CN118047862A - 一种a-fabp中和单克隆抗体及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种A‑FABP中和单克隆抗体或其抗原结合片段及其制备方法和用途，其包含：重链可变区互补决定区1～3，其氨基酸序列依次如SEQ ID NO.1～3所示，和/或轻链可变区互补决定区1～3，其氨基酸序列如SEQ ID NO.4～6所示。该单克隆抗体对A‑FABP具有高度特异性，与人和小鼠的表皮FABP和心脏FABP没有交叉反应；对人A‑FABP和小鼠A‑FABP具有良好的结合亲和力；其治疗减轻了MCAO引起的小鼠缺血性中风损伤，这与减轻BBB破坏和减少促炎症JNK信号的激活有关；治疗健康小鼠21天，没有改变生理参数，表明其具有安全性。
Description
技术领域
本发明属于免疫学和生物制药领域，具体涉及一种能够中和血循环中游离的脂肪细胞脂肪酸结合蛋白的单克隆抗体及其制备方法和评价其在治疗缺血性中风疾病中的用途。
背景技术
缺血性脑卒中(IS)是全球第二大死亡原因，也是第三大死亡和残疾的综合原因。目前，美国食品和药物管理局批准用于缺血性脑卒中治疗的唯一药物是组织凝血酶原激活剂(tPA)。然而，tPA的使用受限于其狭窄的治疗窗口(中风发病后4.5小时内)，副作用大，包括脑出血和血管性水肿。因此，只有少数患者能从这种溶栓治疗中获益。对于不符合t-PA治疗条件的患者，可以采用机械血栓切除术(mTE)来清除血栓，但这只对大动脉闭塞的患者可行。此外，机械血栓切除术的风险包括脑内出血、血管损伤、入路血管痉挛和支架相关的并发症，超过了其益处。因此，开发针对缺血性脑卒中的新型有效疗法是具有重要意义的。
脂肪细胞-脂肪酸结合蛋白(A-FABP)是一种脂肪细胞分泌的蛋白质，又称A-FABP或AP2，是一种在脂肪细胞和巨噬细胞中大量表达的脂肪因子，可分泌到循环中。除了它的脂肪酸伴侣功能外，A-FABP还是炎症的一个关键媒介，在介导脑缺血性卒中中起着有害的作用[2]。在患有代谢并发症(包括肥胖症、动脉硬化和2型糖尿病)的病人中发现，循环中的A-FABP水平很高。在小鼠中，A-FABP的基因缺失或药物抑制可以改善肥胖、脂质代谢、肝硬化和糖代谢等代谢紊乱造成的不良影响。
循环A-FABP水平也与梗塞面积的增加、早期死亡密切相关，也是急性缺血性卒中患者的独立预后生物标志物。发明人先前的研究结果表明，缺血性脑卒中损伤后，小鼠的循环和脑部A-FABP升高。外周血单核细胞、小胶质细胞和浸润的单核细胞分别是循环和脑部A-FABP的主要细胞来源。A-FABP通过调节基质金属肽酶9(MMP-9)介导的血脑屏障(BBB)破坏，加剧了缺血性中风损伤。A-FABP的基因缺失或使用其选择性抑制剂BMS309403对A-FABP进行抑制，可明显减轻缺血性脑卒中的愈后情况，并减少BBB破坏和脑中风后的脑部炎症。这些研究表明，A-FABP是缺血性脑卒中损伤的一个潜在的治疗靶点。
尽管使用BMS309403阻断A-FABP的活性在2型糖尿病和动脉粥样硬化、脂肪性肝炎、肝脏纤维化以及缺血性脑中风的动物模型中均表现出有效的结果，但BMS309403是一种小分子药物，具有低特异性和非靶点活性，如抑制心肌细胞收缩力和刺激C2C12肌管的葡萄糖摄取，这些特性限制了其临床应用的发展。
基于抗体药物的高特异性、较少的脱靶副作用、较少的药物间相互作用和相对较长的半衰期的良好特性，近年来抗体药物的使用和开发逐渐增多。最近的一项研究也表明，针对分泌型A-FABP的单克隆抗体对肥胖小鼠有抗糖尿病的作用。因此，针对循环A-FABP的单克隆抗体可能是缺血性脑卒中的一种潜在治疗方法。
研究小组发明并确定了一种名为CA33的单克隆抗体对抗游离血清A-FABP的效果[3]。发表的文章显示，用CA33治疗可明显提高肥胖小鼠模型的葡萄糖代谢率。Cao在2013年的研究表明，用多克隆抗体中和A-FABP可以逆转肥胖症诱发的糖尿病，这表明A-FABP是治疗糖尿病的潜在靶点[4]。
大多数单克隆抗体疗法是针对靶向信号级联和调节脑卒中后炎症、神经元修复和再生的内源性分子而开发的。然而，由于人类和啮齿动物缺血后的炎症反应都是独有的，大多数在动物研究中显示出有益效果的单克隆抗体都在临床试验中失败。目前缺乏治疗临床缺血性脑卒中损伤的有效抗体药物。
发明内容
因此，本发明的目的是采用传统的杂交瘤技术来产生能够中和血循环A-FABP的单克隆抗体。
本发明的发明人经过研究发现，小鼠在大脑中动脉闭塞(MCAO)手术后血循环中的A-FABP水平明显升高；与野生型小鼠比较，A-FABP基因缺乏小鼠在MCAO手术后,缺血性脑卒中的结果明显减轻。在A-FABP基因缺失小鼠循环中补充重组A-FABP，可加重缺血性脑卒中的结果。这些结果表明，小鼠缺血性脑卒中的循环A-FABP的不利影响与人类一致。
在体外筛选研究中，本发明的发明人发现一种被命名为“6H2”的单克隆抗体(mAb)对脂肪细胞脂肪酸结合蛋白(A-FABP)具有很强的中和能力，研究显示：
(1)6H2对A-FABP具有高度特异性，与人和小鼠的表皮FABP(E-FABP)和心脏FABP(H-FABP)没有交叉反应。
(2)6H2对人A-FABP和小鼠A-FABP具有良好的结合亲和力。
(3)6H2的治疗减轻了MCAO引起的血脑屏障的破坏和减少、促炎症JNK信号的激活，从而减轻小鼠缺血性脑卒中损伤。
(4)从机制上讲，6H2通过与A-FABP的脂肪酸(FFA)结合口袋的盖子相互作用，可能干扰了FFA和A-FABP之间的相互作用，6H2的治疗减弱了A-FABP在缺血性脑中风中的危害作用。
(5)用6H2注射健康小鼠21天，没有改变生理参数，表明6H2的安全性。
基于这些研究成果，本发明的第一方面提供了一种A-FABP中和单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含：
重链可变区互补决定区1，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；重链可变区互补决定区2，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；和重链可变区互补决定区3，其氨基酸序列如SEQID No.3所示，和/或
轻链可变区互补决定区1，其氨基酸序列如SEQ ID No.4所示；轻链可变区互补决定区2，其氨基酸序列如SEQ ID No.5所示；和轻链可变区互补决定区3，其氨基酸序列如SEQID No.6所示。
重链可变区CDR1氨基酸序列为：DYNMD(SEQ ID NO.1)
重链可变区CDR2氨基酸序列为：DINPYNGDTIYNQNFKG(SEQ ID NO.2)
重链可变区CDR3氨基酸序列为：GYGF(SEQ ID NO.3)
轻链可变区CDR1氨基酸序列为：RSSQSLVYINGNTYLH(SEQ ID NO.4)
轻链可变区CDR2氨基酸序列为：KVSNRFS(SEQ ID NO.5)
轻链可变区CDR3氨基酸序列为：SQSTHVPYT(SEQ ID NO.6)
在本发明的A-FABP中和单克隆抗体或其抗原结合片段中，氨基酸序列分别如SEQID No.1～3所示的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3，以及氨基酸序列分别如SEQ ID No.4～6所示的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3，为根据Kabat定义的互补决定区(CDR)。
作为本发明的一种优选实施方式，所述A-FABP中和单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，并且轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。
重链可变区氨基酸序列(SEQ ID NO.7)：
VKLQESGPELVKPGASVKIPCKASGYTFTDYNMDWVRQSRGKSLEWIGDINPYNGDTIYNQNFKGKATLTVDKSSTTAYLELRSLTSEDTAVYYCASGYGFWGQGTTVTVSS
轻链可变区氨基酸序列(SEQ ID NO.8)：
DIVMTQAPLSLPVSLGAQASISCRSSQSLVYINGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHVPYTFGGGTKLEIK
作为本发明的一种实施方式，所述A-FABP中和单克隆抗体的抗原结合片段选自Fab、Fab′、(Fab′)2、Fv、二硫键连接的Fv、scFv、双抗体(diabody)或单域抗体(sdAb)中的一种或多种。
作为本发明的一种实施方式，所述A-FABP中和单克隆抗体选自鼠源抗体、嵌合抗体、人源化抗体、双特异性抗体或多特异性抗体中的一种或多种。
作为本发明的一种优选实施方式，所述A-FABP中和单克隆抗体为鼠源抗体。
优选地，所述鼠源抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，并且轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。
可代替地，所述A-FABP中和单克隆抗体为人源化抗体。优选地，所述人源化抗体包含人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4；更优选地，所述人源化抗体包含人IgG4。
优选地，所述人源化抗体的重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示，并且轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示。
人源化6H2抗体重链氨基酸序列：
VKLQESGPELVKPGASVKIPCKASGYTFTDYNMDWVRQSRGKSLEWIGDINPYNGDTIYNQNFKGKATLTVDKSSTTAYLELRSLTSEDTAVYYCASGYGFWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLS(SEQ ID NO.9)
人源化6H2抗体轻链氨基酸序列：
DIVMTQAPLSLPVSLGAQASISCRSSQSLVYINGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHVPYTFGGGTKLEIKPTVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADGSPVKAGVETTKPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVA(SEQ ID NO.10)
本发明的第二方面提供了所述A-FABP中和单克隆抗体或其抗原结合片段的制备方法，其包括：
(1)采用人重组A-FABP肽免疫小鼠；
(2)将来自步骤(1)的免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞融合来制备杂交瘤细胞；
(3)筛选产生A-FABP中和单克隆抗体的杂交瘤细胞。
作为本发明的一种实施方式，将步骤(1)中的人重组A-FABP肽与佐剂(AbMax生物技术公司(北京)，产品编号AD11.15)混合后进行免疫。
作为本发明的一种实施方式，步骤(3)中的所述筛选包括：使用次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸腺嘧啶培养基进行培养，然后通过酶联免疫吸附测定筛选产生所述A-FABP中和单克隆抗体的杂交瘤细胞；
作为本发明的一种实施方式，所述制备方法还可以包括：
(4)由小鼠腹水制备A-FABP中和单克隆抗体并采用蛋白G磁珠纯化。其中，所述蛋白G磁珠例如中国GenScript，L00209。
本发明的第三方面提供了一种用于预防和/或治疗循环A-FABP升高或其导致的疾病或症状的药物组合物，其包含本发明的A-FABP中和单克隆抗体或其抗原结合片段或者按照本发明的制备方法制备的A-FABP中和单克隆抗体或其抗原结合片段。
作为本发明的一种实施方式，所述药物组合物还包含药学上可接受的载体、稀释剂和/或佐剂。
作为本发明的一种实施方式，所述药物组合物还包含一种或多种其它用于预防和/或治疗循环A-FABP升高或其导致的疾病或症状的药物活性成分。
其中，所述循环A-FABP升高或其导致的疾病或症状可以选自缺血性脑卒中、肥胖症、肝硬化、动脉硬化、糖尿病中的一种或多种。
本发明的第四方面提供了本发明的A-FABP中和单克隆抗体或其抗原结合片段、或者按照本发明的制备方法制备的A-FABP中和单克隆抗体或其抗原结合片段在用于制备用于预防和/或治疗循环A-FABP升高或其导致的疾病或症状的药物中的用途。
作为本发明的一种实施方式，所述药物还包含药学上可接受的载体、稀释剂和/或佐剂。
作为本发明的一种实施方式，所述药物还包含一种或多种其它用于预防和/或治疗循环A-FABP升高或其导致的疾病或症状的药物活性成分。
相应地，本发明第五方面提供了一种用于预防和/或治疗循环A-FABP升高或其导致的疾病或症状的方法，其包括给予有需要的对象本发明的A-FABP中和单克隆抗体或其抗原结合片段、或者按照本发明的制备方法制备的A-FABP中和单克隆抗体或其抗原结合片段。
作为本发明的一种实施方式，所述方法还包括在给予有需要的对象本发明的A-FABP中和单克隆抗体或其抗原结合片段、或者按照本发明的制备方法制备的A-FABP中和单克隆抗体或其抗原结合片段的同时或间隔给予一种或多种其它用于预防和/或治疗循环A-FABP升高或其导致的疾病或症状的药物活性成分。
作为本发明的一种具体实施方式，所述循环A-FABP升高导致的疾病或症状选自缺血性脑卒中、肥胖症、肝硬化、动脉硬化、糖尿病中的一种或多种。
本发明提供的A-FABP中和单克隆抗体对A-FABP具有高度特异性，与人和小鼠的表皮FABP和心脏FABP没有交叉反应；对人A-FABP和小鼠A-FABP具有良好的结合亲和力；其治疗减轻了MCAO引起的小鼠缺血性中风损伤，这与减轻BBB破坏和减少促炎症JNK信号的激活有关；注射健康小鼠21天，没有改变生理参数，表明其具有安全性。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1为A-FABP KO小鼠在输注载液后或A-FABP重组蛋白(rA-FABP)后进行MCAO或假手术后24小时，用TTC染色的冠状脑切片的代表性照片；
图2为A-FABP KO小鼠在输注载液后或rA-FABP后进行MCAO或假手术后24小时或7天的相对梗塞体积、脑部含水量、神经系统评分(n＝5)和生存率(n＝9)的对比图；
图3为A-FABP-6H2复合物的分子对接结构分析图；
图4为6H2与重组小鼠或人A-FABP、E-FABP、H-FABP的抗原结合特异性的ELISA测定结果；
图5为6H2对rA-FABP诱导的JNK激活的中和活性；
图6为6H2对rA-FABP诱导的MMP-9产生的中和作用；
图7为6H2在血清中的半衰期表征结果；
图8为在MCAO手术后24小时用载液或6H2(1.8mg/kg或3.6mg/kg)处理的小鼠的TTC染色冠状大脑切片的代表性照片和相对梗塞体积的对比图；
图9为MCAO或假手术后，用载液或6H2(1.8mg/kg)处理的小鼠血清游离A-FABP水平的动态变化图(A)、脑含水量百分比(B)、神经系统评分(C)和生存率(D)；
图10为MCAO或假手术后，用载液或6H2(1.8mg/kg)处理的小鼠大脑中炎症细胞因子的相对mRNA水平。
图11为小鼠在MCAO或假手术后24小时用埃文斯蓝染色的代表性照片和伊万斯蓝浓度对比图(n＝5)；
图12为MCAO或假手术后用载液或6H2处理的小鼠大脑中紧密连接(TJ)蛋白的代表性免疫印迹以及每种蛋白相对于GAPDH的带强度；
图13为MCAO或假手术后用载液或6H2处理的小鼠大脑皮层中A-FABP,MMP-9,p-JNK(Thr183/Tyr185)和p-c-Jun(Ser 63/73)的代表性免疫印迹，以及每种蛋白相对于其各自对照蛋白或GAPDH的带强度(n＝5)；
图14为MCAO或假手术后用载液或6H2处理的小鼠血清中MMP-9的水平(n＝10)；
图15为监测健康小鼠用6H2或载液注射21天的代谢概况示意图；
图16为健康小鼠在接受6H2或载液注射21天的体重变化(A)；脂肪量(B)和肌肉百分比的变化(C)；6H2或载液注射10天后小鼠的空腹血糖(D)；6H2注射15天后的小鼠糖耐量试验(GTT)(E)；以及6H2或载液注射21天的小鼠的TC、TG和FFA水平的变化(F-H)。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
下述实施例中所用的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试剂、细胞系、病毒株、质粒、试剂盒等，如无特殊说明，均为市售产品。
对实施例中采用的实验方法说明如下。
(1)6H2对缺血性脑卒中的治疗潜力及其安全性的确定
为了评估A-FABP中和抗体6H2在缓解中风结果方面的治疗效率，在小鼠接受MCAO或假手术后一小时后静脉注射非对照免疫球蛋白G(IgG；1.8mg/kg)或6H2(1.8mg/kg或3.6mg/kg)，继而每3天注射一次。为了确定6H2治疗的安全性，与对健康的C57BL/6N小鼠静脉注射对照IgG或6H2(1.8mg/kg)，每3天一次，共21天。然后测定各项生理参数。实验方案经香港大学伦理委员会审查和批准(4847-18)。
(2)神经系统评分评估和脑梗塞体积测量
小鼠接受MCAO或假手术并再灌注24小时后，根据以下标准评估神经功能缺损的严重程度：0＝无缺损；1＝不能伸出前爪；2＝自发对侧转身；3＝自发对侧转圈；4＝丧失行走能力；5＝死亡。然后取出小鼠大脑并切成冠状切片。
脑部梗死情况按照发明人发表在欧洲心脏杂志的文章[1]所述，通过2,3,5-三苯基氯化四氮唑(TTC)染色评估梗死体积。将脑切片置于TTC染液中37℃避光染色15分钟，红色区域为正常脑组织，白色区域为梗塞区。梗死体积用Image J软件(Image J 1.42软件，美国国立卫生研究院)进行量化。计算公式如下：
[对侧半球(mm3)-未受损的同侧半球(mm3)]/对侧半球的面积×100％。
(3)转角试验和存活率
在转角试验中，将两块木板(30cm*20cm*1cm)以30°角连接形成一个角。小鼠被放在距离转角的中间位置。当小鼠到达转角处时，它们向上爬，然后转向任何一侧。记录试验过程中左转(同侧)的次数。
在存活率实验中，记录每组活体动物的数量并计算其百分比。
(4)脑部含水量
在MCAO手术后24小时再灌注后收集小鼠的大脑。安乐死后立即对湿组织样本进行称重。脑部样本在110℃的烤箱中干燥48小时。对样品在干燥过程前后都进行称重。脑部含水量的计算公式如下：
[(湿组织重量-干组织重量)/湿组织重量]×100％。
(5)Western印迹分析
从小鼠初级腹膜巨噬细胞中提取蛋白质。用十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离细胞裂解液。将蛋白质转移到聚偏二氟乙烯膜上，并用针对MMP-9(AB38898,Abcam,美国)和β-肌动蛋白(Proteintech，66009-1-Ig,美国)的一级抗体进行检测。膜与辣根过氧化物酶(HRP)结合的第二抗体进行孵化。使用NIH Image J软件对蛋白带的强度进行量化。
(6)生物化学和免疫学分析
使用Accu-Check血糖仪(德国罗氏公司)测量血糖。血清甘油三酯(TG)和总胆固醇(TC)的浓度使用商业试剂盒(Stanbio实验室，美国)按照制造商手册进行量化。血清FFAs浓度用FFAs，Half Micro Test(罗氏，德国)测量。
(7)葡萄糖耐受实验(GTT)和胰岛素耐受实验(ITT)
在GTT实验中，将小鼠隔夜禁食(晚上19:00-上午9:00)，然后腹腔注射D-葡萄糖(Sigma#G5767，2g/kg体重)。
在ITT实验中，小鼠禁食6小时(上午8:00-下午14:00)，然后腹腔注射胰岛素(HM，1U/kg体重)。在每个实验规定的不同时间点从尾静脉采集血液，用Accu-Check血糖仪测量葡萄糖水平。
实施例1
本实施例用于构建缺血性卒中小鼠模型
1.8周龄雄性A-FABP KO小鼠的制备
A-FABP KO小鼠的制备参考发明人的文章[1]。简单来说，A-FABP KO小鼠是使用基因靶向敲除的方法制备，利用了载体替换A-FABP基因的外显子荧光素酶和新霉素基因。使用基因特异性引物进行基因分型分析以鉴定WT、A-FABP KO和杂合小鼠。
将8周龄雄性A-FABP KO小鼠及其野生型(WT)的同胞或C57BL/6N小鼠随机分组饲养在常规的12小时光照/黑暗周期中，湿度为60％～70％，可自由获得水和食物。
2.暂时性大脑动脉闭塞
用2％的异氟醚对小鼠进行麻醉。用恒温器控制的加热垫将体温维持在37±0.5℃。待小鼠麻醉状态稳定后，将硅包裹头部的细丝通过颈外动脉引入颈内动脉从而阻塞大脑中动脉。60分钟后，将细丝取出。手术过程中，利用激光多普勒血流仪监测皮质血液输注。血流突然下降到基线值的20-30％以下被认为是充分闭塞。在闭塞1小时后，血流供应将得到恢复。
3.确定循环A-FABP对缺血性脑卒中的不利影响
对8周龄雄性A-FABP KO小鼠使用渗透泵输注A-FABP重组蛋白(rA-FABP，AIS，HKU)(2μg/h)或载液(vehicle，主要为非免疫性免疫球蛋白)作为对照，持续7天后进行Sham或MCAO手术，再输注23h或7天。对各种生理参数(包括体重、体脂组成情况、血脂、空腹血糖等)进行分析。
图1为A-FABP KO小鼠在输注载液或重组A-FABP蛋白后,进行MCAO或假手术并在灌注24小时，用TTC染色的冠状脑切片的代表性照片，n＝5。
图2为A-FABP KO小鼠在输注载液后或重组A-FABP蛋白后,进行MCAO或假手术并再灌注24小时或7天后的相对梗塞体积、脑部含水量、神经系统评分(n＝5)和生存率(n＝9)的对比图；数据以平均值±SD表示，*P<0.05,**P<0.01。
TTC染色显示，补充重组A-FABP蛋白后，A-FABP KO小鼠的MCAO手术诱发的梗塞体积明显增加。与此相一致的是，补充了重组A-FABP蛋白的A-FABP KO小鼠的脑水肿和神经功能缺损明显增加，存活率也下降。这些数据证实了循环中的A-FABP在介导脑缺血损伤中的有害作用。
实施例2
采用杂交瘤技术产生针对A-FABP的中和单克隆抗体，具体方法如下：
1.抗原
采用人A-FABP的第22位氨基酸到第36位氨基酸多肽序列作为抗原免疫小鼠，其序列为：KEVGVGFATRKVAGC(SEQ ID No.11)。
1.1将70μg抗原用500μL无菌水稀释，并与600μL弗氏完全佐剂混合。用超声波细胞粉碎机将该混合物超声处理成乳白色混合物，生成免疫原A。
1.2将140μg抗原用1mL无菌水稀释，并与1mL佐剂(AbMax生物技术公司(北京)，AD11.15)混合。在摇床上以80～100rpm在室温下摇动该混合物2小时，以生成免疫原B。
2.免疫小鼠
将免疫原A通过静脉注射给BALB/c小鼠，每3天一次，持续2周。
将免疫原B通过腹腔注射(i.p.)和肌肉注射(i.m.)给BALB/c小鼠，每3天一次，持续2周。
3.酶联免疫吸附测定(ELISA)
注射后14天，从免疫原A或免疫原B处理的小鼠尾静脉采集血样，用于ELISA，以确定是否存在针对A-FABP的抗体。
在4℃下，用1μg/ml的人或小鼠A-FABP重组蛋白(AIS，HKU)将ELISA板包被过夜。在ELISA板的每个孔中加入100微升血清并在4℃下孵育过夜。然后用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗板三次，再在室温下用含5％牛奶的PBS阻断1小时。当血清抗体滴度达到1:10000稀释度背景值的两倍时，将免疫小鼠的脾脏单细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合。将细胞在黄嘌呤-氨基蝶呤-胸腺嘧啶选择培养基中培养10天后，将单克隆菌落挑到96个孔中。7天后通过ELISA进一步测定单克隆菌落上清液中的抗体浓度。
4.由小鼠腹水制备单克隆抗体
将阳性杂交瘤细胞注入小鼠腹腔10天，产生含有所需抗体的腹水液。收集腹水液并离心以去除脂质。然后根据制造商手册，用蛋白G珠(GenScript，L00209，中国)纯化腹水液中的单克隆抗体，获得本发明的单克隆抗体6H2。
5.分子对接
为了评估和确定A-FABP-6H2复合物和目标表位的结构，使用分子操作环境(MOE)软件进行了蛋白质-蛋白质对接分析，结果如图3所示。
从蛋白质数据库中检索(PDB，代码：2NNQ)A-FABP的晶体结构。用SAbPred(http://opig.stats.ox.ac.uk/webapps/newsabdab/sabpred/)预测生成6H2的结构的。
分子对接研究使用分子操作环境(MOE)软件2014.9进行。在制备蛋白质时，去掉了水和共晶配体，加入了氢，并通过MMFF94x力场调整其他重要参数。然后用制备的蛋白质模块进一步处理A-FABP蛋白质和6H2，以模拟缺失的环路区域，计算蛋白质的电离和质子化的蛋白质结构。所制备的6H2被定义为受体，其结合位点被限制在互补性决定区域(CDRs)。准备好的A-FABP将攻击6H2的CDRs，经过100次试验，直到达到最稳定的对接复合物。
图3的目标表位的预测显示，用于产生抗体的A-FABP(绿色)的肽区(红色)作为抗原表位与6H2互补决定区(CDRs)结合(6H2重链的CDRs：黄色；6H2轻链的CDRs：橙色)，6H2重链(6H2-H)的Asn33与A-FABP接触。该结构还显示，6H2直接与β桶的“盖子”(A-FABP的Ser14至Ala37)结合，这被认为是控制脂质进入结合口袋。对接分析表明，6H2的活性可能与A-FABP-脂质结合有关。
实施例3
本实施例用于检测单克隆抗体6H2的活性
1.用Biacore测定6H2的结合亲和力
使用Biacore 8k(GE HealthCare,USA)仪器，通过表面等离子体共振(SPR)分析6H2与人和小鼠A-FABP抗原的结合动力学。具体操作如下：
使用标准胺偶联化学方法将A-FABP抗原共价固定在传感器芯片上。以30微升/分钟的流速在通道上注入两倍稀释的抗体3分钟，并允许再解离10～15分钟，然后以30微升/分钟的流速注入25微升的10mM甘氨酸-盐酸(pH2.5)进行再生。用Biacore 8K评估软件1.0版(GE Healthcare Bio-Sciences)处理和分析数据，结果显示6H2对人A-FABP和小鼠A-FABP都显示出中等强度的亲和力，KD值分别为2.57E-06和5.50E-07。
2.6H2对不同FABPs的特异性
将小鼠或人A-FABP、E-FABP、H-FABP重组蛋白(1μg/ml)涂在96孔板上过夜进行ELISA结合试验来评估单克隆抗体与各种FABPs的反应性和特异性。
在孔中加入100微升6H2(1μg/ml)并在室温下孵育1小时。然后用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗板三次，接着用0.2μg/ml的HRP共轭-小鼠IgG H+L(Proteintech，SA00001-1，日本)作为检测抗体在室温下孵育1小时。用PBS洗涤后，加入TMB显色剂溶液(Beyotime，P0209，中国)进行显色；在孔中加入2M H2SO4停止酶诱导的颜色反应；用微孔板阅读器测量450nm处的吸光度，结果如图4所示。
图4表明，6H2对人和小鼠的A-FABP具有高度特异性，而与人和小鼠的上皮-FABP(e-FABP)和心脏-FABP(h-FABP)没有交叉反应。
3.测定6H2单克隆抗体的中和活性
以前的研究表明，A-FABP通过激活JNK/c-Jun信号通路在各种组织中介导炎症反应。为了评估6H2对A-FABP生物作用的中和活性，进行了ELISA和Western blot检测，以确定用6H2预孵化的rA-FABP或小鼠IgG作为阴性对照(1:1和1:10的比例)处理后，小鼠初级腹膜巨噬细胞的p-JNK/JNK比率和MMP9的产生，结果如图5和图6所示。
对8周的小鼠腹腔注射1毫升3.8％硫代乙醇酸盐培养基(BD，211716，USA)，3天后，通过腹腔灌洗获得原始腹膜巨噬细胞,用于评估单克隆抗体6H2对抑制A-FABP介导的炎症的中和活性。原发性腹膜巨噬细胞在高葡萄糖Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM)中培养，辅以10％胎牛血清(FBS)和100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素，在37℃，5％CO2培养箱中培养。在96孔板中接种后6小时更换培养基。
为了确定6H2在抑制A-FABP介导的JNK信号通路激活方面的效率，将1μg/ml小鼠rA-FABP与6H2(rA-FABP:6H2摩尔比为1:1或1:10)或小鼠非免疫球蛋白G(rA-FABP:IgG摩尔比为1:1或1:10)在DMEM中预孵育30分钟，37℃。随后，用上述混合物在37℃下再处理初级腹膜巨噬细胞30分钟。通过ELISA进一步分析处理后的初级腹膜巨噬细胞中JNK信号的激活情况(n＝3)。
使用Phospho-JNK(T183/Y185)+Total In-Cell ELISA Kit(Abcam,ab207477,英国)检测小鼠初级腹膜巨噬细胞中的p-JNK/JNK比率，所有溶液都根据制造商手册准备。按测试3所述方法处理小鼠腹膜巨噬细胞后，除去培养基，用4％甲醛固定细胞。随后用抗体阻断缓冲液处理细胞，再用一级和二级抗体进行孵化。然后用TMB显色剂溶液(BeyotimeBiotechnology,P0209,China)对平板进行显色。在每个孔中加入2M H2SO4来停止酶诱导的颜色反应，用微孔板阅读器测量450nm处的吸光度。
图5和图6表明，单独用rA-FABP(1ug/ml)处理可明显诱导p-JNK/JNK比率，当重组A-FABP与6H2以1:1的比例预孵化时，该比率被明显抑制，在1:10的比例下，该比率被进一步下调；同样地，A-FABP诱导的MMP-9的表达也被1:1和1:10比例的6H2处理明显抑制。然而，预孵化的小鼠IgG并没有显示出任何效果。这些数据表明，6H2对A-FABP表现出很强的中和活性。
4.测定6H2单克隆抗体的半衰期
为了确定单克隆抗体6H2的半衰期，首先用Sulfo-NHS-Biotin(ThermoScientific,A39256,USA)对6H2进行生物素标记。通过在ZebaSpin脱盐自旋柱(ThermoFisher,89882,USA)上脱盐来消除未结合的生物素。将1.8mg/kg的生物素标记的6H2静脉注射给8周的C57BL/6N小鼠，并在注射后1小时和1～15天收集血样。使用HRP结合的链霉菌素(Thermo Scientific,TH273544,USA)进行Western印迹分析，检测6H2重链(6H2-H)和轻链(6H2-L)。不同时间点的血清生物素标记的6H2-H或6H2-L的含量以百分比表示，注射后1小时的血清生物素标记的6H2-H或6H2-L的含量作为100％，空白血清作为0％。6H2的半衰期是指血清中生物素标记的6H2-H或6H2-L含量达到50％的时间。
C57BL6/N小鼠静脉注射生物素标记的6H2或小鼠IgG，浓度为1.8mg/kg。在注射生物素标记的6H2或小鼠IgG后的不同时间点收集小鼠的血样。Western印迹分析表明，6H2mAb的半衰期为2～3天，可在血清中维持约2周，结果如图7所示。
实施例4
本实施例用于表征单克隆抗体6H2对脑缺血的治疗效果
1.6H2治疗减弱MCAO引起的脑损伤
为了评估单克隆抗体6H2对脑缺血的治疗潜力，对C57BL/6N小鼠进行MCAO手术1小时，然后静脉注射6H2或小鼠IgG，再灌注23小时或7天。6H2的剂量是根据MCAO引起的A-FABP的血清水平计算的。MCAO发生后24小时的TTC染色结果显示，1.8mg/kg 6H2治疗可明显减少缺血引起的梗死体积，如图8所示。
进一步增加6H2的剂量至3.6mg/kg并没有显示梗死体积的进一步减少。因此，在接下来的研究中使用1.8mg/kg 6H2。
ELISA结果表明，与用小鼠IgG治疗的小鼠相比，用6H2治疗明显减少了缺血性中风引起的血清A-FABP的升高，如图9的A图所示。这一数据表明，6H2与循环中的A-FABP有效结合，导致ELISA检测的游离A-FABP减少。一致的是，与小鼠IgG处理的小鼠相比，6H2处理的小鼠在缺血引起的脑水肿中表现出明显的下降，如图9的B图所示。MCAO后7天内的长期神经功能障碍也得到明显改善，与6H2处理的小鼠的存活率增加有关，结果如图9的C图和D图所示。此外，在6H2治疗的小鼠中，MCAO引起的脑部促炎症细胞因子的表达明显减弱，如图10所示。上述数据以平均数±SD表示，*P<0.05，**P<0.01。
以上数据表明，用6H2治疗中和了MCAO诱导的循环A-FABP，导致促炎症细胞因子分泌的减少，从而减轻了脑损伤和不良的功能结果。这些数据验证了中和A-FABP以对抗缺血性脑损伤的广泛潜在适用性。
2.6H2治疗缓解MCAO手术中A-FABP引起的血脑屏障破坏
先前的研究发现，A-FABP-JNK-MMP-9信号通路通过促进MCAO诱导的血脑屏障破坏(BBB)渗漏而加剧了脑缺血损伤。因此，对6H2在挽救BBB完整性方面的作用进行了评估。
在MCAO手术后1小时，将6H2或小鼠IgG静脉注射到小鼠体内。与小鼠IgG处理的对照组相比，缺血诱导的BBB渗漏在6H2处理的小鼠中明显减少，表现为对伊文思蓝染料的渗透性降低，如图11所示。缺血诱导的紧密连接(TJ)蛋白Occludin和ZO-1的降解也被6H2明显减弱，表明6H2对BBB渗漏有保护作用，如图12所示。缺血性中风期间MCAO诱导的JNK/c-Jun信号通路的激活以及脑和循环中的MMP-9水平也被6H2明显抑制，如图13和图14所示。
以上数据以平均值±SD表示，*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001。
3.6H2长期治疗不影响健康小鼠的全身代谢
为了探索6H2治疗是否导致副作用，小鼠静脉注射6H2(1.8mg/kg)或小鼠IgG(1.8mg/kg)，每3天一次，持续21天，并监测基本代谢参数，如图15所示。
与小鼠IgG处理的小鼠相比，6H2处理的小鼠的体重(图16的A图)、脂肪(图16的B图)和肌肉(图16的C图)以及空腹血糖(图16的D图)没有明显变化。
使用葡萄糖耐量试验(GTT)验证了葡萄糖代谢情况。与小鼠IgG处理相比，6H2处理并没有改变葡萄糖耐受性，这表现在类似的葡萄糖处理曲线上(图16的E图)。由于A-FABP是一种与脂质平衡有关的脂质伴侣，因此对血清中的总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)和游离脂肪酸(FFA)水平进行了相应评估(图16的F-H图)。在小鼠IgG-和6H2治疗组之间没有观察到上述参数的明显差异。以上数据表明6H2是一种安全的中和单克隆抗体，用于治疗小鼠缺血引起的脑损伤。
以上实施例表明，大脑中动脉闭塞(MCAO)手术后1小时，单次静脉注射6H2(1.8mg/kg)可明显缓解缺血性中风的结果，包括减少梗塞面积、脑水肿、BBB渗漏、炎症，并改善小鼠的神经功能和生存率(1天)。缺血性中风后每3天用6H2治疗一次，也提高了小鼠的长期(7天)生存率。在健康的C57BL/6N小鼠中静脉注射6H2 21天，与注射IgG的小鼠相比，没有改变任何生理参数，包括身体成分、葡萄糖水平和脂质状况，表明6H2的安全性。这些数据显示6H2是一种能够用于治疗缺血性中风的单克隆抗体，并且具有很高的安全性和效率。
上述实施例仅为本发明的优选实施例而已，并不对本发明起到任何限制作用。在不脱离本发明的技术方案的范围内，任何所属技术领域的技术人员对本发明揭示的技术方案和技术内容做出任何形式的等同替换或修改等变动均未脱离本发明的技术方案，仍属于本发明的保护范围之内。
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Claims (12)
1.一种A-FABP中和单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含：
重链可变区互补决定区1，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；重链可变区互补决定区2，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；和重链可变区互补决定区3，其氨基酸序列如SEQ IDNO.3所示，和/或
轻链可变区互补决定区1，其氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；轻链可变区互补决定区2，其氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示；和轻链可变区互补决定区3，其氨基酸序列如SEQ IDNO.6所示。
2.根据权利要求1所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，并且轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。
3.根据权利要求1或2所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗原结合片段选自Fab、Fab′、(Fab′)2、Fv、二硫键连接的Fv、scFv、双抗体和单域抗体中的一种或多种。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中，所述单克隆抗体选自鼠源抗体、嵌合抗体、人源化抗体、双特异性抗体或多特异性抗体中的一种或多种。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述单克隆抗体为鼠源抗体；
优选地，所述鼠源抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，并且轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。
6.根据权利要求1至4中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述单克隆抗体为人源化抗体；
优选地，所述人源化抗体包含人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4；更优选地，所述人源化抗体包含人IgG4；
优选地，所述人源化抗体的重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示，并且轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示。
7.权利要求1至6中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段的制备方法，包括：
(1)采用人重组A-FABP肽免疫小鼠；
(2)将来自步骤(1)的免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞融合来制备杂交瘤细胞；
(3)筛选产生A-FABP中和单克隆抗体的杂交瘤细胞。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其中，将步骤(1)中的人重组A-FABP肽与佐剂混合后进行免疫；
优选地，步骤(3)中的所述筛选包括：使用次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸腺嘧啶培养基进行培养，然后通过酶联免疫吸附测定筛选产生所述A-FABP中和单克隆抗体的杂交瘤细胞；
优选地，所述制备方法还包括：
(4)由小鼠腹水制备所述A-FABP中和单克隆抗体，并采用蛋白G磁珠纯化。
9.一种用于预防和/或治疗循环A-FABP升高或其导致的疾病或症状的药物组合物，其包含权利要求1至6中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段、或者按照权利要求7或8所述的制备方法制备的单克隆抗体或其抗原结合片段。
10.根据权利要求9所述的药物组合物，其还包含药学上可接受的载体、稀释剂和/或佐剂；
优选地，所述药物组合物还包含一种或多种其它用于预防和/或治疗循环A-FABP升高或其导致的疾病或症状的药物活性成分；
优选地，所述循环A-FABP升高或其导致的疾病或症状选自缺血性脑卒中、肥胖症、肝硬化、动脉硬化、糖尿病中的一种或多种。
11.权利要求1至6中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段、或者按照权利要求7或8所述的制备方法制备的单克隆抗体或其抗原结合片段在用于制备用于预防和/或治疗循环A-FABP升高或其导致的疾病或症状的药物中的用途。
12.根据权利要求11所述的用途，其中，所述药物还包含药学上可接受的载体、稀释剂和/或佐剂；
优选地，所述药物还包含一种或多种用于其它预防和/或治疗循环A-FABP升高或其导致的疾病或症状的药物活性成分；
优选地，所述循环A-FABP升高选自缺血性脑卒中、肥胖症、肝硬化、动脉硬化、糖尿病中的一种或多种。
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