)包含一個、兩個或三個獨立地選自CDR-L1區之胺基酸序列、CDR-L2區之胺基酸序列或CDR-L3區之胺基酸序列的互補決定區(CDR-L)之輕鏈可變區，其中該CDR-L1區之胺基酸序列為Seq.ID No.7(CDRL1)；其中該CDR-L2區之胺基酸序列為Seq.ID No.8(CDRL2)；且其中該CDR-L3區之胺基酸序列係選自Seq.ID No.9(CDRL3)、Seq.ID No.10(CDRL3變異體1)、Seq.ID No.11(CDRL3變異體2)或Seq.ID No.12(CDRL3變異體3)；且(b)包含一個、兩個或三個獨立地選自CDR-H1區之胺基酸序列、CDR-H2區之胺基酸序列或CDR-H3區之胺基酸序列的互補決定區(CDR-H)之重鏈可變區，其中該CDR-H1區之胺基酸序列為Seq.ID No.14(CDRH1)；其中該CDR-H2區之胺基酸序列為Seq.ID No.16(CDRH2)或Seq.ID No.17(CDRH2變異體1)；且其中該CDR-H3區之胺基酸序列係選自Seq.ID No.19(CDRH3)或Seq.ID No.20(CDRH3變異體1)。
  2. 如請求項1之人類化抗-aP2單株抗體或抗原結合劑，其中該輕鏈可變區包含Seq.ID No.7(CDRL1)。
  3. 如請求項1之人類化抗-aP2單株抗體或抗原結合劑，其中該輕鏈可變區包含Seq.ID No.8(CDRL2)。
  4. 如請求項1之人類化抗-aP2單株抗體或抗原結合劑，其中該輕鏈可變區包含Seq.ID No.9(CDRL3)。
  5. 如請求項1之人類化抗-aP2單株抗體或抗原結合劑，其中該輕鏈 可變區包含Seq.ID No.10(CDRL3變異體1)。
  6. 如請求項1之人類化抗-aP2單株抗體或抗原結合劑，其中該輕鏈可變區包含Seq.ID No.11(CDRL3變異體2)。
  7. 如請求項1之人類化抗-aP2單株抗體或抗原結合劑，其中該輕鏈可變區包含Seq.ID No.12(CDRL3變異體3)。
  8. 如請求項1之人類化抗-aP2單株抗體或抗原結合劑，其中該輕鏈可變區包含三個包含CDR-L1區、CDR-L2區及CDR-L3區之互補決定區。
  9. 如請求項8之人類化抗-aP2單株抗體或抗原結合劑，其中該CDR-L3區為Seq.ID No.9(CDRL3)。
  10. 如請求項8之人類化抗-aP2單株抗體或抗原結合劑，其中該CDR-L3區為Seq.ID No.10(CDRL3變異體1)。
  11. 如請求項8之人類化抗-aP2單株抗體或抗原結合劑，其中該CDR-L3區為Seq.ID No.11(CRDL3變異體2)。
  12. 如請求項8之人類化抗-aP2單株抗體或抗原結合劑，其中該CDR-L3區為Seq.ID No.12(CDRL3變異體3)。
  13. 如請求項1之人類化抗-aP2單株抗體或抗原結合劑，其中該重鏈可變區包含Seq.ID No.14(CDRH1)。
  14. 如請求項1之人類化抗-aP2單株抗體或抗原結合劑，其中該重鏈可變區包含Seq.ID No.16(CDRH2)。
  15. 如請求項1之人類化抗-aP2單株抗體或抗原結合劑，其中該重鏈可變區包含Seq.ID No.17(CDRH2變異體1)。
  16. 如請求項1之人類化抗-aP2單株抗體或抗原結合劑，其中該重鏈可變區包含Seq.ID No.19(CDRH3)。
  17. 如請求項1之人類化抗-aP2單株抗體或抗原結合劑，其中該重鏈可變區包含Seq.ID No.20(CDRH3變異體1)。
  18. 如請求項1之人類化抗-aP2單株抗體或抗原結合劑，其中該重鏈可變區包含三個包含CDR-H1區、CDR-H2區及CDR-H3區之互補決定區。
  19. 如請求項18之人類化抗-aP2單株抗體或抗原結合劑，其中該CDR-H2區為Seq.ID No.16(CDRH2)。
  20. 如請求項18之人類化抗-aP2單株抗體或抗原結合劑，其中該CDR-H2區為Seq.ID No.17(CDRH2變異體1)。
  21. 如請求項18之人類化抗-aP2單株抗體或抗原結合劑，其中該CDR-H3區為Seq.ID No.19(CDRH3)。
  22. 如請求項18之人類化抗-aP2單株抗體或抗原結合劑，其中該CDR-H3區為Seq.ID No.20(CDRH3變異體1)。
  23. 如請求項18之人類化抗-aP2單株抗體或抗原結合劑，其中該CDR-H1區為Seq.ID No.14(CDRH1)，該CDR-H2區為Seq.ID No.16(CDRH2)，且該CDR-H3區為Seq.ID No.19(CDRH3)。
  24. 如請求項18之人類化抗-aP2單株抗體或抗原結合劑，其中該CDR-H1區為Seq.ID No.14(CDRH1)，該CDR-H2區為Seq.ID No.17(CDRH2變異體1)，且該CDR-H3區為Seq.ID No.19(CDRH3)。
  25. 如請求項18之人類化抗-aP2單株抗體或抗原結合劑，其中該CDR-H1區為Seq.ID No.14(CDRH1)，該CDR-H2區為Seq.ID No.16(CDRH2)，且該CDR-H3區為Seq.ID No.20(CDRH3變異體1)。
  26. 如請求項18之人類化抗-aP2單株抗體或抗原結合劑，其中該CDR-H1區為Seq.ID No.14(CDRH1)，該CDR-H2區為Seq.ID No.17(CDRH2變異體1)，且該CDR-H3區為Seq.ID No.20(CDRH3變異體1)。
  27. 如請求項1之人類化抗-aP2單株抗體或抗原結合劑，其中該輕鏈可變區包含選自Seq.ID No.446(909gL1 VL區)、Seq.ID No.448(909gL10 VL區)、Seq.ID No.487(909gL13 VL區)、Seq.ID No.488(909gL50 VL區)、Seq.ID No.450(909gL54 VL區)或Seq.ID No.452(909gL55 VL區)之胺基酸序列。
  28. 如請求項1之人類化抗-aP2單株抗體或抗原結合劑，其中該重鏈可變區包含選自Seq.ID No.455(909gH1 VH區)、Seq.ID No.459(909gH15 VH區)、Seq.ID No.457(909gH14 VH區)、Seq.ID No.461(909gH61 VH區)或Seq.ID No.463(909gH62 VH區)之胺基酸序列。
  29. 如請求項1之人類化抗-aP2單株抗體或抗原結合劑，其中該輕鏈可變區包含Seq.ID No.446(909gL1 VL區)且該重鏈可變區為Seq.ID No.459(909gH15 VH區)。
  30. 如請求項1之人類化抗-aP2單株抗體或抗原結合劑，其中該抗體或其抗原結合劑對人類aP2之KD約10-7M。
  31. 一種人類化抗-aP2單株抗體或抗原結合劑，其包含：包含一個、兩個或三個獨立地選自CDR-L1區之胺基酸序列、CDR-L2區之胺基酸序列或CDR-L3區之胺基酸序列的互補決定區(CDR-L)之輕鏈可變區，其中該CDR-L1區之胺基酸序列為Seq.ID No.7(CDRL1)；其中該CDR-L2區之胺基酸序列為Seq.ID No.8；且其中該CDR-L3區之胺基酸序列係選自Seq.ID No.9、Seq.ID No.10、Seq.ID No.11或Seq.ID No.12。
  32. 如請求項31之人類化抗-aP2單株抗體或抗原結合劑，其中該輕鏈可變區包含Seq.ID No.7(CDRL1)。
  33. 如請求項31之人類化抗-aP2單株抗體或抗原結合劑，其中該輕鏈 可變區包含Seq.ID No.8(CDRL2)。
  34. 如請求項31之人類化抗-aP2單株抗體或抗原結合劑，其中該輕鏈可變區包含Seq.ID No.9(CDRL3)。
  35. 如請求項31之人類化抗-aP2單株抗體或抗原結合劑，其中該輕鏈可變區包含Seq.ID No.10(CDRL3變異體1)。
  36. 如請求項31之人類化抗-aP2單株抗體或抗原結合劑，其中該輕鏈可變區包含Seq.ID No.11(CDRL3變異體2)。
  37. 如請求項31之人類化抗-aP2單株抗體或抗原結合劑，其中該輕鏈可變區包含Seq.ID No.12(CDRL3變異體3)。
  38. 如請求項31之人類化抗-aP2單株抗體或抗原結合劑，其中該輕鏈可變區包含三個包含CDR-L1區、CDR-L2區及CDR-L3區之互補決定區。
  39. 如請求項38之人類化抗-aP2單株抗體或抗原結合劑，其中該CDR-L3區為Seq.ID No.9(CDRL3)。
  40. 如請求項38之人類化抗-aP2單株抗體或抗原結合劑，其中該CDR-L3區為Seq.ID No.10(CDRL3變異體1)。
  41. 如請求項38之人類化抗-aP2單株抗體或抗原結合劑，其中該CDR-L3區為Seq.ID No.11(CDRL3變異體2)。
  42. 如請求項38之人類化抗-aP2單株抗體或抗原結合劑，其中該CDR-L3區為Seq.ID No.12(CDRL3變異體3)。
  43. 如請求項31之人類化抗-aP2單株抗體或抗原結合劑，其中該輕鏈可變區包含選自Seq.ID No.446(909gL1 VL區)、Seq.ID No.448(909gL10 VL區)、Seq.ID No.487(909gL13 VL區)、Seq.ID No.488(909gL50 VL區)、Seq.ID No.450(909gL54 VL區)、Seq.ID No.452(909gL55 VL區)之胺基酸。
  44. 如請求項43之人類化抗-aP2單株抗體或抗原結合劑，其中該輕鏈 可變區包含Seq.ID No.448(909gL10 VL區)。
  45. 如請求項31之人類化抗-aP2單株抗體或抗原結合劑，其進一步包含重鏈可變區。
  46. 如請求項31之人類化抗-aP2單株抗體或抗原結合劑，其中該抗體或其抗原結合劑對人類aP2之KD約10-7M。
  47. 一種人類化抗-aP2單株抗體或抗原結合劑，其包含：包含一個、兩個或三個獨立地選自CDR-H1區之胺基酸序列、CDR-H2區之胺基酸序列或CDR-H3區之胺基酸序列的互補決定區(CDR-H)之重鏈可變區，其中該CDR-H1區之胺基酸序列為Seq.ID No.14(CDRH1)；其中該CDR-H2區之胺基酸序列為Seq.ID No.16(CDRH2)或Seq.ID No.17(CDRH2變異體1)；且其中該CDR-H3區之胺基酸序列係選自Seq.ID No.19(CDRH3)或Seq.ID No.20(CDRH3變異體1)。
  48. 如請求項47之人類化抗-aP2單株抗體或抗原結合劑，其中該重鏈可變區包含Seq.ID No.14(CDRH1)。
  49. 如請求項47之人類化抗-aP2單株抗體或抗原結合劑，其中該重鏈可變區包含Seq.ID No.16(CDRH2)。
  50. 如請求項47之人類化抗-aP2單株抗體或抗原結合劑，其中該重鏈可變區包含Seq.ID No.17(CDRH2變異體1)。
  51. 如請求項47之人類化抗-aP2單株抗體或抗原結合劑，其中該重鏈可變區包含Seq.ID No.19(CDRH3)。
  52. 如請求項47之人類化抗-aP2單株抗體或抗原結合劑，其中該重鏈可變區包含Seq.ID No.20(CDRH3變異體1)。
  53. 如請求項47之人類化抗-aP2單株抗體或抗原結合劑，其中該重鏈可變區包含三個包含CDR-H1區、CDR-H2區及CDR-H3區之互補 決定區。
  54. 如請求項53之人類化抗-aP2單株抗體或抗原結合劑，其中該CDR-H1區為Seq.ID No.14(CDRH1)，該CDR-H2區為Seq.ID No.16(CDRH2)，且該CDR-H3區為Seq.ID No.19(CDRH3)。
  55. 如請求項53之人類化抗-aP2單株抗體或抗原結合劑，其中該CDR-H1區為Seq.ID No.14(CDRH1)，該CDR-H2區為Seq.ID No.17(CDRH2變異體1)，且該CDR-H3區為Seq.ID No.19(CDRH3)。
  56. 如請求項53之人類化抗-aP2單株抗體或抗原結合劑，其中該CDR-H1區為Seq.ID No.14(CDRH1)，該CDR-H2區為Seq.ID No.16(CDRH2)，且該CDR-H3區為Seq.ID No.20(CDRH3變異體1)。
  57. 如請求項53之人類化抗-aP2單株抗體或抗原結合劑，其中該CDR-H1區為Seq.ID No.14(CDRH1)，該CDR-H2區為Seq.ID No.17(CDRH2變異體1)，且該CDR-H3區為Seq.ID No.20(CDRH3變異體1)。
  58. 如請求項1之人類化抗-aP2單株抗體或抗原結合劑，其中該抗體或其抗原結合劑對人類aP2之KD約10-7M。
  59. 一種人類化抗-aP2單株抗體或抗原結合劑之用途，其用於製造供減弱人類之aP2介導之病症用的藥物，其中該人類化抗-aP2單株抗體或抗原結合劑包含：(a)包含一個、兩個或三個獨立地選自CDR-L1區之胺基酸序列、CDR-L2區之胺基酸序列或CDR-L3區之胺基酸序列的互補決定區(CDR-L)之輕鏈可變區，其中該CDR-L1區之胺基酸序列為Seq.ID No.7(CDRL1)；其中該CDR-L2區之胺基酸序列為Seq.ID No.8(CDRL2)；且 其中該CDR-L3區之胺基酸序列係選自Seq.ID No.9(CDRL3)、Seq.ID No.10(CDRL3變異體1)、Seq.ID No.11(CDRL3變異體2)或Seq.ID No.12(CDRL3變異體3)；及(b)包含一個、兩個或三個獨立地選自CDR-H1區之胺基酸序列、CDR-H2區之胺基酸序列或CDR-H3區之胺基酸序列的互補決定區(CDR-H)之重鏈可變區，其中該CDR-H1區之胺基酸序列為Seq.ID No.14(CDRH1)；其中該CDR-H2區之胺基酸序列為Seq.ID No.16(CDRH2)或Seq.ID No.17(CDRH2變異體1)；且其中該CDR-H3區之胺基酸序列係選自Seq.ID No.19(CDRH3)或Seq.ID No.20(CDRH3變異體1)。
  60. 如請求項59之用途，其中該aP2介導之病症為代謝病症。
  61. 如請求項60之用途，其中該代謝病症為I型糖尿病。
  62. 如請求項60之用途，其中該代謝病症為II型糖尿病。
  63. 如請求項60之用途，其中該代謝病症為高血糖症。
  64. 如請求項60之用途，其中該代謝病症為肥胖。
  65. 如請求項60之用途，其中該代謝病症為脂肪肝。
  66. 如請求項60之用途，其中該代謝病症為血脂異常。
  67. 如請求項60之用途，其中該代謝病症為多囊性卵巢症候群(POS)。
  68. 如請求項59之用途，其中該aP2介導之病症為心血管病症。
  69. 如請求項68之用途，其中該心血管病症為動脈粥樣硬化。
  70. 如請求項68之用途，其中該心血管病症與圍停經期或停經後期相關。
  71. 如請求項59之用途，其中該aP2介導之病症為發炎病症。
  72. 如請求項71之用途，其中該發炎病症為哮喘。
  73. 如請求項59之用途，其中該aP2介導之病症為贅生性病症。
  74. 如請求項73之用途，其中該贅生性病症係選自脂肪肉瘤、隔膜混合性苗勒氏瘤(mesentery mixed-mullerian tumor)、脊椎神經鞘瘤、膽囊癌、前列腺癌、大腦星形細胞瘤、肺癌、卵巢癌、膀胱癌、結腸癌、食道癌、停經後乳癌、子宮內膜癌、腎癌、肝癌或胰臟癌。
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