JP2004041221A

JP2004041221A - 単量体および二量体抗体フラグメント融合タンパク質

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Publication number: JP2004041221A
Application number: JP2003306222A
Authority: JP
Inventors: Andreas Plueckthun; プリュクトゥーン、　アンドレアス; Peter Pack; パク、　ペーター
Original assignee: Merck Patent GmbH
Current assignee: Merck Patent GmbH
Priority date: 1992-01-23
Filing date: 2003-08-29
Publication date: 2004-02-12
Also published as: CZ287296B6; EP0654085B1; KR950700419A; HU215180B; RU2128709C1; CA2128511A1; HUT68798A; DE69309472D1; KR100254759B1; ES2102007T3; HU9402167D0; CA2128511C; DE69309472T2; DK0654085T3; WO1993015210A1; NO942750D0; JP3490437B2; EP0654085A1; NO942750L; US5910573A

Abstract

【課題】　Ｆｖ−フラグメントを含むが、抗体の定常ドメインを用いていない、二量体形成可能な、新規なクラスの抗原結合分子を提供する。
【解決手段】　抗体のＦｖフラグメントおよび他のペプチドと非共有相互作用によって二量体形成ができるペプチドを含んでなる抗原結合分子とすることで、他の抗体フラグメント分子、あるいは非抗体フラグメント分子と二量体を形成し、二または多官能性の抗体フラグメント融合タンパク質、ならびに所謂ミニ抗体をそれぞれ形成することができる。かかる二量体融合タンパク質は、診断および治療の広範な分野において、利用することができる。
【選択図】　　なし

Description

　本発明は、抗体のＦｖ−フラグメントを含むが定常抗体ドメインを用いない新クラスの抗原結合分子に関する。これらはまた、他の抗体フラグメント分子または非抗体フラグメント分子と二量体を形成して、二または多官能基抗体フラグメント融合タンパク質、およびいわゆるミニ抗体をそれぞれ形成することができる。新規の融合タンパク質は、診断および治療薬の広範な分野において使用することができる。

　二、三年前から、より特異的でより特定の抗体型を得るために天然に生じる抗体を修飾するバイオテクノロジー分野に大きな関心が向けられている。したがって、（修飾された）抗体フラグメントを生産する試みがなされてきた。

　全クラスの天然に生じる抗体はすべて、少なくとも二つの結合部位を有する。これによって、抗体は、Ｆａｂフラグメントのような一価のフラグメントよりも、より多様な親和性で表面と結合することができる。この二、三年の間に記述された方法には、官能基を有する抗体フラグメントを大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）中で産生させ得る方法（ＳｋｅｒｒａおよびＰｌｕｅｃｋｔｈｕｎ、　１９８８、　Ｓｃｉｅｎｃｅ、　２４０、　１０３８〜１０４０、Ｂｅｔｔｅｒら、　１９８８、　Ｓｃｉｅｎｃｅ、　２４０、　１０４１〜１０４３）がある。これらにはＦｖフラグメント（Ｖ_HおよびＶ_Lからなるヘテロ二量体）およびＦａｂフラグメント（Ｖ_LおよびＣ_Lドメインを含む完全なＬ鎖およびＨ鎖の最初の二ドメインのＶ_HおよびＣ_H1からなる）が含まれる。

　しかし、ＦｖフラグメントはＶ_HおよびＶ_Lに解離する傾向にあり、したがって、二つのドメインを共有結合させることが有利である。これらを結合する一つの特別な方法は、これらの間にペプチドリンカーをＶ_H−リンカー−Ｖ_LまたはＶ_L−リンカー−Ｖ_Hのいずれかの配列でデザインすることによる（Ｂｉｒｄら、　１９８８、　Ｓｃｉｅｎｃｅ、　２４２、　４２３、　Ｈｕｓｔｏｎら、　１９８８、　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ、　８５、　５８７９）。得られるフラグメントは一本鎖Ｆｖフラグメントと呼ばれる。

　しかし、これらフラグメントはすべて、一価である。本発明において、われわれは、ペプチド形成両親媒性ヘリックスに基づいて、小さい二量体形成ドメインを作出する方法を記述する。これらのペプチドを「挿入」と称するが、これはターゲットにした会合ができるという意味を表すものであって、二量体形成相接部の特定構造を表して限定するものではない。

　ここに記述される方法は、原則的には、Ｆａｂ、ＦｖまたはｓｃＦｖフラグメントのいずれにも適用できるが、後者にもっとも有利に用いられる。この場合、二価フラグメントは、極めて小サイズに構築することができて、かつＶ_LおよびＶ_Hへの解離およびフラグメント鎖のミスマッチ、例えばＶ_L−Ｖ_Lを妨げることができる。

　小サイズの抗体フラグメントは、多くの適用にとくに有利である。診断的適用（例えば、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡなど）において、より小さい分子表面によって、定常部が多くは関与することが知られている非特異的相互反応の問題が軽減される。抗体フラグメントをアフィニティー・クロマトグラフィーにおいてリーガンドとして用いる場合にも同様である。腫瘍の診断または治療において、注射した抗体のかなりの量が組織に入り込んで腫瘍に集積されることが重要であり、これは分子の大きさに依存している（Ｃｏｌｃｈｅｒら、　１９９０、　Ｊ．　Ｎａｔｌ．　Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎｓｔ．　８２、　１１９１〜１１９７）。組み換えタンパク質の発現率と分泌効率もまた、鎖サイズによって異なり（ＳｋｅｒｒａおよびＰｌｕｅｃｋｔｈｕｎ、　１９９１、　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｎｇ．　４、　９７１）、より小さいタンパク質がこの理由で好ましい。したがって、小サイズの分子が種々の理由から有利である。

　従来、抗体の分子サイズを小さくするということは、タンパク質加水分解フラグメントの調製を意味する。最小の二価のフラグメントである（Ｆａｂ）’₂フラグメントは、本発明のフラグメントのそれでもまだ約２倍の大きさである。したがって、これらの新規フラグメントは三つの特性を合わせ持つ。すなわち、（ａ）小サイズ、（ｂ）二価性および二官能基性および（ｃ）大腸菌における機能発現能を有する。

　二官能基抗体には多くの分野で大きな関心が向けられている。二官能基性抗体は、二つの異なる抗原あるいは同じ抗原の二つのエピトープのいずれかのための二つの異なる特異性を有すると定義することができる。

　今日、二官能基性抗体を産生する方法が多数ある。しかし、現在ある方法のいずれも、選択的に二官能基性抗体だけをイン　ビボで産生させることはできず、むしろ分子型の混合が常におきて、複雑で高価な分離工程を必要とする。

　主たる四つの方法が認められる。第一は化学的架橋結合が用いられ、これには異種二官能基性クロスリンカーが有利に用いられる。この方法によって、全抗体（Ｓｔａｅｒｚら、　１９８５、　Ｎａｔｕｒｅ、　３１４、　６２８、　Ｐｅｒｅｚら、　１９８５、　Ｎａｔｕｒｅ、　３１６、　３５４〜３５６）、Ｆａｂフラグメント（Ｃａｒｔｅｒら、　１９９２、　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、　１０、　１６３）およびｓｃＦｖフラグメント（Ｃｕｍｂｅｒら、　１９９２、　Ｊ．　Ｉｍｍｕｎｏｌ．、　１４９、　１２０）が精製後に化学的に架橋された。

　第二の従来法では、二つのハイブリドーマの融合が関与し、いわゆるヘテロハイブリドーマまたは「クアドローマ」が得られる。この方法では、いずれのＬ鎖がいずれのＨ鎖と対になってもよく、二つのＨ鎖はホモ二量体またはヘテロ二量体を形成することができ、その結果、きわめて複雑な産生物の混合物が得られる（ＭｉｌｓｔｅｉｎおよびＣｕｅｌｌｏ、　１９８３、　Ｎａｔｕｒｅ、　３０５、　５３７）。

　第三の方法は、第二の方法に関連しており、第二の抗体のＨ鎖およびＬ鎖をコードする二つの発現プラスミドをハイブリドーマ細胞へ（ＬｅｎｚおよびＷｅｉｄｌｅ、　１９９０、　Ｇｅｎｅ、　８７、　２１３）または、レトロウイルス・ベクター（Ｄｅ　Ｍｏｎｔｅら、　１９９０、　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　８７、　２９４１〜２９４５）中にトランスフェクトさせることからなる。しかし、いったん導入されると、産生物混合物は第二の方法におけるものと同一である。

　最後の方法では、抗体は還元されて、混合されて、再び酸化される（ＳｔａｅｒｚおよびＢｅｖａｎ、　１９８６、　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　Ｔｏｄａｙ、　７）。ここでも、きわめて複雑な産生物混合物が得られ、高度の分離操作および品質管理工程が要求される。
Ｓｃｉｅｎｃｅ、　２４０、　１０３８〜１０４０、　１９８８Ｓｃｉｅｎｃｅ、　２４０、　１０４１〜１０４３、　１９８８Ｓｃｉｅｎｃｅ、　２４２、　４２３、　１９８８Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ、　８５、　５８７９、　１９８８Ｊ．　Ｎａｔｌ．　Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎｓｔ．　８２、　１１９１〜１１９７、　１９９０Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｎｇ．　４、　９７１、　１９９１Ｎａｔｕｒｅ、　３１４、　６２８、　１９８５Ｎａｔｕｒｅ、　３１６、　３５４〜３５６、　１９８５Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、　１０、　１６３、　１９９２Ｊ．　Ｉｍｍｕｎｏｌ．、　１４９、　１２０、　１９９２Ｎａｔｕｒｅ、　３０５、　５３７、　１９８３Ｇｅｎｅ、　８７、　２１３、　１９９０Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　８７、　２９４１〜２９４５、　１９９０Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　Ｔｏｄａｙ、　７、　１９８６

　このように、化学的架橋から、要求される複雑な調製を行うことなく、直接にヘテロ二量体抗体を選択的に分離できる方法が未だ求められている。

　本発明において、この問題を（ｉ）ｓｃＦｖフラグメント中の対応するＶ_HおよびＶ_Lドメインを共有結合させること、および（ｉｉ）ある種のロイシン・ジッパーおよび誘導体などの、二量体形成ドメインを用いることによって、ヘテロ二量体しか形成されないようにすることによって、解決する。

　本発明の他の重要な考慮点は、詳細に上記に説明したような理由から、二特異性抗体の分子量をできるだけ小さくしたいということであった。これは、ｓｃＦｖフラグメントを用いることによって達成された。

　二特異性抗体の使用についてはこれまで多くの記述があるが、この新技術はそのほとんどに利益をもたらす。例えば、二特異性抗体は腫瘍治療において、きわめて興味深い。抗体の一方の腕を腫瘍マーカーに結合させて、もう一方をＴ細胞エピトープ、トキシンまたは放射性核種結合ペプチドまたはタンパク質に結合させて、傷害機能因子を腫瘍細胞に接近させることができる。診断においては、一方の腕を分析対象と結合させて、もう一方を酵素などの容易に定量できるものと結合させる。最後に、細胞への適用においては、二つの異なるエピトープまたは同じタンパク質複合体が認識され得る場合、または二つの異なるタンパク質が同一の細胞表面に認識され得る場合には、高度の結合選択性を得ることが有利である。

　このように、本発明の目的は、二官能基またはさらに多官能基結合部位を有する新規のそれぞれの安定した抗体フラグメント融合タンパク質を作出することであった。

　Ｆｖフラグメントを含む抗体フラグメント融合タンパク質が特異的な改善された性質を示す遺伝子工学的手法によって産生されることが見出された。

　したがって、本発明の目的は、抗体のＦｖフラグメントおよび非共有相互作用によって他のペプチドと二量体を形成することができるペプチドから本質的になる単量体抗体フラグメント融合タンパク質である。

　用語「非共有相互作用」とは、通常の条件下で安定している共有結合に関しないあらゆる結合であって、例えばファン・デル・ワールズ力、両親媒性ペプチド、とくにペプチド・ヘリックスの（立体的な）結合、またはアミノ酸残基の反対の電荷を有するペプチドなどである。

　両親媒性ペプチドは、５０個までのアミノ酸からなる。好ましくは、これらは１０〜３０個のアミノ酸からなる。本発明の好ましい実施態様では、相互作用性ペプチドはペプチド・ヘリックス団（ヘリックス、ターンおよび別のヘリックスからなる。上記を参照されたい）である。他の実施態様では、相互作用性ペプチドはいくつかの反復アミノ酸を有するペプチドからなるロイシン・ジッパーであり、ここで７個毎のアミノ酸はロイシンである。本発明の他の例では、ペプチドは正または負に荷電した残基、例えばリジン（正に荷電）またはグルタミン酸（負に荷電）を、このペプチドが反対に荷電した他のペプチド（第２の単量体ユニットの）と結合できるように有している。

　Ｆｖフラグメントと挿入ペプチドは、直接に、またはリンカー・ペプチドによって、好ましくはリンカー・ペプチドによって一緒に連結している。好ましい実施態様においては、リンカー・ペプチドは、抗体のヒンジ領域の配列である。

　定義のように、Ｆｖフラグメントは抗体のＶ_LおよびＶ_H領域からなる。本発明によるＦｖフラグメントは、好ましくは一本鎖フラグメントである。一本鎖フラグメントは、標準リンカー分子を用いて標準手法によって得ることができる。

　さらに、本発明の目的は、二つの単量体融合タンパク質から本質的になる二量体融合タンパク質であって、ここで単量体ユニットの連結は同一または異なるペプチドの非共有相互作用に基づき、少なくとも一つの単量体ユニットが上記に定義された抗体−Ｆｖフラグメント融合タンパク質であることを特徴とする。

　二量体が二つのＦｖフラグメントを含む場合は、Ｆｖフラグメントは同じ（同一の抗原結合部位）でも、または異なって（異なる抗原結合部位）いてもよい。これらの場合には、単および二特異性（Ｆｖ）−ミニ抗体を得ることができる。本発明によると、二特異性ミニ抗体が好ましい。

　相互作用性ペプチドは、同一でも異なっていてもよいが、好ましくは同一である。挿入ペプチドは平行または逆平行の状態で会合する。

　したがって、本発明の目的は、とりわけ、異なる特異性（抗原結合部位）を有する二つのＦｖフラグメントおよび同一の挿入ヘリックス・ペプチドからなる二量体融合タンパク質であって、抗体フラグメントとペプチドはヒンジ領域配列によって連結している。

　さらに、本発明の目的は、Ｆｖフラグメントを含む単量体およびＦｖフラグメントが非抗体ペプチドによって置換されたもう一つの単量体ユニットからなる二量体である。非抗体ペプチドは、リシンなどのトキシン、キレート化剤または金属結合性ペプチド、または酵素（例えば、マーカー酵素）、または検出可能な標識（例えば、放射性同位元素）を有するペプチドなどである。

　非抗体ペプチドはまた、該基部のための対応する結合部位を有することができ、これにはＴ細胞またはＴ細胞フラグメントに対する結合部位が含まれる。

　さらに、本発明は、相互作用性ペプチドがＣ末端において、標的タンパク質／ペプチドと上記したようにさらに融合している上記に定義した単量体および二量体に関し、対応する結合部位が含まれる。したがって、得られる融合タンパク質およびミニ抗体は、それぞれ多価性である。

　本発明はまた、上記に定義した単量体抗体融合タンパク質の調製法に関し、これはＦｖフラグメントをコードする遺伝子、相互作用性ペプチドおよび、必要であれば、連結ペプチドを一つの発現プラスミドにクローニングして、宿主細胞を該発現プラスミドで形質変換して栄養溶液中で培養して、単量体融合タンパク質を細胞中で発現させるか、培地中に分泌させることを特徴とする。

　本発明の目的は、最後に、上記に定義した二量体融合タンパク質の調製法であって、これは完全な単量体融合タンパク質、またはその部分をコードする遺伝子を少なくとも一つの発現プラスミドにクローニングして、宿主細胞を該発現プラスミドで形質転換して栄養溶液で培養して、完全な二量体融合タンパク質を細胞中で、または培地中に発現させるか、単量体融合タンパク質を別々に発現させてから、二つの単量体ユニット間の非共有結合を培地中、またはイン　ビトロで行わせること、さらに、融合タンパク質の部分のみがクローニングされた場合には、タンパク質工学的工程を標準手法によって追加して実施することを特徴とする。

　本発明による融合タンパク質を含む二量体Ｆｖフラグメントは、対応する抗原に対する高度の親和性および十分な安定性を示す。これらの新規の二価または二官能基分子は大腸菌中で折りたたまれて組み立てられた分子として調製することができる。これらのミニ抗体は、分泌による機能発現と適合性を示す。

　発明の詳細な説明
　オリゴマー形成ドメインは相当に小さな分子量であって、かつ融合タンパク質の膜を通しての輸送に適合するものが選択された。これらは、二つの異なる型の両親媒性ヘリックスに基づいている。

　両親媒性ヘリックスは、占有的ではないが優勢に、二つの異なる分子構造に会合していることが知られている。すなわち、四ヘリックス団と二重コイルである。ヘリックス団の形態と形成については既に研究されている（Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇら、　１９８６、　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　１、　１６〜２２、ＨｏおよびｄｅＧｒａｄｏ、　１９８７、　Ｊ．　Ａｍ．　Ｃｈｅｍ．　Ｓｏｃ．　１０９、　６７５１〜６７５８、ＲｅｇａｎおよびｄｅＧｒａｄｏ、　１９８８、　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４１、　９７６〜９７８、Ｈｉｌｌら、　１９９０、　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２９４、　５４３〜５４６）。この分子会合はまた、天然タンパク質からも公知である（Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ、　１９８１、　Ａｄｖ．　Ｐｒｏｔ．　Ｃｈｅｍ．　３４、　１６７）。

　四ヘリックス団は、四つの別々の分子から（それぞれ、一つのヘリックスに関与している）、各二つのヘリックスを含む二分子（ヘリックス−ターン−ヘリックスとして連結されている）、またはヘリックス−ターン−ヘリックス−ターン−ヘリックス−ターン−ヘリックス構造を含む一分子のいずれかから形成することができる。二量体形成または多量体形成のためには、最初の二つだけが適している。

　後者の三タイプが試験された。第一のタイプでは、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇら（１９８６、　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　１、　１６〜２２）によって示された配列の一つのヘリックスを用いた。第二タイプでは、この配列をシステインで終わる親水性小ペプチドによって伸長した。一旦、ヘリックスが会合すると、親水性ペプチドは互いに衝突するほどに十分に接近して、大腸菌のペリプラズム中などの酸化条件下でジスルフィド結合が形成され得る。第三のタイプでは、二つのヘリックスが縦列に用いられ、短いターンのコード・ペプチドによって分離される。

　第二のデザインでは、いわゆる二重コイル構造を形成できるようなペプチドが用いられる。そのようなペプチドは、酵母由来のＧＣＮ４などの転写因子中に認められ、ロイシン・ジッパーと呼ばれている（Ｌａｎｄｓｃｈｕｌｚら、　１９８８、　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４０、１７５４〜１７６４）。最近、この結晶構造が解明され（Ｏ’Ｓｈｅａら、　１９９１、　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５４、５３９〜５４４）、ヘリックスの平行構造が示された。

　ヘリックスの共有結合は、ここでも、システインを含む小ペプチド延長物によって可能である。ヘリックスが平行であることから、距離はずっと近くなるので、ペプチド延長物はずっと短くてよい。

　しかし、種々の二量体形成手段物（挿入ヘリックス）が抗体ドメインに直接には融合されなかった。ｓｃＦｖフラグメントとヘリックス開始部との間に可動性のペプチドを導入することは有利である。例えば、マウスＩｇＧ３の上部ヒンジ部が使われてきた。しかし、種々のヒンジを用いることができる。これは、二量体形成自体には要求されないが、全抗体の抗原結合部位と同様の二つのｓｃＦｖドメインの空間を提供する。このようにして、二つの結合部位は空間的により大きい距離を保つことができ、したがって、隣接する抗原に確実な面で到達することができる。

　抗体の天然に認められるヒンジは、二価ミニ抗体におけるヒンジの好ましい例である。二官能基性ミニ抗体の場合、異なる表面からの分子はしばしば可能な限り近接して架橋されていることからヒンジはより短くてよく、二量体の可動性は必要ではない。ヒンジの選択は所望の残基配列、長さ（Ａｒｇｏｓ、　１９９０、　Ｊ．　Ｍｏｌ．　Ｂｉｏｌ．　２１１、　９４３〜９５８）、折りたたみとの適合性、両親媒性ヘリックスの安定性（ＲｉｃｈａｒｄｓｏｎおよびＲｉｃｈａｒｄｓｏｎ、　１９８８、　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４０、　１６４８〜１６５２）、分泌およびプロテアーゼに対する抵抗性によって決定される。

　本発明ではペプチドを二量体形成手段物として扱うが、これはできるだけ小さくなければならない。一つの好ましい実施態様は、両親媒性ヘリックスを形成できるようなペプチドの使用である。そのようなヘリックスは疎水性表面を二量体形成またはさらに多量体形成によって覆う。この型のヘリックスは、ヘリックスの表面に疎水性小区分を有することおよび充分数のヘリックス形成残基を含むことによって特徴づけられる。そのようなペプチドの特徴については、Ｅｎｓｅｎｂｅｒｇら（１９８６）、Ｏ’Ｓｈｅａら（１９９１、　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５４、　５３９〜５４４、　１９９２、　Ｃｅｌｌ　６８、　６９９〜７０８）で考察されている。

　この型の天然ペプチドはいわゆるロイシン・ジッパーとして見出されており、これらは周期的間隔で存在するロイシン（７残基毎）およびその他のやはり７残基毎の疎水性残基（例えば、バリン）によって特徴づけられる。これらの本質は今明らかにされている（Ｏ’Ｓｈｅａら、　１９９１、　１９９２、前出）ので、配列をホモ二量体の会合に不都合であるがヘテロ二量体の会合には好ましくなるような残基を導入するように変えることができる。そのような配列変更には、例えば、荷電架橋の導入などが関与することができ、例えば、ホモ二量体においては、互いに反発しあう荷電が、ヘテロ二量体においては、互いに引き合う荷電の導入が考えられる（下記を参照されたい）。

　本発明はまた、二官能基ミニ抗体にも及ぶことができる。この場合、二量体形成手段物（挿入ペプチド）は、ヘテロ二量体の形成するのみでホモ二量体は形成しないようなものを用いなければならない。本発明のこの部分の好ましい実施態様は、天然に認められるロイシン・ジッパーにおけるような二つの異なる二重コイルヘリックスで、例えば、転写因子タンパク質のｊｕｎおよびｆｏｓなどからのものがある（Ｏ’Ｓｈｅａら、　１９８９、　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４５、　６４６〜６４８）。

　本発明のさらなる実施例において、定常ｓｃＦｖ−ヒンジ−ヘリックスはＣ末端において伸長させて融合タンパク質にすることができる。例えば、酵素と融合させて、そのような二価構成体を診断に利用してもよい。そのような酵素としては、例えば、アルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼまたはホースラディッシュ・ペルオキシダーゼなどでがある。そのような抗体−酵素融合タンパク質の利点としては、抗体の二価性が表面結合抗原との結合を促進することが考えられる。従来の手法（すなわち、選択酵素への抗体の化学的カップリング）によって調製された融合タンパク質と比較しての利点としては、バッチ間の差異がずっと小さいことがあげられる。すなわち、産生物が均一で、調製が大腸菌からの単一工程によるのでより簡単である。

　同様にして、ミニ抗体をＣ末端で伸長してトキシンを導入することができる。そのようなイムノトキシンは二価またはさらに二特異性であることが可能であり、これは上記のような抗体フラグメントの利点と組み合わせて、腫瘍治療においてイムノトキシンとして利用されている。同様に、金属結合ペプチドまたはタンパク質を遺伝子的に結合させて、放射線免疫療法または腫瘍画像において用いることができる。抗体−酵素融合で示したのと同様の利点が遺伝的にコードされたハイブリド・タンパク質においても認められる。

　本発明の他の実施態様において、上記した二特異性ミニ抗体の形成とまったく同様にして、ｓｃＦｖ−ヒンジ−ヘリックス型構成体を二量体形成ドメインに融合した他のタンパク質と二量体形成させることができる。このようにして、ｓｃＦｖフラグメントは、例えば、ｆｏｓタンパク質のヘリックスに適する。ヘテロ二量体をｓｃＦｖフラグメントと形成させることができるような外来性タンパク質としては、診断に有用な酵素、トキシン、金属結合ペプチドまたは放射線免疫療法または放射線画像において有用なタンパク質などがある。

　本発明の原理を用いて、ここで提示された二量体形成ドメインはまた精製目的にも適用できる。いかなる種類の組み換えタンパク質でも二量体形成ドメイン、例えば、ヒンジ−ｆｏｓ−ジッパーに融合することができる。ｓｃＦｖ−ヒンジ−ｊｕｎとの共発現の後、ヘテロ二量体をｓｃＦｖ−特異性のためのアフィニティー・カラムを用いる一工程で精製することができる。別のアプローチにおいては、粗細胞抽出物としてカラムを通過する際にカラム支持体に結合した「反対側の」ジッパーがタンパク質−ヒンジ−ジッパーを「捕らえる」。

　カラムからの精製融合タンパク質の溶出は、ジッパーの展開温度を用いることで可能である。二量体形成ドメインからの続いての分離は、タンパク質加水分解部位の導入、例えば、血液凝固因子Ｘａのヒンジへの導入などによって達成できる（ＮａｇａｉおよびＴｈｏｇｅｒｓｏｎ、　１９８７、　Ｍｅｔｈ．　Ｅｎｚｙｍｏｌ．　１５２、　４６１〜４８１）。

　本発明において記述するミニ抗体のとくに優れている点は、大腸菌内で機能的に組み立てられることである。ホモ二価構成体の場合、二量体形成原則が用いられ、これによってホモ二量体が形成される。上記された例には、酵母タンパク質ＧＣＮ４の二重コイルヘリックス（ロイシン・ジッパー）または逆平行四ヘリックス団からのヘリックスが含まれる。この場合、ｓｃＦｖフラグメントは細菌性シグナル配列の存在下で発現され、ｓｃＦｖフラグメントの遺伝子の末端にヒンジおよび二量体形成ヘリックスまたはヘリックス−ターン−ヘリックスのためのコドンを有している。ヘリックスは、タンパク質の折りたたみ、ジスルフィド形成およびアセンブリーが行われる大腸菌のペリプラズム空間への分泌と適合性を示す。これらの条件下で、ホモ二量体タンパク質は自然に形成され、二量体のかたちで直接に単離することができる。

　ヘテロ二価構成体が望ましければ、二つの異なるｓｃＦｖフラグメント、または異なるタンパク質と会合している一つのｓｃＦｖフラグメントが会合に必要である。本発明の好ましい実施態様においては、組み立てられる両タンパク質は同じ細胞中で、好ましくは同じプラスミド上で、好ましくは二シストロン・オペロンとして発現される。人工的二シストロン・オペロンのデザインは、例えば、Ｓｋｅｒｒａら（１９９１、、Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｎｇ．　４、　９７１）に説明されている。組立は、ペリプラズム中で起きなければならないことから、ｓｃＦｖフラグメントは、酸化的環境中でしか折りたたまれないので、両タンパク質は輸送されて、両方ともシグナル配列とうまく適合せねばならない。二量体形成タンパク質は、二つの異なるタンパク質の会合は促進するが、それぞれのホモ二量体の会合は妨げるように選択せねばならない。そのようなタンパク質の例としては、タンパク質ｆｏｓおよびｊｕｎのロイシン・ジッパー・ペプチドがある（上記を参照されたい）。

　同一の細胞で発現されない場合は、異なるｓｃＦｖ−ヒンジ−ジッパー構成体は粗細胞抽出物または精製タンパク質として一緒に混合されて、温度を上げて処理されねばならない。「反対側の」ジッパーが存在しない状態で、例えば、ｓｃＦｖ−ヒンジ−ｊｕｎ−ジッパー構成体はホモ二量体を形成することができる。約４０℃の融解温度まで短時間加熱した後、不要なホモ二量体のジッパーがはずれて、ずっと安定したヘテロ二量体が形成される（Ｏ’Ｓｈｅａら、　１９９２、　Ｃｅｌｌ、　６８、　６９９〜７０８）。実験で示されたように、温度を上げることなしにはインビトロでのヘテロ二量体の形成は不可能である。

　図面および配列表の簡単な説明
　第１図は、ｓｃＦｖフラグメントを含むｓｃＦｖ発現ベクターｐＬＩＳＣ−ＳＥの模式図である。

　第２図は、二シストロンｓｃＦｖ−ヒンジ−ジッパー発現ベクターｐＡＣＫｘＦｙＪの模式図である。

　第３図は、官能基を有するＥＬＩＳＡの説明図である。

　ＯＤ₂₈₀で測定した（縦軸）アフィニティー精製タンパク質の濃度は、ウェル当たりの結合部位モル数（横軸）に関連する。ＥＬＩＳＡプレートをホスホコリン−ＢＳＡで被覆して、精製されたホスホコリン−特異性ミニ抗体−タンパク質を結合させて、抗ＭｃＰＣ６０３抗血清によって検出した。
（ａ）種々のミニ抗体の比較
（ｂ）ミニ抗体ｓｃＨＬＸｃのＳｃＦＶおよび全ＩｇＡとの比較
　第４図は、官能基を有する抗リゾチームＦＬＩＳＡの説明図である。

　共発現された抗ＰＣ−抗リゾチーム二特異性ミニ抗体のＰＣアフィニティー精製サンプル。横軸上の＋および−はインヒビターをプラスした場合（＋）およびインヒビターなしの場合（−）を意味する。

　添付の配列表は、配列ＩＤ番号（Ｓ．Ｉ．Ｎ．）に対応する。

　Ｓ．Ｉ．Ｎ．１：ｐＬＩＳＣ−ＳＥベクターの全ヌクレオチドおよびアミノ酸配列
　Ｓ．Ｉ．Ｎ．２：挿入ＧＣＮ４−ロイシン・ジッパーの遺伝子断片（カセット）（ヌクレオチドおよびアミノ酸配列）
　Ｓ．Ｉ．Ｎ．３：挿入逆平行ヘリックス−ターン−ヘリックスをコードする遺伝子カセット（ヌクレオチドおよびアミノ酸配列）
　Ｓ．Ｉ．Ｎ．４：挿入ｊｕｎ−ジッパーおよびＩｇＧ３−ヒンジ領域をコードする遺伝子カセット
　Ｓ．Ｉ．Ｎ．５：挿入ｆｏｓ−ジッパーおよびＩｇＧ３−ヒンジ領域をコードする遺伝子カセット
　Ｓ．Ｉ．Ｎ．６：挿入ｊｕｎ−ジッパーおよびデザインされたリンカーをコードする遺伝子カセット
　Ｓ．Ｉ．Ｎ．７：挿入ｆｏｓ−ジッパーおよびデザインされたリンカーをコードする遺伝子カセット

　［実施例１］：挿入ペプチドのための遺伝子を導入するための制限部位を含む分泌一本鎖フラグメントのためのベクターの構築
　組み換えＤＮＡ手法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９、　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：実験室マニュアル、第二版、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）に基づいた。一本鎖Ｆｖフラグメントおよびミニ抗体の大腸菌ＪＭ８３中での機能発現は、ｐＡＳＫ−ｌｉｓｃ（Ｓｋｅｒｒａら、　１９９１、　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｎｇ．　４、　９７１）と同様のベクターを用いて行った。部位特異性突然変異は、これらベクター中でＫｕｎｋｅｌら（１９８７、　Ｍｅｔｈ．　Ｅｎｚｙｍｏｌ．　１５４、　３６７〜３８２）およびＧｅｉｓｓｅｌｓｏｄｅｒら（１９８７、　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　５、　７８６〜７９１）の方法によって、ヘルパーファージＭ１３Ｋ０７（ＶｉｅｉｒａおよびＭｅｓｓｉｎｇ、　１９８７、　Ｍｅｔｈ．　Ｅｎｚｙｍｏｌ．　１５３、　３〜１１）を用いて直接に行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、ＦｌｉｎｇおよびＧｒｅｇｅｒｓｏｎ（１９８６、　Ａｎａｌ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　１５５、　８３〜８８）によって記述されたようにして行った。アフィニティー精製タンパク質の濃度は、計算された吸収係数を用いてＯＤ₂₈₀によって測定した（Ｇｉｌｌおよびｖｏｎ　Ｈｉｐｐｅｌ、　１９８９、　Ａｎａｌ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　１８２、　３１９〜３２６）。ベクターとしては、複製起点、調節可プロモーター、細菌性シグナル配列、それに続く多重クローニング部位、転写ターミネーターおよび一本鎖ファージのための起点を含むｐＡＳＫ４０（Ｓｋｅｒｒａら、　１９９１、　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｎｇ．　４、　９７１）などが用いられる。一本鎖Ｆｖフラグメントの遺伝子は次のようにデザインされる。すなわち、Ｖ_Hドメインのヌクレオチド配列の後に、好ましくは約１５残基、好ましくは配列（Ｇｌｙ₄Ｓｅｒ）₃をコードするリンカー配列が直接に続き、それにＶ_Lドメインの配列が直接に続く。別法として、Ｖ_Lドメインの配列にリンカー配列が直接に続いて、それにＶ_Hドメインの配列が続いてもよい。

　抗体の配列が公知であれば、ｓｃＦｖフラグメントの完全な遺伝子は合成オリゴヌクレオチドから組み立てられる。抗体遺伝子のそのような遺伝子合成のための詳細な実験工程はＰｌｕｅｃｋｔｈｕｎら（１９８７、　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｓｙｍｐ．　Ｑｕａｎｔ　．Ｂｉｏｌ．　５２、　１０５〜１１２）に記述されている。

　Ｖ_HおよびＶ_Lドメインの遺伝子が他のベクター中に存在している場合には、ｓｃＦｖフラグメントの遺伝子を制限フラグメントから組み立てることもできる。例えば、Ｖ_Hドメインのほとんどをコードする制限フラグメントをプラスミドから切り出し、Ｖ_Lドメインのほとんどをコードするフラグメントを別のプラスミドから切り出す。Ｖ_LおよびＶ_Hの残りの片およびｓｃＦｖフラグメントのためのリンカーは、合成オリゴヌクレオチドのカセットによって得ることができ、これらは標準法（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、前出）によって連結する必要がある。フラグメントの混合物を、ベクターｐＡＳＫ４０または適当な制限部位の一対を含む同様のプラスミド中に連結する。

　抗体の遺伝子が前もってクローニングされている場合には、これらは抗体を産生するハイブリドーマ細胞からポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ：ＰＣＲ法はＭｃＰｈｅｒｓｏｎら、　１９９１、　ＰＣＲ−Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ　Ｏｘｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋに記述されている）によって直接に得ることもできる。Ｖ_HおよびＶ_Lドメインの増幅に適するプライマーは、Ｏｒｌａｎｄｉら（１９８９、　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ　．Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　８６、　３８３３〜３８３７）、Ｈｕｓｅら（１９８９、　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４６、　１２７５〜１２８１）およびＬａｒｒｉｃｋら（１９８９、　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　７、　９３４〜９３８）によって記述されている。ハイブリドーマからｍＲＮＡを得る方法については、これらの参考文献に記述されている。別々のＶ_HおよびＶ_L遺伝子を、別々のベクターにクローニングして、ｓｃＦＶ遺伝子を上記に説明した原則によって組み立てることもできる。

　連結されたフラグメントがｓｃＦｖフラグメントの正しい読み枠を構成しない場合には、プラスミド上のシグナル配列コドンとの正確な融合を、部位特異性突然変異によって生じさせてもよい。オリゴヌクレオチドのデザインと構成は、いかなる当業者にも可能である。

　このようにして得られるｓｃＦｖ発現プラスミドは、細菌性シグナル配列のコドンを含み、これに直接に第一の可変領域（Ｖ_HまたはＶ_L）、リンカーおよび第二の可変領域（Ｖ_LまたはＶ_H）が調節可プロモーターのコントロールの下に続く。

　ｓｃＦｖタンパク質のＣ−末端に対応する、この遺伝子の３’末端において、単一制限部位を発現プラスミドに導入して、挿入ペプチドをコードする遺伝子カセットの挿入を可能にする。制限部位をＫｕｎｋｅｌ（１９８７、　Ｍｅｔｈ．　Ｅｎｚｙｍｏｌ．　１５４、　３６７〜３８２）の方法を用いて部位特異性突然変異によって導入する。

　挿入ペプチドを受けるための適当な一本鎖Ｆｖ発現プラスミドｐＬＩＳＣ−ＳＥの完全な配列の例を第１図および配列ＩＤ番号１（Ｓ．Ｉ．Ｎ．：１）（配列表を参照されたい）に示す。

　［実施例２］：ロイシン・ジッパーの挿入ペプチドをコードする遺伝子カセットのデザインおよび構築
　ｓｃＦｖフラグメント遺伝子の３’末端における制限部位と適合するように制限部位を備えた遺伝子カセットは、ヒンジ（ｓｃＦｖフラグメントの挿入タンパク質との結合部）の配列および挿入ペプチド自体をコードしなければならない。しかし、ヒンジ領域は省略してもよい。

　例えば、マウスＩｇＧ３の上部ヒンジ領域の配列（Ｄａｎｇｌら、　１９８８、　ＥＭＢＯ　Ｊ．　７、　１９８９〜１９９４）と、これに続く酵母タンパク質ＧＣＮ４のロイシン・ジッパーの配列（Ｏａｓら、　１９９０、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　Ｔ２９、　２８９１〜２８９４）を、頻用される大腸菌コドン中に戻し翻訳（ｂａｃｋ−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ）する（配列ＩＤ番号３、Ｓ．Ｉ．Ｎ．：２）。オリゴヌクレオチドを合成して、あらかじめＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化しておいたベクターｐＬＩＳＣ−ＳＥ中に連結する。

　［実施例３］：四ヘリックス団の挿入ペプチドをコードする遺伝子カセットのデザインおよび構築
　実施例２と同様にして、マウスＩｇＧ３の上部ヒンジ領域の配列とこれに続く四ヘリックス団のヘリックス−ターン−ヘリックスの配列（Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇら、１９８６、前出）を、頻用される大腸菌コドン中に戻し翻訳する（配列ＩＤ番号５、Ｓ．Ｉ．Ｎ．：３）。オリゴヌクレオチドを合成して、あらかじめＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化しておいたベクターｐＬＩＳＣ−ＳＥ中に連結する。

　［実施例４］：ロイシン・ジッパーの挿入ペプチドをコードする二つの遺伝子カセットのデザインおよび構築、およびそれらの共発現
　実施例２と同様にして、マウスＩｇＧ３の上部ヒンジ領域の配列とこれに続くｊｕｎタンパク質のジッパー配列の配列（Ｏ’Ｓｈｅａら、１９９２、前出）を、頻用される大腸菌コドン中に戻し翻訳する（配列ＩＤ番号７、Ｓ．Ｉ．Ｎ．：４）。オリゴヌクレオチドを合成して、あらかじめＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化しておいたベクターｐＬＩＳＣ−ＳＥ中に連結する。

　これと平行して、マウスＩｇＧ３の上部ヒンジ領域の配列とこれに続くｆｏｓタンパク質のジッパー配列の配列（Ｏ’Ｓｈｅａら、　１９９２、　Ｃｅｌｌ　６８、　６９９〜７０８）を、頻用される大腸菌コドン中に戻し翻訳する（配列ＩＤ番号９、Ｓ．Ｉ．Ｎ．：５）。オリゴヌクレオチドを合成して、あらかじめＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化しておいたベクターｐＬＩＳＣ−ＳＥ中に連結する。このようにして、二つのベクターはそれぞれ異なる抗体ｓｃＦｖフラグメントとそれに続くヒンジペプチドおよび異なるロイシンジッパーペプチドをコードする。二つのｓｃＦｖフラグメントを共発現するために、ｆｏｓを含む産生物の全ｓｃＦｖ−ヒンジ−ジッパー遺伝子をベクターからＸｂａＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントとして切り出して、既に他方の抗体のｓｃＦｖ遺伝子を含んでいるベクターｐＬＩＳＣ−ＳＥ−ｓｃＦｖ−ｊｕｎ中に連結する。

　次いで、新たに得られたベクターによってｓｃＦｖ₁−リンカー₁−ｆｏｓ−ジッパーおよびｓｃＦｖ₂−リンカー₂−ｊｕｎ−ジッパーが二シストロンオペロンとして単一のプロモーターから発現される。

　ｆｏｓおよびｊｕｎジッパーに関してヒンジ領域が改善された配列を配列ＩＤ番号１３（Ｓ．Ｉ．Ｎ．：７）および配列ＩＤ番号１１（Ｓ．Ｉ．Ｎ．：６）に示す。このヒンジはより短くて、したがってタンパク質加水分解を受けにくい。二つの結合部位間の距離があまり重要ではない場合には、そのように短くなったヒンジは有利である。この場合には、ｓｃＦｖフラグメントの「尾」が短くなり、挿入ペプチドのための遺伝子を受けるＥｃｏＲＩ部位は４残基分上流に移動している。

　［実施例５］：二価ミニ抗体の大腸菌からの精製
　実施例２および３のようにして構築されたプラスミドを取り込んだ大腸菌ＪＭ８３を０．５のＯＤ₅₅₀にまで増殖させて、最終濃度１ｍＭのＩＰＴＧを用いて誘導する。細胞を遠心分離して、ＢＢＳ緩衝液（２００ｍＭホウ酸ナトリウム、１６０ｍＭ　ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に再懸濁させて、懸濁液をフレンチプレスに通す。これらの例においては、ホスホリルコリン結合ミニ抗体を用いる。ミニ抗体をホスホリルコリン・アフィニティー・クロマトグラフィーを通して記述されたようにして精製する（ＣｈｅｓｅｂｒｏおよびＭｅｔｚｇｅｒ、　１９７２、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１１、　７６６〜７７１）。

　［実施例６］：二特異性ミニ抗体の大腸菌からの精製
　実施例２および３のようにして構築されて、二つの異なるｓｃＦｖのための二シストロン構造遺伝子を含むプラスミド（第２図）を取り込んだ大腸菌ＪＭ８３を０．５のＯＤ₅₅₀にまで増殖させて、最終濃度１ｍＭのＩＰＴＧを用いて誘導する。細胞を遠心分離して、ＢＢＳ緩衝液（２００ｍＭホウ酸ナトリウム、１６０ｍＭ　ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に再懸濁させて、懸濁液をフレンチプレスに通す。これらの例において、ホスホリルコリンに対する特異性およびベンゾイル−アンピシリンの両者を含む二特異性ミニ抗体を用いる。ミニ抗体をホスホリルコリン・アフィニティー・クロマトグラフィーを通して記述されたようにして精製する（ＣｈｅｓｅｂｒｏおよびＭｅｔｚｇｅｒ、１９７２、前出）。

　［実施例７］：二価ミニ抗体の表面結合
　ＥＬＩＳＡ−プレート（Ｎｕｎｃ、Ｍａｃｒｏｓｏｒｐ社製）を４００μｇ／ｍｌのホスホコリン−ＢＳＡのＰＢＳ緩衝液（２０ｍＭ　リン酸塩、ｐＨ７．２、１１５ｍＭ　ＮａＣｌ）溶液で被覆した。ハプテン試薬をニトロフェニルホスホコリン（シグマ製）から調製したが、これは還元されて、本質的には記述（ＣｈｅｓｅｂｒｏおよびＭｅｔｚｇｅｒ、１９７２、前出）のようにしてジアゾ化して、ホウ酸塩−生理食塩緩衝液（５２．５ｍＭ　ホウ酸ナトリウム、ｐＨ９、１２０ｍＭ　ＮａＣｌ）中で４℃で４８時間ＢＳＡ（シグマ社製）とアゾ−カップリング反応させた後、ＰＢＳに対して透析した。非被覆プレート表面を５％の脱脂乳（ネッスル社製）ＰＢＳ緩衝液溶液で少なくとも２時間ブロックした後、ペリプラズム抽出物または精製タンパク質をＢＢＳ緩衝液中でプレート上で９０分間室温でインキュベートした。徹底的に洗浄（３回）した後、残存する官能基抗体フラグメントを標準法（ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、　１９８８、　「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ」、　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　５５５〜５９２）によってＧａｌｌａｔｉ（１９７９、　Ｃｌｉｎ．　Ｃｈｅｍ．　Ｃｌｉｎ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　１７、　１〜４）によってペルオキシダーゼ（シグマ社製）に結合したウサギ抗ＭｃＰＣ６０３血清および抗ウサギ免疫グロブリンを用いて検出した。

　全てのミニ抗体構成体に関して、単量体ｓｃＦｖフラグメントと比較して、結合性したがって感受性の著しい向上が認められる。これは、二つまたはより以上の結合部位の同じ表面への同時結合と一致する。融合タンパク質ｓｃＧＨｘｃのこれらの親和性は、天然の抗体ＭｃＰＣ６０３に匹敵し、抗原−被覆ＥＬＩＳＡで検出された。一方、単量体ｓｃＦｖフラグメントはそれより１００倍高い濃度でしか検出されなかった（第３ａおよびｂ図）。全ての結合は、単量体ｓｃＦｖフラグメントを除いては、可溶性ハプテンでほぼ全面的に抑制された。天然の抗体の可溶性ホスホコリンへの熱力学的親和性は、約１．６×１０⁵　Ｍ^-1であって、比較的弱く（Ｍｅｔｚｅｒら、　１９７１、　Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　１^st　Ｃｏｎｇｒｅｓｓ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　２５３〜２６７）、これは明らかに単量体フラグメント−ハプテン複合体が官能基ＥＬＩＳＡの繰り返しの洗浄工程に耐えるには充分ではない（ＫｅｍｅｎｙおよびＣｈａｌｌａｃｏｍｂｅ、　１９８８、　「ＥＬＩＳＡおよび他の固相イムノアッセイ」、　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）。

　［実施例８］：二官能基ミニ抗体の表面結合
　ホスホコリンを一方の腕で、リゾチームを他方の腕で認識する共発現された二官能基ミニ抗体を、ホスホコリン（ＰＣ）アフィニティー・クロマトグラフィーによって精製して、リゾチーム特異性を調べた。ＥＬＩＳＡ−プレートをリゾチームで被覆して、ＥＬＩＳＡを実施例７と同様に行った。三つの異なる調製物が抗原表面への結合を示したが、これは可溶性リゾチームで完全に阻害された（第４図）。

　ＳＥＱＵＥＮＣＥ　ＬＩＳＴＩＮＧ：
ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１
ACCCGACACC ATCGAATGGC GCAAAACCTT TCGCGGTATG GCATGATAGC 50
GCCCGGAAGA GAGTCAATTC AGGGTGGTGA ATGTGAAACC AGTAACGTTA 100
TACGATGTCG CAGAGTATGC CGGTGTCTCT TATCAGACCG TTTCCCGCGT 150
GGTGAACCAG GCCAGCCACG TTTCTGCGAA AACGCGGGAA AAAGTGGAAG 200
CGGCGATGGC GGAGCTGAAT TACATTCCCA ACCGCGTGGC ACAACAACTG 250
GCGGGCAAAC AGTCGTTGCT GATTGGCGTT GCCACCTCCA GTCTGGCCCT 300
GCACGCGCCG TCGCAAATTG TCGCGGCGAT TAAATCTCGC GCCGATCAAC 350
TGGGTGCCAG CTGTGTGGTG TCGATGGTAG AACGAAGCGG CGTCGAAGCC 400
TGTAAAGCGG CGGTGCACAA TCTTCTCGCG CAACGCGTCA GTGGGCTGAT 450
CATTAACTAT CCGCTGGATG ACCAGGATGC CATTGCTGTG GAAGCTGCCT 500
GCACTAATGT TCCGGCGTTA TTTCTTGATG TCTCTGACCA GACACCCATC 550
AACAGTATTA TTTTCTCCCA TGAAGACGGT ACGCGACTGG GCGTGGAGCA 600
TCTGGTCGCA TTGGGTCACC AGCAAATCGC GCTGTTAGCG GGCCCATTAA 650
GTTCTGTCTC GGCGCGTCTG CGTCTGGCTG GCTGGCATAA ATATCTCACT 700
CGCAATCAAA TTCAGCCGAT AGCGGAACGG GAAGGCGACT GGAGTGCCAT 750
GTCCGGTTTT CAACAAACCA TGCAAATGCT GAATGAGGGC ATCGTTCCCA 800
CTGCGATGCT GGTTGCCAAC GATCAGATGG CGCTGGGCGC AATGCGCGCC 850
ATTACCGAGT CCGGGCTGCG CGTTGGTGCG GATGTCTCGG TAGTGGGATA 900
CGCAGATACC GAAGACAGCT CATGTTATAT CCCGCCGTTA ACCACCATCA 950
AACAGGATTT TCGCCTGCTG GGGCAAACCA GCGTGGACCG CTTGCTGCAA 1000
CTCTCTCAGG GCCAGGCGGT GAAGGGCAAT CAGCTGTTGC CCGTCTCACT 1050
GGTGAAAAGA AAAACCACCC TGGCGCCCAA TACGCAAACC GCCTCTCCCC 1100
GCGCGTTGGC CGATTCATTA ATGCAGCTGG CACGACAGGT TTCCCGACTG 1150
GAAAGCGGGC AGTGAGCGCA ACGCAATTAA TGTGAGTTAG CTCACTCATT 1200
AGGCACCCCA GGCTTTACAC TTTATGCTTC CGGCTCGTAT GTTGTGTGGA 1250
ATTGTGAGCG GATAACAATT TCACACAGGA AACAGCTATG ACCATGATTA 1300
CGAATTTCTA GATAACGAGG GCAAAAA--- ATG AAA AAG ACA GCT ATC 1345
Met Lys Lys Thr Ala Ile
1 5
GCG ATT GCA GTG GCA CTG GCT GGT TTC GCT ACC GTA GCG CAG 1387
Ala Ile Ala Val Ala Leu Ala Gly Phe Ala Thr Val Ala Gln
10 15 20
GCC GAA GTT AAA CTG GTA GAG TCT GGT GGT GGT CTG GTA CAG 1429
Ala Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
25 30
CCG GGT GGA TCC CTG CGT CTG TCT TGC GCT ACC TCA GGT TTC 1471
Pro Gly Gle Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe
35 40 45
ACC TTC TCT GAC TTC TAC ATG GAG TGG GTA CGT CAG CCC CCG 1513
Thr Phe Ser Asp Phe Tyr Met Glu Trp Val Arg Gln Pro Pro
50 55 60
GGT AAA CGT CTC GAG TGG ATC GCA GCT AGC CGT AAC AAA GGT 1555
Gly Lys Arg Leu Glu Trp Ile Ala Ala Ser Arg Asn Lys Gly
65 70 75
AAC AAG TAT ACC ACC GAA TAC AGC GCT TCT GTT AAA GGT CGT 1597
Asn Lys Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala Ser Val Lys Gly Arg
80 85 90
TTC ATC GTT TCT CGT GAC ACT AGT CAA TCG ATC CTG TAC CTG 1639
Phe Ile Val Ser Arg Asp Thr Ser Gln Ser Ile Leu Tyr Leu
95 100
CAG ATG AAT GCA TTG CGT GCT GAA GAC ACC GCT ATC TAC TAC 1681
Gln Met Asn Ala Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr
105 110 115
TGC GCG CGT AAC TAC TAT GGC AGC ACT TGG TAC TTC GAC GTT 1723
Cys Ala Arg Asn Tyr Tyr Gly Ser Thr Trp Tyr Phe Asp Val
120 125 130
TGG GGT GCA GGT ACC ACC GTT ACC GTT TCT TCT GGT GGT GGT 1765
Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly
135 140 145
GGT TCT GGT GGT GGT GGT TCT GGT GGT GGT GGT TCT GAT ATC 1807
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile
150 155 160
GTT ATG ACC CAG TCT CCG AGC TCT CTG TCT GTA TCT GCA GGT 1849
Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Val Ser Ala Gly
165 170
GAA CGT GTT ACC ATG TCT TGC AAA TCT TCT CAG TCT CTG CTG 1891
Glu Arg Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu
175 180 185
AAC TCT GGT AAC CAG AAA AAC TTC CTG GCG TGG TAT CAG CAA 1933
Asn Ser Gly Asn Gln Lys Asn Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln
190 195 200
AAG CCT GGC CAA CCG CCG AAA CTG CTG ATC TAC GGT GCG TCG 1975
Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser
205 210 215
ACC CGT GAA TCT GGT GTT CCG GAC CGT TTT ACC GGT AGC GGT 2017
Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly
220 225 230
AGC GGT ACC GAC TTC ACT CTG ACC ATC TCT TCT GTA CAG GCT 2059
Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala
235 240
GAA GAT CTG GCT GTT TAC TAC TGT CAA AAC GAC CAC TCT TAC 2101
Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn Asp His Ser Tyr
245 250 255
CCG CTG ACC TTT GGC GCC GGC ACC AAA CTG GAA CTG AAG CGC 2143
Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg
260 265 270
GCT AAC GGT GAA TTC TGATAAGCTT GACCTGTGAA GTGAAAAATGGC 2190
Ala Asn Gly Glu Phe *
275
GCACATTGTG CGACATTTTT TTTGTCTGCC GTTTACCGCT ACTGCGTCAC 2240
GGATCCCCAC GCGCCCTGTA GCGGCGCATT AAGCGCGGCG GGTGTGGTGG 2290
TTACGCGCAG CGTGACCGCT ACACTTGCCA GCGCCCTAGC GCCCGCTCCT 2340
TTCGCTTTCT TCCCTTCCTT TCTCGCCACG TTCGCCGGCT TTCCCCGTCA 2390
AGCTCTAAAT CGGGGCATCC CTTTAGGGTT CCGATTTAGT GCTTTACGGC 2440
ACCTCGACCC CAAAAAACTT GATTAGGGTG ATGGTTCACG TAGTGGGCCA 2490
TCGCCCTGAT AGACGGTTTT TCGCCCTTTG ACGTTGGAGT CCACGTTCTT 2540
TAATAGTGGA CTCTTGTTCC AAACTGGAAC AACACTCAAC CCTATCTCGG 2590
TCTATTCTTT TGATTTATAA GGGATTTTGC CGATTTCGGC CTATTGGTTA 2640
AAAAATGAGC TGATTTAACA AAAATTTAAC GCGAATTTTA ACAAAATATT 2690
AACGTTTACA ATTTCAGGTG GCACTTTTCG GGGAAATGTG CGCGGAACCC 2740
CTATTTGTTT ATTTTTCTAA ATACATTCAA ATATGTATCC GCTCATGAGA 2790
CAATAACCCT GATAAATGCT TCAATAATAT TGAAAAAGGA AGAGTATGAG 2840
TATTCAACAT TTCCGTGTCG CCCTTATTCC CTTTTTTGCG GCATTTTGCC 2890
TTCCTGTTTT TGCTCACCCA GAAACGCTGG TGAAAGTAAA AGATGCTGAA 2940
GATCAGTTGG GTGCACGAGT GGGTTACATC GAACTGGATC TCAACAGCGG 2990
TAAGATCCTT GAGAGTTTTC GCCCCGAAGA ACGTTTTCCA ATGATGAGCA 3040
CTTTTAAAGT TCTGCTATGT GGCGCGGTAT TATCCCGTAT TGACGCCGGG 3090
CAAGAGCAAC TCGGTCGCCG CATACACTAT TCTCAGAATG ACTTGGTTGA 3140
GTACTCACCA GTCACAGAAA AGCATCTTAC GGATGGCATG ACAGTAAGAG 3190
AATTATGCAG TGCTGCCATA ACCATGAGTG ATAACACTGC GGCCAACTTA 3240
CTTCTGACAA CGATCGGAGG ACCGAAGGAG CTAACCGCTT TTTTGCACAA 3290
CATGGGGGAT CATGTAACTC GCCTTGATCG TTGGGAACCG GAGCTGAATG 3340
AAGCCATACC AAACGACGAG CGTGACACCA CGATGCCTGT AGCAATGGCA 3390
ACAACGTTGC GCAAACTATT AACTGGCGAA CTACTTACTC TAGCTTCCCG 3440
GCAACAATTA ATAGACTGGA TGGAGGCGGA TAAAGTTGCA GGACCACTTC 3490
TGCGCTCGGC CCTTCCGGCT GGCTGGTTTA TTGCTGATAA ATCTGGAGCC 3540
GGTGAGCGTG GGTCTCGCGG TATCATTGCA GCACTGGGGC CAGATGGTAA 3590
GCCCTCCCGT ATCGTAGTTA TCTACACGAC GGGGAGTCAG GCAACTATGG 3640
ATGAACGAAA TAGACAGATC GCTGAGATAG GTGCCTCACT GATTAAGCAT 3690
TGGTAACTGT CAGACCAAGT TTACTCATAT ATACTTTAGA TTGATTTAAA 3740
ACTTCATTTT TAATTTAAAA GGATCTAGGT GAAGATCCTT TTTGATAATC 3790
TCATGACCAA AATCCCTTAA CGTGAGTTTT CGTTCCACTG AGCGTCAGAC 3840
CCCGTAGAAA AGATCAAAGG ATCTTCTTGA GATCCTTTTT TTCTGCGCGT 3890
AATCTGCTGC TTGCAAACAA AAAAACCACC GCTACCAGCG GTGGTTTGTT 3940
TGCCGGATCA AGAGCTACCA ACTCTTTTTC CGAAGGTAAC TGGCTTCAGC 3990
AGAGCGCAGA TACCAAATAC TGTCCTTCTA GTGTAGCCGT AGTTAGGCCA 4040
CCACTTCAAG AACTCTGTAG CACCGCCTAC ATACCTCGCT CTGCTAATCC 4090
TGTTACCAGT GGCTGCTGCC AGTGGCGATA AGTCGTGTCT TACCGGGTTG 4140
GACTCAAGAC GATAGTTACC GGATAAGGCG CAGCGGTCGG GCTGAACGGG 4190
GGGTTCGTGC ACACAGCCCA GCTTGGAGCG AACGACCTAC ACCGAACTGA 4240
GATACCTACA GCGTGAGCTA TGAGAAAGCG CCACGCTTCC CGAAGGGAGA 4290
AAGGCGGACA GGTATCCGGT AAGCGGCAGG GTCGGAA AG GAGAGCGCAC 4340
GAGGGAGCTT CCAGGGGGAA ACGCCTGGTA TCTTTATAGT CCTGTCGGGT 4390
TTCGCCACCT CTGACTTGAG CGTCGATTTT TGTGATGCTC GTCAGGGGGG 4440
CGGAGCCTAT GGAAAAACGC CAGCAACGCG GCCTTTTTAC GGTTCCTGGC 4490
CTTTTGCTGG CCTTTTGCTC ACATG 4515

ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２
GGT GAA TTC CCC AAA CCT AGT ACT CCC CCT GGC AGC AGC CGC ATG 45
Gly Glu Phe Pro Lys Pro Ser Thr Pro Pro Gly Ser Ser Arg Met
1 ↑ 5 10 15
←----Ig3-hinge-----------------------→ ←-----
AAA CAG CTG GAA GAT AAA GTT GAA GAG CTT CTT TCG AAA AAC TAC 90
Lys Gln Leu Glu Asp Lys Val Glu Glu Leu Leu Ser Lys Asn Tyr
20 25 30
------------------GCN4-zipper------------------------------
CAC CTC GAA AAT GAA GTT GCG CGC CTC AAA AAA CTT GTT GGT GAA 135
His Leu Glu Asn Glu Val Ala Arg Leu Lys Lys Leu Val Gly Glu
35 40 45
------------------GCN4-zipper------------------------------
CGC TGATAAGCTT GAC 151
Arg ↑

-→ stop

ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３
GGT GAA TTC CCC AAA CCT AGC ACC CCC CCT GGC AGC AGT GGT GAA 45
Gly Glu Phe Pro Lys Pro Ser Thr Pro Pro Gly Ser Ser Glu Glu
1 ↑ 5 10 15
←----Ig3-hinge-----------------------→ ←-----
CTG GAA GAG CTG CTT AAG CAT CTT AAA GAA CTT CTG AAG GGC CCC 90
Leu Glu Glu Leu Leu Lys His Leu Lys Glu Leu Leu Lys Gly Pro
20 25 30
-------------boundle-helix A---------------------→ ←-----
CGC AAA GGC GAA CTC GAG GAA CTG CTG AAA CAT CTG AAG GAG CTG 135
Arg Lys Gly Glu Leu Glu Glu Leu Leu Lys His Leu Lys Glu Leu
35 40 45
-turn→ ←-------------boundle-helix B---------------------
CTT AAA GGT GAA TTC TGATAAGCTT GACCTGTGAA GTGAAAAAAT G 181
Leu Lys Gly Glu Phe ↑
50
-----------------→ stop

ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４
GGT GAA TTC CCC AAA CCT AGT ACT CCC CCT GGC AGC AGC CGT ATC 45
Gly Glu Phe Pro Lys Pro Ser Thr Pro Pro Gly Ser Ser Arg Ile
1 ↑ 5 10 15
←----Ig3-hinge-----------------------→ ←-----
GCT CGT CTC GAG GAA AAA GTT AAA ACC CTG AAA GCT CAG AAC TCC 90
Ala Arg Leu Glu Glu Lys Val Lys Thr Leu Lys Ala Gln Asn Ser
20 25 30
------------------jun-zipper--------------------------------
GAA CTG GCT TCC ACC GCT AAC ATG CTG CGT GAA CAG GTT GCT CAG 135
Glu Leu Ala Ser Thr Ala Asn Met Leu Arg Glu Gln Val Ala Gln
35 40 45
------------------jun-zipper--------------------------------
CTG AAA CAG AAA GTT ATG AAC TAC TGATAAGCTT GACCTGTGAA G 180
Leu Lys Gln Lys Val Met Asn Tyr ↑
50
-----------------------------→ stop

ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５
GGT GAA TTC CCC AAA CCT AGT ACT CCC CCT GGC AGC AGC CTG ACC 45
Gly Glu Phe Pro Lys Pro Ser Thr Pro Pro Gly Ser Ser Leu Thr
1 ↑ 5 10 15
←----Ig3-hinge-----------------------→ ←-----
GAC ACC CTG CAG GCT GAA ACC GAC CAG CTG GAA GAC AAA AAA TCC 90
Asp Thr Leu Gln Ala Glu Thr Asp Gln Leu Glu Asp Lys Lys Ser
20 25 30
------------------fos-zipper--------------------------------
GCT CTG CAG ACC GAA ATC GCT AAC CTG CTG AAA GAA AAA GAA AAA 135
Ala Leu Gln Thr Glu Ile Ala Asn Leu Leu Lys Glu Lys Glu Lys
35 40 45
------------------fos-zipper--------------------------------
CTG GAA TTT ATC CTG GCT GCT TAC TGATAAGCTT GACCTGTGAA G 180
Leu Glu Phe Ile Leu Ala Ala Tyr ↑
50
-----------------------------→ stop

ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６
GGT GAA TTC CCG TCT GGT AAC GAA GCT CGT ATC GCT CGT CTC GAG 45
Gly Glu Phe Pro Ser Gly Asn Glu Ala Arg Ile Ala Arg Leu Glu
1 ↑ 5 10 15
←----linker---------→ ←----jun-zipper--------
GAA AAA GTT AAA ACC CTG AAA GCT CAG AAC TCC GAA CTG GCT TCC 90
Glu Lys Val Lys Thr Leu Lys Ala Gln Asn Ser Glu Leu Ala Ser
20 25 30
------------------jun-zipper--------------------------------
ACC GCT AAC ATG CTG CGT GAA CAG GTT GCT CAG CTG AAA CAG AAA 135
Thr Ala Asn Met Leu Arg Glu Gln Val Ala Gln Leu Lys Gln Lys

35 40 45
------------------jun-zipper--------------------------------
GTT ATG AAC TAC TGATAAGCTT GACCTGTGAA GTGAAAAATG GCG 180
Val Met Asn Tyr ↑
-------------→ stop

ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：７
GGT GAA TTC GGT CCG TCT GGT AAC GAA CTG ACC GAC ACC CTG CAG 45
Gly Glu Phe Gly Pro Ser Gly Asn Glu Leu Thr Asp Thr Leu Gln

1 ↑ 5 10 15
←----linker---------→ ←----fos-zipper--------
GCT GAA ACC GAC CAG CTG GAA GAC AAA AAA TCC GCT CTG CAG ACC 90
Ala Glu Thr Asp Gln Leu Glu Asp Lys Lys Ser Ala Leu Gln Thr
20 25 30
------------------fos-zipper--------------------------------
GAA ATC GCT AAC CTG CTG AAA GAA AAA GAA AAA CTG GAA TTT ATC 135
Glu Ile Ala Asn Leu Leu Lys Glu Lys Glu Lys Leu Glu Phe Ile
35 40 45
------------------fos-zipper--------------------------------
CTG GCT GCT TAC TGATAAGCTT GACCTGTGAA GTGAAAAATG GCG 180
Leu Ala Ala Tyr ↑
-------------→ stop

　　［配列表］
（１）一般的情報
（ｉ）出願者
（Ａ）名称：メルク・パテント・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフトング
（Ｂ）町名：フランクフルター・シュトラーセ２５０
（Ｃ）都市：デー−６１００ダルムシュタット１
（Ｅ）国名：ドイツ
（Ｆ）郵便番号（ＺＩＰ）：４１１９
（Ｇ）電話：０６１５１　７２　７０２２
（Ｈ）テレファックス：０６１５１　７２　７１９１
（ｉｉ）発明の名称：単量体および二量体抗体フラグメント融合タンパク質
（ｉｉｉ）配列の数：１４
（ｉｖ）コンピュータ解読方式
（Ａ）媒体：フロッピーディスク
（Ｂ）コンピュータ：ＩＢＭ・ＰＣコンパティブル
（Ｃ）オペレーティング・システム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ
（Ｄ）ソフトウェア：ＰｅｔｅｎｔＩｎ　Ｒｅｌｅａｓｅ　＃１．０、バージョン＃１．２５（ＥＰＯ）
（ｖ）現在の出願データ：
　出願番号：ＷＯ　９３−０００８２
（２）配列ＩＤ番号１に関する情報：
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）長さ：４５１５塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：環状
（ｉｉ）分子の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
（ｉｉｉ）仮定：無
（ｉｉｉ）アンチセンス：無
（ｖ）フラグメント型：Ｎ−末端
（ｖｉ）起源：
（Ａ）生体：合成、大腸菌およびネズミ起源
（ｖｉｉ）材料：
（Ｂ）クローン：ｐＬＩＳＣ−ＳＥ
（ｉｘ）性質：
（Ａ）名称／キー：ＣＤＳ
（Ｂ）位置：１３２８．．２１５８
（Ｄ）その他の情報：／産生物＝「一本鎖Ｆｖフラグメント（抗体）」
／記＝「ｐＬＩＳＣ−ＳＥベクターの完全配列」
（ｘ）文献情報：
（Ａ）著者：Ｐｌａｃｋ、Ｐｅｔｅｒ
　　　　　　Ｐｌｅｕｃｋｔｈｕｎ、Ａｎｄｒｅａｓ
（Ｂ）表題：Ｍｉｎａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：　Ｕｓｅ　ｏｆ　Ａｍｐｈｉｐｈａｔｉｃ　Ｈｅｌｉｃｅｓ　ｔｏ　Ｐｒｏｄｕｃｅ　Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ，　Ｆｌｅｘｉｂｌｙ　Ｌｉｎｋｅｄ　Ｄｉｍｅｒｉｃ　Ｆｖ　Ｆｒａｇｍｅｎｔ　ｗｉｔｈ　Ｈｉｇｈ　Ａｖｉｄｉｔｙ　ｉｎ　Ｅ．　ｃｏｌｉ
（Ｃ）雑誌：Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
（Ｄ）巻：３１
（Ｅ）号：６
（Ｆ）頁：１５７９〜１５８４
（Ｇ）時：１９９２
（ｘｉ）配列：配列ＩＤ番号１：
ACCCGACACC ATCGAATGGC GCAAAACCTT TCGCGGTATG GCATGATAGC GCCCGGAAGA 60

GAGTCAATTC AGGGTGGTGA ATGTGAAACC AGTAACGTTA TACGATGTCG CAGAGTATGC 120

CGGTGTCTCT TATCAGACCG TTTCCCGCGT GGTGAACCAG GCCAGCCACG TTTCTGCGAA 180

AACGCGGGAA AAAGTGGAAG CGGCGATGGC GGAGCTGAAT TACATTCCCA ACCGCGTGGC 240

ACAACAACTG GCGGGCAAAC AGTCGTTGCT GATTGGCGTT GCCACCTCCA GTCTGGCCCT 300

GCACGCGCCG TCGCAAATTG TCGCGGCGAT TAAATCTCGC GCCGATCAAC TGGGTGCCAG 360

CTGTGTGGTG TCGATGGTAG AACGAAGCGG CGTCGAAGCC TGTAAAGCGG CGGTGCACAA 420

TCTTCTCGCG CAACGCGTCA GTGGGCTGAT CATTAACTAT CCGCTGGATG ACCAGGATGC 480

CATTGCTGTG GAAGCTGCCT GCACTAATGT TCCGGCGTTA TTTCTTGATG TCTCTGACCA 540

GACACCCATC AACAGTATTA TTTTCTCCCA TGAAGACGGT ACGCGACTGG GCGTGGAGCA 600

TCTGGTCGCA TTGGGTCACC AGCAAATCGC GCTGTTAGCG GGCCCATTAA GTTCTGTCTC 660

GGCGCGTCTG CGTCTGGCTG GCTGGCATAA ATATCTCACT CGCAATCAAA TTCAGCCGAT 720

AGCGGAACGG GAAGGCGACT GGAGTGCCAT GTCCGGTTTT CAACAAACCA TGCAAATGCT 780

GAATGAGGGC ATCGTTCCCA CTGCGATGCT GGTTGCCAAC GATCAGATGG CGCTGGGCGC 840

AATGCGCGCC ATTACCGAGT CCGGGCTGCG CGTTGGTGCG GATGTCTCGG TAGTGGGATA 900

CGCAGATACC GAAGACAGCT CATGTTATAT CCCGCCGTTA ACCACCATCA AACAGGATTT 960

TCGCCTGCTG GGGCAAACCA GCGTGGACCG CTTGCTGCAA CTCTCTCAGG GCCAGGCGGT 1020

GAAGGGCAAT CAGCTGTTGC CCGTCTCACT GGTGAAAAGA AAAACCACCC TGGCGCCCAA 1080

TACGCAAACC GCCTCTCCCC GCGCGTTGGC CGATTCATTA ATGCAGCTGG CACGACAGGT 1140

TTCCCGACTG GAAAGCGGGC AGTGAGCGCA ACGCAATTAA TGTGAGTTAG CTCACTCATT 1200

AGGCACCCCA GGCTTTACAC TTTATGCTTC CGGCTCGTAT GTTGTGTGGA ATTGTGAGCG 1260

GATAACAATT TCACACAGGA AACAGCTATG ACCATGATTA CGAATTTCTA GATAACGAGG 1320

GCAAAAA ATG AAA AAG ACA GCT ATC GCG ATT GCA GTG GCA CTG GCT GGT 1369
Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile Ala Val Ala Leu Ala Gly
1 5 10

TTC GCT ACC GTA GCG CAG GCC GAA GTT AAA CTG GTA GAG TCT GGT GGT 1417
Phe Ala Thr Val Ala Gln Ala Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly
15 20 25 30

GGT CTG GTA CAG CCG GGT GGA TCC CTG CGT CTG TCT TGC GCT ACC TCA 1465
Gly Leu Val Gln Pro Gly Gle Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser
35 40 45

GGT TTC ACC TTC TCT GAC TTC TAC ATG GAG TGG GTA CGT CAG CCC CCG 1513
Gly Phe Thr Phe Ser Asp Phe Tyr Met Glu Trp Val Arg Gln Pro Pro
50 55 60

GGT AAA CGT CTC GAG TGG ATC GCA GCT AGC CGT AAC AAA GGT AAC AAG 1561
Gly Lys Arg Leu Glu Trp Ile Ala Ala Ser Arg Asn Lys Gly Asn Lys
65 70 75

TAT ACC ACC GAA TAC AGC GCT TCT GTT AAA GGT CGT TTC ATC GTT TCT 1609
Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala Ser Val Lys Gly Arg Phe Ile Val Ser
80 85 90

CGT GAC ACT AGT CAA TCG ATC CTG TAC CTG CAG ATG AAT GCA TTG CGT 1657
Arg Asp Thr Ser Gln Ser Ile Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ala Leu Arg
95 100 105 110

GCT GAA GAC ACC GCT ATC TAC TAC TGC GCG CGT AAC TAC TAT GGC AGC 1705
Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Arg Asn Tyr Tyr Gly Ser
115 120 125

ACT TGG TAC TTC GAC GTT TGG GGT GCA GGT ACC ACC GTT ACC GTT TCT 1753
Thr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser
130 135 140

TCT GGT GGT GGT GGT TCT GGT GGT GGT GGT TCT GGT GGT GGT GGT TCT 1801
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
145 150 155

GAT ATC GTT ATG ACC CAG TCT CCG AGC TCT CTG TCT GTA TCT GCA GGT 1849
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Val Ser Ala Gly
160 165 170

GAA CGT GTT ACC ATG TCT TGC AAA TCT TCT CAG TCT CTG CTG AAC TCT 1897
Glu Arg Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
175 180 185 190

GGT AAC CAG AAA AAC TTC CTG GCG TGG TAT CAG CAA AAG CCT GGC CAA 1945
Gly Asn Gln Lys Asn Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
195 200 205

CCG CCG AAA CTG CTG ATC TAC GGT GCG TCG ACC CGT GAA TCT GGT GTT 1993
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
210 215 220

CCG GAC CGT TTT ACC GGT AGC GGT AGC GGT ACC GAC TTC ACT CTG ACC 2041
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
225 230 235

ATC TCT TCT GTA CAG GCT GAA GAT CTG GCT GTT TAC TAC TGT CAA AAC 2089
Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn
240 245 250

GAC CAC TCT TAC CCG CTG ACC TTT GGC GCC GGC ACC AAA CTG GAA CTG 2137
Asp His Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu
255 260 265 270

AAG CGC GCT AAC GGT GAA TTC TGATAAGCTT GACCTGTGAA GTGAAAAATG 2188
Lys Arg Ala Asn Gly Glu Phe
275

GCGCACATTG TGCGACATTT TTTTTGTCTG CCGTTTACCG CTACTGCGTC ACGGATCCCC 2248

ACGCGCCCTG TAGCGGCGCA TTAAGCGCGG CGGGTGTGGT GGTTACGCGC AGCGTGACCG 2308

CTACACTTGC CAGCGCCCTA GCGCCCGCTC CTTTCGCTTT CTTCCCTTCC TTTCTCGCCA 2368

CGTTCGCCGG CTTTCCCCGT CAAGCTCTAA ATCGGGGCAT CCCTTTAGGG TTCCGATTTA 2428

GTGCTTTACG GCACCTCGAC CCCAAAAAAC TTGATTAGGG TGATGGTTCA CGTAGTGGGC 2488

CATCGCCCTG ATAGACGGTT TTTCGCCCTT TGACGTTGGA GTCCACGTTC TTTAATAGTG 2548

GACTCTTGTT CCAAACTGGA ACAACACTCA ACCCTATCTC GGTCTATTCT TTTGATTTAT 2608

AAGGGATTTT GCCGATTTCG GCCTATTGGT TAAAAAATGA GCTGATTTAA CAAAAATTTA 2668

ACGCGAATTT TAACAAAATA TTAACGTTTA CAATTTCAGG TGGCACTTTT CGGGGAAATG 2728

TGCGCGGAAC CCCTATTTGT TTATTTTTCT AAATACATTC AAATATGTAT CCGCTCATGA 2788

GACAATAACC CTGATAAATG CTTCAATAAT ATTGAAAAAG GAAGAGTATG AGTATTCAAC 2848

ATTTCCGTGT CGCCCTTATT CCCTTTTTTG CGGCATTTTG CCTTCCTGTT TTTGCTCACC 2908

CAGAAACGCT GGTGAAAGTA AAAGATGCTG AAGATCAGTT GGGTGCACGA GTGGGTTACA 2968

TCGAACTGGA TCTCAACAGC GGTAAGATCC TTGAGAGTTT TCGCCCCGAA GAACGTTTTC 3028

CAATGATGAG CACTTTTAAA GTTCTGCTAT GTGGCGCGGT ATTATCCCGT ATTGACGCCG 3088

GGCAAGAGCA ACTCGGTCGC CGCATACACT ATTCTCAGAA TGACTTGGTT GAGTACTCAC 3148

CAGTCACAGA AAAGCATCTT ACGGATGGCA TGACAGTAAG AGAATTATGC AGTGCTGCCA 3208

TAACCATGAG TGATAACACT GCGGCCAACT TACTTCTGAC AACGATCGGA GGACCGAAGG 3268

AGCTAACCGC TTTTTTGCAC AACATGGGGG ATCATGTAAC TCGCCTTGAT CGTTGGGAAC 3328

CGGAGCTGAA TGAAGCCATA CCAAACGACG AGCGTGACAC CACGATGCCT GTAGCAATGG 3388

CAACAACGTT GCGCAAACTA TTAACTGGCG AACTACTTAC TCTAGCTTCC CGGCAACAAT 3448

TAATAGACTG GATGGAGGCG GATAAAGTTG CAGGACCACT TCTGCGCTCG GCCCTTCCGG 3508

CTGGCTGGTT TATTGCTGAT AAATCTGGAG CCGGTGAGCG TGGGTCTCGC GGTATCATTG 3568

CAGCACTGGG GCCAGATGGT AAGCCCTCCC GTATCGTAGT TATCTACACG ACGGGGAGTC 3628

AGGCAACTAT GGATGAACGA AATAGACAGA TCGCTGAGAT AGGTGCCTCA CTGATTAAGC 3688

ATTGGTAACT GTCAGACCAA GTTTACTCAT ATATACTTTA GATTGATTTA AAACTTCATT 3748

TTTAATTTAA AAGGATCTAG GTGAAGATCC TTTTTGATAA TCTCATGACC AAAATCCCTT 3808

AACGTGAGTT TTCGTTCCAC TGAGCGTCAG ACCCCGTAGA AAAGATCAAA GGATCTTCTT 3868

GAGATCCTTT TTTTCTGCGC GTAATCTGCT GCTTGCAAAC AAAAAAACCA CCGCTACCAG 3928

CGGTGGTTTG TTTGCCGGAT CAAGAGCTAC CAACTCTTTT TCCGAAGGTA ACTGGCTTCA 3988

GCAGAGCGCA GATACCAAAT ACTGTCCTTC TAGTGTAGCC GTAGTTAGGC CACCACTTCA 4048

AGAACTCTGT AGCACCGCCT ACATACCTCG CTCTGCTAAT CCTGTTACCA GTGGCTGCTG 4108

CCAGTGGCGA TAAGTCGTGT CTTACCGGGT TGGACTCAAG ACGATAGTTA CCGGATAAGG 4168

CGCAGCGGTC GGGCTGAACG GGGGGTTCGT GCACACAGCC CAGCTTGGAG CGAACGACCT 4228

ACACCGAACT GAGATACCTA CAGCGTGAGC TATGAGAAAG CGCCACGCTT CCCGAAGGGA 4288

GAAAGGCGGA CAGGTATCCG GTAAGCGGCA GGGTCGGAAC AGGAGAGCGC ACGAGGGAGC 4348

TTCCAGGGGG AAACGCCTGG TATCTTTATA GTCCTGTCGG GTTTCGCCAC CTCTGACTTG 4408

AGCGTCGATT TTTGTGATGC TCGTCAGGGG GGCGGAGCCT ATGGAAAAAC GCCAGCAACG 4468

CGGCCTTTTT ACGGTTCCTG GCCTTTTGCT GGCCTTTTGC TCACATG 4515

（２）配列ＩＤ番号２に関する情報：
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）長さ：２７７アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の種類：タンパク質
（ｘｉ）配列：配列ＩＤ番号２：
Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile Ala Val Ala Leu Ala Gly Phe Ala
1 5 10 15

Thr Val Ala Gln Ala Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu
20 25 30

Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe
35 40 45

Thr Phe Ser Asp Phe Tyr Met Glu Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys
50 55 60

Arg Leu Glu Trp Ile Ala Ala Ser Arg Asn Lys Gly Asn Lys Tyr Thr
65 70 75 80

Thr Glu Tyr Ser Ala Ser Val Lys Gly Arg Phe Ile Val Ser Arg Asp
85 90 95

Thr Ser Gln Ser Ile Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ala Leu Arg Ala Glu
100 105 110

Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Arg Asn Tyr Tyr Gly Ser Thr Trp
115 120 125

Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly
130 135 140

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile
145 150 155 160

Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Val Ser Ala Gly Glu Arg
165 170 175

Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Gly Asn
180 185 190

Gln Lys Asn Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
195 200 205

Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp
210 215 220

Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
225 230 235 240

Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn Asp His
245 250 255

Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg
260 265 270

Ala Asn Gly Glu Phe
275

（３）配列ＩＤ番号３に関する情報：
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）長さ：１５１塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
（ｉｉｉ）仮定：無
（ｉｉｉ）アンチセンス：無
（ｖ）フラグメント型：Ｎ−末端
（ｖｉ）起源：
（Ａ）生体：合成（酵母＋マウス配列から推定）
（ｉｘ）性質：
（Ａ）名称／キー：ＣＤＳ
（Ｂ）位置：１．．１３８
（Ｄ）その他の情報：／産生物＝「挿入ペプチド」
／記＝「挿入ＧＣＮ４−ロイシン・ジッパーの遺伝子カセット」
（ｉｘ）性質：
（Ａ）名称／キー：その他
（Ｂ）位置：１０．．３９
（Ｄ）その他の情報：／産生物＝「免疫グロブリン接合領域」
／記＝「ＩｇＧ３−ヒンジ」
（ｉｘ）性質：
（Ａ）名称／キー：その他
（Ｂ）位置：４０．．１３８
（Ｄ）その他の情報：／産生物＝「ＧＣＮ４−ジッパー」
（ｘｉ）配列：配列ＩＤ番号３：
GGT GAA TTC CCC AAA CCT AGT ACT CCC CCT GGC AGC AGC CGC ATG AAA 48
Gly Glu Phe Pro Lys Pro Ser Thr Pro Pro Gly Ser Ser Arg Met Lys
1 5 10 15

CAG CTG GAA GAT AAA GTT GAA GAG CTT CTT TCG AAA AAC TAC CAC CTC 96
Gln Leu Glu Asp Lys Val Glu Glu Leu Leu Ser Lys Asn Tyr His Leu
20 25 30

GAA AAT GAA GTT GCG CGC CTC AAA AAA CTT GTT GGT GAA CGC 138
Glu Asn Glu Val Ala Arg Leu Lys Lys Leu Val Gly Glu Arg
35 40 45

TGATAAGCTT GAC 151

（２）配列ＩＤ番号４に関する情報：
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）長さ：４６アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の種類：タンパク質
（ｘｉ）配列：配列ＩＤ番号４：
Gly Glu Phe Pro Lys Pro Ser Thr Pro Pro Gly Ser Ser Arg Met Lys
1 5 10 15

Gln Leu Glu Asp Lys Val Glu Glu Leu Leu Ser Lys Asn Tyr His Leu
20 25 30

Glu Asn Glu Val Ala Arg Leu Lys Lys Leu Val Gly Glu Arg
35 40 45

（２）配列ＩＤ番号５に関する情報：
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）長さ：１８１塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
（ｉｉｉ）仮定：無
（ｉｉｉ）アンチセンス：無
（ｖ）フラグメント型：Ｎ−末端
（ｖｉ）起源：
（Ａ）生体：合成
（ｉｘ）性質：
（Ａ）名称／キー：ＣＤＳ
（Ｂ）位置：１．．１５０
（Ｄ）その他の情報：／産生物＝「挿入ペプチド」
／記＝「挿入逆平行ヘリックス−ターン−ヘリックスをコードする遺伝子カセット」
（ｉｘ）性質：
（Ａ）名称／キー：その他
（Ｂ）位置：１０．．３９
（Ｄ）その他の情報：／産生物＝「免疫グロブリン接合領域」
／記＝「ＩｇＧ３−ヒンジ」
（ｉｘ）性質：
（Ａ）名称／キー：その他
（Ｂ）位置：４０．．８７
（Ｄ）その他の情報：／産生物＝「ヘリックス・ペプチド」
／記＝「団−ヘリックスＡ」
（ｉｘ）性質：
（Ａ）名称／キー：その他
（Ｂ）位置：８８．．１５０
（Ｄ）その他の情報：／産生物＝「ヘリックス・ペプチド」
／記＝「団−ヘリックスＢ」
（ｘｉ）配列：配列ＩＤ番号５：
GGT GAA TTC CCC AAA CCT AGC ACC CCC CCT GGC AGC AGT GGT GAA CTG 48
Gly Glu Phe Pro Lys Pro Ser Thr Pro Pro Gly Ser Ser Glu Glu Leu
1 5 10 15

GAA GAG CTG CTT AAG CAT CTT AAA GAA CTT CTG AAG GGC CCC CGC AAA 96
Glu Glu Leu Leu Lys His Leu Lys Glu Leu Leu Lys Gly Pro Arg Lys
20 25 30

GGC GAA CTC GAG GAA CTG CTG AAA CAT CTG AAG GAG CTG CTT AAA GGT 144
Gly Glu Leu Glu Glu Leu Leu Lys His Leu Lys Glu Leu Leu Lys Gly
35 40 45

GAA TTC TGATAAGCTT GACCTGTGAA GTGAAAAAAT G 181
Glu Phe
50

（２）配列ＩＤ番号６に関する情報：
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）長さ：５０アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の種類：タンパク質
（ｘｉ）配列：配列ＩＤ番号６：
Gly Glu Phe Pro Lys Pro Ser Thr Pro Pro Gly Ser Ser Gly Glu Leu
1 5 10 15

Glu Glu Leu Leu Lys His Leu Lys Glu Leu Leu Lys Gly Pro Arg Lys
20 25 30

Gly Glu Leu Glu Glu Leu Leu Lys His Leu Lys Glu Leu Leu Lys Gly
35 40 45

Glu Phe
50

（２）配列ＩＤ番号７に関する情報：
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）長さ：１８１塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
（ｉｉｉ）仮定：無
（ｉｉｉ）アンチセンス：無
（ｖ）フラグメント型：Ｎ−末端
（ｖｉ）起源：
（Ａ）生体：合成、ヒトおよびネズミ配列から推定
（ｉｘ）性質：
（Ａ）名称／キー：ＣＤＳ
（Ｂ）位置：１．．１５９
（Ｄ）その他の情報：／産生物＝「挿入ペプチド」
／記＝「ｊｕｎ−ジッパーおよびＩｇＧ３−ヒンジ領域をコードする遺伝子カセット」
（ｉｘ）性質：
（Ａ）名称／キー：その他
（Ｂ）位置：４０．．１５９
（Ｄ）その他の情報：／産生物＝「ｊｕｎ−ジッパー」
（ｘｉ）配列：配列ＩＤ番号７：
GGT GAA TTC CCC AAA CCT AGT ACT CCC CCT GGC AGC AGC CGT ATC GCT 48
Gly Glu Phe Pro Lys Pro Ser Thr Pro Pro Gly Ser Ser Arg Ile Ala
1 5 10 15

CGT CTC GAG GAA AAA GTT AAA ACC CTG AAA GCT CAG AAC TCC GAA CTG 96
Arg Leu Glu Glu Lys Val Lys Thr Leu Lys Ala Gln Asn Ser Glu Leu
20 25 30

GCT TCC ACC GCT AAC ATG CTG CGT GAA CAG GTT GCT CAG CTG AAA CAG 144
Ala Ser Thr Ala Asn Met Leu Arg Glu Gln Val Ala Gln Leu Lys Gln
35 40 45

AAA GTT ATG AAC TAC TGATAAGCTT GACCTGTGAA G 180
Lys Val Met Asn Tyr
50

（２）配列ＩＤ番号８に関する情報：
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）長さ：５３アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の種類：タンパク質
（ｘｉ）配列：配列ＩＤ番号８：
Gly Glu Phe Pro Lys Pro Ser Thr Pro Pro Gly Ser Ser Arg Ile Ala
1 5 10 15

Arg Leu Glu Glu Lys Val Lys Thr Leu Lys Ala Gln Asn Ser Glu Leu
20 25 30

Ala Ser Thr Ala Asn Met Leu Arg Glu Gln Val Ala Gln Leu LYS Gln
35 40 45

Lys Val Met Asn Tyr
50

（２）配列ＩＤ番号９に関する情報：
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）長さ：１８０塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
（ｉｉｉ）仮定：無
（ｉｉｉ）アンチセンス：無
（ｖ）フラグメント型：Ｎ−末端
（ｖｉ）起源：
（Ａ）生体：合成、ヒトおよびネズミ配列から推定
（ｉｘ）性質：
（Ａ）名称／キー：ＣＤＳ
（Ｂ）位置：１．．１５９
（Ｄ）その他の情報：／産生物＝「挿入ペプチド」
／記＝「挿入ｆｏｓ−ジッパーおよびＩｇＧ３−ヒンジをコードする遺伝子カセット」
（ｉｘ）性質：
（Ａ）名称／キー：その他
（Ｂ）位置：１０．．３９
（Ｄ）その他の情報：／産生物＝「免疫グロブリン接合領域」
／記＝「ＩｇＧ３−ヒンジ（マウス）」
（ｉｘ）性質：
（Ａ）名称／キー：その他
（Ｂ）位置：４０．．１５９
（Ｄ）その他の情報：／産生物＝「ｆｏｓ−ジッパー」
（ｘｉ）配列：配列ＩＤ番号９：
GGT GAA TTC CCC AAA CCT AGT ACT CCC CCT GGC AGC AGC CTG ACC GAC 48
Gly Glu Phe Pro Lys Pro Ser Thr Pro Pro Gly Ser Ser Leu Thr Asp
1 5 10 15

ACC CTG CAG GCT GAA ACC GAC CAG CTG GAA GAC AAA AAA TCC GCT CTG 96
Thr Leu Gln Ala Glu Thr Asp Gln Leu Glu Asp Lys Lys Ser Ala Leu
20 25 30

CAG ACC GAA ATC GCT AAC CTG CTG AAA GAA AAA GAA AAA CTG GAA TTT 144
Gln Thr Glu Ile Ala Asn Leu Leu Lys Glu Lys Glu Lys Leu Glu Phe
35 40 45

ATC CTG GCT GCT TAC TGATAAGCTT GACCTGTGAA G 180
Ile Leu Ala Ala Tyr
50

（２）配列ＩＤ番号１０に関する情報：
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）長さ：５３アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の種類：タンパク質
（ｘｉ）配列：配列ＩＤ番号１０：
Gly Glu Phe Pro Lys Pro Ser Thr Pro Pro Gly Ser Ser Leu Thr Asp
1 5 10 15

Thr Leu Gln Ala Glu Thr Asp Gln Leu Glu Asp Lys Lys Ser Ala Leu
20 25 30

Gln Thr Glu Ile Ala Asn Leu Leu Lys Glu Lys Glu Lys Leu Glu Phe
35 40 45

Ile Leu Ala Ala Tyr
50

（２）配列ＩＤ番号１１に関する情報：
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）長さ：１８０塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
（ｉｉｉ）仮定：無
（ｉｉｉ）アンチセンス：無
（ｖ）フラグメント型：Ｎ−末端
（ｖｉ）起源：
（Ａ）生体：合成、ヒト配列から推定
（ｉｘ）性質：
（Ａ）名称／キー：ＣＤＳ
（Ｂ）位置：１．．１４７
（Ｄ）その他の情報：／産生物＝「挿入ペプチド」
／記＝「挿入ｊｕｎ−ジッパーおよびリンカーをコードする遺伝子カセット」
（ｉｘ）性質：
（Ａ）名称／キー：その他
（Ｂ）位置：１０．．２７
（Ｄ）その他の情報：／産生物＝「合成リンカー」
（ｉｘ）性質：
（Ａ）名称／キー：その他
（Ｂ）位置：２８．．１４７
（Ｄ）その他の情報：／産生物＝「ｊｕｎ−ジッパー」
（ｘｉ）配列：配列ＩＤ番号１１：
GGT GAA TTC CCG TCT GGT AAC GAA GCT CGT ATC GCT CGT CTC GAG GAA 48
Gly Glu Phe Pro Ser Gly Asn Glu Ala Arg Ile Ala Arg Leu Glu Glu
1 5 10 15

AAA GTT AAA ACC CTG AAA GCT CAG AAC TCC GAA CTG GCT TCC ACC GCT 96
Lys Val Lys Thr Leu Lys Ala Gln Asn Ser Glu Leu Ala Ser Thr Ala
20 25 30

AAC ATG CTG CGT GAA CAG GTT GCT CAG CTG AAA CAG AAA GTT ATG AAC 144
Asn Met Leu Arg Glu Gln Val Ala Gln Leu Lys Gln Lys Val Met Asn
35 40 45

TAC TGATAAGCTT GACCTGTGAA GTGAAAAATG GCG 180
Tyr

（２）配列ＩＤ番号１２に関する情報：
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）長さ：４９アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の種類：タンパク質
（ｘｉ）配列：配列ＩＤ番号１２：
Gly Glu Phe Pro Ser Gly Asn Glu Ala Arg Ile Ala Arg Leu Glu Glu
1 5 10 15

Lys Val Lys Thr Leu Lys Ala Gln Asn Ser Glu Leu Ala Ser Thr Ala
20 25 30

Asn Met Leu Arg Glu Gln Val Ala Gln Leu Lys Gln Lys Val Met Asn
35 40 45

Tyr

（２）配列ＩＤ番号１３に関する情報：
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）長さ：１８０塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
（ｉｉｉ）仮定：無
（ｉｉｉ）アンチセンス：無
（ｖ）フラグメント型：Ｎ−末端
（ｖｉ）起源：
（Ａ）生体：合成、ヒト配列から推定
（ｉｘ）性質：
（Ａ）名称／キー：ＣＤＳ
（Ｂ）位置：１．．１４７
（Ｄ）その他の情報：／産生物＝「挿入ペプチド」
／記＝「挿入ｆｏｓ−ジッパーおよびリンカーをコードする遺伝子カセット」
（ｉｘ）性質：
（Ａ）名称／キー：その他
（Ｂ）位置：１０．．２７
（Ｄ）その他の情報：／産生物＝「合成リンカー」
（ｉｘ）性質：
（Ａ）名称／キー：その他
（Ｂ）位置：２８．．１４７
（Ｄ）その他の情報：／産生物＝「ｆｏｓ−ジッパー」
（ｘｉ）配列：配列ＩＤ番号１３：
GGT GAA TTC GGT CCG TCT GGT AAC GAA CTG ACC GAC ACC CTG CAG GCT 48
Gly Glu Phe Gly Pro Ser Gly Asn Glu Leu Thr Asp Thr Leu Gln Ala
1 5 10 15

GAA ACC GAC CAG CTG GAA GAC AAA AAA TCC GCT CTG CAG ACC GAA ATC 96
Glu Thr Asp Gln Leu Glu Asp Lys Lys Ser Ala Leu Gln Thr Glu Ile
20 25 30

GCT AAC CTG CTG AAA GAA AAA GAA AAA CTG GAA TTT ATC CTG GCT GCT 144
Ala Asn Leu Leu Lys Glu Lys Glu Lys Leu Glu Phe Ile Leu Ala Ala
35 40 45

TAC TGATAAGCTT GACCTGTGAA GTGAAAAATG GCG 180
Tyr

（２）配列ＩＤ番号１４に関する情報：
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）長さ：４９アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子の種類：タンパク質
（ｘｉ）配列：配列ＩＤ番号１４：
Gly Glu Phe Gly Pro Ser Gly Asn Glu Leu Thr Asp Thr Leu Gln Ala
1 5 10 15

Glu Thr Asp Gln Leu Glu Asp Lys Lys Ser Ala Leu Gln Thr Glu Ile
20 25 30

Ala Asn Leu Leu Lys Glu Lys Glu Lys Leu Glu Phe Ile Leu Ala Ala
35 40 45

Tyr

　本願において開示される発明の範囲は、以下のものである。

　１．抗体のＦｖフラグメントおよび他のペプチドと非共有相互作用によって二量体形成ができるペプチドから本質的になる単量体抗体フラグメント融合タンパク質。

　２．Ｆｖフラグメントが一本鎖フラグメントである
ことを特徴とする第１項に記載の単量体。

　３．相互作用性ペプチドが１０〜５０、好ましくは１０〜３０個のアミノ酸からなる
ことを特徴とする第１項または第２項に記載の単量体。

　４．ペプチドが少なくとも一つのヘリックスからなる
ことを特徴とする第１項または第３項のいずれか１項に記載の単量体。

　５．ヘリックスペプチドがヘリックス、ターンおよびもう一つのヘリックスからなる
ことを特徴とする第４項に記載の単量体。

　６．ペプチドが、いくつかの反復アミノ酸を有しており、７個毎のアミノ酸がロイシンであるロイシン・ジッパー分子を含む
ことを特徴とする第４項に記載の単量体。

　７．ペプチドが荷電残基を有する
ことを特徴とする第４項に記載の単量体。

　８．連結ペプチドがＦｖフラグメントとペプチドの間である
ことを特徴とする第１項〜第７項のいずれか一項に記載の単量体。

　９．連結ペプチドが抗体のヒンジ領域配列またはそのフラグメントである
ことを特徴とする第８項に記載の単量体。

　１０．第１項〜第９項に定義された単量体抗体融合タンパク質の調製法であって、
Ｆｖフラグメントをコードする遺伝子、相互作用性ペプチド、それに必要であれば連結ペプチドを一つの発現プラスミドにクローニングして、宿主細胞を該発現プラスミドで形質転換して栄養溶液で培養して、単量体融合タンパク質を細胞中で発現させるか培地中に遊離させる
ことを特徴とする単量体抗体融合タンパク質の調製法。

　１１．宿主細胞が大腸菌である
ことを特徴とする第１０項に記載の調製法。

　１２．単量体ユニットの連結が同一または異なるペプチドの非共有相互作用に基づく二つの融合タンパク質から本質的になる二量体融合タンパク質であって、
少なくとも一つの単量体ユニットが第１項〜第９こうに記載の抗体フラグメント融合タンパク質であることを特徴とする二量体融合タンパク質。

　１３．相互反応性ペプチドが同じである第１２項に記載の二量体融合タンパク質。

　１４．第二の単量体ユニットが異なる特異性を有する第１項〜第９項に定義の抗体フラグメント融合タンパク質である
ことを特徴とする第１２項または第１３項に記載の二量体。

　１５．抗体フラグメント（Ｆｖ）が非抗体タンパク質またはペプチドで置換された第二の単量体ユニットが第１項〜第９項に定義の融合タンパク質である
ことを特徴とする第１２項または第１３項に記載の二量体。

　１６．タンパク質またはペプチドがトキシン、キレート化剤ペプチド、金属結合タンパク質または酵素であるか、または対応する特異性結合部位を有する
ことを特徴とする第１５項に記載の二量体。

　１７．タンパク質またはペプチドがＴ細胞、またはＴ細胞フラグメント特異性結合部位を有することを特徴とする第１５項に記載の二量体。

　１８．もう一つのタンパク質が一方または両方の挿入ペプチドのＣ末端で融合している第１２項〜第１７項のいずれか一項に記載の二量体。

　１９．融合されるタンパク質がトキシン、キレート化剤ペプチド、金属結合タンパク質または酵素であるか、または特異性結合部位を有するか、またはＴ細胞（フラグメント）特異性結合部位を有する第１８項に記載の二量体。

　２０．第１２項〜第１９項に定義された二量体融合タンパク質の調製法であって、
完全な単量体融合タンパク質またはその部分をコードする遺伝子を少なくとも一つの発現プラスミドにクローニングして、宿主細胞を該発現プラスミドで形質転換して栄養溶液で培養して、完全な二単量体融合タンパク質を細胞中でまたは培地中に発現させるか、または単量体融合タンパク質を別々に発現させてから二つの単量体ユニット間の非共有結合を培地中またはインビトロで行うこと、そして融合タンパク質の部分だけがクローニングされた場合には遺伝子工学的工程を追加して行う
ことを特徴とする二量体融合タンパク質の調製法。

　２１．第一の単量体融合タンパク質をコードする遺伝子を第一の発現プラスミド中にクローニングして、第二の単量体融合タンパク質をコードする遺伝子を第二の発現プラスミド中にクローニングする
ことを特徴とする第２０項に記載の調製法。

　２２．二量体融合タンパク質を形成する単量体ユニット間の非共有結合をインビトロで行うことを特徴とする第２０項に記載の調製法。

　２３．宿主細胞が大腸菌である
ことを特徴とする第２０項、第２１項または第２２項に記載の調製法。

　２４．第１２項〜１９項に定義の抗体フラグメント融合タンパク質の選択的二量体の調製のための構築キットであって、
（ａ）第１項〜第８項に定義の単量体抗体フラグメント融合タンパク質、および（ｂ）抗体フラグメントが同一または別の抗原特異性を有するか、または抗体フラグメントユニットが非抗体タンパク質／ペプチドによって置換されている（ａ）に定義された第二の単量体融合タンパク質を含んでなる構築キット。

第１図は、ｓｃＦｖフラグメントを含むｓｃＦｖ発現ベクターｐＬＩＳＣ−ＳＥの模式図である。第２図は、二シストロンｓｃＦｖ−ヒンジ−ジッパー発現ベクターｐＡＣＫｘＦｙＪの模式図である。第３図は、官能基を有するＥＬＩＳＡの説明図である。第４図は、官能基を有する抗リゾチームＦＬＩＳＡの説明図である。

Claims

　抗体のＦｖフラグメントおよび他のペプチドと非共有相互作用によって二量体形成ができるペプチドから本質的になる単量体抗体フラグメント融合タンパク質。
　Ｆｖフラグメントが一本鎖フラグメントであることを特徴とする請求項１に記載の単量体。
　相互作用性ペプチドが、１０〜５０、好ましくは１０〜３０個のアミノ酸からなることを特徴とする請求項１または２に記載の単量体。
　ペプチドが、少なくとも一つのヘリックスからなることを特徴とする請求項１または３のいずれか１項に記載の単量体。
　ヘリックス・ペプチドが、ヘリックス、ターンおよびもう一つのヘリックスからなることを特徴とする請求項４に記載の単量体。
　ペプチドが、いくつかの反復アミノ酸を有しており、７個毎のアミノ酸がロイシンであるロイシン・ジッパー分子を含むことを特徴とする請求項４に記載の単量体。
　ペプチドが、荷電残基を有することを特徴とする請求項４に記載の単量体。
　連結ペプチドが、Ｆｖフラグメントとペプチドの間であることを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載の単量体。
　連結ペプチドが、抗体のヒンジ領域配列またはそのフラグメントであることを特徴とする請求項８に記載の単量体。
　請求項１〜９に定義された単量体抗体融合タンパク質の調製法であって、Ｆｖフラグメントをコードする遺伝子、相互作用性ペプチド、それに必要であれば連結ペプチドを一つの発現プラスミドにクローニングして、宿主細胞を該発現プラスミドで形質転換して栄養溶液で培養して、単量体融合タンパク質を細胞中で発現させるか培地中に遊離させることを特徴とする単量体抗体融合タンパク質の調製法。
　宿主細胞が、大腸菌であることを特徴とする請求項１０に記載の調製法。
　単量体ユニットの連結が、同一または異なるペプチドの非共有相互作用に基づく二つの融合タンパク質から本質的になる二量体融合タンパク質であって、少なくとも一つの単量体ユニットが請求項１〜９に記載の抗体フラグメント融合タンパク質であることを特徴とする二量体融合タンパク質。
　相互反応性ペプチドが、同じである請求項１２に記載の二量体融合タンパク質。
　第二の単量体ユニットが、異なる特異性を有する請求項１〜９に定義の抗体フラグメント融合タンパク質であることを特徴とする請求項１２または１３に記載の二量体。
　抗体フラグメント（Ｆｖ）が、非抗体タンパク質またはペプチドで置換された第二の単量体ユニットが請求項１〜９に定義の融合タンパク質であることを特徴とする請求項１２または１３に記載の二量体。
　タンパク質またはペプチドが、トキシン、キレート化剤ペプチド、金属結合タンパク質または酵素であるか、または対応する特異性結合部位を有することを特徴とする請求項１５に記載の二量体。
　タンパク質またはペプチドが、Ｔ細胞、またはＴ細胞フラグメント特異性結合部位を有することを特徴とする請求項１５に記載の二量体。
　もう一つのタンパク質が、一方または両方の挿入ペプチドのＣ末端で融合している請求項１２〜１７のいずれか１項に記載の二量体。
　融合されるタンパク質が、トキシン、キレート化剤ペプチド、金属結合タンパク質または酵素であるか、または特異性結合部位を有するか、またはＴ細胞（フラグメント）特異性結合部位を有する請求項１８に記載の二量体。
　請求項１２〜１９に定義された二量体融合タンパク質の調製法であって、完全な単量体融合タンパク質またはその部分をコードする遺伝子を少なくとも一つの発現プラスミドにクローニングして、宿主細胞を該発現プラスミドで形質転換して栄養溶液で培養して、完全な二単量体融合タンパク質を細胞中でまたは培地中に発現させるか、または単量体融合タンパク質を別々に発現させてから二つの単量体ユニット間の非共有結合を培地中またはインビトロで行うこと、そして融合タンパク質の部分だけがクローニングされた場合には遺伝子工学的工程を追加して行うことを特徴とする二量体融合タンパク質の調製法。
　第一の単量体融合タンパク質をコードする遺伝子を第一の発現プラスミド中にクローニングして、第二の単量体融合タンパク質をコードする遺伝子を第二の発現プラスミド中にクローニングすることを特徴とする請求項２０に記載の調製法。
　二量体融合タンパク質を形成する単量体ユニット間の非共有結合をイン　ビトロで行うことを特徴とする請求項２０に記載の調製法。
　宿主細胞が、大腸菌であることを特徴とする請求項２０、２１または２２に記載の調製法。
　請求項１２〜１９に定義の抗体フラグメント融合タンパク質の選択的二量体の調製のための構築キットであって、（ａ）請求項１〜８に定義の単量体抗体フラグメント融合タンパク質、および（ｂ）抗体フラグメントが同一または別の抗原特異性を有するか、または抗体フラグメントユニットが非抗体タンパク質／ペプチドによって置換されている（ａ）に定義された第二の単量体融合タンパク質を含んでなる構築キット。