ES2649180T3 - Combinación de vacunación e inhibición de la ruta PD-1 - Google Patents

Combinación de vacunación e inhibición de la ruta PD-1 Download PDF

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Abstract

Combinación de vacuna/inhibidor, que comprende: i) como vacuna, una vacuna de ARN que comprende al menos un ARN, donde el al menos un ARN es un ARNm, que comprende al menos un marco de lectura abierto (ORF) que codifica para al menos un antígeno y ii) como inhibidor, una composición que comprende un inhibidor de la ruta PD-1, donde el inhibidor de la ruta PD-1 es un anticuerpo antagonista que está dirigido contra PD-1.

Description

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DESCRIPCION
Combinacion de vacunacion e inhibicion de la ruta PD-1
La presente invencion esta definida por sus reivindicaciones y se refiere a una combinacion de vacuna/inhibidor que comprende (i) como vacuna un ARN de vacua que comprende al menos un ARN, donde el al menos un ARN es un ARNm que comprende al menos un marco de lectura abierto (ORF) que codifica para al menos un antigeno y (ii) como inhibidor una composicion que comprende al menos un inhibidor de la ruta PD-1, donde el inhibidor de la ruta PD-1 es un anticuerpo antagonista, que esta dirigido contra PD-1. La presente invencion ademas se refiere al uso medico de tal combinacion de vacuna/inhibidor, a la composicion farmaceutica y al kit de partes que comprende tal combinacion vacuna/inhibidor, en particular para la prevencion o el tratamiento de enfermedades cancerosas o tumorales o de enfermedades infecciosas. Ademas, la presente invencion se refiere a tal vacuna de ARN para su uso en terapia en combinacion con un inhibidor de la ruta PD-1 como se define anteriormente y a tal inhibidor de la ruta PD-1 para su uso en terapia en combinacion con una vacuna de ARN tal como se define anteriormente.
Tradicionalmente, la inmunoterapia del cancer se ha centrado en estimular el sistema inmunitario mediante la vacunacion o la inmunoterapia celular adoptiva para provocar una respuesta anti-tumoral. Este enfoque se basa en la asuncion de que las celulas tumorales expresan dianas antigenicas, pero en que las celulas T anti- tumorales no se activan lo suficiente. Por tanto, para evitar este problema, se intento principalmente incrementar el reconocimiento de estas dianas antigenicas estimulando las rutas inmunes innatas y co- estimuladoras positivas claves (tal como los receptores CD28, CD154 y TLR).
Mas recientemente, se ha hecho evidente que el sistema inmunitario no reconoce antigenos tumorales, sino que permanece en reposo a pesar de estar presentes antigenos tumorales. Esta observacion lleva a la hipotesis de que existen mecanismos inhibidores espedficos que limitan o incluso detienen la respuesta antitumoral. Esta hipotesis se confirmo cuando se descubrio que las moleculas de superficie de las celulas T reguladoras negativas eran sobre-reguladas en las celulas T activadas para amortiguar su actividad, resultando en una muerte menos efectiva de las celulas tumorales. Estas moleculas inhibidoras se denominaron moleculas co- estimuladoras negativas debido a su homologfa con las moleculas co-estimuladoras de celulas T CD28. Estas protemas, tambien referidas como protemas de punto de control inmunes, funcionan en multiples rutas, incluyendo la atenuacion de senales de activacion temprana, competencia para la co-estimulacion positiva e inhibicion directa de antfgeno presentador de celulas (Bour-Jordan et al., 2011. Immunol Rev. 241(1): 180-205; PMID: 21488898). Un miembro de esta familia de protemas es muerte programada-1 (PD-1) y sus ligandos B7- H1/PD-L1 (CD274) y B7-DC/PD-L2 (CD273).
PD-1 se expresa en celulas T y B activadas, asf como en monocitos implicados en regular el equilibrio entre la activacion inmune y la tolerancia. El papel principal de PD-1 es limitar la actividad de las celulas T en la periferia durante una respuesta inflamatoria a la infeccion y limitar la autoinmunidad. La base para esta regulacion es que los ligandos PD-1 B7-H1/PD-L1 y B7-DC/PD-L2 aumentan en respuesta a diversas citoquinas proinflamatorias y pueden enlazar a PD-1 en celulas T activadas de tejidos inflamados, limitando asf la respuesta inmunitaria. La eliminacion del gen PD-1 lleva a complicaciones autoinmunes, por ejemplo a smtomas similares al lupus (Nishimura et al., 1999. Immunity 11(2):141-51; PMID: 10485649).
Ademas, se ha encontrado que B7-H1/PD-L1 con frecuencia esta sobre-regulado en muchos tipos de tumor diferentes, donde inhibe las respuestas de las celulas T antitumorales locales enlazandose a PD-1 en los linfocitos infiltrantes tumorales. Por ejemplo, se demostro que PD-L1 juega un papel en la evasion inmune tumoral en carcinomas de celulas escamosas de la cabeza y cuello (Dong et al., 2002. Nat Med. 8(8):793-800). Los autores demuestran que la expresion forzada de B7-H1/PD-L1 en tumores que son normalmente B7- H1/PD-L1-negativos inhibe su eliminacion inmune y que el bloqueo de anticuerpos restaura las respuestas antitumorales. Ademas, se demostro que muchos tumores humanos, como carcinomas del pulmon, ovario y colon, sobreregulan B7-H1/PD-L1 en relacion a sus contrapartes de tejido normales. En resumen, estas observaciones sugieren usar el bloqueo de la ruta PD-1 para la inmunoterapia del cancer (Zitvogel and Kroemer, 2012. Oncoimmunology 1, 1223-1125).
En este contexto la US 2010/0055102 describe el uso de antagonistas de PD-1 para incrementar una respuesta inmunitaria de celulas T en un mairnfero. En la WO2010/063011 se describe un tratamiento del cancer que comprende el trasplante de celulas T activadas y la administracion de un antagonista de PD-1. Recientemente se han realizado los primeros ensayos clmicos con inhibidores del punto de control inmune (ICIs) contra el receptor PD-1 y su ligando PD-L1. El primer ensayo de fase I con el anticuerpo monoclonal anti-PD-1 BMS- 936558 se llevo a cabo en pacientes con tumores solidos metastasicos refractarios al tratamiento. La actividad clmica se observo en pacientes con melanoma, carcinoma renal, cancer colon-rectal y cancer de pulmon de celulas no pequenas (NSCLC). Se pudo demostrar que PD-L1 se sobre-expresa en muchos canceres y esta
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asociado frecuentemente a un mal pronostico. Ademas, la expresion tumoral de la superficie celular de PD-L1 en biopsias pre-tratamiento surge como un potencial biomarcador de respuesta, consistente con la biologfa de la ruta (Brahmer et al., 2010. J Clin Oncol. 28(19):3167-75; PMID: 20516446).
Otro estudio cKnico con BMS-936558 produce respuestas objetivo en aproximadamente uno de cada cuatro hasta uno de cada cinco pacientes de cancer de pulmon de celulas no pequenas, melanoma o cancer de celulas renales; el perfil de evento adverso no aparece para impedir su uso. Los datos preliminares sugieren una relacion entre la expresion de PD-L1 en las celulas tumorales y la respuesta objetivo (Topalian et al., 2012. N Engl J Med. 366(26):2443-54; PMID: 22658127).
Ademas, un estudio de fase I con el anticuerpo anti-PD-L1 BMS-936559 induce la regresion tumoral duradera (velocidad de respuesta objetivo de 6 hasta 17%) y la estabilizacion prolongada de la enfermedad (velocidades de 12 hasta 41% en 24 semanas) en pacientes con canceres avanzados, incluyendo cancer de pulmon de celulas no pequenas, melanoma y cancer de celulas renales. Espedficamente, se observo una respuesta objetivo (una respuesta completa o parcial) en 9 de 52 pacientes con melanoma, 2 de 17 con cancer de celulas renales, 5 de 49 con cancer de pulmon de celulas no pequenas y 1 de 17 con cancer de ovario (Brahmer et al. 2012. N Engl J Med. 366(26):2455-65; PMID: 22658128).
En la WO 2008/156712 tambien se describen anticuerpos contra PD-1 humanos.
Sin embargo, unicamente respuestas relativamente bajas en algunos canceres se podnan demostrar en estos estudios (por ejemplo cancer de pulmon y prostata) para los inhibidores del punto de control de la ruta PD-1. En estudios mas recientes las combinaciones con inhibidores del punto de control de la ruta PD-1 se han evaluado en modelos preclmicos.
Un estudio reporta por ejemplo la generacion de una vacuna de celulas dendnticas (DC) con una combinacion de un ligando de siARN de PD-1 y antfgeno de ARNm diana. Estas DC PD-L1-silenciadas cargadas con antfgeno de ARNm incrementan la respuesta de las celulas T CD8+ espedficas de antfgeno ex vivo en pacientes con cancer trasplantados (Hobo et al. 2013. Cancer Immunol Immunother. 62(2):285-97; PMID: 22903385).
Igualmente, Dai et al. demuestran que un sistema de vector lentiviral dirigido a celulas dendnticas (DCLV) que codifica la protema Gag del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH)-1 combinado con un bloqueo de la senal inhibidora de ligando PD-1/PD-1 (PD-L) mediante un anticuerpo anti-PD-L1 genera una respuesta inmunitaria CD8+ espedfica de Gag de VIH-1 mejorada despues de la inmunizacion con DCLV (Dai et al. 2012. Mol Ther. 20(9):1800-9; PMID: 22588271).
Otro estudio examina la combinacion de vacunacion de lentivector recombinante (rLV) con anticuerpos de bloqueo PD-1 y PD-L1. La combinacion de anticuerpos de bloqueo con vacunacion rLV retarda el crecimiento de tumor pero no fue suficiente para inducir el rechazo completo de tumores establecidos (Sierro et al. 2011. Eur J Immunol.; 41(8): 2217-28; PMID: 21538347).
Adicionalmente, la WO 2008/11344 describe la modulacion de una respuesta inmunitaria por la combinacion de un constructo adenoviral recombinante basado en ADN (rAAV) que codifica para un antfgeno o protema terapeutica y un acido nucleico que codifica para un modulador de senalizacion PD-1, particularmente siARN, ARN antisentido o una ribozima espedfica para el gen PD-L1.
En este contexto tambien se estudio la fusion de la protema PD-1 soluble y fragmentos de protema antigenica (WO 2012/062218).
Otro estudio pre-clfnico reporta que el bloqueo de la combinacion de los receptores co-estimuladores CTLA-4- y PD-1-negativos lleva a niveles sinergicos de rechazo del tumor en el contexto de una vacuna adecuada (Curran et al., 2010. Proc Natl Acad Sci USA 107(9): 4275-80; PMID: 20160101). Ratones pre-implantados con celulas de melanoma B16 se vacunaron con celulas de melanoma B16 irradiadas que expresan ya sea GM- CSF (Gvax) o ligando Flt3 (Fvax) combinado con el bloqueo de anticuerpos de antfgeno-4 de linfocito T citotoxico del receptor co-estimulador de celulas T negativo (CTLA-4), muerte programada-1 (PD-1) y su ligando PD-L1. En el contexto de Gvax, ni el bloqueo de cualquier receptor co-inhibidor simple ni de cualquier combinacion resulta en una supervivencia superior al 20%. Usando Fvax, el bloqueo de cualquiera de PD-L1 (8% de supervivencia), CTLA-4 (10% de supervivencia) o PD-1 (25% de supervivencia) mostro un beneficio terapeutico modesto. Sin embargo, unicamente el bloqueo combinado de CTLA-4 y PD-1 lleva al rechazo tumoral en un 50% de los ratones y la adicion posterior de anticuerpo anti-PD-L1 incrementa la tasa al 65%. En resumen, unicamente el bloqueo CTLA-4 combinado con el bloqueo PD-1 tema un efecto significativo en
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promover el rechazo de melanomas B16 en conjunto con la vacuna celular de melanoma B16. El bloqueo de un receptor inhibidor simple (PD-1 o CTLA-4) lleva a una sobre-regulacion de la trayectoria desbloqueada. Por tanto, este estudio sugiere que puede ser necesario el bloqueo simultaneo de multiples receptores co- estimuladores negativos para permitir a las celulas T que infiltran el tumor ser efectivas. Ademas, en base a sus datos pre-clmicos en el modelo de melanoma B16, los autores sugieren que combinar estos agentes puede tener efectos sinergicos en conducir el rechazo del tumor, pero senalan que combinar multiples anticuerpos de bloqueo co-inhibidores en la clmica debe realizarse con gran precaucion.
Mkrtichya et al. reporta ademas respuestas inmunitarias espedficas de antigeno sinergicas empleando un anticuerpo anti-PD-1 (CT-011) con deplecion de celulas Treg por ciclofosfamida a dosis bajas (CPM), combinado con una vacuna de tumor (vacuna de peptido HPV16-E7). Pero unicamente la combinacion de estos 3 tratamientos resulta en una regresion completa de los tumores (Mkrtichya et al. 2011. Eur J Immunol. 41(10): 2977-86; PMID: 21710477).
Un reporte adicional que examina el efecto de la inhibicion PD-L1 en el crecimiento tumoral demuestra que la administracion sistemica de anticuerpo anti-PD-L1 mas celulas dendnticas pulsadas con peptidos de melanoma (DCs) resulta en un numero mas alto de celulas T CD8+ espedficas de peptido de melanoma, pero que esta combinacion es insuficiente para retrasar el crecimiento de melanoma B16 establecido. Aunque la irradiacion corporal adicional retarda el crecimiento tumoral, es necesaria la transferencia adoptiva adicional de celulas T CD8+ espedficas de antfgeno para alcanzar la regresion tumoral y supervivencia a largo plazo de los ratones tratados (Pilon-Thomas et al. 2010. J Immunol. 1; 184(7): 3442-9; PmiD: 20194714).
En un estudio pre-clmico Fotin-Mleczek et al. muestran la combinacion beneficiosa de una vacuna tumoral basada en ARNm y un anticuerpo dirigido contra el receptor CTLA4 que atenua la senalizacion de las celulas T (Fotin-Mleczek et al., 2012. J Gene Med. 14(6):428-39; PMID: 22262664).
En resumen, el uso de inhibidores del punto de control inmune parece representar un enfoque prometedor para una mejor inmunoterapia del cancer. Sin embargo, la combinacion de vacunas con un ICI simple a menudo no lleva a la mejora esperada de la inmunoterapia y el uso clmico combinado de los ICI que dirigen multiples receptores co-estimuladores negativos o la combinacion de los ICI con otros tratamientos puede inducir complicaciones clmicas, por ejemplo inducir una enfermedad autoinmunitaria.
Por tanto, es el objeto de la presente invencion proporcionar medios seguros y efectivos para una terapia basada en los ICI, particularmente basada en inhibidores de la ruta PD-1, en particular para una terapia tumoral, del cancer y/o de enfermedades infecciosas.
El objetivo que subyace en la presente invencion se resuelve por la materia reivindicada. En particular, el objeto de la invencion se resuelve proporcionando una combinacion vacuna/inhibidor que comprende, como vacuna, una vacuna de ARN que comprende al menos un ARNm que comprende al menos un marco de lectura abierto que codifica para al menos un antfgeno y, como inhibidor, una composicion que comprende un inhibidor de la ruta PD-1, donde el inhibidor de la ruta PD-1 es un anticuerpo antagonista dirigido contra el receptor PD-1. Ademas, el objeto se resuelve mediante una composicion farmaceutica o un kit de partes que comprende la combinacion vacuna/inhibidor o los componentes respectivos de los misma.
Para claridad y legibilidad se proporcionan las siguientes definiciones. Cualquier caractenstica tecnica mencionado para estas definiciones se puede leer en todas y cada realizacion de la invencion. Las definiciones y explicaciones adicionales se pueden proporcionar espedficamente en el contexto de estas realizaciones.
Respuesta inmunitaria: Una respuesta inmunitaria puede sertfpicamente cualquiera de una reaccion espedfica del sistema inmunitario adaptativo a un antfgeno particular (denominada respuesta inmunitaria espedfica o adaptativa) o una reaccion no espedfica del sistema inmunitario innato (denominada respuesta inmunitaria no espedfica o innata). En esencia, la invencion se asocia con reacciones espedficas (respuestas inmunitarias adaptativas) del sistema inmunitario adaptativo. Sin embargo, esta respuesta espedfica se puede soportar por una reaccion no espedfica adicional (respuesta inmunitaria innata). Por tanto, la invencion tambien se refiere a un compuesto, composicion o combinacion para la estimulacion simultanea del sistema inmunitario innato y el adaptativo con el fin de evocar una respuesta inmunitaria adaptiva eficiente.
Sistema inmunitario: El sistema inmunitario puede proteger a los organismos de infecciones. Si un patogeno tiene exito traspasando una barrera ffsica de un organismo y entra en este, el sistema inmunitario innato proporciona una respuesta inmediata, pero no espedfica. Si los patogenos evaden esta respuesta innata, los vertebrados tienen una segunda capa de proteccion, el sistema inmunitario adaptativo. Aqrn, el sistema inmunitario adapta su respuesta durante una infeccion para mejorar su reconocimiento del patogeno. Esta
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respuesta mejorada se mantiene asf despues de que el patogeno se ha eliminado en forma de una memoria inmunologica y permite al sistema inmunitario adaptativo desarrollar ataques mas rapidos y fuertes cada vez que se encuentra este patogeno. De acuerdo con esto, el sistema inmunitario comprende el sistema inmunitario innato y el adaptativo. Cada una de estas dos partes tipicamente contiene los denominados componentes humorales y celulares.
Respuesta inmunitaria adaptiva: La respuesta inmunitaria adaptiva se entiende tipicamente como una respuesta espedfica de antigeno del sistema inmunitario. La especificidad de antigeno permite generar respuestas que se adaptan a patogenos espedficos o celulas infectadas por patogenos. Normalmente, la capacidad de desarrollar estas respuestas adaptadas es mantenida en el cuerpo por “celulas de memoria”. Si un patogeno infecta el cuerpo mas de una vez, se usan estas celulas de memoria espedficas para eliminarlo rapidamente. En este contexto, la primera etapa de una respuesta inmunitaria adaptiva es la activacion de celulas T espedficas de antfgeno primitivo o diferentes celulas inmunitarias capaces de inducir una respuesta inmunitaria espedfica de antigeno por celulas presentadoras de antigeno. Esto ocurre en los tejidos linfoides y organos a traves de los cuales las celulas T naive pasan constantemente. Los tres tipos de celulas que pueden servir como celulas presentadoras de antfgeno son celulas dendnticas, macrofagos y celulas B. Cada una de estas celulas tiene una funcion distinta provocando respuestas inmunitarias. Las celulas dendnticas pueden tomar antfgenos por fagocitosis y macropinocitosis y pueden volverse a estimular por contacto con, por ejemplo, un antfgeno exterior para migrar al tejido linfoide local, donde se diferencian en celulas dendnticas maduras. Los macrofagos ingieren antfgenos de partmulas como bacterias y se inducen por agentes infecciosos u otros estfmulos apropiados para expresar las moleculas MHC. La capacidad unica de las celulas B de enlazar e interiorizar antfgenos de protema solubles por medio de sus receptores tambien puede ser importante para inducir las celulas T. Las moleculas MHC son tfpicamente responsables de la presentacion de un antfgeno a celulas T. A este respecto, presentar el antfgeno en moleculas MHC lleva a la activacion de las celulas T que inducen su proliferacion y diferenciacion en celulas T efectoras armadas. La funcion mas importante de las celulas T efectoras es la eliminacion de celulas infectadas por celulas T citotoxicas CD8+ y la activacion de macrofagos por celulas Th1 que juntos conforman la inmunidad mediada por celula, y la activacion de celulas B por ambas celulas Th2 y Thl para producir diferentes clases de anticuerpo, conduciendo asf a la respuesta inmunitaria humoral. Las celulas T reconocen un antfgeno por sus receptores de celulas T que no reconocen y enlazan el antfgeno directamente, pero en su lugar reconocen fragmentos peptfdicos cortos, por ejemplo de antfgenos de protema derivados de patogeno, por ejemplo los llamados epttopos, que se enlazan a moleculas MHC en las superficies de otras celulas.
Sistema inmunitario adaptativo: El sistema inmunitario adaptativo se dedica esencialmente a eliminar o impedir el crecimiento patogenico. Tfpicamente regula la respuesta inmunitaria adaptiva dotando al sistema inmunitario vertebrado de la capacidad para reconocer y recordar patogenos espedficos (para generar inmunidad) y para desarrollar ataques mas fuertes cada vez que se encuentra el patogeno. El sistema es altamente adaptable debido a la hipermutacion somatica (un proceso de mutaciones somaticas aceleradas) la y recombinacion V(D)J (una recombinacion genetica irreversible de segmentos de gen de receptor de antfgeno). Este mecanismo permite a un numero pequeno de genes generar un gran numero de diferentes receptores de antfgeno, que luego se expresan unicamente en cada linfocito individual. Debido a que el reordenamiento del gen lleva a un cambio irreversible del ADN de cada celula, toda de la progenie (descendencia) de tal celula heredara entonces genes que codifican la misma especificidad de receptor, que incluye celulas B de Memoria y celulas T de Memoria, claves para la inmunidad espedfica longeva.
Inmunidad celular/respuesta inmunitaria celular: La inmunidad celular se relaciona tfpicamente con la activacion de macrofagos, celulas asesinas naturales (NK), linfocitos T citotoxicos espedficos de antfgeno y la liberacion de diversas citoquinas en respuesta a un antfgeno. En terminos mas generales, la inmunidad celular no se basa en anticuerpos, sino en la activacion de celulas del sistema inmunitario. Tfpicamente, una respuesta inmunitaria celular se puede caracterizar por ejemplo activando linfocitos T citotoxicos espedficos de antfgeno que son capaces de inducir la apoptosis celular, por ejemplo en celulas inmunitarias espedficas como celulas dendnticas u otras celulas, que detectan epftopos de antfgenos extranos en su superficie. Tales celulas se pueden infectar por virus o con bacterias intracelulares o con celulas de cancer que detectan antfgenos tumorales. Las caractensticas adicionales pueden ser la activacion de macrofagos y celulas asesinas naturales, permitiendoles destruir patogenos y la estimulacion de celulas para secretar una variedad de citoquinas que influyen en la funcion de otras celulas implicadas en respuestas inmunitarias adaptativas e innatas.
Inmunidad humoral/respuesta inmunitaria humoral: La inmunidad humoral se refiere tfpicamente a la produccion de anticuerpos y opcionalmente a procesos accesorios que acompanan a la produccion de anticuerpos. Una respuesta inmunitaria humoral tfpicamente se puede caracterizar, por ejemplo, por la activacion Th2 y la produccion de citoquina, formacion de centro germinal y cambio de isotipo, maduracion de la afinidad y generacion celular de memoria. La inmunidad humoral tambien puede referirse tfpicamente a funciones efectoras de anticuerpos, que incluyen la neutralizacion de patogenos y toxinas, la activacion de
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complemento clasica y la promocion de opsonina de la fagocitosis y la eliminacion de patogenos.
Sistema inmunitario innato: El sistema inmunitario innato, tambien conocido como sistema inmunitario no espedfico (o inespedfico), tipicamente comprende celulas y mecanismos que defienden al huesped de la infeccion por otros organismos de manera no espedfica. Esto significa que las celulas del sistema innato pueden reconocer y responder a patogenos de forma generica, pero, a diferencia del sistema inmunitario adaptativo, no confiere inmunidad de larga duracion o de proteccion al huesped. El sistema inmunitario innato puede ser, por ejemplo, activado por ligandos de receptores tipo Toll (TLRs) u otras sustancias auxiliares, como lipopolisacaridos, TNF-alfa, ligando CD40, o citoquinas, monoquinas, linfoquinas, interleuquinas o quimiocinas, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-24, IL-25, IL-26, IL-27, IL-28, IL-29, IL-30, IL-31, IL-32, IL-33, IFN-alfa, IFN-beta, IFN-gama, GM-CSF, G-CSF, M-CSF, LT-beta, TNF-alfa, factores de crecimiento y hGH, un ligando de receptor tipo Toll humano TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLR10, un ligando de receptor tipo Toll de murino TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLR10, TLR11, TLR12 o TLR13, un ligando de un receptor tipo NOD, un ligando de un receptor tipo RIG-I, un acido nucleico inmunoestimulador, un ARN inmunoestimulador (isARN), un CpG-ADN, un agente antibacteriano o un agente anti-viral. La combinacion vacuna/inhibidor, la composicion farmaceutica o el kit de partes de acuerdo con la presente invencion pueden comprender una o mas de tales sustancias. Tfpicamente, una respuesta del sistema inmunitario innato incluye celulas inmunitarias de reclutamiento a sitios de infeccion mediante la produccion de factores qmmicos, incluyendo mediadores qmmicos especializados denominados citoquinas; activacion de la cascada del complemento; identificacion y eliminacion de sustancias extranas presentes en organos, tejidos, sangre y linfa por globulos blancos especializados; activacion del sistema inmunitario adaptativo; y/o actuando como barrera tisica y qmmica a agentes infecciosos.
Adyuvante/componente adyuvante: Un adyuvante o un componente adyuvante en el sentido mas amplio es tipicamente un agente farmacologico y/o inmunologico que puede modificar, por ejemplo mejorar, el efecto de otros agentes, tal como un farmaco o vacuna. Esto debe interpretarse en un sentido amplio y se refiere a un espectro amplio de sustancias. Tfpicamente, estas sustancias son capaces de incrementar la inmunogenicidad de antigenos. Por ejemplo, los adyuvantes se pueden ser reconocidos por los sistemas inmunitarios innatos y, por ejemplo, pueden provocar una respuesta inmunitaria innata. Los “adyuvantes” tipicamente no provocan una respuesta inmunitaria adaptiva. A este respecto, los “adyuvantes” no califican como antigenos. Su modo de accion es distinto de los efectos desencadenados por antigenos que resultan en una respuesta inmunitaria adaptiva.
Antigeno: En el contexto de la presente invencion el “antigeno” se refiere tipicamente a una sustancia que puede ser reconocida por el sistema inmunitario, preferiblemente por el sistema inmunitario adaptativo, y es capaz de desencadenar una respuesta inmunitaria espedfica de antigeno, por ejemplo por la formacion de anticuerpos y/o celulas T espedficas de antigeno como parte de una respuesta inmunitaria adaptiva. Tfpicamente, un antigeno puede ser o puede comprender un peptido o protema que comprende al menos un epftopo y que se puede presentar por la MHC a celulas T. En el sentido de la presente invencion, un antigeno puede ser el producto de la traduccion de un ARN proporcionado, preferiblemente un ARNm tal como se define aqrn. En este contexto, tambien fragmentos, variantes y derivados de peptidos y protemas que comprenden al menos un epftopo se entienden como antigenos. En el contexto de la presente invencion, los antigenos tumorales y patogenicos como se definen aqrn son particularmente preferentes.
Epftopo: Los epftopos (tambien llamados 'determinates de antigeno') pueden distinguirse en epftopos de celulas T y epftopos de celulas B. Los epftopos de celulas T o partes de las protemas en el contexto de la presente invencion pueden comprender fragmentos que, preferiblemente, tienen una longitud de alrededor de 6 a alrededor de 20 o aun mas aminoacidos, por ejemplo fragmentos tal como se procesan y presentan por moleculas de clase I MHC, preferiblemente con una longitud de alrededor de 8 a alrededor de 10 aminoacidos, por ejemplo 8, 9, o 10, (o aun 11, o 12 aminoacidos), o fragmentos tales como se procesan y presentan por moleculas de clase II MHC, preferiblemente de una longitud de alrededor de 13 o mas aminoacidos, por ejemplo 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o aun mas aminoacidos, donde estos fragmentos se pueden seleccionar de cualquier parte de la secuencia de aminoacidos. Estos fragmentos son tipicamente reconocidos por celulas T en forma de un complejo que consiste en el fragmento de peptido y una molecula MHC, asf, los fragmentos tipicamente no son reconocidos en su forma nativa. Los epftopos de celulas B son tipicamente fragmentos ubicados en la superficie externa de protemas (nativas) o antigenos de peptido como se define aqrn, preferiblemente de 5 a 15 aminoacidos, mas preferiblemente de 5 a 12 aminoacidos, aun mas preferiblemente de 6 a 9 aminoacidos, que pueden ser reconocidos por anticuerpos, esto es en su forma nativa. Tales epftopos de protemas o peptidos ademas se pueden seleccionar de cualquiera de las variantes aqrn mencionadas de tales protemas o peptidos. En este contexto, los determinantes antigenicos pueden ser epftopos conformacionales y discontinuos que se componen de segmentos de las protemas o peptidos tal como se definen aqrn que son discontinuos en la secuencia de aminoacidos de las protemas o peptidos como se definen
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aqrn, pero se reunen en la estructura tridimensional, o epttopos continuos o lineales que se componen de una unica cadena de polipeptidos.
Vacuna: Una vacuna se entiende tipicamente como un material profilactico o terapeutico que proporciona al menos un antfgeno, preferiblemente un inmunogeno. “Proporcionar al menos un antigeno” significa, por ejemplo, que la vacuna comprende el antigeno o que la vacuna comprende una molecula que, por ejemplo, codifica para el antigeno o una molecula que comprende el antigeno. Por ejemplo, la vacuna puede comprender un acido nucleico, tal como un ARN (por ejemplo vacuna de ARN), que codifica para un peptido o protema que comprende el antfgeno. El antigeno o inmunogeno se puede derivar de cualquier material adecuado para la vacunacion. Por ejemplo, el antfgeno o inmunogeno se puede derivar de un patogeno, tal como de bacterias o partmulas virales, etc., o de un tumor o tejido canceroso. El antigeno o inmunogeno estimula el sistema inmunitario adaptativo del cuerpo para proporcionar una respuesta inmunitaria adaptiva. En el contexto de la presente invencion, la vacuna preferiblemente no comprende celulas, como celulas dendnticas o celulas cancerosas, por ejemplo celulas de melanoma B16. Ademas, en el contexto de la presente invencion, la vacuna preferiblemente no consiste en antigenos de peptido, tal como antigenos de peptido tumorales. En el contexto de la presente invencion, la vacuna es preferiblemente una vacuna de ARN.
Vacuna de ARN: La vacuna de ARN se define aqrn como una vacuna que comprende al menos una molecula de ARN que comprende al menos un marco de lectura abierto (ORF) que codifica para al menos un antigeno. En el contexto de la presente invencion, la al menos una molecula de ARN comprendida en la vacuna es preferiblemente una molecula de ARN aislado. Este al menos un ARN es preferiblemente un ARN viral, un ARN auto-replicante (replicon) o mas preferiblemente un ARNm. Tambien se incluyen aqrn hnbridos ARN/ADN que se refieren a que al menos una molecula de ARN de la vacuna de ARN consiste en partes de ribonucleotidos y de desoxirribonucleotidos. En este contexto, al menos un ARN de la vacuna de ARN consiste en al menos un 50% de ribonucleotidos, mas preferiblemente hasta al menos un 60%, 70%, 80%, 90% y mas preferiblemente hasta un 100%. En este contexto, al menos un ARN de la vacuna de ARN tambien se puede proporcionar como ARN complejado o ARNm, como partmula virual y como partmula de replicon como se define aqrn. En el contexto de la presente invencion, al menos un ARN comprendido en la vacuna de ARN no se presenta preferiblemente en celulas, tal como celulas dendnticas o de cancer, por ejemplo celulas de melanoma B16. Ademas es particularmente preferente que la vacuna de ARN de la invencion no comprenda o consiste en un vector lentiviral, en particular no una celula dendntica - vector lentiviral dirigido, o un (recombinante) vector adenoviral/adeno-asociado (vector (r)AAV). Preferiblemente, la vacuna de ARN de la invencion no es una vacuna de VIH. En particular, se prefiere que la vacuna de ARN de la invencion no comprenda un AAV o vector lentiviral que codifique uno o mas antfgenos. Igualmente, la vacuna de ARN de la invencion no puede preferiblemente codificar antfgenos espedficos de VIH, por ejemplo protema Gag, en particular no un vector lentiviral que codifica antfgenos espedficos de VIH, como Gag. Preferiblemente, la vacuna de ARN de la invencion no comprende una protema de fusion de una protema PD1 y una protema antigenica o una protema de fusion de una protema PD1 y una inmunoglobulina o una porcion de los mismos y no codifica tal protema de fusion PD1.
Vacunacion genetica: La vacunacion genetica tipicamente se puede entender como la vacunacion por administracion de una molecula de acido nucleico que codifica un antfgeno o un inmunogeno o fragmentos de los mismos. La molecula de acido nucleico se puede administrar a un cuerpo del sujeto o a celulas aisladas de un sujeto. Tras la transfeccion de ciertas celulas del cuerpo o tras la transfeccion de las celulas aisladas, el antfgeno o inmunogeno puede ser expresado por aquellas celulas y posteriormente ser presentado al sistema inmunitario, provocando una respuesta inmunitaria adaptiva, esto es espedfica de antfgeno. En consecuencia, la vacunacion genetica tfpicamente comprende al menos una de las etapas de a) administrar un acido nucleico, preferiblemente un ARN (aislado) como se define aqrn, a un sujeto, preferiblemente un paciente, o a celulas aisladas de un sujeto, preferiblemente de un paciente, que usualmente resulta en la transfeccion de las celulas del sujeto ya sea in vivo o in vitro; b) transcripcion y/o traduccion de la molecula de acido nucleico introducida; y opcionalmente c) re-administracion de celulas aisladas transfectadas al sujeto, preferiblemente al paciente, si el acido nucleico no se ha administrado directamente al paciente.
Acido nucleico: El termino acido nucleico se refiere a cualquier molecula de ADN o ARN y sinonimo con polinucleotido. Ademas, las modificaciones o derivados del acido nucleico como se definen aqrn se incluyen explfcitamente en el termino general “acido nucleico”. Por ejemplo, APN tambien se incluye en el termino “acido nucleico”.
ARN monocistronico: Un ARN monocistronico tfpicamente puede ser un ARN, preferiblemente un ARNm, que comprende unicamente un marco de lectura abierto. Un marco de lectura abierto en este contexto es una secuencia de diversos tripletes de nucleotidos (codones) que se pueden traducir en un peptido o protema.
ARN Bi-/multicistronico: ARN, preferiblemente ARNm, que tfpicamente puede tener dos (bicistronico) o mas
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(multicistronico) marcos de lectura abiertos (ORF). Un marco de lectura abierto en este contexto es una secuencia de diversos tripletes de nucleotidos (codones) que se pueden traducir en un peptido o protema.
Estructura 5'-Cap: Un 5' Cap es tipicamente un nucleotido modificado, particularmente un nucleotido de guanina, agregado al extremo 5' de una molecula de ARN. Preferiblemente, el 5'-Cap se agrega usando un enlace 5'-5'-trifosfato.
Secuencia Poli(C): Una secuencia poli(C) es tipicamente una secuencia larga de nucleotidos de citosina, tipicamente de alrededor de 10 a alrededor de 200 nucleotidos de citidina, preferiblemente alrededor de 10 a alrededor de 100 nucleotidos de citidina, mas preferiblemente alrededor de 10 a alrededor de 70 nucleotidos de citidina o aun mas preferiblemente alrededor de 20 a alrededor de 50 o aun alrededor de 20 a alrededor de 30 nucleotidos de citidina. Una secuencia poli(C) preferiblemente se puede ubicar en 3' de la region codificadora comprendida en el acido nucleico.
Cola poli(A): Una cola poli(A) tambien llamada “cola 3'-poli(A)” es tfpicamente una secuencia larga de nucleotidos de adenina de hasta alrededor de 400 nucleotidos de adenosina, por ejemplo de alrededor de 25 a alrededor de 400, preferiblemente desde alrededor de 50 a alrededor de 400, mas preferiblemente desde alrededor de 50 a alrededor de 300, aun mas preferiblemente desde alrededor de 50 a alrededor de 250, mas preferiblemente desde alrededor de 60 a alrededor de 250 nucleotidos de adenosina, agregada al extremo 3' de una secuencia de acido nucleico, preferiblemente un ARNm. Una cola poli(A) preferiblemente se puede ubicar en 3' en la region codificadora comprendida en un acido nucleico, por ejemplo un ARNm.
Acido nucleico estabilizado: Un acido nucleico estabilizado tfpicamente puede ser esencialmente resistente a la degradacion in vivo (por ejemplo degradacion por una exo- o endo-nucleasa) y/o la degradacion ex vivo (por ejemplo por el proceso de fabricacion antes de la administracion de la vacuna, por ejemplo durante la preparacion de la solucion de vacuna de ARN a administrarse). La estabilizacion de ARN, particularmente de ARNm, puede por ejemplo alcanzarse proporcionando una estructura 5'-Cap, una cola Poli(A), una cola poli (C), y/o cualquier otra modificacion UTR. Tambien puede conseguirse modificando la estructura, por modificacion de azucar, modificacion de bases y/o modificacion del contenido G/C del acido nucleico. Diversos otros metodos son concebibles en el contexto de la invencion.
Modificacion de un acido nucleico (acido nucleico modificado): La modificacion de una molecula de acido nucleico, particularmente de un ARN o ARNm, puede contener modificaciones estructurales, modificaciones de azucar o modificaciones de bases. Una modificacion estructural en conexion con la presente invencion es una modificacion donde los fosfatos de la estructura de nucleotidos contenida en la molecula de acido nucleico se modifica qmmicamente. Una modificacion de azucar en conexion con la presente invencion es una modificacion qmmica del azucar de los nucleotidos del acido nucleico. Ademas, una modificacion de bases en conexion con la presente invencion es una modificacion qmmica de la parte base de los nucleotidos de la molecula de acido nucleico. Por tanto un acido nucleico modificado tambien se define aqm como una molecula de acido nucleico que puede incluir analogos de nucleotidos. Ademas una modificacion de una molecula de acido nucleico puede contener una modificacion de lfpido. Tal acido nucleico modificado por lfpido tipicamente comprende un acido nucleico como se define aqm. Tal molecula de acido nucleico modificada por lfpido tfpicamente ademas comprende al menos un enlazante unido covalentemente a esa molecula de acido nucleico y al menos un lfpido enlazado covalentemente al enlazante respectivo. Alternativamente, la molecula de acido nucleico modificada por lfpido comprende al menos una molecula de acido nucleico como se define aqm y al menos un lfpido unido covalentemente (bifuncional) (sin enlazante) a esa molecula de acido nucleico. De acuerdo con una tercera alternativa, la molecula de acido nucleico modificada por lfpido comprende una molecula de acido nucleico como se define aqm, al menos un enlazante unido covalentemente a esa molecula de acido nucleico y al menos un lfpido unido covalentemente al enlazante respectivo, y tambien al menos un lfpido (bifuncional) unido covalentemente (sin enlazante) a esa molecula de acido nucleico. Una modificacion de un acido nucleico tambien puede comprender la modificacion del contenido G/C de la region de codificacion de una molecula de acido nucleico, especialmente de al menos un ARN de la vacuna de ARN que codifica al menos un antfgeno en la combinacion vacuna/inhibidor de la invencion. En este contexto, es particularmente preferente que el contenido G/C de la region de codificacion de la molecula de acido nucleico aumente en comparacion con el contenido G/C de la region de codificacion de su secuencia de codificacion de tipo natural particular, esto es el ARN no modificado. La secuencia de aminoacidos codificada de la secuencia de acido nucleico no se modifica preferiblemente en comparacion con la secuencia de aminoacidos codificada del ARNm de tipo natural particular. La modificacion del contenido G/C de la molecula de acido nucleico, especialmente si la molecula de acido nucleico esta en forma de un ARNm o codifica para un ARNm, se basa en el hecho de que la secuencia de cualquier region de ARNm a ser transferida es importante para la traduccion eficiente de ese ARNm. Por tanto, la composicion y la secuencia de los diversos nucleotidos es importante. En particular, las secuencias que tienen un contenido de G (guanosina)/C(citosina) incrementado son mas estables que las secuencias que tienen un contenido de A (adenosina)/U (uracilo) incrementado. Por tanto, los codones de la secuencia de
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codificacion o del ARNm vanan as^ en comparacion con su secuencia de codificacion o ARNm de tipo natural, mientras que conserva la secuencia de aminoacidos traducida, de manera que incluye una cantidad incrementada de nucleotidos G/C. Con respecto al hecho de que diversos codones codifican para uno y el mismo aminoacido (llamado degeneracion del codigo genetico), pueden determinarse los codones mas favorables para la estabilidad (el llamado uso de codon alternativo). Preferiblemente, el contenido G/C de la region de codificacion de la molecula de acido nucleico, especialmente de al menos un ARN de la vacuna de ARN que codifica al menos un antigeno en la combinacion vacuna/inhibidor de la invencion, se incrementa en al menos un 7%, mas preferiblemente al menos un 15%, en particular al menos un 20%, en comparacion con el contenido G/C de la region codificada del ARNm tipo natural. De acuerdo con una realizacion espedfica, al menos el 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, mas preferiblemente al menos el 70%, aun mas preferiblemente al menos el 80% y mas preferiblemente al menos el 90%, 95% o aun 100% de los codones sustituibles en la region que codifica para una protema o peptido como se define aqrn o su fragmento, variante y/o derivado o la secuencia completa de la secuencia de ARNm tipo natural o secuencia de codificacion se sustituyen, incrementando asf el contenido G/C de tal secuencia. En este contexto, es particularmente preferible incrementar el contenido G/C de la molecula de acido nucleico, especialmente de al menos un ARN de la vacuna de ARN que codifica al menos un antigeno en la combinacion vacuna/inhibidor inventiva, al maximo (esto es 100% de los codones sustituibles), en particular en la region que codifica para una protema, en comparacion con la secuencia de tipo natural. Ademas una modificacion del acido nucleico, especialmente de al menos un ARN de la vacuna de ARN que codifica al menos un antfgeno en la combinacion vacuna/inhibidor inventiva se basa en el hallazgo de que la eficiencia de la traduccion tambien esta determinada por una frecuencia diferente en la ocurrencia de los ARNt en las celulas. La frecuencia en la ocurrencia de los ARNt en una celula, y por tanto el uso del codon en tal celula, depende de la especie de la celula de la que se deriva. En consecuencia, una celula de levadura generalmente exhibe un uso de codon diferente que una celula de mamffero, tal como una celula de humano. Por tanto, si los llamados “codones raros” estan presentes en la molecula de acido nucleico (con respecto al sistema de expresion respectivo), especialmente si el acido nucleico esta en forma de ARNm o codifica para un ARNm, en un grado creciente, la molecula de acido nucleico modificada correspondiente se traduce en un grado significativamente mas pobre que en el caso en que los codones que codifican para ARNt relativamente “frecuentes” estan presentes. Por tanto, la region de codificacion del acido nucleico modificado, particularmente al menos un ARN de la vacuna de ARN que codifica al menos un antfgeno en la combinacion vacuna/inhibidor inventiva, preferiblemente esta modificada en comparacion con la region correspondiente del ARNm tipo natural o en la secuencia de codificacion, de manera que al menos un codon de la secuencia de tipo natural que codifica para un ARNt que es relativamente raro en la celula se intercambia por un codon que codifica para un ARNt que es relativamente frecuente en la celula y lleva el mismo aminoacido que el ARNt relativamente raro. Por esta modificacion, las secuencias de la molecula de acido nucleico, particularmente de al menos un ARN de la vacuna de ARN que codifica al menos un antfgeno en la combinacion vacuna/inhibidor inventiva, se modifica de manera que se insertan los codones para los cuales los ARNt frecuentes estan disponibles. En otras palabras, por esta modificacion todos los codones de la secuencia de tipo natural que codifican para un ARNt que es relativamente raro en la celula pueden en cada caso intercambiarse por un codon que codifica para un ARNt que es relativamente frecuente en la celula y que, en cada caso, lleva el mismo aminoacido que el ARNt relativamente raro. Tal acido nucleico modificado preferiblemente se denomina aqrn “acido nucleico o ARN optimizado por codon”. Los ARNt que se producen con relativa frecuencia en la celula y que, en contraste, se producen relativamente de forma rara son conocidos por el experto en la tecnica; cf. por ejemplo Akashi, Curr. Opin. Genet. Dev. 2001, 11(6): 660-666. Es particularmente preferente que una secuencia de acido nucleico que codifica para una protema, en particular al menos un ARN que codifica para al menos un antfgeno comprendido en la vacuna de ARN usada en la presente invencion, sea un codon optimizado para el uso de un codon humano. Los codones que usan para el aminoacido particular del ARNt que aparece con mas frecuencia, por ejemplo el codon Gly, que utiliza el ARNt que se aparece con mas frecuentecia en las celulas (humana) son particularmente preferidos. En este contexto, es particularmente preferible unir el contenido incrementado de G/C secuencial, en particular maximizado en la molecula de acido nucleico modificado, en particularmente a al menos un ARN de la vacuna de ARN que codifica al menos un antfgeno en la combinacion vacuna/inhibidor inventiva, con los codones “frecuentes” sin modificar la secuencia de aminoacido de la protema codificada por la region de codificacion de la molecula de acido nucleico. Esta realizacion preferida permite el suministro de un acido nucleico traducido y estabilizado (modificado) de forma particularmente eficiente, en particular de al menos un ARN de la vacuna de ARN que codifica al menos un antfgeno en la combinacion vacuna/inhibidor inventiva.
Derivado de una molecula de acido nucleico: Un derivado de una molecula de acido nucleico se define aqrn de la misma manera que un acido nucleico modificado tal como se definio arriba.
Analogos de nucleotido: Los analogos de nucleotido son nucleotidos estructuralmente similares (analogos) a los nucleotidos que aparecen naturalmente y que incluyen modificaciones estructurales fosfato, modificaciones de azucar o modificaciones de la base de nucleotidos.
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Modificacion UTR: Una molecula de acido nucleico, especialmente si el acido nucleico esta en forma de una molecula de acido nucleico codificador, en particular el al menos un ARN de la vacuna de ARN que comprende al menos un marco de lectura abierto que codifica para al menos un antigeno de acuerdo con la invencion, preferiblemente tiene al menos una secuencia UTR 5' y/o 3' modificada (modificacion UTR). Estas secuencias incluidas en las regiones no traducidas 5' y/o 3' (UTR) pueden tener el efecto de incrementar la vida media del acido nucleico en el citosol o pueden incrementar la traduccion de la protema o el peptido codificados. Estas secuencias UTR pueden tener un 100% de identidad de secuencia con secuencias que aparecen naturalmente producidas por virus, bacterias y eucariotas, pero tambien pueden ser parcial o completamente sinteticas. Las secuencias no traducidas (UTR) del gen de (alfa-)globina, por ejemplo de Homo sapiens o Xenopus laevis, se pueden mencionar como ejemplos de secuencias de estabilizacion que se pueden usar para un acido nucleico estabilizado. Otro ejemplo de secuencia de estabilizacion tiene la formula general (C/U)CCANxCCC(U/A)PyxUC(C/U)CC, contenida en la 3'UTR del ARN muy estable que codifica para (alfa- )globina, colageno tipo (I), 15-lipoxigenasa o para tirosinahidroxilasa (cf. Holcik et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1997, 94: 2410 to 2414). Particularmente preferente en el contexto de la presente invencion es la UTR mutada de (alfa-)globina que comprende la siguiente secuencia GCCCGaTGGG CCTCCCAACG GGCCCTCCTC cCcTCCTtGc ACcG (SEQ ID NO. 1) (el nucleotido subrayado muestra la mutacion en comparacion con la secuencia natural), que tambien se denomina aqrn muag. Tales secuencias UTR introducidas por supuesto se pueden usar individualmente o en combinacion una con la otra y tambien en combinacion con otras modificaciones de secuencia conocidas por el experto en la tecnica.
Tallo-bucle de histona: En el contexto de la presente invencion, una secuencia tallo-bucle de histona se selecciona preferiblemente de al menos una de las siguientes formulas (I) o (II):
formula (I) (secuencia de tallo-bucle sin elementos frontera de tallo):
[N0-2GN3-5] [No-4(U/T)No-4] [N3-5CN0-2]
V__________________J
v
~v
Tallo 1
V-
Bucle
-J
Tallo 2
formula (II) (secuencia tallo-bucle con elementos frontera del tallo):
imagen1
V
Bucle
Y
Tallo2
V
Tallo1 Tallo1 Elemento frontera
o tallo2 N-i-r: es una secuencia consecutiva de 1 a 6, preferiblemente de 2 a 6,
Tallo2
Elemento frontera
donde:
elementos frontera del tallol mas preferiblemente de 2 a 5, aun mas preferiblemente de 3 a 5, mas preferiblemente de 4 a 5 o de 5 N, donde cada N se selecciona independientemente de un nucleotido seleccionado de entre A, U, T, G y C, o un analogo de nucleotido del mismo;
tallol rNn.2GN3.5l: es complementaria inversa o complementaria parcialmente inversa con el elemento tallo2 y es una secuencia consecutiva de entre 5 a 7 nucleotidos; donde N0-2 es una secuencia consecutiva de 0 a 2, preferiblemente de 0 a 1, mas preferiblemente de 1 N, donde cada N se selecciona independientemente de un nucleotido seleccionado de A, U, T, G y C o un analogo de nucleotido del mismo; donde N3-5 es una secuencia consecutiva de 3 a 5, preferiblemente de 4 a 5, mas preferiblemente de 4 N, donde cada N se selecciona independientemente de un nucleotido seleccionado de A, U, T, G y C o un analogo de nucleotido del mismo, y donde G es guanosina o un analogo del mismo, y se puede reemplazar opcionalmente por una citidina o un analogo de la misma, siempre que su citidina de nucleotido complementario en tallo2 se reemplace por guanosina;
secuencia bucle rNn-4^U/T)Nn-41: se ubica entre los elementos tallol y tallo2 y es una secuencia consecutiva de 3 a 5 nucleotidos, mas preferiblemente de 4 nucleotidos; donde cada N0-4 es independiente de otra secuencia consecutiva de 0 a 4, preferiblemente de 1 a 3, mas preferiblemente de 1 a 2 N, donde cada N se selecciona de un nucleotido seleccionado de A, U, T, G y C o un analogo de nucleotido del mismo; donde U/T representa uridina, u opcionalmente timidina;
tallo2 rN3-5CN0-2l: es complementaria inversa o complementaria parcialmente inversa al elemento tallol y es una secuencia consecutiva de 5 a 7 nucleotidos; donde N3-5 es una secuencia consecutiva de 3 a 5, preferiblemente de 4 a 5, mas preferiblemente de 4 N, donde cada N se selecciona independientemente de un nucleotido seleccionado de A, U, T, G y C o un analogo de nucleotido del mismo; siendo N0-2 una secuencia consecutiva de 0 a 2, preferiblemente de 0 a 1, mas preferiblemente de 1 N, donde cada N se selecciona independientemente de un nucleotido seleccionado de A, U, T, G o C o un analogo de nucleotido del mismo; y donde C es citidina o un analogo de la misma, y se puede reemplazar opcionalmente por una guanosina o un analogo de la misma siempre que su guanosina de nucleosido complementario en tallol se reemplace por
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citidina;
donde tallol y tallo2 son capaces de apareamiento de bases entre s^ formando una secuencia inversa complementaria, donde el apareamiento de bases puede ocurrir entre tallol y tallo2, por ejemplo por apareamiento de bases Watson-Crick de nucleotidos A y U/T o G y C o por apareamiento de bases no Watson- Crick, por ejemplo apareamiento de bases de tambaleo, apareamiento de bases Watson-Crick inverso, apareamiento de bases Hoogsteen, apareamiento de bases Hoogsteen inverso o son capaces de apareamiento de bases entre sf formando una secuencia complementaria parcialmente inversa, donde un apareamiento de bases incompleto puede ocurrir entre tallol y tallo2, en base a que una o mas bases en un tallo no tienen una base complementaria en la secuencia complementaria inversa del otro tallo.
Sintesis de acido nucleico: Las moleculas de acido nucleico usadas de acuerdo con la invencion como se definen aqu se pueden preparar usando cualquier metodo conocido en la tecnica, incluyendo metodos sinteticos como sintesis en fase solida, propagacion in vivo (por ejemplo propagacion in vivo viral), asf como metodos in vitro, tal como reacciones de transcripcion in vitro. Para preparar una molecula de acido nucleico, especialmente si el acido nucleico esta en forma de ARN o ARNm, una molecula de ADN correspondiente por ejemplo puede ser transcrita in vitro. Esta matriz de ADN preferiblemente comprende un promotor adecuado, por ejemplo un promotor T7 o SP6, para la transcripcion in vitro, que es seguido por la secuencia de nucleotido deseada que codifica para la molecula de acido nucleico, por ejemplo el ARNm a preparar y una senal de terminacion para la transcripcion in vitro. La molecula de ADN que forma la matriz de al menos un ARN de interes se puede preparar por proliferacion fermentativa y aislamiento posterior como parte de un plasmido que se puede replicar en bacterias. Plasmidos adecuados para la presente invencion son por ejemplo los plasmidos pT7Ts (numero de acceso del GenBank U26404; Lai et al., Development 1995, 121: 2349 to 2360), serie pGEM®, por ejemplo pGEM®-1 (numero de acceso de GenBank X65300; de Promega) y pSP64 (numero de acceso de GenBank X65327); cf. tambien Mezei and Storts, Purification of PCR Products, en: Griffin and Griffin (ed.), PCR Technology: Current Innovation, CRC Press, Boca Raton, FL, 2001.
ARN: El ARN es la abreviatura habitual para un acido ribonucleico. Es una molecula de acido nucleico, esto es un polfmero que consiste en nucleotidos. Estos nucleotidos son usualmente monomeros de adenosina- monofosfato, uridina-monofosfato, guanosina-monofosfato y citidina-monofosfato que se unen unos a otros a lo largo de un llamado esqueleto. El esqueleto se forma por enlaces fosfodiester entre el azucar, esto es ribosa, de un primer y una porcion fosfato de un segundo monomero adyacente. La sucesion espedfica de monomeros se denomina secuencia de ARN.
ARN mensajero (ARNm): En celulas eucariotas, la transcripcion se realiza tfpicamente dentro el nucleo o la mitocondria. La transcripcion in vivo de ADN usualmente resulta en el llamado ARN prematuro, que tiene que ser procesado en el llamado ARN mensajero, usualmente abreviado como ARNm. El procesamiento del ARN prematuro, por ejemplo en organismos eucariotas, comprende diversas modificaciones post-transcripcionales tal como empalme, 5'-proteccion, poliadenilacion, exportacion del nucleo o la mitocondria y similares. La suma de estos procesos tambien se llama maduracion de ARN. El ARN mensajero maduro usualmente proporciona la secuencia de nucleotidos que se puede transferir en una secuencia de aminoacidos de un peptido o protema particular. Tfpicamente, un ARNm maduro comprende una 5'-cap, una 5'UTR, un marco de lectura abierto, una 3'UTR y una secuencia poli(A). En el contexto de la presente invencion, un ARNm tambien puede ser una molecula artificial, esto es una molecula que no ocurre en la naturaleza. Esto significa que el ARNm en el contexto de la presente invencion puede, por ejemplo, comprender una combinacion de una 5'UTR, un marco de lectura abierto, 3'UTR y secuencia poli(A) que no ocurre en esta combinacion en la naturaleza.
Retrovirus: Un retrovirus es un virus de ARN que se duplica en una celula huesped usando la enzima transcriptasa inversa para producir un ADN de su genoma de ARN. El ADN se incorpora luego en el genoma del huesped mediante una enzima integrasa. El virus despues replica el ADN como parte de la celula huesped y luego experimenta los procesos de transcripcion y traduccion para expresar los genes llevados por el virus. Con frecuencia se emplean lentivirus para la terapia genica. Por razones de seguridad, los vectores lentivirales normalmente no llevan los genes requeridos para su replicacion. Para producir un lentivirus, se transfectan diversos plasmidos en una llamada lmea celular envase, comunmente HEK 293. Uno o mas plasmidos, generalmente denominados como plasmidos envase, codifican las protemas del virion, tal como la capside y la transcriptasa inversa. Otro plasmido contiene el material genetico a suministrarse por el vector. Se transcribe para producir el genoma viral de ARN monocatenario que se envasa en el virion, que se usa para la infeccion celular en la terapia o la vacunacion genetica.
Virion: Las partfculas de virus (conocidas como viriones) consisten en dos o tres partes: i) el material genetico (que comprende genes virales y genes heterologos sustituidos opcionales) ya sea de ADN o ARN; ii) una cubierta proteica que protege estos genes; y en algunos casos iii) una envolvente de lfpidos que rodea la cubierta proteica cuando estan fuera de una celula.
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ARN auto-replicante (Replicones): El ARN auto-replicante son vectores de suministro basados en alfavirus que se han desarrollado de virus Semliki Forest (SFV), virus Sindbis (SIN) y Virus de encefalitis equina venezolana (VEE). Los alfavirus son virus de ARN monocatenario donde los genes heterologos de interes pueden ser sustituidos con genes estructurales de alfavirus. Al proporcionar los genes estructurales in trans, el ARN replicon se envasa en partmulas de replicon (RP) que se pueden usar para la terapia o la vacunacion genetica (ver por ejemplo Vander Veen et al., 2012. Alphavirus replicon vaccines. Animal Health Research Reviews 13(l):1-9). Despues de la entrada en la celula huesped, el ARN viral genomico inicialmente sirve como ARNm para la traduccion de las protemas estructurales virales (nsPs) requeridas para iniciar la amplificacion del ARN viral. La replicacion del ARN ocurre via la smtesis de un intermedio de longitud completa de hebra negativa que se usa como la plantilla para la smtesis de los ARN de longitud completa adicionales y para la transcripcion de un ARN subgenomico de hebra positiva de un promotor interno. Tal ARN se puede luego considerar como ARN auto-replicante, ya que las protemas no estructurales responsables de la replicacion (y transcripcion de los genes heterologos) todavfa estan presentes en tal replicon. Tales vectores de alfavirus se denominan “replicones”.
Particula de replicon: Una partmula de replicon consiste de dos o tres partes: i) el material genetico (= el replicon) (que comprende genes virales y genes heterologos sustituidos opcionales) ya sea de ADN o de ARN; ii) una cubierta proteica que protege estos genes; y en algunos casos iii) una envolvente de lfpidos que rodea la cubierta proteica cuando estan fuera de una celula.
ARN aislado: El ARN aislado se define aqrn como un ARN que no es parte de una celula, una celula irradiada o un lisado celular. Un ARN aislado se puede producir por aislamiento y/o purificacion de celulas o lisados celulares, o de sistemas de transcripcion in vitro. El termino ARN aislado en el contexto de la presente invencion se define aqrn como un ARN que no es parte de las celulas, celulas irradiadas o lisados celulares que incluyen el ARN de la vacuna de ARN o que no es parte de celulas transfectadas con el ARN de la vacuna de ARN. En otras palabras, el termino “ARN aislado” excluye (ex vivo) celulas transfectadas o moduladas usadas como vacuna de ARN, en particular excluye celulas transfectadas ex vivo o moduladas inmunes, tal como celulas dendnticas (DC), por ejemplo DC transfectada/traducida con un ARN usado como vacuna de ARN. Ademas, el termino ARN aislado excluye ARN comprendido en celulas, celulas irradiadas o lisado celular que comprende naturalmente al menos un aRn que codifica para un antfgeno usado como vacuna de ARN. En consecuencia, la vacuna de ARN de la combinacion inventiva preferiblemente no comprende celulas moduladas o transfectadas, en particular celulas no transfectadas o moduladas inmunes (por ejemplo antfgeno presentador de celulas), mas particularmente celulas irradiadas, no transfectadas o moduladas DC o lisados celulares que comprenden naturalmente al menos un ARN de la vacuna de ARN. Con esta realizacion se hace evidente que la vacuna de ARN usada en la presente invencion preferiblemente no corresponde a una vacuna basada en celulas o una vacuna basada en DC, o, mas generalmente, preferiblemente no corresponde a una vacuna basada en celulas o, mas generalmente, la vacuna de ARN usada en la presente invencion preferiblemente esta libre de celulas y la combinacion inventiva a administrar proporciona la vacuna de ARN como ARN, mas preferiblemente como ARNm, opcionalmente en asociacion con un portador y/o componente adyuvante. El termino ARN aislado tambien incluye ARN complejado con componentes adicionales, por ejemplo peptidos, protemas, portadores etc., ARN envasado en partmulas, por ejemplo partmulas de replicon o partmulas virales (viriones) y ARN contenido en solucion, que ademas del ARN puede comprender componentes adicionales, por ejemplo una solucion tampon, reactivos de estabilizacion, inhibidores de ARNsa, etc.
Secuencia de una molecula de acido nucleico: La secuencia de una molecula de acido nucleico se entiende tfpicamente como el orden particular e individual, esto es la sucesion de sus nucleotidos.
Secuencia de una protema o peptido: La secuencia de una protema o peptido se entiende tfpicamente como el orden, esto es la sucesion de sus aminoacidos.
Identidad de secuencia: Dos o mas secuencias son identicas si tienen la misma longitud y orden de nucleotidos o aminoacidos. El porcentaje de identidad tfpicamente describe el grado en que dos secuencias son identicas, esto es tfpicamente describe el porcentaje de nucleotidos que corresponden en su posicion de secuencia con nucleotidos identicos de una secuencia de referencia. Para determinar el grado de identidad, las secuencias a comparar se consideran de la misma longitud, esto es la longitud de la secuencia mas larga de las secuencias a comparar. Esto significa que una primera secuencia que consiste en 8 nucleotidos es un 80% identica a una segunda secuencia que consiste en 10 nucleotidos que comprende la primera secuencia. En otras palabras, en el contexto de la presente invencion, la identidad de secuencia preferiblemente se refiere al porcentaje de nucleotidos de una secuencia que tiene la misma posicion en dos o mas secuencias de la misma longitud. Los espacios son usualmente considerados como posiciones no identicas, independientemente de su posicion actual en una alineacion.
Fragmento de una secuencia: Un fragmento de una secuencia es tfpicamente una parte mas corta de una
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secuencia de longitud completa de, por ejemplo, una secuencia de acido nucleico o de aminoacidos. En consecuencia, un fragmento de una secuencia tipicamente consiste en una secuencia que es identica al tramo o tramos correspondientes dentro de la secuencia de longitud completa. Un fragmento preferente de una secuencia en el contexto de la presente invencion consiste en un tramo continuo de entidades, como nucleotidos o aminoacidos, que corresponden a un tramo continuo de entidades en la molecula de la que se deriva el fragmento, lo que representa al menos el 5%, preferiblemente al menos el 20%, preferiblemente al menos el 30%, mas preferiblemente al menos el 40%, mas preferiblemente al menos el 50%, aun mas preferiblemente al menos el 60%, aun mas preferiblemente al menos el 70% y con total preferencia al menos el 80% de la molecula total (esto es longitud completa) de la cual se deriva el fragmento. Asf, por ejemplo, un fragmento de una protema o antigeno de peptido preferiblemente corresponde a un tramo continuo de entidades de la protema o del antfgeno de peptido del que se deriva el fragmento, lo que representa al menos el 5%, preferiblemente al menos el 20%, preferiblemente al menos el 30%, mas preferiblemente al menos el 40%, mas preferiblemente al menos el 50%, aun mas preferiblemente al menos el 60%, aun mas preferiblemente al menos el 70%, y con total preferencia al menos el 80% de la protema total (esto es longitud completa) o del antfgeno de peptido. Es particularmente preferente que el fragmento de una secuencia sea un fragmento funcional, esto es que el fragmento cumpla una o mas de las funciones realizadas por la secuencia de la que se deriva el fragmento. Por ejemplo, un fragmento de una protema o de antfgeno de peptido preferiblemente exhibe al menos una funcion antigenica (por ejemplo es capaz de provocar una reaccion inmune espedfica frente a al menos un antfgeno determinante en tal protema o antfgeno de peptido) de la protema o antfgeno de peptido de la que se deriva el fragmento.
Fragmentos de protemas: “Fragmentos” de protemas o peptidos, esto es, fragmentos de secuencias de aminoacidos, en el contexto de la presente invencion puede tfpicamente comprender una secuencia de una protema o peptido tal como se define aqrn que es, con respecto a su secuencia de aminoacidos (o su molecula de acido nucleico de codificacion), N-terminal, C-terminal y/o intrasecuencialmente truncada en comparacion con la secuencia de aminoacidos de la protema original (nativa) (o su molecula de acido nucleico codificada). Asf, tal truncamiento puede ocurrir ya sea en el nivel de aminoacidos o correspondientemente en el nivel de acido nucleico. Asf, una identidad de secuencia con respecto a tal fragmento como se define aqrn puede preferiblemente referirse a la protema completa o al peptido como se define aqrn o a la molecula de acido nucleico completa (codificacion) de tal protema o peptido. Igualmente, los “fragmentos” de las secuencias de acido nucleico en el contexto de la presente invencion pueden comprender una secuencia de un acido nucleico como se define aqrn que es, con respecto a su molecula de acido nucleico, 5'-, 3'- y/o intrasecuencialmente truncada en comparacion con la molecula de acido nucleico de la molecula de acido nucleico original (nativa). Una identidad de secuencia con respecto a tal fragmento como se define aqrn puede por tanto preferiblemente referirse al acido nucleico completo como se define aqrn.
Transfeccion: El termino 'transfeccion' se refiere a la introduccion de moleculas de acido nucleico, tal como moleculas de ADN o ARN (por ejemplo ARNm), en celulas, preferiblemente en celulas eucariotas. En el contexto de la presente invencion, el termino 'transfeccion' abarca cualquier metodo conocido por el experto para introducir moleculas de acido nucleico, preferiblemente moleculas de ARN, en las celulas, preferiblemente en celulas eucariotas, tal como en celulas de mamffero. Tales metodos abarcan, por ejemplo, electroporacion, lipofeccion, por ejemplo basado en lfpidos cationicos y/o liposomas, precipitacion de fosfato de calcio, transfeccion basada en nanopartmulas, transfeccion basada en virus o transfeccion basada en polfmeros cationicos, tal como DEAE-dextrano o polietilenimina etc.
Portador: Un portador en el contexto de la invencion tfpicamente puede ser un compuesto que facilita el transporte y/o la complejacion de otro compuesto (carga). Un portador se puede asociar a su carga por interaccion covalente o no covalente. Un portador puede transportar acidos nucleicos, por ejemplo ARN o aDn, a las celulas diana. El portador -para algunas realizaciones - puede ser un compuesto cationico o policationico
0 un portador polimerico como se define aqrn. Un portador, en el contexto de la presente invencion es preferiblemente adecuado como portador para moleculas de acido nucleico, por ejemplo para mediar la disolucion en lfquidos fisiologicamente aceptables, el transporte y la absorcion celular de las moleculas de acido nucleico o un vector. En consecuencia, un portador en el contexto de la presente invencion puede ser un componente que puede ser adecuado para almacenar y suministrar una molecula de acido nucleico o un vector. Tales portadores pueden ser, por ejemplo, portadores cationicos o policationicos o compuestos que pueden servir como agentes de transfeccion o de complejacion. Son particularmente preferentes en este contexto portadores o portadores polimericos como compuestos cationicos o policationicos.
Compuesto cationico o policationico/componente: El termino “compuesto cationico o policationico/componente” tipicamente se refiere a una molecula cargada que esta carga positivamente (cation) a un valor de pH tfpico de
1 a 9, preferiblemente a un pH de o por debajo de 9 (por ejemplo de 5 a 9), de o por debajo de 8 (por ejemplo de 5 a 8), de o por debajo de 7 (por ejemplo de 5 a 7), mas preferiblemente a pH fisiologico, por ejemplo de 7,3 a 7,4. En consecuencia, un compuesto cationico o policationico/componente puede ser cualquier compuesto
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cargado positivamente o poUmero, preferiblemente una protema o peptido cationico o policationico que se carga positivamente bajo condiciones fisiologicas, en particular bajo condiciones fisiologicas in vivo. Una ’protema o peptido cationico' puede contener al menos un aminoacido cargado positivamente o mas de un aminoacido cargado positivamente, por ejemplo seleccionado de Arg, His, Lys u Orn. En consecuencia, compuestos 'policationicos' tambien estan dentro del alcance que exhibe mas de una carga positiva bajo las condiciones dadas. En este contexto una protema o peptido cationico contiene un numero mayor de aminoacidos cationicos, por ejemplo un numero mayor de Arg, His, Lys u Orn, que aminoacidos negativamente cargados. En una realizacion preferente, una protema o peptido cationico en el contexto de la presente invencion contiene un numero mayor de aminoacidos cationicos, por ejemplo un numero mayor de Arg, His, Lys u Orn, que de otros residuos.
El termino “compuesto cationico o policationico” en el contexto de la presente invencion preferiblemente se refiere a compuestos que se pueden usar como agentes de transfeccion o de complejacion, particularmente de acidos nucleicos, usados de acuerdo a la invencion.
Los compuestos cationicos o policationicos segun la invencion, que son agentes particularmente preferidos en este contexto, incluyen protamina, nucleolina, espermina o espermidina, u otros peptidos o protemas cationicos, tal como poli-L-lisina (PLL), poli-arginina, polipeptidos basicos, peptidos penetradores de celulas (CPPs), incluyendo peptidos que enlazan el VIH, Tat VlH-1 (VIH), peptidos derivados de Tat, penetratina, peptidos analogos o derivados de VP22, VP22 HSV (Herpes simple), MAP, KALA o dominios de transduccion de protema (PTDs), PpT620, peptidos enriquecidos con prolina, peptidos enriquecidos con arginina, peptidos enriquecidos con lisina, peptido(s) MPG, Pep-1, L-oligomeros, peptido(s) de calcitonina, peptidos derivados Antennapedia (particularmente de Drosophila antennapedia), pAntp, pIsl, FGF, Lactoferrina, Transportan, Buforin-2, Bac715- 24, SynB, SynB(1), pVEC, peptidos derivados de hCT, SAP, o histonas. La protamina es particularmente preferente.
Adicionalmente, protemas cationicas o policationicas preferidas o peptidos usados como agentes de transfeccion o de complejacion se pueden seleccionar de las siguientes protemas o peptidos de la siguiente formula total (III):
(Arg)i;(Lys)m;(His)n;(Orn)o;(Xaa)x, (formula (III))
donde l + m + n + o + x = 8-15, y l, m, n u o, independientemente, puede ser cualquier numero seleccionado de 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15, siempre que el contenido global de Arg, Lys, His y Orn representa al menos 50% de todos los aminoacidos del oligopeptido; y Xaa puede ser cualquier aminoacido seleccionado de aminoacidos nativos (= que se presentan naturalmente) o no nativos excepto Arg, Lys, His u Orn; y x puede ser cualquier numero seleccionado de 0, 1, 2, 3 o 4, siempre que el contenido total de Xaa no exceda el 50% de todos los aminoacidos del oligopeptido. Son particularmente preferentes en este contexto por ejemplo los peptidos cationicos Arg7, Arga, Argg, H3R9, R9H3, H3R9H3, YSSRgSsY, (RKH)4, Y(RKH)2R, etc.
Otros compuestos cationicos o policationicos preferidos que se pueden usar como agentes de transfeccion o de complejacion pueden incluir polisacaridos cationicos, por ejemplo quitosano, polibreno, polfmeros cationicos, por ejemplo polietilenimina (PEI), lfpidos cationicos, por ejemplo DOTMA: cloruro de [1-(2,3- sioleiloxi)propil)]-N,N,N-trimetilamonio, DMRIE, di-C14-amidina, DOTIM, SAINT, DC-Chol, BGTC, cTaP, DOPC, DODAP, DOPE: Dioleil fosfatidiletanol amina, DOSPA, DODAB, DOIC, DMEPC, DOGS: Dioctadecilamidoglicilespermina, DIMRI: bromuro de dimiristo-oxipropil-dimetilhidroxietil-amonio, DOTAP: dioleoiloxi-3-(trimetilamonio)-propano, DC-6-14: cloruro de O,O-ditetradecanoil-N-(a-trimetilamonioacetil)- dietanolamina, CLIP1: cloruro de rac-[(2,3-dioctadeciloxipropil)(2-hidroxietil)]-dimetilamonio, CLIP6: rac-[2(2,3- dihexadeciloxipropil-oximetiloxi)etil]-trimetilamonio, CLIP9: rac-[2(2,3-dihexadeciloxipropil-oxisucciniloxi)etil]- trimetilamonio, oligofectamina, Lipofectamine® o polfmeros cationicos o policationicos, por ejemplo poliaminoacidos modificados, como p-aminoacido-polfmeros o poliamidas invertidas, etc., polietilenos modificados, tal como PVP (poli(bromuro de N-etil-4-vinilpiridinio)), etc., acrilatos modificados, como pDMAEMA (poli(dimetilaminoetil metilacrilato)), etc., amidoaminas modificadas tal como pAMAM (poli(amidoamina)), etc., polibetaaminoester modificado (PBAE), tal como diamina y polfmeros 1,4-butanodiol-diacrilato-co-5-amino-1- pentanol modificados, etc., dendnmeros, como dendnmeros de polipropilamina o dendnmeros basados en pAMAM, etc., poliimina(s), tal como PEI: poli(etilenimina), poli(propilenimina), etc., polialilamina, polfmeros basados en estructura de azucar, tal como polfmeros basados en ciclodextrina, polfmeros basados en dextrano, quitosano, etc., polfmeros basados en estructuras silano, tal como copolfmeros PMOXA-PDMS, etc., polfmeros en bloque que consisten en una combinacion de uno o mas bloques cationicos (por ejemplo seleccionados de un polfmero cationico como se menciono arriba) y de uno o mas bloques hidrofflicos o hidrofobicos (por ejemplo polietilenglicol); etc.
Portador polimerico: Un portador polimerico es tfpicamente un portador que esta forma por un polfmero. Un
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portador polimerico en el contexto de la presente invencion, usado como agente de transfeccion o de complejacion, puede ser un portador polimerico formado por componentes cationicos disulfuro-reticulados. Los componentes cationicos disulfuro-reticulados pueden ser los mismos o diferentes unos de otros. El portador polimerico tambien puede contener componentes adicionales. Es tambien particularmente preferido que el portador polimerico comprenda mezclas de peptidos cationicos, protemas o polfmeros y componentes opcionalmente adicionales como se definen aqrn, que estan reticulados por enlaces disulfuro como se describe aqrn.
En este contexto, los componentes cationicos, que forman bases para el portador polimerico reticulado de disulfuro, se seleccionan tfpicamente de cualquiera de peptidos cationicos o policationicos adecuados, protemas o polfmeros adecuados para este proposito, en particular cualquier peptido cationico o policationico, protema o polfmero capaz de complejar un acido nucleico como se define de acuerdo a la presente invencion, y asf preferiblemente condensar el acido nucleico. El peptido cationico o policationico, protema o polfmero, es preferiblemente una molecula lineal, sin embargo, tambien se pueden usar peptidos cationicos o policationicos ramificados, protemas o polfmeros.
Cada protema, peptido o polfmero cationicos o policationicos reticulados disulfuro del portador polimerico, que se pueden usar para complejar por ejemplo al menos un ARN de la vacuna de ARN que codifica al menos un antfgeno o un acido nucleico adyuvante en la combinacion vacuna/inhibidor inventiva, contiene al menos una porcion -SH, mas preferiblemente al menos un residuo cistema o cualquier grupo qrnmico adicional que tenga una porcion -SH, capaz de formar un enlace disulfuro sobre la condensacion con al menos una protema, peptido o polfmero cationicos o policationicos adicionales como componente cationico del portador polimerico como se menciona aqrn.
Como se definio arriba, el portador polimerico, que se puede usar para complejar por ejemplo al menos un ARN de la vacuna de ARN que codifica al menos un antigeno o un acido nucleico adyuvante en la combinacion vacuna/inhibidor inventiva, puede estar formado por componentes cationicos (o policationicos) reticulados con disulfuro.
De acuerdo a una primera alternativa, al menos un componente cationico (o policationico) del portador polimerico que se puede usar en este contexto se puede seleccionar de protemas o peptidos cationicos o policationicos. Tales protemas o peptidos cationicos o policationicos preferiblemente tienen una longitud de alrededor de 3 a 100 aminoacidos, preferiblemente una longitud de alrededor de 3 a 50 aminoacidos, mas preferiblemente una longitud de alrededor de 3 a 25 aminoacidos, por ejemplo una longitud de alrededor de 3 a 10, 5 a 15, 10 a 20 o 15 a 25 aminoacidos. Alternativa o adicionalmente, tales protemas o peptidos cationicos o policationicos pueden tener un peso molecular de alrededor de 0,01 kDa a alrededor de 100 kDa, incluyendo un peso molecular de alrededor de 0,5 kDa a alrededor de 100 kDa, preferiblemente de alrededor de 10 kDa a alrededor de 50 kDa, aun mas preferiblemente de alrededor de 10 kDa a alrededor de 30 kDa.
En el caso espedfico que el componente cationico del portador polimerico, que se puede usar para complejar por ejemplo al menos un ARN de la vacuna de ARN que codifica al menos un antfgeno o un acido nucleico de adyuvante en la combinacion vacuna/inhibidor inventiva, comprende una protema o peptido cationico o policationico, las propiedades cationicas de la protema o peptido cationico o policationico o del portador polimerico completo, si el portador polimerico se compone totalmente de protemas o peptidos cationicos o policationicos, se puede determinar en base a su contenido en aminoacidos cationicos. Preferiblemente, el contenido de aminoacidos cationicos en la protema o peptido cationico o policationico y/o el portador polimerico es al menos el 10%, 20% o 30%, preferiblemente al menos el 40%, mas preferiblemente al menos el 50%, 60% o 70%, pero tambien preferiblemente al menos el 80%, 90%, o aun el 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100%, mas preferiblemente al menos el 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100%, o puede estar en el intervalo de alrededor de 10% a 90%, mas preferiblemente en el intervalo de alrededor de 15% a 75%, aun mas preferiblemente en el intervalo de alrededor de 20% a 50%, por ejemplo 20, 30, 40 o 50%, o en un intervalo formado por cualquiera de dos de los valores antes mencionados, siempre que el contenido de todos los aminoacidos, por ejemplo aminoacidos cationicos, lipofflicos, hidrofflicos, aromaticos y adicionales, en la protema o peptido cationico o policationico, o en el portador polimerico completo, si el portador polimerico se compone totalmente de protemas o peptidos cationicos o policationicos, sea el 100%.
Preferiblemente, tales protemas o peptidos cationicos o policationicos del portador polimerico, que comprenden o adicionalmente se modifican para comprender al menos una porcion -SH, se seleccionan de, sin estar limitarse a, protemas o peptidos cationicos tales como protamina, nucleolina, espermina o espermidina, oligo- o poli-L-lisina (PLL), polipeptidos basicos, oligo- o poli-arginina, peptidos penetradores celulares (CPPs), CPP quimericos, tal como Transportan, o peptidos MPG, peptidos que enlazan VIH, Tat, VIH-1 Tat (VIH), peptidos derivados de Tat, miembros de la familia de penetratina, por ejemplo Penetratina, peptidos derivados de Antennapedia (particularmente de Drosophila antennapedia), pAntp, pIsl, etc., CPP derivados antimicrobianos por ejemplo Buforin-2, Bac715-24, SynB, SynB(1), pVEC, peptidos derivados de hCT, SAP, MAP, PpTG20,
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Loligomero, FGF, Lactoferrina, histonas, peptidos analogos o derivados de VP22, Pestivirus Erns, HSV, VP22 (Herpes simple), MAP, KALA o dominios de transduccion de protema (PTDs, PpT620, peptidos enriquecidos con prolina, peptidos enriquecidos con arginina, peptidos enriquecidos con lisina, Pep-1, L-oligomeros, peptido(s) de calcitonina, etc.
Alternativa o adicionalmente, tales protemas o peptidos cationicos o policationicos del portador polimerico, que comprenden o adicionalmente se modifican para comprender al menos una porcion -SH, se seleccionan de, sin limitarse a, los siguientes peptidos cationicos de la siguiente formula suma (IV):
{(Arg)i;(Lys)m;(His)n;(Orn)o;(Xaa)x}; formula (IV)
donde l + m + n +o + x = 3-100, y l, m, n u o, independientemente, es cualquier numero seleccionado de 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21-30, 31-40, 41-50, 51-60, 61-70, 71-80, 81-90 y 91-100 siempre que el contenido total de Arg (Arginina), Lys (Lisina), His (Histidina) y Orn (Ornitina) representa al menos 10% de todos los aminoacidos del oligopeptido; y Xaa es cualquier aminoacido seleccionado de aminoacidos nativos (= que se presentan naturalmente) o no nativos excepto Arg, Lys, His u Orn; y x es cualquier numero seleccionado de 0, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21-30, 31-40, 41-50, 51-60, 61-70, 71-80, 81-90, siempre que el contenido total de Xaa no exceda el 90% de todos los aminoacidos del oligopeptido. Cualquiera de los aminoacidos Arg, Lys, His, Orn y Xaa se puede situar en cualquier lugar del peptido. En este contexto, las protemas o peptidos cationicos en el intervalo de 730 aminoacidos son particularmente preferentes. Peptidos aun mas preferidos de esta formula son oligoargininas, por ejemplo Arg7, Arga, Argg, Arg-i2, HisaArgg, ArggHis3, His3ArggHis3, His6ArggHis6, His3Arg4His3,His6Arg4His6,TyrSer2-ArggSer2Tyr, (ArgLysHis)4, Tyr(ArgLysHis)2Arg, etc.
De acuerdo con una realizacion particularmente preferente adicional, la protema o peptido cationico o policationico del portador polimerico, cuando se define segun la formula {(Arg)l;(Lys)m;(His)n;(Orn)o;(Xaa)x} (formula (IV)) como se muestra arriba y que comprende o se modifica adicionalmente para comprender al menos una porcion -SH, puede seleccionarse, sin limitarse a, de la subformula (IVa):
{(Arg)i;(Lys)m;(His)n;(Orn)o;(Xaa')x (Cys)y} formula (IVa)
donde (Arg)l;(Lys)m;(His)n;(Orn)o; y x son como se definen aqrn, Xaa' es cualquier aminoacido seleccionado de aminoacidos nativos (que se presentan naturalmente) o no nativos excepto Arg, Lys, His, Orn o Cys e y es cualquier numero seleccionado de 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21-30, 31-40, 41-50, 51-60, 61-70, 71-80 y 81-90, siempre que el contenido total de Arg (Arginina), Lys (Lisina), His (Histidina) y Orn (Ornitina) representa al menos el 10% de todos los aminoacidos del oligopeptido.
Esta realizacion puede aplicarse a situaciones donde la protema o peptido cationico o policationico del portador polimerico, por ejemplo cuando se define de acuerdo a la formula empmca (Arg)l;(Lys)m;(His)n;(Orn)o;(Xaa)x (formula (IV)) como se muestra arriba, comprende o se ha modificado con al menos una cistema como porcion -SH en el significado anterior, de manera que el peptido cationico o policationico como componente cationico lleva al menos una cistema que es capaz de formar un enlace disulfuro con otros componentes del portador polimerico.
De acuerdo con otra realizacion particularmente preferida, la protema o peptido cationico o policationico del portador polimerico, cuando se define de acuerdo a la formula {(Arg)l;(Lys)m;(His)n;(Orn)o;(Xaa)x} (formula (IV)) como se muestra arriba, puede seleccionarse, sin limitarse a, la subformula (IVb):
Cys1 {(Arg)i;(Lys)m;(His)n;(Orn)o;(Xaa)x} Cys2 formula (IVb)
donde la formula empmca {(Arg)l;(Lys)m;(His)n;(Orn)o;(Xaa)x} (formula (IV)) es como se define en la presente y forma un nucleo de una secuencia de aminoacidos de acuerdo con la formula (IV) (semiempmca) y donde Cys1 y Cys2 son cistemas proximas a o terminales a (Arg)l;(Lys)m;(His)n;(Orn)o;(Xaa)x. Esta realizacion puede aplicarse a situaciones donde la protema o peptido cationico o policationico del portador polimerico, que se puede usar para complejar al menos un ARN de la vacuna de ARN que codifica al menos un antfgeno o un acido nucleico de adyuvante en la combinacion vacuna/inhibidor inventiva, por ejemplo cuando se define de acuerdo con la formula empmca (Arg)l;(Lys)m;(His)n;(Orn)o;(Xaa)x (formula (IV)) como se muestra arriba, se ha modificado con al menos dos cistemas como porciones-SH en el significado anterior, de manera que el peptido cationico o policationico del portador polimerico inventivo lleva al menos dos cistemas (terminales) que son capaces de formar un enlace disulfuro con otros componentes del portador polimerico.
De acuerdo a una segunda alternativa, al menos un componente cationico (o policationico) del portador
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polimerico se puede seleccionar de, por ejemplo, cualquier poKmero cationico o policationico (no peptidico) adecuado en este contexto, siempre que este polfmero cationico o policationico (no peptidico) tenga o se modifique para tener al menos una porcion -SH-, que dota de un enlace disulfuro al polfmero cationico o policationico con otro componente del portador polimerico como se define aqrn. Por tanto, tal como se define aqrn, el portador polimerico puede comprender los mismos o diferentes polfmeros cationicos o policationicos.
En el caso espedfico de que el componente cationico del portador polimerico comprenda un polfmero cationico o policationico (no peptidico), las propiedades cationicas del polfmero cationico o policationico (no peptfdico) se pueden determinar en base a su contenido de cargas cationicas cuando se compara con las cargas generales de los componentes del polfmero cationico. Preferiblemente, el contenido de cargas cationicas en el polfmero cationico a pH (fisiologico) como se define aqrn es de al menos 10%, 20%, o 30%, preferiblemente al menos 40%, mas preferiblemente al menos 50%, 60% o 70%, pero tambien preferiblemente al menos 80%, 90%, o aun 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100%, mas preferiblemente al menos 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100%, o puede estar en el intervalo de alrededor de 10% a 90%, mas preferiblemente en el intervalo de alrededor de 30% a 100%, aun mas preferiblemente en el intervalo de alrededor de 50% a 100%, por ejemplo 50, 60, 70, 80%, 90% o 100%, o en un intervalo formado por cualquiera de dos de los valores antes mencionados, siempre que el contenido de todas las cargas, por ejemplo cargas positivas y negativas, a pH (fisiologico) como se define aqrn en el polfmero cationico completo sea del 100%.
Preferiblemente, el componente cationico (no peptfdico) del portador polimerico representa un polfmero cationico o policationico, tipicamente con un peso molecular de alrededor de 0,1 o 0,5 kDa a alrededor de 100 kDa, preferiblemente de alrededor de 1 kDa a alrededor de 75 kDa, mas preferiblemente de alrededor de 5 kDa a alrededor de 50 kDa, aun mas preferiblemente de alrededor de 5 kDa a alrededor de 30 kDa, o un peso molecular de alrededor de 10 kDa a alrededor de 50 kDa, aun mas preferiblemente de alrededor de 10 kDa a alrededor de 30 kDa. Adicionalmente, el polfmero cationico o policationico (no peptfdico) tfpicamente tiene al menos una porcion -SH- que es capaz de formar un enlace disulfuro en base a la condensacion con cualquiera de los otros componentes cationicos u otros componentes del portador polimerico como se define aqrn.
En el contexto anterior, el componente cationico (no peptfdico) del portador polimerico, que se puede usar para complejar por ejemplo al menos un ARN de la vacuna de ARN que codifica al menos un antfgeno o un acido nucleico adyuvante en la combinacion vacuna/inhibidor inventiva, se puede seleccionar de acrilatos, acrilatos modificados, tal como pDMAEMA (poli(dimetilaminoetil metilacrilato)), quitosanos, aziridinas o 2-etil-2- oxazolina (formando oligo etileniminas o oligoetileniminas modificadas), polfmeros obtenidos por la reaccion de bisacrilatos con aminas formando oligo-beta-aminoesteres o poli-amido-aminas, u otros polfmeros como poliesteres, policarbonatos, etc. Cada molecula de estos polfmeros cationicos o policationicos (no peptfdicos) tipicamente exhibe al menos una porcion -SH-, donde al menos una porcion -SH- se puede introducir en el polfmero cationico o policationico (no peptfdico) por modificaciones qrnmicas, por ejemplo usando imonotiolano, acido 3-tiopropionico o introduciendo porciones -SH- contenidas en aminoacidos, tales como cistema o cualquier aminoacido adicional (modificado). Tales porciones-SH- son preferiblemente como ya se definio arriba.
De acuerdo con una realizacion particularmente preferente, el componente adicional que puede estar contenido en el portador polimerico, que se puede usar para modificar los diferentes peptidos cationicos o policationicos (cortos) o polfmeros (no peptfdicos) que forman bases para el portador polimerico o las propiedades bioffsicas/bioqmmicas del portador polimerico como se define aqrn, es un componente aminoacido (AA). De acuerdo con la presente invencion, el componente aminoacido (AA) comprende un numero de aminoacidos preferente en el intervalo de alrededor de 1 a 100, preferiblemente en el intervalo de alrededor de 1 a 50, mas preferiblemente seleccionado de un numero que comprende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15-20, o se puede seleccionar de un intervalo formado por cualquiera de dos de los valores antes mencionados. En este contexto los aminoacidos del componente aminoacido (AA) se pueden elegir independientemente uno del otro. Por ejemplo si en el portador polimerico dos o mas componentes (AA) estan presentes, pueden ser iguales o pueden ser diferentes.
El componente aminoacido (AA) puede contener o se puede flanquear (por ejemplo terminalmente) por una porcion que contiene -SH, que permite introducir este componente (AA) mediante un enlace disulfuro en el portador polimerico como se define aqrn. En el caso espedfico que la porcion que contiene -SH sea una cistema, el componente aminoacido (AA) tambien se puede leer como -Cys-(AA)-Cys-, donde Cys representa cistema y proporciona para la porcion -SH- necesaria un enlace disulfuro. La porcion que contiene -SH tambien se puede introducir en el componente aminoacido (AA) usando cualquiera de las modificaciones o reacciones como se indican arriba para el componente cationico o cualquiera de sus componentes.
Ademas, el componente aminoacido (AA) se puede proporcionar con dos porciones -SH- (o aun mas), por ejemplo en la forma representada por la formula HS-(Aa)-SH, para permitir el enlace a dos funcionalidades con enlaces disulfuro, por ejemplo si el componente aminoacido (AA) se usa como enlazante entre dos
componentes adicionales (por ejemplo entre dos poffmeros cationicos).
Alternativamente, el componente aminoacido (AA) se puede proporcionar con otras funcionalidades como ya se describio arriba para los otros componentes del portador polimerico, permitiendo el enlace del componente aminoacido (AA) a cualquiera de los componentes del portador polimerico.
5 Asf, de acuerdo con la presente invencion, el componente aminoacido (AA) del portador polimerico se puede enlazar a componentes adicionales del portador polimerico, los cuales se pueden usar para complejar por ejemplo al menos un ARN de la vacuna de ARN que codifica al menos un anffgeno o un acido nucleico de adyuvante en la vacuna/inhibidor inventivo con o sin usar un enlace disulfuro.
De acuerdo con una alternativa adicional y particularmente preferente, el componente aminoacido (AA) se 10 puede usar para modificar el portador polimerico, particularmente el contenido de componentes cationicos del portador polimerico como se definio arriba.
En el contexto de la presente invencion, el componente aminoacido (AA) se puede seleccionar de las siguientes alternativas: un componente aminoacido aromatico, un componente aminoacido hidrofflico (y preferiblemente sin carga polar), un componente aminoacido lipofflico o un componente aminoacido basico debil.
15 De acuerdo con una alternativa adicional, el componente aminoacido (AA) puede ser un peptido senal o una secuencia senal, una secuencia o senal de localizacion, una secuencia o senal de localizacion nuclear (NLS), un anticuerpo, un peptido de penetracion celular (por ejemplo TAT), etc. Adicionalmente, de acuerdo con otra alternativa, el componente aminoacido (AA) puede ser un peptido o protema funcional que puede modular la funcionalidad del portador polimerico en consecuencia. Tales peptidos o protemas funcionales como 20 componente aminoacido (AA) preferiblemente comprenden cualquiera de los peptidos o protemas como se definen aqrn, por ejemplo como se definen aqrn como anffgenos. De acuerdo con una alternativa, tales peptidos o protemas funcionales adicionales pueden comprender los denominados peptidos penetradores de la celula (CPPs) o peptidos cationicos de transporte.
De acuerdo con una ultima alternativa, el componente aminoacido (AA) puede consistir en o puede comprender 25 cualquier peptido o protema que pueda realizar cualquier funcion favorable en la celula. Particularmente preferentes son peptidos o protemas seleccionados de protemas o peptidos terapeuticamente activos, de anffgenos, por ejemplo anffgenos tumorales, anffgenos patogenicos (por ejemplo anffgenos de animales, anffgenos virales, anffgenos de protozoarios, anffgenos bacterianos), de anticuerpos, de protemas o peptidos inmunoestimuladores, de receptores de celulas T espedficos de anffgeno, o de cualquier otra protema o 30 peptido adecuado para una aplicacion espedfica (terapeutica). En particular, se prefieren epftopos de peptido de estos anffgeno(s) codificados por al menos un ARN de la vacuna de ARN que codifica al menos un anffgeno en la combinacion de vacuna/inhibidor inventiva.
El portador polimerico, que se puede usar para complejar por ejemplo al menos un ARN de la vacuna de ARN que codifica al menos un anffgeno o un acido nucleico de adyuvante en la combinacion de vacuna/inhibidor 35 inventiva puede comprender al menos uno de los peptidos cationicos o policationicos mencionados anteriormente, protemas o poffmeros o componentes adicionales, por ejemplo (Aa), donde cualquiera de las alternativas anteriores se pueden combinar juntas, y se pueden formar por polimerizacion en una reaccion de condensacion de polimerizacion via sus partes -SH-.
Ademas, el portador polimerico se puede seleccionar de una molecula portadora polimerica de acuerdo con la 40 formula generica (V):
L-P1-S-[S-P2-S]n-S-P3-L formula (V)
donde
P1 y P3 son diferentes o identicos y representan una cadena de poffmero hidrofflico lineal o ramificada, cada P1 y P3 tiene al menos una porcion -SH- capaz de formar un enlace disulfuro sobre la condensacion con el 45 componente P2, o alternativamente con (AA), (AA)x, o [(AA)x]z si tales componentes se usan como enlazante
entre P1 y P2 o P3 y P2 y/o con componentes adicionales (por ejemplo (AA), (AA)x, [(AA)x]z o L), la cadena de poffmero hidrofflico lineal o ramificada se seleccionada independientemente de polietilenglicol (PEG), poli-W- (2-hidroxipropil)metacrilamida, poli-2-(metacriloiloxi)etil-fosforilcolinas, poli(hidroxialquil-L-asparagina), poli(2- (metacriloiloxi)etil-fosforilcolina), hidroxietil-almidon o poli(hidroxialquil-L-glutamina), donde la cadena de 50 poffmero hidrofflico tiene un peso molecular de alrededor de 1 kDa a alrededor de 100 kDa, preferiblemente de
alrededor de 2 kDa a alrededor de 25 kDa; o mas preferiblemente de alrededor de 2 kDa a alrededor de 10 kDa, por ejemplo alrededor de 5 kDa a alrededor de 25 kDa o 5 kDa a alrededor de 10 kDa;
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P2 es una protema o peptido cationico o policationico, por ejemplo como se definio arriba para el portador polimerico formado por componentes cationicos disulfuro-reticulados, y preferiblemente de una longitud de alrededor de 3 a alrededor de 100 aminoacidos, mas preferiblemente una longitud de alrededor de 3 a alrededor de 50 aminoacidos, aun mas preferiblemente de una longitud de alrededor de 3 a alrededor de 25 aminoacidos, por ejemplo una longitud de alrededor de 3 a 10, 5 a 15, 10 a 20 o 15 a 25 aminoacidos, mas preferiblemente una longitud de alrededor de 5 a alrededor de 20 y aun mas preferiblemente una longitud de alrededor de 10 a alrededor de 20; o es un polfmero cationico o policationico, por ejemplo como se definio arriba para el portador polimerico formado por componentes cationicos disulfuro-reticulados, tfpicamente con un peso molecular de alrededor de 0,5 kDa a alrededor de 30 kDa, incluyendo un peso molecular de alrededor de 1 kDa a alrededor de 20 kDa, aun mas preferiblemente de alrededor de 1,5 kDa a alrededor de 10 kDa, o con un peso molecular de alrededor de 0,5 kDa a alrededor de 100 kDa, incluyendo un peso molecular de alrededor de 10 kDa a alrededor de 50 kDa, aun mas preferiblemente de alrededor de 10 kDa a alrededor de 30 kDa; teniendo cada P2 al menos dos porciones -SH-, capaces de formar un enlace disulfuro sobre la condensacion con componentes adicionales P2 o componente(s) P1 y/o P3 o alternativamente con componentes adicionales (por ejemplo (AA), (AA)x, o [(AA)x]z);
-S-S- es un enlace disulfuro (reversible) (los soportes se omiten para una mejor legibilidad), donde S preferiblemente representa azufre o una porcion que lleva -SH, que forma un enlace disulfuro (reversible). El enlace disulfuro (reversible) se forma preferiblemente por condensacion de porciones -SH- de cualquiera de los componentes P1 y P2, P2 y P2, o P2 y P3, u opcionalmente de componentes adicionales como se definen aqrn (por ejemplo L, (AA), (AA)x, [(AA)x]z, etc.); La porcion -SH- puede ser parte de la estructura de estos componentes o agregarse por una modificacion como se define abajo;
L es un ligando opcional, que puede estar o no presente, y se puede seleccionar independientemente de RGD, transferrina, folato, un peptido senal o secuencia senal, una secuencia o senal de localizacion, una secuencia o senal de localizacion nuclear (NLS), un anticuerpo, un peptido de penetracion celular, (por ejemplo TAT o KALA), un ligando de un receptor (por ejemplo citoquinas, hormonas, factores de crecimiento etc.), moleculas pequenas (por ejemplo carbohidratos como manosa o galactosa o ligandos sinteticos), agonistas de molecula pequena, inhibidores o antagonistas de receptores (por ejemplo analogos peptidomimeticos RGD), o cualquier protema adicional como se define aqrn, etc.;
n es un entero, tfpicamente seleccionado de un intervalo de alrededor de 1 a 50, preferiblemente de un intervalo de alrededor de 1, 2 o 3 a 30, mas preferiblemente de un intervalo de alrededor de 1, 2, 3, 4 o 5 a 25, o un intervalo de alrededor de 1,2, 3, 4 o 5 a 20, o un intervalo de alrededor de 1, 2, 3, 4 o 5 a 15, o un intervalo de alrededor de 1, 2, 3, 4 o 5 a 10, incluyendo por ejemplo un intervalo de alrededor de 4 a 9, 4 a 10, 3 a 20, 4 a 20, 5 a 20 o 10 a 20, o un intervalo de alrededor de 3 a 15, 4 a 15, 5 a 15 o 10 a 15, o un intervalo de alrededor de 6 a 11 o 7 a 10. Mas preferiblemente, n esta en el intervalo de alrededor de 1, 2, 3, 4 o 5 a 10, mas preferiblemente en el intervalo de alrededor de 1, 2, 3 o 4 a 9, en el intervalo de alrededor de 1, 2, 3 o 4 a 8, o en el intervalo de alrededor de 1,2 o 3 a 7.
Cada uno de los polfmeros hidrofflicos P1 y P3tipicamente tienen al menos una porcion -SH-, donde al menos una porcion -SH- es capaz de formar un enlace disulfuro por reaccion con el componente P2 o con componente el (AA) o (AA)x, si se usa como enlazante entre P1 y P2 o P3 y P2 como se define abajo y opcionalmente con un componente adicional, por ejemplo L y/o (AA) o (AA)x, por ejemplo si existen dos o mas porciones -SH-. Las siguientes subformulas “P1-S-S-P2” y “P2-S-S-P3” dentro de la formula generica (V) anterior (los soportes se omiten para una mejor legibilidad), donde cualquiera de S, P1 y P3 son como se definen aqrn, tfpicamente representan una situacion donde una porcion -SH- de los polfmeros hidrofflicos P1 y P3 se condensa con una porcion -SH- del componente P2 de la formula generica (V) anterior, formando ambos azufres de estas porciones -SH- un enlace disulfuro -S-S- como se define aqrn en la formula (V). Estas porciones -SH- son proporcionadas tfpicamente por cada uno de los polfmeros hidrofflicos P1 y P3, por ejemplo mediante una cistema interna o cualquier aminoacido adicional (modificado) o compuesto que tenga una porcion -SH. En consecuencia, las subformulas “P1-S-S-P2” y “P2-S-S-P3” tambien pueden ser escritas como “P1-Cys-Cys-P2” y “P2-Cys-Cys-P3”, si la porcion -SH- se proporciona por una cistema, en donde el termino Cys-Cys representa dos cistemas acopladas por un enlace disulfuro, no por un enlace peptfdico. En este caso, el termino “-S-S-“ en estas formulas tambien puede escribirse como “-S-Cys”, como “-Cys-S” o como “-Cys-Cys-”. En este contexto, el termino “-Cys-Cys-” no representa un enlace peptfdico sino un enlace de dos cistemas por sus porciones -SH- para formar un enlace disulfuro. En consecuencia, el termino “-Cys-Cys-” tambien se puede entender generalmente como “-(Cys-S)-(S-Cys)-”, donde en este caso espedfico S indica el azufre de la porcion -SH- de la cistema. Igualmente, los terminos “-S-Cys” y “-Cys-S” indican un enlace disulfuro entre una porcion que contiene -SH y una cistema, que tambien puede escrirse como “-S-(S-Cys)” y “-(Cys-S)-S”. Alternativamente, los polfmeros hidrofflicos P1 y P3 se pueden modificar con una porcion -SH, preferiblemente por una reaccion qrnmica con un compuesto que lleva una porcion -SH, de manera que cada uno de los polfmeros hidrofflicos P1 y P3 lleva al menos una de tales porciones -SH. Tal compuesto que lleva una porcion
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-SH puede ser por ejemplo una cistema (adicional) o cualquier aminoacido adicional (modificado) que tenga una porcion -SH. Tal compuesto tambien puede ser cualquier porcion o compuesto no amino que contiene o permite introducir una porcion -SH en los poffmeros hidrofflicos P1 y P3 como se definen aqm. Tales compuestos no amino se pueden enlazar a los poffmeros hidrofflicos P1 y P3 de formula (VI) del portador polimerico de acuerdo con la presente invencion por reacciones qmmicas o enlace de compuestos, por ejemplo por enlace de un acido 3-tiopropionico o tioimolano, por formacion de amida (por ejemplo acidos carbox^licos, acidos sulfuricos, aminas, etc.), por adicion Michael (por ejemplo porciones de maleinimida, carbonilos a,p- insaturados, etc.), por qmmica clic (por ejemplo azidas o alquinos), por metatesis de alqueno/alquino (por ejemplo alquenos o alquinos), formacion de imina o hidrozona (aldetffdos o cetonas, hidrazinas, hidroxilaminas, aminas), reacciones de formacion de complejo (avidina, biotina, protema G) o componentes que permiten reacciones de substitucion tipo Sn (por ejemplo haloalcanos, tioles, alcoholes, aminas, hidrazinas, hidrazidas, esteres de acido sulfonico, sales de oxifosfonio) u otras porciones qmmicas que se pueden utilizar en el enlace de componentes adicionales. Un derivado PEG particularmente preferido en este contexto es alfa-metoxi- omega-mercapto-poli(etilenglicol). En cada caso, la porcion SH, por ejemplo de una cistema o de cualquier aminoacido adicional (modificado) o compuesto, puede estar presente en los extremos terminales o internamente en cualquier posicion de los poffmeros hidrofflicos P1 y P3. Como se define aqm, cada uno de los poffmeros hidrofflicos P1 y P3 ffpicamente tiene al menos una porcion -SH- preferiblemente en un extremo terminal, pero tambien pueden contener dos o aun mas porciones -SH-, que se pueden usar para enlazar adicionalmente componentes adicionales como se definen aqm, preferiblemente peptidos o protemas funcionales adicionales, por ejemplo un ligando, un componente aminoacido (AA) o (AA)x, anticuerpos, peptidos penetradores de la celula o peptidos potenciadores (por ejemplo TAT, KALA), etc.
En el contexto de la formula (V) completa del portador polimerico inventivo se puede definir preferiblemente como sigue:
L-P1-S-[Cys-P2-Cys]n-S-P3-L formula (VI)
donde L, P1, P2, P3 y n son como se definen aqm, S es azufre y cada Cys proporciona una porcion -SH- para el enlace disulfuro.
El componente aminoacido (AA) o (AA)x en el portador polimerico de formula (V o VI), por ejemplo como se definio arriba para el portador polimerico formado por componentes cationicos disulfuro-reticulados, tambien puede ocurrir como un componente aminoacido repetitivo misto [(AA)x]z, donde el numero de componentes aminoacido (AA) o (AA)x se define ademas por el entero z. En este contexto, z se puede seleccionar de un intervalo de alrededor de 1 a 30, preferiblemente de un intervalo de alrededor de 1 a 15, mas preferiblemente 1 a 10 o 1 a 5 y aun mas preferiblemente seleccionado de un numero seleccionado de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15, o se puede seleccionar de un intervalo formado por cualquiera de dos de los valores antes mencionados.
De acuerdo con una alternativa espedfica y particularmente preferida, el componente aminoacido (AA) o (AA)x, preferiblemente escrito como S-(AA)x-S o [S-(AA)x-S] se puede usar para modificar el componente P2, particularmente el contenido del componente S-P2-S en el componente repetitivo [S-P2-S]n del portador polimerico de la formula (V) anterior. Esto se puede representar en el contexto del portador polimerico completo de acuerdo con la formula (VI) por ejemplo por la siguiente formula (Via):
L-P1-S-{[S-P2-S]a[S-(AA)x-S]b}-S-P3-L, formula (Via)
donde x, S, L, AA, P1, P2y P3son preferiblemente como se definen aqm. En la formula (Via) anterior, cualquiera de los componentes simples [S-P2-S] y [S-(AA)x-S] puede ocurrir en cualquier orden en la subformula {[S-P2- S]a[S-(AA)x-S]b}. El numero de componentes simples [S-P2-S] y [S-(AA)x-S] en la subformula {[S-P2-S]a[S-(AA)x- S]b} esta determinado por los enteros a y b, donde a + b = n. n es un entero y se define como antes para la formula (V).
De acuerdo con otra realizacion, el portador polimerico que se puede usar para complejar por ejemplo al menos un ARN de la vacuna de ARN que codifica al menos un anffgeno o un acido nucleico de adyuvante en la combinacion vacuna/inhibidor inventiva o componentes simples del mismo, por ejemplo los peptidos cationicos o policationicos mencionados anteriormente, protemas o poffmeros o componentes adicionales, por ejemplo (AA), se pueden ademas modificar con un ligando, preferiblemente un carbohidrato, mas preferiblemente un azucar, aun mas preferiblemente manosa.
De acuerdo con una realizacion espedfica, el portador polimerico completo se puede formar por condensacion de polimerizacion (de al menos uno) de los peptidos cationicos o policationicos mencionados anteriormente, protemas o poffmeros o componentes adicionales, por ejemplo (AA), a partir de sus porciones -SH- en una primera etapa, y formar complejos por ejemplo de al menos un ARN de la vacuna de ARN que codifica al menos
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un antigeno o un acido nucleico de adyuvante en la combinacion vacuna/inhibidor inventiva con tal portador polimerico en una segunda etapa. El portador polimerico puede entonces contener un numero de al menos uno o aun mas del mismo o de diferentes peptidos cationicos o policationicos definidos anteriormente, protemas o polfmeros o componentes adicionales, por ejemplo (AA), preferiblemente en el numero indicado por el intervalo anterior.
De acuerdo con una realizacion especifica alternativa, el portador polimerico que se puede usar para complejar por ejemplo al menos un ARN de la vacuna de ARN que codifica al menos un antigeno o un acido nucleico de adyuvante en la combinacion vacuna/inhibidor inventiva se forma por condensacion de polimerizacion de al menos uno de los peptidos cationicos o policationicos mencionados anteriormente, protemas o polfmeros o componentes adicionales, por ejemplo (AA), a partir de sus porciones -SH- simultaneamente para formar complejos por ejemplo con al menos un ARN de la vacuna de ARN que codifica al menos un antigeno o un acido nucleico de adyuvante en la combinacion vacuna/inhibidor inventiva al portador polimerico (preparado in situ). Igualmente, el portador polimerico tambien aqrn puede entonces contener un numero de al menos uno o aun mas del mismo o de diferentes peptidos cationicos o policationicos definidos anteriormente, protemas o polfmeros o componentes adicionales, por ejemplo (AA), en el numero preferiblemente determinado por el intervalo anterior.
Relacion N/P: La relacion N/P es una medida de la carga ionica del componente cationico (cadena lateral) del compuesto cationico o policationico o del portador polimerico usado como portador o agente de complejante como se define aqrn. En particular, si las propiedades cationicas del componente cationico son debidas a nitrogenos (por ejemplo de las cadenas laterales de aminoacidos), la relacion N/P expresa la relacion entre los atomos de nitrogeno basico y los residuos fosfato en la estructura del nucleotido, considerando que (cadena lateral) los atomos de nitrogeno del componente cationico del compuesto cationico o policationico o del portador polimerico contribuyen a las cargas positivas y el fosfato de la estructura fosfato de la carga de acido nucleico, por ejemplo al menos un ARN que codifica para al menos un antfgeno compuesto en la vacuna de ARN o un acido nucleico de adyuvante, contribuye a la carga negativa. Generalmente, un fosfato proporciona una carga negativa, por ejemplo un nucleotido en la molecula de acido nucleico de carga proporciona una carga negativa. Esto se puede calcular en base a que, por ejemplo, 1 |jg de ARN tipicamente contiene alrededor de 3 nmol de residuos fosfato, siempre que el aRn exhiba una distribucion estadfstica de bases. Adicionalmente, 1 nmol de peptido tipicamente contiene alrededor de x nmol de residuos de nitrogeno, dependiendo del peso molecular y del numero de sus aminoacidos (cationicos).
Potencial zeta: El “potencial zeta” es un parametro ampliamente usado para la carga electrica superficial de una partmula. Se determina tfpicamente moviendo la partfcula cargada en un campo electrico. En el contexto de la presente invencion, el potencial zeta es el parametro preferido para caracterizar la carga de una partfcula, por ejemplo de un complejo que comprende como portador o agente complejante un compuesto cationico o policationico y/o un portador polimerico y, como carga de acido nucleico, al menos un ARN que codifica para al menos un antfgeno de la vacuna de ARN o un acido nucleico de adyuvante. Por tanto, en el contexto de la presente invencion, la carga de una partfcula preferiblemente se determina calculando el potencial zeta por el metodo de electroforesis de Doppler laser usando un instrumento Zetasizer Nano (Malvern Instruments, Malvern, RU) a 25°C y un angulo de dispersion de 173°. La carga superficial de una partfcula determinada tambien depende de la fuerza ionica de la matriz utilizada (por ejemplo sal que contiene una solucion tampon) y del pH de la solucion. Por tanto, el potencial zeta real de un complejo determinado en una relacion de carga (N/P) puede variar ligeramente entre diferentes soluciones tampon usadas para la inyeccion. Para la medida, las partfculas, tal como complejos que comprenden como portador o agente de formacion de complejo un compuesto cationico o policationico y/o un portador polimerico y como carga de acido nucleico al menos un ARN que codifica para al menos un antfgeno de la vacuna de ARN o un acido nucleico de adyuvante de acuerdo a la invencion, se suspenden preferiblemente en una solucion de Lactato Ringer. En una realizacion espedfica, la presente invencion se refiere al uso de un complejo cargado negativamente bajo las condiciones de una solucion tampon de inyeccion determinada, preferiblemente una solucion de lactato Ringer, evaluada por su potencial zeta. Una solucion de lactato Ringer de acuerdo con la presente invencion preferiblemente contiene 130 mmol/l de iones sodio, 109 mmol/l de iones cloruro, 28 mmol/l de lactato, 4 mmol/l de iones potasio y 1,5 mmol/l de iones calcio. El sodio, cloruro, potasio y lactato tfpicamente provienen de NaCl (cloruro de sodio), NaCaHsOa (lactato de sodio), CaCl2 (cloruro de calcio) y KCl (cloruro de potasio). La osmolaridad de la solucion de lactato Ringer es 273 mOsm/l y el pH se ajusta a 6,5.
Composicion inmunoestimuladora: En el contexto de la invencion, una composicion inmunoestimuladora tfpicamente se puede entender como una composicion que contiene al menos un componente capaz de inducir una respuesta inmunitaria o partir de la cual es derivable un componente que es capaz de inducir una respuesta inmunitaria. Tal respuesta inmunitaria puede ser preferiblemente una respuesta inmunitaria innata o una combinacion de una respuesta inmunitaria innata y adaptativa. Preferiblemente, una composicion inmunoestimuladora en el contexto de la invencion contiene al menos una molecula de acido nucleico
inmunoestimulante/adyuvante, mas preferiblemente un ARN, por ejemplo una molecula de ARNm. El componente inmunoestimulador, tal como el ARNm puede ser formador de complejo con un portadoradecuado. Por tanto, la composicion inmunoestimuladora puede comprender un ARNm/portador-complejo. Ademas, la composicion inmunoestimuladora puede comprender un adyuvante y/o un veldculo adecuado para el 5 componente inmunoestimulador, tal como el ARNm.
Acido nucleico adyuvante: Un acido nucleico adyuvante, como se usa aqrn, se selecciona preferiblemente de acidos nucleicos conocidos por enlazarse a los receptores TLR. Tal acido nucleico adyuvante puede estar en forma de un acido nucleico CpG (inmunoestimulador), en particular CpG-ARN o CpG-ADN, que preferiblemente induce una respuesta inmunitaria innata. Un CpG-ARN o CpG-ADN usado de acuerdo a la invencion puede ser 10 un CpG-ADN de hebra simple (ss CpG-ADN), un CpG-ADN de hebra doble (dsADN), un CpG-ARN de hebra simple (ss CpG-ARN) o un CpG-ARN de hebra doble (ds CpG-ARN). El acido nucleico CpG usado de acuerdo a la invencion esta preferiblemente en forma de CpG-ARN, mas preferiblemente en forma de CpG-ARN de hebra simple (ss CpG-ARN). Tambien preferiblemente, tal acidos nucleicos CpG tienen una longitud como se describio anteriormente. Preferiblemente, los motivos CpG son no metilados. Ademas, un acido nucleico de 15 adyuvante, como se usa aqrn, puede ser un ARN inmunoestimulador (isARN), que preferiblemente provoca una respuesta inmunitaria innata.
Preferiblemente, un acido nucleico adyuvante, preferiblemente un ARN inmunoestimulador (isARN), como se usa aqrn, puede comprender cualquier secuencia de acido nucleico conocida para ser inmunoestimuladora, incluyendo, por ejemplo, secuencias de acido nucleico que representan y/o que codifican ligandos de TLRs, 20 preferiblemente seleccionados de miembros de la familia humana TLR1 - TLR10 o miembros de la familia murinaTLRI -TLR13, mas preferiblemente seleccionado de miembros de la familia TLR1 -TLR10 (humana), aun mas preferiblemente de TLR7 y TLR8, ligandos para receptores intracelulares para ARN (tal como RIG-I o MDA-5, etc.) (ver por ejemplo Meylan, E., Tschopp, J. (2006). Toll-like receptors and RNA helicases: two parallel ways to trigger antiviral responses. Mol. Cell 22, 561-569), o cualquier otra secuencia de ARN 25 inmunoestimuladora. Tal acido nucleico adyuvante puede comprender una longitud de 1.000 a 5.000, de 500 a 5.000, de 5 a 5.000, o de 5 a 1.000, 5 a 500, 5 a 250, de 5 a 100, de 5 a 50 o de 5 a 30 nucleotidos.
De acuerdo a una realizacion particularmente preferida, una secuencia de acido nucleico adyuvante, particularmente un isARN, como se usa aqrn, puede consistir en o comprender un acido nucleico de formula (VII) o (VIII):
30 GiXmGn, (formula (VII))
donde:
G es guanosina, uracilo o un analogo de guanosina o uracilo;
X es guanosina, uracilo, adenosina, timidina, citosina o un analogo de los nucleotidos mencionados anteriormente;
35 l es un entero de 1 a 40, donde cuando l = 1, G es guanosina o un analogo de la misma, cuando l > 1 al menos el 50% de los nucleotidos son guanosina o un analogo de la misma;
m es un entero y es al menos 3; donde cuando m = 3, X es uracilo o un analogo del mismo, cuando m > 3 estan presentes al menos 3 uracilos sucesivos o analogos de uracilo;
n es un entero de 1 a 40, donde cuando n = 1, G es guanosina o un analogo de la misma, cuando n > 1, al 40 menos el 50% de los nucleotidos son guanosina o un analogo de la misma.
CiXmCn, (formula (VIII))
donde:
C es citosina, uracilo o un analogo de citosina o uracilo;
X es guanosina, uracilo, adenosina, timidina, citosina o un analogo de los nucleotidos mencionados 45 anteriormente;
l es un entero e 1 a 40, donde cuando l = 1, C es citosina o un analogo de la misma, cuando l > 1, al menos el 50% de los nucleotidos son citosina o un analogo de la misma;
m es un entero y es al menos 3; donde cuando m = 3, X es uracilo o un analogo del mismo, cuando m > 3, existen al menos 3 uracilos sucesivos o analogos de uracilo;
50 n es un entero de 1 a 40, donde cuando n = 1, C es citosina o un analogo de la misma, cuando n > 1 al menos el 50% de los nucleotidos son citosina o un analogo de la misma.
Los acidos nucleicos de formulas (VII) o (VIII), que se pueden usar como una secuencia de acido nucleico adyuvante, particularmente un isARN, pueden ser moleculas de acido nucleico relativamente cortas, de una longitud tfpica de aproximadamente de 5 a 100 (pero tambien pueden ser mas largas a 100 nucleotidos para 55 realizaciones espedficas, por ejemplo hasta 200 nucleotidos), de 5 a 90 o de 5 a 80 nucleotidos, preferiblemente una longitud de aproximadamente 5 a 70, mas preferiblemente una longitud de aproximadamente 8 a 60 y mas preferiblemente una longitud de aproximadamente 15 a 60 nucleotidos, mas
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preferiblemente de 20 a 60, mas preferiblemente de 30 a 60 nucleotidos. Si el acido nucleico de formula (VII) o (VIII) tiene una longitud maxima de por ejemplo 100 nucleotidos, m tipicamente sera < 98. El numero de nucleotidos G en el acido nucleico de formula (I) esta determinado por l o n. l y n, independientemente uno de otro, son cada uno un entero de 1 a 40, donde cuando l o n = 1, G es guanosina o un analogo de la misma, y cuando l o n > 1, al menos el 50% de los nucleotidos son guanosina o un analogo de la misma. Por ejemplo, sin implicar ninguna limitacion, cuando l o n = 4, Gi o Gn puede ser, por ejemplo, GUGU, GGUU, UGUG, UUGg, GUuG, GGGU, GGUG, GUGG, UGGG o GGGG, etc.; cuando l o n = 5, Gi o Gn puede ser, por ejemplo, GGGUU, GGUGU, GUGGU, UGGGU, UGGUG, UGUGG, UUGGG, GUGUG, GGGGU, GGGUG, GGUGG, GUGGG, UGGGG, o GGGGG, etc.; etc. Un nucleotido adyacente a Xm en el acido nucleico de formula (VII) de acuerdo con la invencion preferiblemente no es uracilo. Similarmente, el numero de nucleotidos C en el acido nucleico de formula (VIII) de acuerdo con la invencion esta determinado por l o n. l y n, independientemente uno de otro, son cada uno un entero de 1 a 40, donde cuando l o n = 1, C es citosina o un analogo de la misma, y cuando l o n > 1, al menos el 50% de los nucleotidos son citosina o un analogo de la misma. Por ejemplo, sin implicar ninguna limitacion, cuando l o n = 4, Ci o Cn pueden ser, por ejemplo, CUCU, CCUU, UCUC, UUCC, CUUC, CCCU, CCUC, CUCC, UCCC o CCCC, etc.; cuando l o n = 5, Ci o Cn pueden ser, por ejemplo, CCCUU, CCUCU, CUCCU, UCCCU, UCCUC, UCUCC, UUCCC, CUCUC, CCCCU, CCCUC, CCUCC, CUCCC, UCCCC, o CCCCC, etc.; etc. Un nucleotido adyacente a Xm en el acido nucleico de formula (VIII) de acuerdo con la invencion preferiblemente no es uracilo. Preferiblemente, para la formula (VII), cuando l o n > 1, al menos el 60%, 70%, 80%, 90% o aun el 100% de los nucleotidos son guanosina o un analogo de la misma como se definio arriba. Los nucleotidos restantes hasta el 100% (cuando guanosina constituye menos del 100% de los nucleotidos) en las secuencias que flanquean G1 y/o Gn son uracilo o un analogo del mismo, como se definio anteriormente. Tambien preferiblemente, l y n, independientemente uno de otro, son cada uno un entero de 2 a 30, mas preferiblemente un entero de 2 a 20 y aun mas preferiblemente un entero de 2 a 15. El Ifmite inferior de I o n puede variar si es necesario y es al menos 1, preferiblemente al menos 2, mas preferiblemente al menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10. Esta definicion se aplica correspondientemente a la formula (VIII).
De acuerdo con una realizacion particularmente preferida adicional, una secuencia de acido nucleico adyuvante, particularmente un isARN, como se usa aqrn, puede consistir en o comprender un acido nucleico de formula (IX) o (X):
(NuGiXmGnNv)a, (formula (IX))
donde:
G es guanosina (guanina), uridina (uracilo) o un analogo de guanosina (guanina) o uridina (uracilo), preferiblemente guanosina (guanina) o un analogo de la misma;
X es guanosina (guanina), uridina (uracilo), adenosina (adenina), timidina (timina), citidina (citosina), o un analogo de estos nucleotidos (nucleosidos), preferiblemente uridina (uracilo) o un analogo del mismo;
N es una secuencia de acido nucleico con una longitud de alrededor de 4 a 50, preferiblemente de alrededor de 4 a 40, mas preferiblemente de alrededor de 4 a 30 o 4 a 20 acido nucleicos, seleccionandose cada N independientemente de guanosina (guanina), uridina (uracilo), adenosina (adenina), timidina (timina), citidina (citosina) o un analogo de estos nucleotidos (nucleosidos);
a es un entero de 1 a 20, preferiblemente de 1a 15, mas preferiblemente de 1 a 10;
I es un entero de 1 a 40, donde cuando I = 1, G es guanosina (guanina) o un analogo de la misma, cuando I > 1, al menos el 50% de estos nucleotidos (nucleosidos) son guanosina (guanina) o un analogo de la misma; m es un entero y es al menos 3; donde cuando m = 3, X es uridina (uracilo) o un analogo de la misma, y cuando m > 3, estan presentes al menos 3 uridinas sucesivas (uracilos) o analogos de uridina (uracilo); n es un entero de 1 a 40, donde cuando n = 1, G es guanosina (guanina) o un analogo de la misma, cuando n
> 1, al menos el 50% de estos nucleotidos (nucleosidos) son guanosina (guanina) o un analogo de la misma; u, v pueden ser independientemente uno del otro un entero de 0 a 50, preferiblemente donde cuando u = 0, v
> 1, o cuando v = 0, u > 1;
teniendo la molecula de acido nucleico de formula (IX) una longitud de al menos 50 nucleotidos, preferiblemente de al menos 100 nucleotidos, mas preferiblemente de al menos 150 nucleotidos, aun mas preferiblemente de al menos 200 nucleotidos y mas preferiblemente de al menos 250 nucleotidos.
(NuCiXmCnNv)a (formula (X))
donde:
C es citidina (citosina), uridina (uracilo) o un analogo de citidina (citosina) o uridina (uracilo), preferiblemente citidina (citosina) o un analogo de la misma;
X es guanosina (guanina), uridina (uracilo), adenosina (adenina), timidina (timina), citidina (citosina) o un analogo de los nucleotidos mencionados anteriormente (nucleosidos), preferiblemente uridina (uracilo) o un analogo de la misma;
N es cada una secuencia de acido nucleico que, independiente una de otra, tiene una longitud de alrededor de 4 a 50, preferiblemente de alrededor de 4 a 40, mas preferiblemente de alrededor de 4 a 30 o 4 a 20 acido
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nucleicos, seleccionandose cada N independientemente de guanosina (guanina), uridina (uracilo), adenosina (adenina), timidina (timina), citidina (citosina) o un analogo de estos nucleotidos (nucleosidos); a es un entero de 1 a 20, preferiblemente de 1 a 15, mas preferiblemente de 1 a 10;
l es un entero de 1 a 40, donde cuando l = 1, C es citidina (citosina) o un analogo de la misma, cuando l > 1, al menos el 50% de estos nucleotidos (nucleosidos) son citidina (citosina) o un analogo de la misma; m es un entero y es al menos 3; donde cuando m = 3, X es uridina (uracilo) o un analogo de la misma, cuando m > 3, estan presentes al menos 3 uridinas sucesivas (uracilos) o analogos de uridina (uracilo); n es un entero de 1 a 40, donde cuando n = 1, C es citidina (citosina) o un analogo de la misma, cuando n > 1, al menos el 50% de estos nucleotidos (nucleosidos) son citidina (citosina) o un analogo de la misma. u, v pueden ser independientemente uno del otro un entero de 0 a 50, preferiblemente donde cuando u = 0, v > 1, o cuando v = 0, u > 1;
donde la molecula de acido nucleico de formula (X) de acuerdo con la invencion tiene una longitud de al menos 50 nucleotidos, preferiblemente de al menos 100 nucleotidos, mas preferiblemente de al menos 150 nucleotidos, aun mas preferiblemente de al menos 200 nucleotidos y mas preferiblemente de al menos 250 nucleotidos.
Cualquiera de las definiciones dadas anteriormente en las formulas (VII) y (VIII), por ejemplo para los elementos N (esto es Nu y Nv) y X (Xm), particularmente la estructura de nucleo como se definio arriba, asf como para los enteros a, l, m, n, u y v, similarmente aplica a los elementos de la formula (IX) y (X) correspondientemente. La definicion de elementos limftrofes Nu y Nv en la formula (X) es identica a las definiciones dadas anteriormente para Nu y Nv en la formula (IX).
ARN inmunoestimulador: Un ARN inmunoestimulador (isARN) en el contexto de la invencion tfpicamente puede ser un ARN que es capaz de inducir una respuesta inmunitaria innata. Este usualmente no tiene un marco de lectura abierto y, por tanto, no proporciona un peptido-antfgeno o inmunogeno, pero provoca una respuesta inmunitaria innata, por ejemplo por enlace a una clase espedfica de receptor tipo Toll (TLR) u otros receptores adecuados. Sin embargo, por supuesto tambien los ARNm que tienen un marco de lectura abierto y que codifican para un peptido/protema puede inducir una respuesta inmunitaria innata y, por tanto, pueden ser ARN inmunoestimuladores. Preferiblemente, el ARN inmunoestimulador puede ser un ARN de hebra simple, uno de hebra doble o uno parcialmente de hebra doble, mas preferiblemente un ARN de hebra simple, y/o un ARN circular o lineal, mas preferiblemente un ARN lineal. Mas preferiblemente, el ARN inmunoestimulador puede ser un ARN (lineal) de hebra simple. Aun mas preferiblemente, el ARN inmunoestimulador puede ser un ARN sin codificacion (largo) (lineal) (de hebra simple). En este contexto es particularmente preferido que el isARN lleve un trifosfato en su extremo 5'- que es el caso para ARN transcrito in vitro. Un ARN inmunoestimulador tambien puede ocurrir como un oligonucleotido de ARN corto como se define aquf Un ARN inmunoestimulador como se usa aqrn ademas se puede seleccionar de cualquier clase de moleculas de ARN, encontradas en la naturaleza o que se preparan sinteticamente, y que pueden inducir una respuesta inmunitaria innata y pueden soportar una respuesta inmunitaria adaptiva inducida por antfgeno. Ademas, (clases de) moleculas de ARN inmunoestimulador, usadas como un compuesto adicional de la combinacion de vacuna/inhibidor inventiva, puede incluir cualquier otro ARN capaz de provocar una respuesta inmunitaria innata. Por ejemplo, tal ARN inmunoestimulador puede incluir ARN ribosomal (ARNt), ARN transferente (ARNt), ARN mensajero (ARNm) y ARN viral (ARNv). Tal ARN inmunoestimulador puede comprender una longitud de 1.000 a 5.000, de 500 a 5.000, de 5 a 5.000, o de 5 a 1.000, 5 a 500, 5 a 250, de 5 a 100, de 5 a 50 o de 5 a 30 nucleotidos.
siARN: Un pequeno ARN de interferencia (siARN) es de interes particularmente en conexion con el fenomeno de Interferencia de ARN. La tecnica in vitro de interferencia de ARN (ARNi) se basa en moleculas de ARN de hebra doble (dsARN), que provoca la supresion espedfica de secuencia de la expresion genica (Zamore (2001) Nat. Struct. Biol. 9: 746-750; Sharp (2001) Genes Dev. 5:485-490: Hannon (2002) Nature 41: 244-251). En la transfeccion de celulas de marnfferos con dsARN largo, la activacion de la protema-quinasa R y RNAsa-L produce unos efectos no espedficos, por ejemplo una respuesta de interferon (Stark et al. (1998) Annu. Rev. Biochem. 67: 227-264; He and Katze (2002) Viral Immunol. 15: 95-119). Estos efectos no espedficos se evitan cuando sew usa el llamado siARN mas corto, por ejemplo 21- hasta 23-mer, (ARN de interferencia pequeno), debido a que los efectos no espedficos no se desencadenan por un siARN que es mas corto de 30 pb (Elbashir et al. (2001) Nature 411: 494-498).
En el contexto de la presente descripcion, los siARN (no reivindicados) dirigidos contra PD-1, PD-L1 o PD-L2 por tanto pueden ser ARN de hebra doble (dsARNs) que tienen una longitud de 17 a 29, preferiblemente de 19 a 25 y preferiblemente es al menos en un 90%, mas preferiblemente 95% y especialmente 100% (de los nucleotidos de un dsARN) complementario a una seccion de la secuencia de ARNm que se presenta naturalmente que codifica para PD-1, PD-L1 o PD-L2 tanto en una seccion codificante o como no codificante, preferiblemente una seccion codificante. Tal seccion de la secuencia de ARNm que se presenta naturalmente se puede denominar aqrn “secuencia diana” y puede ser cualquier seccion de ARNm que se presenta
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naturalmente que codifica para PD-1, PD-L1 o PD-L2. 90% complementary significa que, con una longitud del dsARN aqrn descrito de, por ejemplo, 20 nucleotidos, el dsARN contiene no mas de 2 nucleotidos que no muestrSin embargo, la secuencia del siARN de hebra doble usada de acuerdo con la invencion es preferiblemente totalmente complementaria en su estructura general con una seccion de la secuencia diana. En este contexto, la molecula de acido nucleico del complejo puede ser un dsARN que tiene la estructura general 5'-(Ni7-29)-3', preferiblemente que tiene la estructura general 5'-(Nig-25)-3', mas preferiblemente que tiene la estructura general 5'-(Nig-24)-3', o aun mas preferiblemente que tiene la estructura general 5'-(N2i-23)-3', donde, para cada estructura general, cada N es un nucleotido (preferiblemente diferente) de una seccion de la secuencia diana, preferiblemente seleccionado de un numero continuo de 17 a 29 nucleotidos de una seccion de la secuencia diana, y que esta presente en la estructura general 5'-(Ni7-2g)-3' en su orden natural. En principio, todas las secciones con una longitud de i7 a 29, preferiblemente de i9 a 25, pares de bases que ocurren en la secuencia diana pueden servir para preparar un dsARN como se define aqrn. Igualmente, los dsARN usados como siARN pueden tambien dirigirse contra secuencias de ARNm que no se encuentran en la region de codificacion, en particular en la region no codificadora 5' de la secuencia diana, por ejemplo, asf, contra regiones no codificadoras de la secuencia diana que tienen una funcion reguladora. La secuencia diana del dsARN usada como siARN puede, por tanto, caer en la region traducida y no traducida de la secuencia diana y/o en la region de los elementos de control de la secuencia de ARNm. La secuencia diana para un dsARN usada como siARN dirigida contra PD-i, PD-Li o PD-L2 puede tambien caer en la region de solape de la secuencia no traducida y traducida; en particular, la secuencia diana puede comprender al menos un nucleotido aguas arriba del triplete de inicio de la region de codificacion de la secuencia de ARNm.
Marco de lectura abierto: Un marco de lectura abierto (ORF) en el contexto de la invencion tipicamente puede ser una secuencia de diversos tripletes de nucleotidos que se pueden traducir en un peptido o protema. Un marco de lectura abierto preferiblemente contiene un codon de inicio, esto es una combinacion de tres nucleotidos subsiguientes que codifican usualmente para el aminoacido metionina (ATG o AUG), en su extremo 5'- y una region posterior que usualmente tiene una longitud multiplo de 3 nucleotidos. Un ORF preferiblemente esta terminado por un codon de parada (por ejemplo, TAA, TAG, TGA). Tfpicamente, este es unicamente codon de parada del marco de lectura abierto. Por tanto, un marco de lectura abierto en el contexto de la presente invencion es preferiblemente una secuencia de nucleotidos que consiste en un numero de nucleotidos que se pueden dividir entre tres, que inician con un codon de inicio (por ejemplo ATG o AUG) y que preferiblemente terminan con un codon de parada (por ejemplo, TAA, TGA, o TAG o UAA, UAG, UGA, respectivamente). El marco de lectura abierto se puede aislar o se puede incorporar en una secuencia de acido nucleico mas larga, por ejemplo en un vector o un ARNm. Un marco de lectura abierto tambien se puede denominar “region de codificacion de protema” o “region de codificacion”.
Secuencia IRES (sitio de entrada ribosomal interno): Una IRES puede funcionar como un sitio de enlace de ribosoma unico, pero tambien puede servir para proporcionar un ARN bi- o multi-cistronico como se define aqrn, que codifica para diversas protemas o peptidos, que son traducidos por los ribosomas independientemente uno de otro. Ejemplos de secuencias IRES que se pueden usar de acuerdo con la invencion son aquellas de picornavirus (por ejemplo FMDV), pestivirus (CFFv), poliovirus (PV), virus de la encefalomiocarditis (ECMV), virus de enfermedad de pies y boca (FMDV), virus de hepatitis C (HCV), virus de la fiebre porcina clasica (CSFV), virus de leucoma de raton (MLV), virus de inmunodeficiencia de simio (SIV) o virus de paralisis de grillo (CrPV).
Fragmento o parte de un antigeno (protema/peptido): Se entiende como fragmentos o partes de un antigeno (protema/peptido) en el contexto de la presente invencion tipicamente peptidos que corresponden a una parte continua de la secuencia de aminoacidos de un antigeno (protema/peptido), preferiblemente con una longitud de alrededor de 6 a alrededor de 20 o aun mas aminoacidos, por ejemplo partes tal como se procesan y son presentadas por moleculas de clase I MHC, preferiblemente con una longitud de alrededor de 8 a alrededor de i0 aminoacidos, por ejemplo 8, 9, o i0, (o aun ii, o i2 aminoacidos), o fragmentos como se procesan y presentan por moleculas de clase II MHC, preferiblemente con una longitud de alrededor de i3 o mas aminoacidos, por ejemplo i3, i4, i5, i6, i7, i8, i9, 20 o aun mas aminoacidos, donde estos fragmentos se pueden seleccionar de cualquier parte de la secuencia de aminoacidos. Estos fragmentos son reconocidos tipicamente por las celulas T en forma de un complejo que consiste en el fragmento peptidico y una molecula MHC, esto es los fragmentos tipicamente no son reconocidos en su forma nativa. Los fragmentos o partes de los antigenos (protema/peptido) como se definen aqrn tambien pueden comprender epftopos o sitios funcionales de estos antigenos (protema/peptido). Preferiblemente, los fragmentos o partes de un antigeno (protema/peptido) en el contexto de la invencion son o comprenden epftopos, o no tienen caractensticas antigenicas, que provocan una respuesta inmunitaria adaptiva. Por tanto, los fragmentos de antigenos (protema/peptido) pueden comprender al menos un epftopo de estos antigenos (protema/peptido). Ademas, tambien los dominios de un antigeno (protema/peptido), como el dominio extracelular, el dominio intracelular o el dominio de transmembrana y versiones acortadas o truncadas de un antigeno (protema/peptido) se puede considerar que comprenden un fragmento de un antigeno (protema/peptido).
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Variantes de protemas: Se pueden generar “variantes” de protemas o peptidos como se definen en el contexto de la presente invencion con una secuencia de aminoacidos que difiere de la secuencia inicial en una o mas mutaciones, tal como uno o mas aminoacidos sustituidos, insertados y/o eliminados. Preferiblemente, estas variantes tienen la misma funcion biologica o actividad espedfica en comparacion con la protema nativa de longitud completa, por ejemplo su propiedad antigenica espedfica. “Variantes” de protemas o peptidos como se definen en el contexto de la presente invencion pueden comprender sustituciones de aminoacidos conservativas en comparacion con su secuencia, nativa, esto es fisiologica no mutada. Estas secuencias de aminoacidos, asf como sus secuencias de nucleotidos de codificacion, en particular caen bajo el termino variantes como se define aqrn. Las sustituciones donde los aminoacidos, que se originan de la misma clase, se intercambian unos por otros se llaman sustituciones conservativas. En particular, son aminoacidos que tienen cadenas laterales alifaticas, cadenas laterales cargadas positiva o negativamente, grupos aromaticos en las cadenas laterales o aminoacidos, las cadenas laterales de las cuales pueden participar en puentes de hidrogeno, por ejemplo cadenas laterales con una funcion hidroxilo. Esto significa que, por ejemplo un aminoacido que tiene una cadena lateral polar, se reemplaza por otro aminoacido que tiene una cadena lateral tambien polar, o, por ejemplo, un aminoacido caracterizado por una cadena lateral hidrofobica se sustituye por otro que tiene una cadena lateral tambien hidrofobica (por ejemplo serina (treonina) por treonina (serina) o leucina (isoleucina) por isoleucina (leucina)). Son posibles las inserciones y sustituciones, en particular, en aquellas posiciones de secuencia que no causan una modificacion de la estructura tridimensional o no afectan a la region de enlace. Las modificaciones de una estructura tri-dimensional por inserciones o eliminaciones se puede determinar facilmente por ejemplo usando espectros CD (espectros de dicrofsmo circular) (Urry, 1985, Absorption, Circular Dichroism and ORD of Polypeptides, in: Modern Physical Methods in Biochemistry, Neuberger et al. (ed.), Elsevier, Amsterdam).
Ademas, las variantes de protemas o peptidos como se definen aqrn, que se pueden codificar por una molecula de acido nucleico, tambien pueden comprender aquellas secuencias donde los nucleotidos del acido nucleico se intercambian de acuerdo con la degeneracion del codigo genetico, sin conllevar a una alteracion de la respectiva secuencia de aminoacidos de la protema o peptido, esto es la secuencia de aminoacidos o al menos parte de la misma no puede diferir de la secuencia inicial en una o mas mutaciones dentro del significado anterior.
Con objeto de determinar el porcentaje en que dos secuencias son identicas, por ejemplo secuencias de acido nucleico o secuencias de aminoacidos como se definen aqrn, preferiblemente las secuencias de aminoacidos codificadas por una secuencia de acido nucleico del portador polimerico como se define aqrn o las secuencias de aminoacidos por sf mismas, se pueden alinear con objeto de posteriormente compararse con otras. Por lo tanto, por ejemplo una posicion de una primera secuencia se puede comparar con la posicion correspondiente de una segunda secuencia. Si una posicion en la primera secuencia esta ocupada por el mismo componente (residuo) que en una posicion de la segunda secuencia, las dos secuencias son identicas en esta posicion. Si este no es el caso, las secuencias difieren en esta posicion. Si las inserciones ocurren en la segunda secuencia en comparacion con la primera secuencia, se pueden insertar espaciadores en la primera secuencia para permitir una alineacion adicional. Si las eliminaciones ocurren en la segunda secuencia en comparacion con la primera secuencia, los espaciadores se pueden insertar en la segunda secuencia para permitir una alineacion adicional. El porcentaje en que dos secuencias son identicas es entonces funcion del numero de posiciones identicas dividido entre el numero total de posiciones, incluyendo aquellas posiciones unicamente ocupadas en una secuencia. El porcentaje en que dos secuencias son identicas se puede determinar usando un algoritmo matematico. Un ejemplo preferente de algoritmo matematico que se puede usar, pero sin limitacion, es el algoritmo de Karlin et al. (1993), PNAS USA, 90:5873-5877 o Altschul et al. (1997), Nucleic Acids Res., 25:33893402. Tal algoritmo se integra en el programa BLAST. Las secuencias que son identicas a las secuencias de la presente invencion hasta cierto punto se pueden identificar con este programa. Una “variante” de una protema o peptido puede tener al menos un 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99% de identidad de aminoacido en un tramo de 10, 20, 30, 50, 75 o 100 aminoacidos de tal protema o peptido, preferiblemente en la secuencia de longitud completa de la que se deriva esa variante. Analogamente, una “variante” de una secuencia de acido nucleico puede tener al menos un 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99% de identidad de nucleotido en un tramo de 10, 20, 30, 50, 75 o 100 nucleotidos de tal secuencia de acido nucleico, preferiblemente en la secuencia de longitud completa de la que se deriva la variante.
Derivado de una protema o peptido: Un derivado de un peptido o protema se entiende tfpicamente como una molecula que se deriva de otra molecula, tal como tal peptido o protema. Un “derivado” de un peptido o protema tambien abarca fusiones que comprenden un peptido o protema usado en la presente invencion. Por ejemplo, la fusion comprende una etiqueta, por ejemplo un epftopo, por ejemplo un epftopo FLAG o un epftopo V5. Por ejemplo, el epftopo es un epftopo FLAG. Tal etiqueta es util para, por ejemplo, purificar la protema de fusion.
Cantidad farmaceuticamente efectiva: Una cantidad farmaceuticamente efectiva en el contexto de la invencion se entiende tfpicamente como una cantidad que es suficiente para inducir un efecto farmaceutico, tal como una
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respuesta inmunitaria, que altera un nivel patologico de un peptido o protema expresado, o sustituye un producto carente de gen, por ejemplo, en el caso de una situacion patologica.
Vehiculo: Un vehmulo se entiende tipicamente como un material adecuado para almacenar, transportar y/o administrar un compuesto, tal como un compuesto farmaceuticamente activo. Por ejemplo, puede ser un lfquido fisiologicamente aceptable adecuado para almacenar, transportar y/o administrar un compuesto farmaceuticamente activo.
Ruta PD-1: Los miembros de la ruta PD-1 son todos protemas que estan asociadas a la senalizacion de PD-1. Por un lado, podnan ser protemas que inducen la senalizacion PD-1 aguas arriba de PD-1, por ejemplo los ligandos de PD-1 PD-L1 y PD-L2 y el receptor de transduccion de senal PD-1. Por otro lado, podnan ser protemas de transduccion de senal aguas abajo del receptor PD-1. Miembros de la ruta PD-1 son por ejemplo PD-1, PD-L1 y PD-L2.
Inhibidor de la ruta PD-1: De acuerdo con la presente invencion tal como se define en sus reivindicaciones adjuntas, el inhibidor de la ruta PD-1 comprendido en la combinacion vacuna/inhibidor es un anticuerpo antagonista dirigido contra PD-1. Tambien se describen aqrn realizaciones no reivindicadas donde un inhibidor de la ruta PD-1 preferentemente se define como un compuesto capaz de danar la senalizacion de la ruta PD- 1, preferiblemente la senalizacion mediada por el receptor PD-1. Ademas, se describe aqrn que el inhibidor de la ruta PD-1 puede ser cualquier inhibidor dirigido contra cualquier miembro de la ruta PD-1 capaz de antagonizar la senalizacion de la ruta PD-1. Segun una realizacion no reivindicada, el inhibidor puede ser un anticuerpo antagonista como se define aqrn, cuya diana es cualquier miembro de la ruta PD-1, preferiblemente dirigido contra el receptor PD-1, PD-L1 o PD-L2. Este anticuerpo antagonista tambien puede estar codificado por un acido nucleico (no reivindicado). Tales anticuerpos codificados tambien se llaman “intracuerpos” como se definen aqrn. Tambien, el inhibidor de la ruta PD-1 puede ser un fragmento del receptor PD-1 o el receptor PD1 que bloquea la actividad de ligandos PD1 (no reivindicado). B7-1 o fragmentos del mismo pueden actuar como ligandos que inhiben PD1 tambien. Ademas, el inhibidor de la ruta PD-1 puede ser un siARN (pequeno ARN de interferencia) o ARN antisentido dirigido contra un miembro de la ruta PD-1, preferiblemente PD-1, PD- L1 o PD-L2 (no reivindicado). Adicionalmente, un inhibidor de la ruta PD-1 puede ser una protema que comprende (o un acido nucleico que codifica para) una secuencia de aminoacidos capaz de enlazar a PD-1 pero de prevenir la senalizacion PD-1, por ejemplo inhibiendo la interaccion con PD-1 y B7-H1 o B7-DL (no reivindicado). Adicionalmente, un inhibidor de la ruta PD-1 puede ser un inhibidor de molecula pequena capaz de inhibir la senalizacion de la ruta PD-1, por ejemplo un peptido de enlace PD-1 o una molecula organica pequena (no reivindicado).
Anticuerpo: Un anticuerpo se puede seleccionar de cualquier anticuerpo, por ejemplo cualquiera de los anticuerpos producidos de forma recombinante o que se presentan naturalmente, conocidos en la tecnica, de anticuerpos particulares adecuados para propositos terapeuticos, diagnosticos o cientfficos, particularmente dirigido contra PD-1, PD-L1 o PD-L2. Aqrn, el termino “anticuerpo” se usa en su sentido mas amplio y espedficamente abarca anticuerpos monoclonales y policlonales (que incluyen, antagonista, y anticuerpos de bloqueo o neutralizantes) y especies de anticuerpos con especificidad poliepitopica. De acuerdo con la invencion, “anticuerpo” tfpicamente comprende cualquier anticuerpo conocido en la tecnica (por ejemplo anticuerpos IgM, IgD, IgG, IgA e IgE), tales como anticuerpos que se presentan naturalmente, anticuerpos generados por inmunizacion en un organismo huesped, anticuerpos que se aislaron e identificaron de anticuerpos que se presentan naturalmente o anticuerpos generados por inmunizacion en un organismo huesped y producido de forma recombinante por metodos biomoleculares conocidos en la tecnica, asf como anticuerpos quimericos, anticuerpos humanos, anticuerpos humanizados, anticuerpos biespedficos, intracuerpos, esto es anticuerpos expresados en celulas y opcionalmente ubicados en compartimientos celulares espedficos, y fragmentos y variantes de los anticuerpos mencionados anteriormente. En general, un anticuerpo consiste en una cadena ligera y una cadena pesada, ambas con dominios variables y constantes. La cadena ligera consiste en un dominio variable N-terminal, VL, y un dominio constante C-terminal, CL. En contraste, la cadena pesada del anticuerpo IgG, por ejemplo, se compone de un dominio variable N-terminal, VH, y tres dominios constantes, CH1, CH2 y CH3. Los anticuerpos de cadena simple tambien se pueden usar de acuerdo con la presente invencion.
Los anticuerpos preferiblemente pueden comprender anticuerpos de longitud completa, esto es anticuerpos compuestos de las cadenas pesada completa y ligera completa, como se describio anteriormente. Sin embargo, derivados de anticuerpos tales como fragmentos de anticuerpo, variantes o aductos, tambien se pueden usar como inhibidores de la ruta PD-1 de acuerdo con la invencion. Los fragmentos de anticuerpos se pueden seleccionar de Fab, Fab', F(ab')2, Fc, Facb, pFc', Fd y fragmentos Fv de los anticuerpos antes mencionados (longitud completa). En general, los fragmentos de anticuerpo se conocen en la tecnica. Por ejemplo, un fragmento Fab (“fragmento, enlace de antfgeno”) se compone de un dominio constante y uno variable de cada una de las cadenas pesada y ligera. Los dos dominios variables enlazan el epftopo en antfgenos espedficos.
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Las dos cadenas se conectan por un enlace disulfuro. Un fragmento scFv (“fragmento variable de cadena simple”), por ejemplo, tipicamente consiste en los dominios variables de las cadenas ligera y pesada. Los dominios se unen por un enlace artificial, en general por un polipeptido tal como un peptido compuesto de 1525 residuos de glicina, prolina y/o serina.
Anticuerpo policlonal: “Aanticuerpo policlonal” tipicamente significa mezclas de anticuerpos dirigidos a antfgenos espedficos o inmunogenos o epftopos de una protema generados por inmunizacion de un organismo huesped, tal como un mamfero, por ejemplo incluyendo cabra, ganado, cerdos, perros, gatos, burro, mono, simio, roedores como un, hamster y conejo. Los anticuerpos policlonales generalmente no son identicos y, por tanto, usualmente reconocen diferentes epftopos o regiones del mismo antigeno. Asf, en tal caso, se emplea tfpicamente una mezcla (una composicion) de diferentes anticuerpos, dirigiendose cada anticuerpo a antfgenos espedficos o inmunogenos o epftopos de una protema, en particularmente dirigidos a PD-1, PD-L1 o PD-L2.
Anticuerpos monoclonales: El termino “anticuerpos monoclonales” la presente tfpicamente se refiere aqrn a un anticuerpo obtenido de una poblacion de anticuerpos esencialmente homogeneos, esto es, los anticuerpos individuales que comprenden la poblacion son identicos excepto para mutaciones que se presentan naturalmente, que pueden aparecer en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son altamente espedficos, que se dirigen a un sitio antigenico simple. Ademas, en contraste con las preparaciones de anticuerpo convencionales (policlonal) que tfpicamente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos a diferentes determinantes (epftopos), cada anticuerpo monoclonal se dirige a un determinante simple en el antigeno. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales como se definen arriba se pueden obtener por el metodo de hibridoma descrito primero por Kohler and Milstein, Nature, 256:495 (1975), o por metodos de ADN recombinante, por ejemplo como se describe en la Patente US 4.816.567. Los “anticuerpos monoclonales” tambien pueden aislarse de colecciones de fago generadas usando las tecnicas descritas en McCafferty et al., Nature, 348:552554 (1990), por ejemplo. De acuerdo a Kohler and Milstein, un inmunogeno (antfgeno) de interes se inyecta en un huesped, tal como un raton, y los linfocitos de celulas B producidos en respuesta al inmunogeno se cosechan despues de un tiempo. Las celulas B se combinan con celulas de mieloma obtenidas de raton e introducidas en un medio que permite a las celulas B fusionarse con las celulas de mieloma, produciendo hibridomas. Estas celulas fusionadas (hibridomas) se colocan luego en pocilos separados de placas de microtitulacion y crecen para producir anticuerpos monoclonales. Los anticuerpos monoclonales se ensayan para determinar cuales son adecuados para detectar el antfgeno de interes. Despues de seleccionarse, los anticuerpos monoclonales se pueden cultivar en cultivos celulares o inyectando los hibridomas en ratones. En el contexto de la presente invencion, son particularmente preferidos anticuerpos monoclonales dirigidos contra PD-1, PD-L1 y PD-L2.
Anticuerpos quimericos: Los anticuerpos quimericos, que se pueden usar como inhibidores de la ruta PD-1 de acuerdo con la invencion son preferiblemente anticuerpos donde los dominios constantes de un anticuerpo descrito arriba se reemplazan por secuencias de anticuerpos de otros organismos, preferiblemente secuencias humanas.
Anticuerpos humanizados: Los anticuerpos humanizados (no humanos), que se pueden usar como inhibidores de la ruta PD-1 de acuerdo con la invencion son anticuerpos donde los dominios constante y variable (excepto para los dominios hipervariables) de un anticuerpo se reemplazan por secuencias humanas.
Anticuerpos humanos: Los anticuerpos humanos se pueden aislar de tejidos humanos o de organismos huesped no humanos inmunizados que son transgen para la ubicacion del gen IgG humano. Adicionalmente, los anticuerpos humanos se pueden proporcionar por el uso de una visualizacion de fago.
Anticuerpos biespedficos: Los anticuerpos biespedficos en el contexto de la invencion son preferiblemente anticuerpos que actuan como un adaptador entre un efector y una diana respectiva por dos diferentes dominios Fa/b, por ejemplo con el proposito de reclutar moleculas efectoras como toxinas, farmacos, citoquinas etc., que dirigen celulas efectoras, como celulas CTL, NK, macrofagos, granulocitos, etc. (ver para revision: Kontermann R.E., Acta Pharmacol. Sin, 2005, 26(1): 1-9). Los anticuerpos biespedficos como se describen aqrn en general estan configurados para ser reconocidos por dos diferentes dominios Fa/b, por ejemplo dos diferentes antfgenos, inmunogenos, epftopos, farmacos, celulas (o receptores en celulas), u otras moleculas (o estructuras) como se describio anteriormente. Biespecificidad significa aqrn que las regiones de enlace de antfgeno de los anticuerpos son espedficas para dos diferentes epftopos. Por tanto, diferentes antfgenos, inmunogenos o epftopos, etc. pueden ser llevados juntos, lo que, opcionalmente, permite una interaccion directa de los dos componentes. Por ejemplo, diferentes celulas, como celulas efectoras y celulas diana, se pueden conectar mediante un anticuerpo biespedfico. Abarcado, pero no limitado, por la presente invencion son anticuerpos o fragmentos del mismo que enlazan, por una parte, un antfgeno soluble y, por otro lado, un antfgeno o receptor, por ejemplo PD-1 o sus ligandos PD-L1 y PD-L2, en la superficie de una celula, por ejemplo una celula tumoral.
Intracuerpos: Los intracuerpos pueden ser anticuerpos como se definen arriba. Estos anticuerpos son
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anticuerpos expresados intracelulares y, por tanto, estos anticuerpos pueden ser codificados por acidos nucleicos a emplearse para la expresion de los anticuerpos codificados. Segun una realizacion no reivindicada, los acidos nucleicos que codifican para un anticuerpo, preferiblemente como se definio arriba, en particular un anticuerpo dirigido contra un miembro de la ruta PD-1, por ejemplo PD-1, PD-L1 o PD-L2, se pueden usar como inhibidor de la ruta PD-1 de acuerdo con la presente invencion.
De acuerdo con un primer aspecto, el objeto que subyace en la presente invencion se resuelve mediante una combinacion vacuna/inhibidor que comprende:
(i) como vacuna, una vacuna de ARN que comprende al menos un ARN, donde el al menos un ARN es un ARNm que comprende al menos un marco de lectura abierto (ORF) que codifica para al menos un antigeno, y
(ii) como inhibidor, una composicion que comprende al menos un inhibidor de la ruta PD-1, donde el inhibidor de la ruta PD-1 es un anticuerpo antagonista que esta dirigido contra PD-1.
En el contexto de la presente invencion, el termino “combinacion vacuna/inhibidor” preferiblemente significa una ocurrencia combinada de una vacuna de ARN que comprende al menos un ARN que comprende al menos un marco de lectura abierto (ORF) que codifica para al menos un antigeno y de una composicion que comprende al menos un inhibidor de la ruta PD-1 tal como se define en las reivindicaciones. Por tanto, esta combinacion vacuna/inhibidor puede ocurrir ya sea como una composicion, que comprende todos estos componentes en una y la misma mezcla (por ejemplo en una composicion farmaceutica), o puede ocurrir como un kit de partes donde los diferentes componentes forman diferentes partes de tal kit de partes. Esta combinacion vacuna/inhibidor inventiva preferiblemente permite provocar una respuesta inmunitaria adaptiva (y opcionalmente una respuesta inmunitaria innata) en un paciente a tratar, preferiblemente un mairnfero, empleando como un primer componente una vacuna de ARN que comprende al menos un ARN que comprende al menos un marco de lectura abierto que codifica al menos un antigeno, preferiblemente que codifica un antigeno tumoral o un antigeno patogenico. Este inhibidor de la combinacion vacuna/inhibidor inventiva que es un inhibidor de la ruta PD-1 puede antagonizar la senalizacion de la ruta PD-1 preferiblemente inhibiendo o suprimiendo la transduccion de senal mediada por el receptor PD-1. Por tanto, la administracion de la vacuna y el inhibidor puede ocurrir ya sea simultaneamente o escalonada en el tiempo, ya sea en el mismo sitio de administracion o en diferentes sitios de administracion, como se resume mas adelante. Tal combinacion vacuna/inhibidor puede inducir una respuesta inmunitaria activa y asf previene por ejemplo el crecimiento tumoral o induce la regresion tumoral. La combinacion vacuna/inhibidor inventiva es por tanto adecuada para estimular efectivamente la respuesta inmunitaria espedfica de antfgenos contra cancer y celulas infectadas con patogeno. Mas precisamente, la combinacion vacuna/inhibidor de la invencion es particularmente adecuada para el tratamiento de enfermedades tumorales y enfermedades infecciosas que se pueden asociar a una sobreexpresion de PD-1, PD-L1 o PD-L2 y para mejorar ademas la respuesta inmunitaria contra tales celulas tumorales e infectadas.
Por tanto, la invencion se basa en el sorprendente hallazgo de que la combinacion de una vacuna de ARN y un inhibidor de la ruta PD-1 muestra una inhibicion del crecimiento tumoral extremadamente ventajosa, resultando en una supervivencia mejorada que no se podna esperar de la tecnica previa. Asf, el tratamiento combinado con una vacuna de ARN, por ejemplo que codifica para un antfgeno espedfico (vacunacion activa) tal como un antfgeno tumoral, y con un inhibidor dirigido a un miembro de la ruta PD-1, particularmente el receptor PD-1 o sus ligandos PD-L1 y PD-L2, podnan disminuir fuertemente el impacto perjudicial de una enfermedad a tratar, por ejemplo la velocidad de crecimiento de un tumor. En este contexto, los inventores sorprendentemente encontraron que el tratamiento con una vacuna de ARN que comprende un ARN que codifica para un antfgeno tumoral en combinacion con un inhibidor de la ruta PD-1 como se define en las reivindicaciones inesperadamente inhibe el crecimiento del tumor, resultando en una supervivencia mejorada de ratones enfrentados al tumor de una manera sinergica, como se evidencia por la ocurrencia del 50% de respuestas completas.
Como un primer componente, la combinacion vacuna/inhibidor inventiva incluye como vacuna una vacuna de ARN que comprende al menos un ARN que comprende al menos un marco de lectura abierto (ORF) que codifica para al menos un antfgeno, preferiblemente un antfgeno tumoral o un antfgeno patogenico.
De acuerdo con la invencion, la vacuna de ARN de la combinacion vacuna/inhibidor inventiva preferiblemente comprende al menos un ARN que comprende al menos un marco de lectura abierto que codifica al menos un antfgeno como se define aqrn.
El al menos un ARN de la vacuna de ARN es un ARN mensajero (ARNm).
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Sin embargo otras formas de ARN pueden encontrar igualmente su aplicacion en realizaciones no cubiertas por las reivindicaciones adjuntas. Por ejemplo, el ARN puede ser un aRn derivado de virus, tal como ARN de retrovirus o un replicon de ARN como se define aqm, por ejemplo derivado de un alfavirus.
En realizaciones espedficas, el al menos un ARN de la vacuna de ARN no comprende o no consiste en un vector lentiviral o un vector adenoviral/adeno-asociado.
En una realizacion espedfica, la vacuna de ARN comprende o consiste en ARN aislado tal como se define aqm.
Ademas, el al menos un ARN de la vacuna de ARN de la combinacion vacuna/inhibidor inventiva puede ser un ARN mono- o bi-caternario (que tambien se puede considerar como un ARN (molecula) debido una asociacion no covalente de dos ARN monocatenarios (moleculas)) o un ARN parcialmente de doble hebra o parcialmente de una hebra que son al menos parcialmente auto-complementarios (ambas moleculas de ARN parcialmente de hebra doble o parcialmente de hebra simple tfpicamente se forman por una molecula de ARN de hebra simple mas larga y una mas corta o por dos moleculas de ARN de hebra simple, que son aproximadamente de igual en longitud, donde una molecula de ARN de hebra simple es en parte complementaria a la otra molecula de ARN de hebra simple y ambas forman asf una molecula de ARN de hebra doble en esta region, esto es un ARN parcialmente de hebra doble o parcialmente de hebra simple). Preferiblemente, el al menos un ARN de la vacuna de ARN de la combinacion vacuna/inhibidor inventiva puede ser un ARN monocatenario. Ademas, el al menos un ARN de la vacuna de ARN de la combinacion vacuna/inhibidor inventiva puede ser un ARN circular o lineal, preferiblemente un ARN lineal. Mas preferiblemente, el al menos un ARN de la vacuna de ARN de la combinacion vacuna/inhibidor inventiva puede ser un ARN de una hebra (lineal).
Preferiblemente, el al menos un ARN de la vacuna de ARN de la combinacion vacuna/inhibidor inventiva comprende una longitud de alrededor de 5 a alrededor de 20.000, o 100 a alrededor de 20.000 nucleotidos, preferiblemente de alrededor de 250 a alrededor de 20.000 nucleotidos, mas preferiblemente de alrededor de 500 a alrededor de 10.000, aun mas preferiblemente de alrededor de 500 a alrededor de 5.000.
En una realizacion particularmente preferida del primer aspecto de la invencion, el al menos un ARN de la vacuna de ARN que comprende al menos un marco de lectura abierto codifica al menos un antfgeno tumoral. En este contexto, los antigenos de tumor se ubican preferiblemente en la superficie de la celula (tumor). Los antigenos tumorales tambien se pueden seleccionar de protemas que se sobreexpresan en celulas tumorales en comparacion con una celula normal (por ejemplo celulas no tumorales). Ademas, los antigenos tumorales tambien incluyen antigenos expresados en las celulas que no estan (estaban) ellos mismos (u originalmente no estaban ellos mismos) degenerados, sino asociados al supuesto tumor. Los antfgenos que se conectan con vasos que alimentan al tumor o su (re)formacion, en particular aquellos asociados a la neovascularizacion, por ejemplo factores de crecimiento, tal como VEGF, bFGF etc., tambien se incluyen aqm. Los antfgenos asociados a tumor ademas incluyen antfgenos de celulas o tejidos que tfpicamente incrustan el tumor. Ademas, ciertas sustancias (usualmente protemas o peptidos) se expresan en pacientes que padecen (intencionadamente o no intencionadamente) una enfermedad de cancer y se producen en concentraciones incrementadas en los fluidos del cuerpo de tales pacientes. Estas sustancias tambien son referidas como “antfgenos tumorales”, sin embargo no son antfgenos en el sentido estricto de una respuesta inmunitaria que induce la sustancia. La clase de antfgenos tumorales se puede dividir ademas en antfgenos espedficos de tumor (TSAs) y antfgenos asociados a tumor (TAAs). Los TSA se pueden presentar unicamente por celulas de tumor y nunca por celulas “saludables” normales. Tfpicamente son el resultado de una mutacion espedfica de tumor. Los tAa, que son mas comunes, son usualmente presentados por ambas celulas tumorales y sanas. Estos antfgenos son reconocidos y la celula que presenta el antfgeno se puede ser destruida por las celulas T citotoxicas. Adicionalmente, los antfgenos de tumor tambien pueden ocurrir en la superficie del tumor en forma de, por ejemplo, un receptor mutado. En este caso, pueden ser reconocidos por los anticuerpos.
Ademas, los antfgenos asociados a tumor se pueden clasificar como antfgenos espedficos de tejido, tambien llamados antfgenos espedficos de melanocito, antfgenos de cancer de testmulo y antfgenos espedficos tumorales. Los antfgenos de cancer de testmulotipicamente se entienden como peptidos o protemas de genes asociados a la lmea germinal que se pueden activar en una amplia variedad de tumores. Los antfgenos de cancer de testmulo humano se puede ademas subdividir en antfgenos que se codifican en el cromosoma X, llamados antfgenos-CT-X, y aquellos antfgenos que no se codifican en el cromosoma X, los llamados (antfgenos CT no X). Los antfgenos de cancer de testmulo que se codifican en el cromosoma X comprenden, por ejemplo, la familia de genes de antfgeno de melanoma, la llamada familia MAGE. Los genes de la familia MAGE se pueden caracterizar por un dominio de homologfa MAGE compartida (MHD). Cada uno de estos antfgenos, esto es antfgenos espedficos de melanocito, antfgenos de cancer de testmulo y antfgenos espedficos tumorales, pueden provocar respuestas inmunitarias celulares y humorales autologas. En consecuencia, el antfgeno de tumor codificado por el ARN comprendido en la vacuna de ARN usada en la
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presente invencion es preferiblemente un antigeno espedfico de melanocito, un antigeno de cancer de testmulo
0 un antigeno espedfico de tumor, preferiblemente puede ser un antigeno CT-X, un antigeno CT no X, una pareja de enlace para un antigeno CT-X o una pareja de enlace para un antigeno CT no X o un antigeno espedfico de tumor, mas preferiblemente un antigeno CT-X, una pareja de enlace para un antigeno CT no X o un antigeno espedfico de tumor.
Antigenos de tumor particularmente preferidos de acuerdo con la presente invencion se seleccionan de la lista que consiste en 5t4, 707-AP, 9D7, AFP, AlbZIP HPG1, alfa-5-beta-1-integrina, alfa-5-beta-6-integrina, alfa- actinina-4/m, racemasa alfa-metilacil-coenzima A, ART-4, ARTC1/m, B7H4, BAGE-1, BCL-2, bcr/abl, beta- catenina/m, BING-4, BRCA1/m, BRCA2/m, CA 15-3/CA 27-29, CA19-9, CA72-4, CA125, calreticulina, CAMEL, CASP-8/m, catepsina B, catepsina L, CD19, CD20, CD22, CD25, CDE30, CD33, CD4, CD52, CD55, CD56, CD80, CDC27/m, CDK4/m, CDKN2A/m, CEA, CLCA2, CML28, CML66, COA-1/m, protema como coactosin, mezcla XXIII, COX-2, CT-9/BRD6, Cten, ciclina B1, ciclina D1, cyp-B, CYPB1, DAM-10, DAM-6, DEK-CAN, EFTUD2/m, EGFR, ELF2/m, EMMPRIN, EpCam, EphA2, EphA3, ErbB3, ETV6-AML1, EZH2, FGF-5, FN, Frau-
1, G250, GAGE-1, GAGE-2, GAGE-3, GAGE-4, GAGE-5, GAGE-6, GAGE7b, GAGE-8, GDEP, GnT-V, gp100, GPC3, GPNMB/m, HAGE, HAST-2, hepsin, Her2/neu, HERV-K-MEL, HLA-A*0201-R17I, HLA-A11/m, HLA- A2/m, HNE, homeobox NKX3.1, HOM-TES-14/SCP-1, HOM-TES-85, HPV-E6, HPV-E7, HSP70-2M, HST-2, hTERT, iCE, IGF-1R, IL-13Ra2, IL-2R, IL-5, receptor de laminina inmaduro, calicrema-2, calicrema-4, Ki67, KIAA0205, KIAA0205/m, KK-LC-1, K-Ras/m, LAGE-A1, LDLR-FUT, MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE- A4, MAGE-A6, MAGE-A9, MAGE-A10, MAGE-A12, MAGE-B1, MAGE-B2, MAGE-B3, MAGE-B4, MAGE-B5, MAGE-B6, MAGE-B10, MAGE-B16, MAGE-B17, MAGE-C1, MAGE-C2, MAGE-C3, MAGE-D1, MAGE-D2, MAGE-D4, MAGE-E1, MAGE-E2, MAGE-F1, MAGE-H1, MAGEL2, mamaglobina A, MART-1/melan-A, MART-
2, MART-2/m, protema 22 de matriz, MC1R, M-CSF, ME1/m, mesotelina, MG50/PXDN, MMP11, MN/CA IX- antigeno, MRP-3, MUC-1, MUC-2, MUM-1/m, MUM-2/m, MUM-3/m, miosina clase I/m, NA88-A, N- acetilglucosaminiltransferasa-V, Neo-PAP, Neo-PAP/m, NFYC/m, NGEP, NMP22, NPM/ALK, N-Ras/m, NSE, NY-ESO-B, NY-ESO-1, OA1, OFA-iLRP, OGT, OGT/m, OS-9, OS-9/m, osteocalcina, osteopontina, p15, p190 bcr-abl menor, p53, p53/m, PAGE-4, PAI-1, PAI-2, PAP, PART-1, PATE, PDEF, Pim-1-Quinasa, Pin-1, Pml/PARalfa, POTE, PRAME, PRDX5/m, prosteina, proteinasa-3, PSA, PSCA, PSGR, PSM, PSMA, PTPRK/m, RAGE-1, RBAF600/m, RHAMM/CD168, RU1, RU2, S-100, SAGE, SART-1, SART-2, SART-3, SCC, SIRT2/m, Sp17, SSX-1, SSX-2/HOM-MEL-40, SSX-4, STAMP-1, STEAP-1, survivina, survivina-2B, SYT-SSX-1, SYT- SSX-2, TA-90, TAG-72, TARP, TEL-AML1, TGFbeta, TGFbetaRII, TGM-4, TPI/m, TRAG-3, TRG, TRP-1, TRP- 2/6b, TRP/INT2, TRP-p8, tirosinasa, UPA, VEGFR1, VEGFR-2/FLK-1, y WT1. Tales antfgenos de tumor preferiblemente se pueden seleccionar del grupo que consiste en p53, CA125, EGFR, Her2/neu, hTERT, PAP, MAGE-A1, MAGE-A3, Mesotelina, MUC-1, GP100, MART-1, Tirosinasa, PSA, PSCA, PSMA, STEAP-1, VEGF, VEGFR1, VEGFR2, Ras, CEA or WT1, y mas preferiblemente de PAP, MAGE-A3, WT1, y MUC-1. Tales antfgenos de tumor preferiblemente se pueden seleccionar del grupo que consiste en MAGE-A1 (por ejemplo MAGE-A1 de acuerdo al numero de acceso M77481), MAGE-A2, MaGe-A3, MAGE-A6 (por ejemplo MaGe- A6 de acuerdo al numero de acceso NM_005363), MAGE-C1, MAGE-C2, melan-A (por ejemplo melan-A de acuerdo al numero de acceso NM_005511), GP100 (por ejemplo GP100 de acuerdo al numero de acceso M77348), tirosinasa (por ejemplo tirosinasa de acuerdo al numero de acceso NM_000372), survivina (por ejemplo survivina de acuerdo al numero de acceso AF077350), CEA (por ejemplo CEA de acuerdo al numero de acceso NM_004363), Her-2/neu (por ejemplo Her-2/neu de acuerdo al numero de acceso M11730), WT1 (por ejemplo WT1 de acuerdo al numero de acceso NM_000378), PRAME (por ejemplo PRAME de acuerdo al numero de acceso NM_006115), EGFRI (receptor 1 de factor de crecimiento epidermico) (por ejemplo EGFRI (receptor 1 de factor de crecimiento epidermico) de acuerdo al numero de acceso AF288738), MUC1, mucina-
1 (por ejemplo mucina-1 de acuerdo al numero de acceso NM_002456), SEC61G (por ejemplo SEC61G de acuerdo al numero de acceso NM_014302), hTERT (por ejemplo hTERT numero de acceso nM_198253), 5T4 (por ejemplo 5T4 de acuerdo al numero de acceso NM_006670), TRP-2 (por ejemplo TRP-2 de acuerdo al numero de acceso NM_001922), STEAP1 (antigeno epitelial de seis transmembrana de prostata 1), PSCA, PSA, PSMA, etc. En este contexto es particularmente preferente que al menos un ARN de la vacuna de ARN de la combinacion vacuna/inhibidor inventiva codifique antigenos de tumor seleccionados de PCA, PSA, PSMA, STEAP y MUC-1 opcional, o fragmentos, variantes o derivados del mismo.
En una realizacion particularmente preferente adicional, la vacuna de ARN de la combinacion vacuna/inhibidor inventiva comprende al menos un ARN que codifica para antfgenos de tumor seleccionados de NY-ESO-1, MAGE-C1, MAGE-C2, Survivina, 5T4 opcional y MUC-1 opcional, o fragmentos, variantes o derivados del mismo.
Ademas, los antfgenos de tumor tambien pueden abarcar antfgenos idiotfpicos asociados a un cancer o enfermedad tumoral, particularmente linfoma o una enfermedad asociada a linfoma, donde tal antfgeno idiopatico es un idiotipo de inmunoglobulina de un globulo linfoide o un idiotipo de receptor de celula T de un globulo linfoide.
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En una realizacion particularmente preferente adicional del primer aspecto de la invencion, el al menos un ARN de la vacuna de ARN comprende al menos un marco de lectura abierto que codifica para al menos un antigeno patogenico. Los antigenos patogenicos son antigenos de peptido o protema derivados de un patogeno asociado a una enfermedad infecciosa, preferiblemente seleccionados de antfgenos derivados de los patogenos Acinetobacter baumannii, Anaplasma genus, Anaplasma phagocytophilum, Ancylostoma braziliense, Ancylostoma duodenale, Arcanobacterium haemolyticum, Ascaris lumbricoides, Aspergillus genus, Astroviridae, Babesia genus, Bacillus anthracis, Bacillus cereus, Bartonella henselae, virus Bk, Blastocystis hominis, Blastomyces dermatitidis, Bordetella pertussis, Borrelia burgdorferi, Borrelia genus, Borrelia spp, Brucella genus, Brugia malayi, familia Bunyaviridae, Burkholderia cepacia y otras especies de Burkholderia, Burkholderia mallei, Burkholderia pseudomallei, familia de Caliciviridae, Campylobacter genus, Candida albicans, Candida spp, Chlamydia trachomatis, Chlamydophila pneumoniae, Chlamydophila psittaci, CJD prion, Clonorchis sinensis, Clostridium botulinum, Clostridium difficile, Clostridium perfringens, Clostridium perfringens, Clostridium spp, Clostridium tetani, Coccidioides spp, coronavirus, Corynebacterium diphtheriae, Coxiella burnetii, virus de fiebre hemorragica de Crimean-Congo, Cryptococcus neoformans, Cryptosporidium genus, Citomegalovirus (CMV), virus del Dengue (DEN-1, DEN-2, DeN-3 and DEN-4), Dientamoeba fragilis, Ebolavirus (EBOV), Echinococcus genus, Ehrlichia chaffeensis, Ehrlichia ewingii, Ehrlichia genus, Entamoeba histolytica, Enterococcus genus, Enterovirus genus, Enteroviruses, principalmente virus Coxsackie A y Enterovirus 71 (EV71), Epidermophyton spp, Virus Epstein-Barr (EBV), Escherichia coli O157:H7, O111 y O104:H4, Fasciola hepatica y Fasciola gigantica, FFI prion, superfamilia Filarioidea, Flavivirus, Francisella tularensis, Fusobacterium genus, Geotrichum candidum, Giardia intestinalis, Gnathostoma spp, GSS prion, virus Guanarito, Haemophilus ducreyi, Haemophilus influenzae, Helicobacter pylori, Henipavirus (virus Hendra virus Nipah), Virus de Hepatitis A, Virus de Hepatitis B (HBV), Virus de Hepatitis C (HCV), Virus de Hepatitis D, Virus de Hepatitis E, virus Herpes simple 1 y 2 (HSV-1 y HSV-2), Histoplasma capsulatum, VIH (Virus de inmunideficiencia humana), Hortaea werneckii, bocavirus humano (HBoV), herpesvirus 6 humano (HHV-6) y herpesvirus 7 humano (HHV-7), metapneumovirus humano (hMPV), virus del papiloma humano (HPV), virus de parainfluenza (HPIV), virus de encefalitis Japonesa, virus JC, virus Junrn, Kingella kingae, Klebsiella granulomatis, Kuru prion, virus Lassa, Legionella pneumophila, Leishmania genus, Leptospira genus, Listeria monocytogenes, Virus de coriomeningitis linfocftica (LCMV), virus Machupo, Malassezia spp, virus Marburg, virus Measles, Metagonimus yokagawai, Microsporidia phylum, virus Molluscum contagiosum (MCV), virus Mumps, Mycobacterium leprae y Mycobacterium lepromatosis, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium ulcerans, Mycoplasma pneumoniae, Naegleria fowleri, Necator americanus, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Nocardia asteroides, Nocardia spp, Onchocerca volvulus, Orientia tsutsugamushi, familia de Orthomyxoviridae (Influenza), Paracoccidioides brasiliensis, Paragonimus spp, Paragonimus westermani, Parvovirus B19, Pasteurella genus, Plasmodium genus, Pneumocystis jirovecii, Poliovirus, Virus de la rabia, Virus sincitial respiratorio (RSV), Rinovirus, rinovirus, Rickettsia akari, Rickettsia genus, Rickettsia prowazekii, Rickettsia rickettsii, Rickettsia typhi, virus de la fiebre Rift Valley, Rotavirus, Virus de la rubeola, virus Sabia, genero Salmonella, Sarcoptes scabiei, SARS coronavirus, genero Schistosoma, genero Shigella, virus Sin Nombre, Hantavirus, Sporothrix schenckii, Staphylococcus genus, Staphylococcus genus, Streptococcus agalactiae, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Strongyloides stercoralis, Taenia genus, Taenia solium, Virus de encefalitis transmitido por garrapatas (TBEV), Toxocara canis o Toxocara cati, Toxoplasma gondii, Treponema pallidum, Trichinella spiralis, Trichomonas vaginalis, Trichophyton spp, Trichuris trichiura, Trypanosoma brucei, Trypanosoma cruzi, Ureaplasma urealyticum, virus zoster de varicela (VZV), Virus zoster de varicela (VZV), Viruela mayor o Viruela menor, vCJD prion, Virus de encefalitis equina venezolana, Vibrio cholerae, virus del Nilo Occidental, Virus de encefalitis equina Occidental, Wuchereria bancrofti, Virus de fiebre amarilla, Yersinia enterocolitica, Yersinia pestis, y Yersinia pseudotuberculosis.
En este contexto, son particularmente preferente antfgenos de los patogenos seleccionados de virus de la gripe, virus sincitial respiratorio (RSV), virus de herpes simple (HSV), virus de papiloma humano (HPV), virus de inmunodeficiencia humana (VIH), Plasmodium, Staphylococcus aureus, virus del Dengue, Chlamydia trachomatis, Citomegalovirus (CMV), virus de hepatitis B (HBV), Mycobacterium tuberculosis, virus de la rabia y virus de fiebre amarilla.
El al menos un ARN de la vacuna de ARN que comprende al menos un marco de lectura abierto que codifica para al menos un antfgeno de acuerdo al primer aspecto de la presente invencion puede estar presente como un ARN mono-, di-, o aun multicistronico, esto es un ARN que contiene el marco de lectura abierto de una, dos o mas protemas o peptidos. Tales marcos de lectura abiertos en los ARN di-, o aun multicistronicos pueden estar separados por al menos una secuencia del sitio de entrada de ribosoma interno (IRES), por ejemplo como se describe aqrn o por peptidos de senal que inducen el desdoblamiento del polipeptido resultante que comprende diversas protemas o peptidos.
El al menos un ARN de la vacuna de ARN de la combinacion vacuna/inhibidor inventiva se puede estabilizar con objeto de impedir la inestabilidad y la degradacion (rapida) del ARN por diversos enfoques. Esta inestabilidad del aRn es tfpicamente debida a enzimas que degradan el ARN, “RNasas” (ribonucleasas), donde
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la contaminacion con tales ribonucleasas puede a veces degradar completamente el ARN en solucion. En consecuencia, la degradacion natural del ARN en el citoplasma de las celulas se regula finamente y las contaminaciones de RNasa se pueden eliminar generalmente por tratamiento especial antes del uso de tales composiciones, en particular con pirocarbonato de dietilo (DEPC). Sosn conocidos diversos mecanismos de degradacion natural en este contexto en la tecnica anterior, que tambien se pueden utilizar. Por ejemplo, la estructura terminal es tfpicamente de importancia cntica particularmente para un ARNm. Como ejemplo, en el extremo 5' de los ARNm que se presentan naturalmente usualmente hay una llamada estructura cap, que es un nucleotido de guanosina modificado tambien llamado estructura 5’Cap, y en el extremo 3' tfpicamente una secuencia de hasta 200 nucleotidos de adenosina (la llamada cola poli-A). En una realizacion adicional, el al menos un ARN de la vacuna de ARN de la combinacion vacuna/inhibidor inventiva comprende al menos uno de los siguientes elementos estructurales: una secuencia UTR 5' y/o 3', preferiblemente una modificacion UTR 5' y/o 3', una estructura 5’Cap, una secuencia poli(C), una cola poli-A y/o una senal de poliadenilacion, preferiblemente como se define aqrn.
En una realizacion adicional, el al menos un ARN de la vacuna de ARN de la combinacion vacuna/inhibidor inventiva preferiblemente comprende al menos dos de los siguiente elementos estructurales: una secuencia UTR 5' y/o 3', preferiblemente una modificacion UTR 5' y/o 3' (por ejemplo la secuencia mutada de la UTR 3' del gen (alfa)globina (muag)); una estructura tallo-bucle de histona, preferiblemente una tallo-bucle de histona en su region no traducida 3'; una estructura 5'-Cap; una secuencia poli(C); una cola poli-A; o una senal de poliadenilacion, por ejemplo dada una estructura 5'-Cap y una tallo-bucle de histona y, potencialmente una poli- A-cola.
En este contexto es particularmente preferente que el al menos un ARN de la vacuna de ARN que codifica al menos un antfgeno comprendido en la combinacion vacuna/inhibidor inventiva tiene la siguiente estructura en la direccion 5' a 3':
a) una secuencia UTR 5' opcional que comprende una modificacion UTR
b) un marco de lectura abierto que codifica un antfgeno como se definio arriba;
c) una secuencia UTR 3' que comprende una modificacion UTR
d) al menos un tallo-bucle de histona, opcionalmente sin un elemento aguas abajo 3' al tallo-bucle de histona
e) una secuencia poli(A) u opcional una senal de poliadenilacion; y
f) una secuencia poli(C).
En otra realizacion particularmente preferente, el al menos un ARN de la vacuna de ARN que codifica al menos un antfgeno en la combinacion vacuna/inhibidor inventiva tiene la siguiente estructura en la direccion 5' a 3':
a) una secuencia UTR 5' opcional que comprende una modificacion UTR
b) un marco de lectura abierto que codifica un antfgeno como se definio arriba;
c) una secuencia UTR 3' que comprende una modificacion UTR
d) una secuencia poli(A)
e) una secuencia poli(C); y
f) al menos un tallo-bucle de histona.
Para mejorar aun mas la resistencia a, por ejemplo, la degradacion in vivo (por ejemplo por una exo- o endo- nucleasa), el al menos un ARN de la vacuna de ARN que codifica al menos un antfgeno en la combinacion vacuna/inhibidor inventiva se puede proporcionar como un acido nucleico estabilizado, por ejemplo en forma de un acido nucleico modificado como se define aqrn. De acuerdo con una realizacion adicional de la invencion, es por tanto preferente que el al menos un ARN de la vacuna de ARN que codifica al menos un antfgeno en la combinacion vacuna/inhibidor inventiva este estabilizado, preferiblemente por modificaciones de estructura, modificaciones de azucar y/o modificaciones de base, en especial estabilizado por modificacion del contenido G/C como se define aqrn. Todas estas modificaciones se pueden introducir en el al menos un ARN sin perjudicar la funcion del ARN de ser traducido en el antfgeno, para ser transcrito de forma inversa o replicarse.
De acuerdo a otra realizacion, el al menos un ARN de la vacuna de ARN que codifica al menos un antfgeno en la combinacion vacuna/inhibidor inventiva se puede modificar y, por tanto estabilizar, modificando el contenido de G (guanosina)/C (citosina) del ARNm, preferiblemente del marco de lectura abierto del mismo.
Aqrn, el contenido G/C del al menos un ARN de la vacuna de ARN que codifica al menos un antfgeno en la combinacion vacuna/inhibidor inventiva esta particularmente incrementado en comparacion con el contenido G/C del marco de lectura abierto de su marco de lectura abierto tipo natural particular, esto es el ARN no modificado como se define aqrn. Sin embargo, la secuencia de aminoacidos codificada del marco de lectura abierto del al menos un ARN de la vacuna de ARN que codifica al menos un antfgeno en el ARN de la
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combinacion vacuna/inhibidor inventiva no se modifica preferiblemente en comparacion con la secuencia de aminoacidos codificada del marco de lectura abierto tipo natural particular.
De acuerdo a una realizacion preferente adicional de la invencion, el al menos un ARN de la vacuna de ARN que codifica al menos un antigeno en la combinacion vacuna/inhibidor inventiva esta optimizado para la traduccion (codon optimizado) como se define aqrn, preferiblemente reemplazando los codones para los ARNt menos frecuentes de un determinado aminoacido por los codones que con mas frecuencia de los ARNt del respectivo aminoacido.
En este contexto, es particularmente preferente ligar el contenido G/C secuencial que se incrementa, en particular se maximiza, en el al menos un ARN de la vacuna de ARN que codifica al menos un antigeno en la combinacion vacuna/inhibidor inventiva con los codones “frecuentes” sin modificar la secuencia de aminoacidos de la protema codificada por el marco de lectura abierto comprendido en el al menos un ARN de la vacuna de ARN.
En el contexto de la presente invencion, el al menos un ARN de la vacuna de ARN que codifica al menos un antigeno en la combinacion vacuna/inhibidor inventiva, se puede preparar usando cualquier metodo conocido en la tecnica, incluyendo metodos de smtesis tales como smtesis de fase solida, asf como propagacion in vivo, por ejemplo produccion de partmulas tipo virus o partmulas de replicon en celulas o metodos in vitro, como reacciones de transcripcion in vitro. Los replicones, tal como ARN de auto-amplificacion basado en un genoma de alfavirus, se pueden producir construyendo plasmidos de ADN que codifican el ARN de auto-amplificacion usando tecnicas moleculares estandar. El ADN linealizado se transcribe in vitro por, por ejemplo, la de ARN T7 polimerasa y el ARN resultante se introduce en las celulas, por ejemplo por electroporacion. La produccion de partmulas de replicon se puede evaluar en ensayos de empacado en los cuales el replicon transcrito in vitro y ARN auxiliar defectuoso se co-transfectan en celulas (Perri et al., 2003. J. Virol. 77(19):10394-403; 12970424).
En una realizacion adicional, la vacuna de ARN de la combinacion vacuna/inhibidor inventiva comprende una pluralidad o mas de una, preferiblemente de 2 a 10, mas preferiblemente de 2 a 5, mas preferiblemente de 2 a 4 moleculas ARN como se definen aqrn. Estas vacunas de ARN comprenden mas de una de las moleculas ARN, preferiblemente que codifican diferentes peptidos o protemas que comprenden preferiblemente diferentes antigenos de tumor o antigenos patogenicos.
En este contexto es particularmente preferente que la vacuna de ARN de la combinacion vacuna/inhibidor inventiva que comprende una pluralidad (que significa tfpicamente mas de 1, 2, 3, 4, 5, 6 o mas de 10 acidos nucleicos, por ejemplo 2 a 10, preferiblemente 2 a 5 acidos nucleicos) de moleculas de ARN, particularmente para su uso en el tratamiento de cancer de prostata (PCa) comprende al menos:
a) una molecula ARN que codifica al menos un peptido o protema, donde tal protema o peptido codificado comprende el antigeno de tumor PSA, o un fragmento, variante o derivado del mismo; y
b) una molecula de ARN que codifica al menos un peptido o protema, donde tal protema o peptido codificado comprende el antigeno de tumor PSMA, o un fragmento, variante o derivado del mismo; y
c) una molecula de ARN que codifica al menos un peptido o protema, donde tal protema o peptido codificado comprende el antigeno de tumor PSCA, o un fragmento, variante o derivado del mismo;
d) una molecula de ARN que codifica al menos un peptido o protema, donde tal protema o peptido codificado comprende el antfgeno de tumor STEAP-1, o un fragmento, variante o derivado del mismo; y opcional g
e) una molecula de ARN que codifica al menos un peptido o protema, donde tal protema o peptido codificado comprende el antfgeno de tumor MUC-1, o un fragmento, variante o derivado del mismo.
En una realizacion preferente adicional, la vacuna de ARN de la combinacion vacuna/inhibidor inventiva que comprende una pluralidad (que significa tfpicamente mas de 1,2, 3, 4, 5, 6 o mas de 10 acidos nucleicos, por ejemplo 2 a 10, preferiblemente 2 a 5 acidos nucleicos) de moleculas de ARN, particularmente para su uso en el tratamiento de cancer de pulmon de celulas no pequenas (NSCLC) comprende al menos:
a) una molecula de ARN que codifica al menos un peptido o protema, donde tal protema o peptido codificado comprende el antfgeno de tumor NY-ESO-1, o un fragmento, variante o derivado del mismo; y
b) una molecula de ARN que codifica al menos un peptido o protema, donde tal protema o peptido codificado comprende el antfgeno de tumor MAGE-C1, o un fragmento, variante o derivado del mismo; y
c) una molecula de ARN que codifica al menos un peptido o protema, donde tal protema o peptido codificado comprende el antfgeno de tumor MAGE-C2, o un fragmento, variante o derivado del mismo;
d) una molecula de ARN que codifica al menos un peptido o protema, donde tal protema o peptido codificado comprende el antfgeno de tumor Survivina, o un fragmento, variante o derivado del mismo; y opcional
e) una molecula de ARN que codifica al menos un peptido o protema, donde tal protema o peptido codificado comprende el antfgeno de tumor 5T4, o un fragmento, variante o derivado del mismo; y opcional
f) una molecula de ARN que codifica al menos un peptido o protema, donde tal protema o peptido codificado
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comprende el antfgeno de tumor MUC-1, o un fragmento, variante o derivado del mismo.
De acuerdo a una realizacion de la presente invencion, el al menos un ARN de la vacuna de ARN que codifica al menos un antigeno en la combinacion vacuna/inhibidor inventiva se puede administrar desnudo, sin estar asociado a cualquier vetuculo adicional, agente de transfeccion o de formacion de complejo, para incrementar la eficiencia de la transfeccion y/o las propiedades inmunoestimuladoras del al menos un ArN.
En una realizacion preferida, el al menos un ARN de la vacuna de ARN que codifica al menos un antfgeno en la combinacion vacuna/inhibidor inventiva se puede formular junto con un compuesto cationico o policationico y/o con un portador polimerico como se define aqrn. En consecuencia, en una realizacion espedfica de la invencion se prefiere que el al menos un ARN de la vacuna de ARN que codifica al menos un antfgeno en la combinacion vacuna/inhibidor inventiva este asociado con o forme complejo con un compuesto cationico o policationico o un portador polimerico como se define aqrn, opcionalmente en una relacion en peso seleccionado de un intervalo de alrededor de 6:1 (p/p) hasta alrededor de 0,25:1 (p/p), mas preferiblemente desde alrededor de 5:1 (p/p) hasta alrededor de 0,5:1 (p/p), aun mas preferiblemente de alrededor de 4:1 (p/p) hasta alrededor de 1:1 (p/p) o de alrededor de 3:1 (p/p) hasta alrededor de 1:1 (p/p), y mas preferiblemente una relacion de alrededor de 3:1 (p/p) hasta alrededor de 2:1 (p/p), ARN:compuesto cationico o policationico y/o portador polimerico; u opcionalmente en una relacion N/P de al menos 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,75, 1, 1,5 o 2. Preferiblemente, la relacion N/P esta en un intervalo de alrededor de 0,1, 0,3, 0,4, 0,5, 0,75, 1,0, 1,5 o 2 a 20, preferiblemente en el intervalo de alrededor de 0,2 (0,5 o 0,75 o 1,0) a 12, mas preferiblemente en una relacion N/P de alrededor de 0,4 (0,75 o 1,0) a 10, y aun mas preferiblemente en una relacion N/P de alrededor de 0,4 (0,75 o 1,0) a 5. Mas preferiblemente la relacion N/P esta entre 0,1 y 0,9.
En este contexto es preferible que el compuesto cationico o policationico o el portador polimerico usado como portador o agente de formacion de complejo y el al menos un ARN de la vacuna de ARN que codifica al menos un antigeno en la combinacion vacuna/inhibidor inventiva como se define aqrn se proporcionan con una relacion N/P de al menos alrededor de 1 o, preferiblemente, de un intervalo de alrededor de 1 hasta 20 para aplicaciones in vitro (por ejemplo en el caso de celulas extrafdas del paciente senan tratadas in vitro con la composicion farmaceutica inventiva y posteriormente administradas al paciente).
Para aplicaciones in vivo, una relacion N/P de al menos 0,1 (0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6), preferiblemente en un intervalo de alrededor de 0,1 (0,2, 0,3, 0,4, 0,5 o 0,6) a 1,5 es preferente. Aun mas preferente es un intervalo de relacion N/P de 0,1 o 0,2 a 0,9 o un intervalo de relacion N/P de 0,5 a 0,9.
La relacion N/P influye significativamente en la carga superficial del complejo resultante que consiste en compuestos cationicos o policationicos o de un portador polimerico y una carga de acido nucleico, por ejemplo el al menos un ARN que codifica para al menos un antigeno comprendido en la vacuna de ARN o de un acido nucleico de adyuvante. Por tanto, es preferible que el complejo de carga de portador polimerico resultante se cargue positivamente para aplicaciones in vitro y negativamente o sea neutro para aplicaciones in vivo. La carga superficial del complejo de carga de portador polimerico resultante se puede indicar como Potencial zeta, que se puede medir por metodo de electroforesis de Doppler usando un Zetasizer Nano (Malvern Instruments, Malvern, RU).
El al menos un ARN de la vacuna de ARN que codifica al menos un antfgeno en la combinacion vacuna/inhibidor inventiva tambien puede estar asociado a un vetuculo, agente de transfeccion o de formacion de complejo para incrementar la eficiencia de la transfeccion y/o las propiedades inmunoestimuladoras del al menos un ARN.
En este contexto, es particularmente preferente que el al menos un ARN de la vacuna de ARN que codifica al menos un antfgeno en la combinacion vacuna/inhibidor inventiva este complejado al menos parcialmente con un compuesto cationico o policationico y/o un portador polimerico, preferiblemente protemas o peptidos cationicos. Parcialmente significa que unicamente una parte del al menos un ARN se compleja con un compuesto cationico y que el resto del al menos un ARN de la vacuna de ARN comprendido en la combinacion vacuna/inhibidor inventiva esta no complejado (“libre” o “desnudo”). Preferiblemente, la relacion ARN complejado:ARN no complejado en la vacuna de ARN de la combinacion vacuna/inhibidor inventiva se selecciona de un intervalo de alrededor de 5:1 (p/p) a alrededor de 1:10 (p/p), mas preferiblemente de un intervalo de alrededor de 4:1 (p/p) a alrededor de 1:8 (p/p), aun mas preferiblemente de un intervalo de alrededor de 3:1 (p/p) a alrededor de 1:5 (p/p) o 1:3 (p/p), y mas preferiblemente la relacion entre el ARN complejado y el aRn libre en la vacuna de ARN de la combinacion vacuna/inhibidor inventiva se selecciona de una relacion de alrededor de 1:1 (p/p).
El al menos un ARN complejado en la vacuna de ARN de la combinacion vacuna/inhibidor inventiva preferiblemente se prepara de acuerdo con una primera etapa formando complejos el menos un ARN con un
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compuesto cationico o policationico y/o con un portador polimerico, preferiblemente como se define aqrn, en una relacion espedfica, para formar un complejo estable. En este contexto, es altamente preferible que ningun compuesto cationico o policationico libre o portador polimerico o unicamente una cantidad insignificantemente pequena del mismo permanezca en el componente del ARN complejado despues de formar los complejos de ARN. En consecuencia, la relacion entre el ARN y el compuesto cationico o policationico y/o el portador polimerico en el componente de ARN complejado tfpicamente se selecciona en un intervalo en que el ARN esta totalmente complejado y ningun compuesto cationico o policationico libre o portador polimerico o unicamente una cantidad insignificantemente pequena del mismo permanece en la composicion.
Preferiblemente, la relacion entre el al menos un ARN que comprende al menos un marco de lectura abierto que codifica para al menos un antfgeno y el compuesto cationico o policationico y/o portador polimerico, preferiblemente como se define aqrn, se selecciona de un intervalo de alrededor de 6:1 (p/p) hasta alrededor de 0.25:1 (p/p), mas preferiblemente desde alrededor de 5:1 (p/p) hasta alrededor de 0.5:1 (p/p), aun mas preferiblemente de alrededor de 4:1 (p/p) hasta alrededor de 1:1 (p/p) o de alrededor de 3:1 (p/p) hasta alrededor de 1:1 (p/p), y mas preferiblemente una relacion de alrededor de 3:1 (p/p) hasta alrededor de 2:1 (p/p). Alternativamente, la relacion entre el ARN y el compuesto cationico o policationico y/o portador polimerico, preferiblemente como se define aqrn, en el componente ARN complejado tambien se puede calcular en base a la relacion nitrogeno/fosfato (relacion N/P) de todo el complejo. En el contexto de la presente invencion, la relacion N/P esta preferiblemente en el intervalo de alrededor de 0,1-10, preferiblemente en el intervalo de alrededor de 0,3-4 y mas preferiblemente en el intervalo de alrededor de 0,5-2 o 0,7-2 con respecto a la relacion compuesto cationico o policationico y/o portador polimerico:ARN, preferiblemente como se define aqrn, en el complejo, y mas preferiblemente en el intervalo de alrededor de 0,7-1,5, 0,5-1 o 0,7-1, y aun mas preferiblemente en el intervalo de alrededor de 0,3-0,9 o 0,5-0,9 preferiblemente siempre que el compuesto cationico o policationico en el complejo sea un protema o peptido cationico o policationico y/o el portador polimerico como se definio arriba. En esta realizacion espedfica, el ARN complejado tambien se incluye en el termino “componente adyuvante”.
En otra realizacion, el al menos un ARN que proporciona antfgeno en la vacuna de ARN de la combinacion vacuna/inhibidor inventiva como se definio arriba se puede formular junto con un adyuvante. Tal adyuvante preferiblemente puede ser un acido nucleico adicional que no codifica un antfgeno adicional, sino que es capaz de estimular una respuesta inmunitaria no espedfica, esto es una respuesta inmunitaria innata, interactuando con cualquier parte del sistema inmunitario innato. Tal acido nucleico que estimula una respuesta inmunitaria no espedfica se denomina aqrn “acido nucleico adyuvante”.
En este contexto, un acido nucleico adyuvante preferiblemente comprende o consiste en un oligo- o un poli- nucleotido; mas preferiblemente un acido nucleico adyuvante que comprende o consiste en un ARN o un ADN; aun mas preferiblemente tal acido nucleico adyuvante comprende o consiste en un ARN o un ADN complejado con un compuesto cationico o policationico y/o con un portador polimerico como se define aqrn; opcionalmente en una relacion en peso seleccionado de un intervalo de alrededor de 6:1 (p/p) hasta alrededor de 0,25:1 (p/p), mas preferiblemente desde alrededor de 5:1 (p/p) hasta alrededor de 0,5:1 (p/p), aun mas preferiblemente de alrededor de 4:1 (p/p) hasta alrededor de 1:1 (p:p) o de alrededor de 3:1 (p/p) hasta alrededor de 1:1 (p/p), y mas preferiblemente una relacion de alrededor de 3:1 (p/p) hasta alrededor de 2:1 (p/p) acido nucleico adyuvante:compuesto cationico o policationico y/o portador polimerico; u opcionalmente en una relacion nitrogeno/fosfato compuesto cationico o policationico y/o portador polimerico:acido nucleico adyuvante en el intervalo de alrededor de 0,1-10, preferiblemente en el intervalo de alrededor de 0,3-4, mas preferiblemente en el intervalo de alrededor de 0,7-1 o 0,5-1, y aun mas preferiblemente en el intervalo de alrededor de 0,3-0,9 o 0,5-0,9. Tal acido nucleico adyuvante complejado tambien se incluye en el termino “componente adyuvante”:
En el caso espedfico de que la induccion de IFN-a este prevista, una relacion N/P de al menos 0,1 (0,2, 0,3, 0,4, 0,5 o 0,6) o un intervalo de relacion N/P de 0,1 a 1 es preferente o mas preferido es un intervalo de relacion N/P de 0,1 o 0,2 a 0,9 o un intervalo de relacion N/P de 0,5 a 0,9. En otro caso, si se pretende la induccion de TNFa, una relacion N/P de 1 a 20 es particularmente preferente.
En otras palabras, la vacuna de ARN de la combinacion vacuna/inhibidor de acuerdo con la invencion puede comprender el al menos un ARN que codifica al menos un antfgeno y un acido nucleico adicional actua como adyuvante, el acido nucleico adyuvante. Por supuesto, la vacuna de ARN de la combinacion vacuna/inhibidor inventiva no se limita a comprender unicamente un acido nucleico adyuvante, sino que puede comprender diversos diferentes acidos nucleicos. Ambas clases de acido nucleico, el ARN que codifica el antfgeno y el acido nucleico adyuvante, pueden estar, independientemente, complejados con un portador como se define aqrn. Por tanto, un compuesto cationico o policationico y/o un portador polimerico usado para complejar el al menos un ARN de la vacuna de ARN que codifica al menos un antfgeno o el acido nucleico adyuvante se pueden seleccionar de cualquier compuesto cationico o policationico y/o portador polimerico como se define aqrn.
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En caso de que la vacuna de ARN de la combinacion vacuna/inhibidor inventiva (o la combinacion vacuna/inhibidor inventiva) comprenda un ARN que proporciona el antfgeno y adicionalmente un acido nucleico adyuvante, la respuesta inmunitaria que se evoca por la administracion de tal vacuna comprende la activacion de ambas partes del sistema inmunitario, el sistema inmunitario adaptativo y el innato.
Un factor esencial de la respuesta inmunitaria adaptiva adecuada es la estimulacion de diferentes sub- poblaciones de celulas T. Los linfocitos T tipicamente se dividen en dos sub-poblaciones, las celulas auxiliares T 1 en las siguientes celulas Th1, y las celulas auxiliares T 2 en las siguientes celulas Th2, con las cuales el sistema inmunitario es capaz de destruir patogenos intracelulares y extracelulares (por ejemplo antfgenos). Asf, las celulas Th1 son responsables de la destruccion del patogeno intracelular ayudando a la respuesta inmunitaria celular por activacion de macrofagos y celulas T citotoxicas. Las celulas Th2, por otro lado, son principalmente para la eliminacion de patogenos extracelulares y promueven la respuesta inmunitaria humoral estimulando las celulas B para su conversion en celulas plasmaticas y por la formacion de anticuerpos (por ejemplo frente a antigenos). Las dos poblaciones de celulas auxiliares T difieren en el patron de protemas efectoras (citoquinas) producidas por ellas.
La relacion celula Thl/celula Th2 es de gran importancia en la induccion y mantenimiento de una respuesta inmunitaria adaptiva. En conexion con la presente invencion, la relacion celula Th1/celula Th2 de la respuesta inmunitaria (adaptiva) se desplaza preferiblemente en la direccion hacia la respuesta celular (respuesta Th1), induciendose asf una respuesta inmunitaria celular. La estimulacion de esta respuesta del sistema inmunitario adaptativo principalmente se provoca por la traduccion del ARN que proporciona el antigeno y la presencia resultante de los antfgenos de peptido o protema dentro del organismo.
El sistema inmunitario innato que puede soportar tal respuesta inmunitaria adaptiva y que puede inducir o ayudar un cambio hacia una respuesta Th1 puede ser activado por ligandos de receptores tipo Toll (TLRs). Los TLR son una familia de polipeptidos del receptor de reconocimiento del patron altamente conservado (PRR) que reconocen patrones moleculares asociados a patogenos (PAMP) y juegan un papel cntico en la inmunidad innata en mairnferos. Actualmente se han identificado al menos trece miembros de la familia, designados TLR1 - TLR13 (Receptores tipo Toll: TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLR10, TLR11, TLR12 o TLR13). Ademas, se han identificado ciertos ligandos TLR espedficos. Por ejemplo, se encontro que el ADN bacteriano no metilado y analogos sinteticos del mismo (ADN CpG) son ligandos para TLR9 (Hemmi H et al. (2000) Nature 408:740-5; Bauer S et al. (2001) Proc Natl. Acad. Sci. USA 98, 9237-42). Ademas, se reporta que ligandos para ciertos TLR incluyen ciertas moleculas de acido nucleico y que ciertos tipos de ARN son inmunoestimuladores de forma independiente o dependiente de la secuencia, donde estos diversos ARN inmunoestimuladores pueden por ejemplo estimular TLR3, TLR7, o TLR8, o receptores intracelulares tales como RIG-I, MDA-5, etc.
En el contexto de la invencion, la activacion del sistema inmunitario innato se pueden proporcionar por un acido nucleico adyuvante, preferiblemente un ARN inmunoestimulador (isARN) como se define aqrn, comprendido en la combinacion vacuna/inhibidor inventiva, preferiblemente en la vacuna de ARN.
De acuerdo con lo anterior, en una realizacion preferente adicional de la invencion, la vacuna de ARN de la combinacion vacuna/inhibidor inventiva se formula para comprender
a) dicho al menos un ARN que comprende al menos un marco de lectura abierto que codifica para al menos un antfgeno; preferiblemente en forma de un ARN mono-, bi- o multicistronico, opcionalmente estabilizado, opcionalmente optimizado para la traduccion y/u opcionalmente complejado con un compuesto cationico o policationico o un portador polimerico;
b) opcionalmente un componente adyuvante, que comprende o que consiste en al menos un ARN que comprende al menos un marco de lectura abierto que codifica para al menos un antfgeno y/o al menos un acido nucleico adyuvante, complejado con un compuesto cationico o policationico y/o con un portador polimerico, y
c) opcionalmente un portador farmaceuticamente aceptable como se define aqrn.
En este contexto, es particularmente preferente que el componente adyuvante opcionalmente incluido comprenda el mismo ARNm que codifica para al menos un antfgeno como esta comprendido en la vacuna de ARN de la combinacion vacuna/inhibidor inventiva como ARN proporcionador de antfgeno.
Ademas, la vacuna de ARN de la combinacion vacuna/inhibidor inventiva puede comprender componentes adicionales para facilitar la administracion y absorcion de los componentes de la vacuna de ARN. Tales componentes adicionales pueden ser un portador o vehnculo apropiado o por ejemplo adyuvantes adicionales para apoyar cualquier respuesta inmunitaria como se define aqrn.
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De acuerdo a una realizacion adicional, los componentes de la vacuna de ARN, por ejemplo el al menos un ARN que codifica para al menos un antigeno y un componente adyuvante de la combinacion vacuna/inhibidor inventiva, se pueden formular juntos o de forma separada en la misma o diferentes composiciones.
Como un segundo componente, la combinacion vacuna/inhibidor inventiva incluye como inhibidor una composicion que comprende un inhibidor de la ruta PD-1, donde el inhibidor de la ruta PD-1 es un anticuerpo antagonista dirigido contra PD-1.
La muerte-programada-1 (PD-1, PDCD1) es una protema transmembrana tipo I que pertenece a la familia CD28 extendida de reguladores de celulas T. PD-1 carece del residuo de cistema proximal a la membrana requerido para la homodimerizacion de otros miembros de la familia CD28. Analisis estructurales y bioqmmicos muestran que la PD-1 es monomerica en solucion asf como en la superficie celular (Okazaki and Honjo, 2007. Int Immunol. 19(7):813-24). PD-1 se expresa en celulas T activadas, celulas B y monocitos. La expresion mas amplia de PD-1 contrasta con la expresion restringida de otros miembros de la familia CD28 a las celulas T, lo que sugiere que PD-1 regula un espectro amplio de respuestas inmunitarias comparadas con otros miembros de la familia Cd28.
PD-1 negativamente regula la senalizacion de receptor de antfgeno al reclutar la protema de fosfatasa tirosina SHP-2 sobre la interaccion con cualquiera de dos ligandos, PD-L1 o PD-L2.
PD-L1 (B7-H1, CD274) y PD-L2 (B7-DC, CD273) son glicoprotemas transmembrana tipo I compuestas de dominios extracelulares tipo IgC e IgV. PD-L1 y PD-L2 comparten un 40% de identidad de aminoacidos, mientras que los ortologos de humano y de raton de PD-L1 y PD-L2 comparten un 70% identidad de aminoacidos. Ambos PD-L1 y PD-L2 tienen colas citoplasmicas cortas sin motivo conocido para la transduccion de senal, lo que sugiere que estos ligandos no transducen cualquier senal sobre la interaccion con PD-1.
La interaccion de PD-L1 y PD-1 proporciona una senal co-estimuladora negativa crucial a las celulas T y funciona como inductor de muerte celular. La interaccion entre una concentracion baja de PD-1 y PD-L1 lleva a la transmision de una senal inhibidora que inhibe la proliferacion de celulas CD8+ espedficas de antfgeno. En concentraciones mas altas, esta interaccion no inhibe la proliferacion de celulas, T sino que reduce la produccion de multiples citoquinas. Por tanto, el enlace a PD-L1 puede antagonizar la senal B7 - CD28 cuando la estimulacion antigenica es debil y juega un papel importante en sub-regular las respuestas de las celulas T.
El papel de los ligandos PD-1 y PD-1 en inhibir la proliferacion y activacion de celulas T sugiere que estas protemas pueden servir como dianas terapeuticas para el tratamiento de la inflamacion, cancer o enfermedades infecciosas. Dependiendo del resultado terapeutico deseado, se requiere una sobre- o sub-modulacion de la ruta PD-1. En particular, se requiere la sobre-modulacion del sistema inmunitario en el tratamiento de canceres e infecciones cronicas. Esto puede conseguirse por ejemplo por bloqueo PD-1 o inhibiendo la ruta PD-1. La inhibicion de la ruta PD-1 se puede alcanzar, por ejemplo, por un anticuerpo dirigido a PD-1 o un ligando PD- 1. En este contexto, el inhibidor de la ruta PD-1 puede eliminar la disfuncion de las celulas T que resulta en la senalizacion PD-1 y asf restaura o mejora la funcion de las celulas T (por ejemplo proliferacion, produccion de citoquina, eliminacion de celula objetivo). Adicionalmente, las celulas T anergicas que son insensibles a la estimulacion de antfgeno se pueden reactivar.
En el contexto de la presente invencion, el inhibidor de la ruta PD-1 es un anticuerpo antagonista dirigido contra PD-1. Tambien se describen aqm otras realizaciones (no reivindicadas) donde el inhibidor de la ruta de PD-1 es un anticuerpo codificado por acido nucleico (intracuerpo), un siARN, un ARN antisentido, una protema que comprende (o un acido nucleico que codifica para) una secuencia de aminoacidos capaz de enlazar a PD-1 pero que impide la senalizacion PD-1 (por ejemplo una protema de fusion de un fragmento de PD-L1 o PD-L2 y la parte Fc de una inmunoglobulina), una protema soluble (o un acido nucleico que codifica para una protema soluble) compitiendo con PD-1 enlazado a membrana para enlace de sus ligandos PD-L1 y PD-L2; o un inhibidor de molecula pequena capaz de inhibir la senalizacion de trayectoria PD-1.
Por tanto, segun la presente invencion, el inhibidor de la ruta PD-1 es un anticuerpo antagonista dirigido contra PD-1, preferiblemente un anticuerpo que espedficamente se enlaza al dominio extracelular de PD-1 y asf inhibe la senalizacion PD-1. Preferiblemente, tal anticuerpo antagonista se enlaza cerca del sitio de enlace PD-L1 en PD-1, inhibiendo asf el enlace de PD-L1 a PD-1.
Son particularmente preferentes los anticuerpos anti-PD1 Nivolumab (MDX-1106/BMS-936558/ONO-4538), (Brahmer et al., 2010. J Clin Oncol. 28(19):3167-75; PMID: 20516446); Pidilizumab (CT-011), (Berger et al., 2008. Clin Cancer Res. 14(10): 3044-51; PMID: 18483370); y MK-3475(SCH 900475).
En una realizacion no reivindicada, el inhibidor de la ruta PD-1 es un anticuerpo (o un acido nucleico que codifica para un anticuerpo) dirigido contra un ligando PD-1, preferiblemente un anticuerpo que espedficamente se enlaza al dominio extracelular del ligando PD-1 o PD-2. Preferiblemente, tal anticuerpo se enlaza de forma proximal y rompiendo el sitio de enlace PD-1 o PD-2 en el ligando.
5 Se describen ademas en este contexto anticuerpos anti-PD-LI MDX-1105/BMS-936559 (Brahmer et al. 2012. N Engl J Med. 366(26):2455-65; PMID: 22658128); MPDL3280A/RG7446, o MEDI4736.
En una realizacion no reivindicada, el inhibidor de la ruta PD-1 es una protema que comprende (o un acido nucleico que codifica para) una secuencia de aminoacidos capaz de enlazar a PD-1 pero que impide la senalizacion de la ruta PD-1, en particular en este contexto una protema de fusion de un fragmento de ligando 10 PD-L1 o PD-L2.
En este contexto, tambien se describe aqm una protema de fusion que comprende el dominio extracelular de PD-L1 o PD-L2 o un fragmento del mismo capaz de enlazar a PD-1 o a una porcion Fc de una inmunoglobulina. Un ejemplo de tal protema de fusion es AMP-224 (dominio extracelular de PD-L2/B7-DC murino fusionado a la porcion Fc no modificada de protema IgG2a murina; Mkrtichyan et al., 2012. J Immunol. 189(5):2338-47; PMID: 15 22837483).
En el contexto de la presente invencion, la administracion de la vacuna y el inhibidor puede ocurrir ya sea simultaneamente o escalonada en el tiempo, ya sea en el mismo sitio de administracion o en diferentes sitios de administracion, como se resume mas adelante.
Para asegurar que los mecanismos separados obtenidos por la vacuna de ARN y el inhibidor de la ruta PD-1 20 no se influyen negativamente uno al otro, el inhibidor de la ruta PD-1 y la vacuna de ARN preferiblemente se
administran separados en el tiempo (de forma escalonada en el tiempo), esto es secuencialmente, y/o se
administran en diferentes sitios de administracion. Esto significa que la vacuna de ARN se puede administrar por ejemplo previa, simultanea o despues que el inhibidor de la ruta PD-1, o viceversa. Alternativa o adicionalmente, la vacuna de ARN y el inhibidor de la ruta PD-1 se pueden administrar en diferentes sitios de 25 administracion o en el mismo sitio de administracion, preferiblemente, cuando se administra de forma
escalonada en el tiempo. De acuerdo con una realizacion particularmente preferente, la vacuna de ARN se
administra primero y el inhibidor de la ruta PD-1 se administrar tras la vacuna de ARN. Este procedimiento asegura que las celulas inmunitarias, como celulas presentadoras de antfgeno y celulas T, ya han encontrado el antfgeno antes que el sistema inmunitario se estimule por la inhibicion de la ruta PD-1, aunque una 30 administracion simultanea o una administracion donde el inhibidor de la ruta PD-1 se administra antes de la vacuna de ARN puede llevar a los mismos o al menos a resultados comparables.
En consecuencia, en una realizacion adicional, la combinacion vacuna/inhibidor inventiva ademas comprende un portador farmaceuticamente aceptable y/o vehmulo.
Tal portador farmaceuticamente aceptable tfpicamente incluye la base lfquida o no lfquida de una composicion 35 que comprende los componentes de la combinacion vacuna/inhibidor inventiva. Si la composicion se proporciona en forma lfquida, el portador preferiblemente sera agua libre de pirogenos; solucion salina isotonica o solucion amortiguada (acuosa), por ejemplo fosfato, citrato, etc., soluciones tamponadas. La solucion tampon de inyeccion puede ser hipertonica, isotonica o hipotonica con respecto al medio de referencia espedfico, esto es la solucion tampon puede tener un contenido de sal superior, identico o inferior con respecto al medio de 40 referencia espedfico, donde preferiblemente se usan tales concentraciones de las sales mencionadas anteriormente que no conducen a dano celular debido a osmosis u otros efectos de la concentracion. Medios de referencia son por ejemplo lfquidos que se emplean en metodos “in vivo", tal como sangre, linfa, lfquidos citosolicos u otros lfquidos corporales, o por ejemplo lfquidos que se pueden usar como medios de referencia en metodos “in vitro”, como soluciones tampon o lfquidos comunes. Tales soluciones tampon o lfquidos 45 comunes son conocidos por el experto. La solucion de Lactato Ringer es particularmente preferente como base lfquida.
Sin embargo, se pueden usar tambien para la combinacion vacuna/inhibidor de acuerdo con la invencion uno o mas diluyentes o cargas solidos o lfquidas compatibles o compuestos de encapsulacion, adecuados para la administracion a un paciente a tratar. El termino “compatible” como se usa aqm significa que estos 50 constituyentes de la combinacion vacuna/inhibidor pueden mezclarse con la vacuna de ARN y/o el inhibidor de la ruta PD-1 de manera que no se produce ninguna interaccion que reduzca esencialmente la efectividad farmaceutica de la combinacion vacuna/inhibidor bajo las condiciones de uso tfpicas.
Ademas, la combinacion vacuna/inhibidor inventiva puede comprender uno o mas adyuvantes adicionales
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adecuados para iniciar o incrementar una respuesta inmunitaria del sistema inmunitario innato, esto es una respuesta inmunitaria no espedfica, particularmente por el enlace a patrones moleculares asociados a patogenos (PAMP). Con otras palabras, cuando se administra, la vacuna de ARN preferiblemente provoca una respuesta inmunitaria innata debido al adyuvante opcionalmente contenido allt Sin embargo, el adyuvante tambien puede ser parte de otro componente de la combinacion vacuna/inhibidor inventiva que la vacuna de ARN. Preferiblemente, tal adyuvante se puede seleccionar de un adyuvante conocido por el experto y adecuado para el presente caso, esto es que soporta la induccion de una respuesta inmunitaria innata en un mairnfero, por ejemplo un acido nucleico adyuvante o un componente adyuvante como se definio arriba o un adyuvante como se define en lo siguiente.
Asf, tal adyuvante tambien puede seleccionarse de cualquier adyuvante conocido por el experto y adecuado para el presente caso, esto es que soporta la induccion de una respuesta inmunitaria innata en un mamffero y/o adecuado para almacenar y suministrar los componentes de la combinacion vacuna/inhibidor inventiva. Como adyuvantes adecuados para almacenar y suministrar son preferentes compuestos cationicos o policationicos como se definen arriba. Igualmente, el adyuvante se puede seleccionar del grupo consistente en, por ejemplo, compuestos cationicos o policationicos como se definen arriba, quitosano, TDM, MDP, dipeptido de muramilo, pluronicos, solucion de alumbre, hidroxido de aluminio, ADJUMERTM (polifosfazeno); gel de fosfato de aluminio; glucanos de algas; algamulina; gel de hidroxido de aluminio (alumbre); gel de hidroxido de aluminio que adsorbe altamente la protema; gel de hidroxido de aluminio de viscosidad baja; AF o SPT (emulsion de escualeno (5%), Tween 80 (0.2%), Pluronico L121 (1.25%), solucion salina tamponada con fosfato, pH 7,4); AVRIDINETM (propanodiamina); BAY R1005TM (hidroacetato de (N-(2-deoxi-2-L- leucilaminob-D-glucopiranosil)-N-octadecil-dodecanoil-amida); CALCITRIOL™ (1-alfa,25-dihidroxi-vitamina D3); gel de fosfato de calcio; CAPTM (nanopartmulas de fosfato de calcio); holotoxina de colera, protema de fusion colera-toxina-A1-protema-A-D-fragmento, sub-unidad B de la toxina de colera; CRL 1005 (copolfmero de bloque P1205); liposomas que contienen citoquina; DDA (bromuro de dimetildioctadecilamonio); DHEA (dehidroepiandroesterona); DMPC (dimiristoilfosfatidilcolina); DMPG (dimiristoilfosfatidilglicerol); complejo DOC/alumbre (sal de sodio de acido desoxicolico); adyuvante completo de Freund; adyuvante incompleto de Freund; inulina gama; adyuvante Gerbu (mezcla de: i) N-acetilglucosaminil-(P1-4)-N-acetilmuramil-L-alanil- D35-glutamina (GMDP), ii) cloruro de dimetildioctadecil-amonio (DDA), iii) complejo de sal de zinc-L-prolina (ZnPro-8); gM-CSF); GMDP (N-acetilglucosaminil-(b1-4)-N-acetilmuramil-L47 alanil-D-isoglutamina); imiquimod (1-(2-metipropil)-1H-imidazo[4,5-c]quinolina-4-amina); ImmTher™ (N-acetilglucosaminil-N-
acetilmuramil-L-Ala-D-isoGlu-L-Ala-gliceroi-dipalmitato); DRVs (immunoliposomas preparadas de vesmulas de deshidratacion-rehidratacion); interferongama; interleucina-lbeta; interleucina-2; interleucina-7; interleucina- 12; ISCOMS™; ISCOPREP™ 7.0.3.; liposomas; LOXORIBINE™ (7-alil-8-oxoguanosina); adyuvante oral LT 5 (enterotoxina-protoxina labil E.coli); microesferas y micropartmulas de cualquier composicion; MF59TM; (emulsion de escualeno agua); MONTANIDE™ ISA 51 (adyuvante de Freund incompleto purificado); MONTANIDE™ ISA 720 (adyuvante de aceite metabolizable); MpLtm (lfpido 3-Q-desacil-4'-monofosforilo A); liposomas MTP-PE y mTP-PE ((N-acetil-L-alanil-D-isoglutaminil-L-alanina-2-(1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3- (hidroxifosforiloxi))-etilamida, sal monosodica); MURAMETIDE™ (Nac-Mur-L-Ala-D-Gln-OCH3);
MURAPALMITINE™ y DMURAPALMITINE™ (Nac-Mur-L-Thr-D-isoGIn-sn-gliceroldipalmitoil); NAGO (oxidasa neuraminidasa-galactosa); nanoesferas o nanopartmulas de cualquier composicion; NISV (vesmulas de tensioactivo no ionico); PLEURAN™ (p-glucano); PLGA, PGA y PLA (homo- y co-polfmeros de acido lactico y acido glicolico; microesferas/nanoesferas); pLuRONIC™ L121; PMMA (polimetilmetacrilato); PODDSTM (microesferas proteinoides); derivados de polietilencarbamato; poli-rA: poli-rU (complejo de acido poliademlico- acido poliuridflico); polisorbato 80 (Tween 80); cocleatos de protema (Avanti Polar Lipids, Inc., Alabaster, AL); STImUlON™ (qS-21); Quil-A (saponina Quil-A); S-28463 (4-amino-otec-dimetil-2-etoximetil-1H-imidazo[4,5- c]quinolina-1-etanol); SAF-1TM (“formulacion de adyuvante Syntex”); proteoliposomas Sendai y matrices de lfpido que contienen Sendai; Span-85 (trioleato de sorbitano); Specol (emulsion de Marcol 52, Span 85 y Tween 85); escualeno o Robane® (2,6,10,15,19,23-hexametiltetracosan y 2,6,10,15,19,23-hexametil-2,6,10,14,18,22- tetracosahexano); esteariltirosina (clorohidrato de octadeciltirosina); Theramid® (N-acetilglucosaminil-N- acetilmuramil-L-Ala-D-isoGlu-L-Aladipalmitoxipropilamida); Teronil-MDP (Termurtide™ o [thr 1]-MDP; N- acetilmuramil-L-treonil-D-isoglutamina); partmulas Ty (Ty-VLPs o partmulas tipo virus); liposomas Walter-Reed (liposomas que contienen lfpido A adsorbido en hidroxido de aluminio), y lipopeptidos, que incluyen Pam3Cys, en particular sales de aluminio, tal como Adjuphos, Alhidrogel, Rehidragel; emulsiones, que incluyen CFA, sAf, IFA, MF59, Provax, TiterMax, Montanide, Vaxfectin; copolfmeros, que incluyen Optivax (CRL1005), L121, Poloxamer4010), etc.; liposomas, que incluyen Recubiertos, cocleatos, que incluyen BIORAL; adyuvantes derivados de plantas, que incluyen QS21, Quil A, Iscomatrix, ISCOM; adyuvantes adecuados para la co- estimulacion que incluyen Tomatina, biopolfmeros, que incluyen PLG, PMM, Inulina, adyuvantes derivados de microbios, que incluyen Romurtide, DETOX, MPL, CWS, Manosa, secuencias de acido nucleico CpG, CpG7909, ligandos de TLR humano 1-10, ligandos TLR de murino 1-13, ISS-1018, 35 IC31, Imidazoquinolinas, Ampligen, Ribi529, IMOxine, IRIVs, VLPs, toxina de colera, toxina termoinestable, Pam3Cys, Flagellin, GPI de anclaje, LNFPIII/Lewis X, peptidos antimicrobianos, UC-1V150, protema de fusion RSV, cdiGMP; y adyuvantes adecuados como antagonistas que incluyen neuropeptido CGRP.
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Un adyuvante se selecciona preferiblemente de adyuvantes que soportan la induccion de una respuesta inmunitaria Th1 o la maduracion de celulas T naive, tal como GM-CSF, IL-12, IFNg, cualquier acido nucleico de adyuvante como se definio arriba, preferiblemente un ARN inmunoestimulador, ADN CpG, etc.
En una realizacion preferida adicional, tambien es posible que la combinacion vacuna/inhibidor inventiva contenga tambien el ARN que proporciona el antigeno y los componentes adicionales del inhibidor de la ruta PD-1 seleccionados del grupo que comprende: antigenos adicionales o acido nucleicos que proporcionan antigeno adicional; un agente inmunoterapeutico adicional; una o mas sustancias auxiliares; o cualquier compuesto adicional que se conoce es inmunoestimulante debido a su afinidad de enlace (como ligandos) a receptores tipo Toll humanos; y/o un acido nucleico adyuvante, preferiblemente un ARN inmunoestimulador (isARN).
En consecuencia, en otra realizacion preferida, la combinacion vacuna/inhibidor inventiva ademas comprende al menos un adyuvante, una sustancia auxiliar seleccionada de lipopolisacaridos, TNF-alfa, ligando CD40, o citoquinas, monoquinas, linfoquinas, interleuquinas o quimiocinas, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL- 9, IL-10, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-24, IL-25, IL-26, IL-27, IL-28, IL-29, IL-30, IL-31, IL-32, IL-33, IFN-alfa, IFN-beta, IFN-gama, GM-CSF, G-CSF, M-CSF, LT-beta, TNF- alfa, factores de crecimiento, y hGH, un ligando de receptor tipo Toll humano TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLR10, un ligando de receptor tipo Toll de murino TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLR10, TLR11, TLR12 o TLR13, un ligando de un receptor tipo NOD, un ligando de un receptor tipo RIG-I, un acido nucleico adyuvante, un ARN inmunoestimulador (isARN), un CpG-ADN, un agente antibacteriano, o un agente anti-viral.
La combinacion vacuna/inhibidor como se define de acuerdo con la presente invencion ademas puede comprender aditivos o compuestos adicionales. Los aditivos adicionales que se pueden incluir en la combinacion vacuna/inhibidor inventiva, tal como en la vacuna de ARN y/o en la composicion que comprende un inhibidor de la ruta PD-1, son emulsionantes, por ejemplo Tween®; agentes humectantes, por ejemplo laurilsulfato de sodio; agentes colorantes; agentes que imparten sabor, portadores farmaceuticos; agentes de formacion de comprimidos; estabilizadores; antioxidantes; conservadores, inhibidores de RNasa y/o un agente anti-bacteriano o un agente anti-viral.
La combinacion vacuna/inhibidor inventiva tipicamente comprende una “cantidad segura y efectiva” de los componentes de la combinacion vacuna/inhibidor inventiva como se define aqrn. Como se usa aqrn, una “cantidad segura y efectiva” preferiblemente significa una cantidad de los componentes, preferiblemente de al menos un ARN que codifica al menos un antfgeno y el inhibidor de la ruta PD-1, que es suficiente para inducir significativamente una modificacion positiva o prevencion de una enfermedad o trastorno como se define aqrn. Al mismo tiempo, sin embargo, una “cantidad segura y efectiva” es lo suficientemente pequena para evitar efectos secundarios graves y para permitir una relacion razonable entre ventaja y riesgo. La determinacion de estos lfmites tipicamente se encuentra dentro del alcance del juicio medico sensato.
La combinacion de la vacuna/inhibidor inventiva se puede administrar via oral, parenteral, por aerosol de inhalacion, via topica, rectal, nasal, bucal, vaginal o por medio de un deposito implantado. El termino parenteral como se usa aqrn incluye la inyeccion subcutanea, intravenosa, intramuscular, intra-articular, intra-nodal, intra- sinovial, intraesternal, intratecal, intrahepatica, intralesional, intracraneal, transdermica, intradermica, intrapulmonar, intraperitoneal, intracardiaca, intraarterial y sublingual o tecnicas de infusion. Preferiblemente la vacuna de ARN se administra por aplicacion intradermica o intramuscular y el inhibidor de la ruta PD-1 se administra preferiblemente por inyeccion intramuscular o intraperitoneal, mas preferiblemente por infusion intravenosa, en caso de que sea en forma de un anticuerpo.
De acuerdo a un aspecto adicional, el objeto que subyace a la presente invencion se resuelve mediante una composicion farmaceutica que comprende una vacuna y un inhibidor, en particular, como vacuna, una vacuna de ARN que comprende al menos un ARNm que comprende al menos un marco de lectura abierto que codifica para al menos un antfgeno y, como inhibidor, una composicion que comprende un inhibidor de la ruta PD-1, donde el inhibidor de la ruta PD-1 es una anticuerpo antagonista dirigido contra PD-1, ambos preferiblemente como se definen anteriormente. Igualmente, la composicion farmaceutica preferiblemente se formula y administra como se define arriba para los componentes de la combinacion vacuna/inhibidor inventiva. Tal composicion farmaceutica puede ademas comprender cualquier ingrediente como se define arriba para la combinacion vacuna/inhibidor inventiva.
En consecuencia, la combinacion de la vacuna de ARN y el inhibidor de la ruta PD-1 como se define de acuerdo con la presente invencion puede presentarse ya sea como una composicion, por ejemplo la composicion farmaceutica de acuerdo con la presente invencion, o en mas de una de las composiciones, por ejemplo como un kit de partes, donde los diferentes componentes forman diferentes partes de tal kit de partes. Estos diferentes
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componentes, tal como la vacuna y el inhibidor, se pueden formular en cada caso como una composicion farmaceutica o como una composicion como se define arriba. Preferiblemente, cada uno de las diferentes partes del kit comprende un componente diferente, por ejemplo una parte comprende la vacuna de ARN como se define aqrn, una parte adicional comprende el inhibidor de la ruta PD-1 como se define aqrn, etc.
Por tanto, de acuerdo con un aspecto adicional, la presente invencion tambien proporciona kits, particularmente kits de partes. Tales kits, particularmente kits de partes, tfpicamente comprenden como componentes solos o en combinacion con componentes adicionales como se define aqrn la vacuna de ARN que comprende al menos un ARNm que comprende al menos un marco de lectura abierto que codifica para al menos un antigeno y, preferiblemente en una parte diferente del kit, un inhibidor de la ruta PD-1, siendo el inhibidor de la ruta PD-1 un anticuerpo antagonista dirigido contra PD-1, como se define aqrn. La combinacion vacuna/inhibidor inventiva como se define aqrn, opcionalmente en combinacion con componentes adicionales como se definen aqrn, tal como un adyuvante adicional, puede presentarse en una o diferentes partes del kit. Como ejemplo, por ejemplo al menos una parte del kit puede comprender la vacuna de ARN que comprende el al menos un ARN que codifica al menos un antigeno como se define aqrn, al menos una parte adicional del kit puede comprender el inhibidor de la ruta PD-1 como se define aqrn y opcionalmente al menos una parte adicional del kit puede comprender un adyuvante adicional como se describe aqrn. El kit o kit de partes ademas puede contener instrucciones tecnicas con informacion sobre la administracion y la dosificacion de la combinacion vacuna/inhibidor inventiva, la composicion farmaceutica inventiva o de cualquiera de sus componentes o partes.
La combinacion vacuna/inhibidor inventiva, la composicion farmaceutica inventiva o el kit de partes inventivo que comprende la vacuna de ARN y un inhibidor de la ruta PD-1 se pueden con el ser humano y tambien con propositos medicos veterinarios, preferiblemente para propositos medicos humanos.
Por tanto, de acuerdo con un aspecto adicional, la presente invencion se dirige al primer uso medico de la combinacion vacuna/inhibidor inventiva, la composicion farmaceutica inventiva y el kit de partes inventivo que comprende la vacuna de ARN y un inhibidor de la ruta PD-1 como se define en las reivindicaciones. En consecuencia, la combinacion vacuna/inhibidor inventiva, la composicion farmaceutica inventiva y el kit de partes inventivo que comprende vacuna de ARN y un inhibidor de la ruta PD-1 como se define en las reivindicaciones se puede usar como medicamento.
De acuerdo con otro aspecto, la presente invencion se dirige al segundo uso medico de la combinacion vacuna/inhibidor inventiva, la composicion farmaceutica inventiva y el kit de partes inventivo que comprende la vacuna de ARN y un inhibidor de la ruta PD-1 como se define en las reivindicaciones. Por tanto, la combinacion vacuna/inhibidor inventiva, la composicion farmaceutica inventiva y el kit de partes inventivo que comprende la vacuna de ARN y un inhibidor de la ruta PD-1 como se definen en las reivindicaciones se pueden usar para el tratamiento y/o la mejora de diversas enfermedades, en particular cancer y enfermedades tumorales y enfermedades infecciosas como se definen aqrn.
El cancer o las enfermedades tumorales en este contexto preferiblemente incluyen, por ejemplo, melanomas, melanomas malignos, carcinomas de colon, linfomas, sarcomas, blastomas, carcinomas renales, tumores gastrointestinales, gliomas, tumores de prostata, cancer de vejiga, tumores rectales, cancer de estomago, cancer de esofago, cancer pancreatico, cancer de Idgado, carcinomas mamarios (= cancer de mama), cancer uterino, cancer cervical, leucemia mieloide aguda (AML), leucemia linfoide aguda (ALL), leucemia mieloide cronica (CML), leucemia linfodtica cronica (CLL), hepatomas, diversos tumores inducidos por virus tal como, por ejemplo, carcinomas inducidos por virus de papiloma (por ejemplo carcinoma cervical = cancer cervical), adenocarcinomas, tumores inducidos por virus de herpes (por ejemplo linfoma de Burkitt, linfoma de celula B inducido por EBV), tumores inducidos por heptatitis B (carcinomas hepatocelulares), linfomas inducidos por HTLV-1- y HTLV-2-, neuroma acustico, carcinomas de pulmon (= cancer de pulmon = carcinoma bronquial), carcinomas de pulmon de celula pequena, cancer farmgeo, carcinoma anal, glioblastoma, carcinoma rectal, astrocitoma, tumores del cerebro, retinoblastoma, basalioma, metastasos cerebrales, meduloblastomas, cancer vaginal, cancer pancreatico, cancer testicular, smdrome de Hodgkin, meningiomas, enfermedad de Schneeberger, tumor de hipofisis, Micosis fungoide, carcinoides, neurinoma, espinalioma, linfoma de Burkitt, cancer de laringe, cancer renal, timoma, carcinoma de corpus, cancer de hueso, linfomas de no Hodgkin, cancer uretral, smdrome CUP, tumores de cabeza y cuello, oligodendroglioma, cancer de vulva, cancer intestinal, carcinoma de colon, carcinoma esofagico (= cancer de esofago), implicacion de la verruga, tumores del intestino delgado, craneofaringiomas, carcinoma de ovario, tumores genitales, cancer de ovario (= carcinoma de ovario), carcinoma pancreatico (= cancer pancreatico), carcinoma endometrial, metastasis hepaticas, cancer de pene, cancer de lengua, cancer de vesmula biliar, leucemia, plasmocitoma, tumor de parpado, cancer de prostata (=tumores de prostata), etc. En realizaciones espedficas, el tratamiento de cancer de pulmon (por ejemplo cancer de pulmon de celulas no pequenas o de celulas pequenas) o el cancer de prostata es particularmente preferido.
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Las enfermedades infecciosas en este contexto preferiblemente incluyen enfermedades infecciosas virales, bacterianas o protozoarias. Tales enfermedades infecciosas, preferiblemente enfermedades infecciosas (virales, bacterianas o protozoarias) tipicamente se seleccionan de la lista consistente en infecciones por Acinetobacter, enfermedad Africana del sueno (tripanosomiasis Africana), SIDA (Smdrome de inmunodeficiencia adquirida), Amoebiasis, Anaplasmosis, Antrax, Apendicitis, infeccions por Arcanobacterium haemolyticum, Fiebre hemorragica argentina, Ascariasis, Aspergilosis, infecciones por Astrovirus, pie de atleta, Babesiosis, infecciones de Bacillus cereus, Meningitis bacteriana, Neumoma bacteriana, Vaginosis bacteriana (BV), infecciones Bacteroides, Balantidiasis, infecciones de Baylisascaris, Bilharziosis, infecciones por virus BK, Piedra negra, infecciones por Blastocystis, Blastomicosis, diebre hemorragica Boliviana, infecciones por Borrelia (Borreliosis), Botulismo (y botulismo infantil), Tenia bovina, fiebre hemorragica de Brasil, Brucelosis, infecciones por Burkholderia, ulcera de Buruli, infecciones por Calicivirus (Norovirus y Sapovirus),
Campilobacteriosis, Candidiasis (Candidosis), Infecciones de tenia canina, Enfermedad por aranazo de gato, Enfermedad de Chagas (Tripanosomiasis americana), Chancroide, Varicela, infecciones por Clamidia, infecciones por Chlamydia trachomatis, infecciones por Chlamydophila pneumoniae, Colera, Cromoblastomicosis, Bubo climatico, Clonorquiasis, infecciones por Clostridium difficile, Coccidioidomicosis, resfriado, Fiebre de colorado (CTF), Resfriado comun (Rinofaringitis viral aguda; Coriza aguda), Acuminata del condiloma, Conjuntivitis, enfermedad de Creutzfeldt-Jakob (CJD), Fiebre hemorragica de Crimea-Congo (CCHF), Criptococosis, Criptosporidiosis, Larva cutanea migrans (CLM), Leishmaniosis cutanea, Ciclosporiasis, Cisticercosis, infecciones por Citomegalovirus, Fiebre del dengue, Dermatofitosis,
Dientamoebiasis, Difteria, Difillobotriasis, Donavanosis, Dracunculiasis, Meningoencefalitis de verano temprana (FSME), Fiebre hemorragica de ebola, Equinococosis, Ehrliquiosis, Enterobiasis (Infecciones de oxiuro), infecciones de Enterococcus, infecciones de Enterovirus, Tifus epidermico, Epiglotitis, Mononucleosis
infecciosa de Epstein-Barr, Eritema infeccioso (Quinta enfermedad), Exantema subito, Fasciolopsiasis, Fasciolosis, Insomnio familiar fatal (FFI), Quinta enfermedad, Filariasis, Intoxicacion por pescado (Ciguatera), Tenia de pescado, Gripe, Intoxicacion alimentaria por Clostridium perfringens, Tenia de zorro, Infecciones amebicas disipadas, infecciones por Fusobacterium, Gangrena gaseosa, Geotricosis, smdrome de Gerstmann- Straussler-Scheinker (GSS), Giardiasis, Muermo, Gnatostomiasis, Gonorrea, Granuloma inguinal
(Donovanosis), Infecciones estreptocosicas del grupo A, Infecciones estreptocosicas del grupo B, infecciones por Haemophilus influenzae, Fiebre aftosa de la mano (HFMD), Smdrome pulmonar por Hantavirus (HPS), infecciones por Helicobacter pylori, Smdrome hemolttico-uremico (HUS), Fiebre hemorragica con smdrome renal (HFRS), infecciones por Henipavirus, Hepatitis A, Hepatitis B, Hepatitis C, Hepatitis D, Hepatitis E, Herpes simple, Herpes simple tipo I, Herpes simple tipo II, Herpes zoster, Histoplasmosis, verrugas Hollow, Infecciones del anquilostoma, Infecciones de bocavirus humanos, Ehrlichiosis ewingii humano, Anaplasmosis granulocftica humana (HGA), Infecciones por metapneumovirus humano, Ehrlichiosis monocftica humana, infecciones por Virus de papiloma humano (HPV), Infecciones por virus de parainfluenza humano, Himenolepiasis, Influenza, Isosporiasis, Encefalitis Japonesa, enfermedad de Kawasaki, Queratitis, infecciones por Kingella kingae, Kuru, Lambliasis (Giardiasis), fiebre de Lassa, Legionelosis (Enfermedad del legionario, fiebre de Pontiac), Leishmaniasis, Lepra, Leptospirosis, Piojos, Listeriosis, borreliosis de Lyme, enfermedad de Lyme, Filariasis linfatica (Elefantiasis), Coriomeningitis linfocftica, Malaria, fiebre hemorragica de Marburg (MHF), virus de Marburg, Sarampion, Melioidosis (enfermedad de Whitmore), Meningitis, Enfermedad meningococica, Metagonimiasis, Microsporidiosis, Tenia miniatura, Aborto (inflamacion de prostata), Molluscum contagiosum (MC), Mononucleosis, Paperas, Tifus de murino (Tifus endemico), Micetoma, Mycoplasma hominis, Neumonia por micoplasma, Myiasis, Dermatitis por panal, Conjuntivitis neonatal (Oftalirna neonatal), Sepsis neonatal (Corioamnionitis), Nocardiosis, Noma, infecciones por virus Norwalk, Oncocercosis (Ceguera de los nos), Osteomielitis, Otitis media, Paracoccidioidomicosis (Blastomicosis sudamericana), Paragonimiasis, Paratifoidea, Pasteurelosis, Pediculosis capitis (piojos de cabeza), Pediculosis corporis (piojos de cuerpo), Pediculosis pubis (piojos pubicos, Piojos de cangrejo), Enfermedad inflamatoria pelvica (PID), Tosferina (Tos ferina), Fiebre glandular de Pfeiffer, Plaga, Infecciones neumococicas, Neumoma Pneumocystis (PCP), Neumoma, Polio (cojera infantil), Poliomielitis, Tenia porcina, infecciones por Prevotella, Meningoencefalitis amebiana primaria (PAM), Leucoencefalopatfa multifocal progresiva, Pseudo-grupa, Psitacosis, fiebre Q, fiebre de Conejo, Rabia, Fiebre por mordedura de rata, smdrome de Reiter, infecciones por virus sincitial Respiratorio (RSV), Rinosporidiosis, Infecciones por rinovirus, infecciones por Rickettsial, Rickettsialpox, Fiebre del valle de Rift (RVF), Fiebre manchada montanosa rocosa (RMSF), infecciones por Rotavirus, Rubeola, Salmonella paratifoidea, Salmonella tifus, Salmonelosis, SARS (Smdrome respiratorio agudo grave), Sarna, Escarlatina, Esquistosomiasis (Bilharziosis), Tifus de matorrales, Sepsis, Shigelosis (Disentena bacilar), Herpes, Viruela (Variola), Chancro blando, Esporotricosis, Intoxicacion alimentaria estafilococica, Infecciones por estafilococos, Estrongiloidiasis, Sffilis, Teniasis, Tetanos, Fiebre de tres dfas, Encefalitis transmitida por garrapatas, Tina de la barba (hormigeo de Barber), Tinea capitis (Tina del cuero cabelludo), Tinea corporis (Tina del cuerpo), Tinea cruris (Tina inguinal), Tinea manuum (Tina de la mano), Tinea nigra, Tinea pedis (pie de atleta), Tinea unguium (Onicomicosis), Tinea versicolor (Pitiriasis versicolor), Toxocariasis (Larva Migrans Ocular (OLM) y Larva Migrans Visceral (VLM)), Toxoplasmosis, Triquinosis, Tricomoniasis, Tricuriasis (Infecciones por triquina), Influencia de halucinogenos, Tripanosomiasis (enfermedad del sueno), enfermedad de Tsutsugamushi, Tuberculosis, Tularemia, Tifus, fiebre Tifus, infecciones por Ureaplasma urealyticum, Vaginitis (Colpitis), enfermedad de Creutzfeldt-Jakob Variante (vCJD, nvCJD), Encefalitis equina Venezolana, fiebre hemorragica
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Venezolana, neumoma Viral, Leishmaniosis Visceral, Verrugas, Fiebre del Nilo Occidental, Encefalitis equina occidental, piedra blanca (Tina blanca), Tos ferina, Manchas por hongo de levadura, Fiebre amarilla, infecciones por Yersinia pseudotuberculosis, Yersiniosis, y Cigomicosis.
Son particularmente preferentes enfermedades, particularmente cancer o enfermedades tumorales, asociadas a una sobre-expresion de al menos un miembro de la ruta PD-1, preferiblemente el receptor PD-1 y/o sus ligandos PD-L1 y PD-L2.
En este contexto, es particularmente preferente el tratamiento de melanoma, glioblastoma, y carcinoma de pancreas, pulmon, mama, colon, ovario, y celulas renales, canceres uroteliales, carcinomas de celula escamosa de la cabeza y cuello y carcinoma hepatocelular que se asocia a una sobreexpresion de PD-L1. Es especialmente preferente el tratamiento de cancer de pulmon de celulas no pequenas (NSCLC) o de celulas pequenas asociado a una sobreexpresion de cualquier miembro de la ruta PD-1, particularmente de PD-1 o PD-L1.
En otra realizacion el tratamiento de cancer o enfermedades tumorales asociado a ninguna o a una baja expresion de al menos un miembro de la ruta PD-1, preferiblemente e receptor PD-1 y/o sus ligandos PD-L1 y PD-L2, es particularmente preferente. En este contexto, la vacuna de ARN de la combinacion vacuna/inhibidor inventiva es capaz de inducir la expresion de al menos un miembro de la ruta PD-1, por ejemplo PD-L1, en el paciente a tratar y, por tanto, de permitir la actividad terapeutica del inhibidor PD-1.
De acuerdo con otro aspecto, la presente invencion proporciona un inhibidor de la ruta PD-1 como se define en las reivindicaciones para su uso en terapia en combinacion con una vacuna de ARN que comprende al menos un ARN que comprende al menos un marco de lectura abierto que codifica para al menos un antfgeno como se define en las reivindicaciones, por ejemplo para su uso en un metodo de tratamiento o prevencion de tumores y/o enfermedades de cancer o enfermedades infecciosas como se definen aqrn.
De acuerdo a todavfa otro aspecto, la presente invencion proporciona una vacuna de ARN que comprende al menos un ARN que comprende al menos un marco de lectura abierto que codifica para al menos un antfgeno como se define en las reivindicaciones para su uso en terapia en combinacion con un inhibidor de la ruta PD-1 como se define en las reivindicaciones, por ejemplo para su uso en un metodo de tratamiento o prevencion de tumor y/o enfermedades de cancer o enfermedades infecciosas como se definen aqrn.
Ademas, se describe aqrn un metodo para transfectar y/o tratar una celula, un tejido o un organismo, aplicando o administrando la combinacion vacuna/inhibidor inventiva particularmente con propositos terapeuticos. En este contexto, tipicamente despues de preparar la combinacion vacuna/inhibidor inventiva, la combinacion vacuna/inhibidor inventiva se administra preferiblemente a una celula, un tejido o un organismo, preferiblemente usando cualquiera de los modos de administracion aqrn descritos. El metodo para transfectar y/o tratar una celula se puede llevar a cabo in vitro, in vivo o ex vivo.
Tambien se describe aqrn un metodo de tratamiento no reivindicado que comprende administrar a un sujeto que lo necesita una cantidad terapeuticamente efectiva de una vacuna de ARN que comprende al menos un ARN que comprende al menos un marco de lectura abierto que codifica para al menos un antfgeno como se definio arriba en combinacion con una composicion que comprende un inhibidor de trayectoria PD-1 como se definio arriba.
El metodo no reivindicado preferentemente comprende la transfeccion de celulas aisladas in vitro. As^ las celulas usadas son preferiblemente humanas o animales, particularmente celulas de un cultivo celular primario, que luego se vuelven a transferir a un humano o animal. Antes de la transfeccion, estas celulas tipicamente se afslan del paciente a tratar y se cultivan.
El metodo de tratamiento no reivindicado no comprende la transfeccion de celulas aisladas in vitro. En este caso, la vacuna de ARN como se definio arriba administrada al sujeto que la necesita no comprende celulas aisladas transfectadas con al menos un ARN que comprende al menos un marco de lectura abierto que codifica para al menos un antfgeno comprendido en la vacuna de ARN.
En la presente invencion, si no se indica lo contrario, diferentes rasgos de alternativas y realizaciones se pueden combinar unos con otros. En el contexto de la presente invencion, el termino “que comprende” se puede sustituir por el termino “que consiste en”, donde sea aplicable.
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35
40
Breve descripcion de las figuras
Las figuras mostradas a continuacion son meramente ilustrativas y describen mas detalladamente la invencion. Estas figuras no se consideran limitativas de la presente invencion.
Figura 1: La vacuna de ARN (OVA-RNActive R1710) actua sine^sticamente con anticuerpos anti-PD-
1. Ratones C57 BL/6 fueron tratado v^a subcutanea con 3x105 celulas tumorales syngenic E.G7-OVA el dfa 0 y despues se trataron o bien con una vacuna OVA RNActive (32 mg) sola o en combinacion con un anticuerpo anti-PD-1 o un control IgG (100 mg i.p.) de acuerdo con la forma indicada.
Figura 2: Proporcion de supervivencia de ratones con tumores E.G7-OVA tratados con diferentes
terapias. De acuerdo con el ejemplo 2, los ratones fueron tratados bien con una vacuna OVA RNActive bien con anticuerpos anti PD-1, individualmente o en combinacion.
Figura 3: Secuencia de ARNm optimizada en G/C de R1710 que codifican ovoalbumina de Gallus
gallus comprendida en la vacuna OVA RNActive.
Ejemplos
Los ejemplos mostrados a continuacion son meramente ilustrativos y describen la presente invencion de otra manera. Estos ejemplos no se interpretaran como la de presente invencion.
Ejemplo 1: Preparacion de la vacuna de ARNm
1. Preparacion de constructos de ADN y ARNm
Para los presentes ejemplos, se preparo una secuencia de ADN que codifica ARNm de ovoalbumina de Gallus gallus (R1710) y se uso para las reacciones de transcripcion in vitro posteriores.
De acuerdo con una primera preparacion, se preparo la secuencia de ADN que codifica para el ARNm. El constructo se preparo modificando la secuencia de codificacion tipo natural introduciendo una secuencia optimizada en Gc para la estabilizacion, seguido por una secuencia de estabilizacion derivada de alfa-globina- 3'-UTR (muag (alfa-globin-3'-UTR mutada)), un tramo de 64 adenosinas (secuencia poli-A), un tramo de 30 citosinas (secuencia poli-C) y un bucle tallo de histona. En la SEQ ID NO: 2 (ver Figura 3), se muestra la secuencia de ARNm correspondiente.
2. Transcripcion In vitro
El respectivo plasmido de ADN preparado segun el Ejemplo 1 se transcribio in vitro usando polimerasa T7. Posteriormente el ARNm se purifico usando PureMessenger® (CureVac, Tubingen, Germany).
3. Reactivos
Reactivo de formacion de complejo: protamina
4. Preparacion de la vacuna
El ARNm de R1710 se complejo con protamina por la adicion de protamina al ARNm en la relacion (1:2) (p/p) (componente adyuvante). Despues de la incubacion durante 10 min, se agrego la misma cantidad de ARNm de R1710 libre usado como aRn que proporciona el antfgeno.
Vacuna OVA-RNActive (R1710): comprende un componente adyuvante que consiste en ARNm que codifica para ovoalbumina de Gallus gallus (R1710) segun la SEQ ID NO. 2, formada por complejo con protamina en una relacion 2:1 (p/p) y ARNm libre que proporciona el antfgeno que codifica para la ovoalbumina de Gallus gallus (R1710) segun la SEQ ID NO. (relacion 1:1; ARN complejo: ARN libre).
Ejemplo 2: Combinacion de un anticuerpo anti-PD1 y la vacuna de ARN
El dfa cero, se implanto subcutaneamente a ratones C57BL/6 (flanco derecho) 3x105 celulas E.G.7-OVA por raton (volumen 100 pl en PBS). La E.G7-OVA es una lmea celular de linfoma de celulas T de raton que expresa establemente ovoalbumina de Gallus gallus (OVA). La vacunacion intradermica con la vacuna de ARN que
-45 -
5
10
15
20
25
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45
50
comprende ARNm OVA R1720 (32 jg/ratonMa de vacunacion) (de acuerdo al Ejemplo 1) o Ringer-lactato (RiLa) como solucion tampon control y tratamiento con los anticuerpos monoclonales anti-PD-1/CD279 (100 jg i.p.) o un control isotipo de acuerdo a la Tabla 1 comenzo el dfa 4 y se repitio los dfas 7, 11, 14, 18 y 21. Los animales recibieron la inyeccion de anticuerpo en la manana y se vacunaron en la tarde con un mmimo de cuatro horas entre los tratamientos.
Tabla 1: Grupos de animales
Grupo
Numero de ratones ARN Inyectado por dfa de vacunacion y raton Anticuerpo inyectado por dfa de tratamto. y raton
A
10 100% soluciontampon Ringer Lactato (RiLa) —
B
10 32 jg —
C
6 100 jg anti-PD-1
D
6 32 jg 100 jg anti-PD-1
E
6 _______________32 jg_______________ 100 jg control-IgG2a
El anticuerpo anti-PD-1/CD279 (clon RMP1-14, IgG2a de rata) y el anticuerpo de control de isotipo (clon 2A3, IgG2a de rata) se adquirieron de BioXCell (West Lebanon, NH, USA).
El crecimiento tumoral se vigilo midiendo el tamano del tumor en 2 dimensiones (longitud y ancho) usando un calibrador (a partir del dfa 4). El volumen del tumor se calculo segun la siguiente formula:
Volumen (mm3) = longitud(mm)x n x ancho2(mm2) / 6
Los resultados se muestran en las Figuras 1 y 2.
Como se puede ver en la Figura 1, la vacuna de OVA mARN (OVA-RNActive R1710) sola o en combinacion con control-IgG retarda el crecimiento del tumor por aproximadamente 5 dfas en comparacion con el grupo control tratado con solucion tampon. El tratamiento con anticuerpo anti-PD-1 solo fue comparable con la vacunacion sola, mientras que la aplicacion simultanea de la combinacion vacuna de ARN/anti-PD-1 lleva a una inhibicion del crecimiento tumoral significativa, indicando un efecto sinergico. Las lmeas representan el desarrollo del volumen del tumor medio y las barras de error el SEM. El analisis estadfstico se realizo con Anova de 2 vfas con post-prueba Bonferroni.
Como se puede ver en la Figura 2, la administracion de la vacuna de ARNm OVA (OVA-RNActive R1710) o anticuerpo anti-PD-1 solo ya tema un efecto significativo en la supervivencia, mientras que la aplicacion simultanea de la combinacion vacuna de ARN/anti-PD-1 lleva a un 50% de supervivencia (3 de 6 animales), indicando un efecto sinergico.
LISTADO DE SECUENCIAS
<110> CUREVAC GMBH
<120> COMBINACION DE VACUNACION E INHIBICION DE LA TRAYECTORIA PD-1 <130> CU01P138WO1 <160> 18
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1 <211> 44 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> muag ((alfa-) globina 3' mutada UTR)
<400> 1
gcccgatggg cctcccaacg ggccctcctc ccctccttgc accg 44
<210> 2 <211> 1378 <212> ARN
<213> Secuencia Artificial
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
<220>
<223> mARN correspondiente al constructo de ADN artificial <400> 2
gggagaaagc uuaccauggg cagcaucggg gccgcgucga uggaguucug cuucgacgug 60 uucaaggagc ugaaggucca ccacgccaac gagaacaucu ucuacugccc gaucgccauc 120 augagcgcgc ucgccauggu guaccugggc gccaaggaca gcacccggac gcagaucaac 180 aagguggucc gcuucgacaa gcugcccggc uucggggacu cgaucgaggc gcagugcggc 240 accagcguga acgugcacag cucgcuccgg gacauccuga accagaucac caagccgaac 300 gacgucuaca gcuucagccu ggccucgcgg cucuacgccg aggagcgcua cccgauccug 360 cccgaguacc ugcagugcgu gaaggagcuc uaccggggcg ggcuggagcc gaucaacuuc 420 cagacggcgg ccgaccaggc ccgggagcug aucaacagcu ggguggagag ccagaccaac 480 ggcaucaucc gcaacguccu ccagccgucg agcguggaca gccagaccgc gauggugcug 540 gucaacgcca ucguguucaa gggccugugg gagaagacgu ucaaggacga ggacacccag 600 gccaugcccu uccgggugac cgagcaggag ucgaagccgg uccagaugau guaccagauc 660 gggcucuucc ggguggcgag cauggccagc gagaagauga agauccugga gcugccguuc 720 gccucgggca cgaugagcau gcucgugcug cugcccgacg aggucagcgg ccucgagcag 780 cuggagucga ucaucaacuu cgagaagcug accgagugga ccagcagcaa cgugauggag 840 gagcgcaaga ucaaggugua ccucccgcgg augaagaugg aggagaagua caaccugacg 900 ucgguccuga uggcgauggg gaucaccgac guguucagca gcucggccaa ccucagcggc 960 aucagcucgg ccgagagccu gaagaucagc caggcggugc acgccgccca cgcggagauc 1020 aacgaggccg gccgggaggu cguggggucg gccgaggcgg gcguggacgc cgccagcguc 1080 agcgaggagu uccgcgcgga ccacccguuc cuguucugca ucaagcacau cgccaccaac 1140 gccgugcucu ucuucggccg gugcgugucg cccugaccac uaguuauaag acugacuagc 1200 ccgaugggcc ucccaacggg cccuccuccc cuccuugcac cgagauuaau aaaaaaaaaa 1260 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaugcauc 1320 cccccccccc cccccccccc cccccccccc aaaggcucuu uucagagcca ccagaauu 1378
<210> 3 <211> 7 <212> PRT
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> peptido cationico <400> 3
Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg 1 5
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
<210> 4 <211> 8 <212> PRT
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> peptido cationico <400> 4
Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg 1 5
<210> 5 <211> 9 <212> PRT
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> peptido cationico <400> 5
Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg 1 5
<210> 6 <211> 12 <212> PRT
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> peptido cationico <400> 6
His His His Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg 1 5 10
<210> 7 <211> 12 <212> PRT
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> peptido cationico <400> 7
Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg His His His 1 5 10
<210> 8 <211> 15 <212> PRT
<213> Secuencia Artificial <220>
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
<223> peptido cationico <400> 8
His His His Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg His His His 1 5 10 15
<210> 9 <211> 15 <212> PRT
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> peptido cationico <400> 9
Tyr Ser Ser Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Ser Ser Tyr 1 5 10 15
<210> 10 <211> 12 <212> PRT
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> peptido cationico <400> 10
Arg Lys His Arg Lys His Arg Lys His Arg Lys His 1 5 10
<210> 11 <211> 8 <212> PRT
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> peptido cationico <400> 11
Tyr Arg Lys His Arg Lys His Arg 1 5
<210> 12 <211> 12 <212> PRT
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> peptido cationico <400> 12
Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg 1 5 10
<210> 13
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
<211> 21 <212> PRT
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> peptido cationico <400> 13
His His His His His His Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg His 1 5 10 15
His His His His His 20
<210> 14 <211> 10 <212> PRT
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> peptido cationico <400> 14
His His His Arg Arg Arg Arg His His His 1 5 10
<210> 15 <211> 16 <212> PRT
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> peptido cationico <400> 15
His His His His His His Arg Arg Arg Arg His His His His His His 1 5 10
<210> 16 <211> 15 <212> PRT
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> peptido cationico <400> 16
Tyr Ser Ser Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Ser Ser Tyr 1 5 10 15
<210> 17 <211> 12 <212> PRT
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> peptido cationico <400> 17
15
Arg Lys His Arg Lys His Arg Lys His Arg Lys His 1 5 10
<210> 18 <211> 8 <212> PRT
<213> Secuencia Artificial
10
<220>
<223> peptido cationico
<400> 18 15
Tyr Arg Lys His Arg Lys His Arg 1 5

Claims (17)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    Reivindicaciones
    1. Combinacion de vacuna/inhibidor, que comprende:
    i) como vacuna, una vacuna de ARN que comprende al menos un ARN, donde el al menos un ARN es un ARNm, que comprende al menos un marco de lectura abierto (ORF) que codifica para al menos un antfgeno y
    ii) como inhibidor, una composicion que comprende un inhibidor de la ruta PD-1,
    donde el inhibidor de la ruta PD-1 es un anticuerpo antagonista que esta dirigido contra PD-1.
  2. 2. Combinacion segun la reivindicacion 1, caracterizada porque el anticuerpo dirigido contra PD-1 es BMS- 936558/MDX1106, CT011 o MK-3475.
  3. 3. Combinacion segun la reivindicacion 1 o 2, caracterizada porque el al menos un ARN de la vacuna de ARN es un ARN aislado.
  4. 4. Combinacion segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada porque el al menos un ARN de la vacuna de ARN es un ARN estabilizado.
  5. 5. Combinacion segun cualquiera de las reivindicaciones 1-4, caracterizada porque el al menos un ARN de la vacuna de ARN esta al menos parcialmente G/C-modificado.
  6. 6. Combinacion segun cualquiera de las reivindicaciones 1-5, caracterizada porque el al menos un ARN de la vacuna de ARN comprende una region optimizada por codon.
  7. 7. Combinacion segun cualquiera de las reivindicaciones 1-6, caracterizada porque el al menos un ARN de la vacuna de ARN esta complejado con un portador.
  8. 8. Combinacion segun la reivindicacion 7, caracterizada porque el portador es un compuesto cationico o policationico o un portador polimerico.
  9. 9. Composicion farmaceutica, que comprende:
    i) una vacuna de ARN que comprende al menos un ARN que comprende al menos un marco de lectura abierto que codifica para al menos un antfgeno como se define en cualquiera de las reivindicaciones anteriores y
    ii) un inhibidor de la ruta PD-1 como se define en cualquiera de las reivindicaciones anteriores.
  10. 10. Kit de partes que comprende:
    i) una vacuna de ARN que comprende al menos un ARN que comprende al menos un marco de lectura abierto que codifica para al menos un antfgeno como se define en cualquiera de las reivindicaciones anteriores y
    ii) un inhibidor de la ruta PD-1 como se define en cualquiera de las reivindicaciones anteriores.
  11. 11. Combinacion segun cualquiera de las reivindicaciones 1-8, composicion farmaceutica segun la reivindicacion 9, kit de partes segun la reivindicacion 10 para uso medico.
  12. 12. Combinacion segun cualquiera de las reivindicaciones 1-8, composicion farmaceutica segun la reivindicacion 9, kit de partes segun la reivindicacion 10 para su uso en un metodo para prevenir o tratar un tumor o una enfermedad de cancer o una enfermedad infecciosa.
  13. 13. Combinacion o kit de partes para su uso segun la reivindicacion 11 o 12, caracterizada porque el inhibidor de la ruta PD-1 y la vacuna de ARN son para administrarse a un paciente que lo necesita secuencialmente.
  14. 14. Combinacion o kit de partes para su uso segun la reivindicacion 11 o 12, caracterizada porque el inhibidor de la ruta PD-1 y la vacuna de ARN son para administrarse a un sujeto que lo necesita concurrentemente.j
  15. 15. Combinacion o kit de partes para su uso segun cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14, caracterizado porque
    el inhibidor de la ruta PD-1 y la vacuna de ARN son para administrarse a un sujeto que lo necesita por diferentes vfas de administracion.
  16. 16.
    Inhibidor de la ruta PD-1 como se define en cualquiera de las reivindicaciones anteriores para su uso en terapia en combinacion con una vacuna de ARN como se define en cualquiera de las reivindicaciones anteriores.
  17. 17. 5
    Vacuna de ARN como se define en cualquiera de las reivindicaciones anteriores para su uso en terapia en combinacion con un inhibidor de la ruta PD-1 como se define en cualquiera de las reivindicaciones anteriores.
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