CN111110655B - 一种纳米复合物及其制备方法和应用 - Google Patents

一种纳米复合物及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种纳米复合物及其制备方法和应用，所述纳米复合物的原料包括伊马替尼、PEG化聚合物和甘露糖化壳寡糖；其中，甘露糖化壳寡糖包覆于最外层，其内以PEG化聚合物为载体包载伊马替尼，其中，原料PEG化聚合物与伊马替尼的质量比为8‑50:1。该纳米复合物能够有效的被巨噬细胞摄取，阻断巨噬细胞的M2型分化，促进巨噬细胞向M1型分化，提高巨噬细胞活性，从而延长免疫抑制状态小鼠感染急性侵袭性真菌后的生存时间，实现抗真菌感染的目的。

Description

一种纳米复合物及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种纳米复合物及其制备方法和应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
巨噬细胞(Macrophage)作为固有免疫细胞的主要成员，在各种炎症反应中起着及其重要作用。巨噬细胞可分为经典活化巨噬细胞(M1型巨噬细胞)和替代性活化巨噬细胞(M2型巨噬细胞)，两者功能几乎相互拮抗。M1型巨噬细胞通过分泌促炎性细胞因子，参与正向免疫应答，而M2型巨噬细胞分泌抑制性细胞因子下调免疫应答。且在生理免疫应答过程中，M1型巨噬细胞，通过接触微环境中的IL-4等细胞因子将会自行分化为M2型并撤出炎症部位。
伊马替尼(Imatinib)，C29H31N7O，分子量：493.60，CAS：152459-95-5，结构式如下：
Figure BDA0002375795730000011
伊马替尼是一种特异性酪氨酸激酶抑制剂，且在临床上作为慢性粒细胞白血病的一线用药，并单独或联合其他化疗药物来治疗肺癌、皮肤癌及恶性胃肠道间质瘤等疾病。近年来有报道发现低剂量伊马替尼具有促进骨髓造血干细胞的分化，提高脾及血液中单核巨噬细胞的能力，并且在动物实验中证实了低剂量伊马替尼可以抵抗几种细菌的感染。在肺癌转移模型中，伊马替尼可以通过抑制STAT6磷酸化来阻止肿瘤相关巨噬细胞的M2型表达，降低癌细胞的转移能力从而提高化疗药物对于肺癌的治疗效果。
白色念珠菌(Candida albidans)是一种两相型真菌，在机体免疫力正常时仅以酵母相共生，当宿主免疫力低下时，可突破粘膜屏障转为菌丝相生长且随血液播散，侵犯机体组织并大量繁殖。随着免疫抑制剂的应用(如器官移植等)，侵袭性白色念珠菌感染以其症状不典型、进展快的特点成为移植物功能丧失和患者死亡的重要原因，并引起临床工作者的重视。发明人发现常用的抗真菌药物通过抑制真菌细胞壁或DNA的合成来抗菌，但存在着耐药性、肝肾毒性等问题。
发明内容
因此，本发明的目的是提供一种通过免疫调节巨噬细胞进而抗真菌感染尤其是白色念珠菌感染的纳米复合物，通过调节机体固有免疫来提高抗真菌感染尤其是抗白色念珠菌感染；该纳米复合物能够有效的被巨噬细胞摄取，阻断巨噬细胞的M2型分化，促进巨噬细胞向M1型分化，提高巨噬细胞活性，从而延长免疫抑制状态小鼠感染急性侵袭性真菌尤其白色念珠菌后的生存时间，实现抗真菌尤其抗白色念珠菌感染的目的。
具体地，本发明的技术方案如下所述：
在本发明的第一方面，本发明提供了一种纳米复合物MC-NPs-IM，其原料包括伊马替尼、PEG化聚合物和甘露糖化壳寡糖；其中，甘露糖化壳寡糖包覆于最外层，其内以PEG化聚合物为载体包载伊马替尼，其中，原料PEG化聚合物与伊马替尼的质量比为8-50:1。
在本发明的实施方式中，所述PEG化聚合物，为PEG参与共聚形成的共聚物，本发明优选使用PEG-PTMC嵌段共聚物，PEG-PTMC嵌段共聚物表示为PEGm-PTMCn，其中，m和n分别表示PEG和PTMC的分子量，通常情况下，m和n为任意大小；应用在本发明的实施方式中时，m选自1000-4000，n选自3000-30000，不同分子量配比的这些嵌段共聚物可以单独或者混合使用。相较于其他共聚物，采用PEG-PTMC嵌段共聚物作为纳米复合物的载体能够较好的将伊马替尼包载于其疏水端分子链相乘的疏水性内核中。尤其，在本发明较为优选的实施方式中，所述PEG-PTMC嵌段共聚物为PEG(3000)-PTMC(6000)共聚物，即m＝3000，n＝6000，该嵌段共聚物能够更好的包载伊马替尼，有效地增加伊马替尼的溶解度。
在本发明的实施方式中，所述甘露糖化壳寡糖由壳寡糖的醋酸溶液与甘露糖、三乙酰氧基硼氢化钠反应得到。
本发明所述壳寡糖(chitin oligosaccharides)为壳聚糖的降解产物，分子量在300-3000不等。发明人发现壳寡糖具有良好的生物相容性，其正电荷的特性使其极易被细胞摄取，且壳寡糖链上的氨基可被修饰以改善其理化性质。并且，发明人发现其结构与脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)具有相似性，可通过激活巨噬细胞表面TLR-4通路促进iNOS和促炎性因子TNF-α及IL-6的表达，从而调节巨噬细胞向促炎性M1的分化。
本发明使用甘露糖修饰壳寡糖得到的甘露糖化壳寡糖作为纳米复合物MC-NPs-IM的外覆层，能够提高MC-NPs-IM对巨噬细胞的靶向性，并显著提高其被巨噬细胞的摄取率，刺激巨噬细胞M1型的表达，从而将巨噬细胞的表型向M1方向调节，提高抗白色念珠菌感染的能力。
在本发明的一些实施方式中，所述甘露糖化壳寡糖的制备方法包括：壳寡糖与醋酸溶液加热搅拌过夜后，氢氧化钠调节pH得壳寡糖的醋酸溶液；将d-甘露糖、三乙酰氧基硼氢化钠及壳寡糖的醋酸溶液在室温下搅拌反应，所得溶液用双蒸水透析除去未反应的甘露糖以及三乙酰氧基硼氢化钠得到甘露糖化壳寡糖溶液；制备得到的甘露糖化壳寡糖溶液可直接使用或者可将其冷冻干燥去除水分，制备成甘露糖化壳寡糖冻干剂备用，使用时以注射用水重悬即可。
在一些实施方式中，所述壳寡糖的醋酸溶液的pH为4～5，优选为4.5。
在一些实施方式中，所述壳寡糖、甘露糖和三乙酰氧基硼氢化钠的质量比为1:1:1.5～1:1.5:1.75，优选为1:1.35:1.5。
在本发明的实施方式中，PEG化聚合物包载伊马替尼(NPs-IM)后的平均粒径为68-99nm；外层包覆甘露糖化壳寡糖后的纳米复合物(MC-NPs-IM)的粒径分布为15-250nm，平均粒径在100nm左右。粒径过大或过小均会影响纳米复合物的富集和代谢，粒径过小，则纳米复合物很容易被代谢掉，以及难以实现有效的富集，难以发挥作用，而粒径过大，则无法静脉注射使用。因此，在本发明的实施方式中，本发明的PEG化聚合物包载伊马替尼后的平均粒径为79-90nm更优，外层包覆甘露糖化壳寡糖后的纳米复合物的平均粒径为89-100nm更优。
在本发明的第二方面，本发明提供了一种制备上述第一方面中所述的纳米复合物的方法，其包括：
将PEG化聚合物、伊马替尼溶于有机溶剂中，使PEG化聚合物和伊马替尼形成均匀溶液；将该均匀溶液加入到表面活性剂溶液中，冰浴探头超声，得到乳剂，除去乳剂中的有机溶剂得到包载有伊马替尼的PEG化聚合物纳米复合物制剂，记为NPs-IM纳米复合物制剂；
除去NPs-IM纳米复合物制中的表面活性剂，加入甘露糖化壳寡糖溶液进行共孵育，离心至离出液体有丁达尔效用，即得产品纳米复合物，记为MC-NPs-IM纳米复合物。
在本发明的实施方式中，所述甘露糖化壳寡糖的制备方法包括：壳寡糖与醋酸溶液加热搅拌过夜后，氢氧化钠调节pH得壳寡糖的醋酸溶液；将d-甘露糖、三乙酰氧基硼氢化钠及壳寡糖的醋酸溶液在室温下搅拌反应，所得溶液用双蒸水透析(截留分析量为300-800D)除去未反应的甘露糖以及三乙酰氧基硼氢化钠得到甘露糖化壳寡糖溶液，制备得到的甘露糖化壳寡糖溶液可直接使用或者可将其冷冻干燥去除水分，制备成甘露糖化壳寡糖冻干剂备用，使用时以注射用水重悬即可。在本发明的一些实施方式中，以注射用水重悬后的甘露糖化壳寡糖溶液的质量体积浓度为0.5-4％(mg/mL)，优选为0.5％。
在本发明的一些实施方式中，所述有机溶剂选自二氯甲烷、三氯甲烷、四氢呋喃、乙腈、乙醚和丙酮中的一种或多种，优选为二氯甲烷或三氯甲烷。在本发明的实施方式中，二氯甲烷或三氯甲烷均能够更高的溶解伊马替尼及PEG化聚合物，并且在旋蒸时相较于其他溶剂更容易控制。
在本发明的一些实施方式中，所述表面活性剂为胆酸钠或聚乙烯醇。在本发明的实施方式中，胆酸钠或聚乙烯醇均无毒，但胆酸钠相较于聚乙烯醇是更优的实施方式，胆酸钠分子更小，更容易透过超滤膜。
在本发明的一些实施方式中，所述胆酸钠溶液的浓度为0.2～2％(mg/mL)，优选为0.6％；所述聚乙烯醇溶液的浓度为1-3％(mg/mL)，优选为2％。
在本发明的实施方式中，所述有机溶剂与表面活性剂的体积比为1:3～1:10，更优选为1:5。
在本发明的一些实施方式中，所述PEG化聚合物与伊马替尼的质量比为8-50:1，优选为10-25:1。
在本发明的一些实施方式中，采用冰浴探头超声时，探头超声功率为100-400W，超声次数为20-50次，超声时间为1-5s，超声间隔时间为1-5s。
在本发明的一些实施方式中，本发明采用旋蒸法除去有机溶剂，旋蒸温度为25-40℃；当然，本领域技术人员可根据需要选择可行的能够去除有机溶剂且不损害本发明所得乳剂的其他方法。
在本发明的一些实施方式中，本发明采用超滤离心方式除去表面活性剂，优选的超滤离心条件为截留分子量为3000-30000，离心转速为3000-10000，离心时间为5-60min。
在本发明的实施方式中，在进行甘露糖化壳寡糖溶液与NPs-IM溶液共孵育时，两者体积比为1.5:1～6:1，优选为6:1，当甘露糖化壳寡糖溶液浓度较高时，所用体积较少，且必须分次投放，次数至少为2次。
反应物的用量、超声方式以及表面活性剂的种类等均会影响制备得到的纳米复合物的粒径大小，粒径过大或过小均会影响纳米复合物的富集和代谢，粒径过小，则纳米复合物很容易被代谢掉，以及难以实现有效的富集，难以发挥作用，而粒径过大，则无法静脉注射使用。在本发明的上述实施方式中制备得到的PEG化聚合物包载伊马替尼(NPs-IM)的平均粒径为68-99nm；外层包覆甘露糖化壳寡糖后的纳米复合物(MC-NPs-IM)的粒径分布为15-250nm，平均粒径在100nm左右。在本发明的实施方式中，所述制备方法还包括将制备得到的MC-NPs-IM纳米复合物进行过滤除菌的操作；比如，所述经过过滤除菌，可以经过0.22μm的无菌微孔滤膜过滤除菌。
本发明所采用的方法为乳化/溶剂蒸发法，但本发明并不局限于该方法，本领域技术人员在获知本发明的纳米复合物的组成后，也可以采用盐析法、注入法或薄膜分散法等方法。
在本发明的第三方面，本发明提供了一种递药系统或组合物，其包括上述第一方面中所述的纳米复合物。本发明的纳米复合物对巨噬细胞具有靶向性，能够有效地被巨噬细胞摄取，作为递药系统或者组合物，能够有效地将药物递送至巨噬细胞内，更好地发挥对巨噬细胞的调控作用。
在本发明的第四方面，本发明提供了一种药物制剂，其包括上述第一方面中所述的纳米复合物，或上述第三方面中所述的递药系统或组合物，与至少一种药学上可接受的辅料。所述药物制剂可以为液体制剂或者固体制剂，比如注射剂、冻干粉针剂等等，本领域技术人员可根据需要选择适宜的辅料。
在本发明的第五方面，本发明提供了上述第一方面中所述的纳米复合物，或上述第三方面中所述的递药系统或组合物，或上述第四方面中所述的药物制剂在制备用于调节巨噬细胞和/或抗真菌感染的药物中的应用。
在本发明所述的应用中，所述调节巨噬细胞包括阻断巨噬细胞的M2型分化，促进巨噬细胞向M1型分化，提高巨噬细胞活性。
在本发明所述的应用中，所述真菌感染为白色念珠菌感染。
尤其地，本发明所述的MC-NPs-IM纳米复合物主要蓄积在肝脏及脾脏，对肝脏和脾脏部位的巨噬细胞的调节以及抗白色念珠菌的感染效果更显著。
本发明的MC-NPs-IM纳米复合物安全性高，对巨噬细胞显示出与浓度相关的毒性作用，在本发明的实施方式中，药物浓度不高于25μM时，细胞的生存率高于80％，药物浓度不高于10μM时，细胞的生存率接近90％，药物浓度不高于5μM时，细胞的生存率接近100％，尤其当药物浓度不高于2.5μM时，几乎无细胞毒性。
在本发明的一些实施方式中，本发明第一方面中所述的纳米复合物(MC-NPs-IM)能够有效地被巨噬细胞摄取，通过伊马替尼阻断巨噬细胞M2向极化，壳寡糖刺激巨噬细胞M1型的表达，从而将巨噬细胞的表型向M1方向调节，提高抗白色念珠菌感染的能力。体内实验结果显示，该纳米复合物作用于巨噬细胞，可在小鼠免疫抑制状态下有效提高巨噬细胞活性，延长被白色念珠菌急性感染的小鼠生存时间，提高抗白色念珠菌感染能力。
相较于现有技术，本发明通过以PEG化聚合物作为载体，包载疏水性药物伊马替尼，能有效地增加伊马替尼的溶解度，以静电作用的方式外覆壳寡糖，制成具有双重作用的纳米复合物，即促进巨噬细胞M1向分化，并抑制巨噬细胞的M2型分化；同时本发明所述纳米复合物(MC-NPs-IM)的结构提高了对巨噬细胞的靶向性，将甘露糖链接于壳寡糖链上，靶向巨噬细胞的甘露糖受体；且相较于仅以PEG化聚合物包载药物的纳米复合物而言，外覆甘露糖化壳寡糖的纳米复合物能更有效的被巨噬细胞摄取，从而更好地实现对巨噬细胞的调控，提高巨噬细胞活性。本发明的纳米复合物(MC-NPs-IM)作用于巨噬细胞，可在小鼠免疫抑制状态下有效提高巨噬细胞活性，延长被白色念珠菌急性感染的小鼠生存时间，减少感染小鼠体内白色念珠菌的生长，提高抗白色念珠菌感染能力。
附图说明
构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本申请的进一步理解，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1为MC-NPs-IM纳米复合物(实施例5)的透射电镜照片，制备的MC-NPs-IM纳米复合物分散均匀，且无团聚现象。
图2为MC-NPs-IM纳米复合物(实施例5)的粒径分布图。
图3为实施例8中外覆甘露糖化壳寡糖的纳米复合物被J774A.1巨噬细胞摄取能力荧光图。
图4为实施例10中MC-NPs-IM纳米复合物对J774A.1巨噬细胞细胞毒性趋势图。结果表明：MC-NPs-IM纳米复合物对细胞毒性成浓度依赖。
图5为实施例9中DiR标记的MC-NPs-IM纳米复合物，在C57BL/6野生型小鼠的脏器分布情况。结果显示，靶向纳米复合物主要蓄积在肝脏及脾脏。
图6为实施例10中免疫抑制小鼠在感染白色念珠菌后，各脏器中白色念珠菌生长情况，结果显示相较于盐水组，MC-NPs-IM纳米复合物能够有效减少白色念珠菌的生长。
图7为实施例10中免疫抑制小鼠在白色念珠菌急性感染后的生存曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。本发明所使用的试剂或原料均可通过常规途径购买获得，如无特殊说明，本发明所使用的试剂或原料均按照本领域常规方式使用或者按照产品说明书使用。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
实施例1
称取50mg PEG(3000)-PTMC(6000)共聚物、5mg伊马替尼，加入1ml二氯甲烷，超声使载体材料和药物充分溶解。将该溶液加到5ml的0.6％的胆酸钠溶液中，冰浴探头超声，超声功率为300W，超声时间为3s，超声间隔时间为3s，超声次数为10次。超声结束得到乳剂，将该乳剂40℃旋转蒸发除去二氯甲烷，即得NPs-IM纳米复合物制剂。
结果：制得NPs-IM纳米复合物的平均粒径为83.40±3.94nm。
实施例2
称取50mg PEG(3000)-PTMC(6000)共聚物、2mg伊马替尼，加入1ml二氯甲烷，超声使载体材料和药物充分溶解。将该溶液加到5ml的0.6％的胆酸钠溶液中，冰浴探头超声，超声功率为300W，超声时间为3s，超声间隔时间为3s，超声次数为10次。超声结束得到乳剂，将该乳剂40℃旋转蒸发除去二氯甲烷，即得NPs-IM纳米复合物制剂。
结果：制得NPs-IM纳米复合物的平均粒径为71.23±3.26nm。
实施例3
称取50mg PEG(3000)-PTMC(6000)共聚物、5mg伊马替尼，加入1ml二氯甲烷，超声使载体材料和药物充分溶解。将该溶液加到5ml的2％的聚乙烯醇溶液中，冰浴探头超声，超声功率为300W，超声时间为3s，超声间隔时间为3s，超声次数为10次。超声结束得到乳剂，将该乳剂40℃旋转蒸发除去二氯甲烷，即得NPs-IM纳米复合物制剂。
结果：制得PEG-PTMC纳米复合物的平均粒径为84.44±3.83nm。
实施例4
称取50mg PEG(3000)-PTMC(6000)共聚物、5mg伊马替尼，加入1ml二氯甲烷，超声使载体材料和药物充分溶解。将该溶液加到5ml的2％的聚乙烯醇溶液中，冰浴探头超声，超声功率为300W，超声时间为1s，超声间隔时间为1s，超声次数为20次。超声结束得到乳剂，将该乳剂40℃旋转蒸发除去二氯甲烷，即得NPs-IM纳米复合物制剂。
结果：制得PEG-PTMC纳米复合物的平均粒径为86.32±2.74nm。
实施例5
称取50mg PEG(3000)-PTMC(6000)共聚物、5mg伊马替尼，加入1ml二氯甲烷，超声使载体材料和药物充分溶解。将该溶液加到5ml的0.6％的胆酸钠溶液中，冰浴探头超声，超声功率为300W，超声时间为3s，超声间隔时间为3s，超声次数为10次。超声结束得到乳剂，将该乳剂40℃旋转蒸发除去二氯甲烷，即得NPs-IM纳米复合物制剂。
壳寡糖500mg溶于0.1mol/l醋酸溶液30ml，60℃4000rpm过夜,用0.1mol/l NaOH调节pH至4.5，0.675g D-甘露糖及0.75g三乙酰氧基硼氢化钠溶于10ml双蒸水中，与上述寡壳糖溶液在室温下，400rpm反应36h。终产物500D透析袋透析过滤。液体装于西林瓶中，置冰箱-80℃预冻过夜，然后放入冷冻干燥机中冻干48h，得到棕黄色无塌陷的甘露糖化壳寡糖粉末，注射用水配置成2％mg/ml溶液，将上述NPs-IM溶液4℃，4200rpm,离心15min，除去表面活性剂，分多次加入重悬的2％甘露糖化壳寡糖溶液，甘露糖化壳寡糖的注射用水重悬液与NPs-IM溶液的用量比为3:1，继续离心，直至离出液体有丁达尔效应，得负载伊马替尼并外包甘露糖化壳寡糖的PEG-PTMC复合纳米粒(MC-NPs-IM)。
结果：制得MC-NPs-IM纳米复合物的平均粒径为94.5±4.85nm。
实施例6
称取50mg PEG(3000)-PTMC(6000)共聚物、5mg伊马替尼，加入1ml二氯甲烷，超声使载体材料和药物充分溶解。将该溶液加到5ml的0.6％的胆酸钠溶液中，冰浴探头超声，超声功率为300W，超声时间为3s，超声间隔时间为3s，超声次数为10次。超声结束得到乳剂，将该乳剂40℃旋转蒸发除去二氯甲烷，即得NPs-IM纳米复合物制剂。
壳寡糖以注射用水配置成2％mg/ml溶液，将上述NPs-IM溶液4℃，4200rpm,离心15min，除去表面活性剂，分多次加入壳寡糖溶液，壳寡糖溶液与NPs-IM溶液的用量比为3:1，继续离心，直至离出液体有丁达尔效应，得负载伊马替尼并外包壳寡糖的PEG-PTMC复合纳米粒(C-NPs-IM)。
结果：制得MC-NPs-IM纳米复合物的平均粒径为93.38±3.63nm。
实施例7
称取50mg PEG(3000)-PTMC(6000)共聚物、5mg伊马替尼，加入1ml二氯甲烷，超声使载体材料和药物充分溶解。将该溶液加到5ml的0.6％的胆酸钠溶液中，冰浴探头超声，超声功率为300W，超声时间为3s，超声间隔时间为3s，超声次数为10次。超声结束得到乳剂，将该乳剂35℃旋转蒸发除去二氯甲烷，即得NPs-IM纳米复合物制剂。
壳寡糖500mg溶于0.1mol/l醋酸溶液30ml，60℃4000rpm过夜,用0.1mol/l NaOH调节pH至4.5,0.675g D-甘露糖及0.75g三乙酰氧基硼氢化钠溶于10ml双蒸水中，与上述寡壳糖溶液在室温下，400rpm反应36h。终产物500D透析袋透析过滤。液体装于西林瓶中，置冰箱-80℃预冻过夜，然后放入冷冻干燥机中冻干48h，得到棕黄色无塌陷的甘露糖化壳寡糖粉末，注射用水配置成0.5％mg/ml溶液，将上述NPs-IM溶液4℃，10000rpm，高速离心5min，除去表面活性剂，分多次加入重悬的甘露糖化壳寡糖溶液，甘露糖化壳寡糖的注射用水重悬液与NPs-IM溶液的用量比为6:1，继续离心，直至离出液体有丁达尔效应，得负载伊马替尼并外包甘露糖化壳寡糖的PEG-PTMC复合纳米粒(MC-NPs-IM)。
结果：制得PEG-PTMC纳米复合物的平均粒径为96.7±3.22nm。
实施例8
伊马替尼本身并不携带荧光，故而无法在荧光显微镜或者激光共聚焦显微镜下观察细胞摄取情况，本实施例以带有荧光的脂溶性香豆素6代替伊马替尼形成与实施例5(MC-NPs-IM)粒径相似的纳米粒来定性模拟J774A.1巨噬细胞对纳米粒的摄取情况，实验分为三组，第一组为NPs-C6组，其中NPs-C6纳米粒的制备方法同实施例1，其差异仅在于以带有荧光的脂溶性香豆素6代替伊马替尼；第二组为C-NPs-C6组，其中C-NPs-C6纳米粒的制备方法同实施例6，其差异仅在于以带有荧光的脂溶性香豆素6代替伊马替尼，得到负载带有荧光的脂溶性香豆素6并外包壳寡糖的PEG-PTMC复合纳米粒；第三组为MC-NPs-C6组，其中MC-NPs-C6的制备方法同实施例5，其差异仅在于以带有荧光的脂溶性香豆素6代替伊马替尼，得到负载带有荧光的脂溶性香豆素6并外包甘露糖化壳寡糖的PEG-PTMC复合纳米粒。结果如图3中所示。相较于NPs-C6、C-NPs-C6，外覆甘露糖化壳寡糖的纳米粒复合物被巨噬细胞摄取能力更强。
实施例9
以C57BL/6野生型小鼠为动物模型，通过静脉给予荧光探针DiR标记外覆含甘露糖化壳寡糖的纳米复合物MC-NPs-IM，以CRi成像仪，观察纳米复合物的脏器分布情况。结果如图5所示，荧光主要集中出现在肝脏和脾脏，因而表明靶向纳米复合物主要蓄积在肝脏及脾脏。
实施例10
负载伊马替尼并外包甘露糖化壳寡糖的PEG-PTMC复合纳米粒(MC-NPs-IM)对JA774.1巨噬细胞细胞毒性实验。将J774A.1巨噬细胞以每孔104个接种于96孔培养板。37℃，5％CO2条件下培养24h；然后弃去培养液，加入不同浓度的伊马替尼溶液(IM)、包载伊马替尼的PEG-PTMC纳米复合物(NPs-IM，实施例1)，负载伊马替尼并外包壳寡糖的PEG-PTMC复合纳米粒(C-NPs-IM，实施例6)以及负载伊马替尼并外包甘露糖化壳寡糖的PEG-PTMC复合纳米粒(MC-NPs-IM，实施例5)，继续孵育24h。待孵育结束，弃去培养液，加入5mg/ml的MTT试剂，37℃下继续孵育4h。待孵育结束，弃去MTT溶液，每孔加入DMSO溶剂200μl溶解甲臢沉淀，轻轻振摇1min，以酶联免疫仪在570nm测定OD值，计算细胞抑制率。
结果如图4所示，MC-NPs-IM纳米复合物对巨噬细胞显示出与浓度相关的毒性作用，根据图4可知，药物浓度不高于25μM时，细胞的生存率高于80％，药物浓度不高于10μM时，细胞的生存率接近90％，药物浓度不高于5μM时，细胞的生存率接近100％，尤其当药物浓度不高于2.5μM时，几乎无细胞毒性。
实施例11
将C57BL/6小鼠腹腔给予环磷酰胺进行免疫抑制后，静脉注射等量MC-NPs-IM纳米复合物(实施例5，标示为MC-NPs-IM)、C-NPs-IM纳米复合物(实施例6，标示为C-NPs-IM)、NPs-IM纳米复合物(实施例1，标示为NPs-IM)、游离药物IM组(标记为IM)、不载药物的NPs纳米复合物(与实施例1相比未加入伊马替尼IM，标示为NPs)、C-NPs纳米复合物(与实施例6相比未加入伊马替尼IM，标示为C-NPs)、以及等量生理盐水(标记为NS)治疗，1天后静脉接种白色念珠菌悬液，通过绘制生存去曲线考察不同制剂组小鼠的生存时间，通过观察小鼠内脏PAS染色切片以评价不同制剂的对控制体内白色念珠菌生长的能力。
结果如图6和图7所示，其中，图6示出了免疫抑制小鼠在感染白色念珠菌后，药物注射组与生理盐水组相比，各脏器中白色念珠菌生长情况，根据PAS染色切片可知，MC-NPs-IM纳米复合物能够有效减少白色念珠菌的生长，减少内脏组织伤害，尤其在肝脏和脾脏中效果更为显著。图7示出了免疫抑制小鼠在白色念珠菌急性感染后的生存曲线，MC-NPs-IM组小鼠生存率最高，相同实验条件下，接种白色念珠菌10天后小鼠存活率仍然高于70％，而生理盐水NS组在第4天、NPs组在第5天、C-NPs组在第7天、IM组和NPs-IM组在第8天生存率均为0，C-NPs-IM组小鼠生存率在第10天为35％左右。结果表明，MC-NPs-IM纳米复合物可以显著延长感染小鼠的生存时间，降低内脏白色念珠菌的生长。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (31)

1.一种纳米复合物，其原料包括伊马替尼、PEG化聚合物和甘露糖化壳寡糖；其中，甘露糖化壳寡糖包覆于最外层，其内以PEG化聚合物为载体包载伊马替尼，其中，原料PEG化聚合物与伊马替尼的质量比为8-50:1。
2.根据权利要求1所述的纳米复合物，其特征在于，所述PEG化聚合物为PEG-PTMC嵌段共聚物，表示为PEGm-PTMCn，其中，m和n表示分子量，m选自1000-4000，n选自3000-30000。
3.根据权利要求2所述的纳米复合物，其特征在于，所述PEG-PTMC嵌段共聚物为PEG(3000)-PTMC(6000)共聚物。
4.根据权利要求1所述的纳米复合物，其特征在于，所述甘露糖化壳寡糖由壳寡糖的醋酸溶液与甘露糖、三乙酰氧基硼氢化钠反应得到。
5.根据权利要求4所述的纳米复合物，其特征在于，所述壳寡糖的醋酸溶液的pH为4-5。
6.根据权利要求4所述的纳米复合物，其特征在于，所述壳寡糖、甘露糖和三乙酰氧基硼氢化钠的质量比1:1:1.5-1:1.5:1.75。
7.根据权利要求4所述的纳米复合物，其特征在于，所述甘露糖化壳寡糖的制备方法包括：壳寡糖与醋酸溶液加热搅拌过夜后，氢氧化钠调节pH得壳寡糖的醋酸溶液；将d-甘露糖、三乙酰氧基硼氢化钠及壳寡糖的醋酸溶液在室温下搅拌反应，所得溶液用双蒸水透析除去未反应的甘露糖以及三乙酰氧基硼氢化钠得到甘露糖化壳寡糖溶液。
8.根据权利要求7所述的纳米复合物，其特征在于，可将甘露糖化壳寡糖溶液冷冻干燥去除水分，得甘露糖化壳寡糖冻干剂，使用时以注射用水重悬即可。
9.根据权利要求1所述的纳米复合物，其特征在于，PEG化聚合物包载伊马替尼后的平均粒径为68-99nm。
10.根据权利要求1所述的纳米复合物，其特征在于，所述纳米复合物即外层包覆甘露糖化壳寡糖后的纳米复合物的粒径分布为15-250nm。
11.权利要求1至10中任一项所述的纳米复合物的制备方法，其包括：将PEG化聚合物、伊马替尼溶于有机溶剂中，使PEG化聚合物和伊马替尼形成均匀溶液；将该均匀溶液加入到表面活性剂溶液中，冰浴探头超声，得到乳剂，除去乳剂中的有机溶剂得到包载有伊马替尼的PEG化聚合物纳米复合物制剂，记为NPs-IM纳米复合物制剂；除去NPs-IM纳米复合物制中的表面活性剂，加入甘露糖化壳寡糖溶液共孵育，离心至离出液体有丁达尔效用，即得最终的纳米复合物，记为MC-NPs-IM纳米复合物。
12.根据权利要求11所述的制备方法，其特征在于，所述甘露糖化壳寡糖的制备方法包括：壳寡糖与醋酸溶液加热搅拌过夜后，氢氧化钠调节pH得壳寡糖的醋酸溶液；将d-甘露糖、三乙酰氧基硼氢化钠及壳寡糖的醋酸溶液在室温下搅拌反应，所得溶液用双蒸水透析除去未反应的甘露糖以及三乙酰氧基硼氢化钠得到甘露糖化壳寡糖溶液。
13.根据权利要求12所述的制备方法，其特征在于，可将甘露糖化壳寡糖溶液冷冻干燥去除水分，得甘露糖化壳寡糖冻干剂，使用时以注射用水重悬即可。
14.根据权利要求13所述的制备方法，其特征在于，以注射用水重悬后的甘露糖化壳寡糖溶液的质量体积浓度为0.5-4％。
15.根据权利要求12所述的制备方法，其特征在于，所述双蒸水透析的截留分子量为300-800D。
16.根据权利要求11所述的制备方法，其特征在于，所述有机溶剂选自二氯甲烷、三氯甲烷、四氢呋喃、乙腈、乙醚和丙酮中的一种或多种。
17.根据权利要求16所述的制备方法，其特征在于，所述有机溶剂为二氯甲烷或三氯甲烷。
18.根据权利要求11所述的制备方法，其特征在于，所述表面活性剂为胆酸钠或聚乙烯醇。
19.根据权利要求11所述的制备方法，其特征在于，所述PEG化聚合物与伊马替尼的质量比为8-50:1。
20.根据权利要求11所述的制备方法，其特征在于，采用冰浴探头超声时，探头超声功率为100-400W，超声次数为20-50次，超声时间为1-5s，超声间隔时间为1-5s。
21.根据权利要求11所述的制备方法，其特征在于，除去有机溶剂的方法采用旋蒸法，旋蒸温度为25-40℃。
22.根据权利要求11所述的制备方法，其特征在于，除去表面活性剂采用超滤离心方式。
23.根据权利要求22所述的制备方法，其特征在于，超滤离心条件为截留分子量为3000-30000，离心转速为3000-10000，离心时间为5-60min。
24.根据权利要求11所述的制备方法，其特征在于，在进行甘露糖化壳寡糖溶液与NPs-IM溶液共孵育时，两者体积比为1.5:1-6:1。
25.根据权利要求24所述的制备方法，其特征在于，所述甘露糖化壳寡糖溶液与NPs-IM溶液共孵育时需分次投放，次数至少为2次。
26.根据权利要求11所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括将制备得到的MC-NPs-IM纳米复合物进行过滤除菌的操作。
27.一种药物载体或递药系统，其包括权利要求1至10中任一项所述的纳米复合物。
28.一种组合物或药物制剂，其包括权利要求1至10中任一项所述的纳米复合物，或权利要求27中所述的药物载体或递药系统；
或者，还进一步地包括至少一种药学上可接受的辅料。
29.权利要求1至10中任一项所述的纳米复合物、或权利要求27中所述的药物载体或递药系统、或权利要求28所述的组合物或药物制剂在制备用于调节巨噬细胞和/或抗真菌感染的药物中的应用。
30.根据权利要求29所述的应用，其特征在于，所述调节巨噬细胞包括阻断巨噬细胞的M2型分化，促进巨噬细胞向M1型分化，提高巨噬细胞活性。
31.根据权利要求29所述的应用，其特征在于，所述真菌感染为白色念珠菌感染。
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