CN107090029B - 可溶性 pd-1变体、融合构建体及其用途 - Google Patents

可溶性 pd-1变体、融合构建体及其用途 Download PDF

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Abstract

提供了可溶性PD‑1(sPD‑1)蛋白、所述包含所述sPD‑1蛋白的融合蛋白、编码所述sPD‑1蛋白和融合蛋白的核酸。所述sPD‑1蛋白具有如SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列。所述融合蛋白具有如SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列。还提供了包含所述sPD‑1蛋白、融合蛋白或核酸的药物组合物，特别是疫苗组合物。本发明的sPD‑1蛋白、融合蛋白、核酸和治疗组合物可以提供免于病原体感染包括HIV感染的保护性免疫，并且可以用于预防和/或治疗肿瘤或癌症。

Description

可溶性 PD-1变体、融合构建体及其用途
本申请是分案申请，其母案的中国申请号是：201180054073.3，国际申请号是PCT/CN2011/082087，申请日是2011年11月11日。
说明书
交叉引用相关申请
本申请要求2010年11月11日提交的美国临时申请序列号61/412,557的权益，所述申请完整地通过引用并入本文。
背景技术
主要在T细胞上表达的编程性死亡1(PD-1)是B7-H1分子(也称为编程性死亡配体1(PD-Ll))和B7-DC分子(也称为编程性死亡配体2(PD-L2))的受体。PD-L1在许多不同细胞类型上表达，而PD-L2仅在抗原递呈细胞如B细胞、树突状细胞和巨噬细胞上表达。
将阴性信号传递至免疫细胞的PD-l/PD-L通路在感染和癌症期间的免疫应答调节中发挥关键作用。PD-1与PD-L1/L2的相互作用在HIV感染期间抑制T细胞功能。最近的研究表明在慢性猴免疫缺陷病毒(SIV)感染期间抗PD-1抗体对PD-1的阻断导致增强的B细胞应答以及SlV特异性多功能CD8 T细胞的快速增殖和恢复。其他研究表明PD-l/PD-L通路的阻断促进LCMV和HBV感染期间的体液和细胞介导的免疫应答的恢复。
人免疫缺陷病毒I型(HIV-1)自从其在1981年首次认识到以来已经导致了估计2500万人死亡。目前，全世界有超过3300万人具有该病毒生活。通过将HIV-1 p24与DEC-205抗体融合而获得的一种现有的HIV疫苗组合物增强了CD4 T细胞免疫应答和细胞因子释放。此外，该疫苗组合物赋予了免于牛痘-gag病毒攻击的保护。然而，该HIV疫苗组合物没有改善Th1 CD8 T细胞应答。因此，需要增强免于HIV感染的宿主免疫和保护的改进的HIV 1疫苗组合物。如从下列公开内容清楚地看到的，本发明提供了这些和其他益处。
发明内容
本发明提供了可溶性PD-1(sPD-1)蛋白和核酸，和包含sPD-1蛋白和核酸的治疗组合物，其用于增强受试者的免疫力。在一个实施方案中，将sPD-1蛋白、核酸、和组合物配制为疫苗组合物。
本发明的一个方面提供了sPD-1蛋白变体。在一个实施方案中，sPD-1蛋白变体是mspd1-14del，其具有包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列。在一个实施方案中，sPD-1蛋白变体是mspd1-322mu，其具有包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列。在一个实施方案中，sPD-1蛋白变体是hspd1-14del，其存在于健康中国人中。hspd1-14del变体具有包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列。
本发明的另一个方面提供了编码本发明的sPD-1蛋白的核酸分子。在一个实施方案中，核酸分子编码mspd1-14del，并且具有包含SEQ ID NO:12的序列。在一个实施方案中，核酸分子编码mspd1-322mu，并且具有包含SEQ ID NO:16的序列。在一个实施方案中，核酸分子编码hspd1-14del，并且具有包含SEQ ID NO:26的序列。
此外，本发明提供了sPD-1融合蛋白。在特定实施方案中，本sPD-1融合蛋白包括SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO: 23 或SEQ ID NO: 27。本发明还提供了sPD-1融合核酸分子。在特定实施方案中，本sPD-1融合DNA包括SEQ ID NO:14、SEQID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO: 24 或SEQ ID NO: 28。
本发明的另一个方面提供了用于预防和/或治疗病原体感染、癌症或肿瘤和其中诱导抗原特异性保护性免疫将是有益的其他疾病的方法。有利地，本发明的方法增强宿主体液和细胞介导的免疫。该方法包括将有效量的本发明的融合蛋白或融合核酸分子施用于需要这样的治疗的受试者。在优选实施方案中，本方法可以用于预防和治疗HIV或其他病原体感染。此外，该方法可以用于预防和/或治疗肿瘤或癌症。
本发明进一步提供了治疗或药物组合物。在一个实施方案中，组合物包含治疗有效量的本发明的蛋白和/或核酸分子和任选的药学上可接受的载体。在优选实施方案中，治疗组合物是疫苗组合物。
附图说明
图1A显示mspd1-p24-Fc、mspd1-IgVΔ-p24-Fc和p24-Fc融合蛋白的氨基酸序列的比对。图1B显示mspd1-p24-Fc、mspd1-IgVΔ-p24-Fc和p24-Fc的Western印迹分析。通过抗兔Fc抗体检测蛋白。
图2显示msPD1-p24-Fc融合蛋白与sPD-1配体的结合能力。(A)显示mspd1-p24-Fc、mspd1-IgVΔ-p24-Fc和p24-Fc分别与小鼠PD-L1的结合能力。(B)显示mspd1-p24-Fc、mspd1-IgVΔ-p24-Fc和p24-Fc分别与小鼠PD-L2的结合能力。
图3显示野生型sPD1 DNA引发针对HIV p24的体液和细胞介导的免疫应答。(A)显示在分别用p24-Fc、mspd1-p24-Fc和mspd1-IgVΔ-p24-Fc融合DNA免疫的小鼠中抗p24IgG1和IgG2a抗体的血清水平。条代表三份样品的平均值(±标准偏差)。(B)显示关于CD8 T细胞对于p24表位gagAI(AMQMLKDTI)特异性的分泌IFN-γ的脾细胞的数量。条代表三份样品的平均值(±标准偏差)。(C)显示免疫小鼠的分离的脾细胞的图像。为了分析p24-特异性免疫应答，用H2d-Kd-AMQMLKDTI-PE四聚体染色脾细胞用于CD8 T细胞群体分析。(D)显示关于CD4 T细胞对于p24表位gag26 (TSNPPIPVGDIYKRWIILGL)特异性的分泌IFN-γ的脾细胞的数量。条代表三份样品的平均值(±标准偏差)。数据代表在相同批次的免疫小鼠上的三次实验。
图4显示用野生型msPDl融合DNA免疫保护免于病毒感染。最后免疫后三周用4×107 PFU的牛痘VTT-HIV-gagpol鼻内攻击用p24-Fc、mspd1-p24-Fc或mspd1-IgVΔ-p24-Fc免疫的Balb/c小鼠。病毒攻击后3天将小鼠处死。通过在Vero细胞中的噬斑形成测定评价肺中的病毒滴度。条代表五份样品的平均值(±标准偏差)。
图5显示，使用sPD-1-p24-fc靶向DC诱导了增强的p24特异性抗体和T细胞应答。(A)通过使用抗小鼠PD-L1或L2抗体的流式细胞术分析验证了在从Balb/c小鼠分离的纯化的CD11c+ BM-DC上PD-L1和PD-L2的表达(实线，无阴影)。用同种型抗体对照染色的细胞显示为阴影图。(B)用纯化的msPD-1-p24-fc和msPD1-IgVΔ-p24-fc蛋白处理的BM-DC以检查结合。通过使用抗兔Fc-FITC的流式细胞术检测与DC结合的蛋白(实线，无阴影)，平行的是作为阴性对照的没有蛋白处理的DC(阴影)。通过尾静脉注射将20µg msPD-1-p24-fc或msPD1-IgVΔ-p24-fc蛋白处理的2×106 DC引入Balb/c小鼠，每三周一次，持续共六周的实验持续时间。接受未处理的CD11c+ DC的小鼠充当对照。(C)收集小鼠血清，并且通过ELISA分析针对HIV-1 p24特异性的IgG1和IgG2a抗体的存在。(D)在分别使用特异性肽gagAI和gag26刺激的小鼠脾细胞中通过ELISpot测定测量产生IFN-γ的CD8+和CD4+细胞。在分离的脾细胞上进行H2-Kd-AMQMLKDTI-PE四聚体染色，并且通过流式细胞术分析为来自免疫小鼠组中的数据的柱状图。条代表两只重复小鼠的平均值和通过误差条表示的标准误差。数据代表两次独立的免疫实验。*P<0.05。
图6显示hspd1-p24-Fc引发针对HIV-1 p24的体液和细胞介导的免疫应答。(A)显示hsPD-1-p24-Fc与小鼠PD-L1结合。(B)显示hsPD-1-p24-Fc与小鼠PD-L2结合。(C)显示当与用p24-Fc免疫的小鼠相比时，用hspd1-p24-Fc免疫的小鼠中的抗p24 IgG1和IgG2a抗体的高血清水平。(D)显示关于CD8 T细胞的对于p24表位gagAI(AMQMLKDTI)特异性的分泌IFN-γ的脾细胞的数量和关于CD4 T细胞的对于p24表位gag26(TSNPPIPVGDIYKRWIILGL)特异性的分泌IFN-γ的脾细胞的数量。条代表三份样品的平均值(±标准偏差)。
图7A显示mspd1-p24-Fc、mspd1-14del-p24-Fc、mspd1-322mu-p24-Fc和p24-fc融合蛋白的氨基酸序列的比对。图7B显示mspd1-14del-p24-Fc、mspd1-322mu-p24-Fc和p24-Fc的Western印迹分析。通过抗兔Fc抗体检测蛋白。
图8显示mspd1-14del-p24-Fc、mspd1-322mu-p24-Fc和p24-fc融合蛋白分别与sPD-1配体的结合能力。(A)显示mspd1-14del-p24-Fc、mspd1-322mu-p24-Fc和p24-Fc融合蛋白分别与PD-L1的结合能力。(B)显示mspd1-14del-p24-Fc、mspd1-322mu-p24-Fc和p24-Fc融合蛋白分别与PD-L2的结合能力。
图9显示变体sPD1 DNA引发针对HIV p24的体液和细胞介导的免疫应答。(A)显示在分别用mspd1-14del-p24-Fc、mspd1-322mu-p24-Fc和p24-Fc融合DNA免疫的小鼠中抗p24IgG1和IgG2a抗体的血清水平。条代表三份样品的平均值(±标准偏差)。(B)显示关于CD8 T细胞对于p24表位gagAI (AMQMLKDTI)特异性的分泌IFN-γ的脾细胞的数量。条代表三份样品的平均值(±标准偏差)。(C)显示免疫小鼠的分离的脾细胞的图像。为了分析p24-特异性免疫应答，用H2d-Kd-AMQMLKDTI-PE四聚体染色脾细胞用于CD8 T细胞群体分析。(D)显示关于CD4 T细胞对于p24表位gag26(TSNPPIPVGDIYKRWIILGL)特异性的分泌IFN-γ的脾细胞的数量。条代表三份样品的平均值(±标准偏差)。数据代表在相同批次的免疫小鼠上的三次实验。
图10显示用变体msPDl融合DNA免疫保护免于病毒感染。最后免疫后三周用4×107PFU的牛痘VTT-HIV-gagpol鼻内攻击用mspd1-14del-p24-Fc、mspd1-322mu-p24-Fc和p24-Fc融合DNA免疫的Balb/c小鼠。病毒攻击后3天将小鼠处死。通过在Vero细胞中的噬斑形成测定评价肺中的病毒滴度。条代表五份样品的平均值(±标准偏差)。
图11显示hspd1-14del-p24-Fc引发针对HIV-1 p24的体液和细胞介导的免疫应答。(A)显示hspd1-14del-p24-Fc不与小鼠PD-L1结合。(B)显示hspd1-14del-p24-Fc不与小鼠PD-L2结合。(C)显示当与用p24-Fc免疫的小鼠相比时，用hspd1-14del-p24-Fc免疫的小鼠中的抗p24 IgG1和IgG2a抗体的高血清水平。(D)显示关于CD8 T细胞的对于p24表位gagAI (AMQMLKDTI)特异性的分泌IFN-γ的脾细胞的数量和关于CD4 T细胞的对于p24表位gag26(TSNPPIPVGDIYKRWIILGL)特异性的分泌IFN-γ的脾细胞的数量。条代表三份样品的平均值(±标准偏差)。
图12显示根据本发明有用的各种克隆的结构。
图13显示sPD-1-p24-fc接种疫苗诱导有效的p24-特异性免疫应答。(A) 包含PD-1的可溶性形式或具有对于与PD-L1/L2结合必需的两个氨基酸缺失的PD-1的可溶性形式(sIgV-PD-1)、在CMV启动子下的p24和兔Fc的构建体的图示。兔Fc用作用于纯化目的的标签。(B)描述了小鼠免疫时间表。在第0、3和6周时以20μg的低剂量或100µg的高剂量用EP以i.m.用sPD-1-p24-fc、sIgV-PD-1-p24-fc和p24-fc免疫Balb/c小鼠。仅接受PBS的小鼠充当阴性对照。最终免疫后两周收集小鼠血清和脾细胞分别用于分析抗体和T细胞应答。(C)免疫后两周通过ELISA检测针对HIV-1 Gag p24的特异性IgG1和IgG2a抗体。分别通过ELISpot测量对HIV-1 Gag p24表位gagAI和gag26特异性应答的分泌IFN-γ的(D) CD8+和(E) CD4+T细胞的数量。(F) 对使用源自横跨整个HIV-1 Gag p24的59种肽的三种不同肽合并物的刺激应答的分泌IFN-γ+的细胞。(G) CD8+ T细胞群体的代表性H2-Kd-AMQMLKDTI-PE四聚体染色显示于流式细胞图中，或者将数据合并为柱状图(H)。数据代表三次独立的免疫实验。*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001。
图14显示sPD1-p24-fc诱导的T细胞的多功能性。以100µg的剂量用sPD1-p24-fc和sIgV-PD1-p24-fc i.m./EP免疫Balb/c小鼠。仅接受PBS的小鼠充当对照。收集脾细胞并且在使用针对IFN-γ+、TNF-α、和IL-2的抗体细胞内染色后通过流式细胞术进行分析。表明对于(A)IFN-γ+和(B) TNF-α阳性的CD8+或CD4+ T细胞的散点图。描述对于细胞因子IFN-γ+、TNF-α、和IL-2单、双或三阳性的(C) CD8+或(D) CD4+ T细胞的柱状图。(E)代表对于IFN-γ、TNF-α、和IL-2的组合阳性的总的分泌细胞因子的CD8+或CD4+ T细胞亚群的饼形图。柱代表三只重复小鼠的平均值和作为误差条的标准误差。数据代表两次独立的免疫实验。*P<0.05, **P<0.01。
图15显示，用sPD-1-p24-fc 的接种疫苗诱导了特异性的持久且保护性的免疫。分离源自免疫后30周小鼠的血清和脾细胞，并且检查抗体和CD8+和CD4+ T细胞应答。(A) 通过ELISA检测的针对HIV-1 Gag p24的特异性 IgG1和IgG2a抗体。进行使用对于(B) CD8+ T细胞和(C) CD4+ T细胞特异性的HIV-1 Gag p24表位的ELISpot测定以测试T细胞产生IFN-γ的能力。免疫后三周用2x105 PFU强毒的WRgagpol攻击以前用100μg DNA疫苗的剂量免疫的小鼠以检查免疫保护。每组含有最多达5只小鼠。(D) 牛痘攻击后将免疫小鼠每天称重，持续八天。(E) 通过在Vero细胞单层上的噬斑形成评价免疫小鼠的肺中的病毒滴度。
图16 显示 DNA疫苗构建体的表达和结合特征。(A) 通过Western印迹检测编码sPD-1、突变形式slgV-PD-l、p24和 fc的DNA疫苗的蛋白表达。较低大小的条带代表p24-fc，而较高大小的条带代表sPD-1-p24-fc或sIgV-PD-1-p24-fc。(B) 用PD-L1或PD-L2表达载体瞬时转染293T细胞，并且检查重组蛋白的结合概况。通过用来自构建体的纯化的蛋白处理细胞和随后使用抗兔Fc-FITC抗体检测获得流式细胞信号。对照包括用抗兔Fc-FITC抗体(阴性，阴影)或抗小鼠pD-Ll或L2抗体(阳性，实线，无阴影)染色的转染的293T细胞。
图17显示，使用sPD-1-p24-fc靶向树突状细胞(DC)诱导了增强的p24特异性抗体和T细胞应答。(A) 通过使用抗小鼠PD-L1或L2抗体的流式细胞术分析验证了在从Balb/c小鼠分离的纯化的CD11c+ BM-DC上PD-L1和PD-L2的表达(实线，无阴影)。用同种型抗体对照染色的细胞显示为阴影图。(B)用纯化的sPD-1-p24-fc和sIgV-PD-1-p24-fc蛋白处理的BM-DC以检查结合。通过使用抗兔Fc-FITC的流式细胞术检测与DC结合的蛋白(实线，无阴影)，平行的是作为阴性对照的没有蛋白处理的DC(阴影)。通过尾静脉注射将20µg sPD-1-p24-fc或sIgV-PD-1-p24-fc蛋白处理的2×106 DC引入Balb/c小鼠，每三周一次，持续共六周的实验持续时间。接受未处理的CD11c+ DC的小鼠充当对照。(C)收集小鼠血清，并且通过ELISA分析针对HIV-1 p24特异性的IgG1和IgG2a抗体的存在。(D) 在分别使用特异性肽gagAI和gag26刺激的小鼠脾细胞中通过ELISpot测定测量产生IFN-γ的CD8+和CD4+细胞。(E)在分离的脾细胞上进行H2-Kd-AMQMLKDTI-PE四聚体染色，并且通过流式细胞术分析为来自免疫小鼠组中的数据的柱状图。条代表两只重复小鼠的平均值和通过误差条表示的标准误差。数据代表两次独立的免疫实验。*P<0.05。
图18 表征sPD-1-p24-fc DNA接种疫苗。(A)无电穿孔(EP)，(B)用EP以纯化的p24-fc和/或sPD-1-fc，或(c) 用EP以没有兔Fc标签的DNA疫苗通过i.m.的免疫策略的CD8+ T细胞ELISpot测定。所有数据点代表平均值 ± 作为误差条的标准误差。*P<0.05。
图19显示，人sPD-1-p24-fc在小鼠中引发类似的p24-特异性免疫。(A) hu-sPD-1-p24-fc蛋白与在293T细胞上瞬时表达的鼠PD-1配体的结合概况。通过用hu-sPD-1-p24-fc蛋白和随后用于检测的抗兔Fc-FITC抗体处理细胞而获得流式细胞信号。对照包括用抗兔Fc-FITC抗体(阴性，阴影)或抗小鼠PD-L1-或L2- FITC抗体(阳性，实线，无阴影)染色的转染的293T细胞。Balb/c小鼠以20µg的剂量用hu-sPD-1- p24-fc和p24-fc i.m./EP免疫，或仅接受PBS而充当阴性对照。(B)免疫后两周通过ELISA检测小鼠血清中针对HIV-1 Gag p24的特异性 IgG1和IgG2a抗体。(C) 分别通过ELISpot测定法测量对对于CD4+和CD8+ T细胞特异性的HIV-1 Gag p24表位特异性应答的分泌IFN-γ的CD8+和CD4+ T细胞的频率。柱代表三只重复小鼠的平均值和作为误差条的标准误差。数据代表两次独立的免疫实验。*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001。
序列概述
SEQ ID NO:1是小鼠PD-1的野生型可溶性胞外结构域的氨基酸序列(小鼠spd1)。
SEQ ID NO:2是野生型小鼠spd1 DNA的核酸序列。
SEQ ID NO: 3是根据本发明有用的HIV p24的氨基酸序列。
SEQ ID NO: 4是根据本发明有用的HIV p24 DNA的核酸序列。
SEQ ID NO: 5是对于本发明有用的兔Fc结构域的氨基酸序列。
SEQ ID NO: 6是对于本发明有用的兔Fc DNA的核酸序列。
SEQ ID NO:7是mspd1-IgVΔ的氨基酸序列。
SEQ ID NO:8是mspd1-IgVΔDNA的核酸序列。
SEQ ID NO:9是mspd1-IgVΔ-p24-Fc融合蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO:10是mspd1-IgVΔ-p24-Fc融合DNA的核酸序列。
SEQ ID NO:11是mspd1-14del的氨基酸序列。
SEQ ID NO:12是mspd1-14del DNA的核酸序列。
SEQ ID NO:13是mspd1-14del-p24-Fc融合蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO:14是mspd1-14del-p24-Fc融合DNA的核酸序列。
SEQ ID NO:15是mspd1-322mu的氨基酸序列。
SEQ ID NO:16是mspd1-322mu DNA的核酸序列。
SEQ ID NO:17是mspd1-322mu-p24-Fc融合蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO:18是mspd1-322mu-p24-Fc融合DNA的核酸序列。
SEQ ID NO:19是mspd1-p24-Fc融合蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO:20是mspd1-p24-Fc融合DNA的核酸序列。
SEQ ID NO:21是人PD-1的野生型可溶性胞外结构域的氨基酸序列(人spd1)。
SEQ ID NO:22是野生型人spd1 DNA的核酸序列。
SEQ ID NO:23是hspd1-p24-Fc融合蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO:24是hspd1-p24-Fc融合DNA的核酸序列。
SEQ ID NO:25是hspd1-14del的氨基酸序列。
SEQ ID NO:26是hspd1-14del DNA的核酸序列。
SEQ ID NO:27是hspd1-14del-p24-Fc融合蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO:28是hspd1-14del-p24-Fc融合DNA的核酸序列。
SEQ ID NO:29是根据本发明有用的接头序列的氨基酸序列。
SEQ ID NO:30是根据本发明有用的接头序列的氨基酸序列。
SEQ ID NO:31是根据本发明有用的接头序列的氨基酸序列。
SEQ ID NO:32是根据本发明有用的接头序列的氨基酸序列。
SEQ ID NO:33是根据本发明有用的接头序列的氨基酸序列。
SEQ ID NO:34是根据本发明有用的接头序列的氨基酸序列。
SEQ ID NO:35是根据本发明有用的接头序列的氨基酸序列。
SEQ ID NO:36是根据本发明有用的接头序列的氨基酸序列。
SEQ ID NO:37是根据本发明有用的接头序列的氨基酸序列。
SEQ ID NO:38是根据本发明有用的接头序列的氨基酸序列。
SEQ ID NO:39是根据本发明有用的氨基酸序列。
SEQ ID NO:40是根据本发明有用的氨基酸序列。
发明详述
本发明提供了可溶性PD-1(sPD-1)蛋白和核酸，和包含可溶性PD-1蛋白和核酸的治疗组合物，其可用于诱导免于感染和癌症的抗原特异性保护性免疫。在一个实施方案中，将本sPD-1蛋白、核酸、和组合物配制为疫苗组合物。在一个实施方案中，本发明提供了新的融合蛋白mspd1-p24Fc、mspd1-14del-p24Fc、mspd1-322mu-p24Fc、和hspd1-14del-p24Fc，和编码这些融合蛋白的核酸分子。
本发明基于如下发现：免疫调节性PD-l/PD-L通路下调HIV-1-特异性CD8+ T细胞应答。本发明人发现在健康人中存在的PD-1的天然变体不与PD-L1或PD-L2(PD-1的配体)相互作用。此外，还发现对于PD-1和其配体相互作用必不可少的点突变。
在一个实施方案中，本发明提供了新的DNA疫苗设计，其通过将可溶性PD-1与目的抗原融合而模拟编程性死亡-1(PD-1)与在树突状细胞(Dc)上表达的其配体的结合而用于功能活化。融合DNA疫苗的经由电穿孔(EP)的肌内免疫在小鼠中引发强烈的抗Gag抗体滴度，并且检测到IgGl (Th2)和IgG2a (Thl)应答。在免疫后引发高频率的Gag-特异性、广泛反应且多功能T细胞，特别是CD8+ T细胞。这些应答是剂量依赖性的、持久的且赋予免于用强毒牛痘-Gag的鼻内攻击的保护。具体而言，mspd-p24fc、mspd1-14del-p24fc和mspd1-322mu-p24fc增强了HIV-1 Gag-特异性免疫应答，正如由使用Elispot测定的表达IFN-γ的CD4和CD8 T细胞的数量所确定的。因此，本发明的基于可溶性PD-l的DNA/EP接种疫苗提供了诱导持久和保护性的CD8+ T细胞免疫的方便、可重复且有效的方式，其对于疫苗开发和基因治疗具有重要意义。
在一个实施方案中，通过缺失野生型mspdl的氨基酸26-39(氨基酸26-39是由野生型小鼠PD-1基因的第二个外显子编码的前14个氨基酸。mspd1的这些14个氨基酸具有和由人hspd1-14del同系物的第二个外显子编码的前14个氨基酸相同的序列)而获得mspd1-14del蛋白变体。通过将野生型PD-1蛋白的氨基酸残基108从Met变为Val而获得mspd1-322mu蛋白变体。源自人PD-1的天然同种型的hspd1-14del变体缺失野生型hspdl的氨基酸26-39(由野生型人PD-1基因的第二个外显子的第一部分编码)。
mspd1-p24Fc融合蛋白结合PD-1配体PD-L1和L2，并且抗PD-Ll/L2抗体可以阻断PD-1与PD-L的结合。假设mspd1-p24Fc融合蛋白的结合抑制PD-1/PD-L通路，其将阴性信号传递至免疫细胞。相比之下，mspd1-14del-p24Fc、mspd1-322mu-p24Fc、和hspd1-14del-p24Fc融合蛋白都无法结合PD-L1或PD-L2。这表明由spd1的外显子2的DNA编码的氨基酸残基26-39和mspd1的氨基酸残基108对于PD-L结合是重要的。
有利地，mspd1-p24Fc、mspd1-14del-p24Fc、mspd1-322mu-p24Fc、和hspd1-14del-p24Fc融合蛋白或其融合DNA的施用增强了HIV-1 Gag-特异性免疫应答。如图3-6和8-11中所示，mspd1-p24Fc、mspd1-14del-p24Fc、mspd1-322mu-p24Fc、和hspd1-14del-p24Fc DNA的施用显著增加了抗p24 IgG1 (Th2)和IgG2a(Th1)抗体滴度。此外，mspd1-p24Fc、mspd1-14del-p24Fc、mspd1-322mu-p24Fc、和hspd1-14del-p24Fc DNA的施用也显著增加了小鼠中表达IFN-γ的CD4和CD8 T细胞的数量。具体而言，mspd1-p24Fc、mspd1-14del-p24Fc、或mspd1-322mu-p24Fc DNA免疫的小鼠在牛痘病毒-gagpol(VTT-gagpol)攻击后显著降低了攻击病毒的滴度。
相比之下，通过缺失小鼠PD-1蛋白的氨基酸89-90而获得的mspd1-IgVΔ-p24-Fc无法结合PD-1配体PD-L1和PD L2。此外，mspd1-IgVΔ-p24-Fc DNA的施用没有增强小鼠中的体液或细胞介导的免疫。此外，mspd1-IgVΔ-p24-Fc DNA的施用没有降低牛痘病毒-gagpol(MVTT-gagpol)攻击后的HIV病毒滴度。
PD-1变体和融合构建体
本发明的第一个方面提供了sPD-1蛋白变体。在一个实施方案中，通过缺失野生型sPD-1蛋白的氨基酸残基26-39而获得sPD-1蛋白变体。野生型sPD-1蛋白优选是哺乳动物来源的(如野生型小鼠、兔、非人灵长类或猪PD-1蛋白)，更优选地，是人来源的。
在一个实施方案中，sPD-1蛋白变体是mspd1-14del，其具有包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列。在一个实施方案中，sPD-1蛋白变体是mspd1-322mu，其具有包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列。在一个实施方案中，sPD-1蛋白变体是hspd1-14del，其具有包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列。
在某些实施方案中，本发明包括与mspd1-14del(SEQ ID NO:11)、mspd1-322mu(SEQ ID NO:15)、或hspd1-14del (SEQ ID NO:25)同源的PD-1蛋白变体。在一个实施方案中，sPD-1蛋白变体具有与SEQ ID NO:11至少约 95%、96%、97%、98%、99%、或99.5%相同的氨基酸序列。在一个实施方案中，sPD-1蛋白变体具有与SEQ ID NO:15至少约 95%、96%、97%、98%、99%、或99.5%相同的氨基酸序列。在一个实施方案中，sPD-1蛋白变体具有与SEQ IDNO:25至少约 95%、96%、97%、98%、99%、或99.5%相同的氨基酸序列。在一个实施方案中，PD-1蛋白变体不包含SEQ ID NO: 7。
本发明的第二个方面提供了编码本发明的sPD-1蛋白的核酸分子。核酸分子包括DNA分子(如基因组DNA和cDNA)和RNA分子。此外，本核酸分子可以是单链或双链的。
在一个实施方案中，核酸分子编码sPD-1蛋白，其通过缺失野生型sPD-1蛋白(如野生型人、小鼠或兔sPD-1蛋白)的氨基酸残基26-39而获得。在一个实施方案中，核酸分子编码mspd1-14del，并且具有包含SEQ ID NO:12的序列。在一个实施方案中，本核酸分子编码mspd1-322mu，并且具有包含SEQ ID NO:16的序列。在一个实施方案中，本核酸分子编码hspd1-14del，并且具有包含SEQ ID NO:26的序列。
在某些实施方案中，本发明包括与编码mspd1-14del、mspd1-322mu、或hspd1-14del的核酸同源的核酸分子。在一个实施方案中，核酸分子具有与SEQ ID NO:12、SEQ IDNO:16、或SEQ ID NO:26至少约95%、96%、97%、98%、99%、或99.5%相同的序列。在一个实施方案中，sPD-1核酸分子不包含SEQ ID NO: 8。
本发明的第三个方面提供了PD-1融合蛋白。在一个实施方案中，本发明提供了PD-1融合蛋白，包含与抗原蛋白片段融合的sPD-1蛋白片段。在进一步实施方案中，sPD-1融合蛋白包含Fc结构域。在一个实施方案中，经由接头序列将可溶性PD-1蛋白与抗原连接。在可替代的实施方案中，PD-1融合蛋白包含任选地经由接头序列与Fc结构域融合的PD-1蛋白。
在一个实施方案中，sPD-1融合蛋白包括野生型小鼠可溶性PD-1蛋白(mspdl)，其具有包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列。在一个实施方案中，sPD-1融合蛋白包括野生型人sPD-1蛋白(hspd1)，其具有包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列。在一个实施方案中，sPD-1融合蛋白是变体小鼠sPD-1蛋白mspd1-14del，其具有包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列。在一个实施方案中，sPD-1融合蛋白是变体小鼠sPD-1蛋白mspd1-322mu，其具有包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列。在一个实施方案中，sPD-1蛋白是变体人sPD-1蛋白(hspd1-14del)，并且具有包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列。
抗原蛋白片段可以源自病毒、细菌、真菌、或其他微生物病原体的免疫原性片段，所述病毒、细菌、真菌、或其他微生物病原体包括但不限于人免疫缺陷病毒(HIV)、HSV包括HSV-1和HSV-2、KSHV、HPV包括HPV-6、HPV-11、HPV-16、和HPV-18、呼吸道合胞病毒、鼻病毒、肝炎病毒包括甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、己型肝炎病毒、和庚型肝炎病毒、致癌病毒、人嗜T淋巴细胞病毒Ⅰ型(HTLV-1)、流行性感冒、牛白血病病毒(BLV)、EB病毒、百日咳、脊髓灰质炎、麻疹、腮腺炎、风疹、天花、带状疱疹、炭疽、破伤风、轮状病毒、狂犬病、禽痘、脑膜炎球菌、白喉、乳头瘤病毒、炭疽、瘟疫、脑炎、肺炎球菌、肺炎、斑疹伤寒、伤寒热、链球菌、葡萄球菌、奈瑟氏菌、莱姆病、霍乱、大肠杆菌、志贺氏菌、利什曼虫、麻风病、巨细胞病毒(CMV)、呼吸道合胞病毒、副流感、腺病毒、水痘、黄病毒、登革热、弓形体病、球孢子菌病、血吸虫病、结核分枝杆菌、和疟疾。抗原蛋白片段也可以源自肿瘤或癌细胞。在一个实施方案中，可溶性PD-1、其变体及其融合蛋白充当分子或蛋白佐剂以增强免疫应答。此外，还可以将编码可溶性PD-1、其变体及其融合蛋白的核酸分子施用于受试者以增强免疫应答。
在一个实施方案中，抗原蛋白片段源自HIV蛋白结构域的免疫原性片段，包括但不限于p24、gag、pol、nef、tat、rev、gp120、和gp41。在一个实施方案中，抗原蛋白源自HIVp24。在一个特定实施方案中，抗原蛋白包含SEQ ID NO:3。在一个进一步实施方案中，sPD-1融合蛋白进一步包含Fc结构域。在一个实施方案中，sPD-1融合蛋白包含用于纯化目的的兔Fc结构域。
术语“Fc结构域”包括天然人和动物Fc和Fc变体分子和序列的全长和片段，包括，例如IgG、IgM、IgD、IgE、IgA和亚型诸如例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、和IgA2。如同Fc变体和天然Fc的，术语“Fc结构域”包括单体或多聚体形式的分子，无论是从整个抗体消化的或通过其他方式产生的。
在一个实施方案中，抗原蛋白片段源自肿瘤抗原。
术语“Fc变体”是指从天然Fc修饰但仍包含对于拯救受体的结合位点的分子或序列。Fc结构域包括具有共价、非共价、或通过共价和非共价相互作用结合的两条或更多的多肽链的分子。IgG分子通常形成二聚体；IgM、五聚体；IgD、二聚体；和IgA、单体、二聚体、三聚体或四聚物。可以通过利用Fc的天然Ig来源的序列和获得的活性或通过衍生化(如下所定义)这样的天然Fc而形成多聚体。
本发明范围内的Fc结构域可以是任何同种型的抗体，包括IgG、IgA、IgE、IgD、和IgM。IgG同种型抗体可以进一步细分为IgGl、IgG2、IgG3和IgG4亚型。IgA抗体可以进一步细分为IgA1和IgA2亚型。在一个特定实施方案中，Fc结构域是IgGl。
在一个进一步实施方案中，本发明的sPD-1融合蛋白包含将可溶性PD-1结构域连接至抗原的接头序列。此外，也可以经由接头序列将Fc结构域连接至融合蛋白。接头序列通常是多肽链。肽的长度可以是，例如，6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40、50或更多氨基酸残基，但通常是5至25个残基。
取决于长度和侧链组成，接头可以具有，但不需要具有，比平均柔韧性更大的柔韧性。可以使用本领域已知的算法计算柔韧性。在一个实施方案中，接头序列是SEQ ID NO:29。有用的接头的实例包括，但不限于
Figure DEST_PATH_IMAGE001
Figure DEST_PATH_IMAGE002
Figure DEST_PATH_IMAGE003
。
在一个特定实施方案中，本sPD-1融合蛋白包含SEQ ID NO:13。在另一个特定实施方案中，本sPD-1融合蛋白包含SEQ ID NO:17。在另一个特定实施方案中，本sPD-1融合蛋白包含SEQ ID NO:19。在另一个特定实施方案中，本sPD-1融合蛋白包含SEQ ID NO:23。在另一个特定实施方案中，本sPD-1融合蛋白包含SEQ ID NO:27。
此外，本发明提供了sPD-1融合核酸构建体，其包含编码本sPD-1融合蛋白的核酸分子。在一个实施方案中，sPD-1融合构建体包含与编码蛋白抗原的核酸融合的编码sPD-1蛋白的核酸分子。在进一步实施方案中，PD-1融合构建体包含Fc DNA。在一个实施方案中，经由接头序列将可溶性PD-1 DNA与抗原DNA连接。任选地，经由接头DNA序列将Fc DNA与sPD-1-抗原DNA连接。
本发明的抗原核酸分子编码病毒、细菌、真菌、或其他微生物病原体的免疫原性片段，所述病毒、细菌、真菌、或其他微生物病原体包括但不限于人免疫缺陷病毒(HIV)、HSV包括HSV-1和HSV-2、KSHV、HPV包括HPV-6、HPV-11、HPV-16、和HPV-18、呼吸道合胞病毒、鼻病毒、肝炎病毒包括甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、己型肝炎病毒、和庚型肝炎病毒、致癌病毒、人嗜T淋巴细胞病毒Ⅰ型(HTLV-1)、流行性感冒、牛白血病病毒(BLV)、EB病毒、百日咳、脊髓灰质炎、麻疹、腮腺炎、风疹、天花、带状疱疹、炭疽、破伤风、轮状病毒、狂犬病、禽痘、脑膜炎球菌、白喉、乳头瘤病毒、炭疽、瘟疫、脑炎、肺炎球菌、肺炎、斑疹伤寒、伤寒热、链球菌、葡萄球菌、奈瑟氏菌、莱姆病、霍乱、大肠杆菌、志贺氏菌、利什曼虫、麻风病、巨细胞病毒(CMV)、呼吸道合胞病毒、副流感、腺病毒、水痘、黄病毒、登革热、弓形体病、球孢子菌病、血吸虫病、结核分枝杆菌、和疟疾。
在一个实施方案中，抗原核酸分子编码肿瘤抗原。
在一个实施方案中，融合核酸分子包含野生型小鼠PD-1 (mspd1) DNA (SEQ IDNO:2)。在一个实施方案中，融合核酸分子包含野生型人PD-1 (hspd1) DNA (SEQ ID NO:22)。在一个实施方案中，融合核酸分子包含变体小鼠PD-1 DNA，其具有SEQ ID NO:12或SEQID NO:16的序列。在一个实施方案中，融合核酸分子包含变体人PD-1 DNA，其具有SEQ IDNO:26的序列。
在一个特定实施方案中，本PD-1融合DNA包含SEQ ID NO:14。在另一个特定实施方案中，本PD-1融合DNA包含SEQ ID NO:18。在另一个特定实施方案中，本PD-1融合DNA包含SEQ ID NO:20。在另一个特定实施方案中，本PD-1融合DNA包含SEQ ID NO:24。在另一个特定实施方案中，本PD-1融合DNA包含SEQ ID NO:28。
在某些实施方案中，本发明的PD-1蛋白或核酸通常基本上不含其他成分，如其他生物分子、蛋白或肽、核酸、脂质和碳水化合物。如本文所使用的，术语“基本上不含”包括本发明的制剂，其具有少于约20%、10%和优选少于5%(以干重计)污染因素(如生物分子、蛋白或肽、核酸、脂质和碳水化合物和其他细胞成分)。
如果需要，可以通过任何合适的方法修饰本蛋白和核酸分子。有时使用随机诱变进行蛋白优化的策略。在这些情况下，随机挑选位置，或使用过分简单的规则进行氨基酸变化。例如，可以将所有残基都突变为丙氨酸，称为丙氨酸扫描。此外，除本发明特定例举或天然存在于本发明的融合蛋白中的那些取代以外的氨基酸的取代也在本发明的范围内。例如，可以将非天然氨基酸取代融合蛋白的氨基酸，只要具有取代的氨基酸的融合蛋白基本上保留与其中氨基酸没有被取代的融合蛋白相同的功能活性。
非天然氨基酸的实例包括，但不限于鸟氨酸、瓜氨酸、羟脯氨酸、高丝氨酸、苯基甘氨酸、牛磺酸、碘化酪氨酸、2,4-二氨基丁酸、α-氨基异丁酸、4-氨基丁酸、2-氨基丁酸、γ-氨基丁酸、ε-氨基己酸、6-氨基己酸、2-氨基异丁酸、3-氨基丙酸、正亮氨酸、正缬氨酸、肌氨酸、高瓜氨酸、磺基丙氨酸、τ-丁基甘氨酸、τ-丁基丙氨酸、苯基甘氨酸、环己基丙氨酸、β-丙氨酸、氟-氨基酸、设计者氨基酸如β-甲基氨基酸、C-甲基氨基酸、N-甲基氨基酸、和通常的氨基酸类似物。非天然氨基酸还包括具有衍生化的侧基的氨基酸。此外，蛋白中的任何氨基酸可以是D(右旋)形式或L(左旋)形式。
本发明还涉及编码本发明的功能融合蛋白的核酸分子的变体。变体序列包括其中序列的一个或多个核苷酸已经被取代、缺失，和/或插入的那些序列。
可以取代DNA的天然核苷酸的核苷酸具有碱基部分，所述碱基部分可以包括，但不限于，肌苷、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、次黄嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、5-甲基胞嘧啶和三苯甲基化的碱基。序列中的核苷酸的糖部分也可以进行修饰，并且包括，但不限于，阿拉伯糖、木酮糖和己糖。此外，可以用乙酰基、甲基、和/或硫代基团修饰核苷酸的腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶碱基。含有核苷酸取代、缺失、和/或插入的序列可以使用本领域已知的标准技术进行制备和测试。
除非另有规定，如本文所使用的，两个序列的百分比序列同一性和/或相似性可以使用如Karlin和Altschul(1993)中修改的Karlin和Altschul(1990)的算法来确定。将这样的算法并入Altschul等人(1990)的NBLAST和XBLAST程序中。可以用NBLAST程序、评分=100、字长= 12进行BLAST搜索，以获得具有期望百分比序列同一性的序列。为了获得用于比较目的的有缺口的比对，可以如Altschul等人(1997)中所述使用Gapped BLAST。当利用BLAST和Gapped BLAST程序时，可以使用各自程序(NBLAST和XBLAST)的默认参数。参见NCBI/NIH网站。
本发明还考虑具有与本文例举的核酸序列足够同源以便允许在标准严谨条件下使用标准方法(Maniatis等人，1982)与该序列的杂交的序列的那些核酸分子。如本文所使用的，对于杂交的“严谨的”条件是指其中通常在6x SSPE, 5x Denhardt溶液, 0.1% SDS,0.1 mg/ml变性DNA中在低于DNA杂合体的熔解温度(Tm) 20-25 C时过夜进行杂交的条件。下式(Beltz等人，1983)描述了熔解温度Tm：
Tm=81.5 C+16.6 Log[Na+]+0.41(%G+C)-0.61(%甲酰胺)-600/双链体的碱基对长度。
洗涤通常如下进行：
(1) 在室温在1x SSPE, 0.1% SDS中两次15分钟(低严谨洗涤)。
(2) 在Tm-20 C在0.2x SSPE, 0.1% SDS中一次15分钟(中等严谨洗涤)。
此外，本发明提供了包含PD-1核酸分子或其融合构建体的表达构建体。本发明的表达构建体通常包括在其中待表达表达构建体的预期宿主细胞中有功能的调控元件。调控元件包括启动子、转录终止序列、翻译终止序列、增强子和多聚腺苷酸化元件。
本发明的表达构建体可以包含与编码本发明的肽的核酸序列可操作地连接的启动子序列。多拷贝的启动子或多启动子可以用于本发明的表达构建体中。在一个优选实施方案中，启动子与转录起始位点定位的距离可以与在其天然遗传环境中其与转录起始位点的距离大致相同。在启动子活性没有显著下降的情况下，该距离的一些变化是允许的。表达构建体中通常包括转录起始位点。
对于动物细胞中的表达，本发明的表达构建体可以包含可以驱动多核苷酸序列转录的合适启动子。对于哺乳动物细胞，合适的启动子包括，例如，Pcmv、肌动蛋白启动子、金属硫蛋白启动子、NF-κB启动子、EGR启动子、SRE启动子、IL-2启动子、NFAT启动子、骨钙蛋白启动子、SV40早期启动子和SV40晚期启动子、Lck启动子、BMP5启动子、和TRP-1启动子。
免于病原体感染和癌症的保护
本发明的另一个方面提供了用于预防和/或治疗病原体感染和/或癌症的方法。有利地，本发明的方法诱导抗原特异性的体液和细胞介导的免疫。在一个实施方案中，该方法包括将有效量的本发明的融合蛋白或融合核酸分子施用于需要这样的治疗的受试者。
在一个实施方案中，本发明提供了诱导免于病原体感染和/或癌症的保护性免疫的方法。在一个特定实施方案中，该方法包括施用包含融合核酸分子的组合物，其中所述融合核酸分子包含编码目的抗原的核酸；编码野生型可溶性pD1蛋白的sPD-1核酸，编码本发明的spd1-14del蛋白的核酸，或编码本发明的spd1-322 del蛋白的核酸；和任选地编码Fc结构域的核酸和连接sPD-1核酸和抗原核酸的接头核酸序列。在一个实施方案中，经由电穿孔(EP)通过肌内注射施用组合物。
在另一个特定实施方案中，该方法包括施用包含融合蛋白的组合物，其中所述融合蛋白包含目的抗原；选自野生型可溶性pD1蛋白、本发明的spd1-14del蛋白、或本发明的spd1-322 del蛋白的可溶性PD-1蛋白；和任选地Fc结构域和连接sPD-1蛋白和抗原蛋白的接头序列。
该方法可用于预防和/或治疗感染和其他疾病，其中诱导抗原特异性体液和细胞介导的免疫是有益的。在一个特定实施方案中，本发明可以用于预防和/或治疗肿瘤或癌症。
如本文所使用的，术语“治疗”或其任何语法变体(例如，治疗(treat)、治疗(treating)和治疗(treatment)等)包括但不限于改善或减轻疾病或状况的症状，降低、压制、抑制、减轻或影响状况的进展、严重性和/或范围。
如本文所使用的，术语“预防”或其任何语法变体(例如，预防(prevent)、预防(preventing)和预防(prevention)等)包括但不限于延迟症状的开始，防止复发疾病，减少复发事件的数量或频率，增加症状事件之间的潜伏，或其组合。如本文所使用的，预防不需要完全抑制或消除症状。
如本文所使用的，术语“有效量”是指能够治疗或改善疾病或状况或能够以其他方式产生预期的治疗效果的量。
如本文所使用的，术语“受试者”描述生物体，包括哺乳动物如灵长类，对所述生物体可以提供用本发明的组合物的治疗。得益于公开的治疗方法的哺乳动物物种包括但不限于猿、黑猩猩、猩猩、人、猴；和其他动物如狗、猫、马、牛、猪、绵羊、山羊、鸡、小鼠、大鼠、豚鼠、和仓鼠。
在某些实施方案中，在预防病原体感染或癌症的情况下，将本发明的基于sPD-l的组合物施用于未患有待预防的病原体感染或癌症类型的受试者或未显示待预防的病原体感染或癌症类型的症状的受试者。
在一个实施方案中，本发明可以用于预防和/或治疗病毒、细菌、真菌、或其他微生物病原体的感染，所述病毒、细菌、真菌、或其他微生物病原体包括但不限于人免疫缺陷病毒(HIV)、HSV包括HSV-1 和HSV-2、KSHV、HPV包括HPV-6、HPV-11、HPV-16、和HPV-18、呼吸道合胞病毒、鼻病毒、肝炎病毒包括甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、己型肝炎病毒、和庚型肝炎病毒、致癌病毒、人嗜T淋巴细胞病毒Ⅰ型(HTLV-1)、流行性感冒、牛白血病病毒(BLV)、EB病毒、百日咳、脊髓灰质炎、麻疹、腮腺炎、风疹、天花、带状疱疹、炭疽、破伤风、轮状病毒、狂犬病、禽痘、脑膜炎球菌、白喉、乳头瘤病毒、炭疽、瘟疫、脑炎、肺炎球菌、肺炎、斑疹伤寒、伤寒热、链球菌、葡萄球菌、奈瑟氏菌、莱姆病、霍乱、大肠杆菌、志贺氏菌、利什曼虫、麻风病、巨细胞病毒(CMV)、呼吸道合胞病毒、副流感、腺病毒、水痘、黄病毒、登革热、弓形体病、球孢子菌病、血吸虫病、结核分枝杆菌、和疟疾。
在一个特定实施方案中，本发明可以用于预防和/或治疗HIV感染。在某些实施方案中，该方法包括将有效量的融合蛋白施用于需要这样的治疗的受试者，所述融合蛋白包含选自SEQ ID NO:13、17、19、23、和27的氨基酸序列。在特定实施方案中，本方法包括将有效量的融合DNA施用于需要这样的治疗的受试者，所述融合DNA包含选自SEQ ID NO:14、18、20、24、和28的核酸序列。
此外，该方法可用于治疗或减轻疾病，其中增强的体液和细胞介导的免疫是有益的。在一个实施方案中，本发明可以用于治疗或减轻肿瘤或癌症。在特定实施方案中，sPD-1蛋白可用于治疗或减轻肿瘤或癌症。
在一个实施方案中，可用于治疗或减轻肿瘤的sPD-1蛋白包含源自癌症或肿瘤细胞的抗原片段。可用于治疗或减轻肿瘤或癌症的可溶性PD-1蛋白还包括，例如，野生型mspd-1 (SEQ ID NO:1)、野生型hspd1 (SEQ ID NO:21)、mspd1-14del (SEQ ID NO:11)、mspd1-322mu (SEQ ID NO:15)、hspd1-14del (SEQ ID NO:25)、或其融合蛋白。另外或可替代地，可用于治疗或减轻肿瘤或癌症的PD-1蛋白包含与野生型 mspd-1 (SEQ ID NO:1)、野生型hspd1 (SEQ ID NO:21)、mspd1-14del (SEQ ID NO:11)、mspd1-322mu (SEQ ID NO:15)、hspd1-14del (SEQ ID NO:25)、或其融合蛋白至少95%、96%、97%、98%、99%、或99.5%相同的氨基酸序列。
在特定实施方案中，可用于治疗或减轻肿瘤或癌症的sPD-1核酸分子包括，例如，野生型mspd-1 DNA (SEQ ID NO:2)、野生型hspd1 DNA (SEQ ID NO:22)、mspd1-14del DNA(SEQ ID NO:12)、mspd1-322mu DNA (SEQ ID NO:16)、hspd1-14del DNA (SEQ ID NO:26)、或其融合蛋白。另外或可替代地，可用于治疗或减轻肿瘤或癌症的sPD-1核酸分子包含与野生型mspd-1 DNA (SEQ ID NO:2)、野生型hspd1 DNA (SEQ ID NO:22)、mspd1-14del DNA(SEQ ID NO:12)、mspd1-322mu DNA (SEQ ID NO:16)、hspd1-14del DNA (SEQ ID NO:26)、或其融合DNA至少90%、95%、96%、97%、98%、99%、或99.5%相同的序列。
治疗组合物和施用途径
本发明进一步提供了治疗或药物组合物。在一个实施方案中，组合物包含治疗有效量的本发明的蛋白和/或核酸分子和任选的药学上可接受的载体。
在一个实施方案中，将蛋白和/或核酸分子配制为疫苗组合物，用于施用于具有某些病原体感染的风险的受试者。疫苗组合物是包含一种或多种用于产生对疾病的主动免疫的免疫原性抗原的抗原制剂。此外，可以将本发明的组合物施用于具有现有感染的受试者，并且提供定制的疫苗时间表和组合物，以预防疾病恶化或使之最小化。
本发明考虑了可用于实施本文所述的治疗方法的治疗组合物。治疗组合物可以是任何药物形式，包括可注射的制剂，如液体和冻干注射剂。
在特定实施方案中，治疗有效量的本发明的蛋白和/或核酸分子通常是如下量：使得当以生理上耐受的组合物施用时足以达到约0.01微克(ug)/毫升(mL)至约200 ug/mL的血浆浓度。以不同方式表示，该剂量可以如下变化：约0.1 mg/kg至约300 mg/kg，优选约0.2mg/kg至约200 mg/kg，最优选约0.5 mg/kg至约20 mg/kg，每天一次或多次剂量施用，持续一天或几天。
用于和试剂使用的合适的无毒的药学上可接受的载体对于药物制剂领域的技术人员将是显而易见的。参见，例如，Remington's Pharmaceutical Sciences, 第17版，编辑Alfonso R. Gennaro, Mack Publishing Company, Easton, Pa. (1985)。合适的载体包括乙醇、二甲亚砜、甘油、二氧化硅、氧化铝、淀粉、山梨糖醇、肌醇、木糖醇、D-木糖、manniol、粉末状纤维素、微晶纤维素、滑石、胶体二氧化硅、碳酸钙、碳酸镁、磷酸钙、硅酸铝钙、氢氧化铝、淀粉磷酸钠、卵磷脂、和等效载体和稀释剂。盐溶液和葡萄糖水溶液和甘油溶液也可以用作液体载体，特别是用于可注射溶液。
合适的药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、稻米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、干燥脱脂乳、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。治疗组合物，如果需要，也可以含有少量的润湿剂或乳化剂，或pH缓冲剂。此外，如果需要，组合物可以含有提高活性成分有效性的少量的辅助物质，如润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂等。。
根据如待治疗的状况的类型和受试者，可以与载体材料组合以产生单一剂型的活性成分的量将变化。通常，治疗性组合物含有约5％至约95％活性成分(w/w)。更具体地，治疗组合物含有约20% (w/w)至约80%、或约30%至约70%活性成分(w/w)。
含有在其中溶解或分散的活性成分的药物组合物的制备是本领域充分理解的，并且不需要基于制剂进行限制。通常，将这样的组合物制备为注射剂，作为液体溶液或悬浮液；然而也可以制备适合于在使用之前的液体中的溶液或悬浮液的固体形式。也可以乳化该制剂。
本发明的治疗组合物可以包括其中成分的药学上可接受的盐。药学上可接受的盐包括酸加成盐(与多肽的游离氨基形成)，其是与无机酸如例如盐酸、磷酸或有机酸如醋酸、酒石酸、扁桃酸等形成的。与游离羧基形成的盐也可以衍生自无机碱如例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁和有机碱如异丙胺、三甲胺、2-乙氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等。
如本文所使用的，术语“药学上可接受的”、“生理上可耐受的”和其语法变型，当它们是指组合物、载体、稀释剂和试剂时，互换使用，并且代表该材料能够施用于哺乳动物或施用于哺乳动物上。
本发明还提供了药物包装或试剂盒，其包含一个或多个容器，所述容器填充有适于施用的一种或多种成分，例如，化合物，载体。
本发明的组合物可以施用于通过标准途径治疗的受试者，所述标准途径包括口服、吸入、或肠胃外施用，包括静脉内、皮下、局部、经皮、皮内、经粘膜、腹膜内、肌内、囊内、眼眶内、心内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、椎管内、硬脑膜外和胸骨内注射、输注、和电穿孔、以及作为待插入(暂时性或永久性)受试者的任何医疗装置或对象的成分而共同施用。
在一个优选实施方案中，本发明的微粒可以配制用于肠胃外施用。鉴于本公开内容，含有一种或多种试剂如本发明的蛋白或核酸分子的水性组合物的制备将对于本领域技术人员是已知的。通常，将这样的组合物制备为注射剂，作为液体溶液或悬浮液；也可以制备适合于在注射之前添加液体后用于制备溶液或悬浮液的固体形式；并且也可以将该制剂乳化。
适于注射使用的药物形式包括无菌水溶液或分散液；包括芝麻油、花生油或水性丙二醇的配方；以及用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。在所有情况下，形式必须是无菌的，而且必须是液体，其程度为存在轻易的可注射性。它必须在生产和保存条件下是稳定的，必须在防止微生物如细菌和真菌的污染作用的条件下保藏。
通过将所需量的活性组分并入合适的溶剂中，随后无菌过滤而制备无菌的可注射的溶液。通常，通过将各种无菌的活性成分并入包含基本分散介质和选自上面所举的成分的所需的其它成分的无菌媒介物中而制备分散剂。在用于制备无菌可注射的溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，其产生来自前面无菌过滤的其溶液的活性成分和任何其它所需的成分的粉末。
此外，本发明的核酸分子和组合物可以通过本领域中已知的方法体内递送进宿主细胞。在一个实施方案中，可以经由病毒载体如腺相关病毒(AAV)、单纯疱疹病毒(HSV)、逆转录病毒、乳头瘤病毒、腺病毒、EB病毒(EBV)体内引入本发明的核酸分子和组合物。此外，也可以经由脂质体转染(经由从合成的阳离子脂质制备的脂质体的DNA转染)体内引入本发明的核酸分子和组合物(Felgner等人, 1987)。合成的阳离子脂质(LIPOFECTIN,Invitrogen Corp., La Jolla, CA)可以用于制备脂质体以封装本发明的核酸分子。也可以使用本领域已知的方法如转染、显微注射、电穿孔、磷酸钙沉淀、并且通过生物弹射击方法作为裸DNA引入本发明的核酸分子。
具体实施方式
下列是说明用于实施本发明的实施方案的实施例。这些实施例不应解释为限制性的。所有百分比都是以重量计，并且所有溶剂混合物比例以体积计，除非另有说明。
实施例1—小鼠sPD-1疫苗候选的构建
本实施例举例说明小鼠sPD-l-p24融合构建体的构建。为了构建小鼠sPD-1-p24-Fc构建体，将携带野生型msPD-1基因和p24基因的PVAX载体与兔Fc DNA融合。载体和p24-FcDNA通过编码GGGSGGG(SEQ ID NO:29)的接头连接。转录在启动子Pcmv的控制下。
通过缺失小鼠PD-1蛋白的氨基酸89-90而获得小鼠sPD1蛋白变体mspd1-IgVΔ，所述小鼠PD-1蛋白的氨基酸89-90形成IgV结构域的C’’D环并且对于PD-1和PD-L1/L2相互作用是必不可少的。经由编码GGGSGGG (SEQ ID NO:29)接头序列的接头将携带mspd1-IgVΔ的PVAX载体与p24-兔Fc DNA连接。此外，通过将携带p24的PVAX载体与兔Fc DNA连接而获得p24-Fc融合构建体。转录在启动子Pcmv的控制下。
图1A显示msPd1-p24-Fc、mspd1-IgVΔ-p24-Fc、和p24-fc融合蛋白的氨基酸序列的比对。图1B显示根据本发明有用的各种融合构建体的Western印迹结果。简而言之，使用聚乙烯亚胺(PEI)用各种融合构建体转染293T细胞，并且在转染后72小时收集上清液。通过抗兔Fc抗体检测蛋白。图1B显示，msPd1-p24-Fc和mspd1-IgVΔ-p24-Fc大小为约72KD，而p24-Fc大小为约50KD。结果还显示，msPd1-p24-Fc、mspd1-IgVΔ-p24-Fc、和p24-Fc融合蛋白是可溶性的。
实施例2—小鼠SPD-1融合蛋白与SPD-1配体的结合能力
本实施例显示msPD-1融合蛋白与小鼠sPD-1配体的结合能力。简而言之，用PD-L(PD-L1和PD-L2)转染293T细胞。使用流式细胞仪通过FITC-抗兔Fc抗体检测sPD-1蛋白与PD-1配体的结合，并且通过flowJo分析结果。
如图2A-B所示的结果揭示，mspd1-p24-Fc与小鼠PD-1配体PD-Ll和PD-L2结合。相比之下，变体mspd1-IgVΔ融合蛋白没有与小鼠PD-1配体结合。此外，p24-Fc不影响PD-1和PD-Ll/L2之间的相互作用。
实施例3-野生型小鼠SPD1疫苗诱导体液和细胞介导的免疫应答
本实施例显示野生型msPDl-p24-Fc有效诱导体液和细胞介导的免疫应答。简而言之，在第0周引发Balb/c小鼠，并且在第3周和第6周用编码msPd1-p24-Fc、mspd1-IgVΔ-p24-Fc、或p24-Fc的20μg/小鼠DNA载体经由肌内电穿孔增强。接受PBS的小鼠充当对照。
最后免疫后两周，收集小鼠血清并且与HIV-1 p24病毒蛋白接触。通过ELISA测量抗p24 IgG1和IgG2a抗体的水平。没有显示对照样品中抗p24抗体水平，因为这些样品的吸光度读出值低于用于测定抗体滴度的截止值。抗p24抗体端点滴度被定义为产生比具有相同稀释度的对照样品的读数至少高两倍的读数的测试样品的最高稀释度的倒数。结果显示，当与用p24-Fc或mspd1-IgVΔ-p24-Fc免疫的小鼠相比时，用mspd1-p24-Fc免疫的小鼠具有高IgG1和IgG2a滴度。
为了检查p24-特异性免疫应答，使用ELIspot测定法测定关于CD8 T细胞的对于p24表位gagAI (AMQMLKDTI)(SEQ ID NO:39)特异性的分泌IFN-γ的脾细胞的数量和关于CD4 T细胞的对于p24表位gag26 (TSNPPIPVGDIYKRWIILGL) (SEQ ID NO:40)特异性的脾细胞的数量。此外，从免疫的接种疫苗的小鼠分离的脾细胞进行H2d-Kd- AMQMLKDTI-PE四聚体染色，并且分析CD8 T细胞和CD4 T细胞群体。
结果显示，当与用p24-Fc或mspd1-IgVΔ-p24-Fc免疫的小鼠相比时，用mspd1-p24-Fc免疫的小鼠具有高抗p24抗体滴度(图 3A)和分泌IFN-γ的脾细胞的较高数量(图3B和3D)。当与用p24-Fc或mspd1-IgVΔ-p24-Fc免疫的小鼠相比时，从用mspd1-p24-Fc免疫的小鼠分离的脾细胞含有约五倍更高的H2d-Kd-AMQMLKDTI四聚体阳性细胞(图 3C)。
实施例4-用野生型小鼠SPD1融合蛋白免疫的小鼠中VTT-HIV-GAGPOL滴度的降低
本实施例显示用野生型msPDl融合蛋白免疫保护免于病毒感染。简而言之，在第0周引发Balb/c小鼠，并且在第3周和第6周用编码msPd1-p24-Fc、mspd1-IgVΔ-p24-Fc、或p24-Fc的20μg/小鼠DNA经由肌内电穿孔增强。接受PBS的小鼠充当对照。免疫后的三周，用4×107PFU牛痘VTT-HIV-gagpol鼻内攻击小鼠。病毒攻击后3天将小鼠处死，并且通过噬斑测定评价肺中的病毒滴度。结果显示用mspd1-p24-Fc免疫的小鼠在病毒攻击后显示明显降低的VTT-HIV-gagpol滴度(图4)。
实施例5-野生型人SPD1疫苗诱导体液和细胞介导的免疫应答
通过将携带hsPD-1-p24的PVAX载体与兔Fc DNA融合而构建人sPD-1-p24-Fc。载体和p24-Fc DNA通过编码GGGSGGG(SEQ ID NO:29)的接头连接。转录在启动子Pcmv的控制下。
为了分析hsPD-1-p24-Fc与sPD-1配体的结合能力，分别用小鼠PD-L1和PD-L2转染293T细胞。使用流式细胞仪通过小鼠sPD-1-Fc蛋白和FITC-抗兔Fc抗体检测sPD-1蛋白与PD-1配体的结合，并且通过flowJo分析结果。如图6A和6B所示的结果揭示，hspd1-p24-Fc融合蛋白与PD-1配体结合。
为了检查hsPD-1-p24-Fc对免疫应答的诱导，在第0周引发Balb/c小鼠，并且在第3周和第6周用编码hsPD1-p24-Fc或p24-Fc的20μg/小鼠DNA经由肌内电穿孔增强。接受PBS的小鼠充当对照。
最后免疫后两周，收集小鼠血清。通过ELISA测量抗p24 IgG1和IgG2a抗体的水平。没有显示对照样品中抗p24抗体水平，因为这些样品的吸光度读出值低于用于测定抗体滴度的截止值。抗p24抗体端点滴度被定义为产生比具有相同稀释度的对照样品的读数至少高两倍的读数的测试样品的最高稀释度的倒数。如图6C所示的结果揭示，当与用p24-Fc免疫的小鼠相比时，用hspd1-p24-Fc免疫的小鼠具有高IgG1和IgG2a滴度。
为了检查p24-特异性免疫应答，通过ELIspot测定法测定关于CD8 T细胞的对于p24表位gagAI (AMQMLKDTI)(SEQ ID NO:39)特异性的分泌IFN-γ的脾细胞的数量和关于CD4 T细胞的对于p24表位gag26 (TSNPPIPVGDIYKRWIILGL) (SEQ ID NO:40)特异性的分泌IFN-γ的脾细胞的数量。条代表三份样品的平均值(±标准偏差)。如图6D所示的结果揭示，野生型hsPD1 (hspd1-p24-Fc)与小鼠pD-L1和PD-L2结合，并且有效引发体液和细胞介导的免疫应答。
图5显示，使用sPD-1-p24-fc靶向树突状细胞诱导了增强的p24特异性抗体和T细胞应答。
实施例6—小鼠SPD-1变体疫苗候选的构建
本实施例举例说明变体msPD-1融合候选的构建。构建小鼠sPD1变体、mspd1-14del和mspd1-322mu(图7A)。通过缺失野生型mspdl的氨基酸26-39(由野生型小鼠PD-1基因的第二个外显子的第一部分编码)而获得mspd1-14del变体。通过将野生型小鼠PD-1蛋白的氨基酸残基108从Met变为Val而获得mspd1-322mu变体。
通过将携带mspd1变体-p24的PVAX载体与兔Fc DNA融合而获得小鼠sPD-1融合构建体。PVAX载体和p24-Fc DNA通过编码GGGSGGG(SEQ ID NO:29)的接头连接。转录在启动子Pcmv的控制下。
图7A显示msPd1-p24-Fc、mspd1-14del-p24-Fc、mspd1-322mu-p24-Fc、和p24-Fc融合蛋白的氨基酸序列的比对。图7B显示根据本发明有用的各种融合蛋白的Western印迹结果。简而言之，使用聚乙烯亚胺(PEI)用各种融合构建体转染293T细胞，并且在转染后72小时收集上清液。通过抗兔Fc抗体检测蛋白。图7B显示，mspd1-14del-p24-Fc和mspd1-322mu-p24-Fc大小为约72KD，而p24-Fc 大小为约50KD。结果还显示，mspd1-14del-p24-Fc和mspd1-322mu-p24-Fc融合蛋白是可溶性的。
实施例7—小鼠SPD-1变体融合蛋白与SPD-1配体的结合能力
本实施例显示，msPD-1变体融合蛋白、mspd1-14del-p24-Fc和mspd1-322mu-p24-Fc不与小鼠sPD-1配体pD-L1和pD-L2结合(图8)。简而言之，用PD-L(PD-L1和PD-L2)转染293T细胞。使用流式细胞仪通过小鼠sPD-1-p24-Fc蛋白和FITC-抗兔Fc抗体检测sPD-1蛋白与PD-1配体的结合，并且通过flowJo分析结果。
实施例8-变体小鼠sPD1疫苗诱导体液和细胞介导的免疫应答
本实施例显示msPD1变体有效引发体液和细胞介导的免疫应答。简而言之，在第0周引发Balb/c小鼠，并且在第3周和第6周用编码mspd1-14del-p24-Fc、mspd1-322mu-p24-Fc、或p24-Fc的20μg/小鼠DNA载体经由肌内电穿孔增强。接受PBS的小鼠充当对照。
最后免疫后两周，收集小鼠血清。通过ELISA测量抗p24 IgG1和IgG2a抗体的水平。没有显示对照样品中抗p24抗体水平，因为这些样品的吸光度读出值低于用于测定抗体滴度的截止值。抗p24抗体端点滴度被定义为产生比具有相同稀释度的对照样品的读数至少高两倍的读数的测试样品的最高稀释度的倒数。结果显示，当与用p24-Fc免疫的小鼠相比时，用mspd1-14del-p24-Fc或mspd1-322mu-p24-Fc免疫的小鼠具有高IgG1和IgG2a滴度。
为了检查p24-特异性免疫应答，通过ELIspot测定法测定关于CD8 T细胞的对于p24表位gagAI (AMQMLKDTI)(SEQ ID NO:39)特异性的分泌IFN-γ的脾细胞的数量和关于CD4 T细胞的对于p24表位gag26 (TSNPPIPVGDIYKRWIILGL) (SEQ ID NO:40)特异性的分泌IFN-γ的脾细胞的数量。
结果显示，用mspd1-14del-p24-Fc或mspd1-322mu-p24-Fc免疫的小鼠具有高抗p24抗体滴度(图9A)和分泌IFN-γ的脾细胞的较高数量(图9B和9D)。当与用p24-Fc免疫的小鼠相比时，从用mspd1-14del-p24-Fc或mspd1-322mu-p24-Fc免疫的小鼠分离的脾细胞含有更高的H2d-Kd-AMQMLKDTI四聚体阳性细胞(图9C)。
实施例9-用变体小鼠SPD1融合蛋白免疫的小鼠中VTT-HIV-GAGPOL滴度的降低
本实施例显示用变体mspd1-14del-p24-Fc或mspd1-322mu-p24-Fc免疫保护免于HIV感染。简而言之，在第0周引发Balb/c小鼠，并且在第3周和第6周用编码mspd1-14del-p24-fc或mspd1-322mu-p24-Fc的20μg/小鼠DNA经由肌内电穿孔增强。免疫后的三周，用4×107PFU VTT-HIV-gagpol鼻内攻击小鼠。接受PBS的小鼠充当对照。病毒攻击后3天将小鼠处死，并且通过噬斑测定评价肺中的病毒滴度。结果显示，用mspd1-14del-p24-Fc或mspd1-322mu-p24-Fc免疫的小鼠在病毒攻击后显示明显降低的VTT-HIV-gagpol滴度(图10)。
实施例10-变体人SPD1疫苗诱导体液和细胞介导的免疫应答
在本实施例中，构建变体hsPDl构建体hsPD1-14del-p24-Fc。为了分析hsPD1-14del-p24-Fc蛋白与小鼠PD-L1和PD-L2的结合能力，分别用PD-L1和PD-L2转染293T细胞。使用流式细胞仪通过FITC-抗兔Fc抗体检测hsPD1-14del-p24-Fc蛋白与PD-1的结合，并且通过flowJo分析结果。如图11A和11B所示的结果揭示，hspd1-p24-Fc融合蛋白与PD-1配体结合。
为了检查hsPD1-14del-p24-Fc对免疫应答的诱导，在第0周引发Balb/c小鼠，并且在第3周和第6周用编码hsPD1-14del-p24-Fc或p24-Fc的20μg/小鼠DNA经由肌内电穿孔增强。接受PBS的小鼠充当对照。
最后免疫后两周，收集小鼠血清。通过ELISA测定抗p24 IgG1和IgG2a抗体的水平。没有显示对照样品中抗p24抗体水平，因为这些样品的吸光度读出值低于用于测定抗体滴度的截止值。抗p24抗体端点滴度被定义为产生比具有相同稀释度的对照样品的读数至少高两倍的读数的测试样品的最高稀释度的倒数。
为了检查p24-特异性免疫应答，通过ELIspot测定法测定关于CD8 T细胞的对于p24表位gagAI (AMQMLKDTI)(SEQ ID NO:39)特异性的分泌IFN-γ的脾细胞的数量和关于CD4 T细胞的对于p24表位gag26 (TSNPPIPVGDIYKRWIILGL) (SEQ ID NO:40)特异性的分泌IFN-γ的脾细胞的数量。尽管hspd1-14del-p24-Fc蛋白没有与PD-1结合，但是结果显示，hspd1-14del-p24-Fc在HIV病毒攻击后显著增强体液和细胞介导的免疫应答(图11C和图11D)。
实施例11-基于SPD-1的疫苗对树突状细胞的抗原靶向扩增CD8 T细胞免疫
本实施例显示，基于sPD-1的疫苗通过将疫苗抗原靶向至树突状细胞(DCs)、而同时阻断PD-l/PD-L通路对T细胞功能的负面影响而改善CD8+ T细胞免疫。
选择HIV-1 Gag p24作为测试抗原，因为它已经通常用于其他DC靶向策略作为模型免疫原7,8。设计三种DNA疫苗p24-fc、sPD-1-p24-fc、和sIgV-PD-1-p24-fc(图13a和16a)。sIgV-PD-1-p24-fc与sPD-1-p24-fc的不同在于sPD-1的功能IgV结构域中的两个必需氨基酸，使其无法结合PD-1配体14。
结果显示，PD-L1和PD- L2与重组sPD-l-p24-fc蛋白相互作用，但不与sIgV-PD-1-p24-fc或p24-fc蛋白相互作用(图16b)。
此外，表达PD-L1和PD-L2(图17a)的Balb/c小鼠骨髓(BM)衍生的CD11c+ DCs与sPD-1- p24-fc结合，但不与sIgV-PD-1-p24-fc结合(图17b)。
用20μg sPD-1-p24-fc或对照蛋白刺激(pulse)2x106 BM-DCs，并且根据标准免疫时间表15,16经由尾静脉回输进Balb/c小鼠中(图13b)。与sIgV-PD-1-p24-fc相比，sPD-1-p24-fc刺激的BM-DCs引发更高水平的抗p24 IgG1 (Th2)和IgG2a (Th1)抗体应答(p<0.05；图17c)。增加水平的p24-特异性CD8+ T细胞免疫也是显然的，正如IFN-γ ELISpot (图17d)和H2-Kd-AMQMLKDTI (Gag-AI)四聚体测定法17,18所测定的(图17e)。结果显示，基于sPD-1的蛋白疫苗通过靶向树突状细胞诱导p24特异性CD8+ T细胞免疫。
结果还显示，sPD-1-p24-fc可以用作免于感染的DNA疫苗。本发明人以前已经显示，肌内(i.m.)/EP一致地增强DNA疫苗的免疫原性13,19,20。
在本实施例中，使用20μg或100μg的疫苗剂量进行i.m. sPD-1-p24-fc/EP接种疫苗(图13b)。结果显示，如IFN-γ+ ELISpots(图13d和13e)所测定的，除有效和剂量依赖性的抗Gag CD8+ (p<0.001)和CD4+ (p<0.05)T细胞应答以外，当与sIgV-PD-1-p24-fc/EP对照比较时，sPD-1-p24-fc/EP引发显著更高水平的IgG1 (4倍; p<0.01)和IgG2a (8倍; p<0.01)抗体应答(图13c)。具体而言，在剂量20μg和100μg分别发现针对CD8+-特异性Gag-AI表位的约700和1600 ELISpots/106个脾细胞。这与本发明人以前描述15,16的由1mg/i.m.ADVAX (密码子优化的HIV DNA疫苗)或106 TCID50/i.m. ADMVA (牛痘MVA-载体的HIV-1疫苗)引发的针对相同表位的200-300 ELISpots/106个脾细胞形成很大的对比。
p24-特异性T细胞免疫不限于单一的GAG-AI表位。约800-1000 ELISpots/106个脾细胞与三种横跨整个p24蛋白的非重叠肽合并物中的每一种反应，表明了在用sPD-1-p24-fc/EP接种疫苗之后的抗Gag T细胞应答的广泛的宽度(图13f)。此外，在20μg和100μg sPD-1-p24-fc/EP剂量组中分别超过12.7%和22%的CD8+ T细胞对于H2-Kd-Gag- AI四聚体结合是阳性的，这比sIgV-PD-1-p24-fc/EP组中的值显著更高(P <0.05，图13g和13h)，并且与用两种活载体L. monocytogenes和Ad5使用异源引发-增强方案在Balb/c小鼠中观察到的那些相当18。
此外，本实施例研究了p24-特异性T细胞群体对抗原刺激应答以分泌IFN-γ、TNF-α和IL-2的能力。与sIgV- PD-1-p24-fc/EP相比，sPD-1-p24-fc/EP引发基本上更高的产生IFN-γ (47.1%)和TNF-α (23.6%)的p24-特异性CD8+ T细胞的频率，并且提高了产生IFN-γ (6.8%)和TNF-α (3.6%)的p24-特异性CD4+ T细胞的频率(图14a和14b)。结果显示，产生效应物的CD8+和CD4+ T细胞群体的比例相似，顺序为IFN-γ+/TNF-α+ > IFN-γ+ > IFN-γ+/TNF-α+/IL-2+ (图14c和14d)。在分析总的产生细胞因子的p24-特异性CD8+ T细胞之后，分泌IFN-γ (42.2%)、IFN-γ/TNF-α (44.8%)和IFN-γ/TNF-α/IL-2 (9.4%)的细胞的高频率表明增强的疫苗效价(图14e)。
为了表征sPD-1-p24-fc/EP接种疫苗和研究其免疫诱导的一种或多种根本机制，进行额外的实验。具体而言，本实施例比较了在20μg剂量时有或没有EP的sPD-1-p24-fcDNA接种疫苗。在没有EP的情况下，与sPD-1-p24-fc/EP相比，sPD-1-p24-fc诱导了少10倍的分泌IFN-γ+的CD8+ T细胞(图18a和13d)，可能是由于缺乏EP将DC有效招募至该部位3。此外，在没有EP的情况下递送时sPD-1-p24-fc和sIgV-PD-1-p24-fc诱导的CD8+ T细胞之间缺乏统计学差异表明，sPD-1单独不具有强烈的佐剂效果。
在另一项实验中，通过i.m./EP用20μg的sPD-1-fc和p24-fc的混合物共同免疫小鼠，并且在这两组中它们的IFN-γ+/CD8+ T细胞应答之间没有发现统计学差异(图18b)，表明单独的sPD-1-fc的重新合成不足以增强免疫原性。这显示经由抗原与sPD-1的融合的DC靶向的重要性。
为了排除兔-Fc在增强p24-特异性免疫中的作用，从sPD-1-p24-fc和p24-fc去除兔Fc片段以产生用于免疫的sPD-1-p24和p24 DNA疫苗。在佐证sPD-1-p24-fc/EP中，sPD-1-p24/EP诱导了比p24/EP显著更高水平的IFN-γ+/CD8+ T细胞应答(图18c)。此外，在sPD-1-p24-fc/EP和sPD-1-p24/EP的诱导p24-特异性IFN-γ+/CD8+ T细胞应答的能力之间没有统计学差异(图13b和18c)。
在另一项实验中，人(hu-)sPD-1-p24-fc疫苗用于比较研究，因为已知hu-sPD-1与鼠PD-L1和PD-L223交叉反应(图19a)。结果显示，在Balb/c小鼠中，当与p24-fc/EP相比时，hu-sPD-1-p24-fc/EP诱导了显著更高水平的p24-特异性IFN-γ+/CD8+ T细胞和抗体应答(图19b和19c)。还诱导了抗人PD-1应答，这是由于与鼠PD-1的序列差异引起的，这可以解释在观察的免疫原性概况中鼠sPD-1-p24-fc/EP和hu-sPD-1-p24-fc/EP之间的差异(即在用hu-sPD-1-p24-fc/EP免疫的小鼠中p24-特异性CD4+ T细胞应答是弱的)(图13e和图19c)。
为了确定sPD-1-p24-fc/EP是否引发长寿的p24-特异性记忆T细胞应答，在用20µgDNA疫苗第三次免疫后将7.5个月的小鼠组处死。除持久性抗p24 IgG1和IgG2a抗体应答(图15a)以外，与对照相比，在用sPD-1-p24-fc/EP免疫的小鼠中p24-特异性CD8+(p<0.05)和CD4+ (p<0.05)记忆T细胞应答是持续的(图15b和15c)。
为了研究sPD-1-p24-fc/EP引发的细胞免疫是否导致保护，用2x105 PFU的修饰以表达HIV-1 gag和pol的牛痘的强毒株(WRgagpol)鼻内攻击以100μg的剂量用DNA疫苗免疫的Balb/c小鼠(图13b)。攻击后八天，与对照相比，在用sPD-1-p24-fc/EP接种疫苗的小鼠中观察到肺中病毒滴度的显著降低(p<0.01；图15d)。与用sPD-1-p24-fc/EP免疫且在攻击后存活且具有<7%体重降低的小鼠相比，用安慰剂或sIgV-PD-1-p24-fc/EP免疫的小鼠在病毒接种后8天内显示>25%体重降低(图15e)。因为没有涉及的抗牛痘中和抗体，结果表明，sPD-1-p24-fc/EP诱导的p24-特异性T细胞免疫提供了显著的免于强毒病毒的粘膜攻击的保护。
总而言之，本实施例表明，经由sPD-1作为DNA疫苗将HIV-1 p24靶向至DC增强了特异性CD8+ T细胞免疫的级别、广度和多功能性。基于sPD-1的DNA疫苗可以用于诱导免于病原体感染包括HIV-1、肺结核和疟疾的保护性且持久的CD8+ T细胞免疫。
材料与方法
基于sPD-1的疫苗和对照的构建
在pVAX1的背景中构建三种DNA疫苗sPD-1-p24-fc、sIgV-PD-1-p24-fc、和p24-fc(图13a)。通过巢式PCR从小鼠cDNA获得小鼠PD-1(sPD-1)的胞外结构域的编码序列10,26，并且在没有密码子优化的情况下从中国患者的原代分离物HIV-102HNsq4扩增HIV-1 p24片段27。为了增加融合蛋白的柔韧性，在sPD-1和HIV-1 p24基因之间应用接头。
还根据与野生型PD-1相同的策略克隆sPD-1的突变体形式(slgV-PD-l)。sIgV-PD1不与PD-1配体反应4,28，因为在IgV结构域中存在两个必需氨基酸(位置89-90)符合读框地缺失。单独表达HIV-1 p24的质粒充当对照。
所有质粒含有促进蛋白纯化和表征的兔Fc标签。使用聚乙烯亚胺(PEI)进行DNA转染进(HEK-)293T细胞中，并且使用抗兔Fc抗体通过Western印迹检测蛋白表达。
使用蛋白G琼脂糖(Invitrogen)通过亲和层析从转染细胞的上清液纯化重组蛋白，并且通过Micro BCA蛋白测定试剂盒(Thermo Scientific)测定蛋白浓度。
sPD-1融合蛋白的结合特征
将瞬时表达pD-L1和pD L2的106 293T细胞与2μg纯化的sPD-1-p24-fc、sIgV-PD-1-p24-fc或p24-fc融合蛋白孵育。山羊抗兔IgG (H+L)-FITC (Invitrogen)用来捕获阳性细胞。FITC-大鼠抗小鼠PD-L1或PD-L2抗体(eBioscience)和FITC-大鼠IgG1同种型染色的转染的293T细胞分别充当阳性和阴性对照。在FACSCalibur仪器(BD Biosciences)上获得数据，并且使用BD CellQuest软件进行分析。
小鼠免疫
所有动物实验由香港大学活动物在教学和研究中的用途的委员会(theCommittee on the Use of Live Animals in Teaching and Research of theUniversity of Hong Kong)批准。在香港大学实验室动物单元的标准无病原体条件下，繁殖5-8周大的雌性Balb/c小鼠。将小鼠在具有规定温度和湿度的标准条件下放在笼子里，用投掷的食物和自来水喂养，并且根据实验动物护理和使用指南中概述的标准进行护理。
免疫程序与以前在15,16中所述的方案类似(图13b)。小鼠以20μg或100μg/小鼠的剂量每隔三周在有或没有EP的情况下通过肌内(i.m.)注射接受三次DNA免疫。最后免疫后两周，将小鼠处死，并且收集血清和脾脏细胞(脾细胞)用于免疫应答分析。
酶联免疫吸附测定(ELISA)
如前面所述15,16通过ELISA评价特异性抗体应答。简而言之，用HIV-1 p24蛋白(Abcam)包被高亲和力蛋白结合的ELISA板(BD Bioscieces)。然后添加系列稀释的血清，并且通过山羊辣根过氧化物酶(HRP)-标记的抗小鼠IgG1或IgG2a抗体(Sigma)检测抗体。相对抗体滴度表示为产生比相同稀释度的对照血清样品的读出值至少大两倍的光密度读出值的样品的最高稀释度的倒数。
HIV-1 Gag p24-特异性T细胞应答的评价
如前面所述15,16通过ELISpot测定(Millipore)评价产生IFN-γ的T细胞。在体外使用2μg/ml HIV-1 p24肽或肽合并物(每种肽的终浓度为2μg/ml，由NIH捐赠)来刺激脾细胞。将由Gag p24文库的59-成员组成的肽合并物分为3份19-20肽的合并物，所述合并物跨越氨基酸1-87(合并物1)、77-167(合并物2)和157-231(合并物3)。肽gagAI (AMQMLKDTI)对于CD8+ T细胞是特异性的，而肽gag26(TSNPPIPVGDIYKRWIILGL)对于CD4+ T细胞是特异性的15,16。
通过500ng/ml PMA加上1 μg/ml钙离子霉素(calcium ionocycin)刺激的细胞或仅留在培养基中的细胞分别充当阳性和阴性对照。细胞在37°C、5% CO2、和100%湿度刺激20h。通过免疫斑点阅读器和图像分析仪(Thermo Scientific)鉴定斑点。
对于细胞内细胞因子染色(ICS)，在37oC在共刺激性抗CD28抗体(2μg/ml,eBioscience)存在的情况下用HIV-1 p24肽合并物(每种肽2μg/ml)刺激脾细胞20~24h。添加10μg/ml Brefeldin A (BFA; Sigma)持续最后5 h以累积胞内细胞因子。洗涤细胞并且在4oC与2.4G2 mAb孵育15min以阻断Fcγ。在用抗小鼠CD3-APC/cy7、CD4-PE/cy5、CD8-Percp/cy5.5抗体(eBioscience)表面染色后,细胞在4°C在100μl固定/通透溶液(BDBiosciences)中通透20min，用Perm/Wash™缓冲液(BD)洗涤，并且然后用抗IFN-γ-PE、抗IL-2-PE/cy7、抗TNF-α-FITC(eBioscience)胞内染色。使用藻红蛋白(PE)-缀合的主要组织相容性复合物(MHC)I类四聚体H2d-Kd-AMQMLKDTI (Beckman Coulter)评价四聚体阳性的CD8+ T细胞群体。在BD Arial III流式细胞仪(BD Biosciences)上获得流式细胞术数据并进行分析。
抗原刺激的树突状细胞的小鼠免疫
通过Dynabeads小鼠DC富集试剂盒(Invitrogen)富集来自Balb/c小鼠的骨髓DC(BM-Dc)。在4ºC将200万CD11c+ BM-DC与20µg纯化的sPD-1-p24-fc或sIgV-PD-1-p24-fc蛋白共培养1h。细胞然后用pBS充分洗涤，并且经由尾静脉注射转导进小鼠中。未处理的DC独自充当对照。免疫程序和免疫应答分析与上面描述的相同。
牛痘病毒攻击
用2x105 PFUs被修饰以表达HIV-1 gag和pol基因的牛痘株Western Reserve(WR)病毒鼻内攻击免疫的小鼠。每天监测动物体重。攻击后8天也将动物组处死以测量它们的肺中的病毒滴度。通过物理破坏制备肺匀浆，并且通过在单层Vero细胞上的噬斑形成测定法测定肺中的病毒滴度，并且监测细胞病变效应。
统计分析
使用成对的单尾Student’s t检验(paired one- tailed Student’s t test)进行所有统计分析。P值小于0.05被认为是统计学显著的。数据表示为至少3次独立实验的平均值±标准误差。
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应当理解的是，本文描述的实施例和实施方案仅用于说明目的，并且鉴于其的各种修饰或变化将提示于本领域技术人员并且将包括在本申请的精神和范围之内。
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26. Kuipers, H.等人 Contribution of the PD-1 ligands/PD-1 signalingpathway to dendritic cell-mediated CD4+ T cell activation. Eur J Immunol 36,2472-2482 (2006).
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序列表
<110> 香港大学
<120> 可溶性 PD-1变体、融合构建体及其用途
<130> UHK.152XC1
<150> 61/412,557
<151> 2010-11-11
<160> 40
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 178
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠
<400> 1
Met Trp Val Arg Gln Val Pro Trp Ser Phe Thr Trp Ala Val Leu Gln
1 5 10 15
Leu Ser Trp Gln Ser Gly Trp Leu Leu Glu Val Pro Asn Gly Pro Trp
20 25 30
Arg Ser Leu Thr Phe Tyr Pro Ala Trp Leu Thr Val Ser Glu Gly Ala
35 40 45
Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Leu Ser Asn Trp Ser Glu Asp Leu Met
50 55 60
Leu Asn Trp Asn Arg Leu Ser Pro Ser Asn Gln Thr Glu Lys Gln Ala
65 70 75 80
Ala Phe Cys Asn Gly Leu Ser Gln Pro Val Gln Asp Ala Arg Phe Gln
85 90 95
Ile Ile Gln Leu Pro Asn Arg His Asp Phe His Met Asn Ile Leu Asp
100 105 110
Thr Arg Arg Asn Asp Ser Gly Ile Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu
115 120 125
His Pro Lys Ala Lys Ile Glu Glu Ser Pro Gly Ala Glu Leu Val Val
130 135 140
Thr Glu Arg Ile Leu Glu Thr Ser Thr Arg Tyr Pro Ser Pro Ser Pro
145 150 155 160
Lys Pro Glu Gly Arg Phe Gln Pro Glu Phe Arg Gly Gly Gly Ser Gly
165 170 175
Gly Gly
<210> 2
<211> 537
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 小鼠
<400> 2
atgtgggtcc ggcaggtacc ctggtcattc acttgggctg tgctgcagtt gagctggcaa 60
tcagggtggc ttctagaggt ccccaatggg ccctggaggt ccctcacctt ctacccagcc 120
tggctcacag tgtcagaggg agcaaatgcc accttcacct gcagcttgtc caactggtcg 180
gaggatctta tgctgaactg gaaccgcctg agtcccagca accagactga aaaacaggcc 240
gccttctgta atggtttgag ccaacccgtc caggatgccc gcttccagat catacagctg 300
cccaacaggc atgacttcca catgaacatc cttgacacac ggcgcaatga cagtggcatc 360
tacctctgtg gggccatctc cctgcacccc aaggcaaaaa tcgaggagag ccctggagca 420
gagctcgtgg taacagagag aatcctggag acctcaacaa gatatcccag cccctcgccc 480
aaaccagaag gccggtttca accggaattc cggggtggtg gtggttcagg aggagga 537
<210> 3
<211> 231
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HIV
<400> 3
Pro Ile Val Gln Asn Leu Gln Gly Gln Met Val His Gln Pro Ile Ser
1 5 10 15
Pro Arg Thr Leu Asn Ala Trp Val Lys Val Ile Glu Glu Lys Ala Phe
20 25 30
Ser Pro Glu Val Ile Pro Met Phe Ser Ala Leu Ser Glu Gly Ala Thr
35 40 45
Pro Gln Asp Leu Asn Thr Met Leu Asn Thr Val Gly Gly His Gln Ala
50 55 60
Ala Met Gln Met Leu Lys Glu Thr Ile Asn Glu Glu Ala Ala Glu Trp
65 70 75 80
Asp Arg Leu His Pro Val Gln Ala Gly Pro Val Ala Pro Gly Gln Met
85 90 95
Arg Glu Pro Arg Gly Ser Asp Ile Ala Gly Thr Thr Ser Asn Leu Gln
100 105 110
Glu Gln Ile Gly Trp Met Thr Asn Asn Pro Pro Ile Pro Val Gly Glu
115 120 125
Ile Tyr Lys Arg Trp Ile Ile Leu Gly Leu Asn Lys Ile Val Arg Met
130 135 140
Tyr Ser Pro Thr Ser Ile Leu Asp Ile Arg Gln Gly Pro Lys Glu Pro
145 150 155 160
Phe Arg Asp Tyr Val Asp Arg Phe Tyr Lys Thr Leu Arg Ala Glu Gln
165 170 175
Ala Ser Gln Glu Val Lys Asn Trp Met Thr Glu Thr Leu Leu Val Gln
180 185 190
Asn Ser Asn Pro Asp Cys Lys Thr Ile Leu Lys Ala Leu Gly Pro Ala
195 200 205
Ala Thr Leu Glu Glu Met Met Thr Ala Cys Gln Gly Val Gly Gly Pro
210 215 220
Gly His Lys Ala Arg Val Leu
225 230
<210> 4
<211> 693
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HIV
<400> 4
cctatagtgc aaaacctcca ggggcaaatg gtacatcagc ccatatcacc tagaacttta 60
aatgcatggg taaaagtaat agaagagaag gcttttagtc cagaagtaat acccatgttt 120
tcagcattat cagaaggagc caccccacaa gatttaaaca ccatgctaaa cacagtgggg 180
ggacatcaag cagccatgca aatgttaaaa gaaaccatca atgaggaagc tgcagaatgg 240
gatagattgc atccagtgca ggcagggcca gttgcaccag gccagatgag agaaccaagg 300
ggaagtgaca tagcaggaac tactagtaat cttcaggagc aaataggatg gatgacaaat 360
aatccaccta tcccagtagg agaaatctat aaaagatgga taatcctggg gttaaataaa 420
atagtaagaa tgtatagccc taccagcatt ctggacataa gacaaggacc aaaggaaccc 480
tttagagact atgtagaccg gttctataaa actctaagag ccgagcaagc ttcacaagag 540
gtaaaaaatt ggatgacaga aaccttgttg gtccaaaatt cgaacccaga ttgtaagact 600
attttaaaag cattgggacc agcagctaca ctagaagaaa tgatgacagc atgtcaggga 660
gtggggggac ctggccataa agcaagagtt ttg 693
<210> 5
<211> 288
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> rabbit
<400> 5
Met Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu
1 5 10 15
Lys Lys Leu Gly Gly Ser Asn Asp Ile Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser
20 25 30
Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser Ala Ser His Leu Glu Gln Tyr
35 40 45
Leu Glu Ala Thr Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Ala Pro Ser Thr
50 55 60
Cys Ser Lys Pro Met Cys Pro Pro Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
65 70 75 80
Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
85 90 95
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Asp Asp Pro
100 105 110
Glu Val Gln Phe Thr Trp Tyr Ile Asn Asn Glu Gln Val Arg Thr Ala
115 120 125
Arg Pro Pro Leu Arg Glu Gln Gln Phe Asn Ser Thr Ile Arg Val Val
130 135 140
Ser Thr Leu Pro Ile Ala His Gln Asp Trp Leu Arg Gly Lys Glu Phe
145 150 155 160
Lys Cys Lys Val His Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
165 170 175
Ile Ser Lys Ala Arg Gly Gln Pro Leu Glu Pro Lys Val Tyr Thr Met
180 185 190
Gly Pro Pro Arg Glu Glu Leu Ser Ser Arg Ser Val Ser Leu Thr Cys
195 200 205
Met Ile Asn Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ser Val Glu Trp Glu Lys
210 215 220
Asn Gly Lys Ala Glu Asp Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Thr Val Leu Asp
225 230 235 240
Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val Pro Thr Ser
245 250 255
Glu Trp Gln Arg Gly Asp Val Phe Thr Cys Ser Val Met His Glu Ala
260 265 270
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Ile Ser His Ser Pro Gly Lys
275 280 285
<210> 6
<211> 880
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> rabbit
<400> 6
atcctgatgc agtacatcaa ggccaacagt aagttcatcg gaatcaccga gcttaagaag 60
ctgggaggct caaacgacat attcaacaac ttcacagtgt ccttctggtt gcgggttccc 120
aaggtctctg ctagccacct cgaacaatac ctggaggcca ccaacaccaa agtggacaag 180
accgttgcgc cctcgacatg cagcaagccc atgtgcccac cccctgaact cctgggggga 240
ccgtctgtct tcatcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc acgcaccccc 300
gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc caggatgacc ccgaggtgca gttcacatgg 360
tacataaaca acgagcaggt gcgcaccgcc cggccgccgc tacgggagca gcagttcaac 420
agcacgatcc gcgtggtcag caccctcccc atcgcgcacc aggactggct gaggggcaag 480
gagttcaagt gcaaagtcca caacaaggca ctcccggccc ccatcgagaa aaccatctcc 540
aaagccagag ggcagcccct ggagccgaag gtctacacca tgggccctcc ccgggaggag 600
ctgagcagca ggtcggtcag cctgacctgc atgatcaacg gcttctaccc ttccgacatc 660
tcggtggagt gggagaagaa cgggaaggca gaggacaact acaagaccac gccgaccgtg 720
ctggacagcg acggctccta cttcctctac agcaagctct cagtgcccac gagtgagtgg 780
cagcggggcg acgtcttcac ctgctccgtg atgcacgagg ccttgcacaa ccactacacg 840
cagaagtcca tctcccactc tcctggtaaa taatctagag 880
<210> 7
<211> 176
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mspd1-IgV
<400> 7
Met Trp Val Arg Gln Val Pro Trp Ser Phe Thr Trp Ala Val Leu Gln
1 5 10 15
Leu Ser Trp Gln Ser Gly Trp Leu Leu Glu Val Pro Asn Gly Pro Trp
20 25 30
Arg Ser Leu Thr Phe Tyr Pro Ala Trp Leu Thr Val Ser Glu Gly Ala
35 40 45
Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Leu Ser Asn Trp Ser Glu Asp Leu Met
50 55 60
Leu Asn Trp Asn Arg Leu Ser Pro Ser Asn Gln Thr Glu Lys Gln Ala
65 70 75 80
Ala Phe Cys Asn Gly Leu Ser Gln Gln Asp Ala Arg Phe Gln Ile Ile
85 90 95
Gln Leu Pro Asn Arg His Asp Phe His Met Asn Ile Leu Asp Thr Arg
100 105 110
Arg Asn Asp Ser Gly Ile Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu His Pro
115 120 125
Lys Ala Lys Ile Glu Glu Ser Pro Gly Ala Glu Leu Val Val Thr Glu
130 135 140
Arg Ile Leu Glu Thr Ser Thr Arg Tyr Pro Ser Pro Ser Pro Lys Pro
145 150 155 160
Glu Gly Arg Phe Gln Pro Glu Phe Arg Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
165 170 175
<210> 8
<211> 531
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mspd1-IgV
<400> 8
atgtgggtcc ggcaggtacc ctggtcattc acttgggctg tgctgcagtt gagctggcaa 60
tcagggtggc ttctagaggt ccccaatggg ccctggaggt ccctcacctt ctacccagcc 120
tggctcacag tgtcagaggg agcaaatgcc accttcacct gcagcttgtc caactggtcg 180
gaggatctta tgctgaactg gaaccgcctg agtcccagca accagactga aaaacaggcc 240
gccttctgta atggtttgag ccaacaggat gcccgcttcc agatcataca gctgcccaac 300
aggcatgact tccacatgaa catccttgac acacggcgca atgacagtgg catctacctc 360
tgtggggcca tctccctgca ccccaaggca aaaatcgagg agagccctgg agcagagctc 420
gtggtaacag agagaatcct ggagacctca acaagatatc ccagcccctc gcccaaacca 480
gaaggccggt ttcaaccgga attccggggt ggtggtggtt caggaggagg a 531
<210> 9
<211> 695
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mspd1-IgV-p24-Fc融合蛋白
<400> 9
Met Trp Val Arg Gln Val Pro Trp Ser Phe Thr Trp Ala Val Leu Gln
1 5 10 15
Leu Ser Trp Gln Ser Gly Trp Leu Leu Glu Val Pro Asn Gly Pro Trp
20 25 30
Arg Ser Leu Thr Phe Tyr Pro Ala Trp Leu Thr Val Ser Glu Gly Ala
35 40 45
Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Leu Ser Asn Trp Ser Glu Asp Leu Met
50 55 60
Leu Asn Trp Asn Arg Leu Ser Pro Ser Asn Gln Thr Glu Lys Gln Ala
65 70 75 80
Ala Phe Cys Asn Gly Leu Ser Gln Gln Asp Ala Arg Phe Gln Ile Ile
85 90 95
Gln Leu Pro Asn Arg His Asp Phe His Met Asn Ile Leu Asp Thr Arg
100 105 110
Arg Asn Asp Ser Gly Ile Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu His Pro
115 120 125
Lys Ala Lys Ile Glu Glu Ser Pro Gly Ala Glu Leu Val Val Thr Glu
130 135 140
Arg Ile Leu Glu Thr Ser Thr Arg Tyr Pro Ser Pro Ser Pro Lys Pro
145 150 155 160
Glu Gly Arg Phe Gln Pro Glu Phe Arg Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
165 170 175
Pro Ile Val Gln Asn Leu Gln Gly Gln Met Val His Gln Pro Ile Ser
180 185 190
Pro Arg Thr Leu Asn Ala Trp Val Lys Val Ile Glu Glu Lys Ala Phe
195 200 205
Ser Pro Glu Val Ile Pro Met Phe Ser Ala Leu Ser Glu Gly Ala Thr
210 215 220
Pro Gln Asp Leu Asn Thr Met Leu Asn Thr Val Gly Gly His Gln Ala
225 230 235 240
Ala Met Gln Met Leu Lys Glu Thr Ile Asn Glu Glu Ala Ala Glu Trp
245 250 255
Asp Arg Leu His Pro Val Gln Ala Gly Pro Val Ala Pro Gly Gln Met
260 265 270
Arg Glu Pro Arg Gly Ser Asp Ile Ala Gly Thr Thr Ser Asn Leu Gln
275 280 285
Glu Gln Ile Gly Trp Met Thr Asn Asn Pro Pro Ile Pro Val Gly Glu
290 295 300
Ile Tyr Lys Arg Trp Ile Ile Leu Gly Leu Asn Lys Ile Val Arg Met
305 310 315 320
Tyr Ser Pro Thr Ser Ile Leu Asp Ile Arg Gln Gly Pro Lys Glu Pro
325 330 335
Phe Arg Asp Tyr Val Asp Arg Phe Tyr Lys Thr Leu Arg Ala Glu Gln
340 345 350
Ala Ser Gln Glu Val Lys Asn Trp Met Thr Glu Thr Leu Leu Val Gln
355 360 365
Asn Ser Asn Pro Asp Cys Lys Thr Ile Leu Lys Ala Leu Gly Pro Ala
370 375 380
Ala Thr Leu Glu Glu Met Met Thr Ala Cys Gln Gly Val Gly Gly Pro
385 390 395 400
Gly His Lys Ala Arg Val Leu Met Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys
405 410 415
Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu Lys Lys Leu Gly Gly Ser Asn Asp Ile
420 425 430
Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser
435 440 445
Ala Ser His Leu Glu Gln Tyr Leu Glu Ala Thr Asn Thr Lys Val Asp
450 455 460
Lys Thr Val Ala Pro Ser Thr Cys Ser Lys Pro Met Cys Pro Pro Pro
465 470 475 480
Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys
485 490 495
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
500 505 510
Asp Val Ser Gln Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Thr Trp Tyr Ile Asn
515 520 525
Asn Glu Gln Val Arg Thr Ala Arg Pro Pro Leu Arg Glu Gln Gln Phe
530 535 540
Asn Ser Thr Ile Arg Val Val Ser Thr Leu Pro Ile Ala His Gln Asp
545 550 555 560
Trp Leu Arg Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val His Asn Lys Ala Leu
565 570 575
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Arg Gly Gln Pro Leu
580 585 590
Glu Pro Lys Val Tyr Thr Met Gly Pro Pro Arg Glu Glu Leu Ser Ser
595 600 605
Arg Ser Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Asn Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
610 615 620
Ile Ser Val Glu Trp Glu Lys Asn Gly Lys Ala Glu Asp Asn Tyr Lys
625 630 635 640
Thr Thr Pro Thr Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser
645 650 655
Lys Leu Ser Val Pro Thr Ser Glu Trp Gln Arg Gly Asp Val Phe Thr
660 665 670
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
675 680 685
Ile Ser His Ser Pro Gly Lys
690 695
<210> 10
<211> 2104
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mspd1-IgV-p24-Fc
<400> 10
atgtgggtcc ggcaggtacc ctggtcattc acttgggctg tgctgcagtt gagctggcaa 60
tcagggtggc ttctagaggt ccccaatggg ccctggaggt ccctcacctt ctacccagcc 120
tggctcacag tgtcagaggg agcaaatgcc accttcacct gcagcttgtc caactggtcg 180
gaggatctta tgctgaactg gaaccgcctg agtcccagca accagactga aaaacaggcc 240
gccttctgta atggtttgag ccaacaggat gcccgcttcc agatcataca gctgcccaac 300
aggcatgact tccacatgaa catccttgac acacggcgca atgacagtgg catctacctc 360
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gtggtaacag agagaatcct ggagacctca acaagatatc ccagcccctc gcccaaacca 480
gaaggccggt ttcaaccgga attccggggt ggtggtggtt caggaggagg acctatagtg 540
caaaacctcc aggggcaaat ggtacatcag cccatatcac ctagaacttt aaatgcatgg 600
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tcagaaggag ccaccccaca agatttaaac accatgctaa acacagtggg gggacatcaa 720
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gtgtccttct ggttgcgggt tcccaaggtc tctgctagcc acctcgaaca atacctggag 1380
gccaccaaca ccaaagtgga caagaccgtt gcgccctcga catgcagcaa gcccatgtgc 1440
ccaccccctg aactcctggg gggaccgtct gtcttcatct tccccccaaa acccaaggac 1500
accctcatga tctcacgcac ccccgaggtc acatgcgtgg tggtggacgt gagccaggat 1560
gaccccgagg tgcagttcac atggtacata aacaacgagc aggtgcgcac cgcccggccg 1620
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caccaggact ggctgagggg caaggagttc aagtgcaaag tccacaacaa ggcactcccg 1740
gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc agagggcagc ccctggagcc gaaggtctac 1800
accatgggcc ctccccggga ggagctgagc agcaggtcgg tcagcctgac ctgcatgatc 1860
aacggcttct acccttccga catctcggtg gagtgggaga agaacgggaa ggcagaggac 1920
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ctctcagtgc ccacgagtga gtggcagcgg ggcgacgtct tcacctgctc cgtgatgcac 2040
gaggccttgc acaaccacta cacgcagaag tccatctccc actctcctgg taaataatct 2100
agag 2104
<210> 11
<211> 164
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mspd1-14del
<400> 11
Met Trp Val Arg Gln Val Pro Trp Ser Phe Thr Trp Ala Val Leu Gln
1 5 10 15
Leu Ser Trp Gln Ser Gly Trp Leu Leu Ala Trp Leu Thr Val Ser Glu
20 25 30
Gly Ala Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Leu Ser Asn Trp Ser Glu Asp
35 40 45
Leu Met Leu Asn Trp Asn Arg Leu Ser Pro Ser Asn Gln Thr Glu Lys
50 55 60
Gln Ala Ala Phe Cys Asn Gly Leu Ser Gln Pro Val Gln Asp Ala Arg
65 70 75 80
Phe Gln Ile Ile Gln Leu Pro Asn Arg His Asp Phe His Met Asn Ile
85 90 95
Leu Asp Thr Arg Arg Asn Asp Ser Gly Ile Tyr Leu Cys Gly Ala Ile
100 105 110
Ser Leu His Pro Lys Ala Lys Ile Glu Glu Ser Pro Gly Ala Glu Leu
115 120 125
Val Val Thr Glu Arg Ile Leu Glu Thr Ser Thr Arg Tyr Pro Ser Pro
130 135 140
Ser Pro Lys Pro Glu Gly Arg Phe Gln Pro Glu Phe Arg Gly Gly Gly
145 150 155 160
Ser Gly Gly Gly
<210> 12
<211> 495
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mspd1-14del
<400> 12
atgtgggtcc ggcaggtacc ctggtcattc acttgggctg tgctgcagtt gagctggcaa 60
tcagggtggc ttctagcctg gctcacagtg tcagagggag caaatgccac cttcacctgc 120
agcttgtcca actggtcgga ggatcttatg ctgaactgga accgcctgag tcccagcaac 180
cagactgaaa aacaggccgc cttctgtaat ggtttgagcc aacccgtcca ggatgcccgc 240
ttccagatca tacagctgcc caacaggcat gacttccaca tgaacatcct tgacacacgg 300
cgcaatgaca gtggcatcta cctctgtggg gccatctccc tgcaccccaa ggcaaaaatc 360
gaggagagcc ctggagcaga gctcgtggta acagagagaa tcctggagac ctcaacaaga 420
tatcccagcc cctcgcccaa accagaaggc cggtttcaac cggaattccg gggtggtggt 480
ggttcaggag gagga 495
<210> 13
<211> 683
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mspd1-14del-p24-Fc
<400> 13
Met Trp Val Arg Gln Val Pro Trp Ser Phe Thr Trp Ala Val Leu Gln
1 5 10 15
Leu Ser Trp Gln Ser Gly Trp Leu Leu Ala Trp Leu Thr Val Ser Glu
20 25 30
Gly Ala Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Leu Ser Asn Trp Ser Glu Asp
35 40 45
Leu Met Leu Asn Trp Asn Arg Leu Ser Pro Ser Asn Gln Thr Glu Lys
50 55 60
Gln Ala Ala Phe Cys Asn Gly Leu Ser Gln Pro Val Gln Asp Ala Arg
65 70 75 80
Phe Gln Ile Ile Gln Leu Pro Asn Arg His Asp Phe His Met Asn Ile
85 90 95
Leu Asp Thr Arg Arg Asn Asp Ser Gly Ile Tyr Leu Cys Gly Ala Ile
100 105 110
Ser Leu His Pro Lys Ala Lys Ile Glu Glu Ser Pro Gly Ala Glu Leu
115 120 125
Val Val Thr Glu Arg Ile Leu Glu Thr Ser Thr Arg Tyr Pro Ser Pro
130 135 140
Ser Pro Lys Pro Glu Gly Arg Phe Gln Pro Glu Phe Arg Gly Gly Gly
145 150 155 160
Ser Gly Gly Gly Pro Ile Val Gln Asn Leu Gln Gly Gln Met Val His
165 170 175
Gln Pro Ile Ser Pro Arg Thr Leu Asn Ala Trp Val Lys Val Ile Glu
180 185 190
Glu Lys Ala Phe Ser Pro Glu Val Ile Pro Met Phe Ser Ala Leu Ser
195 200 205
Glu Gly Ala Thr Pro Gln Asp Leu Asn Thr Met Leu Asn Thr Val Gly
210 215 220
Gly His Gln Ala Ala Met Gln Met Leu Lys Glu Thr Ile Asn Glu Glu
225 230 235 240
Ala Ala Glu Trp Asp Arg Leu His Pro Val Gln Ala Gly Pro Val Ala
245 250 255
Pro Gly Gln Met Arg Glu Pro Arg Gly Ser Asp Ile Ala Gly Thr Thr
260 265 270
Ser Asn Leu Gln Glu Gln Ile Gly Trp Met Thr Asn Asn Pro Pro Ile
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Pro Val Gly Glu Ile Tyr Lys Arg Trp Ile Ile Leu Gly Leu Asn Lys
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Ile Val Arg Met Tyr Ser Pro Thr Ser Ile Leu Asp Ile Arg Gln Gly
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Pro Lys Glu Pro Phe Arg Asp Tyr Val Asp Arg Phe Tyr Lys Thr Leu
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Leu Leu Val Gln Asn Ser Asn Pro Asp Cys Lys Thr Ile Leu Lys Ala
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ctcccggccc ccatcgagaa aaccatctcc aaagccagag ggcagcccct ggagccgaag 1800
gtctacacca tgggccctcc ccgggaggag ctgagcagca ggtcggtcag cctgacctgc 1860
atgatcaacg gcttctaccc ttccgacatc tcggtggagt gggagaagaa cgggaaggca 1920
gaggacaact acaagaccac gccgaccgtg ctggacagcg acggctccta cttcctctac 1980
agcaagctct cagtgcccac gagtgagtgg cagcggggcg acgtcttcac ctgctccgtg 2040
atgcacgagg ccttgcacaa ccactacacg cagaagtcca tctcccactc tcctggtaaa 2100
taatctagag 2110
<210> 21
<211> 176
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人
<400> 21
Met Gln Ile Pro Gln Ala Pro Trp Pro Val Val Trp Ala Val Leu Gln
1 5 10 15
Leu Gly Trp Arg Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp
20 25 30
Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp
35 40 45
Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val
50 55 60
Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala
65 70 75 80
Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg
85 90 95
Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg
100 105 110
Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu
115 120 125
Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val
130 135 140
Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro
145 150 155 160
Arg Pro Ala Gly Gln Pro Glu Phe Arg Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
165 170 175
<210> 22
<211> 531
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人
<400> 22
atgcagatcc cacaggcgcc ctggccagtc gtctgggcgg tgctacaact gggctggcgg 60
ccaggatggt tcttagactc cccagacagg ccctggaacc cccccacctt ctccccagcc 120
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<211> 695
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hspd1-p24-Fc
<400> 23
Met Gln Ile Pro Gln Ala Pro Trp Pro Val Val Trp Ala Val Leu Gln
1 5 10 15
Leu Gly Trp Arg Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp
20 25 30
Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp
35 40 45
Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val
50 55 60
Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala
65 70 75 80
Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg
85 90 95
Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg
100 105 110
Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu
115 120 125
Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val
130 135 140
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145 150 155 160
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165 170 175
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Pro Arg Thr Leu Asn Ala Trp Val Lys Val Ile Glu Glu Lys Ala Phe
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210 215 220
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Phe Arg Asp Tyr Val Asp Arg Phe Tyr Lys Thr Leu Arg Ala Glu Gln
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355 360 365
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435 440 445
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Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Arg Gly Gln Pro Leu
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595 600 605
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610 615 620
Ile Ser Val Glu Trp Glu Lys Asn Gly Lys Ala Glu Asp Asn Tyr Lys
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Thr Thr Pro Thr Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser
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675 680 685
Ile Ser His Ser Pro Gly Lys
690 695
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<211> 2104
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hspd1-p24-Fc
<400> 24
atgcagatcc cacaggcgcc ctggccagtc gtctgggcgg tgctacaact gggctggcgg 60
ccaggatggt tcttagactc cccagacagg ccctggaacc cccccacctt ctccccagcc 120
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gagagcttcg tgctaaactg gtaccgcatg agccccagca accagacgga caagctggcc 240
gccttccccg aggaccgcag ccagcccggc caggactgcc gcttccgtgt cacacaactg 300
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ccgctacggg agcagcagtt caacagcacg atccgcgtgg tcagcaccct ccccatcgcg 1680
caccaggact ggctgagggg caaggagttc aagtgcaaag tccacaacaa ggcactcccg 1740
gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc agagggcagc ccctggagcc gaaggtctac 1800
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ctctcagtgc ccacgagtga gtggcagcgg ggcgacgtct tcacctgctc cgtgatgcac 2040
gaggccttgc acaaccacta cacgcagaag tccatctccc actctcctgg taaataatct 2100
agag 2104
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<211> 162
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hspd1-14del
<400> 25
Met Gln Ile Pro Gln Ala Pro Trp Pro Val Val Trp Ala Val Leu Gln
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Leu Gly Trp Arg Pro Gly Trp Phe Leu Ala Leu Leu Val Val Thr Glu
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Gly Asp Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser
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Phe Val Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys
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Leu Ala Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg
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Phe Arg Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val
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Val Arg Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile
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Ser Pro Arg Pro Ala Gly Gln Pro Glu Phe Arg Gly Gly Gly Ser Gly
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Gly Gly
<210> 26
<211> 489
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hspd1-14del
<400> 26
Ala Thr Gly Cys Ala Gly Ala Thr Cys Cys Cys Ala Cys Ala Gly Gly
1 5 10 15
Cys Gly Cys Cys Cys Thr Gly Gly Cys Cys Ala Gly Thr Cys Gly Thr
20 25 30
Cys Thr Gly Gly Gly Cys Gly Gly Thr Gly Cys Thr Ala Cys Ala Ala
35 40 45
Cys Thr Gly Gly Gly Cys Thr Gly Gly Cys Gly Gly Cys Cys Ala Gly
50 55 60
Gly Ala Thr Gly Gly Thr Thr Cys Thr Thr Ala Gly Cys Cys Cys Thr
65 70 75 80
Gly Cys Thr Cys Gly Thr Gly Gly Thr Gly Ala Cys Cys Gly Ala Ala
85 90 95
Gly Gly Gly Gly Ala Cys Ala Ala Cys Gly Cys Cys Ala Cys Cys Thr
100 105 110
Thr Cys Ala Cys Cys Thr Gly Cys Ala Gly Cys Thr Thr Cys Thr Cys
115 120 125
Cys Ala Ala Cys Ala Cys Ala Thr Cys Gly Gly Ala Gly Ala Gly Cys
130 135 140
Thr Thr Cys Gly Thr Gly Cys Thr Ala Ala Ala Cys Thr Gly Gly Thr
145 150 155 160
Ala Cys Cys Gly Cys Ala Thr Gly Ala Gly Cys Cys Cys Cys Ala Gly
165 170 175
Cys Ala Ala Cys Cys Ala Gly Ala Cys Gly Gly Ala Cys Ala Ala Gly
180 185 190
Cys Thr Gly Gly Cys Cys Gly Cys Cys Thr Thr Cys Cys Cys Cys Gly
195 200 205
Ala Gly Gly Ala Cys Cys Gly Cys Ala Gly Cys Cys Ala Gly Cys Cys
210 215 220
Cys Gly Gly Cys Cys Ala Gly Gly Ala Cys Thr Gly Cys Cys Gly Cys
225 230 235 240
Thr Thr Cys Cys Gly Thr Gly Thr Cys Ala Cys Ala Cys Ala Ala Cys
245 250 255
Thr Gly Cys Cys Cys Ala Ala Cys Gly Gly Gly Cys Gly Thr Gly Ala
260 265 270
Cys Thr Thr Cys Cys Ala Cys Ala Thr Gly Ala Gly Cys Gly Thr Gly
275 280 285
Gly Thr Cys Ala Gly Gly Gly Cys Cys Cys Gly Gly Cys Gly Cys Ala
290 295 300
Ala Thr Gly Ala Cys Ala Gly Cys Gly Gly Cys Ala Cys Cys Thr Ala
305 310 315 320
Cys Cys Thr Cys Thr Gly Thr Gly Gly Gly Gly Cys Cys Ala Thr Cys
325 330 335
Thr Cys Cys Cys Thr Gly Gly Cys Cys Cys Cys Cys Ala Ala Gly Ala
340 345 350
Cys Gly Cys Ala Gly Ala Thr Cys Ala Ala Ala Gly Ala Gly Ala Gly
355 360 365
Cys Cys Thr Gly Cys Gly Gly Gly Cys Ala Gly Ala Gly Cys Thr Cys
370 375 380
Ala Gly Gly Gly Thr Gly Ala Cys Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ala Ala
385 390 395 400
Gly Gly Gly Cys Ala Gly Ala Ala Gly Thr Gly Cys Cys Cys Ala Cys
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Thr Cys Ala Cys Cys Cys Ala Gly Gly Cys Cys Ala Gly Cys Cys Gly
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Gly Cys Cys Ala Gly Cys Cys Gly Gly Ala Ala Thr Thr Cys Cys Gly
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Gly Gly Gly Thr Gly Gly Thr Gly Gly Thr Gly Gly Thr Thr Cys Ala
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Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly Ala
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<210> 27
<211> 681
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hspd1-14del-p24-Fc
<400> 27
Met Gln Ile Pro Gln Ala Pro Trp Pro Val Val Trp Ala Val Leu Gln
1 5 10 15
Leu Gly Trp Arg Pro Gly Trp Phe Leu Ala Leu Leu Val Val Thr Glu
20 25 30
Gly Asp Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser
35 40 45
Phe Val Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys
50 55 60
Leu Ala Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg
65 70 75 80
Phe Arg Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val
85 90 95
Val Arg Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile
100 105 110
Ser Leu Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu
115 120 125
Arg Val Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro Thr Ala His Pro Ser Pro
130 135 140
Ser Pro Arg Pro Ala Gly Gln Pro Glu Phe Arg Gly Gly Gly Ser Gly
145 150 155 160
Gly Gly Pro Ile Val Gln Asn Leu Gln Gly Gln Met Val His Gln Pro
165 170 175
Ile Ser Pro Arg Thr Leu Asn Ala Trp Val Lys Val Ile Glu Glu Lys
180 185 190
Ala Phe Ser Pro Glu Val Ile Pro Met Phe Ser Ala Leu Ser Glu Gly
195 200 205
Ala Thr Pro Gln Asp Leu Asn Thr Met Leu Asn Thr Val Gly Gly His
210 215 220
Gln Ala Ala Met Gln Met Leu Lys Glu Thr Ile Asn Glu Glu Ala Ala
225 230 235 240
Glu Trp Asp Arg Leu His Pro Val Gln Ala Gly Pro Val Ala Pro Gly
245 250 255
Gln Met Arg Glu Pro Arg Gly Ser Asp Ile Ala Gly Thr Thr Ser Asn
260 265 270
Leu Gln Glu Gln Ile Gly Trp Met Thr Asn Asn Pro Pro Ile Pro Val
275 280 285
Gly Glu Ile Tyr Lys Arg Trp Ile Ile Leu Gly Leu Asn Lys Ile Val
290 295 300
Arg Met Tyr Ser Pro Thr Ser Ile Leu Asp Ile Arg Gln Gly Pro Lys
305 310 315 320
Glu Pro Phe Arg Asp Tyr Val Asp Arg Phe Tyr Lys Thr Leu Arg Ala
325 330 335
Glu Gln Ala Ser Gln Glu Val Lys Asn Trp Met Thr Glu Thr Leu Leu
340 345 350
Val Gln Asn Ser Asn Pro Asp Cys Lys Thr Ile Leu Lys Ala Leu Gly
355 360 365
Pro Ala Ala Thr Leu Glu Glu Met Met Thr Ala Cys Gln Gly Val Gly
370 375 380
Gly Pro Gly His Lys Ala Arg Val Leu Met Gln Tyr Ile Lys Ala Asn
385 390 395 400
Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu Lys Lys Leu Gly Gly Ser Asn
405 410 415
Asp Ile Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys
420 425 430
Val Ser Ala Ser His Leu Glu Gln Tyr Leu Glu Ala Thr Asn Thr Lys
435 440 445
Val Asp Lys Thr Val Ala Pro Ser Thr Cys Ser Lys Pro Met Cys Pro
450 455 460
Pro Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys
465 470 475 480
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
485 490 495
Val Val Asp Val Ser Gln Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Thr Trp Tyr
500 505 510
Ile Asn Asn Glu Gln Val Arg Thr Ala Arg Pro Pro Leu Arg Glu Gln
515 520 525
Gln Phe Asn Ser Thr Ile Arg Val Val Ser Thr Leu Pro Ile Ala His
530 535 540
Gln Asp Trp Leu Arg Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val His Asn Lys
545 550 555 560
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Arg Gly Gln
565 570 575
Pro Leu Glu Pro Lys Val Tyr Thr Met Gly Pro Pro Arg Glu Glu Leu
580 585 590
Ser Ser Arg Ser Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Asn Gly Phe Tyr Pro
595 600 605
Ser Asp Ile Ser Val Glu Trp Glu Lys Asn Gly Lys Ala Glu Asp Asn
610 615 620
Tyr Lys Thr Thr Pro Thr Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Leu
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Tyr Ser Lys Leu Ser Val Pro Thr Ser Glu Trp Gln Arg Gly Asp Val
645 650 655
Phe Thr Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
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<210> 28
<211> 2062
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hspd1-14del-p24-Fc
<400> 28
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gtggacgtga gccaggatga ccccgaggtg cagttcacat ggtacataaa caacgagcag 1560
gtgcgcaccg cccggccgcc gctacgggag cagcagttca acagcacgat ccgcgtggtc 1620
agcaccctcc ccatcgcgca ccaggactgg ctgaggggca aggagttcaa gtgcaaagtc 1680
cacaacaagg cactcccggc ccccatcgag aaaaccatct ccaaagccag agggcagccc 1740
ctggagccga aggtctacac catgggccct ccccgggagg agctgagcag caggtcggtc 1800
agcctgacct gcatgatcaa cggcttctac ccttccgaca tctcggtgga gtgggagaag 1860
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tacttcctct acagcaagct ctcagtgccc acgagtgagt ggcagcgggg cgacgtcttc 1980
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tctcctggta aataatctag ag 2062
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<220>
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头序列
<400> 30
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<220>
<223> 连接序列
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<213> 人工序列
<220>
<223> 接头序列
<400> 32
Ser Glu Arg Ser Glu Arg Ser Glu Arg Ser Glu Arg Ser Glu Arg Ser
1 5 10 15
Glu Arg Ser Glu Arg Ser Glu Arg Ser Glu Arg
20 25
<210> 33
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 连接序列
<400> 33
Gly Gly Gly Gly Gly Cys Pro Pro Cys
1 5
<210> 34
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 连接序列
<400> 34
Gly Leu Tyr Gly Leu Tyr Gly Leu Tyr Gly Leu Tyr Ser Glu Arg Ser
1 5 10 15
Glu Arg Ser Glu Arg
20
<210> 35
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 连接序列
<400> 35
Ser Cys Val Pro Leu Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn
1 5 10
<210> 36
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 连接序列
<400> 36
Pro Ser Cys Val Pro Leu Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn
1 5 10
<210> 37
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 连接序列
<400> 37
Gly Asp Leu Ile Tyr Arg Asn Gln Lys
1 5
<210> 38
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 连接序列
<400> 38
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Pro Ser Cys Val Pro Leu Met
1 5 10 15
Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn
20
<210> 39
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 连接序列
<400> 39
Ala Met Gln Met Leu Lys Asp Thr Ile
1 5
<210> 40
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 连接序列
<400> 40
Thr Ser Asn Pro Pro Ile Pro Val Gly Asp Ile Tyr Lys Arg Trp Ile
1 5 10 15
Ile Leu Gly Leu
20

Claims (20)

1.可溶性PD-1蛋白，其由选自SEQ ID NO:21的氨基酸序列组成。
2.PD-1核酸分子，其编码权利要求1中的可溶性PD-1蛋白。
3.可溶性PD-1融合蛋白，其包含可溶性PD-1蛋白部分和抗原性蛋白片段，其中所述可溶性PD-1蛋白部分由SEQ ID NO:21的氨基酸序列组成。
4.权利要求3中的可溶性PD-1融合蛋白，其中所述抗原性蛋白片段来自病毒、细菌或真菌病原体，和肿瘤细胞的蛋白片段。
5.权利要求4中的PD-1融合蛋白，所述病原体选自人免疫缺陷病毒、人类单纯疱疹病毒(HSV)、巨细胞病毒、呼吸道合胞病毒、鼻病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、己型肝炎病毒、庚型肝炎病毒、人嗜T淋巴细胞病毒Ⅰ型、流感病毒、牛白血病病毒、EB病毒、百日咳杆菌、脊髓灰质炎病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、风疹病毒、天花病毒、水痘带状疱疹病毒、炭疽杆菌、破伤风杆菌、轮状病毒、狂犬病毒、禽痘病毒、脑膜炎球菌、白喉杆菌、乳头瘤病毒、肺炎球菌、斑疹伤寒立克次体、伤寒杆菌、链球菌、葡萄球菌、奈瑟氏菌、伯氏疏螺旋体、霍乱杆菌、大肠杆菌、志贺氏菌、利什曼虫、麻风杆菌、副流感病毒、腺病毒、黄病毒、登革热病毒、弓形体、球孢子菌、血吸虫、结核分枝杆菌、或疟原虫。
6.权利要求4中的PD-1融合蛋白，所述抗原性蛋白片段来自HIV p24。
7.权利要求3中的PD-1融合蛋白，其进一步包含Fc结构域。
8.权利要求7中的PD-1融合蛋白，其进一步包含接头序列，其中所述接头序列连接所述可溶性PD-1蛋白部分和所述抗原性蛋白片段。
9.权利要求3中的PD-1融合蛋白，其由SEQ ID NO:23的氨基酸序列组成。
10.PD-1融合核酸分子，其编码权利要求3-9中任一项的PD-1融合蛋白。
11.权利要求10中的PD-1融合核酸分子，其中所述核酸分子为SEQ ID NO:24的序列。
12.疫苗组合物，其包含权利要求10或11中的PD-1融合核酸分子。
13.权利要求10的融合核酸在制备药物中的用途，所述药物用于预防或治疗需要这样的预防或治疗的受试者中的病原性感染和/或肿瘤或癌症。
14.权利要求13的用途，其中所述病原性感染由病原体引起，所述病原体选自
人免疫缺陷病毒、人类单纯疱疹病毒(HSV)、巨细胞病毒、呼吸道合胞病毒、鼻病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、己型肝炎病毒、庚型肝炎病毒、人嗜T淋巴细胞病毒Ⅰ型、流感病毒、牛白血病病毒、EB病毒、百日咳杆菌、脊髓灰质炎病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、风疹病毒、天花病毒、水痘带状疱疹病毒、炭疽杆菌、破伤风杆菌、轮状病毒、狂犬病毒、禽痘病毒、脑膜炎球菌、白喉杆菌、乳头瘤病毒、肺炎球菌、斑疹伤寒立克次体、伤寒杆菌、链球菌、葡萄球菌、奈瑟氏菌、伯氏疏螺旋体、霍乱杆菌、大肠杆菌、志贺氏菌、利什曼虫、麻风杆菌、副流感病毒、腺病毒、黄病毒、登革热病毒、弓形体、球孢子菌、血吸虫、结核分枝杆菌、或疟原虫。
15.权利要求14的用途，其中所述融合核酸包含编码HIV p24的抗原性核酸片段，并且所述病原性感染是HIV感染。
16.权利要求15的用途，其中所述融合核酸由SEQ ID NO:24的序列组成。
17.权利要求13的用途，其中所述融合核酸通过注射而递送。
18.权利要求17的用途，其中所述融合核酸经由电穿孔而递送。
19.权利要求3的融合蛋白在制备药物中的用途，所述药物用于预防或治疗需要这样的预防或治疗的受试者中的病原性感染和/或肿瘤。
20.权利要求19的用途，其中所述病原性感染由病原体引起，所述病原体选自人免疫缺陷病毒、人类单纯疱疹病毒(HSV)、巨细胞病毒、鼻病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、己型肝炎病毒、庚型肝炎病毒、人嗜T淋巴细胞病毒Ⅰ型、流感病毒、牛白血病病毒、EB病毒、百日咳杆菌、脊髓灰质炎病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、风疹病毒、天花病毒、水痘带状疱疹病毒、炭疽杆菌、破伤风杆菌、轮状病毒、狂犬病毒、禽痘病毒、脑膜炎球菌、白喉杆菌、乳头瘤病毒、肺炎球菌、斑疹伤寒立克次体、伤寒杆菌、链球菌、葡萄球菌、奈瑟氏菌、伯氏疏螺旋体、霍乱杆菌、大肠杆菌、志贺氏菌、利什曼虫、麻风杆菌、呼吸道合胞病毒、副流感病毒、腺病毒、黄病毒、登革热病毒、弓形体、球孢子菌、血吸虫、结核分枝杆菌、或疟原虫。
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