TWI399213B - 抗藍舌病病毒之重組疫苗 - Google Patents

抗藍舌病病毒之重組疫苗 Download PDF

Info

Publication number
TWI399213B
TWI399213B TW096119784A TW96119784A TWI399213B TW I399213 B TWI399213 B TW I399213B TW 096119784 A TW096119784 A TW 096119784A TW 96119784 A TW96119784 A TW 96119784A TW I399213 B TWI399213 B TW I399213B
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
btv
virus
animal
immunogenic composition
vaccine
Prior art date
Application number
TW096119784A
Other languages
English (en)
Other versions
TW200810779A (en
Inventor
Jean Christophe Francis Audonnet
Kemal Karaca
Jiansheng Yao
Nigel James Maclachlan
Original Assignee
Merial Ltd
Univ California
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Merial Ltd, Univ California filed Critical Merial Ltd
Publication of TW200810779A publication Critical patent/TW200810779A/zh
Application granted granted Critical
Publication of TWI399213B publication Critical patent/TWI399213B/zh

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56983—Viruses
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6854—Immunoglobulins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5256—Virus expressing foreign proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/24011—Poxviridae
    • C12N2710/24041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/24043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2720/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsRNA viruses
    • C12N2720/00011—Details
    • C12N2720/12011—Reoviridae
    • C12N2720/12111—Orbivirus, e.g. bluetongue virus
    • C12N2720/12122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2720/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsRNA viruses
    • C12N2720/00011—Details
    • C12N2720/12011—Reoviridae
    • C12N2720/12111—Orbivirus, e.g. bluetongue virus
    • C12N2720/12134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Oncology (AREA)

Description

抗藍舌病病毒之重組疫苗
本發明係關於含有至少一種呼腸孤病毒科(Reoviridae )家族環狀病毒屬(更特定言之，係藍舌病病毒(或BTV))之多核苷酸或至少一種編碼至少一種BTV抗原、免疫原或抗原決定部位之核酸分子的載體(例如，可包含及表現至少一種BTV多核苷酸之體內及體外表現載體或可包含及表現至少一種BTV抗原、免疫原或抗原決定部位之體內及體外表現載體)，以及抗藍舌病之免疫原組合物及疫苗；例如，可含有一或多種該等載體及/或一或多種該等載體之表現產物的此等組合物或疫苗。本發明亦係關於使用該等載體、組合物及疫苗之方法，其包括針對此病毒實施免疫及疫苗接種、表現該(等)多核苷酸之表現產物、在試驗中使用該等表現產物或產生可用於試驗之抗體；以及尤其係關於用於製備該(等)多核苷酸、載體、組合物、疫苗、試樣之方法。
藍舌病(BT)係一種反芻動物之節肢動物傳播性病毒性疾病。牛及山羊可能易於感染致病性BTV但不會出現廣泛的血管損傷且因此此等物種通常不會呈現明顯的臨床表現。與此相反，綿羊之該疾病的特徵為口、鼻及前胃之黏膜的卡他性炎症以及蹄之冠狀帶及冠狀層的炎症。出現上皮表皮脫落且最終導致口腔黏膜壞死；腫脹及發炎的舌及口可能呈現藍色，該疾病因此而得名(Spreull 1905)。據估計，綿羊之死亡率為1－30%。
BTV係環狀病毒屬(呼腸孤病毒科家族)之原型病毒且包括至少24種不同的血清型(Wilson and Mecham 2000)。在世界範圍內於整個熱帶區及溫帶區已經確定了BTV之不同菌株。BTV感染在歐洲可於遠至45°N處發生，在亞洲及北美可於遠至50°N處發生且在南半球可於遠至35°處發生。BTV並不會在反芻動物之間接觸傳染，因此BTV之分佈取決於節肢動物載體物種coides sp(叮咬蠓)之存在，其中不同載體物種在世界不同區域中出現。最新數據表明：遺傳漂變及建立者效應可造成BTV野生株之各基因區段的多樣化(Bonneau,Mullens等人，2001)。已經證實：BTV血清陽性動物不會再感染同源BTV血清型。
反芻動物之BTV感染係暫時的，而庫蠓屬(Culicoides )昆蟲載體之感染係持久的。病毒血症之持續時間視動物物種及BTV菌株而定。已經報道：病毒血症在綿羊中可能係極為短暫的而在BTV感染個體中可持續長達41天，山羊持續長達42天且牛持續長達100天。由於牛之BTV感染經常導致病毒血症持續時間延長但不會持久，因此，牛用作自其庫蠓屬載體可攝取病毒且隨後將該病毒傳播給其他反芻動物之儲存宿主(Anderson,Stott等人，1985；MacLachlan 1994；MacLachlan and Pearson 2004)。人們對庫蠓屬載體許多物種之生態學知之甚少且其繁殖區基本上無特徵及其散佈速率未知。庫蠓屬索諾拉蜂(Culicoides sonorensis )在北美係主要的BTV載體。雌性庫蠓屬昆蟲可持續地感染BTV且可在長達14天之外在潛伏期後傳播該病毒(Mullens,Tabachnick等人，1995)。BTV在溫帶區可藉助垂直感染昆蟲載體越冬，但最新數據表明：外衣殼基因在昆蟲載體幼蟲期之持久性BTV感染期間的表現減少(White,Wilson等人，2005)。
BTV之病毒粒子具有約69奈米之直徑，其中雙層殼體(衣殼)時常由源自感染細胞之細胞膜的脂蛋白"假被膜"包圍。BTV基因組包括10個不同的雙鏈RNA區段，該等區段共同編碼7種結構蛋白(VP1至VP7)及4種非結構蛋白(NS1、NS2、NS3及NS3a)(Roy 1996)；9個基因組區段具有單順反子功能而第10個區段藉助另一框內起始密碼子編碼NS3及NS3A二者。基因組RNA在二十面體病毒粒子顆粒中藉由雙層蛋白衣殼受到殼體化(Verwoerd,Els等人，1972)。該二十面體核心包含2種主要蛋白(VP3及VP7)及3種次要蛋白(VP1、VP4、VP6)並由包含分別藉由基因組區段2及基因組區段5編碼之VP2及VP5的外衣殼包圍(Roy 1996)。VP2負責BTV至細胞之結合及進入、中和、血清型特異性及血凝反應。多聚形式之VP2(二聚物及三聚物)分佈於病毒顆粒外表面上VP5支架之大部分表面上(Hassan and Roy 1999)。VP2在24種BTV血清型中變化最大，且抗－VP2抗體之水平與體外及體內病毒中和狀況有關(Huismans and Erasmus 1981)。VP5在不同血清型BTV及不同BTV菌株之間亦有明顯的不同(de Mattos,de Mattos等人，1994；DeMaula,Bonneau等人，2000)且儘管迄今為止未確定VP5特異性中和MAb，但數據表明此蛋白可藉由其對VP2之構型影響在中和及血清型確定中起作用(Huismans and Erasmus 1981；Roy,Urakawa等人，1990；DeMaula等人，2000)。將經純化VP2注入綿羊中，該純化VP2經BTV抗核心血清免疫吸附以移除痕量VP7。50微克初始劑量之VP2足以產生VP2沉澱抗體以及中和抗體和血凝抑制抗體。此等綿羊可完全抵抗相同BTV血清型之毒性菌株的攻擊。低劑量之VP2仍可提供顯著水平之保護，即使在攻擊之前未檢測到中和抗體(Huismans,van der Walt等人，1987)。最新結果顯示VP2及NS1可表現藉由細胞毒性T－淋巴細胞(CTL)識別之抗原決定部位(Andrew,Whiteley等人，1995)而VP7及VP5不可能具有CTL抗原決定部位。到目前為止，VP3、VP4、VP6、NS2及NS3未在綿羊中刺激CTL反應(Lobato,Coupar等人，1997)。下表1(自(Wilson and Mecham 2000)修改)概述BTV之基因及其蛋白功能：
Lobato及Coupar(Lobato,Coupar等人，1997)已研發出基於牛痘病毒之表現載體，其含有諸多對應於編碼體內及體外研究所用BTV結構蛋白VP2、VP5及VP7之核苷酸序列的插入體。將此等表現載體投與兔子及綿羊以依據ELISA及中和抗體效價評定免疫反應並在綿羊中測試VP2及VP5構建體之保護性效能。經牛痘病毒表現之VP2、VP5及VP2＋VP5具有保護性，其中最高重現性保護出現於經VP2及VP5二者免疫之動物中，然而即使使用此構建體實施保護，亦會出現變化。
較佳提供抵抗BTV之改良免疫原組合物及疫苗組合物及用於製備及使用此等組合物(包括供用於鑑別診斷方法、試驗及套組之彼等組合物)之方法。
本說明書中任一文獻之引用或證實並非認可此文獻可用作本發明之先前技術。
本發明提供一種可在感染BTV或相關病毒之動物中引發抵抗環狀病毒屬(尤其是藍舌病病毒(BTV))之免疫反應或保護性免疫反應的免疫原組合物或疫苗組合物，其包括或主要包含一醫藥上或獸醫上可接受之媒劑或賦形劑及一載體，該載體含有或主要包含異源核酸分子並於該動物體內表現環狀病毒屬－BTV蛋白、抗原、免疫原或其抗原決定部位，例如(但不限於)BTV VP2(L2)及BTV VP5(M5)多肽。
該載體可為重組DNA質粒或重組病毒，例如重組腺病毒、重組疱疹病毒或痘病毒，如禽痘病毒(例如金絲雀痘苗病毒或雞痘病毒)。該動物可選自由羊、牛、豬、山羊、羚羊、馬、美洲駝及其他組成之有蹄類群組。
較佳地，該核酸分子分別包括或主要包含編碼BTV VP2(L2)之核苷酸20－2887(SEQ ID NO：3和1)及編碼BTV蛋白VP5(M5)之核苷酸30－1610(SEQ ID NO：4和2)。較佳實施例包括或包含哺乳動物密碼子優化之核酸分子。
該免疫原組合物或疫苗組合物可進一步包括佐劑，例如卡波姆。
該免疫原組合物或疫苗組合物可進一步包括該動物之非BTV病原體抗原或免疫原或其抗原決定部位或含有編碼該抗原或免疫原或其抗原決定部位之核酸分子並於該動物體內表現該核酸分子的載體或非BTV滅活或減毒病原體。
本發明亦涉及包括或主要包含下列之套組：(a)該免疫原組合物或疫苗組合物及(b)動物之非BTV病原體抗原或免疫原或其抗原決定部位或含有編碼該抗原或免疫原或其抗原決定部位之核酸分子並在該動物體內表現該核酸分子的載體或該動物之非BTV滅活或減毒病原體，其中(a)及(b)位於不同容器中，且該套組視情況含有用於混合及/或投與(a)及(b)之說明書。
本發明亦包括一種用於在動物中引發抵抗BTV之免疫反應或保護性免疫反應的方法，其可包括對該動物投與含有編碼該抗原、免疫原或其抗原決定部位之核酸分子的免疫原組合物或疫苗組合物。
本發明進一步包括一種用於在動物中引發抵抗BTV之免疫反應或保護性免疫反應的方法，其可包括對該動物投與：(a)該免疫原組合物或疫苗組合物，及(b)BTV分離抗原、免疫原或其抗原決定部位，其中在一初免－加強方案中於投與(b)之前投與(a)，或在一初免－加強方案中於投與(a)之前投與(b)，或者一起(相繼或以混合物形式)投與(a)及(b)。本發明亦涉及一種用於實施此方法之套組，其可包括位於不同容器中之(a)及(b)，視情況包括用於混合及/或投藥之說明書。
本發明甚至進一步包括抵抗BTV之初免－加強免疫或疫苗接種，其中使用含有或主要包含編碼及在體內表現BTV免疫原、抗原或抗原決定部位之核酸分子的DNA疫苗或免疫組合物或免疫原組合物實施初免並使用係含有或主要包含編碼及在體內表現BTV免疫原、抗原或抗原決定部位之核酸分子的疫苗或免疫組合物或免疫原組合物(係BTV滅活或減毒或亞單位(抗原、免疫原及/或抗原決定部位)製劑及/或重組或經修飾病毒疫苗或免疫組合物或免疫原組合物)實施加強。因此，本發明提供一種抵抗BTV之初免－加強免疫或疫苗接種方法，例如可包括下列之初免－加強免疫或疫苗接種：對目標物種動物投與含有或主要包含編碼及於體內表現BTV抗原、免疫原或抗原決定部位之核酸分子的本發明DNA疫苗或免疫組合物或免疫原組合物(作為初免)且隨後投與可包含編碼及於體內表現BTV免疫原、抗原或抗原決定部位之核酸分子的滅活BTV及/或減毒BTV或BTV亞單位(抗原、免疫原及/或抗原決定部位)製劑及/或重組或經修飾病毒疫苗或免疫組合物或免疫原組合物(較佳為於體內表現BTV免疫原、抗原或抗原決定部位之重組疫苗或免疫組合物或免疫原組合物)(作為加強)。較佳地，該加強應與該初免相匹配，例如，該加強含有或主要包含或表現至少一種藉由該初免表現之抗原、抗原決定部位或免疫原。
本發明之初免－加強方案可用於任一年齡之動物，較佳為幼小動物(例如，具有可檢測母體抗體及/或處於尚未斷奶期或護理期或哺乳期之動物)、成年前動物(較幼小動物大但還未達到成熟期或成年期或可交配或生殖之年齡的動物)、成年動物(例如，處於交配或生殖年齡或已度過此生命時期的動物)，且較佳在妊娠雌性或者在分娩、產仔或授精前雌性中採用該初免－加強方案。
本發明亦係關於此等免疫原組合物及疫苗組合物及其適用於此等初免－加強方案之套組及初免－加強方案。可對其實施初免－加強方案之宿主或目標物種包括易患由環狀病毒屬感染引起之疾病的任一動物(目標或宿主)物種，包括哺乳動物、爬行動物、鳥類，尤其是人類、伴侶哺乳動物或動物，例如(但不限於)犬、貓、馬、動物園哺乳動物或動物，例如水生哺乳動物(如海豹)、貓、馬、動物園爬行動物(例如，蛇、鱷魚、短吻鱷)及禽類物種。
特別佳地係對幼小動物實施該初免－加強方案，乃因此有助於在早期實施疫苗接種或免疫，舉例而言，可在幼小動物具有母體抗體之年齡時對該幼小動物首次實施該初免－加強方案。此方案之另一優點係其可為存於幼小動物相同位置或靠近幼小動物或彼此靠近之妊娠雌性提供安全度。因此，本發明提供一種抵抗BTV之初免－加強免疫或疫苗接種方法，且可對幼小動物(例如，羊羔、幼犬或貓仔)實施該方法，舉例而言，其中在該幼小動物具有抵抗BTV之母體抗體時實施初免且較佳在母體抗體可能減弱或減少或通常不存在時(例如，在護理期後哺乳期)實施加強。
因此，本發明亦提供用於實施初免－加強方案之套組，其包括或主要包含位於不同容器中之初免疫苗或免疫組合物或免疫原組合物及加強疫苗或免疫組合物或免疫原組合物，視情況包括用於混合及/或投藥之說明書。
另外，本發明提供一種鑑別診斷方法，其包括對動物投與免疫原組合物或疫苗組合物及/或BTV抗原、免疫原或其抗原決定部位，及測試該等動物是否存在未由該免疫原組合物或疫苗組合物表現及/或未存在於BTV抗原、免疫原或抗原決定部位中之BTV蛋白或其抗體。本發明亦涉及一種用於實施此方法之套組，其包括位於不同容器中之免疫原組合物或疫苗組合物及/或BTV抗原、免疫原或抗原決定部位與用於測試該BTV蛋白是否存在之試樣，視情況包括用於投與該免疫原組合物或疫苗組合物及/或BTV抗原、免疫原或抗原決定部位及/或用於實施該試驗之說明書。
應注意：在本揭示內容中且特定言之在申請專利範圍及/或各段落中，諸如"包括"("comprises"、"comprised"、"comprising"及諸如此類)術語及諸如"主要包含"("consisting essentially of"及"consists essentially of")術語具有美國專利法中對其所規定含義，例如，其包含未明確列舉出之要素，但不包含發現於先前技術中或可影響本發明之基本或新穎特徵之要素。
此等及其他實施例揭示於下列實施方式中或可自下列實施方式易知並涵蓋於下列實施方式中。
如本文所述，本發明係關於含有至少一種BTV多核苷酸或至少一種編碼至少一種BTV抗原、免疫原或抗原決定部位之核酸分子的載體，例如，包含至少一種BTV多核苷酸之體內及體外表現載體或包含並表現至少一種BTV抗原、免疫原或抗原決定部位之體內及體外表現載體；以及抵抗藍舌病之免疫原組合物及疫苗；例如，含有一或多種該等載體及/或一或多種該等載體之表現產物的組合物或疫苗。
較佳地，該等免疫原、抗原包括外衣殼蛋白VP2(L2)或外衣殼蛋白VP5(M5)或其抗原決定部位或組合，例如VP2及VP5；VP2；及VP5或其片段。該等組合可為不同的蛋白或多蛋白。因此，該等組合物或疫苗可含有一或多種表現一種以上蛋白(例如，不同的蛋白)之載體。該等組合物或疫苗可包含或其載體可表現來自BTV之不同菌株或分離物之蛋白。因此，該等組合物或疫苗可包含或其載體可表現VP2、VP5或其組合，其中該VP2及VP5係來自不同的菌株或分離物。
在此方面，應注意有血清型17 BTV分離物或菌株，例如野外分離物(作為區段儲存於GenBank中(de Mattos,de Mattos等人，1994)[VP2]分離物17B81，SEQ ID No.S72158；(Mecham and Johnson 2005)[VP5]分離物FL99，SEQ ID No：AY855281)；及/或美國典型培養物保藏中心VR－875TM (作為BTV血清型17儲存；來自具有典型藍舌病之綿羊的血液，Wyoming,1962)。由於BTV基因組之分段性質，因此需分別測定用於每一血清型區段之每一區段的基因組核苷酸序列。表2列示用於BTV血清型17之序列。
表2 BTV－17－可用於BTV血清型17之RNA序列的編號
而且，應注意，各血清型內VP2序列之對比系統進化分析表明存在一定同源性但所存在的差異性足以辨別單一血清型內之病毒譜系。BTV血清型主要藉助由基因組區段2編碼之病毒性外衣殼蛋白VP2加以控制。可設想：區段2之序列分析不僅可用於識別病毒血清型而且藉由與參照菌株之序列對比可用於識別個別病毒菌株之來源。
較佳地，在涉及至少一種存於本發明組合物或疫苗中或藉由載體於本發明組合物或疫苗中表現之抗原決定部位的實施例中，該(等)抗原決定部位係來自VP2、VP5或其組合，且該(等)抗原決定部位可來自不同的菌株或分離物。在此方面，應注意：吾人可定位或繪示存於BTV抗原或免疫原(VP5蛋白)中之抗原決定部位；參見，例如，(Martinez－Torrecuadrada,Langeveld等人，1999)及(Wang,Du Plessis等人，1995)、VP2蛋白(Heidner,Rossitto等人，1990；Rossitto and MacLachlan 1992；DeMaula,Bonneau等人，2000)及VP1蛋白(Huang,Hwang等人，1995)。
亦如本文所述，本發明係關於使用該等載體、免疫組合物及疫苗之方法，包括針對此病毒實施免疫及疫苗接種、表現藉由該(等)多核苷酸編碼之多肽；及在試驗中使用該等表現產物或產生用於試驗之抗體的方法；以及尤其係關於用於製備該(等)多核苷酸、載體、組合物疫苗、試樣之方法。
因此，本發明係關於用於防止及/或抗擊由BTV引起之疾病以便減少或消除臨床表現及/或病毒血症及/或損傷之方法。
本發明係關於適用於易患由BTV引起之疾病之不同動物(目標或宿主)物種的此等免疫原組合物及疫苗組合物，該等動物物種包括但不限於哺乳動物、爬行動物、鳥類，尤其是人類、伴侶哺乳動物或動物(例如犬、貓、馬)、動物園哺乳動物或動物(例如水生哺乳動物、貓、馬)、動物園爬行動物及禽類物種。
本發明進一步係關於涉及用於該等目標或宿主物種之免疫原組合物及疫苗組合物的免疫及疫苗接種方法。且在本發明之此態樣中提及，對於野生或非飼養動物(例如但不限於野生或非飼養鳥類或哺乳動物)而言，可藉由包含或含有一或多種載體之食物(例如，誘餌或哺乳動物或鳥類食物)遞送包括一或多種表現一或多種BTV抗原決定部位或抗原或免疫原的載體之組合物或將該等組合物留給野生或非飼養鳥類或哺乳動物食用以便藉由哺乳動物或鳥類消耗該食物經口投與該組合物當該一或多種載體係一或多種痘病毒(例如，禽痘病毒，如減毒金絲雀痘病毒(例如ALVAC)或減毒雞痘病毒(例如TROVAC)；或牛痘病毒，例如減毒牛痘病毒，如NYVAC)時，此投藥途經可為較佳。因此，本發明設想經口或經黏膜投藥，以及含有一或多種本發明載體之可食用組合物，類似於MERIAL狂犬病用產品RABORALTM 。自此揭示內容及此項技術中知識，熟習此項技術者可調配用於鳥或哺乳動物之含有適宜劑量之一或多種本發明載體之可食用動物飼料。而且，本發明涵蓋含有載體之組合物的局部投藥，參見，例如，關於載體組合物局部投藥之美國專利第6,348,450號；及用於對野生或非飼養動物局部投與組合物之裝置，參見，例如，關於此等用於齧齒類動物及鳥類之裝置的WO 01/95715，美國申請案第10/374,627號，於2003年2月26日提出申請；每一該等案件以及本文所引用或所參考每一文獻如同本文所引用每一文獻及本文所引用每一文獻中所參考或所引用的每一文獻一般以引用方式併入本文中。
本發明進一步係關於可實施鑑別診斷之方式及方法，例如，可辨別或有利於辨別受病原體BTV感染之動物與服用本發明之疫苗或免疫原組合物之動物的方法。
除包含編碼VP2及VP5之多核苷酸外，本發明之表現載體可包括一或多種編碼BTV其他蛋白(較佳為BTV之結構蛋白)之其他多核苷且該等序列較佳選自彼等編碼結構病毒性蛋白者。
該載體較佳包括對應於(例如)VP2、VP5或(較佳)VP2及VP5或其抗原決定部位之多核苷酸編碼區；即其多蛋白或抗原決定部位之表現被視為較佳。包含編碼不同蛋白(例如，VP2及/或VP5或其抗原決定部位)之若干不同多核苷酸的載體亦屬於本發明之範圍。尤其對於體內表現而言，該載體亦可包含對應於一種以上BTV血清型、菌株或分離物之多核苷酸，例如，兩或多種編碼不同菌株之VP2或VP5或其抗原決定部位的多核苷酸、編碼所有不同血清型(例如但不限於血清型1、2、4、9、10、11、13、16及17)之VP2或VP5或其抗原決定部位的多核苷酸。
同樣，免疫原組合物或疫苗組合物可包含一或多種用於表現對應於一種以上BTV血清型、菌株或分離物之多核苷酸(例如，兩種或更多種編碼不同菌株之VP2或VP5或其抗原決定部位的多核苷酸)的載體。尤其對於體內表現而言，該載體亦可包含一或多種編碼其他病原體及/或細胞因子之免疫原的核苷酸序列。
術語"編碼BTV蛋白之多核苷酸"主要意指編碼該蛋白之DNA片段或分離DNA分子或其互補鏈；但不排除RNA，在此項技術中，應理解：DNA序列中之胸苷(T)被視為等同於RNA序列中之尿嘧啶(U)。由於DNA序列中之胸苷(T)被視為等同於RNA序列中之尿嘧啶(U)，因此，可用於本發明(例如，用於RNA載體)之RNA序列可自DNA序列獲得。
術語蛋白包括肽及多肽。蛋白片段由於在投與宿主時能夠引發針對該蛋白之體液型及/或細胞型免疫反應而具有免疫活性。較佳地，該蛋白片段係與總蛋白實質具有相同免疫活性者。因此，本發明之蛋白片段包括或主要包含或包含至少一抗原決定部位或抗原決定簇。術語抗原決定部位與能夠引發體液型(B細胞)及/或細胞型(T細胞)免疫反應之蛋白位點有關。
因此，核苷酸之最小結構為其包括或主要包含或包含編碼BTV蛋白之抗原決定部位或抗原決定簇的核苷酸。更佳地，編碼總蛋白片段之多核苷酸包括或主要包含或包含最少21個核苷酸，較佳地，至少42個核苷酸，且較佳地，該序列之至少57個、87個或150個連串或接續核苷酸編碼該總蛋白或多蛋白。如上文所述，抗原決定部位測定程序，例如，產生重疊肽文庫(Hemmer,Pinilla等人，1998)、肽掃描技術(Pepscan)(Geysen,Meloen等人，1984)；(Geysen,Barteling等人，1985)；(Van der Zee,Van Eden等人，1989)；(Geysen 1990)；MultipinPeptide Synthesis Kits de Chiron)及演算法(De Groot and Rothman 1999)，可在無需過多實驗時用於實踐本發明。本文所引用及所併入其他文獻亦可為用於測定免疫原或抗原之抗原決定部位進而測定編碼此等抗原決定部位之核酸分子的方法提供咨詢。
用於表現該(等)多核苷酸之元件較佳存於本發明之載體中。最低限度地，此包括、主要包含或包含起始密碼子(ATG)、終止密碼子及啟動子，且視情況亦包括某些載體(例如，質粒及某些病毒載體，例如除痘病毒之病毒載體)之聚腺苷酸化序列。當該多核苷酸在(例如，較佳)該載體中編碼蛋白片段時，可將ATG置於閱讀框架之5'並將終止密碼子置於3'。可存在用於控制表現之其他元件，例如增強子序列、穩定化序列及可分泌該蛋白之信號序列。
用於製備及/或投與用於在體內或體外表現本發明基因之基因產物之載體或重組體或質粒的方法可為任一期望方法，例如，藉由下列或類似於揭示於下列中或揭示於所引用文獻中之方法的方法：美國專利第6,130,066號、第5,494,807號、第5,514,375號、第5,744,140號、第5,744,14l號、第5,756,103號、第5,762,938號、第5,766,599號、第5,990,091號、第6,004,777號、第6,130,066號、第6,497,883號、第6,464,984號、第6,451,770號、第6,391,314號、第6,387,376號、第6,376,473號、第6,368,603號、第6,348,196號、第6,306,400號、第6,228,846號、第6,221,362號、第6,217,883號、第6,207,166號、第6,207,165號、第6,159,477號、第6,153,199號、第6,090,393號、第6,074,649號、第6,045,803號、第6,033,670號、第6,485,729號、第6,103,526號、第6,224,882號、第6,312,682號、第6,312,683號、第6,348,450號、第4,603,112號號、第4,769,330號、第5,174,993號、第5,505,941號、第5,338,683號、第5,494,807號、第4,394,448號、第4,722,848號、第4,745,051號、第4,769,331號、第5,591,639號、第5,589,466號、第4,945,050號、第5,677,178號、第5,591,439號、第5,552,143號及第5,580,859號；於1986年10月16日提出申請之美國專利申請案第920,197號；WO 94/16716；WO 96/39491；WO 91/11525；WO 98/33510；WO 90/01543；EP 0 370 573；EP 265785；(Paoletti 1996)；(Moss 1996)；Richardson(Ed)(1995)Methods in Molecular Biology 39,"Baculovirus Expression Protocols," Humana Press Inc.；(Smith,Summers等人，1983)；(Pennock,Shoemaker等人，1984)；(Roizman 1996)；(Andreansky,He等人，1996)；(Robertson,Ooka等人，1996)；(Frolov,Hoffman等人，1996)；(Kitson,Burke等人，1991)；(Ballay,Levrero等人，1985)；(Graham 1990)；(Prevec,Schneider等人，1989)；(Felgner,Kumar等人，1994)；(Ulmer,Donnelly等人，1993)；(McClements,Armstrong等人，1996)；(Ju,Edelstein等人，1998)；及(Robinson and Torres 1997)。因此，於本發明中載體可為任一適宜重組病毒或病毒載體，例如痘病毒(例如，牛痘病毒、禽痘病毒、金絲雀痘病毒、雞痘病毒、浣熊痘病毒、豬痘病毒等)、腺病毒(例如，犬腺病毒)、疱疹病毒、杆狀病毒、逆轉錄病毒等(如以引用方式併入本文之文獻中所述)；或該載體可為質粒。本文所引用及以引用方式併入本文中之文獻除了提供可用於實踐本發明之載體實例外，亦可提供擬藉由存於或包含於本發明多價體或混合劑免疫原組合物或疫苗中載體表現之非－BTV蛋白或其抗原決定部位(例如非－BTV免疫原或其抗原決定部位)、細胞因子等的來源。
本發明亦係關於包含載體(例如，表現載體)之製劑，例如，疫苗或免疫原組合物。該等製劑可包括、主要包含或含有一或多種載體(例如，表現載體，如體內表現載體)，該(等)載體包括、主要包含或包含(且較佳表現)一或多種編碼VP2、VP5或其組合或多蛋白(尤其是如上文所述者，如VP2、VP5、VP2及VP5或至少其一抗原決定部位)之BTV多核苷酸；且較佳地，該載體於醫藥上或獸醫上可接受之載劑、賦形劑或媒劑中包含並表現包括、主要包含或包含編碼BTV VP2及/或VP5之編碼區的多核苷酸。因此，依照本發明之實施例，該製劑之其他載體包括、主要包含或包含編碼一或多種BTV其他蛋白(例如，VP2、VP5或其抗原決定部位)之多核苷酸且該載體於適當條件下表現該(等)BTV其他蛋白。
依照另一實施例，該製劑之載體包括、主要包含或包含編碼一或多種BTV蛋白或其抗原決定部位(例如，一或多種BTV血清型、菌株或分離物)之多核苷酸；且較佳地，在適宜宿主細胞中或於適當條件下，該(等)載體表現藉由該(等)多核苷酸編碼之多肽。本發明製劑較佳包括、主要包含或包含至少兩種載體，該等載體包括、主要包含或包含且較佳亦表現(較佳於體內在適當條件或適宜條件下或在適宜宿主細胞中)藉由編碼相同蛋白及/或不同蛋白(但較佳為相同蛋白)之不同BTV血清型、菌株或分離物之多核苷酸編碼的多肽。至於含有一或多種含有、主要包含或包含編碼並(較佳)表現(較佳在體內)BTV VP2或VP5或其抗原決定部位之多核苷酸之載體的製劑，表現產物較佳來自兩、三或更多種不同的BTV血清型、菌株或分離物，較佳為菌株。本發明亦係關於含有、主要包含或包含編碼並表現不同菌株之VP2或VP5之多核苷酸的載體。較佳情形為於此等混合物中，至少一種載體含有、主要包含或包含編碼並表現VP2之多核苷酸。
依照另一實施例及如下文更詳細所示，該製劑中其他載體包括並表現一或多種其他病原體之一或多種細胞因子及/或一或多種免疫原。其他病原體之細胞因子、免疫原或其抗原決定部位及編碼該等之核酸分子的來源可發現於本文所引用文獻以及WO 02096349、WO 0208162、WO 0020025、WO 00152888、WO 0145735、WO 00127097、WO 0116330、WO 0077210、WO 0077188、WO 0077043、WO 9842743、WO 9833928、WO 9749826、WO 9749825、美國專利第6,387,376號、第6,306,400號、第6,159,477號、第6,156,567號、第6,153,199號、第6,090,393號、第6,074,649號、第6,033,670號中。
本發明亦係關於本文所揭示不同實施例之各種組合，例如，含有各種載體之組合物或疫苗、含有載體及蛋白(BTV及/或非BTV)及/或細胞因子之組合物或疫苗等等。
包括包含並表現編碼VP2、VP5之多核苷酸之體外或體內表現載體的製劑構成本發明之較佳實施例。
依照另一較佳實施例，一或多種額外結構蛋白VP7及/或VP3聯合本發明之VP2及VP5結構蛋白藉由相同表現載體或藉由其自己的表現載體來表現。該等較佳基於單一多核苷酸一起表現，例如作為多蛋白。即，在某些實施例中，該載體進一步含有、主要包含或包含一或多種編碼VP7及/或VP3之核苷酸；或者組合物或疫苗進一步含有、主要包含或包含一或多種含有、主要包含或包含一或多種編碼VP7及/或VP3之核苷酸的額外載體；此載體或此等載體較佳表現該(等)結構蛋白；並且，VP7及VP3較佳以聯合方式表現，且更佳地，作為多蛋白。
依照另一較佳實施例，一或多種非結構蛋白NS1、NS2及NS3及/或VP1、VP4聯合本發明之VP2及VP5結構蛋白藉由相同表現載體或藉由其自己的表現載體來表現。即，在某些實施例中，該載體進一步含有、主要包含或包含一或多種編碼VP1、VP4、NS1、NS2及/或NS3之核苷酸；或者組合物或疫苗進一步含有、主要包含或包含一或多種含有、主要包含或包含一或多種編碼VP1、VP4、NS1、NS2及/或NS3之核苷酸的額外載體；此載體或此等載體較佳表現該(等)結構蛋白；且較佳表現VP1、VP4、NS1、NS2及/或NS3。因此，本發明亦係關於載體，例如包括、主要包含或包含編碼VP1、VP4、NS1、NS2及NS3、其組合(包括其多蛋白)之多核苷酸的體內或體外表現載體。該載體可為一種包括、主要包含或包含編碼一或多種結構蛋白(例如，VP2、VP5、VP7及/或VP3組合及其多蛋白)之多核苷酸的上述載體，例如，含有或主要包含編碼結構蛋白或其抗原決定部位之多核苷酸的此載體亦可含有或主要包含編碼一或多種非結構蛋白之多核苷酸、其組合、其多蛋白或其抗原決定部位的其多核苷酸。作為一替代方案，本發明係關於亦包含至少一種含有編碼及(較佳)表現非結構蛋白之多核苷酸之載體且視情況包含醫藥上或獸醫上可接受之載劑、媒劑或賦形劑的如上文所述製劑。
對於製備本發明之載體(例如，表現載體)而言，熟習此項技術者易知各種BTV血清型、菌株及分離物及關於其基因組之核苷酸序列的闡述，參見例如本文所述，亦參照其中可獲知核酸序列資訊之24種BTV血清型(Wilson and Mecham 2000)。
例如，本文提及菌株BTV－17。本文提供每一蛋白之對應核苷酸序列(de Mattos,de Mattos等人，1994；Huang,Hwang等人，1995；Bernard,Israel等人，1997)。藉由對比及比對該等序列，可容易地測定編碼另一BTV血清型或菌株中此蛋白之多核苷酸。
如本文所述，術語多核苷酸應理解為意指編碼對特定BTV菌株具有特異性之蛋白或其片段或其抗原決定部位的核酸序列；並且，同樣地，術語多核苷酸應理解為包括不同BTV菌株之對應核苷酸序列及由密碼子簡並產生的不同核苷酸序列。因此，編碼BTV VP2之多核苷酸應理解為包括、主要包含或包含(a)BTV－17之nt 20－2887(SEQ ID NO：3)，(b)不同BTV菌株之對應序列，及(c)編碼BTV VP2但因密碼子簡並而不同於(a)及(b)之核苷酸序列。
編碼外衣殼蛋白VP2之BTV L2基因在BTV球形菌株之間具有最大程度的遺傳變異性。此並不令人感到驚奇，乃因此蛋白負責病毒中和及血清型－特異性(Mecham,Dean等人，1986；Roy 1992)且其可能受遺傳漂變及建立者效應選擇的影響。遺傳漂變及建立者效應可產生具有增強毒性之變體(Bernard,Israel等人，1997)。人們已經鑑別出許多中和決定子(Ghiasi,Fukusho等人，1987；DeMaula,Heidner等人，1993；Jewell and Mecham 1994)。已經證實VP2係主要負責結合並進入哺乳動物宿主細胞之蛋白(Hassan and Roy 1999)。使用系統進化分析時，兩血清型間之差異通常會使得病毒能根據血清型分離而與分離地理來源無關(Pritchard and Gould 1995；Bonneau,Zhang等人，1999)。BTV M5基因編碼內外衣殼蛋白VP5且在諸多BTV基因中具有第二大程度的遺傳變異性，在給定血清組中顯示51－71%一致性。VP5可造成外衣殼結構出現構象變化並改變中和特性(Cowley and Gorman 1989；DeMaula,Bonneau等人，2000)。VP5亦可用於識別宿主細胞(Roy 1992)。
由於血清型內及血清型外之固有遺傳變異性，本發明涵蓋編碼如下蛋白之多核苷酸：該等蛋白之胺基酸序列與該蛋白之共有BTV胺基酸序列一致或同源並呈現功能等效性。舉例而言，經表現VP2衣殼蛋白與自下列表現之多肽的對應衣殼序列可具有大於20%之一致性：(a)包括BTV－17區段2之核苷酸20－2887(SEQ ID NO：3)，(b)不同BTV菌株之對應序列，及/或(c)編碼BTV VP2但因密碼子簡並而不同於(a)及(b)以及因菌株、血清型及血清組遺傳變異性而不同於(a)及(b)之核苷酸序列。儘管有此變異性，但該等多核苷酸在功能上可編碼VP2衣殼多肽。
因此，本發明涵蓋表現此等功能上同源之多肽的多核苷酸；及與編碼和同源多肽同源或一致之多肽之多核苷酸具有對應程度同源性或一致性之彼等多核苷酸。同源多肽較佳含有一或多個與其一致或同源之多肽的抗原決定部位，以便同源多肽與和其一致或同源之多肽呈現免疫類似性或一致性，例如，同源多肽產生與和其一致或同源之多肽類似的或較之更佳的免疫反應(為熟習免疫學者所知)及/或該同源多肽結合至由與其一致或同源之多肽產生及/或結合的抗體，較佳不結合其他抗體。
因此，本發明設想同源多肽及和其一致或同源之多肽的片段(較佳為彼等與同源多肽或和其一致或同源之多肽呈現免疫類似性或一致性之片段)，且因此本發明亦可設想可代表同源多肽及和其一致或同源之多肽的多核苷酸片段的多核苷酸且該等多核苷酸可用於本發明。
術語"序列一致性"表示兩等長胺基酸序列間或兩等長核苷酸序列間之同源性程度的定量量度。若擬對比的兩個序列具有不等長度，則可能必須藉助在該等蛋白序列末端插入間隙或平截來比對二者以達最佳配合。可依照((Nref －Ndif )/Nref )×100計算序列一致性，其中Ndif 係在比對時兩序列中不一致殘基之總數量且其中Nref 係一個序列中殘基之數量。因此，DNA序列AGTCAGTC與序列AATCAATC可具有75%之序列一致性(Ndif ＝2及Nref ＝8)。缺口計數為非一致性特異性殘基，即，DNA序列AGTGTC可與DNA序列AGTCAGTC具有75%之序列一致性(Ndif ＝2及Nref ＝8)。序列一致性亦可藉由BLAST程式(例如，BLASTP程式)計算(Pearson and Lipman 1988)(www.ncbi.nlm.nih.gov/cgi－bin/BLAST)。在本發明之一個態樣中，係藉由序列比對方法ClustalW及由(Thompson,Higgins等人，1994)所述缺省參數實施比對，此可自http：//www2.ebi.ac.uk/clustalw/獲知。因此，多核苷酸可為任一包含DNA、RNA、LNA(鎖核酸)、PNA、RNA、dsRNA、RNA－DNA－雜合體之核酸分子及非天然核苷酸。
且自本文揭示內容可知，藉由本發明載體表現之蛋白或多肽較佳係免疫活性肽及多肽，例如BTV－17之多肽或蛋白，藉由本發明載體表現之蛋白或多肽可為：a)一或多種不同BTV血清型、菌株或分離物之對應蛋白或多肽，b)與其(BTV－17及/或a)不同但保留與天然BTV蛋白具有等於或大於20%之一致性的蛋白。因此，所提及BTV蛋白可包括如本文所述額外蛋白。
不同BTV血清型及菌株可以(例如)存儲編號VR－875、VR－1231、VR－187、VR－873、VR－983、VR－1231AF或VR－1231CAF自保藏中心(特定言之，係美國典型培養物保藏中心(ATCC))獲得，且如本文另外所述，亦可以化學方式合成完全基因。
在本發明中，多核苷酸較佳亦包括編碼信號肽之核苷酸序列(定位於表現蛋白編碼區上游)以利於其釋放；且，因此，本發明涵蓋藉助前導序列或信號序列表現諸如BTV抗原、免疫原或其片段(如，抗原決定部位)等BTV多肽。該前導序列或信號序列可為內源序列，例如，BTV多肽之天然信號序列。該前導序列或信號序列亦可為異源序列且因此其可藉由與BTV異源之核苷酸序列編碼。舉例而言，該前導序列或信號序列可為該載體之內源序列，或者前導序列或信號序列與該載體及BTV二者異源，例如，組織纖維蛋白溶酶原激活因子(tPA)(如，人類tPA)之信號肽，且因此，該載體或其中多核苷酸可包括編碼該前導序列或信號肽(例如，人類組織纖維蛋白溶酶原激活因子(tPA)之前導序列或信號肽)之序列(Hartikka,Sawdey等人，1996)。較佳將編碼該信號肽之核苷酸序列插入框內及編碼BTV多肽(例如，VP2、VP5或組合，如VP2及VP5)之序列的上游。
依照本發明之一實施例，該等載體(如體內表現載體)係病毒載體。
病毒載體(如，病毒表現載體)較佳為：痘病毒，例如牛痘病毒或減毒牛痘病毒(例如，MVA，即一種在Ankara疫苗菌株於雞胚成纖維細胞上傳代570次以上之後所獲得經修飾Ankara菌株，參見(Stickl and Hochstein－Mintzel 1971；Sutter and Moss 1992)；可以ATCC VR－1508獲得者；或NYVAC(參見美國專利第5,494,807號，例如，美國專利第5,494,807號之實例1至實例6以及下文等等，其論述NYVAC之構造、以及NYVAC與自Copenhagen菌株牛痘病毒基因組刪除之額外ORF之差異、以及異源編碼核酸分子至該重組體位點之插入、以及匹配啟動子之使用；亦可參見WO 96/40241)；禽痘病毒或減毒禽痘病毒(例如，金絲雀痘、雞痘、野鴿痘、家鴿痘、鵪鶉痘、ALVAC或TROVAC；參見，例如，美國專利第5,505,941號、第5,494,807號)、豬痘、浣熊痘、駱駝痘或黏液瘤變性病毒；腺病毒，例如禽類、犬、豬、牛、人類腺病毒；或疱疹病毒，例如羊疱疹病毒(OHV1及2)、馬疱疹病毒(EHV血清型1及4)、犬疱疹病毒(CHV)、貓疱疹病毒(FHV)、牛疱疹病毒(BHV血清型1及4)、豬疱疹病毒(PRV)、馬立克氏病(Marek's disease)病毒(MDV血清型1及2)、火雞疱疹病毒(HVT或MDV血清型3)或鴨疱疹病毒。當使用疱疹病毒時，對於禽類物種疫苗接種而言，優選載體HVT；對於牛之疫苗接種而言，優選牛載體；對於綿羊之疫苗接種而言，優選羊載體；且對於馬之疫苗接種而言，優選載體EHV。
更一般而言，在某些實施例中，較佳使載體與宿主匹配，例如，在馬中使用馬病毒(如EHV)，或在禽類(如家禽或雞)中使用係禽類病原體之載體(如雞痘、HVT、MDV或鴨疱疹)，或在羊中使用係羊病原體之載體(如OHV)，在牛(例如，奶牛)中使用牛病原體(如BHV)，或在豬中使用係豬病原體之載體(如豬疱疹病毒)，或在犬(例如，狗)中使用係犬病原體之載體(如犬腺病毒或犬疱疹病毒)，在貓中使用係貓病原體之載體(如FHV)，乃因此有利於抵抗該載體之免疫反應進而提供抵抗宿主或目標物種之病原體的免疫反應以及抵抗環狀病毒屬之免疫反應。
然而，亦應注意：較佳情形可為該載體不為該宿主之天然病原體；以便於(例如)該載體可具有例如外源BTV編碼序列表現，但具有有限的或不具有複製；舉例而言，禽痘載體在哺乳動物宿主中之使用，如在美國專利第5,174,993號中所述。亦應注意：本發明涵蓋疫苗、免疫及免疫原組合物，其中該等術語以此項技術中對其所施加含義使用；參見，例如，本文所引用文獻，例如美國專利第6,497,883號。
依照本發明之另一實施例，痘病毒載體(如表現載體)係金絲雀痘病毒或雞痘病毒載體，較佳為減毒金絲雀痘病毒或雞痘病毒。在此方面，金絲雀痘病毒可得自ATCC寄存編號VR－111。減毒金絲雀痘病毒闡述於美國專利第5,756,103號(ALVAC)及WO 01/05934中。亦可獲得許多雞痘病毒疫苗接種用菌株，例如MERIAL出售之DIFTOSEC CT菌株及Intervet出售之NOBILIS VARIOLE疫苗；亦可參照美國專利第5,766,599號，該案係關於減毒雞痘菌株TROVAC。
關於痘病毒及如何產生其重組體及如何投與其重組體之資訊，熟習此項技術者可參照本文所引用文獻及WO 90/12882，例如，關於牛痘病毒，尤其於美國專利第4,769,330號、第4,722,848號、第4,603,112號、第5,110,587號、第5,494,807號及第5,762,938號中述及；關於雞痘，尤其於美國專利第5,174,993號、第5,505,941號及第US－5,766,599號中述及；關於金絲雀痘病毒，尤其在美國專利第5,756,103號中述及；關於豬痘，尤其在美國專利第5,382,425號中述及；關於浣熊痘，尤其在WO 00/03030中述及。
當該表現載體係牛痘病毒時，擬表現之多核苷酸的插入位點較佳位於胸苷激酶(TK)基因或插入位點、血球凝集素(HA)基因或插入位點、編碼A型包涵體(ATI)之區；亦可參見本文所引用文獻，尤其是關於牛痘病毒者。倘若為金絲雀痘病毒，則插入位點較佳為ORF C3、ORF C5及/或ORF C6；亦可參見本文所引用文獻，尤其是關於金絲雀痘病毒者。倘若為雞痘，則該插入位點較佳為ORF F7及/或ORF F8；亦可參見本文所引用文獻，尤其是關於雞痘病毒者。MVA病毒之插入位點較佳係如各出版物中所述，包括(Carroll,Overwijk等人，1997)；(Stittelaar,Wyatt等人，2000)；(Sutter,Wyatt等人，1994)；在此方面，亦應注意：完全MVA基因組闡述於(Antoine,Scheiflinger等人，1998)中，該文件有助於熟習此項技術者使用其他插入位點或其他啟動子。
較佳地，當該表現載體係痘病毒時，插入擬表現之多核苷酸在特定痘病毒啟動子控制下，例如，尤其是牛痘啟動子7.5k Da(Cochran,Puckett等人，1985)、牛痘啟動子I3L(Riviere,Tartaglia等人，1992)、牛痘啟動子HA(Shida 1986)、牛痘啟動子ATI(Funahashi,Sato等人，1988)，牛痘啟動子H6((Taylor,Weinberg等人，1988)；(Guo,Goebel等人，1989)；(Perkus,Limbach等人，1989))。
較佳地，對於哺乳動物疫苗接種而言，該表現載體係金絲雀痘病毒或雞痘。藉此方式，可在有限複製或無有效複製時表現異源蛋白，例如，BTV蛋白。較佳地，對於禽類(例如，雞、鴨、火雞及鵝)之疫苗接種而言，該表現載體係金絲雀痘病毒或雞痘。
當該表現載體係火雞疱疹病毒或HVT時，較佳插入位點係位於BamHI I片段或HVT之BamHI M片段。該HVT BamHI I限制酶切片段可包括若干開放閱讀框架(ORF)及3個基因間區域且包括若干較佳插入區(例如，作為較佳區之3個基因間區域1、2及3)及ORF UL55(參見，例如FR－A－2 728 795，美國專利第5,980,906號)。該HVT BamHI M限制酶切片段包括ORF UL43，其亦為較佳插入位點(參見，例如，FR－A－2 728 794，美國專利第5,733,554號)。
當該表現載體係EHV－1或EHV－4疱疹病毒時，較佳插入位點包括TK、UL43及UL45(參見，例如，EP－A－668355)。
較佳地，當該表現載體係疱疹病毒時，擬表現之多核苷酸在真核啟動子控制下插入，例如強真核生物啟動子，較佳為CMV－IE(鼠類或人類)啟動子；即，在本文實施例中，擬表現之多核苷酸係以可操作方式連接至啟動子，且在疱疹病毒實施例中，較佳地，擬表現多核苷酸係以可操作方式連接至強真核啟動子，例如mCMV－IE或hCMV－IE啟動子。本文亦針對作為載體之質粒論述強啟動子。
依照本發明之又一實施例，該載體(例如，體內表現載體)係質粒載體或DNA質粒載體，例如在稱作DNA疫苗者中使用的質粒載體類別(相對於在產生不可用於DNA疫苗之重組病毒的同源重組中所用轉染質粒而言)。
術語質粒涵蓋任一呈多核苷酸序列形式之DNA轉錄單元，該多核苷酸序列包含本發明之多核苷酸及為由該多核苷酸編碼者於期望宿主或目標之細胞中進行體內表現所需之元件；且，在此方面，應注意：有超螺旋及非超螺旋環狀質粒以及直線型及多聚化形式，所有該等均欲屬於本發明之範圍。
每一質粒包括或含有或主要包含於該多核苷酸之宿主細胞中表現的啟動子以及編碼病原體(例如，BTV(或BTV及另一病原體))之抗原或抗原決定部位的多核苷酸；且，可認為該多核苷酸以可操作方式連接至啟動子或處於該啟動子控制下或依賴於該啟動子。一般而言，較佳採用真核啟動子，例如，強真核啟動子。較佳強真核生物啟動子係源於人類或鼠類之立即早期巨細胞病毒啟動子(CMV－IE)，或視情況源於諸如大鼠或豚鼠等另一生物。該CMV－IE啟動子可包括實際啟動子部分，其可與或不與增強子部分締合。可參照EP－A－260 148、EP－A－323 597、美國專利第5,168,062號、第5,385,839號及第4,968,615號以及PCT WO 87/03905。該CMV－IE啟動子較佳係人類CMV－IE(Boshart,Weber等人，1985)或鼠類CMV－IE。
更一般而言，該啟動子源於病毒或細胞。可有效地用於實踐本發明之強病毒啟動子(不包括CMV－IE)係SV40病毒之早期/晚期啟動子或勞斯肉瘤(Rous sarcoma)病毒之LTR啟動子。可有效地用於實踐本發明之強細胞啟動子係細胞骨架基因之啟動子，例如，結蛋白啟動子(Kwissa,van Kampen等人，2000)或肌動蛋白啟動子(Miyazaki,Takaki等人，1989)。
本發明包含此等啟動子之功能性亞片段，即此等啟動子維持足夠啟動活性之部分，例如，WO 98/00166或美國專利第6,156,567號之截短CMV－IE啟動子可用於實踐本發明。因此，用於實踐本發明之啟動子可包括全長啟動子維持足夠啟動活性且因此可用作啟動子之衍生物及亞片段，較佳地，啟動活性實際上類似於自其衍生該衍生物或亞片段之實際或全長啟動子的活性，例如，類似於美國專利第6,156,567號之截短CMV－IE啟動子的活性與全長CMV－IE啟動子之活性。因此，用於實踐本發明之CMV－IE啟動子可包括或主要包含或包含全長啟動子之啟動子部分及/或全長啟動子之增強子部分以及衍生物及亞片段。
較佳地，該等質粒包括或主要包含其他表現控制元件。特別佳地，納入穩定化序列，例如，內含子序列，較佳為兔子β－球蛋白基因之內含子II(van Ooyen,van den Berg等人，1979)。
關於質粒及病毒載體(不包括痘病毒)之聚腺苷酸化信號(polyA)，較佳可使用牛生長激素(bGH)基因之polyA信號(參見，美國專利第5,122,458號)或兔子β－球蛋白基因之poly(A)信號或SV40病毒之poly(A)信號。
關於可在質粒中使用的其他表現控制元件，可將注意力集中於可用於疱疹病毒表現載體之表現控制元件。
依照本發明之另一實施例，該等表現載體係可用於在適當細胞系統中於體外表現蛋白之表現載體。在分泌後或在分泌之前或期間(若無分泌，則通常會發生或實施細胞裂解)可以培養物上清液或自培養物上清液收集表現蛋白，視情況藉由濃縮方法(例如，超濾)加以濃縮及/或藉由純化方法(例如，親和型、離子交換型或或凝膠過濾型層析方法)加以純化。
藉由下列可生成蛋白：藉由質粒轉染哺乳動物細胞、於哺乳動物細胞或禽類細胞中在病毒載體無有效複製時實施複製或表現或對昆蟲細胞(例如，Sf9草地黏蟲細胞ATCC CRL 1711；亦可參見美國專利第6,228,846號、第6,103,526號)實施杆狀病毒複製(參見，例如，美國專利第4,745,051號；(Vialard,Lalumiere等人，1990)；Luckow(Luckow and Summers 1988)，例如，Autographa californica Nuclear Polyhedrosis Virus AcNPV)。可使用的哺乳動物細胞較佳為倉鼠細胞(例如，CHO或BHK－21)或猴子細胞(例如，COS或VERO)。因此，本發明相應地涵蓋納入本發明之多核苷酸的表現載體以及由此自體外表現產生或表現的BTV蛋白或其片段及含有該等之製劑。
因此，本發明亦係關於BTV蛋白濃縮及/或純化製劑。當該多核苷酸編碼若干蛋白且該等蛋白受到切割時，則上述製劑中含有切割蛋白。
本發明亦係關於抵抗BTV之免疫原組合物及疫苗，其包括至少一種本發明之體內表現載體及醫藥上或獸醫上可接受之賦形劑或載劑或媒劑且視情況包括佐劑。
免疫原組合物涵蓋任一在投與目標物種時可引發抵抗BTV之免疫反應的組合物。術語疫苗應理解為意指能夠引發有效的保護之組合物。目標物種包括哺乳動物，例如，馬、犬、貓、牛、羊、豬及人類；爬行動物及鳥類或禽類。此列表意欲包括繁殖動物、產卵動物、生產動物及伴侶動物。
醫藥上或獸醫上可接受之載劑或媒劑或賦形劑為一熟習此項技術者所熟知。舉例而言，醫藥上或獸醫上可接受之載劑或媒劑或賦形劑可為0.9% NaCl鹽水溶液或磷酸鹽緩衝液。醫藥上或獸醫上可接受之載劑或媒劑或賦形劑可為有利於投與該載體(或自本發明載體於體外表現之蛋白)之任一化合物或若干化合物之組合；較佳地，該載劑、媒劑或賦形劑可有利於轉染及/或改良該載體(或蛋白)之保存。劑量及劑量體積在本文中陳述於免疫及疫苗接種方法之簡要說明中，且亦可由彼等熟習此項技術者自結合此項技術知識閱讀本揭示內容在無需任何過多實驗時確定。
本發明之免疫原組合物及疫苗較佳包括或主要包含一或多種佐劑。特定言之，用於實踐本發明之適宜佐劑係(1)丙烯酸或甲基丙烯酸之聚合物、馬來酸酐及烯基衍生物聚合物，(2)免疫刺激序列(ISS)，例如，具有一或多個未經甲基化CpG單元之寡脫氧核糖核苷酸序列(Klinman,Yi等人，1996；WO 98/16247)，(3)水包油型乳液，例如，闡述於由M.Powell,M.Newman出版的"Vaccine Design,The Subunit and Adjuvant Approach"之第147頁(Powell and Newman 1995)中之SPT乳液，及闡述於該著作第183頁之乳液MF59，(4)含有四級銨鹽之陽離子脂質，(5)細胞因子，(6)氫氧化鋁或磷酸鋁或(7)陳述於本發明所引用及以引用方式併入本發明之任一文獻中的其他佐劑，或(8)該等之任一組合或混合物。
特別適用於病毒載體之水包油型乳液(3)可基於：－輕質液體石蠟油(歐洲藥典類別)，－類異戊二烯油，例如角鯊烷、角鯊烯，－自烯烴(例如，異丁烯或癸烯)之寡聚反應產生的油，－具有直鏈烷基之酸或醇的酯，例如植物油、油酸乙酯、丙二醇、二(辛酸酯/癸酸酯)、甘油三(辛酸酯/癸酸酯)及丙二醇二油酸酯，或－具支鏈脂肪醇或脂肪酸之酯，尤其是異硬脂酸酯。
該油可聯合乳化劑使用以形成乳液。該等乳化劑可為非離子型表面活性劑，例如：－一端為山梨醇酐、二縮甘露醇(例如，無水甘露醇油酸酯)、甘油、聚甘油或丙二醇且另一端為油酸、異硬脂酸、蓖麻油酸或羥基硬脂酸之酯，該等酯視情況經乙氧基化，－聚氧丙烯－聚氧乙烯嵌段共聚物，例如，Pluronic，如，L121。
在類別(1)佐劑聚合物中，較佳者係交聯丙烯酸或甲基丙烯酸之聚合物，尤其是藉由糖或多元醇之聚烯基醚交聯者。已知此等化合物之名稱為卡波姆(Pharmeuropa，第8卷，no.2，1996年6月)。一熟習此項技術者亦可參照美國專利第2,909,462號，該案件提供藉由多羥基化合物交聯之丙烯酸系聚合物，該多羥基化合物具有至少3個羥基基團，較佳不大於8個此基團，至少3個羥基基團之氫原子經具有至少2個碳原子之不飽和脂肪族基團代替。較佳基團係彼等含有2個至4個碳原子者，例如乙烯基、烯丙基及其他乙烯系不飽和基團。該等不飽和基團亦可含有其他取代基，例如，甲基。以名稱Carbopol(BF Goodrich,Ohio,USA)出售之產品特別適宜。該等係藉由烯丙基蔗糖或藉由烯丙基異戊四醇交聯。其中，提及Carbopol 974P、934P及971P。
關於馬來酸酐－烯基衍生物共聚物，較佳者係EMA(Monsanto)，其係直鏈或交聯伸乙基－馬來酸酐共聚物且其藉由(例如)二乙烯基醚交聯。亦可參照(Regelson,Kuhar等人，1960)。
對於結構而言，丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物及EMA較佳可藉由具有下式之基本單元形成：
其中：－R1 及R2 可為相同或不同，二者表示H或CH3 －x＝0或1，較佳地，x＝1 －y＝1或2，其中x＋y＝2。
對於EMA，x＝0且y＝2且對於卡波姆，x＝y＝1。
此等聚合物可溶於水或生理鹽溶液(20克/公升NaCl)且可藉由(例如)蘇打(NaOH)將pH調節至7.3至7.4以提供可將表現載體納入其中之佐劑溶液。最終疫苗組合物中之聚合物濃度可介於0.01% w/v與1.5% w/v之間，較佳介於0.05% w/v至1% w/v之間且較佳介於0.1% w/v至0.4% w/v之間。
較佳但並非僅適用於質粒之含四級銨鹽之陽離子脂質(4)較佳為彼等具有下式者： 其中R1 係具有12至18個碳原子之飽和或不飽和直鏈脂肪族基團，R2 係含有2或3個碳原子之另一脂肪族基團且X係胺或羥基基團。
在此等陽離子脂質中，較佳者係DMRIE(N－(2－羥基乙基)－N,N－二甲基－2,3－雙(十四烷基氧基)－1丙烷銨鹽；WO 96/34109)，較佳與中性脂質(較佳為DOPE(二油醯基－磷脂醯基－乙醇胺；Behr J.P.,1994,Bioconjugate Chemistry,5,382－389))締合，以形成DMRIE－DOPE。
較佳地，具有佐劑之質粒混合物在投與該製劑時或在即將投與該製劑之前當場或(較佳)同時形成；舉例而言，在即將投藥之前或投藥之前，形成該質粒－佐劑混合物以利於該混合物在投藥之前具有足夠時間(例如，在投藥前約10分鐘至約60分鐘期間，如在投藥前約30分鐘)形成複合物。
當存在DOPE時，DMRIE：DOPE莫耳比例較佳為約95：約5至約5：約95，更佳為約1：約1，例如，1：1。
DMRIE或DMRIE－DOPE佐劑：質粒重量比例可介於約50：約1與約1：約10之間，例如介於約10：約1與約1：約5之間且較佳介於約1：約1與約1：約2之間，例如，介於1：1與1：2之間。
細胞因子(5)可以蛋白形式存於免疫原組合物或疫苗組合物中，或者可與免疫原或其抗原決定部位一起在宿主中共同表現。較佳地，該(等)細胞因子藉由與表現該(等)免疫原或其抗原決定部位之載體相同的載體或藉由其另一載體共同表現。
該(等)細胞因子可選自：介白素18(IL－18)、介白素12(IL－12)、介白素15(IL－15)、MIP－1α(巨噬細胞發炎性蛋白1α；(Marshall,WO olford等人，1997)、GM－CSF(粒細胞－巨噬細胞集落－刺激因子)。特別提及禽類細胞因子，例如，雞之細胞因子，如cIL－18(Schneider,Puehler等人，2000)、cIL－15(Xin,Hamajima等人，1999)；及馬細胞因子，例如馬GM－CSF(WO 00/77210)。較佳地，使用欲接受疫苗接種之物種的細胞因子；即，較佳地，使細胞因子與目標或宿主物種相匹配，且注意(例如)犬GM－CSF(WO 00/77043之實例8)、貓GM－CSF(WO 00/77043之實例9)。
WO 00/77210提供對應於馬GM－CSF之核苷酸序列及胺基酸序列、體外GM－CSF生產及有利於馬GM－CSF體內表現之載體(例如，質粒及病毒載體)的構建。此等蛋白、質粒及病毒載體可用於本發明之免疫原組合物及馬疫苗。舉例而言，可使用闡述於WO 00/77210之實例3中之質粒pJP097或者可藉助該案件之教示內容以產生其他載體或與體外生產馬GM－CSF及將該等載體或馬GM－CSF納入本發明之免疫原組合物或馬疫苗中。
本發明亦係關於免疫原組合物及所謂的亞單位疫苗，其納入或包括或主要包含蛋白VP2且視情況包括一或多種其他本文所述BTV蛋白(例如，VP5或VP7且較佳藉由以本文所述方式於體外表現產生)以及醫藥上或獸醫上可接受之載劑或媒劑或賦形劑。
醫藥上或獸醫上可接受之載劑或媒劑或賦形劑可由彼等熟習此項技術者在無需過多實驗時根據本文揭示內容及此項技術之知識確定，例如，參照本文所引用及所納入文獻或者在本文所引用文獻及以引用方式併入本文之文獻中所提及文獻；且該等可為(例如)0.9% NaCl鹽水溶液或磷酸鹽緩衝液。
本發明之免疫原組合物及亞單位疫苗較佳包括或主要包含一或多種佐劑。特別適用於本發明者係(1)丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物或馬來酸酐及烯基衍生物聚合物，(2)免疫刺激序列(ISS)，例如，具有一或多個未經甲基化CpG單元之寡脫氧核糖核苷酸序列(Klinman,Yi等人，1996)，(3)水包油型乳液，例如，闡述於由M.PoWell,M.Newman出版的"Vaccine Design,The Submitand Adjuvant Approach"之第147頁(Powell and Newman 1995)之SPT乳液，及闡述於該著作第183頁之乳液MF59，(4)油包水型乳液(EP－A－639 071)，(5)皂角苷，例如Quil－A，或(6)氫氧化鋁或等效物。界定於1)、2)及3)下之不同類別佐劑結合基於表現載體之疫苗及免疫原組合物更具體地闡述於本文中。
該等劑量及劑量體積結合免疫及疫苗接種方法之一般描述陳述於本文中。
經本發明之免疫原組合物或疫苗免疫之動物可產生抵抗BTV之特異性免疫，其與未經疫苗接種之對照動物相比在BTV感染期間可減輕病毒血症且實際上可完全阻斷該病毒。本發明之此較佳態樣可用於終止BTV傳播以限制哺乳動物病毒儲存庫之存在並防止藍舌病發作。
本發明之另一較佳態樣係該保護性免疫可自經疫苗接種之受試者傳遞給後代。
依照本發明，該抵抗BTV之疫苗接種可與疫苗接種程序框架內之其他疫苗接種聯合，以免疫或疫苗接種套組或方法形式，或以多價體免疫原組合物及多價體疫苗形式，即，包括或主要包含至少一種抵抗BTV之疫苗組份及至少一種抵抗至少一種其他病原體之疫苗組份。此亦包括藉由相同表現載體表現至少兩病原體(包括BTV)之基因。
因此，本發明亦係關於藉助含有及表現至少一種本發明BTV多核苷酸及至少一種表現另一病原體免疫原之多核苷酸的相同體內表現載體來抵抗BTV及抵抗目標物種之至少一種其他病原體的多價體組合物或"混合劑"免疫原組合物或者多價體疫苗或"混合劑"疫苗。關於組合或多價體或"混合劑"免疫原之組合物或疫苗以及此等組合物或疫苗中及藉由該等組合物或疫苗表現之免疫原或抗原或其抗原決定部位，注意力應集中於本文所引用及以引用方式併入本文之文獻以及美國專利第5,843,456號及第6,368,603號。
藉由本發明載體表現之"免疫原"或用於多價體或"混合劑"組合物或疫苗的"免疫原"應理解為意指可引發免疫反應(較佳為保護性免疫反應)之蛋白、糖蛋白、多肽、肽、抗原決定部位或衍生物，例如融合蛋白。
如本文所述，此等多價體組合物或疫苗亦可包括或主要包含醫藥上或獸醫上可接受之載劑或媒劑或賦形劑且視情況包括佐劑。
本發明亦係關於包括至少一種其中插入(且於體內表現)至少一種藍舌病病毒多核苷酸之體內表現載體及其中插入(且於體內表現)編碼另一病原體免疫原之多核苷酸之另一表現載體的多價體免疫原組合物或多價體疫苗。此等多價體組合物或疫苗亦包括或主要包含醫藥上或獸醫上可接受之載劑或媒劑或賦形劑且視情況包括佐劑。
對於擬藉由多價體免疫原組合物或疫苗(包括BTV抗原、免疫原或抗原決定部位)表現或包含於該等中之抗原或免疫原或抗原決定部位，包括(諸如)決定型或確定型抗原決定部位，熟習此項技術者可參考本文所引用文獻及本文所引用文獻中所引用文獻，所有該等文獻均以引用方式併入本申請案中。
對於羊多價體免疫原組合物及多價體疫苗而言，額外羊病原體(對於其而言額外羊抗原或免疫原或其抗原決定部位藉由該等多價體免疫原組合物及多價體疫苗表現及/或包含於該等中)較佳選自包含下列病毒之群組：1型羊疱疹病毒(OHV－1)、2型羊疱疹病毒(OHV－2)、邊境病病毒(BDV)、波爾納病(Borna disease)病毒、小反芻動物瘟疫(Peste－des－petits－ruminant)病毒、內羅畢羊病(Nairobi sheep disease)病毒(NSDV)、深膿皰病毒(羊類痘病毒)、狂犬病病毒(棒狀病毒)、貓細小病毒(FPV)、羊輪狀病毒、羊瘟疫病毒、羊腺病毒、口蹄疫病毒(FMDV)、裏夫特山谷熱病毒(Rift Valley Fever virus)及其混合物。適用於本發明組合物之額外抗原包括源自綿羊之細菌及病毒性病原體的抗原。較佳細菌及寄生抗原包括小球隱孢子蟲(Cryptosporidium parvum)、衣原體(Chlamydia)、伯納特氏立克次氏體(Coxiella burnetti)、梭狀芽孢桿菌屬(Clostridium sp.)、出血敗血性巴斯德氏菌(Pasteurella multocida)、溶血性巴斯德氏菌(Pasteurella haemolytica)、沙門氏鼠傷寒菌(Salmonella typhimurium)、布魯氏桿菌屬(Brucella)、豬紅斑丹毒絲菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)、撚轉血矛線蟲(Haemonchus contortis)、奧斯特他氏線蟲屬(Ostertagia)、球蟲屬(Coccidia 及大腸桿菌(Escherichia coli)。
對於牛多價體免疫原組合物及多價體疫苗而言，額外馬病原體(對於其而言，額外馬抗原或免疫原或其抗原決定部位藉由該等多價體免疫原組合物及多價體疫苗表現及/或包含於該等中)較佳選自包含下列之群組：1型牛疱疹病毒(BHV－1)(亦稱為牛感染性鼻氣管炎(IBR))、牛呼吸道合胞體病毒(BRSV)、黏膜病病毒(亦稱為1型或2型牛瘟疫病毒(牛病毒性腹瀉病毒或BVDV－1及BVDV－2))及3型副流感病毒，對於每一效價，一或多種基因選自由下列組成之群：gB及gD(對於牛疱疹病毒)、F及G(對於牛呼吸道合胞體病毒)、E2、C＋E1＋E2及E1＋E2(對於黏膜病病毒)及HN和F(對於3型副流感病毒)。適用於本發明組合物之額外抗原包括源自牛之細菌病原體及病毒性病原體之抗原。較佳細菌抗原包括梭狀芽孢桿菌性抗原，例如C型及D型肉毒梭狀芽孢桿菌(Clostridium botulinum)、A型、B型、C型及D型產氣莢膜梭狀芽胞桿菌(Clostridium perfringens)、敗血梭狀芽胞桿菌(Clostridium septicum)、破傷風梭狀芽胞桿菌(Clostridium tetani)、鳴疽梭狀芽胞桿菌(Clostridium chauvoei)、B型諾維氏梭狀芽胞杆(Clostridium novyi)、雙酶梭狀芽胞桿菌(Clostridium sordellii)、溶血梭狀芽胞桿菌(Clostridium haemolyticum)；鉤端螺旋體屬(Leptospira)抗原，例如，問號鉤端螺旋體(Leptospira interrogans)，如哈德焦鉤端螺旋體(Leptospira hardjo)、波摩那鉤端螺旋體(Leptospira Pomona)、哥本哈根鉤端螺旋體(Leptospira copenhageni)、紮諾恩鉤端螺旋體(Leptospira zanoni)、塔拉索夫氏鉤端螺旋體(Leptospira tarassovi)；巴斯德菌屬(Pasteurella)抗原，例如出血敗血性巴斯德菌(Pasteurella multocida)及溶血性巴斯德菌(Pasteurella haemolytica)；棒狀桿菌(Corynebacterium)抗原，例如假結核棒狀桿菌(Corynebacterium pseudotuberculosis)、腎棒狀桿菌(Corynebacterium renale)、膀胱炎棒狀桿菌(Corynebacterium cystitis)、多毛棒狀桿菌(Corynebacteriurn pilosum)及牛棒狀桿菌(Corynebacterium bovis)；及嗜血桿菌屬(Haemophilus)抗原，例如睡眠嗜血桿菌(Haemophilus somnus)及胸膜肺炎嗜血菌(Haemophilus pleuropneumoniae)；腐蹄病節瘤擬桿菌纖毛蛋白(Dichelobacter nodosus pilus)；支原體屬(Mycoplasma)抗原，例如無乳支原體(Mycoplasma agalactiae)、牛支原體(Mycoplasma bovis)及羊肺炎支原體(Mycoplasma ovipneumoniae)。較佳病毒性抗原包括牛病毒性腹瀉(BVD)抗原、牛鼻氣管炎病毒(IBR)抗原、副流感－3抗原、呼吸道合胞體病毒(RSV)抗原及牛短暫熱(BEF)抗原。因此，本發明涵蓋編碼此(等)免疫原之免疫活性片段或抗原決定部位之多核苷酸的用途。
對於馬多價體免疫原組合物及多價體疫苗而言，額外馬病原體(對於其而言，額外馬抗原或免疫原或其抗原決定部位藉由該等多價體免疫原組合物及多價體疫苗表現及/或包含於該等中)較佳選自包含下列病毒之群組：馬流感(EI)病毒、非洲馬病([AHSV]，較佳具有免疫原VP2及VP5之組合)、馬腦病病毒([EEV]，亦具有VP2及VP5之組合)、西方馬腦炎病毒(WEEV)、委內瑞拉馬腦炎病毒(VEEV)、東方馬腦炎病毒(EEEV)、西尼羅河病毒(WNV)、破傷風桿菌(Clostridium tetani )(破傷風)及其混合物。較佳地，對於AHSV，免疫原係VP2及/或VP5，對於EIV，免疫原較佳係HA、NP及/或N；對於腦炎病毒，免疫原較佳係C及/或E2；且對於破傷風桿菌，免疫原係破傷風毒素之全部或部分C亞單位。因此，本發明涵蓋編碼此(等)免疫原之免疫活性片段或抗原決定部位之多核苷酸的用途。
對於犬多價體免疫原組合物及多價體疫苗而言，額外犬病原體(對於其而言，額外犬抗原或免疫原或其抗原決定部位藉由該等多價體免疫原組合物及多價體疫苗表現及/或包含於該等中)較佳選自包括下列病毒之群組：麻疹病病毒、犬腺病毒1(CAV－1)、犬腺病毒2(CAV－2)、犬瘟熱病毒(CDV)、2型犬副流感病毒(CPI－2)、1型犬疱疹病毒(CHV－1)、狂犬病病毒(棒狀病毒)、犬細小病毒(CPV)、犬冠狀病毒(CCV)、犬腺病毒、伯氏疏螺旋菌(Borrelia burgdorferi )、鉤端螺旋體屬(Leptospira )及其混合物。較佳地，對於CDV，免疫原較佳係F及/或HA(亦可參見關於CDV免疫原及構建體之美國專利第6,309,647號、第5,756,102號)；對於CPV，免疫原較佳係VP2；對於CCV，免疫原較佳係S及/或M；對於CHV－1，免疫原較佳係gB及/或gC及/或gD(亦可參見關於CHV免疫原及構建體之美國專利第5,688,920號、第5,529,780號)；對於狂犬病病毒，免疫原較佳係G(亦可參見關於狂犬病組合組合物之美國專利第5,843,456號)；對於伯氏疏螺旋菌，免疫原較佳係OspA(亦可參見關於OspA組合組合物之美國專利第6,368,603號)。因此，本發明涵蓋編碼此(等)免疫原之免疫活性片段或抗原決定部位之多核苷酸的用途。
對於貓多價體免疫原組合物及多價體疫苗，額外貓病原體(對於其而言，額外貓抗原或免疫原或其抗原決定部位藉由該等多價體免疫原組合物及多價體疫苗表現及/或包含於該等中)較佳選自包含下列病毒之群組：1型貓疱疹病毒(FHV－1)、貓嵌杯樣病毒(FCV)、狂犬病病毒(棒狀病毒)、貓細小病毒(FPV)、貓感染性腹膜炎病毒(FIPV)、貓白血病病毒(FeLV)、貓免疫缺陷病毒(FIV)、衣原體及其混合物。較佳地，對於FeLV，免疫原較佳係A及/或B及/或gag及/或pol，例如，gag/pol；對於FPV，免疫原較佳係VP2；對於FIPV，免疫原較佳係S及/或M及/或N，例如，S及M及/或N(亦可參見美國專利第6,348,196號及第5,858,373號：關於免疫原及其構建體)；對於FHV，免疫原較佳係gB及/或gC及/或gD，例如，gB及gC及/或gD(亦可參見美國專利第5,338,683號、第6,183,750號；關於疱疹病毒免疫原及表現該等之構建體)；對於FCV，免疫原較佳係C；對於FIV，免疫原較佳係env及/或gag及/或pro，例如，gag/pro、env或env及gag/pro(亦可參見論述於1996年11月14日提出申請的Tartaglia等人之美國申請案第08/746,668號中之免疫原及構建體)；對於狂犬病病毒，免疫原較佳係G。因此，本發明涵蓋編碼該(等)免疫原之免疫活性片段或抗原決定部位之多核苷酸的用途。
對於禽類多價體免疫原組合物及多價體疫苗而言，額外禽類病原體(對於其而言，額外禽類抗原或免疫原或其抗原決定部位藉由該等多價體免疫原組合物及多價體疫苗表現及/或包含於該等中)較佳選自包含下列病毒之群組：馬立克氏病(Marek's disease)病毒(MDV)(例如，血清型1及血清型2，較佳為血清型1)、新城病病毒(NDV)、岡博羅氏病(Gumboro disease)病毒或感染性法氏囊病病毒(IBDV)、感染性支氣管炎病毒(IBV)、感染性貧血病毒或雞貧血病毒(CAV)、感染性喉氣管炎病毒(ILTV)、腦脊髓炎病毒或禽類腦脊髓炎病毒(AEV或禽類白血病病毒ALV)、火雞出血性腸炎病毒(HEV)、肺病毒病病毒(TRTV)、禽疫病毒(禽類流感)、雞積水性心包炎病毒、禽類呼腸孤病毒、大腸桿菌、雞支原體(Mycoplasma gallinarum )、雞敗血支原體(Mycoplasma gallisepticum )、禽類嗜血桿菌(Haemophilus avium )、雞巴斯德菌(Pasteurella gallinarum )、出血敗血性巴斯德氏菌殺雞亞種(Pasteurella multocidaga llicida )及其混合物。較佳地，對於MDV，免疫原較佳係gB及/或gD，例如，gB及gD；對於NDV，免疫原較佳係HN及/或F，例如，HN及F；對於IBDV，免疫原較佳係VP2；對於IBV，免疫原較佳係S(更佳為S1)及/或M及/或N，例如，S(或S1)及M及/或N；對於CAV，免疫原較佳係VP1及/或VP2；對於ILTV，免疫原較佳係gB及/或gD；對於AEV，免疫原較佳係env及/或gag/pro，例如，env及gag/pro或gag/pro；對於HEV，免疫原較佳係100K蛋白及/或六鄰體(hexon)；對於TRTV，免疫原較佳係F及/或G；且對於雞瘟，免疫原較佳係HA及/或N及/或NP，例如，HA及N及/或NP。因此，本發明涵蓋編碼該(等)免疫原之免疫活性片段或抗原決定部位之多核苷酸的用途。
作為實例，在向其中視情況添加一或多種如本文所述佐劑且欲用於馬物種之本發明多價體免疫原組合物或多價體疫苗(因此，該組合物含有主要包含或包含一或多種佐劑)中，可能納入(且因此，該組合物或疫苗可包括、主要包含或含有)一或多種闡述於WO 98/03198中(較佳地，如其實例8至實例25所述)之質粒及/或彼等闡述於WO 00/77043中(較佳為彼等闡述於其實例6及7中者)且與馬物種相關者。對於犬物種而言，多價體組合物或疫苗可含有或主要包含或包含一或多種闡述於WO 98/03199中(較佳地，如其實例8至實例16所述)之質粒及/或彼等闡述於WO 00/77043中且與犬物種相關者(較佳為彼等闡述於其實例2、實例3及實例4中者)且此等組合物或疫苗可含有、主要包含或包含一或多種佐劑。對於貓物種而言，多價體組合物或疫苗可含有或主要包含或包含一或多種闡述於WO 98/03660(較佳為其實例8至實例19)中之質粒及/或彼等闡述於WO 00/77043中(較佳為彼等闡述於其實例5中者)且與貓物種相關者；且此等組合物或疫苗可含有、主要包含或包含一或多種佐劑。且對於禽類物種而言，多價體組合物或疫苗可含有或主要包含或包含一或多種闡述於WO 98/03659(較佳為其實例7至實例27)中之質粒；且此等組合物或疫苗可含有、主要包含或包含一或多種佐劑。
本文所述免疫原組合物或疫苗亦可與至少一種針對相同病原體或該組合物或疫苗所針對物種之至少一種其他病原體的習用疫苗(例如，滅活、活性減毒或亞單位)組合。本文所述免疫原組合物或疫苗可在習用疫苗之前或之後投與，例如在"初免－加強"方案中。
本發明進一步涵蓋採用本發明之免疫原組合物及亞單位疫苗之組合疫苗接種。因此，本發明亦係關於包含下列之多價體免疫原組合物及多價體疫苗：一或多種本發明之蛋白及至少一種其他病原體(較佳為來自彼等於本文中以及本文所引用及以引用方式併入本文之文獻中所述者)及/或呈滅活或減毒形成或作為一亞單位之另一病原體的一或多種免疫原(如同術語免疫原一般闡述於本文中)。在所述方法中，此等多價體疫苗或組合物亦可含有、主要包含或包含醫藥上或獸醫上可接受之媒劑或賦形劑且視情況包括一或多種佐劑。
本發明亦係關於用於目標物種(例如，如本文所述者)之免疫及疫苗接種的方法。
本發明亦係關於用於藉助初免－加強方案來實施目標物種之免疫及/或疫苗接種的方法。術語"初免－加強"係指連續投與共同具有至少一種免疫原之兩種不同疫苗類別或免疫原或免疫組合物類別。初免投藥(初免)係第一疫苗或免疫原或免疫組合物類別之投藥且可包括1次、2次或更多次投藥。加強投藥係第二疫苗或免疫原或免疫組合物類別之投藥且可包括1次、2次或更多次投藥，且(例如)可包括或主要包含年度投藥。
本發明之針對BTV之初免－加強免疫或疫苗接種方法的實施例係一如下初免－加強免疫或疫苗接種方法：其中首先對動物投與包括或主要包含及於體內表現至少一種BTV免疫原、抗原或抗原決定部位之DNA疫苗或免疫組合物或免疫原組合物(初免)，且隨後投與含有或主要包含或表現至少一種與該初免疫苗或免疫原或免疫組合物共有之免疫原、抗原或抗原決定部位的第二類別疫苗或免疫原或免疫組合物(加強)。此第二類別疫苗可為滅活或減毒或亞單位疫苗或免疫原或免疫組合物或載體，例如，具有體內表現之重組或經修飾病毒疫苗或免疫原或免疫組合物(例如，痘病毒、疱疹病毒、腺病毒)。較佳可採用痘病毒，例如，減毒牛痘病毒，如MVA或NYVAC；及禽痘病毒，如金絲雀痘病毒及雞痘病毒。
有利地，該DNA疫苗意欲引發對經表現免疫原、抗原或抗原決定部位具有特異性之初免免疫反應或者可藉由相繼投與(加強)包括或主要包含病毒載體(例如，活的重組痘病毒)之滅活疫苗或免疫組合物或活的重組疫苗加強的"DNA引發免疫反應"(例如，對經表現免疫原、抗原或抗原決定部位具有特異性之γ－干擾素＋(IFNγ ＋)T細胞記憶反應)，該病毒載體含有或主要包含及於體內表現至少藉由該DNA疫苗表現的該(等)免疫原或抗原或抗原決定部位。對經表現BTV免疫原具有特異性之IFNγ ＋T細胞記憶反應可在定量酶聯免疫斑點(ELISPOT)測試中藉助外周血單核細胞(PBMC)展示(Laval,Paillot等人，2002)。
"加強"可在"初免"後自約2周至約6個月期間施與，例如，在初免後自約3周至約8週期間，且較佳在初免後自約3周至約6週期間，且更佳為在初免後約4周時施與。
對於羊、牛或馬而言，依照本發明，該初免可使用包括或主要包含及於體內表現編碼BTV免疫原、抗原或抗原決定部位之核酸分子的DNA疫苗或免疫原或免疫組合物實施且該加強較佳使用包含重組活病毒載體(例如，痘病毒、疱疹病毒、腺病毒)(例如，重組雞痘病毒或重組金絲雀痘病毒、重組OHV－1或OHV－2、重組BHV－1或BHV－2、重組EHV－1或EHV－4)之疫苗或免疫原或免疫組合物實施，該重組活病毒載體包括或主要包含編碼及如DNA疫苗或免疫原或免疫組合物表現一般於體內表現至少一種該BTV免疫原、抗原或抗原決定部位的核酸分子。在另一實施例中，可(例如)藉由DMRIE－DOPE(用於初免DNA疫苗或免疫組合物或免疫原組合物)及藉由Carbopol(用於加強重組疫苗或免疫或免疫原組合物)輔助此等初免及加強疫苗或免疫組合物或免疫原組合物。
可對可能具有抵抗BTV(免疫或疫苗接種所針對者)之母體抗體的幼小綿羊、牛犢或馬駒實施該初免。有利地，將該DNA疫苗或免疫組合物或免疫原組合物投與自出生至(且包括)約16週齡的幼小動物，例如，自出生至(且包括)約8週齡，例如，自出生至(且包括)約6週齡，例如，自出生至(且包括)約4週齡的幼小動物。
對於貓而言，依照本發明，該初免可使用包括或主要包含及於體內表現編碼BTV免疫原、抗原或抗原決定部位之核酸分子的DNA疫苗或免疫原或免疫組合物實施且該加強較佳使用包括或主要包含重組活病毒載體(例如，痘病毒、疱疹病毒、腺病毒，較佳為重組雞痘病毒或重組金絲雀痘病毒、重組FHV、重組犬腺病毒)之疫苗或免疫原或免疫組合物實施，該重組活病毒載體包括或主要包含編碼及於體內表現至少一種與藉由該DNA疫苗表現者相同的BTV免疫原、抗原或抗原決定部位的核酸分子。在另一實施例中，可(例如)藉由DMRIE－DOPE(用於初免DNA疫苗或免疫組合物或免疫原組合物)及藉由Carbopol(用於加強重組疫苗或免疫或免疫原組合物)輔助此等初免及加強疫苗或免疫組合物或免疫原組合物。
可對可能具有抵抗BTV(免疫或疫苗接種所針對者)之母體抗體的小貓實施該初免。將該DNA疫苗或免疫組合物或免疫原組合物投與自出生至(且包括)約12週齡的小貓，例如，自出生至(且包括)約8週齡，較佳為自出生至(且包括)約6週齡，例如，自出生至(且包括)約4週齡的小貓。
對於犬而言，依照本發明，該初免可使用包括或主要包含及於體內表現編碼BTV免疫原、抗原或抗原決定部位之核酸分子的DNA疫苗或免疫原或免疫組合物實施且該加強較佳使用包括或主要包含重組活病毒載體(例如，痘病毒、疱疹病毒、腺病毒，較佳為重組雞痘病毒或重組金絲雀痘病毒、重組CHV、重組犬腺病毒)之疫苗或免疫原或免疫組合物實施，該重組活病毒載體包括或主要包含編碼及於體內表現至少一種與藉由該DNA疫苗表現者相同的BTV免疫原、抗原或抗原決定部位的核酸分子。在另一實施例中，可(例如)藉由DMRIE－DOPE(用於初免DNA疫苗或免疫組合物或免疫原組合物)及藉由Carbopol(用於加強重組疫苗或免疫或免疫原組合物)輔助此等初免及加強疫苗或免疫組合物或免疫原組合物。
可對可能具有抵抗BTV(免疫或疫苗接種所針對者)之母體抗體的幼犬實施該初免。可將該DNA疫苗或免疫組合物或免疫原組合物投與自出生至(且包括)約12週齡的幼犬，例如，自出生至(且包括)約8週齡，較佳為自出生至(且包括)約6週齡，例如，自出生至(且包括)約4週齡的幼犬。
對於禽類而言，依照本發明，該初免可使用包括或主要包含及於體內表現編碼BTV免疫原、抗原或抗原決定部位之核酸分子的DNA疫苗或免疫原或免疫組合物實施且該加強較佳使用包括或主要包含重組活病毒載體(例如，痘病毒、疱疹病毒、腺病毒，較佳為重組雞痘病毒或重組金絲雀痘病毒、重組HVT、重組MDV、重組禽類腺病毒)之疫苗或免疫原或免疫組合物實施，該重組活病毒載體包括或主要包含編碼及於體內表現至少一種與藉由該DNA疫苗表現者相同之BTV免疫原、抗原或抗原決定部位的核酸分子。在另一實施例中，可(例如)藉由DMRIE－DOPE(用於初免DNA疫苗或免疫組合物或免疫原組合物)及藉由Carbopol(用於加強重組疫苗或免疫或免疫原組合物)輔助此等初免及加強疫苗或免疫組合物或免疫原組合物。
在一實施例中，該初免DNA疫苗或免疫原或免疫組合物包括或主要包含編碼及表現VP2、VP5或VP2及VP5多肽之質粒，例如，其中已經納入遍在真核啟動子(即，人類巨細胞病毒立即早期(CMV－IE)啟動子)的質粒pLH2078.15(圖10)以獲得VP2及VP5蛋白之有效表現，且該加強重組疫苗或免疫或免疫原組合物包括或主要包含痘病毒，例如，金絲雀痘病毒，如重組金絲雀痘病毒vCP2289(實例9)。在另一實施例中，此等初免及加強疫苗或免疫組合物或免疫原組合物可以如下輔助：含有質粒pLH2078.15(圖10)(包含但不限於CMV－IE啟動子)之DNA疫苗或免疫組合物或免疫原組合物可藉由DMRIE－DOPE(例如，闡述於美國專利申請案第20050255127號中者)輔助；且含有VCP2289之重組疫苗或免疫組合物或免疫原組合物可藉由Carbopol(例如，闡述於美國專利申請案第20050255127號中者)輔助。
本發明亦係關於用於實施初免－加強方法之套組，其包括或主要包含位於不同容器中之初免疫苗或免疫組合物或免疫原組合物及加強疫苗或免疫組合物或免疫原組合物，視情況包括用於混合及/或投藥之說明書。
在初免及加強中所投與數量(劑量)以及初免及加強所用投藥途徑可為如本文所述，以便根據本揭示內容及此項技術中知識在無需過多實驗時實施該初免－加強方案。而且，根據本文揭示內容及此項技術中之知識，彼等熟習此項技術者可對任一本文所述目標物種實踐本文之方法、套組等等。
此等方法可包括、主要包含或包含投與有效量的本發明之免疫原組合物或疫苗。此投藥可藉由非經腸途徑(例如，經皮下、經皮內或肌內投藥及/或藉由經口及/或經鼻途徑)實現。有利地，此投藥係經肌內或經皮下實施。可能出現一或多種投藥方式，例如，兩種投藥方式。
可藉由無針液體噴射注射器或粉末噴射注射器注射疫苗或免疫原組合物。對於質粒而言，亦可使用塗覆有質粒並以滲透擬受免疫受試者之皮膚細胞的方式射出之金顆粒(Tang,DeVit等人，1992)。本文所引用及所納入其他文獻可為本發明疫苗或免疫原組合物之投與方法及設備提供咨詢。無針注射器亦可為(例如)Biojector 2000(Bioject公司，Portland OR,USA)。
有利地，本發明之免疫原組合物及疫苗包括或主要包含或包含有效量的可產生免疫反應之(例如但不限於)中和抗體及/或可產生保護性免疫反應之一或多種本文所述表現載體及/或多肽；並且，有效量可在無需過多實驗時根據本揭示內容(包括本文所納入文獻)及此項技術中之知識確定。有利地，本發明之免疫原組合物及疫苗包括或主要包含或包含有效量的可產生保護性反應(例如但不限於，減少或消除臨床症狀，例如但不限於體溫過高、白細胞減少、淋巴細胞減少、血小板減少及/或減少或消除病毒血症)之一或多種本文所述表現載體及/或多肽。
若為基於質粒載體之免疫原組合物或疫苗，則劑量通常可包括、主要包含或包含約10微克至約2000微克，較佳為約50微克至約1000微克。劑量體積可介於約0.1毫升與約2毫升之間，較佳介於約0.2毫升與約1毫升之間。
此等劑量及劑量體積適用於馬及係哺乳動物之其他目標物種(例如羊、牛、犬、貓)的疫苗接種。
對於禽類之疫苗接種或免疫而言，劑量較佳係介於約10微克與約500微克之間且較佳介於約50微克與約200微克之間。劑量體積可介於約0.1毫升與約1毫升之間，較佳介於約0.2毫升與約0.5毫升之間。
一熟習此項技術者根據本揭示內容及此項技術中之知識可確定用於每一免疫或疫苗接種方案及物種之有效質粒劑量。
倘若為基於痘病毒之免疫原組合物或疫苗，則劑量可介於約102 pfu與約109 pfu之間。
對於羊、牛、馬及係哺乳動物之其他目標物種(例如，貓及犬)而言，當載體係牛痘病毒時，劑量更佳係介於約104 pfu與約109 pfu之間，較佳介於約106 pfu與約108 pfu之間且當該載體係金絲雀痘病毒時，劑量更佳介於約105 pfu與約109 pfu之間且較佳介於約105.5 pfu(或約106 pfu)與約108 pfu之間。
對於禽類而言，當載體係痘病毒(例如，金絲雀痘病毒)時，劑量更佳係介於約103 pfu與約107 pfu之間，較佳介於約104 pfu與約106 pfu之間；且當載體係痘病毒(例如，雞痘病毒)時，劑量更佳係介於約102 pfu與約105 pfu之間，較佳介於約103 pfu與約105 pfu之間。根據本揭示內容及此項技術中之技術，熟習此項技術者可確定當該載體係另一禽痘病毒(例如，野鴿痘、家鴿痘等)時之適宜劑量。
倘若為基於非痘病毒病毒載體(例如，疱疹病毒或腺病毒)之供哺乳動物目標物種用免疫原組合物或疫苗，則劑量通常係介於約103 pfu與約108 pfu之間；且倘若此基於非痘病毒病毒載體之免疫原組合物用於禽類物種或禽類疫苗，則劑量通常係介於約103 pfu與約106 pfu之間。對於供較大目標哺乳動物物種(例如，較大的貓(例如，動物園中所養貓)或馬)使用的此基於非痘病毒病毒載體之免疫原組合物或疫苗組合物而言，例如，倘若為馬免疫原組合物或疫苗組合物，則劑量較佳係介於約106 pfu與約108 pfu之間。
用於哺乳動物目標物種之免疫原組合物及疫苗組合物的劑量體積(例如，基於病毒載體之馬免疫原組合物或疫苗組合物(如，基於非痘病毒病毒載體之免疫原組合物或疫苗組合物)的劑量體積)通常係介於約0.5毫升與約2.5毫升之間，例如，介於約0.5毫升與約2.0毫升之間，較佳介於約1.0毫升與約2.0毫升之間，較佳為約1.0毫升。基於病毒載體之供禽類用免疫原組合物或疫苗組合物的劑量體積(例如，基於非痘病毒病毒載體之禽類免疫原組合物或疫苗組合物的劑量體積)通常係介於約0.1毫升與約1.0毫升之間，較佳介於約0.1毫升與約0.5毫升之間且更佳介於約0.2毫升與約0.3毫升之間。根據本文揭示內容及此項技術中之知識，亦結合此疫苗或免疫原組合物，熟習此項技術者可在無需任何過多實驗時確定投藥次數、投與途徑及擬用於每一免疫或疫苗接種方案之劑量。舉例而言，可以(例如)35天間期對綿羊、牛或馬投藥2次。
倘若為亞單位免疫原組合物或亞單位疫苗，根據活性成份(例如，亞單位(抗原、免疫原、抗原決定部位))之數量，劑量通常包括或主要包含或包含約10微克至約2000微克，較佳為約50微克至約1000微克。用於哺乳動物(例如，馬)目標物種之此等免疫原組合物或疫苗組合物的劑量體積通常係介於約1.0毫升與約2.0毫升之間，較佳介於約0.5毫升與約2.0毫升之間且更佳為約1.0毫升。供禽類用之此等免疫原組合物或疫苗組合物的劑量體積通常係介於約0.1毫升與約1.0毫升，較佳介於約0.1毫升與約0.5毫升之間且更佳係介於約0.2毫升與0.3毫升之間。而且對於此疫苗或免疫原組合物而言，熟習此項技術者根據本揭示內容及此項技術中之知識可在無需任何過多實驗時確定投藥次數、投藥途徑及用於每一免疫或疫苗接種方案之劑量。
依照本發明，本發明亦係關於體內表現載體之用途或載體及/或多肽之製備，此用於調配欲保護目標物種或在目標物種中產生抵抗BTV(且在某些實施例中，抵抗至少一種其他病原體)之免疫反應的免疫原組合物或疫苗。
依照本發明，基於質粒之疫苗或表現一或多種BTV蛋白或一BTV亞單位疫苗之病毒性疫苗在免疫或接種疫苗之動物中不會產生抵抗該病毒其他蛋白之抗體，該等抗體不會存於該免疫原組合物或疫苗中或藉由該免疫原組合物或疫苗產生(例如，不會存於免疫原組合物或疫苗中及/或藉由該免疫原組合物或疫苗表現)。藉由此特徵，本發明提供鑑別診斷方法。藉助本發明能夠區別經致病性BTV野外菌株感染之動物與用本發明之疫苗或組合物實施疫苗接種或免疫之動物。在前者中，存在針對該等致病性BTV野外菌株之蛋白及/或抗體且該等蛋白及/或抗體可藉由抗原－抗體反應檢測。在後者(依照本發明實施疫苗接種或免疫之動物)中，事實並非如此：此等動物在此抗原－抗體反應中保持隱性，此乃因該免疫原組合物或疫苗組合物中不存在或不會產生蛋白之故。為了實現此鑑別，該診斷方法採用一種當其不出現於疫苗或免疫原組合物時不會出現於該疫苗或免疫原組合物中或藉由該疫苗或免疫原組合物產生(不存在或不表現)之蛋白，例如，蛋白VP7、NS1、NS2或NS3。
因此，本發明涵蓋採用本發明疫苗或免疫原組合物中不存在或藉由本發明疫苗或免疫原組合物表現之蛋白或其抗體的診斷試樣或套組；且使用者可藉助含有此診斷試樣或套組及此疫苗或免疫原組合物的套組對動物實施接種及/或疫苗接種且此後測試該等動物以確定彼等已經暴露於BTV之動物與彼等僅針對BTV實施免疫及/或疫苗接種之動物。
因此，本發明係關於用本發明之載體、製劑及多肽的用途，該等用於製備能夠區別經疫苗接種或免疫動物與經感染動物之免疫原組合物及疫苗。
本發明亦係關於可實施此區別之診斷方法相關的免疫及疫苗接種方法。
選擇用於診斷之蛋白或其片段或抗原決定部位在診斷測試中用作抗原及/或用於產生多株或單株抗體。
熟習此項技術者具有足夠實踐知識以產生此等抗體及利用抗原及/或抗體於習知診斷方法(例如ELISA測試)中，進而實施本發明之鑑別診斷測試。
現在將藉由下列非限制性實例進一步闡述及說明本發明。
實例
所有構建均利用Sambrook J.等人(Sambrook and Russell 2001)闡述的標準分子生物學方法(選殖、藉由限制酵素消化、合成互補單鏈DNA、聚合酶鏈反應、藉由DNA聚合酶延長寡核苷酸等)實現。用於本發明此等實例之所有限制片段以及各種聚合酶鏈反應(PCR)產物係使用Qiagen凝膠萃取或PCR純化套組分離及純化。
實例1：藍舌病(BTV)攻擊病毒之培養
全部使用BTV血清型17，一種源自死於藍舌病之綿羊(來自Tulare County,CA(USA))血液分離的菌株。在原代牛肺微血管內皮細胞中分離之前，該病毒於血清陰性牛中傳代2次。對於擴增，此BTV血清型17菌株(Bonneau,De Maula等人，2002；DeMaula,Leutenegger等人，2002)於獲自美國典型培養物保藏中心(ATCC)編號CCL－10的BHK－21細胞(幼倉鼠腎細胞)中培養。
該等BHK－21細胞在補充有10%胎牛血清(Hyclone Labo－ratories)、10%胰化蛋白(tryptose)磷酸鹽肉湯及1%青黴素及鏈黴素的Eagle's培養基(EMEM)中培養。該等細胞於＋37℃、5% CO2 氣氛下培養。
細胞單層在3天內鋪滿(confluent)。隨後使用補充有10% FBS之新鮮EMEM培養基代替該培養基，並以約5 pfu/個細胞之比率添加BTV。當細胞病變效應(CPE)完成時(通常在培養開始後48小時至72小時)，收穫病毒懸浮液且隨後藉由離心澄清並於－70℃凍乾。需要1次或兩次連續傳代以產生病毒批料，將該病毒批料於－70℃儲存。
實例2：優化BTV VP2及VP5之合成
不同物種中所優選密碼子可能明顯不同。為了在羊/牛/馬哺乳動物細胞中提高使用金絲雀痘表現系統(ALVAC)表現異種蛋白(即，BTV VP2 & VP5)之水平，至關重要的是將該異種蛋白之密碼子頻率調節至與宿主表現系統之密碼子頻率相匹配(Kim,Oh等人，1997)。對於密碼子最佳化，生物信息學家應考慮許多其他因素，例如，二級結構、GC含量、重複密碼子、限制內切酶位點等等並研發專有運算法則。Geneart GmbH(Regensburg，德國)已經研發在單一作業中利用多參數最佳化之專利GeneOptimizerTM 軟體(待決專利)。並行考慮最重要的參數，該軟體在演算方法中可產生多達500,000個優化目標序列變體並可選擇一最適宜者。已經報導：此等優化基因與初始基因序列相比在表現產量方面增加多達100倍(Bradel－Tretheway,Zhen等人，2003；Disbrow,Sunitha等人，2003)。
將關於BTV－17 VP2(SEQ ID NO：3)(de Mattos,de Mattos等人，1994)及BTV－17 VP5(SEQ ID NO：4)之核酸序列資訊提交給Geneart以用作"天然"BTV－17序列。將此序列資訊應用於Geneart之Gene OptimizerTM 軟體，並產生VP2及VP5之經優化合成序列。
圖1 提供天然VP2(SEQ ID NO：3)與經優化(藉由Geneart)合成VP2(SEQ ID NO：1)間之核苷酸序列的對比/比對。圖2 提供天然VP5(SEQ ID NO：4)與經優化合成VP5(SEQ ID NO：2)間之核苷酸序列的對比/比對。Geneart使用VP2及VP5之經優化序列作為一系列高精確度寡核苷酸化學合成之基礎，所有該等高精確度寡核苷酸涵蓋每一基因之整個合成編碼序列。隨後使用基於PCR(聚合酶鏈反應)之策略裝配每一基因之寡核苷酸以產生完全合成VP2及VP5編碼序列。
實例3：經優化BTV－17合成VP2及合成VP5之pPCR－Script選殖
合成VP2. 藉由使用限制內切酶(RE)Sac I及Kpn I切割在其多選殖位點(MCS)區域將可自Stratagene(San Diego,CA,USA)獲得的選殖載體pPCR－ScriptAmp SK(＋)線性化。隨後使用T4 DNA連接酶將2,913核苷酸直線型完全裝配合成VP2編碼序列連接至質粒載體，該VP2編碼序列含有恰位於ATG起始密碼子上游之H6啟動子的3'末端。所連接DNA用於轉化感受態E.coli 細胞。選擇用於進一步特徵分析之陽性轉化體，其具有氨苄西林抗性(攜帶質粒載體)並藉助其位於XGal指示平板上之"白色"表現型(藉由在pPCR－Script之MCS中插入VP2而受到破壞的β－半乳糖苷酶基因)包含VP2合成基因序列。分離一種選殖體，043004 pPCR－Script(5,779 bp)並藉由DNA序列分析確定其係正確的。圖3闡明上述選殖策略。043004選殖體用於後續選殖作業。
合成VP5. 藉由使用REsSac I及Kpn I切割在其MCS區域將可自Stratagene(San Diego,CA,USA)獲得的選殖載體pPCR－ScriptAmp SK(＋)線性化。隨後使用T4 DNA連接酶將1,638核苷酸直線型完全裝配合成VP5編碼序列連接至質粒載體。所連接DNA用於轉化超感受態E.coli 細胞。選擇用於進一步特徵分析之陽性轉化體，其具有氨苄西林抗性(攜帶質粒載體)並藉助其位於XGal指示平板上之"白色"表現型(藉由在pPCR－Script之MCS中插入VP2而受到破壞的β－半乳糖苷酶基因)包含VP5合成基因序列。分離一種選殖體043005 pPCR－Script(4,492bp)並藉由DNA序列分析確定其正確性。圖8闡明上述選殖策略。此選殖體用於後續選殖策略。
實例4：pNVQH6C5LSP－18 ALVAC供體質粒。 美國專利申請案第20050255127號闡述ALVAC供體質粒pNVQH6C5LSP－18之構建。確定編碼ORF指定C5 (於該病毒性基因組之1864位置開始且於2187位置終止)之金絲雀痘病毒DNA的5 kb基因座。下文闡述藉由刪除大部分C5 ORF並使用H6啟動子、多選殖位點(MCS)及所有閱讀框架中之轉錄及轉譯終止序列代替之所構建C5 插入質粒。使用引物C5A1及C5B1自基因組金絲雀痘病毒DNA擴增含有上游C5R臂之1590 bp PCR片段。
(SEQ ID NO：5)C5A：－5' GGCCGAATTCTGAATGTTAAATGTTATACTTT 3'(SEQ ID NO：6)：C5B1：－5' CCCGGGATCGATGGATCCTTTTTATAGCTAATTAGTCACGTACCTTTGAGAGTACCACTTCAGCTA 3'
經擴增片段包括位於5'－末端之Eco R I位點、終止序列及含有位於3'－末端之Bam H I、Cla I及Xma I位點的MCS。
使用引物C5C1及C5D1自基因組金絲雀痘病毒DNA擴增含有下游C5L臂之458 bp PCR片段。
(SEQ ID NO：7)C5C1：－5' GGATCCATCGATCCCGGGTTTTTATGACTAGTTAATCACGGCCGCTTATAAAGATCTAAAATGCAT 3'(SEQ ID NO：8)C5D1 －5' GGCTGCAGGTATTCTAAACTAGGAATAGAT 3'
經擴增片段包括5'BamH I、Cla I及Xma I限制內切酶位點、終止序列及位於3'－末端之Pst I位點。
藉由使用引物C5A及C5D(以上)實施再次擴增將上述PCR片段融合在一起，產生選殖至pUC 8質粒載體中之2,030 bpEco R I－Pst I片段，產生pUC/C5L/B Cia Xm/C5R。使用下列寡核苷酸藉由寡插入(oligoinsertion)Eco R I位點中在C5R臂5'－末端導入獨特Not I序列，產生pUC/Not I/C5R/MCS/C5L：寡核苷酸用於導入Not I 5' AATTGCGGCCGC 3'(SEQ ID NO：18)
牛痘H6啟動子包含於質粒pBSH6－1上使用引物H6A1及H6B1擴增含有H6啟動子及用於多選殖位點之識別序列的176 bp片段(H6片段)，該多選殖位點含有Asp 718 I、Xho I、Xba I、Cla I及Sma I：(SEQ ID NO：9)H6A1：－5' TCGTTAATTAATTAGAGCTTCTTTAT－TCTATACTTAAAAAG 3'(SEQ ID NO：10)H6B1：－5' AAAACCCGGGATCGATTCTAGACTCGAGGGTACCTACGATACAAACTTAACGGATA 3'
收集以上編碼H6之片段並使用H6B1實施再次擴增以產生232 bp H6p/MCS片段，其被插入位於Bam H I位點與Xma I位點間之pUC/C5L/B Cla Xm/C5R中。圖4展示所得質粒、pNH6C5LSP－18、含有該H6啟動子之C5 插入質粒、所有閱讀框架中之轉錄及轉譯功能性終止子及MCS。
實例5：pCXL148.2 ALVAC供體質粒構建 。pNVQH6C5LSP－18供體質粒之核苷酸序列分析表明：ALVAC供體質粒pNVQH6C5LSP－18之C5R區(闡述於美國申請案第20050255127號中)相對於ALVAC病毒載體之C5R區(未提供序列)有單一鹼基突變。因此，按照下列形成pCXL148以修飾供體質粒序列從而實現與經選殖(蝕斑純化)ALVAC之序列精確匹配進而最小化在形成重組體衍生的藍舌病ALVAC病毒構建體期間可能產生的任一序列差異。圖5闡明該構建策略。
使用限制內切酶sSna BI＋Bsr GI消化質粒pNVQH6C5LSP－18(美國申請案第20050255127號)以產生3,923 bp片段及962 bp片段。藉由瓊脂糖凝膠電泳解析RE消化物並自該凝膠切除3,923 bp片段。使用QIA快速凝膠提取套組(Qiagen Inc.,USA；目錄編號28704)按照製造商所述純化該DNA片段。
接下來，使用ALVAC基因組DNA作為引物組7634CXL與引物組7521CXL之PCR反應(參見下文)的模版以產生跨越該病毒C5R區域之1.89 kb PCR片段。
(SEQ ID NO：11)7521CXL(正向)：－5' TTATTTAGAAATTATGCATTTTAGA(SEQ ID NO：12)7634CXL(反向)：－5' GTTCTCGTAGGAGAGAACTATTGAC
使用Sna BI＋Bsr GI消化1.89 kb PCR擴增片段以產生3個片段：361 bp、569 bp及962 bp。藉由瓊脂糖凝膠電泳顯示該RE消化物並自該凝膠切除962 bp片段且使用QIA快速凝膠提取套組(Qiagen Inc.,USA；目錄編號28704)按照製造商所述純化該DNA。
藉由合併若干RE片段以形成如下pCXL148.2來實現ALVAC供體質粒pNVQH6C5LSP－18之再次構建，其中使用對應的ALVAC野生型核苷酸"C"代替供體質粒之C5R編碼區中之突變"T"核苷酸：a.使用T4 DNA連接酶將來自RE(Sna BI＋Bsr GI)消化之pNVQH6C5LSP－18的經純化3,923 bp片段直接連接至源自ALVAC之PCR擴增C5R區的962 bpSna BI＋Bsr GI片段。
b.連接反應用於轉化感受態E.coli 細胞且該等轉化反應在氨苄西林選擇下進行。
選擇轉化體並藉由RE消化物表徵其質粒DNA。發現一候選選殖體pCXL148.2之核苷酸序列在C5R區中具有正確的"C"核苷酸。新穎C5供體質粒pCXL148.2與ALVAC病毒載體中對應序列具有精確同源性。圖6中提供pCXL148.2供體質粒之核酸序列(SEQ ID NO：13)
實例6：pC5 H6pVP2之構建
使用EcoR V＋Xho I來RE消化質粒VP2 BTV 17(043004，圖3)以產生單獨2,913 bp片段，其依序包含：5'Eco R V位點以及全長合成密碼子優化BTV－VP2以及3'Xho I位點。藉由瓊脂糖凝膠電泳顯示此RE消化，並自該凝膠切除2,913 bp片段且使用QIA快速凝膠提取套組(Qiagen Inc.,USA；目錄編號28704)按照製造商所述純化該DNA。
使用Eco R V及Xho I消化pCXL148.2(pC5供體質粒，參見圖5)以產生含有C5右臂、H6啟動子及C5左臂之線性化4879 bp同源性載體。
使用T4 DNA連接酶將來自RE(Eco RV＋Xho I)消化之043004pVP2 BTV 17的經純化2,913 bp片段直接連接至經4879 bpEco RV＋Xho I消化及線性化之pCXL－148.2供體ALVAC質粒。連接反應用於轉化感受態E.coli 細胞，且該等轉化反應在氨芳西林選擇下進行。選擇轉化體、使之生長並藉由RE消化物表徵其質粒DNA。使用VP2特異性核酸寡核苷酸在南方點漬上探測具有正確RE譜圖之選殖體。選擇一個用於後續選殖操作之陽性選殖體pALVAC C5H6p－合成BTV VP2。圖7中提供上述選殖策略。
實例7：納入42K啟動子之VP5的PCR擴增
選擇桑緣燈蛾昆蟲痘病毒(Entomopoxvirus Amsacta moorei)42K啟動子(Barcena,Lorenzo等人，2000)以調節經優化合成VP5基因之表現。使用基於PCR之策略將42K啟動子核酸序列(參見下文：啟動子序列係斜體及無下劃線之文字)毗鄰合成VP5基因之5'ATG起始密碼子放置，其中42K啟動子包埋於正向合成引物之5'末端。使用此引物聯合反向引物可自用作模板之質粒VP5 BTV 17(043005)直接擴增(參見圖8)。在PCR反應中使用引物配對13247.JY/13248.JY(下文及圖21)來擴增包含側接Xho I位點之42Kp－VP5表現彈夾的DNA片段。
用於擴增42Kp－BTV VP5表現彈夾之引物：(SEQ ID NO：14)13247.JY正向：－5' GCGCTCGAGTTTTATTCAAAATTGAAAATATATAATTACAATATAAA A TGGGCAAGATCATCAAGAGCCTG (SEQ ID NO：15)13247.JY反向：－5' ATCTCGAGATAAAAA TCATCAGGCGTTCCTCAGGAACAGGGGCACGTC
使用上述引物實施反向轉錄酶聚合酶鏈反應(PCR反應)，並按照製造商說明將所得PCR產物選殖至pCR2.1－TOPO選殖載體之Xho I位點(Invitrogen公司，Carlsbad,CA,USA)以形成pLH2033.1(pCR2.1 42Kp合成BTV－VP5)。已證實此構建體含有正確的序列。此選殖策略闡明於圖9中。擴展pLH2033.1選殖體以在後續選殖活動中按照需要擴增質粒產量。
實例8：構建供體同源性載體pLH2078.15(pC5H6VP242KpVP5)
使用可釋放編碼BTV VP5之1,647 bp片段的Xho I切割包含42Kp－合成BTV VP5序列之pLH2033.1。藉由瓊脂糖凝膠電泳顯示此Xho I消化物並自該凝膠切除1,647 bp VP2片段且使用QIA快速凝膠提取套組(Qiagen Inc.,USA；目錄編號28704)按照製造商所述純化該DNA。
使用Xho I消化pLH2030.2(pALVAC C5H6p－合成BTV VP2，pC5供體質粒，參見圖7)以產生含有C5右臂、H6啟動子、合成BTV VP2及C5左臂之線性化7,744 bp同源性載體。
使用T4 DNA連接酶將來自Xho I消化之pLH2033.1的經純化1,647 bp片段連接至經7,744 bpXho I線性化之pLH2030.2供體ALVAC質粒。該等連接反應用於轉化感受態E.coli 細胞且該等轉化反應在氨苄西林選擇下進行。選擇轉化體、使之生長並藉由RE消化物表徵其質粒DNA。由於所述連接係無方向的，選殖體選擇之元素組份需要相對於供體質粒中H6pVP2之取向適當地定向42Kp－合成VP5插入體，因此在此實施例中較佳取向係由頭至尾，例如，於該質粒上沿相同5'至3'方向轉錄及轉譯VP2及VP5。選擇用於進一步特徵分析之具有正確RE圖案之選殖體。選擇並測序一個陽性選殖體pLH2978.15。在圖10中提供用於構建最終ALVAC－BTV供體質粒之所述選殖策略。pLH2978.15之注釋核苷酸序列提供於圖11中。
實例9. ALVAC BTV(vCP2289)之產生及表徵.
為了產生基於LVAC之BTV重組體，使用15微克與FuGENE－6轉染試劑(Roche)混合之Not I 線性化pLH2078.15供體質粒DNA(pC5 H6p－BTV VP2－42Kp－BTV VP5)轉染原代雞胚纖維母細胞(CEF)。隨後使用ALVAC(6.3 x 109 pfu/毫升HM1372)作為拯救病毒以10之MOI感染該等經轉染細胞。在24小時後，收穫經傳染感染細胞，超聲處理之並用於噬菌斑純化及重組病毒篩選。在置於新鮮CEF上24－48小時後，將重組噬菌斑轉移至耐綸膜上並依照製造商規程與標記有辣根過氧化物酶之BTV－特異性DNA探針雜交(Amersham，目錄編號RPM3001)。在4輪連續噬菌斑純化後，擴增單一噬菌斑以產生被命名為vCP2289.1.2.1.1及vCP2289.1.1.1之原種。藉由雜交確認重組病毒，對於BTV插入體呈現100%陽性且對於空C5位點呈現100%陰性。
自最後一輪噬菌斑純化選擇單一噬菌斑並擴展以獲得P1(T－25燒瓶)、P2(T－75燒瓶)及P3(滾瓶)原種以便擴增vCP2289.1.2.1.1及vCP2289.2.1.1.1。藉由雜交於P2水平下再次確認該等重組體且發現其對插入體呈現100%陽性且對於空C5位點呈現100%陰性。收集來自滾瓶之經感染細胞培養液並濃縮以產生病毒原液(1.8毫升vCP2289.1.2.1.1，1.25×1010 pfu/毫升；及1.9毫升vCP2289.2.1.1.1，1.0×1010 pfu/毫升)。圖12提供用於構建重組ALVAC＋BTV VP2及VP5(vCP2289)之流程圖。
實例10. ALVAC BTV(vCP2289)之特徵.
1.遺傳純度之確認. 藉由雜交再次驗證P3原種：對BTV插入體呈現100%陽性且對於空C5位點呈現100%陰性。
2.基因組份析. a.限制酶切圖譜：i.在Vector NTI(Invitrogen,USA)中形成基因組DNA之理論限制內切酶(RE)凝膠電泳片段分析並展示於圖13中。
ii.自vCP2289.1.2.1.1及vCP2289.2.1.1.1提取基因組DNA，使用Bam H I、Hin d III或Pst I消化之，並藉由0.8%瓊脂糖凝膠電泳分離。結果顯示異種基因序列之正確插入(參見圖14)。
b.南方點漬：將經Bam H I、Hin d III或Pst I消化之基因組DNA轉移至耐綸膜並藉由使用BTV探針探測來實施南方點漬分析。經觀測到BTV－特異性9508bpBam H I、14974bpHin d III及2901bpPst I帶處於預期尺寸。結果表明BTV插入體正確插入C5基因座中。圖15提供南方點漬之結果。
3.表現分析： a.西方點漬. 使用vCP2289.1.2.1.1及vCP2289.2.1.1.1之P3原種以10之MOI感染1°CEF細胞並於37℃下培育24小時。隨後收穫該等細胞及培養物上清液。使用10% SDS－PAGE凝膠分離樣品蛋白，電印跡轉移至Immobilon耐綸膜，並以1：2000稀釋率使用兔子抗－BTV17 VP5親和純化IgG(University of California,Davis,USA)探測。使用綴合山羊抗－兔子抗血清之過氧化物酶作為二級抗體並使用Amersham檢測試劑顯現帶型。在vCP2289.1.2.1.1及vCP2289.2.1.1.1之細胞沉澱中檢測位於47KDa與60KDa間之兩蛋白帶型，表明BTV－17 VP5蛋白受到表現(參見圖16)。經表現BTV－17 VP5蛋白並未分泌至細胞培養基中。
b.螢光免疫試驗法. 使用4種小鼠抗－BTV－17 VP2抗體(ABX IgG 17.81 α－BTV 17、PA IgG17.815 α－BTV 17、PA IgG 17.85 α－BTV 17、PA IgG 17.813 α－BTV－17，來自University of California,Davis,USA)之混合物，VP2表現之西方點漬及免疫噬菌斑試驗為陰性，此可能係由於試劑構形敏感性及由轉移和雜交所施加的"類似變性環境"所致。因此，使用vCP2289.1.2.1.1及vCP2289.2.1.1.1之P3原種以0.1之MOI感染1°CEF細胞並在37℃下培育24小時。隨後使用3%低聚甲醛固定該等細胞並使用0.5% Triton X－100透化。以1：100稀釋率使用4種小鼠抗－BTV17 VP2抗體(ABX IgG 17.81抗－BTV 17、PA IgG 17.815抗－BTV 17、PA IgG 17.85抗－BTV 17、PA IgG 17.813抗－BTV－17，來自University of California,USA)之混合物作為一級抗體並使用綴合山羊抗－小鼠抗體之FITC作為二級抗體。在Nikon Eclipse TE300螢光顯微鏡下觀測亮綠色螢光細胞，表明BTV VP2蛋白受到表現(數據未示出)。
4.序列分析 ：藉由C5基因座和BTV插入體側接臂之PCR擴增及序列分析對P3原種基因組DNA實施更具體的分析。位於C5基因座之臂外的引物7931.DC及7932.DC用於擴增整個C5R－BTV插入體－C5L片段。
用於vCP2289 C5臂加插入體之PCR擴增的引物：(SEQ ID NO：16)7931.DC：－5 GAATCTGTTAGTTAGTTACTTGGAT(SEQ ID NO：17)7932.DC：－5 TGATTATAGCTATTATCACAGACTC
結果顯示BTV插入體及vCP2289.1.2.1.1和vCP2289.2.1.1.1中位於BTV插入體附近之C5左臂及右臂的序列係正確的。
實例11：重組疫苗之製備
對於羊疫苗、牛疫苗或馬疫苗之製備而言，可使用卡波姆溶液(即由BF Goodrich,Ohio,USA生產的CarbopolTM 974P，分子量為約3,000,000)輔助重組金絲雀痘vCP2289病毒(實例9)。
在含有1克/公升氯化鈉之蒸餾水中開始製備1.5% CarbopolTM 974P儲備溶液。此儲備溶液用於製備存於生理鹽溶液中之4毫克/毫升CarbopolTM 974P溶液。以單一階段或若干連續階段將該儲備溶液與足夠體積之生理鹽溶液混合，在每一階段中使用1N氫氧化鈉溶液(或甚至更濃)調節pH值以獲得7.3至7.4之最終pH值。
使用以此方式獲得的備用CarbopolTM 974P溶液來溶解凍乾重組病毒或稀釋濃重組病毒儲備溶液。舉例而言，為了獲得含有108 pfu/l毫升劑量之病毒性懸浮液，稀釋病毒性儲備溶液以獲得108.3 pfu/毫升之效價，繼而分若干等份使用該備用4毫克/毫升CarbopolTM 974P稀釋。
實例12：用於羊、牛或馬之DNA疫苗的製備.
對於DNA免疫，構建若干質粒，其中密碼子優化之BTV VP2核苷酸序列(附圖1，SEQ ID：1)位於一個質粒上且BTV VP5(SEQ ID：2)核苷酸序列位於另一質粒上。可藉由(但不限於)CMV－IE啟動子(人類CMV或鼠類CMV)驅動來自每一質粒之BTV序列的表現。Poly Adenine(polyA)序列信號(來自牛生長激素基因或兔子β球蛋白基因，但不限於此等)在每一質粒中應在BTV編碼序列3'末端納入。
可能需要自相同質粒表現BTV VP2及VP5以確保BTV蛋白在相同細胞中共表現。在此情形中，應構建類似於pLH2078.15之質粒(實例8，附圖10)，其中使用(但不限於)遍在真核啟動子(例如，人類CMV－IE啟動子)代替痘病毒啟動子。可能需要藉由不同啟動子控制BTV VP2及VP5之表現。PolyA信號序列應包含於每一BTV核苷酸序列之3'末端。
可藉由以Sambrook等人(1989)所述方式實施乙醇沉澱來濃縮含有上述質粒之DNA溶液。可藉由0.9% NaCl溶液溶解該DNA沉澱以獲得1毫克/毫升之濃度。藉由使用適宜體積之無菌H2 O吸收DMRIE－DOPE冷幹產物可製備0.75 mM DMRIE－DOPE溶液。
可藉由使用存於0.9% NaCl中之1毫克/毫升DNA溶液稀釋若干等份0.75 mM DMRIE－DOPE溶液(1：1)來形成質粒－脂質DNA複合物。可藉助26G捲曲狀針沿含有氧離子脂質溶液之燒瓶壁逐漸導入DNA溶液以防止形成泡沫。應在將這兩種溶液混合後即刻輕柔地攪拌。最終獲得包含0.375 mM DMRIE－DOPE及500微克/毫升質粒之組合物。
對於本文所述所有作業而言，所有溶液需要在環境溫度下使用。在對動物實施免疫之前，應使DNA/DMRIE－DOPE在環境溫度下複合30分鐘。
實例13：使用重組金絲雀痘病毒對綿羊實施疫苗接種
自CA西北方(一無BTV感染之區域)之供應商購得11只無角多爾塞特(Dorset)羊羔(9只雄性，2只雌性)。在整個所述研究過程中，將該等動物圈入隔離昆蟲之安全設施中且在實施疫苗接種之前藉由競爭性ELISA證實所有該等動物均不含抵抗BTV之抗體。在約13個月大時(11/22/05)，藉助經PBS稀釋之約1毫升BTV－CP(0.2毫升未經稀釋[109.5 TCID50 /毫升]vCP2289/只綿羊＝~6.3×108 個病毒顆粒)對6只羊羔分別接種SQ/IM並使用表現West Nile病毒vCP/WNV(Recombitek)之preM及E蛋白的重組金絲雀痘對5只羊羔實施疫苗接種，依照製造商說明復原並投與該重組金絲雀痘。22天後(12/14/05)以相同劑量使用相應的疫苗構建體對所有綿羊實施再次疫苗接種(作為初次免疫)。將該等動物一起圈養，而不管疫苗類別如何。
實例14：滴定抗－BTV中和抗體
以3之比率在添加有10%胎牛血清之DMEM培養基(存於細胞培養型96孔板中)中產生每一血清之稀釋系列。向0.05毫升經稀釋血清中加入含有約100 CCIP50 /毫升BTV之0.05毫升培養基。將此混合物在37℃下於烘箱中在含有5% CO2之氣氛中培育2小時。
隨後向每一混合物中加入具有約100,000個細胞/毫升之濃度的0.15毫升BHK－21細胞懸浮液。於37℃下在含有5% CO2 之氣氛中培養4天至5天後，藉由相差顯微鏡觀測細胞病變效應(CPE)。使用Krber方法計算每一血清之中和效價。該等效價係以抑制50%小孔之細胞病變效應的最大稀釋率形式給出。該等效價以log10 VN50 表示。對每一血清滴定至少2次且較佳為4次。
實例15. 綿羊之BTV感染及試樣收集
藉由在二次疫苗接種後第34天經皮下接種105.5 TCID50 BTV－17來攻擊所有11只羊羔。在接種後每日評定該等動物之藍舌病表像，持續3周。在接種前及於接種後3天、6天、9天、13天及16天(DPI)收集用於全血細胞計數(CBC)之供血液學分析用血液(收集於EDTA中)。在0、1、3、5、7、9、11、14及21 DPI時收集用於病毒分離之血樣(酸式檸檬酸鹽右旋糖)。每隔一周剛好在實施疫苗接種前自所有綿羊收集血清("Tiger Top"，血清分離器)。在攻擊暴露於BTV後第25天時以人道方式對所有該等綿羊實施無痛致死術。
實例16. BTV病毒分離
按照上文所述自全羊血分離病毒(Bonneau,Mullens等人，2001；Bonneau,DeMaula等人，2002；DeMaula,Leutenegger 等人，2002)。簡言之，以2,500G於4℃下將真空試管離心10分鐘。傾倒出血清並棄置。使用5毫升無菌PBS(1×)洗滌紅血細胞/白血細胞(1×)，再次離心並將細胞沉澱重新懸浮於等體積之無菌再蒸餾水(ddH2 O)中。將經洗滌/裂解血細胞超聲處理1－2分鐘，然後在EMEM中稀釋(10－1 至10－4 )並接種(0.25毫升/孔)至存於24孔板中之鋪滿BHK－21單層上。將該等培養物於37℃下培育1小時，此時添加維持培養基。每日檢查該等培養物，持續10天並藉由Reed及Mnch之方法測定病毒效價。
實例17. 存於綿羊中之BTV－vCP2289重組ALVAC的免疫原性
藉由在實施疫苗接種之前實施競爭性ELISA及BTV－17微量中和試驗測得所有綿羊對BTV均呈現血清陰性(數據未示出)。用vCP/BTV表現載體實施疫苗接種之綿羊出現針對BTV－17之中和抗體，而彼等用vCP/WNV免疫者未出現該等抗體(參見下表3)。所有綿羊均保持健康且在實施疫苗接種後未顯示副作用。
實例18. 經BTV－CP免疫之綿羊在攻擊後之保護
在暴露於BTV－17攻擊後藉由比較存於vCP/BTV vCP2289與vCP/WNV免疫綿羊血液中之BTV－17的效價來評定vCP/BTV保護免疫綿羊之能力。
表4 在使用表現藍舌病病毒(vCP/BTV)或West Nile病毒(vCP/WNV)之外殼蛋白的重組金絲雀痘病毒實施免疫後存於經該病毒攻擊之綿羊血液中之藍舌病病毒的效價 結果(上表4)顯示：可使用BTV攻擊病毒在攻擊後第3天有效地感染對照綿羊(WNV－CP)。在攻擊後對照綿羊持續呈現病毒血症長達21天，在此時終止該實驗。
經BTV－CP疫苗免疫之綿羊在實驗性攻擊感染後呈現抵抗病毒血症之強烈保護，此乃因在21天研究期間未在經疫苗接種綿羊血液中檢測到BTV。所有6只經BTV－CP免疫之綿羊均可完全抵抗有毒攻擊，此表明該疫苗之功效。
實例19 BTV感染綿羊之臨床反應. 下文提供用BTV－CP實施疫苗接種之綿羊(疫苗接種者)與用WNV－CP實施疫苗接種之綿羊(對照)在使用BTV－17攻擊後的臨床反應對比：1.體溫(BT). 在攻擊後14天期間，每日監測所有6只BTC－CP疫苗接種者及所有5只對照(經WNV－CP免疫)綿羊之體溫。受攻擊綿羊之溫度數據顯示於下表3及附圖17中。該等數據顯示：對照在攻擊後第3天平均BT升高約1℃，而BTV－CP疫苗接種者之平均BT沒有變化。在第6天時，觀測到對照動物溫度突然升高4℃(105℃)。此係病毒血症性BTV感染動物之典型反應。經BTV－CP免疫之動物呈現不會明顯偏離攻擊前動物溫度之正常溫度。此等結果證實疫苗(BTV－CP)之效能。
2.白血細胞計數 在攻擊後16天期間，在第0天及每隔約3天監測所有6只BTC－CP疫苗接種者及所有5只對照(經WNV－CP免疫)綿羊之白血細胞(WBC)計數。受攻擊綿羊之WBC數據顯示於下表6及附圖18中。該等數據顯示對照者在攻擊後第8天平均WBC開始有所降低且在攻擊後第9－16天平均WBC持續升高，而BTV－CP疫苗接種者之平均WBC沒有變化。WBC在攻擊後之延遲升高係病毒血症性BTV感染動物之典型反應。經BTV－CP免疫之動物呈現不會明顯偏離攻擊前動物WBC之正常WBC。此等結果證實疫苗(BTV－CP)效能。
3.淋巴細胞計數. 在攻擊後16天期間，在第0天及每隔約3天(直至第16天)監測所有6只BTC－CP疫苗接種者及所有5只對照(經WNV－CP免疫)綿羊之淋巴細胞計數。受攻擊綿羊之淋巴細胞數據顯示於下表7及附圖19中。該等數據顯示對照者在攻擊後前8天內平均WBC開始有所降低且在攻擊後第9－16天平均淋巴細胞計數持續升高，而BTV－CP疫苗接種者之平均淋巴細胞計數沒有變化。淋巴細胞計數在攻擊後之延遲增加係病毒血症性BTV感染動物之典型反應。經BTV－CP免疫之動物呈現不會明顯偏離攻擊前動物淋巴細胞計數之正常淋巴細胞計數。此等結果證實疫苗(BTV－CP)效能。
4.血小板計數. 在攻擊後16天期間，在第0天及每隔約3天(直至第16天)監測所有6只BTC－CP疫苗接種者及所有5只對照(經WNV－CP免疫)綿羊之血小板計數。受攻擊綿羊之血小板數據顯示於下表8及附圖20中。該等數據顯示對照者在攻擊後前8天內平均血小板計數開始有所降低且在攻擊後第9－16天平均血小板計數持續升高。在BTV－CP疫苗接種者中，在整個研究期間血小板逐漸增加。在整個研究期間BTV－CP疫苗接種者之血小板計數高於對照者之血小板計數。血小板計數在攻擊後之降低係病毒血症性BTV感染動物之典型反應。經BTV－CP免疫之動物呈現正常的血小板計數。此等結果證實疫苗(BTV－CP)效能。
參考文獻
A nderson,G.A.,J.L.Stott等人(1985)."Subclinical and clinical bluetongue disease in cattle：clinical,pathological and pathogenic considerations." Prog Clin Biol Res 178：103－7.
Andreansky,S.S.,B.He等人(1996)."The application of genetically engineered herpes simplex viruses to the treatment of experimental brain tumors." Proc Natl Acad Sci U S A 93(21)：11313－8.
Andrew,M.,P.Whiteley等人(1995)."Antigen specificity of the ovine cytotoxic T lymphocyte response to bluetongue virus." Vet Immunol Immunopathol 47(3－4)：311－22.
Antoine,G.,F.Scheiflinger等人(1998)."The complete genomic sequence of the modified vaccinia Ankara strain：comparison with other orthopoxviruses." Virology 244(2)：365－96.
Ballay,A.,M.Levrero等人(1985)."In vitro and in vivo synthesis of the hepatitis B virus surface antigen and of the receptor for polymerized human serum albumin from recombinant human adenoviruses." Embo J 4(13B)：3861－5.
Barcena,J.,M.M.Lorenzo等人(2000)."Sequence and analysis of a swinepox virus homologue of the vaccinia virus major envelope protein P37(F13L)." J Gen Virol 81(Pt 4)：1073－85.
Bernard,K.A.,B.A.Israel等人(1997)."Sequence and cognitive analyses of tWO virulence－associated markers of bluetongue virus serotype 17." Intervirology 40(4)：226－31.
Bonneau,K.R.,C.D.DeMaula等人(2002)."Duration of viraemia infectious to Culicoides sonorensis in bluetongue virus－infected cattle and sheep." Vet Microbiol 88(2)：115－25.
Bonneau,K.R.,B.A.Mullens等人(2001)."Occurrence of genetic drift and founder effect during quasispecies evolution of the VP2 and NS3/NS3A genes of bluetongue virus upon passage between sheep,cattle,and Culicoidess onorensis." J Virol 75(17)：8298－305.
Bonneau,K.R.,N.Zhang等人(1999)."Sequence comparison of the L2 and S10 genes of bluetongue viruses from the United States and the People's Republic of China." Virus Res 61(2)：153－60.
Boshart,M.,F.Weber等人(1985)."A very strong enhancer is located upstream of an immediate early gene of human cytomegalovirus." Cell 41(2)：521－30.
Bradel－Tretheway,B.G.,Z.Zhen等人(2003)."Effects of codon－optimization on protein expression by the human herpesvirus 6 and 7 U51 open reading frame." J Virol Methods 111(2)：145－56.
Carroll,M.W.,W.W.Overwijk等人(1997)."Highly attenuated modified vaccinia virus Ankara(MVA)as an effective recombinant vector：a murine tumor model." Vaccine 15(4)：387－94.
Cochran,M.A.,C.Puckett等人(1985)."In vitro mutagenesis of the promoter region for a vaccinia virus gene：evidence for tandem early and late regulatory signals." J Virol 54(1)：30－7.
Cowley,J.A.and B.M. Gorman(1989)."Cross－neutralization of genetic reassortants of bluetongue virus serotypes 20 and 21." Vet Microbiol 19(1)：37－51.
De Groot,A.S.and F.G.Rothman(1999)."In silico predictions；in vivo veritas." Nat Biotechnol 17(6)：533－4.
de Mattos,C.A.,C.C.de Mattos等人(1994)."Heterogeneity of the L2 gene of field isolates of bluetongue virus serotype 17 from the San Joaquin Valley of California." Virus Res 31(1)：67－87.
DeMaula,C.D.,K.R.Bonneau等人(2000)."Changes in the outer capsid proteins of bluetongue virus serotype ten that abrogate neutralization by monoclonal antibodies." Virus Res 67(1)：59－66.
DeMaula,C.D.,H.W.Heidner等人(1993)."Neutralization determinants of United States bluetongue virus serotype ten." Virology 195(1)：292－6.
DeMaula,C.D.,C.M.Leutenegger等人(2002)."The role of endothelial cell－derived inflam matory and vasoactive mediators in the pathogenesis of bluetongue." Virology 296(2)：330－7.
Disbrow,G.L.,I.Sunitha等人(2003)."Codon optimization of the HPV－16 E5 gen eenhances protein expression." Virology 311(1)：105－14.
Felgner,J.H.,R.Kumar等人(1994)."Enhanced gene delivery and mechanism studies with a novel series of cationic lipid formulations." J Biol Chem 269(4)：2550－61.
Frolov,I.,T.A.Hoffman等人(1996)."Alphavirus－based expression vectors：strategies and applications." Proc Natl Acad Sci U S A 93(21)：11371－7.
Funahashi,S.,T.Sato等人(1988)."Cloning and characterization of the gene encoding the major protein of the A－type inclusion body of cowpox virus." J Gen Virol 69(Pt 1)：35－47.
Geysen,H.M.(1990)."Molecular technology：peptide epitope mapping and the pin technology." Southeast Asian J Trop Med Public Health 21(4)：523－33.
Geysen,H.M.,S.J.Barteling等人(1985)."Small peptides induce antibodies with a sequence and structural requirement for binding antigen comparable to antibodies raised against the native protein." Proc Natl Acad Sci U S A 82(1)：178－82.
Geysen,H.M.,R.H.Meloen等人(1984)."Use of peptide synthesis to probe viral antigens for epitopes to a resolution of asingle amino acid." Proc Natl Acad Sci U S A 81(13)：3998－4002.
Ghiasi,H.,A.Fukusho等人(1987)."Identification and characterization of conserved and variable regions in the neutralization VP2 gene of bluetongue virus." Virology 160(1)：100－9.
Graham,F.L.(1990)."Adenoviruses as expression vectors and recombinant vaccines." Trends Biotechnol 8(4)：85－7.
Guo,P.X.,S.Goebel等人(1989)."Expression in recombinant vaccinia virus of the equine herpesvirus 1 gene encoding glycoprotein gp13 and protection of immunized animals." J Virol 63(10)：4189－98.
Hartikka,J.,M.Sawdey等人(1996)."An improved plasmid DNA expression vector for direct injection into skeletal muscle." Hum Gene Ther 7(10)：1205－17.
Hassan,S.S.and P.Roy(1999)."Expression and functional characterization of bluetongue virus VP2 protein：role in cell entry." J Virol 73(12)：9832－42.
Heidner,H.W.,P.V.Rossitto等人(1990)."Identification of four distinct neutralizing epitopes on bluetongue virus serotype 10 using neutralizing monoclonal antibodies and neutralization－escape variants." Virology 176(2)：658－61.
Hemmer,B.,C.Pinilla等人(1998)."The use of soluble synthetic peptide combinatorial libraries to determine antigen recognition of T cells." J Pept Res 52(5)：338－45.
Huang,I.J.,G.Y.Hwang等人(1995)."Sequence analyses and antigenic epitope mapping of the putative RNA－directed RNA polymerase of five U.S.bluetongue viruses."Virology 214(1)：280－8.
Huismans,H.and B.J.Erasmus(1981)."Identification of the serotype－specific and group－specific antigens of bluetongue virus." Onderstepoort J Vet Res 48(2)：51－8.
Huismans,H.,N.T.van der Walt等人(1987)."Isolation of a capsid protein of bluetongue virus that induces a protective immune response in sheep." Virology 157(1)：172－9.
Jewell,J.E.and J.O.Mecham(1994)."Identification of an amino acid on VP2 that affects neutralization of bluetongue virus serotype 10." Virus Res 33(2)：139－44.
Ju,Q.,D.Edelstein等人(1998)."Transduction of non－dividing adult human pancreatic beta cells by an integrating lentiviral vector." Diabetologia 41(6)：736－9.
Kim,C.H.,Y.Oh等人(1997)."Codon optimization for high－level expression of human erythropoietin(EPO)in mammalian cells." Gene 199(1－2)：293－301.
Kitson,J.D.,K.L.Burke等人(1991)."Chimeric polioviruses that include sequences derived from tWO independent antigenic sites of foot－and－mouth disease virus (FMDV)induce neutralizing antibodies against FMDV in guinea pigs." J Virol 65(6)：3068－75.
Klinman,D.M.,A.K.Yi等人(1996)."CpG motifs present in bacteria DNA rapidly induce lymphocytes to secrete interleukin 6,interleukin 12,and interferon gamma." Proc Natl Acad Sci U S A 93(7)：2879－83.
Kwissa,M.,K.van Kampen等人(2000)."Efficient vaccination by intradermal or intramuscular inoculation of plasmid DNA expressing hepatitis B surface antigen under desmin promoter/enhancer control." Vaccine 18(22)：2337－44.
Laval,F.,R.Paillot等人(2002)."Quantitative analysis of the antigen－specific IFNgamma＋ T cell－mediated immune response in conventional outbred pigs：kinetics and duration of the DNA－induced IFNgamma＋ CD8＋ T cell response." Vet Immunol Immunopathol 90(3－4)：191－201.
Lobato,Z.I.,B.E.Coupar等人(1997)."Antibody responses and protective immunity to recombinant vaccinia virus－expressed bluetongue virus antigens." Vet Immunol Immunopathol 59(3－4)：293－309.
Luckow,V.A.and M.D.Summers(1988)."Signals important for high－level expression of foreign genes in Autographa californica nuclear polyhedrosis virus expression vectors." Virology 167(1)：56－71.
MacLachlan,N.J.(1994)."The pathogenesis and immunology of bluetongue virus infection of ruminants." Comp Immunol Microbiol Infect Dis 17(3－4)：197－206.
MacLachlan,N.J.and J.E.Pearson(2004).Bluetongue：Prodeedings of the Third International Symposium.Bluetongue：Prodeedings of the Third International Symposium.N.J.MacLachlan and J.E.Pearson,Vet Italiana.40：1－730.
Marshall,E.,L.B.WO olford等人(1997)."Continuous infusion of macrophage inflammatory protein MIP－lalpha enhances leucocyte recovery and haemopoietic progenitor cell mobilization after cyclophosphamide." Br J Cancer75(12)：1715－20.
Martinez－Torrecuadrada,J.L.,J.P.Langeveld等人(1999)."Antigenic profile of African horse sickness virus serotype 4 VP5 and identification of a neutralizing epitope shared with bluetongue virus and epizootic hemorrhagic disease virus." Virology 257(2)：449－59.
McClements,W.L.,M.E.Armstrong等人(1996)."Immunization with DNA vaccines encoding glycoprotein D or glycoprotein B,alone or in combination,induces protective immunity in animal models of herpes simplex virus－2 disease." Proc Natl Acad Sci U S A 93(21)：11414－20.
Mecham,J.O.,V.C.Dean等人(1986)."Correlation of serotype specificity and protein structure of the five U.S.serotypes of bluetongue virus." J Gen Virol 67(Pt 12)：2617－24.
Mecham,J.O.and D.J.Johnson(2005)."Persistence of bluetongue virus serotype 2(BTV－2)in the southeast United States." Virus Res 113(2)：116－22.
Miyazaki,J.,S.Takaki等人(1989)."Expression vector system based on the chicken beta－actin promoter directs efficient production of interleukin－5." Gene 79(2)：269－77.
Moss,B.(1996)."Genetically engineered poxviruses for recombinant gene expression,vaccination,and safety." Proc Natl Acad Sci U S A 93(21)：11341－8.
Mullens,B.A.,W.J.Tabachnick等人(1995)."Effects of temperature on virogenesis of bluetongue virus serotype 11 in Culicoides variipennis sonorensis." Med Vet Entomol 9(1)：71－6.
Paoletti,E.(1996)."Applications of pox virus vectors to vaccination：an update." Proc Natl Acad Sci U S A 93(21)：11349－53.
Pearson,W.R.and D.J.Lipman(1988)."Improved tools for biological sequence comparison." Prdc Natl Acad Sci U S A 85(8)：2444－8.
Pennock,G.D.,C.Shoemaker等人(1984)."Strong and regulated expression of Escherichia coli beta－galactosidase in insect cells with a baculovirus vector." Mol Cell Biol 4(3)：399－406.
Perkus,M.E.,K.Limbach等人(1989)."Cloning and expression of foreign genes in vaccinia virus,using a host range selection system." J Virol 63(9)：3829－36.
Powell,M.F.and M.J.Newman(1995).Vaccine Design,The Subunit and Adjuvant Approach.A Compendium of Vaccine Adjuvants and Excipients.F.Vogel and M.Powell.New York,Plenum Press.6：147,183.
Prevec,L.,M.Schneider等人(1989)."Use of human adenovirus－based vectors for antigen expressionin animals." J Gen Virol 70(Pt 2)：429－34.
Pritchard,L.I.and A.R.Gould(1995)."Phylogenetic comparison of the serotype－specific VP2 protein of bluetongue and related orbiviruses." Virus Res 39(2－3)：207－20.
Regelson,W.,S.Kuhar等人(1960)."Synthetic polyelectrolytes as tumour inhibitors." Nature 186：778－80.
Riviere,M.,J.Tartaglia等人(1992)."Protection of mice and swine from pseudorabies virus conferred by vaccinia virus－based recombinants." J Virol 66(6)：3424－34.
Robertson,E.S.,T.Ooka等人(1996)."Epstein－Barr virus vectors for gene delivery to B lymphocytes." Proc Natl Acad Sci U S A 93(21)：11334－40.
Robinson,H.L.and C.A.Torres(1997)."DNA vaccines." Semin Immunol 9(5)：271－83.
Roizman,B.(1996)."The function of herpes simplex virus genes：a primer for genetic engineering of novel vectors." Proc Natl Acad Sci U S A 93(21)：11307－12.
Rossitto,P.V.and N.J.MacLachlan(1992)."Neutralizing epitopes of the serotypes of bluetongue virus present in the United States." J Gen Virol 73(Pt 8)：1947－52.
Roy,P.(1992)."Bluetongue virus proteins." J Gen Virol 73(Pt 12)：3051－64.
Roy,P.(1996)."Orbivirus structure and assembly." Virology 216(1)：1－11.
Roy,P.(1996).Orbiviruses and their replication.Fields Virology.B.N.Fields,D.M.Knipe,P.M.Howley.Philadelphia,PA,Lippincott－Raven：1709－1734.
Roy,P.,T.Urakawa等人(1990)."Recombinant virus vaccine for bluetongue disease in sheep." J Virol 64(5)：1998－2003.
Sambrook,J.and D.W.Russell(2001).Molecular Cloning：a laboratory manual/Joseph Sambrook,David W.Russell.Cold Spring Harbor,N.Y.,Cold Spring Harbor Laboratory Press.
Schneider,K.,F.Puehler等人(2000)."cDNA cloning of biologically active chicken interleukin－18." J Interferon Cytokine Res 20(10)：879－83.
Shida,H.(1986)."Nucleotide sequence of the vaccinia virus hemagglutinin gene." Virology 150(2)：451－62.
Smith,G.E.,M.D.Summers等人(1983)."Production of human beta interferon in insect cells infected with a baculovirus expression vector." Mol Cell Biol 3(12)：2156－65.
Spreull,J.(1905)."Malarial catarrhal fever(bluetongue)of sheep in South Africa." J.Comp.Path..Ther.18：321－337.
Stickl,H.and V.Hochstein－Mintzel(1971)."[Intracutaneous smallpox vaccination with a weak pathogenic vaccinia virus("MVA virus")]." Munch Med WO chenschr 113(35)：1149－53.
Stittelaar,K.J.,L.S.Wyatt等人(2000)."Protective immunity in macaques vaccinated with a modified vaccinia virus Ankara－based measles virus vaccine in the presence of passively acquired antibodies." J Virol 74(9)：4236－43.
Sutter,G.and B.Moss(1992)."Nonreplicating vaccinia vector efficiently expresses recombinant genes." Proc Natl Acad Sci U S A 89(22)：10847－51.
Sutter,G.,L.S.Wyatt等人(1994)."A recombinant vector derived from the host range－restricted and highly attenuated MVA strain of vaccinia virus stimulates protective immunity in mice to influenza virus." Vaccine 12(11)：1032－40.
Tang,D.C.,M.DeVit等人(1992)."Genetic immunization is a simple method for eliciting an immune response." Nature 356(6365)：152－4.
Taylor,J.,R.Weinberg等人(1988)."Protective immunity against avian influenza induced by a fowlpox virus recombinant." Vaccine 6(6)：504－8.
Thompson,J.D.,D.G.Higgins等人(1994)."CLUSTAL W：improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting,position－specific gap penalties and weight matrix choice." Nucleic Acids Res 22(22)：4673－80.
Ulmer,J.B.,J.J.Donnelly等人(1993)."Heterologous protection against influenza by injection of DNA encoding a viral protein." Science 259(5102)：1745－9.
Van der Zee,R.,W.Van Eden等人(1989)."Efficient mapping and characterization of a T cell epitope by the simultaneous synthesis of multiple peptides." Eur J Immunol 19(1)：43－7.
van Ooyen,A.,J.van den Berg等人(1979)."Comparison of total sequence of a cloned rabbit beta－globin gene and its flanking regions with a homologous mouse sequence." Science 206(4416)：337－44.
VerWO erd,D.W.,H.J.Els等人(1972)."Structure of the bluetongue virus capsid." J Virol 10(4)：783－94.
Vialard,J.,M.Lalumiere等人(1990)."Synthesis of the membrane fusion and hemagglutinin proteins of measles virus,using a novel baculovirus vector containing the beta－galactosidase gene." J Virol 64(1)：37－50.
Wang,L.F.,D.H.Du Plessis等人(1995)."Use of a gene－targeted phage display random epitope library to map an antigenic determinant on the bluetongue virus outer capsid protein VP5." J Immunol Methods 178(1)：1－12.
White,D.M.,W.C.Wilson等人(2005)."Studies on overwintering of bluetongue viruses in insects." J Gen Virol 86(Pt 2)：453－62.
Wilson,W.C.and J.O.Mecham(2000)."Molecular Evolution of Orbiviruses." Proc USAHA 104：169－180.
Xin,K.Q.,K.Hamajima等人(1999)."IL－15 expression plasmid enhances cell－mediated immunity induced by an HIV－1 DNA vaccine." Vaccine 17(7－8)：858－66.
上文已具體闡述了本發明之較佳實施例，應瞭解，本發明係由隨附申請專利範圍所界定，而非僅限於上文說明中所述特定細節，乃因可對其作出許多明顯的修改，此並不脫離本發明之精神或範疇。
作為實例給出之上述實施方式並非欲將本發明完全侷限於所述具體實施例，結合附圖可最佳地理解上述實施方式。
圖1繪示天然BTV－17 VP2之核酸序列(SEQ ID NO：3)與密碼子優化之合成BTV17 VP2之核酸序列(SEQ ID NO：1)的對比圖。
圖2繪示天然BTV－17 VP5之核酸序列(SEQ ID NO：4)與密碼子優化之合成BTV17 VP5之核酸序列(SEQ ID NO：2)的對比圖。
圖3係一展示編碼經優化合成BTV VP2蛋白之質粒043004pPCR－Script之構建的示意圖。
圖4係一展示pNVH6C5LSP－18供體質粒之限制性內切酶圖譜的示意圖。
圖5係一展示pCXL148.2(一種ALVAC供體質粒)之構建的示意圖。
圖6提供pCXL148.2供體質粒之核酸序列(SEQ ID NO：13)。
圖7係一展示pALVACC5H6p－合成BTV VP2(pLH2030.2)供體質粒之構建的示意圖。
圖8係一示意圖，其展示編碼經優化合成BTV VP5蛋白之質粒043005pPCR－Script之構建以將桑緣燈蛾昆蟲痘病毒之42Kp合成啟動子序列添加至BTV－VP5片段。
圖9係一示意圖，其展示42Kp啟動子驅動之優化合成BTV VP5於pCR2.1 TOPO選殖/往復載體中之選殖方案(形成pCR2－42KpVP5)，以供用於42KpVP5彈夾擴增。
圖10係一展示最終供體同源載體pC5H6pVP2 42KpVP5(pLH2078.15)之構建的示意圖，該最終供體同源載體含有受H6啟動子驅動之經優化VP2及受42K啟動子驅動之經優化BTV VP5以及與ALVAC之C5R區同源之載體。
圖11提供pLH2078.15(pC5 H6p合成BTV－VP2 42Kp合成BTV－VP5)之核酸及蛋白序列數據，該最終同源載體用於形成重組ALVAC＋BTV。A以出現順序分別揭示SEQ ID NOS：20－21。B揭示編碼SEQ ID NOS：20－21之SEQ ID NO：19。C揭示編碼SEQ ID NOS：20－21之SEQ ID NO：19的核苷酸1800－6293。D揭示SEQ ID NO：22。
圖12繪示闡明編碼經優化合成BTV VP2及VP5之重組ALVAC病毒載體(vCP2289)之構建的流程圖。
圖13係自Vector NTI(Invitrogen,Carlsbad,CA)製得的ALVAC核酸序列及質粒產生的重組ALVAC－BTV vCP2289之理論RE消化圖譜。
圖14係展示自ALVAC＋BTV重組病毒vCP2289製備之基因組DNA之限制內切酶消化的染色瓊脂糖凝膠(與以上圖13中所示理論期望帶型對比)。
圖15展示使用BTV－特異性DNA探針探測得經限制內切酶消化之vCP2289基因組DNA的南方點漬分析。
圖16展現在使用兩種可探測VP5自ALVAC重組病毒表現之不同vCP2289分離物感染後製備得CEF裂解物及上清液部分之西方點漬。一級抗體探針係以1：2000稀釋率使用的兔子抗－BTV－17 VP5特異性多株血清(polyclonal sera)。
圖17係經vCP2289免疫之綿羊與經WNV－CP對照疫苗免疫之綿羊在使用有毒野生型BTV－17攻擊後之平均體溫的對比圖表。
圖18係展示經vCP2289免疫之綿羊與經WNV－CP對照疫苗免疫之綿羊在使用有毒野生型BTV－17攻擊後之平均白細胞計數(WBC)的對比圖表。
圖19係展示經vCP2289免疫之綿羊與經WNV－CP對照疫苗免疫之綿羊在使用有毒野生型BTV－17攻擊後之平均淋巴細胞計數的對比圖表。
圖20係展示經vCP2289免疫之綿羊與經WNV－CP對照疫苗免疫之綿羊在使用有毒野生型BTV－17攻擊後之平均血小板計數的對比圖表。
圖21繪示在擴增包含側接Xho I位點之42Kp－VP5表現彈夾之DNA片段的PCR反應中所用引物配對13247.JY/13248.JY。
<110> 美商龍馬躍公司美國加利福尼亞大學董事會<120> 抗藍舌病病毒之重組疫苗<130> MER－06－064.TW <140> TW096119784 <141> 2007－06－01 <150> PCT/US07/12709 <151> 2007－05－30 <150> US11/444,698 <151> 2006－06－01 <160> 26 <170> PatentIn Ver.3.3 <210> 1 <211> 2868 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 人工序列之說明：合成BTV17密碼子最佳化之VP2 <400> 1 <210> 2 <211> 1581 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 人工序列之說明：合成BTV17密碼子最佳化之VP5 <400> 2<210> 3 <211> 2868 <212> DNA <213> 藍舌病病毒17 <400> 3<210> 4 <211> 1581 <212> DNA <213> 藍舌病病毒17 <400> 4 <210> 5 <211> 32 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 人工序列之說明：合成引子<400> 5<210> 6 <211> 66 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 人工序列之說明：合成引子<400> 6<210> 7 <211> 66 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 人工序列之說明：合成引子<400> 7 <210> 8 <211> 30 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 人工序列之說明：合成引子<400> 8<210> 9 <211> 41 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 人工序列之說明：合成引子<400> 9<210> 10 <211> 56 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 人工序列之說明：合成引子<400> 10<210> 11 <211> 25 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 人工序列之說明：合成引子<400> 11<210> 12 <211> 25 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 人工序列之說明：合成引子<400> 12<210> 13 <211> 4879 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 人工序列之說明：合成PCXL148.2供體質體序列<400> 13 <210> 14 <211> 72 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 人工序列之說明：合成引子<400> 14<210> 15 <211> 48 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 人工序列之說明：合成引子<400> 15<210> 16 <211> 25 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 人工序列之說明：合成引子<400> 16<210> 17 <211> 25 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 人工序列之說明：合成引子<400> 17<210> 18 <211> 12 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 人工序列之說明：合成寡核苷酸<400> 18<210> 19 <211> 6795 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 人工序列之說明：合成核苷酸序列<220> <221> CDS <222> (1800)..(4664) <220> <221> CDS <222> (4716)..(6293) <400> 19 <210> 20 <211> 955 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 人工序列之說明：合成蛋白質序列<400> 20 <210> 21 <211> 526 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 人工序列之說明：合成蛋白質序列<400> 21 <210> 22 <211> 9380 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 人工序列之說明：合成核苷酸序列<400> 22 <210> 23 <211> 72 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 人工序列之說明：合成核苷酸序列<220> <221> CDS <222> (49)..(72) <400> 23<210> 24 <211> 8 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 人工序列之說明：合成胜肽<400> 24<210> 25 <211> 48 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 人工序列之說明：合成核苷酸序列<400> 25<210> 26 <211> 9 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 人工序列之說明：合成胜肽<400> 26
(無元件符號說明)

Claims (22)

  1. 一種在動物中引發免疫反應的免疫原組合物，其包含重組痘病毒，其中該重組痘病毒包含編碼具有SEQ ID NO：20所載序列之藍舌病病毒(BTV)VP2的核酸分子及編碼具有SEQ ID NO：21所載序列之BTV VP5的核酸分子。
  2. 一種在動物中引發免疫反應的免疫原組合物，其包含重組痘病毒，該重組痘病毒包含一或多個核酸分子，其中該一或多個核酸分子包含SEQ ID NO：1所載序列、SEQ ID NO：2所載序列或其組合。
  3. 如請求項1或2之免疫原組合物，其中該重組痘病毒係重組禽痘病毒。
  4. 如請求項3之免疫原組合物，其中該重組禽痘病毒係金絲雀痘病毒。
  5. 如請求項4之免疫原組合物，其中該金絲雀痘病毒係ALVAC。
  6. 如請求項1或2之免疫原組合物，其進一步包括佐劑。
  7. 如請求項6之免疫原組合物，其中該佐劑係卡波姆(carbomer)。
  8. 如請求項1或2之免疫原組合物，其進一步包括該動物之非BTV病原體之抗原或免疫原或其抗原決定部位，或含有及於該動物活體內表現編碼該抗原、免疫原或其抗原決定部位之核酸分子的載體，或該動物之非BTV之滅活或減毒病原體。
  9. 如請求項1或2之免疫原組合物，其中該動物係羊、牛、 貓或馬。
  10. 如請求項1或2之免疫原組合物，其中該核酸分子係以可操作方式連接至一或多個啟動子。
  11. 如請求項10之免疫原組合物，其中該核酸分子具有可操作方式連接至H6啟動子之SEQ ID NO：1所載序列及/或其中該核酸分子具有可操作方式連接至42K啟動子之SEQ ID NO：2所載序列。
  12. 一種套組，其係用於實施投與：(a)如請求項1或2之免疫原組合物及(b)BTV抗原、免疫原或抗原決定部位，及測試動物中存在或不存在該BTV蛋白或其抗體之方法，其中該套組包含位於不同容器中之(a)及(b)，視情況包括用於混合及/或投藥之說明書。
  13. 如請求項12之套組，其中該動物係羊、牛、貓或馬。
  14. 一種套組，其包含：(a)如請求項1或2之免疫原組合物，及(b)該動物之非BTV病原體之抗原或免疫原或其抗原決定部位，或含有及於該動物活體內表現編碼該抗原、免疫原或其抗原決定部位之核酸分子的載體，或該動物之非BTV之滅活或減毒病原體，該套組包含位於不同容器中之(a)及(b)，且該套組視情況包含用於混合及/或投與(a)及(b)之說明書。
  15. 如請求項14之套組，其中該動物係羊、牛、貓或馬。
  16. 一種如請求項1或2之免疫原組合物的用途，其用於製備在動物中引發抵抗BTV之免疫反應或保護性反應的藥物。
  17. 一種如請求項1或2之免疫原組合物的用途，其用於製備在動物中引發抵抗BTV之免疫反應的藥物。
  18. 如請求項17之用途，其中該藥物進一步包括卡波姆佐劑。
  19. 一種(a)如請求項1或2之免疫原組合物及(b)BTV分離抗原、免疫原或其抗原決定部位的用途，其用於製備在動物中引發抵抗BTV之免疫反應的藥物，其中(a)係用於在初免(prime)-加強方案中於(b)之前投藥，或(a)與(b)一起相繼投藥或混合投藥。
  20. 如請求項16至19中任一項之用途，其中該動物係羊、牛、貓或馬。
  21. 一種體外鑑別(differential)診斷方法，其包括測試自投與如請求項1或2之免疫原組合物之動物獲得的樣品中，存在或不存在一種非由該投與的痘病毒表現之BTV蛋白或其抗體。
  22. 如請求項21之方法，其中該動物係羊、牛、貓或馬。
TW096119784A 2006-06-01 2007-06-01 抗藍舌病病毒之重組疫苗 TWI399213B (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US11/444,698 US7862821B2 (en) 2006-06-01 2006-06-01 Recombinant vaccine against bluetongue virus
PCT/US2007/012709 WO2008030282A2 (en) 2006-06-01 2007-05-30 Recombinant vaccine against bluetongue virus

Publications (2)

Publication Number Publication Date
TW200810779A TW200810779A (en) 2008-03-01
TWI399213B true TWI399213B (zh) 2013-06-21

Family

ID=38790493

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW096119784A TWI399213B (zh) 2006-06-01 2007-06-01 抗藍舌病病毒之重組疫苗

Country Status (17)

Country Link
US (1) US7862821B2 (zh)
EP (2) EP2029622A2 (zh)
CN (2) CN101754975B (zh)
AR (1) AR061152A1 (zh)
AU (1) AU2007293474C9 (zh)
BR (1) BRPI0712191A2 (zh)
CA (1) CA2653696C (zh)
ES (1) ES2623138T3 (zh)
HK (1) HK1200180A1 (zh)
IL (1) IL195641A (zh)
MA (1) MA30569B1 (zh)
NZ (1) NZ573435A (zh)
RU (1) RU2446823C2 (zh)
TW (1) TWI399213B (zh)
UY (1) UY30385A1 (zh)
WO (1) WO2008030282A2 (zh)
ZA (1) ZA200810826B (zh)

Families Citing this family (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20070280690A1 (en) * 2006-06-02 2007-12-06 Fujitsu Limited System and Method for Managing Power in an Optical Network
CL2008001806A1 (es) 2007-06-20 2008-09-05 Wyeth Corp Composicion de vacuna en emulsion agua en aceite que comprende un antigeno y un adyuvante en la fase acuosa; y metodo de elaboracion.
GB0805356D0 (en) * 2008-03-25 2008-04-30 Isis Innovation Vaccine adjuvant composition
BRPI0920622B1 (pt) * 2008-10-24 2019-11-12 Merial, Inc. vacina contra o vírus da doença equina africana
US20110110980A1 (en) * 2009-09-02 2011-05-12 Wyeth Llc Heterlogous prime-boost immunization regimen
US20110236416A1 (en) * 2010-03-12 2011-09-29 Jean-Christophe Audonnet Foot and mouth disease virus recombinant vaccines and uses thereof
WO2011131208A1 (fr) * 2010-04-22 2011-10-27 Institut Pasteur D'algerie Vaccin bivalent a usage vétérinaire anti-entérotoxémie
CA2851658C (en) * 2011-10-21 2022-03-15 Intervet International B.V. Recombinant non-pathogenic marek's disease virus constructs encoding infectious laryngotracheitis virus and newcastle disease virus antigens
CN104203271B (zh) 2012-02-14 2017-08-25 梅里亚股份有限公司 表达狂犬病病毒和ox40蛋白的重组痘病毒载体及从其制造的疫苗
RU2656187C2 (ru) 2012-06-13 2018-05-31 Мериал, Инк. Реассортантные btv и ahsv вакцины
MX2015002688A (es) * 2012-08-29 2015-05-12 Intervet Int Bv Vacuna indicadora.
CN103305472A (zh) * 2013-06-18 2013-09-18 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 抗蓝舌病病毒血清1型vp2蛋白的单克隆抗体btv1-3e8及其识别的b细胞表位多肽与应用
CN103305473B (zh) * 2013-06-18 2015-01-07 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 抗蓝舌病病毒血清1型vp2蛋白的单克隆抗体btv1-4b6及其识别的b细胞表位多肽与应用
CN104258138A (zh) * 2014-09-28 2015-01-07 山东新希望六和集团有限公司 一种用于治疗牛蓝舌病的药物组合物及其制备方法
EA202092165A1 (ru) 2018-03-19 2021-02-25 Бёрингер Ингельхайм Ветмедика Гмбх Новый ehv сайт инсерции ul43
CN110551634A (zh) * 2019-09-04 2019-12-10 中国农业科学院兰州兽医研究所 一种山羊支原体山羊肺炎亚种分离培养方法
CN110551653A (zh) * 2019-09-04 2019-12-10 中国农业科学院兰州兽医研究所 一种无血清制备牛支原体抗原的方法
CN113308441B (zh) * 2021-06-02 2022-05-10 华中农业大学 一株猫疱疹病毒i型病毒株及其应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050255127A1 (en) * 2001-04-06 2005-11-17 Loosmore Sheena M Recombinant vaccine against West Nile Virus

Family Cites Families (88)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2909462A (en) 1955-12-08 1959-10-20 Bristol Myers Co Acrylic acid polymer laxative compositions
US4394448A (en) 1978-02-24 1983-07-19 Szoka Jr Francis C Method of inserting DNA into living cells
US4769331A (en) 1981-09-16 1988-09-06 University Patents, Inc. Recombinant methods and materials
US4722848A (en) 1982-12-08 1988-02-02 Health Research, Incorporated Method for immunizing animals with synthetically modified vaccinia virus
US5833975A (en) 1989-03-08 1998-11-10 Virogenetics Corporation Canarypox virus expressing cytokine and/or tumor-associated antigen DNA sequence
US5174993A (en) 1981-12-24 1992-12-29 Health Research Inc. Recombinant avipox virus and immunological use thereof
US5505941A (en) 1981-12-24 1996-04-09 Health Research, Inc. Recombinant avipox virus and method to induce an immune response
US4769330A (en) 1981-12-24 1988-09-06 Health Research, Incorporated Modified vaccinia virus and methods for making and using the same
US5110587A (en) 1981-12-24 1992-05-05 Health Research, Incorporated Immunogenic composition comprising synthetically modified vaccinia virus
US4603112A (en) 1981-12-24 1986-07-29 Health Research, Incorporated Modified vaccinia virus
US5338683A (en) 1981-12-24 1994-08-16 Health Research Incorporated Vaccinia virus containing DNA sequences encoding herpesvirus glycoproteins
US4745051A (en) 1983-05-27 1988-05-17 The Texas A&M University System Method for producing a recombinant baculovirus expression vector
EP0173552B1 (en) 1984-08-24 1991-10-09 The Upjohn Company Recombinant dna compounds and the expression of polypeptides such as tpa
US4945050A (en) 1984-11-13 1990-07-31 Cornell Research Foundation, Inc. Method for transporting substances into living cells and tissues and apparatus therefor
US5168062A (en) 1985-01-30 1992-12-01 University Of Iowa Research Foundation Transfer vectors and microorganisms containing human cytomegalovirus immediate-early promoter-regulatory DNA sequence
US4963481A (en) 1985-12-18 1990-10-16 Genetics Institute Inc Promoter system
US4968615A (en) 1985-12-18 1990-11-06 Ciba-Geigy Corporation Deoxyribonucleic acid segment from a virus
DK175363B1 (da) 1986-09-12 2004-09-13 Genentech Inc Fremgangsmåde til kontinuert produktion af et önsket heterologt protein i en eukaryotisk værtcelle, vektor, som tilförer denne evne, og celler transformeret med vektoren
IE872748L (en) 1986-10-16 1988-04-16 Arjomari Europ Polypeptides derived from the evvelope gene of human¹immunodeficiency virus in recombinant baculovirus infected¹insect cells
GB8717430D0 (en) 1987-07-23 1987-08-26 Celltech Ltd Recombinant dna product
DE3743138A1 (de) 1987-12-18 1989-09-14 Mayr Christian Gmbh & Co Kg Schleifringlose, elektromagnetische ueberlastkupplung
EP0386185A1 (fr) 1988-07-29 1990-09-12 IntraCel Corporation Procede d'expression genetique de proteines heterologues par des cellules transfectees in vivo
CA2003300A1 (en) 1988-11-21 1990-05-21 Franklin Volvovitz Skin test and test kit for aids
US5703055A (en) 1989-03-21 1997-12-30 Wisconsin Alumni Research Foundation Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery
US5552143A (en) 1989-03-24 1996-09-03 The Wistar Institute Of Anatomy & Biology Recombinant cytomegalovirus vaccine
US5591439A (en) 1989-03-24 1997-01-07 The Wistar Institute Of Anatomy And Biology Recombinant cytomegalovirus vaccine
GB9001766D0 (en) 1990-01-25 1990-03-28 Univ Court Of The University O Vaccines
US5514375A (en) 1990-08-15 1996-05-07 Virogenetics Corporation Flavivirus recombinant poxvirus vaccine
MY109299A (en) 1990-08-15 1996-12-31 Virogenetics Corp Recombinant pox virus encoding flaviviral structural proteins
US6309647B1 (en) 1999-07-15 2001-10-30 Aventis Pasteur Poxvirus—canine dispemper virus (CDV) or measles virus recombinants and compositions and methods employing the recombinants
US5756102A (en) 1990-11-20 1998-05-26 Virogenetics Corporation Poxvirus-canine distemper virus (CDV) recombinants and compositions and methods employing the recombinants
JP3602530B2 (ja) 1991-03-07 2004-12-15 ヴァイロジェネティクス コーポレイション 遺伝子操作したワクチン菌株
US5843456A (en) 1991-03-07 1998-12-01 Virogenetics Corporation Alvac poxvirus-rabies compositions and combination compositions and uses
US5997878A (en) 1991-03-07 1999-12-07 Connaught Laboratories Recombinant poxvirus-cytomegalovirus, compositions and uses
US5382425A (en) 1992-01-13 1995-01-17 Syntro Corporation Recombinant swinepox virus
US5846945A (en) 1993-02-16 1998-12-08 Onyx Pharmaceuticals, Inc. Cytopathic viruses for therapy and prophylaxis of neoplasia
FR2702373B1 (fr) 1993-03-08 1996-06-07 Rhone Merieux Emulsions vaccinales fluides eau-dans-l'huile contenant une huile métabolisable.
US5830463A (en) * 1993-07-07 1998-11-03 University Technology Corporation Yeast-based delivery vehicles
US6485729B1 (en) 1993-09-13 2002-11-26 Protein Sciences Corporation Neuraminidase-supplemented compositions
EP0668355B1 (en) 1993-12-20 1999-04-07 Akzo Nobel N.V. Vaccine for the protection of horses against equine herpesvirus infection
US5529780A (en) 1994-03-30 1996-06-25 Virogenetics Corporation Nucleotide and amino acid sequences of canine herpesvirus gB and gC
FR2728794B1 (fr) 1994-12-30 1997-03-21 Rhone Merieux Vaccin recombinant aviaire a base de virus herpes aviaire, notamment contre la maladie de gumboro
FR2728795B1 (fr) 1994-12-30 1997-03-21 Rhone Merieux Vaccin vivant recombinant aviaire, utilisant comme vecteur un virus herpes aviaire
CA2214029A1 (en) 1995-04-25 1996-10-31 Magda Marquet Single-vial formulations of dna/lipid complexes
FR2741806B1 (fr) 1995-11-30 1998-02-20 Rhone Merieux Vaccin vivant recombinant a base d'herpesvirus felin de type 1, notamment contre la peritonite infectieuse feline
US5858373A (en) 1995-12-01 1999-01-12 Virogenetics Corporation Recombinant poxvirus-feline infectious peritionitis virus, compositions thereof and methods for making and using them
FR2750866B1 (fr) 1996-06-27 1998-11-27 Rhone Merieux Vaccin vivant recombinant aviaire, utilisant comme vecteur le virus de la laryngotracheite infectieuse aviaire
FR2750865B1 (fr) 1996-06-27 1998-12-04 Rhone Merieux Vaccin vivant recombinant a base d'herpesvirus canin, notamment contre la maladie de carre, la rage ou le virus parainfluenza de type 2
JP2002512501A (ja) 1996-07-03 2002-04-23 メリアル インコーポレイテッド 外来性ｄｎａを含む組換えイヌアデノウィルス（ｃａｖ）
US6090393A (en) 1996-07-03 2000-07-18 Merial Recombinant canine adenoviruses, method for making and uses thereof
US6156567A (en) 1996-07-03 2000-12-05 Merial Truncated transcriptionally active cytomegalovirus promoters
FR2751226B1 (fr) 1996-07-19 1998-11-27 Rhone Merieux Formule de vaccin polynucleotidique contre les pathologies du cheval
FR2751227B1 (fr) 1996-07-19 1998-11-27 Rhone Merieux Formule de vaccin polynucleotidique contre les pathologies canines, notamment les pathologies respiratoires et digestives
FR2751225B1 (fr) 1996-07-19 1998-11-27 Rhone Merieux Formule de vaccin polynucleotidique aviaire
FR2751223B1 (fr) 1996-07-19 1998-12-04 Rhone Merieux Formule de vaccin polynucleotidique felin
FR2751228B1 (fr) 1996-07-19 1998-11-20 Rhone Merieux Vaccin polynucleotidique bovin pour voie intradermique
FR2751224B1 (fr) 1996-07-19 1998-11-20 Rhone Merieux Formule de vaccin polynucleotidique contre les pathologies respiratoires et de reproduction des porcs
FR2751229B1 (fr) 1996-07-19 1998-11-27 Rhone Merieux Formule de vaccin polynucleotidique notamment contre la pathologie respiratoire des bovins
ATE292980T1 (de) 1996-10-11 2005-04-15 Univ California Immunostimulierende oligonucleotidekonjugate
DE69703974T2 (de) 1996-10-17 2001-07-19 Oxford Biomedica Ltd Retrovirale vektoren
FR2757061B1 (fr) 1996-12-16 1999-03-26 Rhone Merieux Vaccin vivant recombinant aviaire, utilisant comme vecteur le virus de la laryngotracheite infectieuse aviaire
FR2758986B1 (fr) 1997-01-31 1999-04-30 Rhone Merieux Vaccin vivant recombinant aviaire, utilisant comme vecteur le virus de la laryngotracheite infectieuse aviaire
US6183752B1 (en) 1997-02-05 2001-02-06 Pasteur Merieux Serums Et Vaccins Restenosis/atherosclerosis diagnosis, prophylaxis and therapy
US6368603B1 (en) 1997-03-05 2002-04-09 Merial Limited Lyme combination compositions and uses
US6004777A (en) 1997-03-12 1999-12-21 Virogenetics Corporation Vectors having enhanced expression, and methods of making and uses thereof
US5990091A (en) * 1997-03-12 1999-11-23 Virogenetics Corporation Vectors having enhanced expression, and methods of making and uses thereof
WO1998042743A1 (en) 1997-03-24 1998-10-01 Merial Canine ehrlichiosis immunogenic and diagnostic compositions and methods
US6348450B1 (en) 1997-08-13 2002-02-19 The Uab Research Foundation Noninvasive genetic immunization, expression products therefrom and uses thereof
FR2781159B1 (fr) 1998-07-06 2000-10-06 Merial Sas Vaccin circovirus et parvovirus porcin
US6391314B1 (en) 1997-10-03 2002-05-21 Merial Porcine circoviruses vaccines diagnostic reagents
US6517843B1 (en) 1999-08-31 2003-02-11 Merial Reduction of porcine circovirus-2 viral load with inactivated PCV-2
US6224882B1 (en) 1997-11-07 2001-05-01 Protein Science Corp. Insect cells or fractions as adjuvant for antigens
DK1895010T3 (da) 1997-12-22 2011-11-21 Oxford Biomedica Ltd Vektorer baseret på virus for infektiøs hesteanæmi (eiav)
US6294176B1 (en) 1998-07-10 2001-09-25 Schering-Plough Veterinary Corp. Recombinant raccoonpox virus and uses thereof as a vaccine in mammalian and avian species
WO2000020025A2 (en) 1998-10-02 2000-04-13 St. Elizabeth's Medical Center, Inc. Akt compositions for enhancing survival of cells
US6103526A (en) 1998-10-08 2000-08-15 Protein Sciences Corporation Spodoptera frugiperda single cell suspension cell line in serum-free media, methods of producing and using
US6943152B1 (en) 1999-06-10 2005-09-13 Merial DNA vaccine-PCV
US6645740B1 (en) 1999-06-10 2003-11-11 Merial Limited Nucleic acids encodings equine GM-CSF
US6497883B1 (en) 1999-06-10 2002-12-24 Merial Porcine circovirus recombinant poxvirus vaccine
PL210451B1 (pl) 1999-06-10 2012-01-31 Merial Sas Szczepionka DNA przeciwko wirusowi nosówki psów (CDV)
ES2326849T3 (es) 1999-10-08 2009-10-20 Merial sin titulo.
AU784557B2 (en) 1999-12-21 2006-05-04 Merial Compositions and vaccines containing antigen(s) of cryptosporidium parvum and of another pathogen
FR2804028B1 (fr) 2000-01-21 2004-06-04 Merial Sas Vaccins adn ameliores pour animaux de rente
CA2311881C (en) 2000-06-16 2007-08-28 Gary O. Maupin Control of arthropods in rodents
US6455595B1 (en) 2000-07-24 2002-09-24 Chevron U.S.A. Inc. Methods for optimizing fischer-tropsch synthesis
FR2825280B1 (fr) 2001-06-01 2005-04-15 Merial Sas Vaccination contre le virus de l'immunodeficience feline
DE10260805A1 (de) 2002-12-23 2004-07-22 Geneart Gmbh Verfahren und Vorrichtung zum Optimieren einer Nucleotidsequenz zur Expression eines Proteins
JP4902972B2 (ja) * 2005-07-15 2012-03-21 ルネサスエレクトロニクス株式会社 不揮発性記憶素子の制御方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050255127A1 (en) * 2001-04-06 2005-11-17 Loosmore Sheena M Recombinant vaccine against West Nile Virus

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Lobato et al., "Antibody responses and protective immunity to recombinant vaccinia virus-expressed bluetongue virus antigens." Veterinary Immunology and Immunopathology, 59 (1997) 293-309. NCBI,GenBank:AF017279, 1997/9/18 NCBI, GenBank:X55359, 2005/4/1 *

Also Published As

Publication number Publication date
WO2008030282A3 (en) 2009-12-17
US20070280960A1 (en) 2007-12-06
CN103143034A (zh) 2013-06-12
AR061152A1 (es) 2008-08-06
RU2008152064A (ru) 2010-07-20
US7862821B2 (en) 2011-01-04
AU2007293474C9 (en) 2014-09-18
TW200810779A (en) 2008-03-01
ZA200810826B (en) 2009-11-25
AU2007293474B2 (en) 2012-07-19
CN101754975B (zh) 2013-01-02
AU2007293474C1 (en) 2014-06-05
BRPI0712191A2 (pt) 2012-03-06
NZ573435A (en) 2011-09-30
IL195641A (en) 2013-12-31
CA2653696A1 (en) 2008-03-13
HK1200180A1 (zh) 2015-07-31
IL195641A0 (en) 2011-08-01
RU2446823C2 (ru) 2012-04-10
CN101754975A (zh) 2010-06-23
ES2623138T3 (es) 2017-07-10
EP2816057B1 (en) 2017-02-01
CA2653696C (en) 2017-10-24
EP2816057A1 (en) 2014-12-24
UY30385A1 (es) 2008-01-02
WO2008030282A2 (en) 2008-03-13
EP2029622A2 (en) 2009-03-04
AU2007293474A1 (en) 2008-03-13
MA30569B1 (fr) 2009-07-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
TWI399213B (zh) 抗藍舌病病毒之重組疫苗
US8535682B2 (en) Recombinant vaccine against West Nile Virus
EP2861248B1 (en) Reassortant btv and ahsv vaccines
US20030104008A1 (en) Recombinant vaccine against west nile virus
US20140120133A1 (en) Vaccine Against African Horse Sickness Virus
RU2283138C2 (ru) Вакцина против вируса западно-нильской лихорадки
US20040037848A1 (en) Recombinant vaccine against West Nile Virus
US20050031641A1 (en) Recombinant vaccine against West Nile Virus