CN103957932A

CN103957932A - 包含最优化的猫白血病病毒包膜基因的重组猫白血病病毒疫苗

Info

Publication number: CN103957932A
Application number: CN201280041551.1A
Authority: CN
Inventors: H·普莱; T·埃德曼
Original assignee: Institut Gustave Roussy (IGR); Merial Ltd
Current assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Institut Gustave Roussy (IGR); Universite Paris Sud Paris 11; Merial Ltd
Priority date: 2011-07-20
Filing date: 2012-02-02
Publication date: 2014-07-30
Anticipated expiration: 2032-02-02
Also published as: CA2842055A1; JP6084970B2; MX2014000625A; IL230460A0; PL2734230T3; EP2734230B1; RS58289B1; CY1125328T1; ZA201400349B; DK2734230T3; AU2012284558A1; US20150030623A1; LT2734230T; JP2017052774A; CA2842055C; IL230460B; JP2014528699A; EP2734230A1; US8895027B2; WO2013012446A1

Abstract

本发明提供包含以及体内或体外表达引发动物或人的抗FeLV的免疫应答的FeLV抗原的载体，包含所述载体和/或FeLV多肽的组合物，抗FeLV免疫接种的方法和用于与这样的方法和组合物一起使用的试剂盒。

Description

包含最优化的猫白血病病毒包膜基因的重组猫白血病病毒疫苗

与相关申请的交叉参考

本申请要求2011年7月20日递交的美国临时申请61/509,912的优先权。

发明领域

本发明涉及用于抵御动物中猫白血病病毒感染的组合物或疫苗。具体地，本发明提供了包含和体内或体外表达引发动物的抗猫白血病病毒的免疫应答的最优化的猫白血病病毒包膜抗原的载体，包括包含所述载体的组合物，抗猫白血病病毒的免疫接种方法以及用于与这样的方法和组合物一起使用的试剂盒。

发明背景

猫白血病病毒(FeLV)是全世界家猫感染的常见原因以及显著的发病率和死亡率的原因。抗原血症的流行可从健康猫中的1至5%变化至病猫中的15至30%(Hosie M.J.等人,Veterinary Records,1989,128,293-297;Braley J.,Feline Practice,1994,22,25-29;Malik R.等人,Australian Veterinary Journal,1997,75,323-327;Arjona A.等人,Journal of Clinical Microbiology,2000,38,3448-3449)。病毒可建立特征在于持续的病毒血症和致命性结果的终生感染。大多数FeLV相关疾病在被感染的动物中持续发生，它们总是严重的并且最有可能是致命的。最常被诊断的病况有淋巴瘤、骨髓性白血病、免疫缺陷和非再生性贫血。感染可通过鉴定和隔离作为传染源的持续性病毒血症的猫来进行控制。疫苗还帮助阻止病毒播散。几种FeLV疫苗是可获得的。它们中的大部分包含灭活的病毒或重组亚单位。它们的效力是有争议的(Sparkes A.H.,Journal of Small Animal Practice,1997,38,187-194)。已观察到了疫苗分解(breakdown)。

备选的方法将是使用重组病毒载体。已就FeLV基因表达测试了金丝雀痘病毒载体，特别是ALVAC载体(Tartaglia J.等人,Journal ofVirology,1993,67,2370-2375;Poulet H.等人,Veterinary Record,2003,153,141-145)。商业重组FeLV疫苗也是可获得的(FeLV,Merial)。

FeLV基因组编码3个基因：编码病毒的主要结构组分的GAG基因、编码包膜糖蛋白的ENV基因和编码聚合酶蛋白的POL基因(Thomsen D.R.,等人,Journal of General Virology,73,1819-1824,1992)。FeLV包膜(ENV)基因编码被细胞酶蛋白水解加工以产生主要包膜糖蛋白gp70和相关跨膜蛋白p15E的gp85前体蛋白(DeNoronha,F.,等人,1978,Virology85:617-621;Nunberg,J.H.,等人,1983,PNAS81:3675-3679)。跨膜蛋白p15E包含在γ反转录病毒间保守的具有免疫抑制性质的序列(Mathes,L.E.等人,1978,Nature)。FeLV包膜糖蛋白是主要免疫原之一并且是FeLV特异性细胞毒性T细胞反应以及中和抗体的靶标(Flynn,J.N.,等人,2002,J.Virol.)。美国专利申请US2008/0008683讨论了能够调节病毒蛋白针对表达其的宿主的免疫抑制性质。FeLV GAG基因编码被蛋白酶(FeLV PRO基因)切割以产生衣壳蛋白的前体多聚蛋白。衣壳蛋白也是主要的免疫原，其诱导FeLV特异性细胞毒性T细胞反应以及中和抗体(Flynn,J.N.,等人,2002,J.Virol.)。POL基因编码3种蛋白质：蛋白酶(PRO)、反转录酶和整合酶。通过基因的蛋白酶部分进行的自加工产生POL区域的所有3种蛋白质(Thomsen D.R.,等人,1992)。

存在对FeLV疫苗的效力和安全性的改善以及在现场条件下的更有效保护的一般需要。

发明概述

本发明的目的可以是下述的任一或所有：提供重组载体或病毒以及用于产生这样的病毒的方法，和提供用于治疗和预防FeLV感染的组合物和/或疫苗以及方法。

本发明提供了重组载体例如重组病毒，例如重组痘病毒，其包含和表达至少一个外源核酸分子，并且所述至少一个外源核酸分子可包含编码来自FeLV蛋白的目标免疫原或表位（例如FeLV ENV和/或FeLV GAG/PRO）的核酸分子。

具体地，本发明提供了重组载体，例如重组病毒，例如重组痘病毒，其包含和表达至少一个外源核酸分子，并且所述至少一个外源核酸分子可包含FeLV多肽和/或其变体或片段。

本发明还提供了包含这样的表达载体或这样的表达载体的表达产物的组合物或疫苗。

本发明还提供了用于诱导抗FeLV的免疫(或免疫原性)或保护性反应的方法，以及用于防止FeLV或由FeLV引起的疾病状态的方法，所述方法包括施用表达载体或所述表达载体的表达产物，或包含表达载体的组合物，或包含表达载体的表达产物的组合物。

本发明还涉及来自病毒的表达产物以及由所述表达产物或其体内表达产生的抗体以及这样的产物和抗体例如在诊断应用中的用途。

这些和其它实施方案被公开，或根据下列详细说明为显然的并且被包含在下列详细说明中。

附图简述

通过实例的方式给出的并且无意将本发明限定于所描述的特定实施方案的下列详细说明可结合通过引用并入本文的附图来进行理解，其中：

图1提供了标识指定给多核苷酸和蛋白质序列的SEQ ID NO的表。

图2描述了pH6C5env(208.2)的质粒图谱。

图3提供了包含FeLV ENV DNA和左右臂(SEQ ID NO:36)以及来自质粒pHCMV-ENV FeLV的FeLV ENV蛋白(SEQ ID NO:7)的质粒pCXL208.2(pH6C5env)片段的序列。

图4提供了质粒pPB713的限制性图谱。

图5提供了FeLV ENV DNA和蛋白质的序列比对。

图6提供了质粒pPB712限制性图谱。

图7显示野生型GAG/PRO DNA(SEQ ID NO:11)与密码子最优化的GAG/PRO DNA(SEQ ID NO:10)之间的DA序列比对。

图8提供了克隆方案。

图9提供了质粒pJY1874.1的限制性图谱。

图10提供了FeLV GAG-PRO蛋白序列。

图11显示了包含臂和插入物的pJY1874.1DNA片段的核苷酸序列(SEQ ID NO:38)。

图12提供了用于产生vCP2294质粒的克隆方案。

图13显示具有引物位置的vCP2294质粒C3区域图谱。

图14描述了vCP2294质粒序列(注释的)。

图15提供了用于产生vCP2296质粒的克隆方案。

图16显示具有引物位置的vCP2296质粒C5区域图谱。

图17提供了用于产生vCP2295质粒的克隆方案。

图18描述了vCP2295质粒序列。

图19是显示攻击后每组平均proviremia的演化的图。

图20是显示攻击后每组平均proviremia的演化和p27状态的图。

图21是显示与p27状态相关的骨髓中的proviremia的图。

图22显示在D35上的FeLV特异性-IFNγ应答。

图23显示在D35上的FeLV特异性(ENV肽混合物1号)IFNγ应答。

图24显示在D35上的FeLV特异性(ENV肽混合物)IL-10应答。

图25显示在D35上的FeLV特异性(GAG/PRO肽混合物)–IL-20应答。

图26a-b显示在D35上的FeLV特异性(ENV刺激)–IFNγ/IL-10比率。

图27显示在D126上的FeLV特异性(GAG/PRO刺激)–IFNγ应答。

图28a显示在D126上的FeLV特异性(ENV刺激)–IL-10应答。

图28b显示在D126上的FeLV特异性(GAG/PRO刺激)–IL-10应答。

图29显示在D35上的FeLV特异性IFNγ/IL-10比率FeLV ENV和GAG/PRO肽混合物。

发明详述

应注意，在本公开、尤其是权利要求中，术语例如“包含”、“包含有”、“包含（comprising）”等可具有美国专利法中归于其的含义；例如，它们可意指“包括”、“包括有”、“包括(including)”等；并且术语例如“基本上由……组成的”和“基本上由……组成”具有美国专利法中归于它们的含义，例如，它们允许未被明确地引述的元素，但不包括在现有技术中发现的或影响本发明的基本或新颖特征的元素。

除非另有所指，否则技术术语按照常规用法来使用。分子生物学中常见术语的定义可见于Benjamin Lewin,Genes V.，由OxfordUniversity Press出版,1994(ISBN0-19-854287-9);Kendrew等人(eds.),The Encyclopedia of Molecular Biology,由Blackwell ScienceLtd.出版的,1994(ISBN0-632-02182-9);和Robert A.Meyers(ed.),Molecular Biology and Biotechnology:a Comprehensive DeskReference,由VCH Publishers,Inc.出版的,1995(ISBN1-56081-569-8)。

除非上下文清楚地另有所指，否则单数术语“一个/一种(a)”、“一个/一种(an)”和“所指物(the)”包括复数所指物。类似地，除非上下文明确地另有所指，否则单词“或”意欲包括“和”。单词“或”意指特定列表的任一个成员并且还包括所述列表的成员的任意组合。

术语“FeLV ENV多肽或DNA”是指任何天然或最优化的/突变的FeLV ENV多肽或DNA，以及它们的衍生物和变体。例如，最优化的/突变的FeLV ENV DNA可以是密码子最优化的FeLV DNA，FeLVENV DNA可被最优化来在FeLV多肽中产生单个氨基酸突变。最优化的/突变的FeLV ENV多肽可包含单个氨基酸突变或双氨基酸突变或多个氨基酸突变。

术语“动物”在本文中用于包括所有哺乳动物、鸟类和鱼。如本文中所使用的动物可选自马科(例如，马)、犬科(例如，狗、狼、狐狸、郊狼、豺)、猫科(例如，狮子、老虎、家猫、野猫、其它大型猫和其它猫科动物包括猎豹和山猫)、牛科(例如，牛)、猪科(例如，猪)、羊类(例如，绵羊、山羊、驼羊、野牛)、禽类(例如，鸡、鸭、鹅、火鸡、鹌鹑、雉鸡、鹦鹉、雀、鹰、乌鸦、驼鸟、鸸鹋和鹤鸵)、灵长类(例如，狐猴、跗猴、猴、长臂猿、人猿)、人和鱼。术语“动物”还包括所有发育阶段（包括胚胎期和胎儿期）的个体动物。

术语“多肽”和“蛋白质”在本文中可互换地使用，以指连续氨基酸残基的聚合物。

术语“核酸”、“核苷酸”和“多核苷酸”是指RNA或DNA及其衍生物，例如包含经修饰的主链的那些。应当理解，本发明提供了包含与本文中描述的那些序列互补的序列的多核苷酸。根据本发明的多核苷酸可以以不同的方式(例如通过化学合成，通过基因克隆等)被制备，并且可采取各种形式(例如线性或分支的，单链或双链的，或其杂交体，引物，探针等)。

术语“基因”被广义地用于指与生物功能相关的多核苷酸的任意区段。因此，基因或多核苷酸包括内含子和外显子（如在基因组序列中），或仅编码序列(如在cDNA中)，例如开放阅读框架(ORF)，始于起始密码子(甲硫氨酸密码子)并终于终止信号(终止密码子)。基因和多核苷酸还可包括调节它们的表达例如转录起始、翻译和转录终止的区域。因此，还包括的是启动子和核糖体结合区域(一般而言，这些调控元件位于编码序列或基因的起始密码子上游约60至250个核苷酸；Doree S M等人;Pandher K等人;Chung J Y等人)、转录终止子(一般而言，终止子位于编码序列或基因的终止密码子下游约50个核苷酸内；WardC K等人)。基因或多核苷酸还指表达mRNA或功能性RNA，或编码特定蛋白质的核酸片段，并且其包括调控序列。

如本文中所用，术语“免疫原性多肽”或“免疫原性片段”是指这样的多肽或多肽的片段：其包含等位基因特异性基序、表位或其它序列从而所述多肽或片段将结合MHC分子并且诱导抗所述免疫原性多肽或免疫原性片段所源自的抗原的细胞毒性T淋巴细胞(“CTL”)应答，和/或B细胞应答(例如，抗体产生)，和/或T辅助淋巴细胞应答，和/或延迟型超敏(DTH)应答。DTH应答是其中T细胞依赖性巨噬细胞活化和炎症引起组织损伤的免疫反应。对抗原的皮下注射的DTH反应常被用作用于细胞介导的免疫的测定。

按照定义，表位是抗原决定簇，其在一旦被施用给宿主，其能够引发体液(B细胞)和/或细胞类型(T细胞)的免疫应答的意义上为免疫活性的。这些是分子上为抗原性的特定化学基团或肽序列。抗体特异性地结合多肽上的特定抗原性表位。表位的具体的、非限制性实例包括多肽中的四至五肽，多糖中的三至五糖苷序列。在动物中，大多数抗原将同时呈递几个或甚至许多抗原性决定簇。这样的多肽还可适格作为免疫原性多肽并且表位可如进一步描述的被鉴定。

“分离的”生物学组分(例如核酸或蛋白质或细胞器)是指与所述组分天然存在于其中的生物体细胞中的其它生物学组分实质上分离或纯化的组分，例如，其它染色体和染色体外DNA和RNA、蛋白质和细胞器。已被“分离”的核酸和蛋白质包括通过标准纯化方法纯化的核酸和蛋白质。此术语还包括通过重组技术以及化学合成制备的核酸和蛋白质。

如本文中所使用的，术语“纯化的”不需要绝对纯度；相反地，其意在作为相对的术语。因此，例如，纯化的多肽制备物是其中多肽比在其天然环境中的所述多肽更加富集的多肽制备物。多肽制备物是基本上纯化的从而多肽代表几个为制备物的总多肽含量的至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%或至少98%的实施方案。这同样适用于多核苷酸。本文中公开的多肽可通过本领域已知的任何方式来纯化。

重组多核苷酸是具有非天然存在的序列或具有通过两个否则分开的序列区段的人工重组产生的序列的多核苷酸。该人工重组通常通过化学合成或更常见地，通过分离的核酸区段的人工操作（例如，通过遗传工程技术）来实现。在一个实施方案中，重组多核苷酸编码融合蛋白。

在一个方面，本发明提供了来自FeLV的最优化的或突变的多肽。在另一个方面，本发明提供了最优化的或突变的FeLV ENV多肽。在另一个方面，本发明提供了最优化的FeLV ENV蛋白，其中突变存在于，但不限于SEQ ID NO:2、4、6、27、28、29、30、31、32、33、34或43的氨基酸位置527处，或SEQ ID NO:7的氨基酸位置533处。在另一个方面，突变是精氨酸(R)、天冬氨酸(D)或甲硫氨酸(M)对SEQ ID NO:2、4、6、27、28、29、30、31、32、33、34或43的氨基酸位置527或者SEQ ID NO:7的氨基酸位置533处的谷氨酸(E)的置换。本领域技术人员理解，基于序列比对，所描述的突变包括未列于本申请中的其它FeLV ENV多肽中相应氨基酸位置处的突变，其中相应的氨基酸位置等同于SEQ ID NO:2、4、6、27、28、29、30、31、32、33、34或43的氨基酸位置527或SEQ ID NO:7的氨基酸位置533。某些FeLV ENV多肽的蛋白质序列比对示例于图1d中。在一个实施方案中，最优化的或突变的FeLV ENV多肽包含SEQ IDNO:6的氨基酸位置527处或FeLV ENV蛋白的相应氨基酸位置处的氨基酸突变。在另一个实施方案中，最优化的或突变的FeLV ENV多肽包括R、D或M对SEQ ID NO:6的氨基酸位置527或FeLV ENV多肽的相应氨基酸位置处的E的氨基酸置换。在另一个实施方案中，最优化的或突变的FeLV ENV多肽包括R对SEQ ID NO:6的氨基酸位置527或FeLV ENV多肽的相应氨基酸位置处的E的氨基酸置换。在另一个实施方案中，突变的FELV ENV多肽具有SEQ ID NO:2,4,7或43中所示的序列。

此外，来自FeLV的多肽的同源物意欲在本发明的范围内。如本文中所用的，术语“同源物”包括直系同源物、类似物和旁系同源物。术语“类似物”是指具有相同或相似功能，但在不相关的生物体中分别进化的两个多核苷酸或多肽。术语“直系同源物”是指来自不同物种，但已通过物种形成从共同的祖先基因进化而来的两个多核苷酸或多肽。通常，直系同源物编码具有相同或相似功能的多肽。术语“旁系同源物”是指通过基因组内的复制而相关的两个多核苷酸或多肽。旁系同源物通常具有不同的功能，但这些功能可以是相关的。野生型FeLV多肽的类似物、直系同源物和旁系同源物可通过翻译后修饰、氨基酸序列差异或二者而与野生型FeLV多肽相异。特别地，本发明的同源物将通常显示与野生型FeLV多肽或多核苷酸序列的全部或部分至少80-85%、85-90%、90-95%或95%、96%、97%、98%、99%的序列同一性，并且将显示相似的功能。

在另一个方面，本发明提供了与具有SEQ ID NO:2,4,6,27,28,29,30,31,32,33或34所示的序列的多肽具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性的最优化或突变的FeLV ENV多肽。

在另一个方面，本发明提供了上文中鉴定的最优化的或突变的FeLV ENV多肽的片段和变体，其可由本领域技术人员使用公知的分子生物学技术来容易地制备。

变体是具有与SEQ ID NO:2、4、6、27、28、29、30、31、32、33或34所示的氨基酸序列至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一的氨基酸序列的同源多肽。

变体包括等位基因变体。术语“等位基因变体”是指包含导致蛋白质的氨基酸序列的变化和存在于天然群体(例如，病毒种类或品种)中的多态性的多核苷酸或多肽。这样的天然等位基因变异通常可引起多核苷酸或多肽中1-5%的变异。等位基因变体可通过对许多不同种类中的目标核酸序列进行测序来鉴定，这可通过使用杂交探针来鉴定那些种类中相同基因的基因座来容易地进行。作为天然等位基因变异的结果和不改变目标基因的功能活性的任何和全部此类核酸变异和所产生的氨基酸多态性或变异均意欲在本发明的范围内。

如本文中所用的，术语“衍生物”或“变体”是指下述多肽或编码多肽的核酸：其具有一个或多个保守性氨基酸变异或其它小的修饰，从而(1)当与野生型多肽相比较时相应的多肽具有基本上等同的功能或(2)针对多肽产生的抗体与野生型多肽免疫反应。这些变体或衍生物包括具有最优化的或突变的FeLV ENV多肽一级氨基酸序列的少数修饰的多肽，所述修饰可产生相较于未修饰的对应多肽具有基本上等同的活性的肽。这样的修饰可以是有意而为的，如通过定点诱变，或可以是自发的。术语“变体”还包括对序列的缺失、添加和置换，只要所述多肽起作用而产生如本文中定义的免疫应答。修饰可以是在不同于SEQ ID NO:2、4、6、27、28、29、30、31、32、33、34或43的位置527或SEQ ID NO:7的氨基酸位置533的氨基酸位置处的任何氨基酸变化。

术语“保守性变异”是指氨基酸残基被另一个生物学上相似的残基替换，或核酸序列的核苷酸的替换，从而所编码的氨基酸残基不改变或为另一个生物学上相似的残基。在这方面，特别优选的置换将通常在性质上是保守的，即在氨基酸的家族内发生的那些置换。例如，氨基酸通常被分成4个家族：(1)酸性的—天冬氨酸或谷氨酸；(2)碱性的—赖氨酸、精氨酸,组氨酸；(3)非极性的--丙氨酸,缬氨酸,亮氨酸,异亮氨酸,脯氨酸,苯丙氨酸,甲硫氨酸,色氨酸；和(4)不带电荷的极性的--甘氨酸,天冬酰胺,谷氨酰胺,半胱氨酸,丝氨酸,苏氨酸,酪氨酸。苯丙氨酸,色氨酸和酪氨酸有时被分类为芳香族氨基酸。保守性变异的实例包括将一个疏水残基例如异亮氨酸,缬氨酸,亮氨酸或甲硫氨酸置换为另一种疏水残基，或将一个极性残基置换为另一个极性残基，例如赖氨酸对精氨酸、谷氨酸对天冬氨酸或谷氨酰胺对天冬酰胺的置换等；或对于生物学活性将没有主要影响的、结构上相关的氨基酸对氨基酸的类似保守替换。具有与参照分子基本上相同的氨基酸序列但具有少量不实质上影响蛋白质的免疫原性的氨基酸置换的蛋白质因而在参照多肽的定义内。所有由这些修饰产生的多肽均被包括在本文中。术语“保守性变异”还包括使用经置换的氨基酸来替代未经置换的亲本氨基酸，条件是针对经置换的多肽产生的抗体也与未经置换的多肽免疫反应。

FeLV ENV多肽的免疫原性片段包括具有SEQ ID NO:2、4、6、7、27、28、29、30、31、32、33、34或43所示的序列的FeLV ENV多肽或其变体的至少8、10、15或20个连续氨基酸、至少21个氨基酸、至少23个氨基酸、至少25个氨基酸或至少30个氨基酸。在另一个实施方案中，FeLV ENV多肽的片段包括在全长FeLV ENV多肽上发现的特定抗原性表位。

确定多肽的片段和表位的程序，例如产生重叠肽文库(Hemmer B.等人)、肽扫描（Pepscan）(Geysen H.M.等人,1984；Geysen H.M.等人，1985；Van der Zee R.等人；Geysen H.M.)和算法(De Groot A.等人；Hoop T.等人；Parker K.等人)可用于本发明的实践，而无需过度实验。一般而言，抗体特异性结合特定抗原表位。具体地，表位的非限制性实例包括多肽中的四至五肽序列，多糖中的三至五糖苷序列。在动物中，大多数抗原将同时呈递几个或甚至许多抗原决定簇。优选地，其中表位是更大分子的蛋白质片段，其将具有与总蛋白质基本上相同的免疫活性。

在一个方面，本发明提供了编码FeLV ENV多肽的多核苷酸。在另一个方面，本发明提供了编码最优化的或突变的FeLV ENV多肽的FeLV ENV多核苷酸，其中突变在SEQ ID NO:2、4、6、27、28、29、30、31、32、33、34或43的氨基酸位置527或SEQ ID NO:7的氨基酸位置533处发生。在另一个方面，FeLV ENV多核苷酸编码最优化的或突变的FeLV ENV多肽，其中突变是精氨酸(R)、天冬氨酸(D)或甲硫氨酸(M)对SEQ ID NO:2、4、6、7、28、29、30、31、32、33、34或43的氨基酸位置527或SEQ ID NO:7的氨基酸位置533处的谷氨酸(E)的置换。在另一个方面，FeLV ENV多肽编码在SEQ IDNO:6的氨基酸位置527处或FeLV ENV蛋白的相应氨基酸位置处具有氨基酸突变的最优化的或突变的FeLV ENV多肽。在另一个方面，FeLV ENV多核苷酸编码在SEQ ID NO:6的氨基酸位置527处或在FeLV ENV多肽的相应氨基酸位置处具有E至R、D或M的氨基酸改变的最优化的或突变的FeLV ENV多肽。在另一个方面，FeLV ENV多核苷酸编码在SEQ ID NO:6的氨基酸位置527处或在FeLV ENV多肽的相应氨基酸位置处具有E至R的氨基酸改变的最优化的或突变的FeLV ENV多肽。在另一个实施方案中，FeLV ENV多核苷酸编码具有SEQ ID NO:2、4、7或43所示的序列的FeLV ENV多肽。在另一个实施方案中，FeLV ENV多核苷酸编码与具有SEQ ID NO:2、4、6、7、27、28、29、30、31、32、33、34或43所示的序列的多肽具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性的FeLV ENV多肽、或保守变体、等位基因变体、同源物或包含这些多肽之一的至少8个或至少10个连续氨基酸的免疫原性片段，或这些多肽的组合。

在另一个方面，本发明提供了与具有SEQ ID NO:12所示序列的多肽具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性的FeLVGAG-PRO多肽。

在另一个方面，本发明提供了具有SEQ ID NO:1、3或5所示的核苷酸序列的FeLV ENV多核苷酸或其变体。在另一个方面，本发明提供了与具有SEQ ID NO:1、3或5所示序列的多核苷酸具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性的FeLV ENV多核苷酸，或其变体。

在另一个方面，本发明提供了与具有SEQ ID NO:10或11所示的序列的多核苷酸具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性的FeLV GAG-PRO多核苷酸或其变体。

这些多核苷酸可包括编码FeLV ENV或GAG-PRO多肽的DNA、cDNA和RNA序列。应理解，所有编码FeLV ENV或GAG-PRO多肽的多核苷酸也包括在本文中，只要它们编码具有所认可的活性的多肽，所述活性例如为对识别所述多肽的抗体的结合、诱导对所述多肽的免疫应答或当给暴露于寄生虫或经受FeLV感染的迹象或症状减轻的受试者施用时对白血病的存活的作用。

本公开的多核苷酸包括作为遗传密码的结果的简并的序列，例如对于特定宿主的最优化的密码子使用。如本文中所用的，“最优化的”是指经遗传工程化以增加其在给定的物种中的表达的多核苷酸。为了提供编码FeLV ENV或GAG-PRO多肽的最优化的多核苷酸，可修饰FeLV ENV或GAG-PRO基因的DNA序列以1)包含在特定物种中高度表达的基因所优选的密码子；2)在核苷酸碱基组成上包含基本上为在所述物种中发现的A+T或G+C含量；3)形成所述物种的起始序列；或4)消除引起RNA的去稳定化、不适当的多腺苷酸化、降解和终止，或形成二级结构发夹或RNA剪接位点的序列。FeLV蛋白在所述物种中的增加的表达可通过利用密码子使用在真核生物和原核生物，或在特定物种中的分布频率来实现。术语“优选密码子使用的频率”是指特定宿主细胞在使用核苷酸密码子来指定给定的氨基酸方面所显示出的偏好。存在20种天然氨基酸，其中大部分由多于一种密码子指定。因此，所有简并的核苷酸序列被包括在本公开中，只要由核苷酸序列编码的FeLV多肽的氨基酸序列在功能上未被改变。

两个氨基酸序列之间的序列同一性可使用标准参数，通过NCBI(国家生物技术信息中心)配对blast和blosum62矩阵来确立(参见，例如，可在“国家生物技术信息中心”(NCBI,Bethesda,Md.,USA)服务器上以及在Altschul等人中可获得的BLAST或BLASTX算法；从而，该文献通过术语“blasts”提及使用算法或BLAST或BLASTX和BLOSUM62矩阵)。

两个核苷酸序列之间的序列同一性还可使用Myers和Miller(“Optimal Alignments in Linear Space”,CABIOS4,11-17,1988)的、且可在NCBI获得的“Align”程序确定，以及可通过英特网在其网站例如NCBI网站上获得的相同或其它的程序来确定。

备选地或此外，术语“同一性”（例如关于核苷酸或氨基酸序列时），可表示两个序列之间的同源性的定量量度。百分比序列同源性可被计算为：

(N_ref-N_dif)*100/N_ref,其中N_dif是当比对时两个序列中不相同的残基的总数并且其中N_ref是序列之一中的残基的数目。因此，DNA序列AGTCAGTC将与序列AATCAATC(N_ref=8；N_dif=2)具有75%的序列同一性。

备选地或此外，关于序列的“同一性”可指具有相同的核苷酸或氨基酸的位置的数目除以两个序列中较短序列的核苷酸或氨基酸数目，其中两个序列的比对可按照Wilbur和Lipman算法(Wilbur和Lipman)确定（例如使用20个核苷酸的窗口大小、4个核苷酸的字长和为4的缺口罚分），并且包括比对的序列数据的计算机辅助分析和解释可使用商购可得的程序(例如，Intelligenetics^TMSuite,Intelligenetics Inc.CA)来方便地进行。当RNA序列被认为是相似的，或与DNA序列具有一定程度的序列同一性或同源性时，DNA序列中的胸苷(T)被认为等同于RNA序列中的尿嘧啶(U)。因此，RNA序列在本发明的范围内，并且可通过将DNA序列中的胸苷(T)认为等同于RNA序列中的尿嘧啶(U)而衍生自DNA序列。

两个氨基酸序列的序列同一性或序列相似性或两个核苷酸序列之间的序列同一性可使用Vector NTI软件包(Invitrogen,1600FaradayAve.,Carlsbad,CA)来确定。

FeLV ENV或GAG-PRO多核苷酸可包括被整合到载体、自主复制的质粒或病毒、或者原核或真核生物的基因组DNA中的重组DNA，或作为独立于其它序列的单独的分子(例如，cDAN)存在的重组DNA。

本文中公开的重组载体可包括编码多肽、其变体或其片段的多核苷酸。重组载体可包括质粒和病毒载体并且可用于体外或体内表达。重组载体还可包括信号肽。信号肽是指导蛋白质(其在细胞溶质中被合成)至某些细胞器（例如细胞核、线粒体基质、内质网、叶绿体、非原质体和过氧化物酶体）的翻译后运输的短肽链(3-60个氨基酸长)。通常地，天然存在的FeLV ENV蛋白可被翻译为前体，其具有N末端信号肽序列和“成熟的”蛋白质结构域。信号肽可在翻译后被快速切掉。信号序列可以是来自FeLV ENV蛋白的天然序列或来自经分泌的蛋白的肽信号，例如来自组织纤溶酶原激活蛋白(tPA)、特别是人tPA(S.Friezner Degen等人；R.Rickles等人；D.Berg.等人)的信号肽，或来自胰岛素样生长因子1(IGF1)、特别是马IGF1(K.Otte等人)、犬IGF1(P.Delafontaine等人)、猫科IGF1(WO03/022886)、牛IGF1(S.Lien等人)、猪IGF1(M.Muller等人)、鸡IGF1(Y.Kajimoto等人)、火鸡IGF1(GenBank登录号AF074980)的信号肽。来自IGF1的信号肽可以是天然的或是最优化的，这可通过除去隐蔽剪接位点和/或通过改变密码使用来实现。翻译后，可在切割位点切割未加工的多肽以产生成熟的多肽。切割位点可使用Von Heijne的方法(1986)来预测。

质粒可包括DNA转录单元，例如允许其在宿主细胞中复制的核酸序列，例如复制起点(原核生物或真核生物的)。质粒还可包括一个或多个可选择的标记物基因和本领域已知的其它遗传元件。质粒的环状和线性形式被包括在本公开中。

在其它方面，本发明涉及包含多核苷酸序列的体内表达载体，其包含并在宿主体内表达最优化的或突变的FeLV ENV多肽和/或其变体或片段。表达载体还可包含编码FeLV GAG-PRO多肽和/或其变体或片段的多核苷酸。

体内表达载体可包括含有目标多核苷酸或基因以及用于其体内表达的那些必需元件的任何转录单元。这些表达载体可以是质粒或重组病毒载体。对于体内表达，启动子可以是病毒或细胞来源的。在一个实施方案中，启动子可以是巨细胞病毒(CMV)早期启动子(CMV-IE启动子)、SV40病毒早期或晚期启动子或劳斯肉瘤病毒LTR启动子、细胞骨架基因的启动子例如肌间线蛋白启动子(Kwissa M.等人)，或肌动蛋白启动子(Miyazaki J.等人)。当几个基因存在于同一质粒中时，可在相同的转录单元或在不同的单元中提供它们。

如本文中所用的，术语“质粒”可包括含有根据本发明的多核苷酸和其在所需宿主或靶标的细胞中体内表达所必需的元件的任何DNA转录单元；并且在这方面，应注意超螺旋或非超螺旋的环状质粒以及线性形式意欲在本发明的范围内。质粒还可包括其它转录调控元件例如内含子类型的稳定化序列。在几个实施方案中，质粒可包括CMV-IE的第一内含子(WO89/01036)、兔β珠蛋白基因的内含子II(van Ooyen等人)、由组织纤溶酶原激活物编码的蛋白质的信号序列(tPA；Montgomery等人)和/或多腺苷酸化信号(polyA)，特别是牛生长激素(bGH)基因的polyA(US5,122,458)或兔β-珠蛋白基因或SV40病毒的polyA。

在其它方面，本发明涉及组合物，其包含：a)体内表达载体，其中所述载体包含编码一个或多个选自FeLV ENV多肽、FeLV ENV多肽的变体或片段以及其混合物的多肽；和b)药学上或兽医上可接受的媒介物、稀释剂或赋形剂。

在另一个方面，本发明涉及组合物，所述组合物包含：a)体内表达载体，其中所述载体包含编码一种或多种选自FeLV ENV多肽、FeLV GAG/PRO多肽、FeLV ENV多肽的变体或片段以及其混合物的多肽的多核苷酸；和b)药学上或兽医学可接受的媒介物、稀释剂或赋形剂。

在另一个方面，本发明涉及组合物，其包含：a)体内表达载体，其中所述载体包含编码FeLV ENV多肽、FeLV GAG/PRO多肽的多核苷酸；和b)药学上或兽医上可接受的媒介物、稀释剂或赋形剂。

FeLV ENV和FeLV GAG/PRO多肽描述于上文中。

在一个实施方案中，本发明涉及组合物，其包含：a)体内表达载体，其中所述载体包含编码在SEQ ID NO:6的氨基酸位置527处或FeLV多肽的相应氨基酸位置处具有R、D或M对E的氨基酸置换的最优化的或突变的FeLV ENV的多核苷酸，和编码与具有SEQ IDNO:12所示的序列的多核苷酸具有至少90%的同一性的FeLVGAG/PRO多肽的多核苷酸；和b)药学上或兽医上可接受的媒介物、稀释剂或赋形剂。在另一个实施方案中，本发明的组合物包含：a)表达载体，其包含编码具有SEQ ID NO:2或4所示的氨基酸序列的FeLVENV多肽的第一多核苷酸和编码具有SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列的FeLV GAG/PRO多肽的第二多核苷酸；和b)药学上或兽医上可接受的媒介物、稀释剂或赋形剂。

术语“组合物”包含任何疫苗或免疫组合物，其一旦被注射入宿主(包括犬科、猫科和人)，就诱导宿主的免疫应答和/或保护宿主免患白血病，和/或其可防止寄生虫的植入，和/或其可防止被感染的受试者中的疾病进展，和/或其可限制逃离的寄生物至内部器官的扩散。这可在根据本发明的疫苗接种后，通过诱导细胞因子分泌（特别是IFN-γ分泌）(作为测量IFN-γ分泌的方法的实例，可使用来自R&D SystemsInc.的免疫测定(目录号#CAIF00)(Djoba Siawaya JF等人))来实现。

使用的药学上可接受的媒介物或赋形剂是常规的。Remington'sPharmaceutical Sciences,by E.W.Martin,Mack Publishing Co.,Easton,PA,第15版(1975)描述了适用于本文中公开的多肽、质粒、病毒载体的药物递送的组合物和制剂。一般而言，媒介物或赋形剂的性质将取决于所采用的特定施用模式。例如，亲代制剂通常包含可注射的液体，其包括药学和生理上可接受的液体例如水、生理盐水、平衡盐溶液、含水葡萄糖、甘油等作为媒介物。对于固体组合物(例如，冷冻干燥的锭剂、粉剂、丸剂、片剂或胶囊形式)，常规非毒性固体媒介物或赋形剂可包括例如药物级的甘露醇、乳糖、淀粉或硬脂酸镁。除了生物学上中性的媒介物或赋形剂外，待施用的免疫原性组合物可包含少量非毒性辅助物质例如湿润剂或乳化剂、防腐剂和pH缓冲剂等，例如醋酸钠或脱水山梨糖醇单月桂酸酯。

根据本发明的组合物或疫苗可包括编码上述根据本发明的任何多核苷酸的载体。

可使用不同的插入位点或使用相同的插入位点在同一载体中进行多个插入。当使用同一插入位点时，可将可以是前述本发明的任何多核苷酸的每一个多核苷酸插入物插入在相同和/或不同启动子的控制之下。可尾对尾、头对头、尾对头或头对尾地进行插入。还可将IRES元件(内部核糖体进入位点，参见EP0803573)用于分隔和表达可操作地连接至相同和/或不同启动子的多个插入物。

在一个实施方案中，本发明涉及包含前述多核苷酸的表达载体。所述表达载体可以是体内表达载体或体外表达载体。

更常见地，本发明包括体内表达载体，其包括含有且在宿主中体内表达FeLV ENV多肽、其变体或其片段的多核苷酸或基因以及其在体内表达所必需的元件的任何质粒(EP-A2-1001025；Chaudhuri P.)。

在具体的非限制性实例中，pVR1020或pVR1012质粒(VICALInc.；Luke C.等人；Hartikka J.等人)、pVR2001-TOPA(或pVR2001-TOPO)(Oliveira F.等人)或pAB110(US6,852,705)可被用作用于插入多核苷酸序列的载体。pVR1020质粒来源于pVR1012并且包含人tPA信号序列。pVR1020是可从Vical,Inc.,(San Diego,CA)获得的先前已被使用的质粒主链，参见，例如，美国专利号6,451,769和7,078,507。如Oliveira等人中所述，质粒pVR2001-TOPO(或pVR2001-TOPA)是经如下修饰的pVR1020：添加侧翼于克隆位点的拓扑异构酶，并且包括编码和表达信号分泌肽例如组织纤溶酶原激活物信号肽(tPA)，这增加产生分泌的蛋白的可能性(参见Oliveira F.等人中的图1)。

每一个质粒可包括或包含可操作地连接至启动子或处于启动子的控制之下或依赖于启动子的根据本发明的多核苷酸或基本上由所述多核苷酸组成，其中启动子可以有利地与所期望表达的多核苷酸邻近。一般而言，采用在真核细胞中起作用的强启动子是有利的。有用的启动子的一个实例可以是人或鼠来源的立即早期巨细胞病毒启动子(CMV-IE)，或其可任选地具有另一个来源例如来自大鼠或豚鼠。CMV-IE启动子可包含实际的启动子部分，其可以与或可以不与增强子部分结合。可参考EP260148,EP323597,US5,168,062,5,385,839和4,968,615以及参考WO87/03905。CMV-IE启动子可以有利地是人CMV-IE(Boshart M.等人)或鼠CMV-IE。在更一般的术语中，启动子可具有病毒或细胞来源。除CMV-IE外可有用地用于实施本发明的强病毒启动子是SV40病毒的早期/晚期或启动子或劳斯肉瘤病毒的LTR启动子。可有用地用于实施本发明的强细胞启动子是细胞骨架的基因的启动子例如肌间线蛋白启动子(Kwissa M.等人)或肌动蛋白启动子(Miyazaki J.等人)。这些启动子的功能性亚片段，即这些启动子的维持足够的启动子活性的部分，被包括在本发明中，例如根据WO98/00166或US6,156,567的截短的CMV-IE启动子，并且可用于实施本发明。在实施本发明中有用的启动子因而可包括全长启动子的衍生物和/或亚片段，所述衍生物和/或亚片段可维持足够的启动子活性，并因而作为启动子起作用，并且其可有利地具有与所述衍生物或亚片段所源自的实际或全长启动子的活性实质上相似的启动子活性，例如类似于US6,156,567的截短的CMV-IE启动子的活性相较于全长CMV-IE启动子的活性。因此，用于实施本发明的CMV-IE启动子可包含全长启动子的启动子部分和/或全长启动子的增强子部分以及其衍生物和/或亚片段，或基本上由它们组成，或由它们组成。

有利地，质粒包含其它表达控制元件或基本上由所述元件组成。特别有利地是整合稳定化序列，例如内含子序列，例如hCMV-IE的第一内含子(WO89/01036)、兔β-珠蛋白基因的内含子II(van Ooyen等人)。关于质粒和痘病毒以外的病毒载体的多腺苷酸化信号(polyA)，可使用牛生长激素(bGH)基因的poly(A)信号(参见US5,122,458)或兔β-珠蛋白基因的poly(A)信号或SV40病毒的poly(A)信号。

更一般地，本发明包括体内表达载体，包括含有编码一个或多个FeLV ENV和/或其变体或片段的多核苷酸或基因(包括其体内表达所必需的任何元件)的任何重组病毒载体。

所述重组病毒载体可选自例如痘病毒，特别是禽痘病毒例如鸟痘(fowlpox)病毒或金丝雀痘病毒。在一个实施方案中，鸟痘病毒是TROVAC(参见WO96/40241)。在另一个实施方案中，金丝雀痘载体是ALVAC。这些重组病毒载体的使用以及目标多核苷酸或基因的插入在US5,174,993；US5,505,941和US5,766,599(对于鸟痘病毒)中和US5,756,103(对于金丝雀痘)中被充分描述。病毒基因组内超过一个插入位点可被用于多个目标基因的插入。

在一个实施方案中，病毒载体是腺病毒，例如人腺病毒(HAV)或犬科腺病毒(CAV)。

在另一个实施方案中，病毒载体是人腺病毒，特别是血清型5腺病毒，其通过病毒基因组的E1区域中的缺失而使得不能复制，特别是参照在登录号M73260下于Genbank中和引用的出版物Chroboczek等人,1992中公开的hAd5的序列的约核苷酸459至约核苷酸3510。在表达E1的293(Graham等人,1977)或PER细胞，特别是PER.C6(Falloux等人,1998)中繁殖经缺失的腺病毒。人腺病毒可另外地或备选地在E3区域中有缺失，特别是从约核苷酸28592至约核苷酸30470。可将E1区域中的缺失与E3区域中的缺失组合进行(参见，例如，Shriver等人；Graham等人；Ilan等人；美国专利号6,133,028和6,692,956；Tripathy等人；Tapnell；Danthinne等人；Berkner；Berkner等人；Chavier等人)。在E1和/或E3区域的部分或完全缺失后，插入位点最终可以是E1和/或E3基因座(区域)。有利地，当表达载体是腺病毒时，将待表达的多核苷酸插入在于真核生物细胞中具有功能的启动子的控制之下，所述启动子例如为强启动子，有利地为巨细胞病毒立即-早期基因启动子(CMV-IE启动子)，特别是Boshart等人中的约核苷酸–734至约核苷酸+7的增强子/启动子区域，或来自Promega Corp的pCI载体的增强子/启动子区域。CMV-IE启动子有利地为鼠或人来源的。也可使用延伸因子1α的启动子。还可使用肌肉特异性启动子(Li等人)。在本申请中还关于质粒载体讨论了强启动子。在一个实施方案中，剪接序列可位于增强子/启动子区域的下游。例如，从CMV-IE基因分离的内含子1(Stenberg等人)，从兔或人β-珠蛋白基因分离的内含子，特别是来自β-珠蛋白基因的内含子2，从免疫球蛋白基因分离的内含子，来自SV40早期基因的剪接序列或从来自Promege Corp的pCI载体分离的嵌合内含子序列。可将poly(A)序列和终止子序列插入在待表达的多核苷酸下游，所述待表达的多核苷酸例如为牛生长激素基因，特别是具有GenBank登录号BOVGHRH的序列的约核苷酸2339至约核苷酸2550，兔β-珠蛋白基因或SV40晚期基因多腺苷酸化信号。

在另一个实施方案中，病毒载体是犬腺病毒，特别是CAV-2(参见，例如Fischer等人；美国专利号5,529,780和5,688,920；WO95/14102)。对于CAV，插入位点可在E3区域中和/或在位于E4区域与右ITR区域之间的区域中(参见美国专利号6,090,393和6,156,567)。在一个实施方案中，插入物处于启动子例如巨细胞病毒立即早期基因启动子(CMV-IE启动子)或已对于人腺病毒载体进行了描述的启动子的控制之下。可将poly(A)序列和终止子序列插入到待表达的多核苷酸例如牛生长激素基因或兔β-珠蛋白基因多腺苷酸化信号的下游。

在另一个实施方案中，病毒载体是疱疹病毒例如猫疱疹病毒(FHV)。在一个实施方案中，将待表达的多核苷酸插入到于真核细胞中具有功能的启动子（有利地为CMV-IE启动子(鼠或人)）的控制之下。可将poly(A)序列和终止子序列插入到待表达的多核苷酸（例如牛生长激素或兔β-珠蛋白基因多腺苷酸化信号）的下游。

对于基于痘病毒载体的重组载体，可使用痘苗病毒或减毒的牛痘病毒(例如，MVA，为在鸡胚成纤维细胞上进行超过570次安卡拉疫苗株(Ankara vaccine strain)传代后获得的改良安卡拉株；参见Stickl&Hochstein-Mintzel；Sutter等人；可作为ATCC VR-1508获得获得的；或NYVAC,参见US5,494,807和美国专利号5,494,807，所述专利讨论了NYVAC的构建，以及具有从Copenhagen株牛痘病毒基因组缺失的额外ORF的NYVAC的变异，以及异源编码核酸分子至该重组体的位点的插入，以及使用匹配的启动子；也参见WO96/40241)、禽痘病毒或减毒的禽痘病毒(例如，金丝雀痘、鸟痘、dovepox、鸽痘、鹌鹑痘、ALVAC或TROVAC；参见，例如，美国专利号5,505,941,5,494,807)。减毒金丝雀痘病毒被描述于US5,756,103(ALVAC)和WO01/05934中。也参考US5,766,599，其涉及减毒的鸟痘株TROVAC。参考可在登录号VR-111下从ATCC获得的金丝雀痘。许多鸟痘病毒疫苗接种株也是可获得的，例如由MERIAL市售的DIFTOSEC CT和由INTERVET市售的NOBILISVARIOLE疫苗。关于用于产生其重组体和如何施用其重组体的方法的信息，本领域技术人员可参考本文中引用的文献和WO90/12882，例如关于牛痘病毒，特别地，参考美国专利号4,769,330、4,722,848、4,603,112、5,110,587、5,494,807和5,762,938；关于鸟痘，特别地，参考美国专利号5,174,993、5,505,941和5,766,599；关于金丝雀痘，特别地，参考美国专利号5,756,103。当表达载体是牛痘病毒时，待表达的多核苷酸的插入位点有利地在胸苷激酶(TK)基因或插入位点处，血凝素(HA)基因或插入位点处，编码A型包涵体(ATI)的区域；也参见本文中引用的文献，特别是与牛痘病毒相关的那些文献。在金丝雀痘的情形中，有利地插入位点是ORF C3、C5和/或C6；也参见本文中引用的文献，特别是涉及金丝雀痘病毒的那些文献。在鸟痘的情形中，有利地是插入位点是ORF F7和/或F8；也参见本文中引用的文献，特别是涉及鸟痘病毒的那些文献。MVA病毒的插入位点有利地是如各种出版物中的，所述出版物包括Carroll M.W.等人；Stittelaar K.J.等人；Sutter G.等人；并且，在这方面，还注意到，完全MVA基因组被描述于Antoine G.,Virology中，其使得本领域技术人员能够使用其它插入位点或其它启动子。有利地，将待表达的多核苷酸插入在特定痘病毒启动子（例如，特别是，牛痘启动子7.5kDa(Cochran等人)、牛痘启动子I3L(Riviere等人)、牛痘启动子HA(Shida)、牛痘启动子ATI(Funahashi等人)、牛痘启动子H6(Taylor J.等人；GuoP.等人J.；Perkus M.等人)）的控制之下。

此处公开的多核苷酸的任一个可通过将DNA或表达载体转移到适当的宿主细胞中来体外表达。宿主细胞可以是原核或真核的。术语“宿主”还包括主题宿主细胞的任何后代。稳定转移(意指外源多核苷酸被持续地维持在宿主细胞中)的方法是本领域中已知的。宿主细胞可包括细菌(例如，大肠杆菌(Escherichia coli))、酵母、昆虫细胞和脊椎动物细胞。在真核细胞中表达DNA序列的方法是本领域中熟知的。作为用于体外表达的方法，可将重组杆状病毒载体(例如，苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcNPV))与本文中公开的核酸一起使用。例如，可将多角体蛋白启动子与昆虫细胞(例如，草地贪夜蛾细胞，如可在登录号CRL1711下于ATCC获得的Sf9细胞，或Sf21细胞)一起使用(参见例如，Smith等人；Pennock等人；Vialard等人；Verne A.；O'Reilly等人；Kidd I.M.&Emery V.C.；EP0370573；EP0265785；US4,745,051)。关于表达，可使用来自Pharmingen(BectonDickinson)的BaculoGold Starter Package(Cat#21001K)。作为用于体外表达的方法，可将重组大肠杆菌与载体一起使用。例如，当在细菌系统中克隆时，可使用可诱导的启动子例如阿拉伯糖启动子、噬菌体λ的pL、plac、ptrp、ptac(ptrp-lac杂合启动子)等。可通过本领域技术人员公知的常规技术来用重组DNA转化宿主细胞。当宿主是原核生物例如大肠杆菌时，可从在指数生长期后收获、随后使用本领域公知的方法通过CaCl2法处理的细胞制备能够摄取DNA的感受态细胞。备选地，可使用MgCl2或RbCl。还可通过电穿孔进行转化。当宿主是真核生物时，可使用DNA转导（如磷酸钙沉淀）、常规机械程序（例如显微注射）、电穿孔、封装在脂质体中的质粒的插入或病毒载体的方法。真核细胞还可用L.Iongipalpis多核苷酸序列和编码可选择表型的第二外来DNA分子（例如单纯疱疹-胸腺激酶基因）来共转化。另一种方法是使用真核生物病毒载体(参见上文)例如疱疹病毒或腺病毒(例如，犬腺病毒2)来瞬时转导真核细胞和表达蛋白质(Gluzman EA)。此外，可使用转染剂例如二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)。

可通过常规方式来进行重组表达的多肽的分离和纯化，所述常规方法包括制备层析法(例如，尺寸排阻、离子交换、亲和)、选择性沉淀和超滤。可使用但不限于的现有技术的实例可见于“ProteinPurification Applications”,第二版，由Simon Roe编著，并且可在Oxford University Press获得。此种重组表达的多肽是本公开的一部分分。还包括了用于产生上文中描述的根据本发明的任何多肽的方法，特别是包含根据本公开的多核苷酸的重组表达载体和宿主细胞的使用。

可冷冻干燥（有利地利用稳定剂）包含根据本发明的重组病毒载体的疫苗。可按照公知的标准冻干方法进行冷冻干燥。药学上或兽医上可接受的稳定剂可以是糖类(例如山梨醇、甘露醇、乳糖、蔗糖、葡萄糖、葡聚糖、海藻糖)、谷氨酸钠(Tsvetkov T等人；Israeli E等人)、蛋白质例如蛋白胨、白蛋白、乳清蛋白或酪蛋白、含蛋白质试剂例如脱脂奶(Mills C K等人；Wolff E等人)和缓冲剂(例如磷酸盐缓冲剂、碱金属磷酸盐缓冲剂)。可使用佐剂来使得冻干的制备物可溶。

根据本发明的任何疫苗组合物还可有利地包含一种或多种佐剂。

基于质粒的疫苗可用阳离子脂质，有利地用DMRIE(N-(2-羟乙基)-N,N-二甲基-2,3-双(十四烷氧基)-1-丙铵；WO96/34109)来配制，并且有利地与中性脂质例如DOPE(二油酰磷脂酰乙醇胺；Behr J.P.)结合，从而形成DMRIE-DOPE。在一个实施方案中，混合物被临时制成，在其施用前，有利地等待约10min至约60min（例如约30min）用于适当的混合。当使用DOPE时，DMRIE/DOPE的摩尔比可以为95/5至5/95，并且有利地为1/1。质粒/DMRIE或DMRIE-DOPE佐剂的重量比是例如50/1至1/10，10/1至1/5或1/1至1/2。

任选地，可将细胞因子添加至组合物，特别是诱导Th1的GM-CSF或细胞因子(例如IL12)。可将这些细胞因子添加至组合物作为编码细胞因子蛋白的质粒。在一个实施方案中，细胞因子来自犬来源，例如基因序列已放置在GenBank数据库(登录号S49738)中的犬GM-CSF。该序列可用于以与在WO00/77210中所进行的方式相似的方式产生所述质粒。

可将基于重组病毒载体的疫苗与fMLP(N-甲酰基-甲硫氨酰基-亮氨酰-苯丙氨酸；US6,017,537)和/或卡波姆佐剂(Phameuropa第8卷,No.2,June1996)组合。本领域技术人员还可参考US2,909,462，其描述了利用多羟基化合物交联的此种丙烯酸类聚合物，所述多羟基化合物具有至少3个羟基（有利地不超过8个），至少3个羟基的氢原子被具有至少2个碳原子的不饱和脂肪族原子团取代。例如，所述原子团是包含2至4个碳原子的那些，例如乙烯基,烯丙基和其它烯属不饱和基团。不饱和原子团本身可包含其它取代基例如甲基。在名称(BF Goodrich,Ohio,USA)下销售的产品是适当的。所述产品用烯丙基蔗糖或用烯丙基季戊四醇交联。其中，可有利地提及974P、934P和971P。

在马来酸酐与烯基衍生物的共聚物当中，为马来酸酐与乙烯的共聚物(线性的或交联的，例如用二乙烯醚交联的)的共聚物(Monsanto)是有利的。可参考J.Fields等人。

所述丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物和共聚物由例如下式

的基本单元形成，其中：

-R₁和R₂，其是相同的或不同的，代表H或CH₃

-x=0或1,优选x=1

-y=1或2,x+y=2

对于共聚物x=0并且y=2。对于卡波姆，x=y=1。

这些聚合物在水中的溶解导致酸性溶液，其被中和（有利地至生理学pH），以提供将疫苗本身掺入其中的佐剂溶液。聚合物的羧基从而部分为COO-形式。

在一个实施方案中，在蒸馏水中，有利地在氯化钠的存在下，制备佐剂溶液特别是卡波姆的溶液(Pharmeuropa,第8卷,No.2,June1996)，所获得的溶液呈酸性pH。通过将其（或其主要部分）添加至所需量的(用以获得所需的终浓度)含有NaCl的水（有利地生理盐水(NaCl9g/l)）而稀释此储液，同时以几个部分进行伴随的或随后的中和（有利地用NaOH进行）(pH7.3至7.4)。将具有生理pH的该溶液用于与疫苗混合，所述疫苗可特别是以冻干的液体或冷冻形式贮存的。

最终的疫苗组合物中的聚合物浓度可以为0.01%至2%w/v、0.06至1%w/v或0.1至0.6%w/v。

可将亚单位疫苗与佐剂（如基于矿物油和/或植物油和非离子性表面活性剂例如嵌段共聚物、的水包油、水包油包水乳剂）组合。这样的乳剂特别是“Vaccine Design–The Subunit andAdjuvant Approach”,Pharmaceutical Biotechnology,1995的第147页中描述的那些，或TS乳剂，特别是TS6乳剂和LF乳剂，特别是LF2乳剂(关于TS和LF乳剂，参见WO04/024027)。其它适当的佐剂是例如维生素E、皂苷类和(Noveon；参见WO99/51269；WO99/44633)、氢氧化铝或磷酸铝(“Vaccine Design,The subunit andadjuvant approach”,Pharmaceutical Biotechnology,第6卷,1995)、生物佐剂(即C4b,特别是鼠C4b(Ogata R T等人)或马C4b、GM-CSF，特别是马GM-CSF(US6,645,740))、毒素(即霍乱毒素CTA或CTB、大肠杆菌不耐热毒素LTA或LTB(Olsen C W等人；FingerutE等人；Zurbriggen R等人Peppoloni S等人)和CpG(即CpG#2395(参见Jurk M等人)、CpG#2142(参见EP1,221,955中的SEQ.ID.NO:890)。

组合物或疫苗还可包含或包括一种或多种FeLV抗原例如ENV或ENV和GAG，或ENV和GAG以及PRO基因。

还可将组合物或疫苗与至少一种FeLV抗原例如灭活的FeLV结合。在具体实施方案中，FeLV株可以是FeLV A型株，或FeLV A型与B型的组合，或FeLV A型与C型的组合，或A型、B型与C型株的组合。FeLV的这些株可通过化学或物理方法灭活。化学方法特别是BPL、甲醛。物理方法可特别地是超声处理。用于灭活用于疫苗的FeLV的一种方法被描述于R.Cordeiro Giunchetti等人,Vaccine,2007中。可将灭活的FeLV疫苗与佐剂（如先前对于亚单位疫苗描述的那些佐剂）组合。

本发明的另一个方面涉及使用本文中公开的疫苗组合物对宿主进行抗FeLV的免疫接种的方法。

宿主可以是猫科(例如，家猫、小猫、大猫和野猫)之任一或全部。在一个实施方案中，宿主是猫科动物。

施用途径可以是例如肌内(IM)或真皮内(ID)或经皮(TD)或皮下(SC)。施用的工具可以例如为具有针或无针装置的注射器，或具有与电转移(ET)处理结合的针或与ET处理结合的无针装置的注射器。

本发明的另一个方面涉及根据本发明的基于质粒的疫苗用于给宿主施用的用途，其中该施用与ET处理结合。基于质粒的疫苗的施用有利地是肌内的。施用的工具是例如注射器和针。可相继施用一次或数次注射。在数次注射的情况下，其可间隔2至6周，例如约间隔3周进行。在一个实施方案中，还施用半年度的加强或年度加强。

对于基于质粒的疫苗，有利的施用途径可以是ID或IM。该施用可通过使用具有针或具有无针装置（如Dermojet或Biojector(Bioject,Oregon,USA)或Vetjet^TM(Merial)或Vitajet^TM(Bioject Inc.)）的注射器，参见US2006/0034867。剂量可以为每质粒50μg至500μg。当添加DMRIE-DOPE时，可利用100μg/质粒。当使用GM-CSF或其它细胞因子时，编码该蛋白质的质粒可以以约200μg至约500μg的剂量存在，并且可以为200μg。剂量的体积可以为0.01ml至0.5ml，例如0.25ml。可以通过多个注射点提供施用。

备选地，可通过与电转移(ET)处理结合的IM途径施用基于质粒的疫苗。ET处理可使用用于电转移的装置和制造商的说明书(即Sphergen G250发生器(Sphergen SARL,Evry Genopole,France)；DNA电穿孔系统(Innovio Biomedical Corporation,SanDiego,California,USA))来进行。在一个实施方案中，用于电转移的装置具有单极场。场强可为约50至约250V/cm、约50至约200V/cm或约50至约175V/cm。脉冲持续时间可为约1至约50msec，或约15至约25msec。频率可为约1至约50Hz，或约5至约15Hz。脉冲间隔可为约1至1000msec或约1至约200msec。脉冲次数可为1至20次，或5至10次。组织内强度可有利地达到约2A。电极间距离可以为约0.2至约1cm或约0.2至约0.5cm。

对于基于重组病毒载体的疫苗，施用途径可以有利地是SC或IM或TD或ID。可通过具有针或具有无针装置如Dermojet或Biojector(Bioject,Oregon,USA)或Vetjet^TM(Merial)或Vitajet^TM(Bioject Inc.)的注射器进行该施用。剂量可以为约10³pfu至约10⁹pfu/重组痘病毒载体。当载体是金丝雀痘病毒时，剂量可以是例如约10⁵pfu至约10⁹pfu,约10⁶pfu至约10⁸pfu或约10⁶pfu至约10⁷pfu。剂量的体积可以是约0.01ml至0.2ml，有利地为0.1ml。施用可包括多个注射点。

对于IM途径，所提供的疫苗的体积可以是0.2至2ml，特别是约0.5至1ml。对于本发明的任意载体，使用相同的剂量。

对于亚单位疫苗，施用途径可有利地是通过SC或IM或TD或ID。该施用可通过具有针或具有无针装置如Dermojet或Biojector(Bioject,Oregon,USA)或Vetjet^TM(Merial)或Vitajet^TM(Bioject Inc.)的注射器来进行。剂量可以是约50至约500μg，特别是约50至约150μg，更具体地约50至约100μg。所提供的亚单位疫苗的体积是约0.2至2ml，特别是约0.5至1ml。

在另一个方面，本发明涉及疫苗策略，其基于初免-加强施用方案，其中初免施用和加强施用使用包含药学上或兽医上可接受的赋形剂、稀释剂或媒介物以及包含多核苷酸序列的体内表达载体的组合物，所述多核苷酸序列包含并表达FeLV多肽和/或其变体或片段。

本发明涉及体内表达载体用于初免-加强施用方案的用途，包括初免施用含有药学上或兽医上可接受的媒介物、稀释剂或赋形剂、含有用于体内表达FeLV多肽和/或其变体或片段的多核苷酸序列的体内表达载体的疫苗，继以加强施用包含药学上或兽医上可接受的媒介物或赋形剂、含有用于体内表达上述FeLV多肽和/或其变体或片段的多核苷酸序列的体内表达载体的疫苗，以保护宿主免患FeLV和/或防止被感染的宿主的疾病进展。

初免-加强方案包括至少一次初免施用和至少一次使用至少一种共同的多肽和/或其变体或片段的加强施用。用于初免施用的疫苗在性质上可与用作更晚的加强疫苗的那些疫苗不同。初免施用可包括一次或多次施用。类似地，加强施用可包括一次或多次施用。

施用途径、剂量和体积是如先前在本文中公开的。

初免-加强施用可有利地间隔2-6周，例如间隔约3周进行。根据一个实施方案，还预期半年度的加强或年度加强，有利地使用基于病毒载体的疫苗进行。在第一次施用时，动物可以是至少6至8周龄。

在一个实施方案中，初免-加强施用方案包括至少一次根据本发明的基于质粒的疫苗的初免施用和至少一次根据本发明的基于重组病毒载体的疫苗的加强施用。

在另一个实施方案中，初免-加强施用方案包括至少一次初免施用根据本发明的基于重组病毒载体的疫苗和至少一次加强施用根据本发明的亚单位疫苗。

在另一个实施方案中，初免-加强施用方案包括至少一次初免施用根据本发明的基于重组病毒载体的疫苗和至少一次加强-施用根据本发明的基于质粒的疫苗。

在一个实施方案中，本发明涉及免疫接种FeLV易感的受试者的方法，所述方法包括初免-加强施用方案，其中所述方案包括初免施用包含药学上或兽医上可接受的媒介物、稀释剂或赋形剂、含有用于体内表达FeLV多肽、FeLV多肽的变体或片段的多核苷酸的质粒或其混合物的疫苗或组合物，继而加强施用包含药学上或兽医上可接受的媒介物或赋形剂、含有用于体内表达同一FeLV多肽、其变体或片段的多核苷酸的重组病毒载体的疫苗，以保护受试者免患FeLV和/或防止被感染的受试者中的疾病进展。

在另一个实施方案中，本发明涉及免疫接种FeLV易感的受试者的方法，所述方法包括初免-加强施用方案，其中所述方案包括初免施用包含药学上或兽医上可接受的媒介物、稀释剂或赋形剂、含有用于体内表达FeLV多肽、FeLV多肽的变体或片段的多核苷酸的重组病毒载体或其混合物的疫苗或组合物，继而加强施用包含药学上或兽医上可接受的媒介物或赋形剂、含有用于体内表达FeLV多肽、其变体或片段的多核苷酸的质粒的疫苗，以保护受试者免患FeLV和/或防止被感染的受试者中疾病的进展。

在另一个实施方案中，本发明涉及免疫接种FeLV易感的受试者的方法，所述方法包括初免-加强施用方案，其中所述方案包括初免施用包含药学上或兽医上可接受的媒介物、稀释剂或赋形剂、含有用于体内表达FeLV多肽、FeLV多肽的变体或片段的多核苷酸的重组病毒载体或其混合物的疫苗或组合物，继而加强施用包含药学上或兽医上可接受的媒介物或赋形剂、相同的FeLV多肽、其变体、其片段的疫苗，以保护受试者免患FeLV和/或防止被感染的受试者中疾病的进展。

本发明的另一个方面涉及用于根据本发明的初免-加强免疫接种的试剂盒。所述试剂盒可包括至少两个小瓶：包含用于根据本发明的初免-免疫接种的疫苗的第一小瓶和包含用于根据本发明的加强-免疫接种的疫苗的第二小瓶。所述试剂盒可有利地包含用于另外的初免-免疫接种或另外的加强-免疫接种的另外的第一或第二小瓶。

在一个实施方案中，试剂盒可包括两个小瓶，一个小瓶包含用于根据本发明的初免-免疫接种的基于质粒的疫苗，另一个小瓶包含用于根据本发明的加强-免疫接种的基于重组病毒载体的疫苗。

在另一个实施方案中，试剂盒可包括两个小瓶，一个小瓶包含用于根据本发明的初免-免疫接种的基于重组病毒载体的疫苗，另一个小瓶包含用于根据本发明的加强-免疫接种的亚单位疫苗。

在另一个实施方案中，试剂盒可包括两个小瓶，一个小瓶包含用于根据本发明的初免-免疫接种的基于重组病毒载体的疫苗，另一个小瓶包含用于根据本发明的加强-免疫接种的基于质粒的疫苗。

现在将通过下列非限制性实施例进一步描述本发明。

实施例

无需进一步详细阐述，相信本领域技术人员可使用前述描述最大程度地实施本发明。下面详细描述的实施例将被解释为仅是举例说明性的，并且无论怎样不以任何方式限制前述公开内容。本领域技术人员将迅速识别关于反应物以及关于反应条件和技术方面的由所述程序的适当变化。

使用由J.Sambrook等人(Molecular Cloning:A LaboratoryManual,第2版,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold SpringHarbor,New York,1989)描述的标准分子生物学技术进行DNA插入物、质粒和重组病毒载体的构建。所有用于本发明的限制性片段均使用“Geneclean”试剂盒(BIO101Inc.,La Jolla,Calif.)分离。

实施例1pH6C5env质粒pPB713的构建

构建pH6C5env-pCXL208.2,用于产生FeLV-ENV/ALVAC(2) 重组体的C5插入质粒

将包含插入在C5基因座的FeLV ENV和插入在C3基因座的GAG/POL(+T5NT)的ALVAC(1)重组病毒(Merial专有权材料)用于扩增FeLV ENV基因。引物7862CXL和7847CXL用于PCR扩增。

7862CXL:ACG CCG CTC GAG CGG GGA TCT CTT TAT TCT ATA CTT A(SEQ ID NO:25)

Xho I H6启动子

7847CXL:CTC GGA TCC AGAAAAA TCA TGG TCG GTC CGG ATC(SEQ ID NO:26)

Bam HI T5NT终止

经扩增的PCR片段(2.1Kb)包含FeLV ENV基因、紧邻ENV上游的H6启动子和T5NT序列，继以ENV的终止密码子。然后用XhoI/BamHI消化PCR片段，并连接至经XhoI/BamHI消化的pH6C5ALVAC供体质粒(Merial专有权材料)以产生pCXL208.2，对所述pCXL208.2进行了测序确认。

pCXL208.2的质粒图谱及其序列示于图2和3中。

pH6C5env质粒pPB713的构建

将FeLV ENV糖基化并剪切以产生糖蛋白gp70ENV和p15EENV。株82K的突变的FeLV ENV基因的蛋白质序列示于图5中。突变是Arg对FeLV ENV基因的位置527处的Glu的置换。

从Institut Gustave-Roussy(Villejuif,法国)收到了质粒pHCMV-ENV FeLV。所提供的突变的FeLV ENV片段的序列(SEQ ID NO:3)相较于参照序列(Glasgow,GenBank登录号M12500,SEQ ID NO:35)包含5个突变(在核苷酸中)。在这5个核苷酸突变中，两个突变是沉默突变(无氨基酸改变)，但引入了新的限制性位点(=FspI)；3个突变引入了FeLV ENV的氨基酸序列中的突变(Arg替代Glu；如图5中显示的,SEQ ID NO:4)。

用RsrII/SacII消化了质粒phCMV-ENV FeLV以产RsrII-SacII片段(片段B:520bp)。用RsrII/SacII消化了质粒pCXL208.2以产生RsrII-SacII片段(片段A:6231bp)。将片段A和B连接以产生质粒pPB713(6756bp)。通过FspI消化确认了pPB713的身份。pPB713的限制性图谱和pPB713序列示于图4中。

pH6C5env质粒pPB712的构建

用RsrII/SacII消化质粒PhCMV-ENV FeLV以产生RsrII-SacII片段(片段A:520bp)。用RsrII/SacII消化质粒pPB575(Merial专有权材料)以产生RsrII-SacII片段(片段B:5971bp)。将片段A和B连接以产生质粒pPB712(6496bp)。通过EcoRI消化确认了pPB712的身份。利用通用M13引物和反向M13引物，通过DNA测序（Cogenics，法国）控制存在于pPB712克隆中的FeLV的突变区域的序列。选择了两个候选物(n°1和n°2)。2个克隆的序列相同，但与SEQ IDNO:4(Glu至Arg的单个氨基酸突变)不同。存在8个核苷酸突变，产生仅一个氨基酸改变。pPB712中的突变的FeLV(SEQ ID NO:1)与pHCMV-ENV FeLV中的突变的FeLV(SEQ ID NO:3)之间的DNA和蛋白质序列比较示于图5中。不同株系的FeLV ENV蛋白质的序列比较示于图5中。

实施例2用于产生表达FeLV密码子最优化的GAG-PRO的 ALVAC重组体的C3ALVAC供体质粒的构建

将FeLV(猫白血病病毒)密码子最优化的GAG-PRO基因用于产生vCP2294。最优化FeLV GAG-PRO基因以用于在哺乳动物细胞中进行基因表达。密码子最优化的GAG-PRO基因(SEQ ID NO:10)与野生型gap-pro基因(Genbank登录号M18247,SEQ ID NO:11)之间在DNA水平上的序列比较示于图7中。

构建方案概述于图8中。将包含H6p-FeLV密码子最优化的GAG-PRO盒的质粒pJY1320.1(Merial专有权材料)用作PCR扩增的模板。H6p是牛痘病毒H6启动子。引物13301JY和13302JY被用于PCR扩增。将PCR片段克隆至pCR2.1-TOPO载体。对所得的质粒pJY1857.5进行测序，并确认了其具有H6p-FeLV GAG-PRO的正确序列。为了构建pC3FeLV H6p-GAG-PRO，从pJY1857.5分离了NruI/SpeI DNA片段(其包含3’-部分H6启动子和全长GAG-PRO)，并将其连接至Nru I/Spe I消化的pJY1738.2(Merial专有权材料)以产生pJY1874.1(如图9、10和11中所示)，其被确认为具有正确的序列。

正向引物13301JY(SEQ ID NO:13)

Nru I H6p(SEQ ID NO:15)

5’ATTA TATCCGTTAAGTTTGTATCGTA ATG GGA CAG ACCATC ACC ACC

CCC CTG T

反向引物13302JY(SEQ ID NO:14)

Spe I

5’ATTACAAGAAAAA TCA TTA CAG CAC CTG CAG GGG CAGTCC TCT

在FeLV感染的细胞中，通过通读产生了GAG-PRO。在病毒装配的更晚期中将GAG进一步切割成MA(p15)、CA(p30)和NC蛋白。

实施例3.插入在ALVAC的C3基因座的包含H6p FeLV密码子最优化的GAG-PRO的ALVAC重组体(vFP2294)的产生和表征

使用试剂(Roche)，通过用10μg Not I线性化的供体质粒pJY1874.1转染原代鸡胚成纤维细胞(1℃EF)来进行IVR(体外重组)。使用于体外重组的原代鸡胚成纤维细胞(1℃EF)在1x抗生素/抗真菌剂(P/S/A/A,BRL/Gibco#15240-062)的存在下生长于10%FBS(JRH:γ-辐照的#12107-500M),补充有4mM谷氨酰胺(BRL/Gibco#25030-081)和1mM丙酮酸钠(BRL/Gibco#11360-070)的DMEM(BRL/Gibco#11960-051或11960-044)中。随后以10的MOI(感染复数)、利用ALVAC作为拯救病毒感染经转染的细胞(ALVAC#HM137204年4月7日)。24小时后，收获经转染的感染的细胞，对其进行超声处理，并用于重组病毒筛选。

按照制造商的方案(Amersham Cat#RPN3001)，使用以辣根过氧化物酶(HRP)标记的1.4kb FeLV GAG特异性探针，基于噬斑转印杂交法筛选重组噬斑。在顺次5轮噬斑纯化后，产生了命名为vCP2294.1.1.1.1.1的重组体，并通过杂交将其确认为对于FeLV GAG插入物是100%阳性的并且对于C3ORF是100%阴性的。

从第5轮噬斑纯化选择了单个噬斑，将其扩增以获得P1(1x T25烧瓶)、P2(1xT75烧瓶)和P3(6x滚瓶)。收获来自滚瓶的感染的细胞培养液，将其浓缩以产生病毒储存物vCP2294.1.1.1.1.1。

产生重组vCP2294的方案描绘于图12中。

重组体的分析：对P3储备物进行下列分析。

遗传纯度的确认

通过杂交将P3储备物重新确认为对于FeLV GAG是100%阳性的并且对于C3ORF是100%阴性的。

基因组分析

提取了来自vCP2294.1.1.1.1.1的基因组DNA，利用BamHI、HindIII或Pst I进行消化，在0.8%琼脂糖凝胶上进行电泳(run)。将具有经BamHI、HindIII或PstI消化的基因组DNA的凝胶转移至尼龙膜，通过用1.4kb FeLV GAG探针探测来进行Southern印迹分析。在预期的大小上观察到多个条带，表明FeLV GAG-PRO基因至C3基因座中的正确插入。

限制性酶	片段(bp)
		Bam HI	4152488513961
Hind III	17783
		Pst I	681244412041

表达分析

1)蛋白质印迹

以10的MOI、用vCP2294.1.1.1.1.1的P3储备物感染原代CEF细胞，在37℃温育24小时。随后收获培养上清液和细胞。利用由Roche制造的报告子基因测定裂解缓冲液(Cat.1897675)裂解细胞沉淀。利用添加了抗氧化剂的系统制备上清液和裂解物。将蛋白质在10%Bis-Tris预制凝胶上进行分离，然后转移至PVDF膜。抗FeLV GAG抗体显示出在上清液和细胞沉淀中都检测到的～70kDa的蛋白质和仅在细胞沉淀中检测到的～57kDa的蛋白质。

2)免疫蚀斑测定

对于重组vCP2294.1.1.1.1.1，群体的同质性对于FeLV GAG蛋白是100%阳性的，如通过使用抗-FeLV GAG抗体的免疫蚀斑测定所证明的。

序列分析

通过对C3基因座的侧翼臂和FeLV插入物的PCR扩增和序列分析进行了P3储备物基因组DNA的更详细分析。位于ALVAC基因组的C3基因座的臂之外的引物8103JY和8104JY被用于扩增整个C3L-FeLV-C3R片段。结果显示FeLV插入物和ALVAC的C3L和C3R的序列是正确的。

用于扩增FeLV GAG探针的引物:

11369JY:5’ATGATGAACGTGGGCTGGCCT3’(SEQ ID NO:17)11377JY:5’TCTCCTAAGTTGAGCAGGGTG3’(SEQ ID NO:18)

用于C3L-FeLV GAG-PRO盒-C3R的PCR扩增的引物:

8103JY:5’GAGGCATCCAACATATAAAGAAGACTAAAG3’(SEQ ID NO:19)

8104JY:5’TAGTTAAATACTCATAACTCATATCTG3’(SEQ ID NO:20)

图13显示了显示引物位置的vCP2294C3区域图谱。vCP2294序列被描绘于图14中。

实施例4包含插入在vCP2294的C5基因座的FeLV修饰的 ENV基因、ALVAC C3H6p FeLV密码子最优化的GAG-PRO– vCP2296的ALVAC重组体的产生和表征

使用试剂(Roche)，通过用10μg Not I-线性化的供体质粒pPB713转染1℃EF细胞来进行IVR。随后以10的MOI用vCP2294(ALVAC C3H6p FeLV密码子最优化的GAG-PRO,实施例2)作为拯救病毒感染经转染的细胞。24小时后，收获经转染感染的细胞，对其进行超声处理并用于重组病毒筛选。

按照制造商的方案(Amersham Cat#RPN3001)，使用以辣根过氧化物酶(HRP)标记的503bp FeLV ENV特异性探针，基于噬斑转印杂交法筛选重组噬斑。在4轮顺次的噬斑纯化后，产生了命名为vCP2296.6.1.1.2的重组体，并通过杂交将其确认为对于FeLV ENV插入物是100%阳性的并且对于空C5位点是100%阴性的。

从第4轮噬斑纯化选择单个噬斑，将其扩增以获得P1(1x T25烧瓶)、P2(1xT75烧瓶)和P3(6x滚瓶)储备物。收获来自滚瓶的感染细胞培养液，将其浓缩以产生病毒储备物vCP2296.6.1.1.2。

vCP2296的构建被描绘于图15中。

重组体的分析：对P3储备物进行下列分析。

遗传纯度的确认

通过杂交将P3储备物重新确认为对于FeLV GAG和FeLV ENV均为100%阳性的并且对于C3和C5ORF均为100%阴性的。

表达分析

1)蛋白质印迹:

以10的MOI用vCP2296.6.1.1.2的P3储备物感染原代CEF细胞，在37℃温育24小时。然后收获培养上清液和细胞。用由Roche生产的报告子基因测定裂解缓冲液(Cat.1897675)裂解细胞沉淀。利用添加了抗氧化剂的系统制备上清液和裂解物。在10%Bis-Tris预制凝胶上分离了蛋白质，然后将其转移至PVDF膜。抗FeLV GAG抗体显示了在上清液和细胞沉淀中都检测到的～70kDa的蛋白质，并且通过用抗FeLV ENV抗体温育，～80kDa的蛋白质也在上清液和细胞沉淀中均表达。

2)免疫蚀斑测定:

对于重组vCP2296.1.1.2，群体的同质性对于FeLV ENV蛋白是100%阳性的，如通过使用抗-FeLV ENV抗体的免疫蚀斑测定所证明的(参见附件vCP2296Immunoplaque.doc中的IP确认扫描图)。

序列分析

通过PCR扩增vCP2296.6.1.1.2的C5位点处的FeLV ENV基因的插入物。将位于ALVAC基因组中C5基因座的臂之外的引物7931DC和7932DC(参见图16)用于扩增整个C5L-FeLV-C5R片段。

用于扩增FeLV ENV探针的引物:

7900CXL5’AGGAGGGCTTTAGTCCCTGTTCCGA3’(SEQ ID NO:21)

7934CXL5’ACTAAAGACTGTTGGCTCTGCCTG3’(SEQ ID NO:22)

用于C5L-FeLV ENV盒-C5R的PCR扩增的引物:

7931DC5’GAATCTGTTAGTTAGTTACTTGGAT3’(SEQ ID NO:23)

7932DC5’TGATTATAGCTATTATCACAGACTC3’(SEQ ID NO:24)

实施例5包含插入在vCP2294的C5基因座处的FeLV天然ENV 基因、ALVAC C3H6p FeLV密码子最优化的GAG-PRO–vCP2295 的ALVAC重组体的产生和表征

供体质粒pCXL208.2包含天然ENV基因(SEQ ID NO:5)。

使用试剂(Roche)、通过用10μg Not I-线性化的供体质粒pCXL208.2转染1℃EF细胞来进行IVR。随后以10的MOI用vCP2294(实施例2)作为拯救病毒感染经转染的细胞。24小时后，收获转染的感染细胞，对其进行超声处理，并用于重组病毒筛选。

按照制造商的方案(Amersham Cat#RPN3001)，使用以辣根过氧化物酶(HRP)标记的503bp FeLV ENV特异性探针，基于噬斑转印杂交法筛选了重组噬斑。在4轮顺次的噬斑纯化后，产生了命名为vCP2295.2.2.2.1的重组体，并通过杂交将其确认为对于FeLV ENV插入物是100%阳性的并且对于空C5位点是100%阴性的。

从第4轮噬斑纯化选择单个噬斑，将其扩增以获得P1(1x T25烧瓶)、P2(1xT75烧瓶)和P3(6x滚瓶)。收获来自滚瓶的感染细胞培养液，将其浓缩以产生病毒储备物vCP2295.2.2.2.1。产生重组vCP2295的方案示于图17中。

重组体的分析：对P3储备物进行下列分析。

遗传纯度的确认

通过杂交将P3储备物重新确认为对于FeLV GAG和FeLV ENV是100%阳性的并且对于C3和C5ORF是100%阴性的。

表达分析

1)蛋白质印迹

以10的MOI利用vCP2295.2.2.2.1的P3储备物感染原代CEF细胞，在37℃温育24小时。然后收获培养上清液和细胞。利用由Roche制造的报告子基因测定裂解缓冲液(Cat.1897675)裂解细胞沉淀。利用添加了抗氧化剂的系统制备上清液和裂解物。在10%Bis-Tris预制凝胶上分离蛋白质，然后将其转移至PVDF膜。抗FeLV gag抗体显示了在上清液和细胞沉淀中都检测到的～70kDa的蛋白质，并且通过用抗FeLV ENV抗体温育，～80kDa的蛋白质也在上清液和细胞沉淀中表达。

2)免疫蚀斑测定:

对于重组vCP2295.2.2.2.1，群体的同质性对于FeLV ENV蛋白是100%阳性的，如通过使用抗-FeLV ENV抗体的免疫蚀斑测定所证明的。

序列分析

通过C5基因座的侧翼臂和FeLV插入物的PCR扩增和序列分析进行了对P3储备物基因组DNA的详细分析。位于ALVAC基因组中C5基因座的臂之外的引物7931DC和7932DC被用于扩增整个C5L-FeLV-C5R片段。结果显示FeLV插入物和ALVAC的C5L和C5R的序列是正确的。

重组vCP2295序列被描绘于图18中。

实施例6通过免疫接种/攻击模型对皮下施用的金丝雀痘载体疫苗(vCP2296,FeLV ENV)的效力评价

材料/方法

将44只在第一次免疫接种时为57至63日龄(平均58天；标准偏差1.3天)的雄性和雌性猫随机分配至两个22只动物的组中。在第0和21天以10^6.2组织培养剂量₅₀(TCID₅₀)/ml用1ml的FeLV-金丝雀痘载体疫苗(vCP2296)皮下(SQ)免疫接种组1中的猫。组2中猫在第0和21天接受两个剂量的1ml的包含无菌生理盐溶液的安慰剂疫苗并且用作阴性对照。在第42和43天(在第2次免疫接种后3周)，用1ml的包含10^4.5和10^4.7TCID₅₀/ml的FeLV(61-E)的强毒株悬浮液攻击所有的猫；通过口鼻途径施用(分别在第42和43天)。在第-6、42天(攻击前)、以及在攻击后约3周并且以每周的间隔收集血液样品进行直至12个连续周(第62天-第146天)，对于FeLV抗原血症(FeLV p27蛋白)测试血清。

从第1次免疫接种前2天开始直至第42天进行临床评价。在第-2-0天(免疫接种前)、1-2天、19-21天(免疫接种前)和22-23天每天记录直肠温度。此外，在每一次免疫接种后前两天和免疫接种后以一周的间隔评价注射位点，直至攻击当天，并且包括对肿胀、发红和触诊后疼痛的评价。

结果：攻击后FeLV p27抗原血症的持续性

当猫被测试到连续3周或5个非连续周对于FeLV p27是阳性时，其被认为具有持续性FeLV p27抗原血症。相较于经免疫接种组的5/21(23.8%)，来自安慰剂组的22只猫中的19只(86.4%)成为了持续性FeLV抗原血症的。与安慰剂组相比，经免疫接种的组中具有可归因于FeLV攻击的持续性FeLV抗原血症的猫的发病率显著更低(p=0.00005)。所估计的经预防的部分为72.43%，具有43.04%至89.78%的95%置信区间。因此，与安慰剂动物相比，在经免疫接种的动物中动物成为持续性FeLV抗原血症的机会有72%的下降。

结论

发现通过SQ途径施用的两个剂量的Merial的FeLV-金丝雀痘载体疫苗(vCP2296)有效地抗FeLV攻击，如由下列结果所证明的：

1.在攻击后，测试疫苗显示出在21只经免疫接种-攻击的猫中的16只(76.2%)中在预防持续性FeLV抗原血症方面是有效的，相较于对照有显著更少数目的经免疫接种的猫发生持续性抗原血症(p=0.00005；被预防的部分72%；主要效力变量)。

2.有效攻击被验证，如通过在86%(19/22)的对照猫中产生持续性FeLV抗原血症所证明的。

3.免疫接种后，经免疫接种的猫都未显示局部或全身性反应。

实施例7通过在猫中攻击进行的具有天然ENV基因的重组金丝雀痘-FeLV(vCP2295)与具有最优化的ENV基因的重组金丝雀痘 -FeLV(vCP2296)的效力的比较

材料/方法

将8至12周龄(在D0平均9周)的总共30只SPF(无特定病原体)小猫(15只雄性和15只雌性)根据它们的性别、同窝幼崽和年龄随机分配至3个具有10只小猫的组。

表1.此研究的实验设计

*组C:猫的数目=因在D1一只猫死亡而导致从D1至结束时9只**以log10CCID50/mL表示

SC:皮下

BS:血液采样

免疫接种前在D0和D28，监测所有小猫的身体状况。然后在全身麻醉下通过在肩胛间区皮下注射免疫接种组A和B的猫。在D44，将攻击株在37℃解冻，将32mL的所述株系与8mL具有10%胎牛血清的F15培养基混合，并且在接种之前保持在碎冰上。所有猫经历全身麻醉。然后通过口鼻途径用1mL的接种物(每个鼻腔0.25mL)以及0.5mL经口(舌、咽和扁桃体)接种每一只猫。

结果

在D0、D5、D7、D15、D26、D35、D49、D70、D77、DB4、D91、D96、D105、D112、D133对清醒(vigil)的猫和在D44、D56、D63、D119、D126、D140和D147在全身麻醉(0.1至0.2mL/kg的Zoletll"50、肌内途径)下对猫进行血液采样。

1.抗原血症测试

在免疫接种前D0，在攻击前D44和从攻击后第3周开始每周(即在D63、D70、D77、D84、D91、D98、D105、D112、D119、D126、D133、D140和D147)将血液样品收集在干燥试管中以用Witness FeLV试剂盒(Synbiotics Corporation,MO,USA)进行FeLV p27抗原滴定。响应是二元的(存在/不存在)。定义了3类应答：a)0:无抗原血症(所有的滴定均是阴性的)，b)1:短暂抗原血症(少于3个阳性连续滴定和少于5个阳性滴定)，c)2:持续性抗原血症(在至少5个时机是阳性的或至少3个阳性连续滴定)。

在经vCP2295免疫接种的组(组A)中，40%的猫被保护免患持续性抗原血症：4/10的猫从未被发现是阳性的，6/10的猫显示持续性抗原血症。在经vCP2296接种的组(组B)中，60%的猫被保护免患p27持续性抗原血症。5/10从未被发现是阳性的，1/10的猫显示短暂抗原血症：可在D63和D84在该猫的血清中检测到p27。4/10的猫显示持续性抗原血症。在对照组(组C)中，100%的猫患有持续性抗原血症。结果显示在表2中。

表2.p27抗原血症结果(比率)

*非持续性感染的猫的数目/猫的数目

**在研究过程中死亡的一只猫被连续4次发现是阳性的

NA:不适用的：对照组

比较3个组关于未呈现(抗原血症=0)、短暂呈现(抗原血症=1)或持续性呈现(抗原血症=2)抗原血症的猫的频率给出了显著的p值(“Fisher's精确检验”:p=0.028)。在组B与组C之间证明了向显著性的趋势(用Bonferroni's法调整的p值：A对C:p=0.260,B对C:p=0.056,A对B:p=1)。

2.Proviremia测试

将白细胞计数用于将proviremia表示为原病毒拷贝数/50,000WBC(白细胞)。在攻击前D44和在攻击后每3周(即在D63、D84、D105、D126和D147)将血液样品收集在EDTA管中用于白细胞计数以及使用定量PCR在PBMC(外周血单核细胞)上进行FeLV proviremia监控。由于标准的重复测量性质和个体随机效应，使用具有重复测量的混合模型分析了proviremia数据。

a)血液中的Proviremia

图19显示攻击后每组平均proviremia的演化。图17显示攻击后每组平均proviremia和p27抗原血症状态的演化。在这两个经免疫接种的组中，p27抗原血症与proviremia密切相关(图20)。

b)骨髓中的proviremia

p27阴性猫的骨髓中的proviremia水平为3至5log10，而其在p27阳性猫中达到8至9log10。proviremia的水平与p27抗原血症个体状态以及与个体血液proviremia密切相关(如图21中显示的)。

3.细胞免疫应答

在D5、D7、D15、D28、D35、D49、D56、D63、D119和D126将血液样品收集在经肝素处理的管中以用于FeLV免疫监控。在D35和D126，在用加载有FeLV肽混合物的树突细胞(DC)刺激PBMC后，通过ELISpot监测IFNγ–细胞介导的免疫应答。在D35、D63和D126，在用FeLV肽混合物刺激PBMC后，通过ELISpot监测IL10介导的免疫。在D5、D15、D35、D49、D63和D126监测调节性T细胞。

A)方法

a).猫PBMC分离

通过密度梯度离心(无制动，以600g进行30分钟)分离PBMC。在无菌PBS(磷酸缓冲盐溶液)中洗涤PBMC两次(以400g离心10分钟)，随后用自动化ABX Pentra120细胞计数器进行计数。将细胞在PBS中洗涤最后一次，并以5.10⁶/ml的浓度重悬于无菌完全RPMI(=RPMI+青霉素-链霉素(PS)+β巯基乙醇(βM))+10%的胎牛血清(FCS)中。

b).树突细胞产生

在平的6孔板中培养Ficoll-分离的PBMC20小时。除去非贴壁细胞，将补充有猫IL-4和猫GM-CSF的新鲜完全培养基添加至孔中。单核细胞至DC的分化持续7天。

c).IFNγELISpot测定:

通过利用IFNγELISPOT测定定量了不同动物组中FeLV-特异性细胞免疫应答的强度。用100μl/孔、在碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液(0.2M,pH9.6)中稀释(1/25)的纯化的抗-犬IFNγmAb在+4℃过夜涂覆HAELISPOT板。在无菌PBS中洗涤经涂覆的板3次，在室温(RT)下利用无菌完全RPMI10%FCS封闭未被占据的位点2h。

在D+15、D+35和D+126，用编码FeLV ENV和GAG蛋白的肽混合物加载树突细胞。简要地，在终体积100μ1的完全RPMi10%FCS中，单独地用1μg/ml的肽混合物n^o1和2(对于FeLV ENV)或肽混合物No.2、3、6和8FeLV GAG-PRO重新刺激100.10³DC。将加载的树突细胞转移至ELISpot板中，将500.10³PBMC添加至每一个孔中。用无关的肽加载树突细胞作为阴性对照。在37℃+5%CO₂下刺激细胞20-24h。然后清除细胞，并允许细胞裂解。将冷蒸馏水添加至每一个孔(200μl)，在RT进行5min。然后于PBS-0.05%Tween中洗涤板3次，在+4℃用100μl生物素化的抗-猫γIFN MAb(以1/100稀释于PBS-0.05%Tween中)进行温育。然后在PBS-0.05%Tween中洗涤板3次，将100μl稀释的HRP-链霉抗生物素蛋白溶液添加至每一个孔，在37℃进行1h。然后在PBS-0.05%Tween中洗涤板3次，并在黑暗中于RT、用AEC底物溶液温育15分钟。用自来水充分洗涤板并干燥。利用CCD照相机系统(Microvision,Redmond,WA,USA)计数斑点。如下计算肽特异性IFNγ-斑点形成细胞(SFC)的频率：肽特异性IFNγSFC的数目=个体FeLV肽混合物再刺激后IFNγSFC的数目-无关肽混合物再刺激后IFNγSFC的数目。结果被表示为log10。

d).IL-10ELISpot测定

按照制造商的说明书(R&D systems,Minneapolis,MN,USA)进行了ELISpot IL-10。以200μ1完全RPMI10%FCS的终体积中的lμg/ml的编码FeLV ENV和GAG-PRO序列的重叠肽混合物直接再刺激500.10³经纯化的PBMC，将其置于ELIspot IFNγ涂覆的板中。用无关肽再刺激500.10³PBMC作为阴性对照。如下计算肽特异性IL-10斑点形成细胞(SFC)的频率：

肽混合物特异性IL-10SFC的数目=个体FeLV肽混合物再刺激后IL-10SFC的数目-无关肽再刺激后IL-10SFC的数目。

结果表示为log10。

B)结果

a)免疫接种后细胞的免疫应答

i)免疫接种后FeLV-特异性IFNγ分泌性细胞应答的监控

使用IFNγ-ELIspot测定分析PBMC响应利用FeLV ENV和GAG-PRO肽混合物加载的DC的再刺激而产生IFNγ的能力。对用加载有编码FeLV ENV和GAG-PRO序列的肽混合物的树突细胞体外激活后诱导的IFNγ⁺SFC(斑点形成细胞)总和的分析显示，相较于vCP2295免疫接种，vCP2296免疫接种在第35天诱导更高频率的FeLV-特异性IFNγ分泌性细胞。非免疫接种组不诱导任何IFNγ分泌性细胞(图22)。

当集中关注FeLV ENV混合物No.1和No.2特异性应答时，vCP2295与vCP2296在它们诱导IFNγ产生性细胞的能力之间的差异更加清除。对用加载有FeLV ENV的肽混合物No.1(编码FeLV ENV序列的开始部分)的树突细胞体外激活后，PBMC中的IFNγ⁺SFC频率的分析显示血液中第35天的vCP2296(组B)与vCP2295免疫接种(组A)之间的差异。非免疫接种组不诱导任何IFNγ分泌性细胞(图23)。

ii)免疫接种后FeLV特异性IL-10分泌性细胞的监控

FeLV-特异性IL-I0分泌性细胞监控：对血液中FeLV ENV-特异性应答的分析

在免疫接种后第35天，使用IL-10-ELIspot测定分析PBMC响应FeLV ENV肽混合物再刺激而产生IL-10的能力。相较于vCP2296免疫接种和对照组，vCP2295免疫接种诱导更高频率的FeLV ENV特异性IL-10分泌性细胞(图24)。

FeLV-特异性IL-10分泌性细胞监控：对血液中FeLV GAG-PRO 特异性应答的分析

在接种后第35天，使用IL-10-ELIspot测定分析PBMC响应FeLVGAG-PRO肽混合物再刺激而产生IL-10的能力。vCP2295免疫接种倾向于诱导比vCP2296免疫接种更多的FeLV GAG-PRO特异性IL-10分泌性细胞(图25)。

总之，vCP2295免疫接种(组A)相较于vCP2296免疫接种(组B)和对照组(组C)在外周血中诱导更高频率的FeLV特异性IL-10分泌性细胞。

iii)免疫接种后FeLV特异性IFNγ和IL-10产生性细胞的比率。

为了进一步评价两个重组疫苗和Th1应答与调节性应答之间的平衡，对于每一个经免疫接种的组计算了ENV或GAG-PRO体外再刺激后FeLV-特异性IFNγSFC的数目与FeLV特异性IL-10SFC的数目之间的比率。每一个组的FeLV-特异性IFNγIL-10SFC比率的比较显示出相较于由vCP2295免疫接种诱导的偏向于IL-10应答的免疫应答，vCP2296免疫接种诱导了更为平衡的应答。该差异在对FeLV ENV再刺激的应答中比在对GAG-PRO再刺激的应答中更明显(图26a和26b)。

b)在实验攻击后对细胞免疫应答的监控

i)在攻击后对FeLV-特异性IFNγ分泌性细胞应答的监控

在攻击后(D126)，使用IFNγ-ELIspot测定分析了PBMC响应以FeLV ENV或GAG-PRO肽混合物加载的OC进行的再刺激而产生IFNγ的能力。相较于经vCP2295-免疫接种的猫，经vCP2296-免疫接种的猫在攻击后(D126)不久在PBMC中维持更高频率的FeLV ENV-特异性IFNγ分泌性细胞。对于任何组，在此时未能观察到FeLVGAG-PRO-特异性IFNγ分泌性细胞(图27)。

ii)对攻击后FeLV-特异性IL-10分泌性细胞应答的监控

攻击后(D126)，使用IL-10ELIspot测定分析了PBMC响应FeVENV和GAG-PRO肽混合物再刺激而产生IL-10的能力。相较于第35天的应答，FeLV攻击特异性加强了所有组中的FeLV ENV-特异性IL-10细胞应答，3个组之间没有差异(图28a)。攻击不影响针对FeLVGAG-PRO区域的抗原特异性应答，并且经vCP2295-免疫接种的猫维持它们的FeLV GAG-PRO-特异性IL-10应答(图28b)。攻击后，经vCP2295免疫接种的猫(组A)仅显示FeLV-特异性IL-10免疫应答，而经vCP2296-免疫接种的猫(组B)产生FeLV-特异性IL-10免疫应答，而且还维持它们的FeLV-特异性IFNγ应答。

c)FeLV-特异性IFNγ和IL-10产生性细胞在被保护和经感染的动物中的频率

根据p27抗原血症结果鉴定了被保护和经感染的动物。将每组中被保护和经感染的动物分开(图29)，并计算每一个亚组的IFNy/IL-I0比率以评估免疫接种后的IFNγ/IL-I0SFC比率是否可指征保护。

在经vCP2296免疫接种的组中：10只猫中有4只呈现出与高IFNγ应答和低IL-10应答相关的高IFNγ/IL-I0比率，并且得到保护。10只猫中有2只未呈现任何IFNγ或IL10应答，并且得到保护。10只猫中有4只呈现出与高IL-10应答相关的低IFNγ/IL-I0比率。这些猫中有3只呈现出高IFNγ应答，并且它们中的一只未呈现任何IFNγ应答。这些猫未得到保护。

在经vCP2295免疫接种的组中：10只猫中有8只呈现出与高IL-10应答和低IFNγ应答相关的低IFNγ/IL-10比率。它们中的6只被感染，并且它们中的2只得到保护。10只猫中有2只呈现出IFNγ和IL-10应答以及高IFNγ/IL-10比率。这些猫得到保护。

相较于被感染的猫，来自经vCP2295-或vCP2296-免疫接种的组的被保护的猫展示出在血液中更高的IFNγ/IL-10比率(图26)。此外，相较于来自经vCP2295-免疫接种组的被保护的猫，来自经vCP2296-免疫接种组的被保护的猫具有更高的IFNγ/IL-10SFC比率。

保护与增加的IFNγ/IL-10比率相关，并且相较于经vCP2295-免疫接种的猫，来自经vCP2296免疫接种的被保护的猫产生偏向于IFNγ保护的FeLV-特异性细胞介导的免疫。

结论

60%的以vCP2296(最优化的ENV基因)免疫接种的猫得到抗持续性抗原血症的保护，40%的以vCP2295(天然ENV基因)免疫接种的猫得到抗持续性抗原血症的保护。3个组的比较显示出经免疫接种组与未经免疫接种组之间的保护作用的显著差异，以及以最优化的ENV基因(vCP2296)免疫接种的组B与以天然ENV基因(vCP2295)免疫接种的组A之间的显著差异的倾向。

Proviremia与抗原血症结果密切相关：具有持续性抗原血症的猫具有强且持久的proviremia直至研究结束。非抗原血症猫具有更低且退行性的proviremia。P27阴性猫能够控制proviremia。根据免疫接种和攻击期中FeLV特异性IFNγ和IL-10产生性细胞的诱导，vCP2295与vCP2296免疫接种之间的差异是明显的。显示了FeLV金丝雀痘疫苗(特别是当ENV基因在其免疫抑制序列中被突变时(vCP2296))对FeLV-特异性IFNγ产生性细胞的诱导。有趣地，在攻击后超过100天仍然检测到了由vCP2296免疫接种诱导的这些IFNγ产生性FeLV-特异性细胞，这表明vCP2296免疫接种诱导了FeLV-特异性记忆T细胞的产生。相反地，vCP2295更强地诱导FeLV-特异性IL-10-产生性细胞的分化。免疫接种后，与vCP2296和未免疫接种的对照猫相比，在经vCP2295免疫接种的猫中FeLV-特异性IL-10产生性细胞的频率更高。IL-10因其调节性性质（参与免疫应答的抑制或其终结）而为人所知。免疫接种后更高的FeLV-特异性IFNγ/IL-10SFC比率与保护相关(通过抗原血症评价的)。所有呈现出高IFNγ/IL-10比率和低IL-10应答的猫均得到保护。该观察与IL-10-产生性细胞的潜在免疫抑制作用以及与IFNγ-产生性细胞的抗病毒功能相一致。相较于vCP2295中的天然ENV基因，vCP2296疫苗中的ENV基因的修饰减小了构建体的免疫抑制性质并且为该构建体提供了免疫学优势。

本研究显示对FeLV的ENV基因的修饰导致与抗持续性抗原血症的更好保护相关的不同免疫应答质量。FeLV的ENV基因的修饰允许金丝雀痘-FeLV以比具有天然ENV FeLV基因的相同构建体更低的剂量起作用。

将为明显的是，可使所描述的方法的精确细节被改变或修饰而不背离所描述的公开的精神。我们要求落入下面权利要求的范围和精神内的所有这样的修饰和改变。

将本文中引用或参考的所有文献(“本文中引用的文献”)，和本文中引用的文献中引用或参考的所有文献，与用于本文或通过引用而并入本文的任何文献中的任何产品的任何制造商的说明书、描述、产品说明书和产品表单一起通过引用并入本文，并且可将其用于实施本发明。

Claims

1.一种组合物，其包含：

a)包含编码最优化的猫白血病病毒(FeLV)包膜(ENV)多肽的第一多核苷酸和编码FeLV GAG/PRO多肽的第二多核苷酸的表达载体；和

b)药学上或兽医上可接受的媒介物、稀释剂或赋形剂。

2.权利要求1的组合物，其中所述最优化的FeLV ENV多肽在FeLV ENV蛋白的氨基酸位置527或等同的相应氨基酸位置处包含突变。

3.权利要求1或2的组合物，其中所述突变包括精氨酸(R)、天冬氨酸(D)或甲硫氨酸(M)对谷氨酸(E)的置换。

4.权利要求1-3的任一项的组合物，其中所述多核苷酸编码与SEQ ID NO:2、4、6、27、28、29、30、31、32、33或34所示的序列具有至少80%的序列同一性的FeLV ENV多肽，并且其中所述多肽在FeLV ENV蛋白的氨基酸位置527或等同的相应氨基酸位置处包含突变。

5.权利要求4的组合物，其中所述突变包括精氨酸(R)、天冬氨酸(D)或甲硫氨酸(M)对谷氨酸(E)的置换。

6.权利要求5的组合物，其中所述突变包括精氨酸(R)对谷氨酸(E)的置换。

7.权利要求1-6的任一项的组合物，其中所述多核苷酸与SEQID NO:1、3或5所示的序列具有至少70%的序列同一性。

8.权利要求1-7的任一项的组合物，其中所述载体包含编码FeLVENV多肽的第一多核苷酸和编码FeLV GAG/PRO多肽的第二多核苷酸。

9.权利要求8的组合物，其中第一多核苷酸编码与SEQ ID NO:2、4、6、27、28、29、30、31、32、33或34所示的序列具有至少80%序列同一性的FeLV ENV多肽，其中所述多肽在FeLV ENV蛋白的氨基酸位置527或等同的相应氨基酸位置处包含突变，并且其中所述第二多核苷酸编码与SEQ ID NO:12所示的序列具有至少80%的序列同一性的FeLV GAG/PRO多肽。

10.权利要求8或9的组合物，其中所述第一多核苷酸编码具有SEQ ID NO:2或4所示的氨基酸序列的FeLV ENV多肽，并且其中所述第二多核苷酸编码具有SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列的FeLVGAG/PRO多肽。

11.权利要求8或9的组合物，其中编码FeLV ENV多肽的多核苷酸与SEQ ID NO:1、3或5所示的序列具有至少70%的序列同一性，并且编码FeLV GAG/PRO多肽的多核苷酸与SEQ ID NO:10或11所示的序列具有至少70%的序列同一性。

12.权利要求1-11的任一项的组合物，其中所述表达载体是禽痘载体。

13.权利要求1-12的任一项的组合物，其中所述组合物以约10⁵pfu至约10⁹pfu的剂量范围被施用给动物。

14.一种表达载体，其包含编码最优化的FeLV ENV多肽的第一多核苷酸和编码FeLV GAG/PRO多肽的第二多核苷酸。

15.权利要求14的表达载体，其中所述第一多核苷酸编码与SEQID NO:2、4、6、27、28、29、30、31、32、33或34所示的序列具有至少80%的序列同一性的FeLV ENV多肽，其中所述多肽在FeLVENV蛋白的氨基酸位置527或等同的相应氨基酸位置处包含突变，并且其中所述第二多核苷酸编码与SEQ ID NO:12所示的序列具有至少80%的序列同一性的FeLV GAG/PRO多肽。

16.权利要求14或15的表达载体，其中所述第一多核苷酸编码具有SEQ ID NO:2或4所示的氨基酸序列的FeLV ENV多肽，并且其中所述第二多核苷酸编码具有SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列的FeLV GAG/PRO多肽。

17.权利要求14或15的表达载体，其中编码FeLV ENV多肽的多核苷酸与SEQ ID NO:1、3或5所示的序列具有至少70%的序列同一性，并且编码FeLV GAG/PRO多肽的多核苷酸与SEQ ID NO:10或11所示的序列具有至少70%的序列同一性。

18.权利要求14-17的任一项的表达载体，其中所述表达载体是禽痘载体。

19.一种免疫接种动物的方法，包括至少一次施用权利要求1-18的任一项的组合物或表达载体。

20.权利要求19的方法，其中所述方法包括初免-加强施用方案。

21.权利要求19或20的方法，其中所述组合物以约10⁵pfu至约10⁹pfu的剂量范围被施用。

22.一种组合物，其包含：

a)表达载体，其中所述载体包含一种或多种多核苷酸，所述多核苷酸编码一种或多种选自最优化的FeLV多肽、最优化的FeLV多肽的变体或片段、及其混合物的多肽；和

b)药学上或兽医上可接受的媒介物、稀释剂或赋形剂。

23.一种表达载体，其包含一种或多种多核苷酸，所述多核苷酸编码一种或多种选自最优化的FeLV多肽、最优化的FeLV多肽的变体或片段及其混合物的多肽。

24.一种用于初免-加强免疫接种的试剂盒，其包括至少两个小瓶：含有用于初免-接种的权利要求1-18的任一项的组合物或表达载体的第一小瓶，和含有用于加强-接种的权利要求1-18的任一项的组合物或表达载体或者亚单位FeLV疫苗或者质粒FeLV疫苗的第二小瓶。

25.权利要求24的试剂盒，其中所述第一小瓶含有权利要求10的组合物并且第二小瓶含有权利要求10的组合物，并且其中所述组合物以约10⁵pfu至约10⁹pfu的剂量范围被施用。