RU2283138C2 - Вакцина против вируса западно-нильской лихорадки - Google Patents
Вакцина против вируса западно-нильской лихорадки Download PDFInfo
- Publication number
- RU2283138C2 RU2283138C2 RU2003132455/13A RU2003132455A RU2283138C2 RU 2283138 C2 RU2283138 C2 RU 2283138C2 RU 2003132455/13 A RU2003132455/13 A RU 2003132455/13A RU 2003132455 A RU2003132455 A RU 2003132455A RU 2283138 C2 RU2283138 C2 RU 2283138C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- virus
- vaccine according
- vaccine
- west nile
- plasmid
- Prior art date
Links
- 241000700605 Viruses Species 0.000 title claims abstract description 106
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims abstract description 80
- 201000006449 West Nile encephalitis Diseases 0.000 title claims abstract description 57
- 241000700647 Variola virus Species 0.000 claims abstract description 28
- 241000283086 Equidae Species 0.000 claims abstract description 17
- 101000611764 Gordonia sp. (strain TY-5) Propane 2-monooxygenase, effector component Proteins 0.000 claims abstract description 14
- 101001090095 Gordonia sp. (strain TY-5) Propane 2-monooxygenase, hydroxylase component large subunit Proteins 0.000 claims abstract description 14
- 101001090278 Gordonia sp. (strain TY-5) Propane 2-monooxygenase, hydroxylase component small subunit Proteins 0.000 claims abstract description 14
- 101000701089 Gordonia sp. (strain TY-5) Propane 2-monooxygenase, reductase component Proteins 0.000 claims abstract description 14
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims abstract description 13
- 101710204837 Envelope small membrane protein Proteins 0.000 claims abstract description 8
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 claims abstract description 6
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 claims abstract description 5
- 101710085938 Matrix protein Proteins 0.000 claims abstract description 4
- 101710127721 Membrane protein Proteins 0.000 claims abstract description 4
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 claims abstract description 3
- 101710145006 Lysis protein Proteins 0.000 claims abstract 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 78
- 206010057293 West Nile viral infection Diseases 0.000 claims description 53
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 53
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 53
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 53
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 53
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 39
- 241000710886 West Nile virus Species 0.000 claims description 35
- 241000271566 Aves Species 0.000 claims description 27
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 claims description 24
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 claims description 21
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 claims description 20
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 claims description 20
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 claims description 19
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 claims description 19
- 241000287231 Serinus Species 0.000 claims description 19
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims description 19
- 244000052769 pathogen Species 0.000 claims description 18
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 claims description 17
- 229920002125 Sokalan® Polymers 0.000 claims description 12
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 11
- 102000004457 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 claims description 10
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 claims description 10
- 206010014599 encephalitis Diseases 0.000 claims description 10
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims description 10
- 229940031348 multivalent vaccine Drugs 0.000 claims description 8
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 claims description 6
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 claims description 6
- SMZOUWXMTYCWNB-UHFFFAOYSA-N 2-(2-methoxy-5-methylphenyl)ethanamine Chemical compound COC1=CC=C(C)C=C1CCN SMZOUWXMTYCWNB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- CERQOIWHTDAKMF-UHFFFAOYSA-N Methacrylic acid Chemical compound CC(=C)C(O)=O CERQOIWHTDAKMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- FPYJFEHAWHCUMM-UHFFFAOYSA-N maleic anhydride Chemical compound O=C1OC(=O)C=C1 FPYJFEHAWHCUMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 241000132980 Turkey adenovirus 3 Species 0.000 claims description 4
- 239000012190 activator Substances 0.000 claims description 4
- 125000002947 alkylene group Chemical group 0.000 claims description 4
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 claims description 4
- 150000003242 quaternary ammonium salts Chemical class 0.000 claims description 4
- 102000000013 Chemokine CCL3 Human genes 0.000 claims description 3
- 241000193449 Clostridium tetani Species 0.000 claims description 3
- 241000701063 Gallid alphaherpesvirus 1 Species 0.000 claims description 3
- 241000701047 Gallid alphaherpesvirus 2 Species 0.000 claims description 3
- 241000711450 Infectious bronchitis virus Species 0.000 claims description 3
- 102000013462 Interleukin-12 Human genes 0.000 claims description 3
- 108010065805 Interleukin-12 Proteins 0.000 claims description 3
- 102000003812 Interleukin-15 Human genes 0.000 claims description 3
- 108090000172 Interleukin-15 Proteins 0.000 claims description 3
- 102000003810 Interleukin-18 Human genes 0.000 claims description 3
- 108090000171 Interleukin-18 Proteins 0.000 claims description 3
- 206010035148 Plague Diseases 0.000 claims description 3
- 241000282887 Suidae Species 0.000 claims description 3
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 claims description 3
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 3
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 3
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 3
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 claims description 3
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims description 3
- 229940117681 interleukin-12 Drugs 0.000 claims description 3
- NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N Acrylic acid Chemical group OC(=O)C=C NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 241000606560 Avibacterium avium Species 0.000 claims description 2
- 241000606591 Avibacterium gallinarum Species 0.000 claims description 2
- 101000605403 Homo sapiens Plasminogen Proteins 0.000 claims description 2
- 208000007502 anemia Diseases 0.000 claims description 2
- 229960001631 carbomer Drugs 0.000 claims description 2
- 201000002491 encephalomyelitis Diseases 0.000 claims description 2
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 claims description 2
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 claims description 2
- 241001516406 Avian orthoreovirus Species 0.000 claims 1
- 108700012434 CCL3 Proteins 0.000 claims 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims 1
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 claims 1
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 claims 1
- 241001148547 Mycoplasma gallinarum Species 0.000 claims 1
- 241000204022 Mycoplasma gallisepticum Species 0.000 claims 1
- 208000010359 Newcastle Disease Diseases 0.000 claims 1
- 229940047122 interleukins Drugs 0.000 claims 1
- 229940124856 vaccine component Drugs 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 112
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 104
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 48
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 40
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 39
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 36
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 31
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 30
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 29
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 29
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 29
- 238000000034 method Methods 0.000 description 26
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 25
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 25
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 22
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 21
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 20
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 20
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 19
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 19
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 18
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 18
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 17
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 17
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 17
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 17
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 17
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 17
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 16
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 16
- 229940023860 canarypox virus HIV vaccine Drugs 0.000 description 15
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 15
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 15
- 241000701024 Human betaherpesvirus 5 Species 0.000 description 14
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 14
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 14
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 14
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 13
- 241000178270 Canarypox virus Species 0.000 description 12
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 12
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 11
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 11
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 10
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 10
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 10
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 10
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 9
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 9
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 8
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 8
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 8
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 8
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 8
- 238000009004 PCR Kit Methods 0.000 description 7
- 102000003978 Tissue Plasminogen Activator Human genes 0.000 description 7
- 108090000373 Tissue Plasminogen Activator Proteins 0.000 description 7
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 7
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 7
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 7
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 7
- 108010076039 Polyproteins Proteins 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 6
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 6
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 6
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 6
- 244000144977 poultry Species 0.000 description 6
- 235000013594 poultry meat Nutrition 0.000 description 6
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 6
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 5
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 5
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 5
- 101800001030 Non-structural protein 2A Proteins 0.000 description 5
- 101710088839 Replication initiation protein Proteins 0.000 description 5
- 108010008038 Synthetic Vaccines Proteins 0.000 description 5
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 5
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 5
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 5
- 229940124551 recombinant vaccine Drugs 0.000 description 5
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 5
- 241000272517 Anseriformes Species 0.000 description 4
- 241000218236 Cannabis Species 0.000 description 4
- 241001183012 Modified Vaccinia Ankara virus Species 0.000 description 4
- -1 NS2B Proteins 0.000 description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 4
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 4
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 4
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 4
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 229940031626 subunit vaccine Drugs 0.000 description 4
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 4
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 4
- WALUVDCNGPQPOD-UHFFFAOYSA-M 2,3-di(tetradecoxy)propyl-(2-hydroxyethyl)-dimethylazanium;bromide Chemical compound [Br-].CCCCCCCCCCCCCCOCC(C[N+](C)(C)CCO)OCCCCCCCCCCCCCC WALUVDCNGPQPOD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 3
- 241000701081 Equid alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 3
- 241000701089 Equid alphaherpesvirus 4 Species 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 3
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 3
- 241000286209 Phasianidae Species 0.000 description 3
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 3
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 3
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 3
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 3
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 3
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 239000007764 o/w emulsion Substances 0.000 description 3
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 3
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 3
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- PRAKJMSDJKAYCZ-UHFFFAOYSA-N squalane Chemical compound CC(C)CCCC(C)CCCC(C)CCCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C PRAKJMSDJKAYCZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 229960000187 tissue plasminogen activator Drugs 0.000 description 3
- 210000003501 vero cell Anatomy 0.000 description 3
- 125000003903 2-propenyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])=C([H])[H] 0.000 description 2
- 241000711404 Avian avulavirus 1 Species 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 2
- 108010041986 DNA Vaccines Proteins 0.000 description 2
- 229940021995 DNA vaccine Drugs 0.000 description 2
- 241000701087 Felid alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 2
- 108091005904 Hemoglobin subunit beta Proteins 0.000 description 2
- 241000702626 Infectious bursal disease virus Species 0.000 description 2
- VQTUBCCKSQIDNK-UHFFFAOYSA-N Isobutene Chemical compound CC(C)=C VQTUBCCKSQIDNK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010090054 Membrane Glycoproteins Proteins 0.000 description 2
- 102000012750 Membrane Glycoproteins Human genes 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 2
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 2
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 2
- 241000711955 Turkey rhinotracheitis virus Species 0.000 description 2
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 2
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 2
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 230000034994 death Effects 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 2
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 2
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 2
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 2
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 2
- ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N oleic acid Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N 0.000 description 2
- 229940124276 oligodeoxyribonucleotide Drugs 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 2
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 2
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 2
- JNYAEWCLZODPBN-KVTDHHQDSA-N (2r,3r,4r)-2-[(1r)-1,2-dihydroxyethyl]oxolane-3,4-diol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@H]1OC[C@@H](O)[C@H]1O JNYAEWCLZODPBN-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- JNYAEWCLZODPBN-JGWLITMVSA-N (2r,3r,4s)-2-[(1r)-1,2-dihydroxyethyl]oxolane-3,4-diol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@H]1OC[C@H](O)[C@H]1O JNYAEWCLZODPBN-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- YYGNTYWPHWGJRM-UHFFFAOYSA-N (6E,10E,14E,18E)-2,6,10,15,19,23-hexamethyltetracosa-2,6,10,14,18,22-hexaene Chemical compound CC(C)=CCCC(C)=CCCC(C)=CCCC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)C YYGNTYWPHWGJRM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OVYMWJFNQQOJBU-UHFFFAOYSA-N 1-octanoyloxypropan-2-yl octanoate Chemical compound CCCCCCCC(=O)OCC(C)OC(=O)CCCCCCC OVYMWJFNQQOJBU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XDOFQFKRPWOURC-UHFFFAOYSA-N 16-methylheptadecanoic acid Chemical class CC(C)CCCCCCCCCCCCCCC(O)=O XDOFQFKRPWOURC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UZLHBUQJHDTDRD-UHFFFAOYSA-N 2,3-di(tetradecoxy)propyl-(2-hydroxyethyl)-dimethylazanium Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCOCC(C[N+](C)(C)CCO)OCCCCCCCCCCCCCC UZLHBUQJHDTDRD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RFIMISVNSAUMBU-UHFFFAOYSA-N 2-(hydroxymethyl)-2-(prop-2-enoxymethyl)propane-1,3-diol Chemical compound OCC(CO)(CO)COCC=C RFIMISVNSAUMBU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UMHYVXGZRGOICM-AUYXYSRISA-N 2-[(z)-octadec-9-enoyl]oxypropyl (z)-octadec-9-enoate Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OCC(C)OC(=O)CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC UMHYVXGZRGOICM-AUYXYSRISA-N 0.000 description 1
- NFIHXTUNNGIYRF-UHFFFAOYSA-N 2-decanoyloxypropyl decanoate Chemical compound CCCCCCCCCC(=O)OCC(C)OC(=O)CCCCCCCCC NFIHXTUNNGIYRF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NKDFYOWSKOHCCO-YPVLXUMRSA-N 20-hydroxyecdysone Chemical compound C1[C@@H](O)[C@@H](O)C[C@]2(C)[C@@H](CC[C@@]3([C@@H]([C@@](C)(O)[C@H](O)CCC(C)(O)C)CC[C@]33O)C)C3=CC(=O)[C@@H]21 NKDFYOWSKOHCCO-YPVLXUMRSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- GHUXAYLZEGLXDA-UHFFFAOYSA-N 8-azido-5-ethyl-6-phenylphenanthridin-5-ium-3-amine;bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N=[N+]=[N-])=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 GHUXAYLZEGLXDA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000004998 Abdominal Pain Diseases 0.000 description 1
- 241000238876 Acari Species 0.000 description 1
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- 241000256111 Aedes <genus> Species 0.000 description 1
- 241000272525 Anas platyrhynchos Species 0.000 description 1
- 241000256186 Anopheles <genus> Species 0.000 description 1
- 206010003591 Ataxia Diseases 0.000 description 1
- 241001203868 Autographa californica Species 0.000 description 1
- 241000283725 Bos Species 0.000 description 1
- 101000583086 Bunodosoma granuliferum Delta-actitoxin-Bgr2b Proteins 0.000 description 1
- 101710155856 C-C motif chemokine 3 Proteins 0.000 description 1
- 241000282832 Camelidae Species 0.000 description 1
- 241000282836 Camelus dromedarius Species 0.000 description 1
- 241000282465 Canis Species 0.000 description 1
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 101710197658 Capsid protein VP1 Proteins 0.000 description 1
- 241000700199 Cavia porcellus Species 0.000 description 1
- 241001227713 Chiron Species 0.000 description 1
- 208000002881 Colic Diseases 0.000 description 1
- 241000272201 Columbiformes Species 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 241001137251 Corvidae Species 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- 241000256054 Culex <genus> Species 0.000 description 1
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102100036912 Desmin Human genes 0.000 description 1
- 108010044052 Desmin Proteins 0.000 description 1
- 241000255925 Diptera Species 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- LVGKNOAMLMIIKO-UHFFFAOYSA-N Elaidinsaeure-aethylester Natural products CCCCCCCCC=CCCCCCCCC(=O)OCC LVGKNOAMLMIIKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710126499 Envelope glycoprotein E Proteins 0.000 description 1
- VGGSQFUCUMXWEO-UHFFFAOYSA-N Ethene Chemical class C=C VGGSQFUCUMXWEO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282324 Felis Species 0.000 description 1
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 description 1
- 208000032843 Hemorrhage Diseases 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 208000002979 Influenza in Birds Diseases 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- 241000710912 Kunjin virus Species 0.000 description 1
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 description 1
- 241001502481 Meleagrid alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 1
- 101710081079 Minor spike protein H Proteins 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 206010048849 Myocardial haemorrhage Diseases 0.000 description 1
- 206010028851 Necrosis Diseases 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 101800001020 Non-structural protein 4A Proteins 0.000 description 1
- 101800001019 Non-structural protein 4B Proteins 0.000 description 1
- 241000702244 Orthoreovirus Species 0.000 description 1
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 description 1
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 description 1
- 208000007542 Paresis Diseases 0.000 description 1
- 241000543245 Pasteurella multocida subsp. gallicida Species 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 102000001938 Plasminogen Activators Human genes 0.000 description 1
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 description 1
- 229920003171 Poly (ethylene oxide) Polymers 0.000 description 1
- 241000282335 Procyon Species 0.000 description 1
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 description 1
- 101800004937 Protein C Proteins 0.000 description 1
- 102000017975 Protein C Human genes 0.000 description 1
- 206010037714 Quadriplegia Diseases 0.000 description 1
- 101710118046 RNA-directed RNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 241000700638 Raccoonpox virus Species 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 101800001700 Saposin-D Proteins 0.000 description 1
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 241000256251 Spodoptera frugiperda Species 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- 241000700565 Swinepox virus Species 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 206010043376 Tetanus Diseases 0.000 description 1
- 108010055044 Tetanus Toxin Proteins 0.000 description 1
- BHEOSNUKNHRBNM-UHFFFAOYSA-N Tetramethylsqualene Natural products CC(=C)C(C)CCC(=C)C(C)CCC(C)=CCCC=C(C)CCC(C)C(=C)CCC(C)C(C)=C BHEOSNUKNHRBNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 1
- 101150081415 UL55 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150093578 VP2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101900340951 Vaccinia virus Protein I3 Proteins 0.000 description 1
- QYKIQEUNHZKYBP-UHFFFAOYSA-N Vinyl ether Chemical compound C=COC=C QYKIQEUNHZKYBP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010058874 Viraemia Diseases 0.000 description 1
- 101710108545 Viral protein 1 Proteins 0.000 description 1
- UZQJVUCHXGYFLQ-AYDHOLPZSA-N [(2s,3r,4s,5r,6r)-4-[(2s,3r,4s,5r,6r)-4-[(2r,3r,4s,5r,6r)-4-[(2s,3r,4s,5r,6r)-3,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)-4-[(2s,3r,4s,5s,6r)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxyoxan-2-yl]oxy-3,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy-3,5-dihydroxy-6-(hy Chemical compound O([C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]([C@@H]1O)O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]([C@@H]1O)O[C@H]1CC[C@]2(C)[C@H]3CC=C4[C@@]([C@@]3(CC[C@H]2[C@@]1(C=O)C)C)(C)CC(O)[C@]1(CCC(CC14)(C)C)C(=O)O[C@H]1[C@@H]([C@@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O[C@H]4[C@@H]([C@@H](O[C@H]5[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O5)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O4)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O3)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O UZQJVUCHXGYFLQ-AYDHOLPZSA-N 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001336 alkenes Chemical class 0.000 description 1
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 1
- 238000011888 autopsy Methods 0.000 description 1
- 206010064097 avian influenza Diseases 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229920001400 block copolymer Polymers 0.000 description 1
- 108010006025 bovine growth hormone Proteins 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 229940028617 conventional vaccine Drugs 0.000 description 1
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 1
- 229920006037 cross link polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 1
- 210000004292 cytoskeleton Anatomy 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 210000005045 desmin Anatomy 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000003748 differential diagnosis Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- MWRBNPKJOOWZPW-CLFAGFIQSA-N dioleoyl phosphatidylethanolamine Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OCC(COP(O)(=O)OCCN)OC(=O)CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC MWRBNPKJOOWZPW-CLFAGFIQSA-N 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 1
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 1
- LVGKNOAMLMIIKO-QXMHVHEDSA-N ethyl oleate Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OCC LVGKNOAMLMIIKO-QXMHVHEDSA-N 0.000 description 1
- 229940093471 ethyl oleate Drugs 0.000 description 1
- 229920001038 ethylene copolymer Polymers 0.000 description 1
- 150000002191 fatty alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 238000005187 foaming Methods 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 101150029683 gB gene Proteins 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 244000144993 groups of animals Species 0.000 description 1
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 229940090046 jet injector Drugs 0.000 description 1
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 208000027905 limb weakness Diseases 0.000 description 1
- 231100000861 limb weakness Toxicity 0.000 description 1
- 229940057995 liquid paraffin Drugs 0.000 description 1
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 1
- 210000003141 lower extremity Anatomy 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000001823 molecular biology technique Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 208000010125 myocardial infarction Diseases 0.000 description 1
- JXTPJDDICSTXJX-UHFFFAOYSA-N n-Triacontane Natural products CCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC JXTPJDDICSTXJX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AFFLGGQVNFXPEV-UHFFFAOYSA-N n-decene Natural products CCCCCCCCC=C AFFLGGQVNFXPEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 1
- 201000008383 nephritis Diseases 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 239000002736 nonionic surfactant Substances 0.000 description 1
- 229940049964 oleate Drugs 0.000 description 1
- 238000006384 oligomerization reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 231100000915 pathological change Toxicity 0.000 description 1
- 230000036285 pathological change Effects 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 208000008494 pericarditis Diseases 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 229940127126 plasminogen activator Drugs 0.000 description 1
- 229920001983 poloxamer Polymers 0.000 description 1
- 229920000058 polyacrylate Polymers 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 229920001281 polyalkylene Polymers 0.000 description 1
- 229920000223 polyglycerol Polymers 0.000 description 1
- 229920005862 polyol Polymers 0.000 description 1
- 150000003077 polyols Chemical class 0.000 description 1
- 235000015277 pork Nutrition 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 229940010310 propylene glycol dioleate Drugs 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 229960000856 protein c Drugs 0.000 description 1
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 1
- 239000001397 quillaja saponaria molina bark Substances 0.000 description 1
- 229930182490 saponin Natural products 0.000 description 1
- 150000007949 saponins Chemical class 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 1
- 210000004927 skin cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000012798 spherical particle Substances 0.000 description 1
- 229940032094 squalane Drugs 0.000 description 1
- 229940031439 squalene Drugs 0.000 description 1
- TUHBEKDERLKLEC-UHFFFAOYSA-N squalene Natural products CC(=CCCC(=CCCC(=CCCC=C(/C)CCC=C(/C)CC=C(C)C)C)C)C TUHBEKDERLKLEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 229940118376 tetanus toxin Drugs 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- LADGBHLMCUINGV-UHFFFAOYSA-N tricaprin Chemical compound CCCCCCCCCC(=O)OCC(OC(=O)CCCCCCCCC)COC(=O)CCCCCCCCC LADGBHLMCUINGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VLPFTAMPNXLGLX-UHFFFAOYSA-N trioctanoin Chemical compound CCCCCCCC(=O)OCC(OC(=O)CCCCCCC)COC(=O)CCCCCCC VLPFTAMPNXLGLX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 229940126580 vector vaccine Drugs 0.000 description 1
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000008158 vegetable oil Substances 0.000 description 1
- 229960000834 vinyl ether Drugs 0.000 description 1
- 125000000391 vinyl group Chemical group [H]C([*])=C([H])[H] 0.000 description 1
- 229920002554 vinyl polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 229960004854 viral vaccine Drugs 0.000 description 1
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 1
- 239000007762 w/o emulsion Substances 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/525—Virus
- A61K2039/5256—Virus expressing foreign proteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
- A61K2039/552—Veterinary vaccine
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55511—Organic adjuvants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55511—Organic adjuvants
- A61K2039/55522—Cytokines; Lymphokines; Interferons
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55511—Organic adjuvants
- A61K2039/55555—Liposomes; Vesicles, e.g. nanoparticles; Spheres, e.g. nanospheres; Polymers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/24011—Poxviridae
- C12N2710/24041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2710/24043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/24011—Flaviviridae
- C12N2770/24111—Flavivirus, e.g. yellow fever virus, dengue, JEV
- C12N2770/24122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/24011—Flaviviridae
- C12N2770/24111—Flavivirus, e.g. yellow fever virus, dengue, JEV
- C12N2770/24134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/24011—Flaviviridae
- C12N2770/24111—Flavivirus, e.g. yellow fever virus, dengue, JEV
- C12N2770/24171—Demonstrated in vivo effect
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Virology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Oncology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области вирусологии и ветеринарии. Предложена вакцина для защиты лошадей, собак, кошек, крупного рогатого скота, свиней и птиц от вируса лихорадки Западного Нила. Вакцина содержит один или несколько рекомбинантных вирусов оспы птиц NYVAC или MVA и экспрессирует белки prM, M и Е вируса западно-нильской лихорадки. Изобретение может быть использовано в ветеринарии для вакцинации животных против вируса лихорадки Западного Нила. 21 з.п. ф-лы, 1 табл.
Description
Настоящее изобретение относится к векторам экспрессии in vivo и in vitro, содержащим и экспрессирующим, по меньшей мере, один полинуклеотид вируса западно-нильской лихорадки, а также к иммуногенным композициям и вакцинам против западно-нильской лихорадки. Также изобретение относится к методам иммунизации и вакцинации против указанного вируса.
Уровень техники
Впервые вирус западно-нильской лихорадки (West Nile Virus или WNV - вирус Западного Нила) был идентифицирован в 1937 году у жителя Уганды из провинции Западный Нил (Zeiler H.G., Med. Trop., 1999 г. №59, стр.490-494).
Будучи широко распространенным в Африке и встречающимся в Индии, Пакистане и средиземноморском регионе, этот вирус в США впервые был идентифицирован в Нью-Йорке в 1999 году (Anderson J.F. и др. Science, 1999 г., №286, стр.2331-2333).
Вирус западно-нильской лихорадки поражает как птиц, так и млекопитающих и человека.
У птиц болезнь носит характер поражения центральной нервной системы с последующей гибелью. Поражения проявляются в виде энцефалитов, кровоизлияний в миокарде, а также кровоизлияний и некрозов кишечного тракта.
У цыплят экспериментальные инфицирования посредством подкожных инокуляций выделенных из ворон вирусов западно-нильской лихорадки приводили к некрозам миокарда, нефритам и пневмонии через 5-10 суток после инокуляции, энцефалитам от средней до большой тяжести через 21 сутки после инокуляции (Senne D.A. и др., Avian Disease, 2000 г., №44, стр.642-649).
Также вирус западно-нильской лихорадки поражает лошадей, в частности, в Северной Африке и Европе (Cantile С. и др., Equine Vet. J., 2000 г., №32(1), стр.31-35). У таких лошадей отмечаются признаки атаксии, слабости задних конечностей, пареза, развивающегося в тетраплегию, с последующей гибелью. Лошади и верблюды являются основными видами животных, демонстрирующих клинические признаки в виде энцефалитов.
Антитела к вирусу западно-нильской лихорадки были обнаружены у некоторых видов грызунов и у скота, в частности, коров и овец, у домашних животных, в частности, собак (Zeiler H.G., Med. Trop., 1999 г., №59, стр.490-494; Lundstrom J. O., Journal of Vector Ecology, 1999 г., №24(1), стр.1-39).
Не пощадил вирус западно-нильской лихорадки и человека, в котором он проявляется многочиленными сиптомами (Sampson B.A., Human Pathology, 2000 г., №31(5), стр.527-531; Marra C.M., Seminars in Neurology, 2000 г., №20(3), стр.323-327).
Вирус западно-нильской лихорадки передается птицам и млекопитающим через укусы некоторых видов комаров (например, Culex, Aedes, Anopheles) и клещей.
Дикие и домашние птицы служат резервуаром вируса западно-нильской лихорадки и его распространителями вследствие миграций.
Вирионы вируса западно-нильской лихорадки представляют собой сферические частицы диаметром 50 нм, состоящие из липопротеиновой оболочки вокруг нуклеокапсида в форме двадцатигранника, содержащего РНК с одной нитью положительной полярности.
Единственная открытая рамка считывания (ORF) кодирует совокупность вирусных белков в виде полипротеина. Расщепление и созревание этого полипротеина приводит к образованию десятка разных вирусных белков. Структурные белки кодируются 5′-областью генома и соответствуют нуклеокапсиду С (14 кДа), гликопротеину оболочки Е (50 кДа), белку предмембраны prM (23 кДа) и белку мембраны М (7 кДа). Неструктурные белки кодируются 3′-областью генома и соответствуют белкам NS1 (40 кДа), NS2A (19 кДа), NS2B (14 кДа), NS3 (74 кДа), NS4A (15 кДа), NS4B (29 кДа), NS5 (97 кДа).
Parrish C.R. и др. (J.Gen. ViroL, 1991 г., №72, стр.1645-1653), Kulkarni A.B. и др. (J.Virol, 1992 г., №66(6), стр.3583-3592) и Hill A.B. и др. (J.Gen. Virol, 1992 г., №73, стр.1115-1123) создали на основе вируса коровьей оспы векторы экспрессии in vivo, содержащие различные вставки, соответствующие последовательностям нуклеотидов, кодирующим неструктурные белки вируса Кунджин, ассоциированные при необходимости со структурными белками. Такие векторы вводились в мышь для определения клеточной иммунной реакции. Авторы настаивают на значимости клеточной реакции, существенно стимулированной неструктурными белками, в частности, такими, как NS3, NS4A, NS4B. Указанные статьи свидетельствуют о трудности создания эффективной стратегии вакцинации против западно-нильской лихорадки.
До сегодняшнего дня не имеется вакцины для предупреждения инфекции вирусом западно-нильской лихорадки.
Раскрытие изобретения
Целью настоящего изобретения является создание средства для профилактики и/или борьбы против болезней, вызываемых вирусом западно-нильской лихорадки.
Другой целью изобретения является создание такого средства, которое могло бы применяться для разных видов животных, восприимчивых к болезни, вызываемой указанным вирусом, в частности, для лошадей и птиц.
Еще одной целью изобретения является создание способов иммунизации и вакцинации целевых животных.
Следующей целью изобретения является создание таких средств и способов, которые обеспечивают дифференциальную диагностику.
Следовательно, первой целью изобретения являются векторы экспрессии in vitro и/или in vivo, содержащие полинуклеодид, кодирующий белок оболочки Е вируса западно-нильской лихорадки. Кроме того, такие векторы содержат элементы, которые необходимы для экспрессии полинуклеотида в клетке хозяина.
Помимо полинуклеотида, кодирующего белок Е, векторы экспрессии согласно изобретению могут содержать один или несколько других полинуклеотидов, кодирующих другие белки вируса западно-нильской лихорадки, предпочтительно структурные белки вируса западно-нильской лихорадки, причем эти последовательности выбираются предпочтительно из последовательностей, кодирующих белок предмембраны prM и белок мембраны М.
Вектор содержит преимущественно полинуклеотид, образующий единую кодирующую рамку, соответствующую, например, prM-E, M-E, в особенности, prM-М-Е. Вектор, содержащий несколько отдельных полинуклеотидов, кодирующих разные белки (например, prM и/или М и Е), также входит в состав настоящего изобретения. Вектор, в частности, in vivo, также может содержать полинуклеотиды, соответствующие более чем одному штамму вируса западно-нильской лихорадки, в частности, двум или более полинуклеотидам, кодирующим Е или prM-М-Е разных штаммов. Как будет показано ниже, вектор, в частности, in vivo, также может содержать одну или несколько последовательностей нуклеотидов, кодирующих иммуногены других патогенных возбудителей и/или цитокины.
Согласно предпочтительному варианту осуществления изобретения вектор экспрессии содержит в себе полинуклеотид, кодирующий prM-М-Е, причем предпочтительно в единой фазе считывания.
Под полинуклеотидом, кодирующим белок вируса западно-нильской лихорадки, понимается в принципе фрагмент ДНК, кодирующий этот белок, или комплементарная нить этого фрагмента ДНК. РНК также не исключена.
В смысле настоящего изобретения термин "белок" охватывает фрагменты, в том числе пептиды и полипептиды. По определению белковый фрагмент является иммунологически активным в том смысле, что, будучи введенным в хозяина, он сохраняет способность вызывать иммунную реакцию гуморального и/или клеточного типа, направленную против белка. Предпочтительно, чтобы фрагмент белка обладал по существу одинаковой иммунологической активностью с целым белком. Фрагмент белка согласно изобретению содержит, следовательно, по меньшей мере, один эпитоп или антигенную детерминанту. Термин "эпитоп" относится к участку белка, способного вызывать иммунную реакцию гуморального (В-клетки) и/или клеточного типа (Т-клетки).
Следовательно, минимальной структурой полинуклеотида является структура, которая кодирует эпитоп или антигенную детерминанту рассматриваемого белка. Полинуклеотид, кодирующий фрагмент целого белка, содержит, в частности, не менее 21 нуклеотида, а именно, по меньшей мере, 42 нуклеотида, предпочтительно, по меньшей мере, 57, 87 или 150 расположенных один за другим нуклеотидов последовательности, из которой он происходит. Способы определения эпитопов среднему специалисту хорошо известны, можно пользоваться, в частности, банками перекрывающихся пептидов (Hemmer В. и др. Immunology Today, 1998 г., №19(4), стр.163-168, Pepscan (Geysen H.M. и др., Proc. Nat. Acad. Sci., США, 1984 г., №81(13), стр.3998-4002; Geysen H.M. и др., Proc. Nat. Acad. Sci., США, 1985 г., №82(1), стр.178-182; Van der Zee R. и др., Eur. J. Immunol., 1989 г., №19(1), стр.43-47; Geysen H.M., Southeast Asian J. Trop. Med. Public Health, 1990 г., №21(4), стр.523-533; Multipin® Peptide Synthesis Kits de Chiron) и алгоритмами (De Groot А. и др., Nature Biotechnology, 1999 г., №17, стр.533-561).
В частности, полинуклеотиды согласно изобретению содержат в себе нуклеотидную последовательность, кодирующую один или два трансмембранных домена, предпочтительно два, расположенных в С-концевой области белка Е. Для штамма вируса западно-нильской лихорадки NY99 эти домены соответствуют последовательностям аминокислот от 742 до 766 и от 770 до 791 банка GenBank AF196835.
Элементы для экспрессии полинуклеотида или полинуклеотидов должны присутствовать. Имеются в виду, по меньшей мере, инициирующий кодон (ATG), терминирующий кодон и промотор, а также последовательность полиаденирования в случае плазмид и вирусных векторов, иных нежели поксвирусы. В том случае, когда полинуклеотид кодирует фрагмент полипротеина, например, prM-E, M-E, prM-М-Е, инициирующий кодон ATG располагается в 5′-положении рамки считывания, а терминирующий кодон - в 3′-положении. Как будет пояснено ниже, могут присутствовать и другие элементы, обеспечивающие контроль экспрессии, такие, как активаторные (энхансер), стабилизирующие и сигнальные последовательности, обеспечивающие секрецию белка.
Объектом настоящего изобретения являются также препараты, содержащие упомянутые экспрессионные векторы. В частности, изобретение касается препаратов, содержащих один или несколько векторов экспрессии in vivo, содержащих и экспрессирующих один или несколько из указанных выше полинуклеотидов, в том числе и кодирующий Е полинуклеотид, в фармацевтически приемлемом носителе или индифферентном инертном веществе.
Согласно первому варианту осуществления изобретения другой или другие содержащиеся в препарате векторы содержат и экспрессируют один или несколько других белков вируса западно-нильской лихорадки, например, prM, M, prM-М.
Согласно второму варианту осуществления изобретения другой или другие содержащиеся в препарате векторы содержат и экспрессируют один или несколько белков другого или других штаммов вируса западно-нильской лихорадки. В частности, препарат содержит, по меньшей мере, два вектора экспрессии, в частности, in vivo полинуклеотидов разных штаммов вируса западно-нильской лихорадки, которые кодируют одинаковые и/или разные белки, предпочтительно, одинаковые. Речь идет преимущественно о векторах экспрессии in vivo E или prM-М-Е двух, трех или более разных штаммов вируса западно-нильской лихорадки. Целью изобретения являются кроме того смеси векторов экспрессии prM, M, Е, prM-М, prM-E или M-E разных штаммов.
Согласно еще одному варианту осуществления изобретения, о котором подробнее речь пойдет ниже, другой или другие, присутствующие в препарате векторы содержат и экспрессируют один или несколько цитокинов и/или один или несколько иммуногенов другого или других патогенных возбудителей.
Целью изобретения являются также комбинации указанных разных вариантов осуществления.
Препараты, содержащие вектор экспрессии in vitro или in vivo, содержащий и экспрессирующий полинуклеотид, кодирующий prM-М-Е, являются предпочтительным вариантом осуществления изобретения.
Согласно особому варианту осуществления изобретения векторы экспрессии in vitro или in vivo содержат в качестве единственного (единственных) полинуклеотида (полинуклеотидов) вируса западно-нильской лихорадки полинуклеотид, кодирующий белок Е, при необходимости в ассоциации с prM и/или М, предпочтительно кодирующий prM-М-Е, и при необходимости сигнальную последовательность вируса лихорадки Западного Нила.
Согласно особому варианту осуществления изобретения один или несколько неструктурных белков NS2A, NS2B и NS3 экспрессируются вместе со структурными белками согласно изобретению либо посредством того же экспрессионного вектора, либо посредством отдельного экспрессионного вектора. Предпочтительно, чтобы их экспрессия происходила совместно на основе единого полинуклеотида.
Также объектом изобретения является вектор экспрессии in vitro или in vivo, содержащий полинуклеотид, кодирующий NS2A, NS2B, NS3, их комбинации, предпочтительно кодирующий NS2A-NS2B-NS3. В сущности данный вектор может быть одним из описанных выше векторов, содержать полинуклеотид, кодирующий структурный или структурные белки, в частности, Е или prM-М-Е. В одном из вариантов изобретение касается препарата, такого, как описанный выше, содержащего дополнительно, по меньшей мере, один из указанных векторов, экспрессирующих неструктурный белок, и при необходимости фармацевтически приемлемый носитель или инертное вещество.
Осуществление изобретения
Для получения экспрессионных векторов согласно изобретению средний специалист располагает разными штаммами вируса западно-нильской лихорадки и описанием нуклеотидной последовательности их генома. См., в частности. Savage H.M. и др., (Am.J.Trop. Med. Hyg., 1999 г., №61(4), стр.600-611), таблица 2, в которой приведены 24 штамма вируса западно-нильской лихорадки и инвентарные номера полинуклеотидных последовательностей в банке GenBank.
Например, можно отослать к штамму NY99 (GenBank AF 196835). В этом банке для каждого белка имеется точная соответствующая последовательность ДНК (нуклеотиды 466-741 для prM, 742-966 для М, 967-2469 для Е, т.е. 466-2469 для prM-М-Е, 3526-4218 для NS2A, 4219-4611 для NS2B и 4612-6468 для NS3, т.е. 3526-6468 для NS2A-NS2B-NS3). В результате сравнения и выравнивания последовательностей сразу определяется полинуклеотид, кодирующий такой белок в другом штамме вируса западно-нильской лихорадки.
Выше речь уже шла о том, что под полинуклеотидом понимается последовательность, которая кодирует белок, или фрагмент, или эпитоп, специфичный для вируса западно-нильской лихорадки. Кроме того, вследствие эквивалентности термином "полинуклеотид" охватываются также соответствующие нуклеотидные последовательности разных штаммов вируса западно-нильской лихорадки, а также последовательности нуклеотидов, которые различаются из-за вырожденности кода.
В семействе вирусов западно-нильской лихорадки идентичность между аминокислотными последовательностями prM-М-Е и таковой для NY99 достигает 90% и более. Следовательно, изобретение охватывает и полинуклеотиды, кодирующие аминокислотную последовательность, идентичность которой с природной аминокислотной последовательностью составляет 90% или более, в частности, 92%, предпочтительно 95%, более предпочтительно 98%. В качестве эквивалентов могут рассматриваться также фрагменты таких гомологичных полинуклеотидов, являющиеся специфичными для вирусов западно-нильской лихорадки.
Кроме того, в том случае, когда речь идет о полинуклеотиде вируса лихорадки Западного Нила, данный термин включает в себя и последовательности, эквивалентные в смысле настоящего изобретения.
Уже было сказано, что термином "белок" обозначаются иммунологически активные полипептиды и пептиды. Применительно к изобретению этот термин охватывает:
а) соответствующие белки разных штаммов вируса западно-нильской лихорадки;
б) белки, которые отличаются между собой, но которые сохраняют по отношению к природному белку вируса западно-нильской лихорадки идентичность, превышающую или равную 90%, в частности, 92%, предпочтительно 95% и особо предпочтительно 98%.
Следовательно, когда речь заходит о белке вируса западно-нильской лихорадки, то этим термином охватываются эквивалентные в смысле настоящего изобретения белки.
Доступ к различным штаммам вируса западно-нильской лихорадки возможен благодаря коллекциям, в частности, American Type Culture Collection (ATCC), например, под номерами доступа VR-82 или VR-1267. Вирус Кунджин (Kunjin) рассматривается в качестве подлинного вируса западно-нильской лихорадки.
Согласно изобретению предпочтительно, чтобы полинуклеотид содержал, кроме того, нуклеотидную последовательность, кодирующую сигнальный пептид, расположенный перед экспрессируемым белком, для обеспечения его секреции. Следовательно, речь может идти об эндогенной последовательности, т.е. о природной сигнальной последовательности в случае ее существования (происходящей из того же вируса западно-нильской лихорадки или из другого штамма). Так, например, для вируса западно-нильсколй лихорадки NY99 эндогенная сигнальная последовательность Е соответствует нуклеотидам от 922 до 966 последовательности GenBank; для prM речь идет о нуклеотидах от 421 до 465. Также речь может идти о нуклеотидной последовательности, кодирующей гетерологичный сигнальный пептид, в частности, о последовательности, кодирующей сигнальный пептид тканевого активатора человеческого плазминогена (tPA) (Hartikka J. и др., Human Gene Therapy, 1996 г., №7, стр.1205-1217). Нуклеотидная последовательность, кодирующая сигнальный пептид, встраивают в фазе и располагают перед последовательностью, кодирующей Е или ее комбинации, например, prM-М-Е.
Согласно первому варианту осуществления изобретения векторы экспрессии in vivo представляют собой вирусные векторы.
Этими экспрессионными векторами являются преимущественно поксвирусы, например, вирус осповакцины, или аттенуированные мутанты вируса осповакцины, например, MVA (штамм Ankara) (Stickl H. и Hochstein-Mintzel V., Munch. Med. Wschr., 1971 г., №113, стр.1149-1153; Sutter G. и др., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1992 г., №89, стр.10847-10851; стандартный штамм АТСС VR-1508; MVA получен после более 570 пассажей штамма осповакцины "Ankara" на фибробластах куриных эмбрионов) или NYVAC (его получение описано в патенте US-A-5 494 807, в частности, в примерах 1-6;
в этом патенте описано также введение гетерологичных генов по сайтам рекомбинации и применение адаптированных промоторов; см. также WO-A-96/40241), вирус оспы птиц (в частности, оспа канареек, домашней птицы, голубей, перепелов), вирус оспы свиней, оспы енотов и оспы верблюдов, аденовирусы, такие как аденовирусы птиц, собак, свиней, крупного рогатого скота, людей, и герпесвирусы, такие как вирусы конского герпеса (EHV, серотипы 1 и 4), вирус собачьего герпеса (CHV), вирус кошачьего герпеса (FHV), вирусы герпеса крупного рогатого скота (BHV, серотипы 1 и 4), вирус свиного герпеса (PRV), вирусы болезни Марека (Marek) (MDV, серотипы 1 и 2), вирус герпеса индюшек (HVT или MDV, серотип 3), вирус герпеса уток. В случае применения вируса герпеса при вакцинации птиц предпочтительным является вектор HVT, при вакцинации лошадей предпочтительным является вектор EHV.
Согласно одному из предпочтительных вариантов осуществления изобретения поксвирусным эспрессионным вектором является вирус оспы канареек или оспы домашней птицы, эти вирусы оспы могут быть при необходимости аттенюированы. Можно указать на вирус оспы канареек, коммерческий доступ к которому возможен через АТСС под номером доступа VR-111. Аттенюированные вирусы оспы канареек описаны в US-A-5 756 103 и WO-A-01/05934. Также доступны многочисленные вакцинные штаммы вируса оспы домашней птицы, например, вакцина DIFTOSEC СТ®, предлагаемая ф. MERIAL, и вакцина NOBILIS® VARIOLE, предлагаемая ф. Intervet.
За сведениями о поксвирусах специалист может обратиться к WO-A-90/12882, в частности, о вирусе осповакцины - к US-A-4 769330, US-A-4722848, US-A-4603112, US-A-5110587, US-A-5494807, US-A-5762938; об оспе домашней птицы - к US-A-5174993, US-A-5505941, US-A-5766599; об оспе канареек - к US-A-57566103; об оспе свиней - к US-A-5382425; об оспе енотов - к WO-A-00/03030.
В том случае, когда вектор экспрессии является вирусом осповакцины, то инсерционными сайтами для экспрессируемого полинуклеотида (полинуклеотидов) являются, в частности, ген тимидинкиназы (ТК), ген гемагглютинина (НА), область белка включения типа A (ATI). Если речь идет об оспе канареек, то инсерционные сайты располагаются в ORF С3, С5 и С6 или образованы ими. Если в виду имеется оспа домашней птицы, то инсерционные сайты располагаются в ORF F7 и F8 или образованы ими.
Встраивание генов в вирус MVA описано в разных публикациях, в частности, в Caroll M. W. и др., Vaccine, 1997 г., №15(4), стр.387-394; Stittelaar K.J. и др., J. Virol, 2000 г., №74(9), стр.4236-4243; Sutler G. и др., Vaccine, 1994 г., №12(11), стр.1032-1040, к которым специалист может обратиться. Полный геном MVA описан Antoine G., Virology, 1998 г., №244, стр.365-396, что позволяет среднему специалисту использовать другие инсерционные сайты или промоторы.
Предпочтительно, чтобы в том случае, когда вектором экспрессии является поксвирус, экспрессируемый полинуклеотид встраивался под контроль специфичного поксвирусного промотора, в частности, промотора вируса осповакцины 7,5 кДа (Cochran и др., J. Virology, 1985 г., №54, стр.30-35), промотора вируса осповакцины I3L (Riviere и др., J. Virology, 1992 г., №66, стр.3424-3434), промотора вируса осповакцины НА (Shida, Virology, 1986 г., №150, стр.451-457), промотора вируса осповакцины ATI (Funahashi и др., J. Gen. Virol, 1988 г., №69, стр.35-47) или промотора вируса осповакцины Н6 (Taylor J. и др., Vaccine, 1988 г., №6, стр.504-508; Guo P. и др., J. Virol., 1989 г., №63, стр.4189-4198; Perkus M. и др., J. Virol., 1989 г., №63, стр.3829-3836).
Предпочтительно, чтобы при вакцинации млекопитающих экспрессионным вектором служил вирус оспы канареек. Предпочтительно, чтобы при вакцинации птиц, в частности, цыплят, уток, индюшек и гусей экспрессионным вектором служил вирус оспы канареек или оспы домашней птицы.
Если экспрессионным вектором является вирус герпеса HVT, то соответствующие инсерционные сайты располагаются во фрагменте BamHI I или фрагменте BamHI M вируса герпеса HVT. Рестрикционный фрагмент BamHI I вируса герпеса HVT содержит несколько открытых рамок считывания (ORF) и три межгенные области, а также несколько участков, предпочтительных для вставки, а именно три межгенные области 1, 2 и 3, являющиеся предпочтительными, и ORF UL55 (FR-A-2728795, US-A-5980906). Рестрикционный фрагмент BamHI M вируса герпеса HVT содержит ORF UL 43, который также является предпочтительным инсерционным сайтом (FR-A-2728794, US-A-5733554).
Если экспрессионным вектором служит вирус герпеса EHV-1 или EHV-4, то подходящими инсерционными сайтами являются, в частности, ТК, UL 43, UL 45 (ЕР-А-0668355).
Предпочтительно, чтобы в том случае, когда экспрессионным вектором является вирус герпеса, экспрессируемый полинуклеотид вводился под контролем сильного эукариотического промотора, предпочтительно промотора CMV-IE. Такие сильные промоторы описаны ниже, в относящейся к плазмидам части описания.
Согласно второму варианту осуществления изобретения векторами экспрессии in vivo являются плазмидные векторы, так называемые плазмиды.
Термин "плазмида" предполагает любую транскрипционную единицу ДНК в виде последовательности полинуклеотидов, содержащей полинуклеотид согласно изобретению, а также элементы для его экспрессии in vivo. Предпочтительной является кольцевая плазмида, сверхспирализованная или нет. Линейная форма также входит в рамки данного изобретения.
Каждая плазмида содержит промотор, обеспечивающий в клетках-хозяевах экспрессию полинуклеотида, введенного под его контроль. Речь идет, как правило, о сильном эукариотическом промоторе. Предпочтительным сильным эукариотическим промотором является немедленный ранний промотор цитомегаловируса (CMV-IE) человека или мыши или при необходимости какого-либо другого происхождения, например, крысы, морской свинки. Промотор CMV-IE может содержать собственно промоторную часть, связанную или не связанную с активаторной частью (энхансером).
Можно отослать к ЕР-А-260 148, ЕР-А-323 597, US-A-5 168 062, US-A-5 385 839, US-A-4 968 615, WO-A-87/03905. Предпочтительным является CMV-IE человека (Boshart M. и др., Cell., 1985 г., №41, стр.521-530) или мыши.
В более широком смысле промотор имеет либо вирусное, либо клеточное происхождение. В качестве сильного вирусного промотора, иного, нежели CMV-IE, можно назвать ранний/поздний промотор вируса SV40 или промотор LTR вируса саркомы Рауса. В качестве сильного клеточного промотора можно указать на промотор гена цитоскелета, такого как, например, промотор десмина (Kwissa M. и др., Vaccine, 2000 г., №18(22), стр.2337-2344) или промотор актина (Miyazaki J. и др., Gene, 1989 г., №79(2), стр.269-277).
Благодаря эквивалентности субфрагменты указанных промоторов, сохраняющие адекватную промоторную активность, включены в состав настоящего изобретения, например, укороченные промоторы CMV-IE согласно WO-A-98/00166. Следовательно, понятие промотора согласно изобретению включает в себя производные и субфрагменты, сохраняющие адекватную промоторную активность, предпочтительно существенно схожую с активностью собственно промотора, из которого они происходят. Применительно к CMV-IE это понятие охватывает собственно промоторную часть и/или активаторную часть и производные и субфрагменты.
Предпочтительно, чтобы плазмиды содержали другие элементы для контроля экспрессии. В частности, целесообразно вводить стабилизирующие последовательности типа интрона, предпочтительно интрон II гена бета-глобина кролика (van Ooyen и др., Science, 1979 г., №206, стр.337-344).
В качестве сигнала полиаденилирования (polyA) для плазмид и вирусных векторов, иных, нежели поксвирусы, можно использовать, в частности, сигнал гена гормона роста быка (bGH) (US-A-5122458), сигнал гена бета-глобина кролика или сигнал вируса SV40.
Также и другие элементы для контроля экспрессии, применимые в плазмидах, могут присутствовать в векторах экспрессии на основе вируса герпеса.
Согласно другому варианту осуществления изобретения экспрессионными векторами являются векторы, используемые для экспрессии белков in vitro в соответствующей клеточной системе. Белки могут быть затем выделены из культуральной жидкости после секреции или при ее отсутствии (при отсутствии секреции проводится лизис клеток), при необходимости проводят концентрирование традиционными способами, в частности, ультрафильтрацией, и/или очищают традиционными средствами, в частности, методами аффинной, ионообменной или гель- фильтрационной хроматографии.
Продукция обеспечивается трансфекцией клеток млекопитающих плазмидами, репликацией вирусных векторов в клетках млекопитающих или птиц или репликацией бакуловируса (US-A-4745051; Vialard J. и др., J. Virol., 1990 г., №64(1), стр.37-50; Verne A., Virology, 1988 г., №167, стр.56-71), например, вируса ядреного полиэдроза Autographa californica AcNPV, в клетках насекомых (например, клетках Sf9 Spodoptera frugiperda, банк АТСС CRL 1711). В качестве клеток млекопитающих могут использоваться, в частности, клетки хомяка (например, СНО или ВНК-21), клетки обезьяны (например, COS или VERO). Таким образом изобретение распространяется и на экспрессионные векторы, содержащие полинуклеотид согласно изобретению, белки вируса западно-нильской лихорадки или продуцированные таким образом фрагменты и препараты, их содержащие.
Объектом настоящего изобретения являются также очищенные и/или концентрированные препараты белков вируса западно-нильской лихорадки. Если полинуклеотид кодирует несколько белков, которые разъединяются, то упомянутые препараты в таком случае содержат в себе разъединенные белки.
Объектом изобретения являются также иммуногенные композиции и вакцины против вируса западно-нильской лихорадки, содержащие, по меньшей мере, один вектор экспрессии in vivo согласно изобретению и фармацевтически приемлемый носитель или инертное вещество, а также при необходимости адъювант.
Понятие "иммуногенная композиция" включает в себя любую композицию, способную после своего введения в целевое животное вызвать иммунную реакцию, направленную против вируса западно-нильской лихорадки. Под вакциной понимается композиция, способная обеспечить эффективную защиту. Целевыми животными служат семейства лошадиных, псовых, кошачьих, воловьих, свиных и пернатых, предпочтительно, лошадь, собака, кошка, свинья и среди птиц: гуси, индюшки, куры, утки, все то, что по определению включает в себя животных-производителей, несушек, животных мясного направления.
Фармацевтически приемлемые носители или инертные вещества хорошо известны среднему специалисту. В качестве примера можно указать на солевой раствор 0,9% NaCl или фосфатный буферный раствор. Фармацевтически приемлемые носители или инертные вещества включают в себя также любое соединение или комбинацию соединений, упрощающих введение вектора, в частности, трансфекцию, и/или улучшающие сохранность.
Дозы и их объемы будут указаны ниже в общем описании методов иммунизации и вакцинации.
Иммуногенные композиции и вакцины согласно изобретению предпочтительно содержат один или несколько адъювантов, выбираемых, в частности, из обычных адъювантов. В рамках настоящего изобретения особо пригодными являются: (1) полимеры акриловой или метакриловой кислоты, полимеры малеинового ангидрида и производного алкилена, (2) иммуностимуляторные последовательности (ISS), в частности, олигодезоксирибонуклеотидные последовательности с одним или несколькими неметилированными мотивами CpG (Klinman D.M. и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996г., №93, стр.2879-2883; WO-A1-98/16247), (3) эмульсия "масло в воде", в частности, эмульсия SPT, описанная на стр.147 "Vaccine Disign, The Subunit and Adjuvant Approach", ред. M.Powell, M.Newman, Plenum Press, 1995 г., и эмульсия MF59, описанная на стр.183 той же публикации, (4) катионные липиды, содержащие соли четвертичного аммония, (5) цитокины или (6) их комбинации или смеси.
Эмульсия "масло в воде" (3), которая особо пригодна для вирусных векторов, может быть приготовлена на основе:
- легкого жидкого парафина (типа, предусмотренного Европейской фармакопеей);
- изопреноидного масла, такого как сквалан, сквален;
- масла, образующегося при олигомеризации алкенов, в частности, изобутена или децена;
- сложных эфиров кислот или спиртов с линейной алкильной группой;
- особенно растительных масел, этилолеата, пропиленгликольдикаприлата /дикапрата, глицерилтрикаприлата/ трикапрата, пропиленгликольдиолеата;
- сложных эфиров кислот или жирных спиртов с разветвленной цепью, в частности, сложных эфиров изостеариновой кислоты.
Для образования эмульсии масло применяется вместе с эмульгаторами. Эмульгаторами служат предпочтительно неионные поверхностно-активные вещества, в частности:
- сложные эфиры, с одной стороны, сорбитана, маннида (например, ангидроманнитололеата), глицерина, полиглицерина или пропиленгликоля и, с другой стороны, олеиновой, изостеариновой, рицинолевой, оксистеариновой кислот, причем указанные сложные эфиры при необходимости являются этоксилированными;
- блоксополимеры полиоксипропилен-полиоксиэтилен, в частности, Pluronic, a именно L121.
Из добавляемых полимеров типа (1) предпочтительными являются сшитые полимеры акриловой или метакриловой кислоты, в частности, сшитые полиалкиленовыми эфирами сахаров или многоатомных спиртов. Такие соединения известны под названием "карбомеры" (Pharmeuropa, т. 8, №2, июнь 1996 г.). Специалист может также обратиться к патенту US-A-2909462, в котором описаны такие акриловые полимеры, сшитые полигидроксилированным соединением, содержащим, по меньшей мере, 3 гидроксильных группы, предпочтительно не более 8, при этом атомы водорода, по меньшей мере, в трех гидроксилах замещены алифатическими ненасыщенными радикалами, содержащими, по меньшей мере, 2 атома углерода. Предпочтительными радикалами являются радикалы с 2-4 атомами углерода, например, винилы, аллилы и другие ненасыщенные группы этиленового ряда. Ненасыщенные радикалы могут сами содержать другие заместители, такие как метил. Особо пригодными являются продукты, предлагаемые под названием Carbopol® (BF Goodrich, шт. Огайо, США). Они сшиты, в частности, аллильным производным сахарозы или аллилпентаэритритолом. Из них можно указать, в частности, на Carbopol® 974P, 934Р и 971Р.
Из сополимеров малеинового ангидрида и производного алкилена предпочтительными являются EMA® (Monsanto), которые представляют собой сополимеры малеинового ангидрида и этилена, линейные или сшитые, например, сшитые дивиниловым эфиром. Можно отослать к J. Fields и др., Nature, №186, стр.778-780, от 4 июня 1960 г.
В отношении своей структуры полимеры акриловой или метакриловой кислоты и EMA® образованы преимущественно структурными звеньями следующей формулы:
где:
- R1 и R2, одинаковые или разные, означают Н или СН3,
- х=0 или 1, предпочтительно х=1,
- у=1 или 2, при этом х+у=2.
Для EMA® х=0, у=2. Для карбомеров х=у=1.
Эти полимеры растворены в воде или физиологическом растворе (NaCl при концентрации 20 г/л), показатель рН доведен до 7,3-7,4 едким натром для получения раствора адъюванта, в который будут введены экспрессионные векторы.
Концентрация полимера в конечной вакцинной композиции может достигать 0,01-1,5% (вес/объем), в частности, 0,05-1% (вес/объем), предпочтительно 0,1-0,4% (вес/объем).
Катионными липидами (4), содержащими соль четвертичного аммония и являющимися особо, но не исключительно, пригодными для плазмид, служат липиды следующей формулы:
где R1 означает насыщенный или ненасыщенный линейный алифатический радикал с 12-18 атомами углерода, Rз означает другой алифатический радикал с 2 или 3 атомами углерода, Х - гидроксильная или аминогруппа.
Из катионных липидов предпочтительным является DMRIE (N-(2-гидроксиэтил)-N,N-диметил-2,3-бис(тетрадецилокси)-1-пропиламмоний, WO-A-96/34109), предпочтительно с нейтральным липидом, предпочтительно с DOPE (диолеоил-фосфатидил-этаноламин; Behr J.P., 1994 г., Bioconjugate Chemistry, №5, стр.382-389), образуя DMRIE-DOPE.
Предпочтительно приготавливать смесь из плазмиды с указанным адъювантом непосредственно перед использованием, также предпочтительно перед введением смесь выдержать в течение времени, необходимого для образования комплексов, например, в течение 10-60 минут, в частности, около 30 минут.
Если присутствует DOPE, молярное соотношение DMRIE: DOPE составляет предпочтительно 95:5-5:95, в частности, 1:1.
Весовое соотношение между плазмидой и адъювантом DMRIE или DMRIE-DOPE может составлять 50:1-1:10, в частности, 10:1-1:5, предпочтительно 1:1-1:2.
Цитокин или цитокины (5) могут вводиться в композицию или вакцину в виде белка или подвергаться совместной экспрессии в хозяине вместе с иммуногеном или иммуногенами. Предпочтительной является коэкспрессия цитокина или цитокинов либо посредством того же вектора, что и вектор, экспрессирующий иммуноген, либо посредством собственного вектора.
Цитокины могут выбираться, в частности, из интерлейкина 18 (IL-18), интерлейкина 12(IL-12), интерлейкина 15(IL-15), макрофагального воспалительного белка 1α MIP-1α (macrophage inflammatory protein 1α; Marshall E. и др., Br. J. Cancer, 1997 г., №75(12), стр.1715-1720), гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора GM-CSF (Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor). Можно указать на цитокины птиц, в частности, цыпленка, такие как cIL-18 (Schneider К. и др., J.Interferon Cytokine Res., 2000 г., №20(10), стр.879-883), cIL-15 (Xin K.-Q. и др., Vaccine, 1999 г., №17, стр.858-866), и на цитокины лошади, в частности, конский GM-CSF (WO-A-00/77210). Предпочтительно применять цитокины вакцинируемого вида животного.
В WO-A-00/77210 описаны нуклеотидная последовательность и аминокислотная последовательность, соответствующие конскому GM-CSF, получение GM-CSF in vitro и конструирование векторов (плазмид и вирусных векторов), обеспечивающих экспрессию конского GM-CSF in vivo. Эти белки, плазмиды и вирусные векторы могут найти применение в иммуногенных композициях и конских вакцинах согласно изобретению. В качестве примера можно использовать плазмиду pJP097, которая описана в примере 3 данной, более ранней заявки, или использовать техническое решение этой заявки для получения других векторов или конского GM-CSF in vitro и вводить такие векторы или конский GM-CSF в иммуногенные композиции или конские вакцины согласно изобретению.
Объектом настоящего изобретения являются, кроме того, иммуногенные композиции и так называемые субъединичные вакцины, содержащие белок Е и при необходимости один или несколько других белков вируса западно-нильской лихорадки, в частности, prM или М, предпочтительно полученные экспрессией in vitro, как описано выше, а также фармацевтически приемлемый носитель или инертное вещество.
Фармацевтически приемлемые носители или инертные вещества среднему специалисту хорошо известны. В качестве примера можно привести солевой 0,9%-ный раствор NaCl или фосфатный буфер.
Иммуногенные композиции и субъединичные вакцины согласно изобретению предпочтительно содержат один или несколько адъювантов, выбранных, в частности, из обычных адъювантов. В рамках настоящего изобретения особо пригодными являются: (1) полимер акриловой или метакриловой кислоты, полимер малеинового ангидрида и производного алкилена, (2) иммуностимуляторная последовательность (ISS), в частности, олигодезоксирибонуклеотидная последовательность, содержащая один или несколько неметилированных мотивов CpG (Klinman D.M. и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996 г., №93, стр.2879-2883; WO-A1-98/16247), (3) эмульсия "масло в воде", в частности, эмульсия SPT, описанная на стр.147 "Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach", издано M. Powell, M. Newman, Plenum Press, 1995 г., и эмульсия MF59, описанная на стр.183 той же публикации, (4) эмульсия "вода в масле" (ЕР-А-639071), (5) сапонин, в частности, Quil-A, и (6) гидроксид алюминия или подобное. Разные типы адъювантов, охарактеризованные в пунктах (1), (2), (3), более подробно описаны выше в связи с вакцинами на основе экспрессионных векторов.
Дозы и их объемы приводятся ниже в рамках общего описания методов иммунизации и вакцинации.
Согласно изобретению вакцинация против вируса западно-нильской лихорадки может быть ассоциирована с другими видами вакцинации в рамках программ проведения вакцинации с применением наборов для иммунизации и вакцинации или поливалентных иммуногенных композиций и вакцин, т.е. таких, которые содержат, по меньшей мере, один компонент вакцины против вируса лихорадки Западного Нила и, по меньшей мере, один компонент вакцины против, по меньшей мере, одного другого патогенного возбудителя. Это предусматривает также экспрессию с помощью одного и того же экспрессионного вектора генов, по меньшей мере, двух патогенных вобудителей, включая и вирус западно-нильской лихорадки.
Объектом изобретения является, кроме того, иммуногенная поливалентная композиция или поливалентная вакцина против вируса лихорадки Западного Нила и, по меньшей мере, против одного другого патогена целевого животного с использованием того же вектора экспрессии in vivo, содержащего и экспрессирующего, по меньшей мере, один полинуклеотид вируса западно-нильской лихорадки согласно изобретению и, по меньшей мере, один полинуклеотид, экспрессирующий иммуноген другого патогена.
Под экспрессированным таким образом "иммуногеном" понимаются, в частности, белок, гликопротеин, полипептид или пептид, эпитоп или производное, например, полученный слитой белок, вызывающий иммунную, предпочтительно защитную реакцию.
Как уже описано выше, такие композиции или поливалентные вакцины содержат, кроме того, фармацевтически приемлемый носитель или инертное вещество, а также при необходимости адъювант.
Объектом изобретения является также поливалентная иммуногенная композиция или поливалентная вакцина, содержащая, по меньшей мере, один вектор экспрессии in vivo, в который встроен, по меньшей мере, один полинуклеотид вируса лихорадки Западного Нила, и, по меньшей мере, один другой вектор экспрессии, в который введен полинуклеотид, кодирующий иммуноген другого патогенного возбудителя. Как уже описано выше, такие поливалентные композиции или вакцины содержат также фармацевтически приемлемый носитель или инертное вещество, а также при необходимости адъювант.
Для иммуногенных композиций и поливалентных вакцин указанные другие конские патогены выбирают, в частности, из группы, включающей вирусы конской ринопневмонии EHV-1 и/или EHV-4 (предпочтительно применять иммуногены EHV-1 и EHV-4 в ассоциации), вирусы конского гриппа EIV, вирусы восточного энцефалита EEV, вирусы западного энцефалита WEV, вирусы венесуэльского энцефалита VEV (предпочтительна комбинация всех трех EEV, WEV и VEV), Clostridium tetani (столбняк) и их смеси. Предпочтительно выбирать для EHV гены gB и/или gD, для EIV - гены НА, NP и/или N, для вирусов энцефалита - С и/или Е2, для Clostridium tetani - ген, кодирующий полностью или частично субъединицу С столбнячного токсина. Это включает использование полинуклеотидов, кодирующих иммунологически активный фрагмент или эпитоп данного иммуногена.
Другие указанные патогены птиц выбираются, в частности, из группы, включающей вирусы болезни Марека MDV (серотипы 1 и 2, предпочтительно серотип 1), вирусы болезни Ньюкасла (Newcastle) NDV, вирусы болезни Гумборо IBDV, вирусы инфекционного бронхита IBV, вирусы инфекционной анемии CAV, вирусы инфекционного ларинготрахеита ILTV, вирусы энцефаломиелита AEV (или также вирусы лейкоза птиц ALV), вирусы геморрагического энтерита индюшек (HEV), вирусы пневмовироза (TRTV), вирусы птичьей чумы (грипп птиц), вирусы серозного перикардита кур, реовирусы птиц, Escherichia coli, Mysoplasma gallinarum, Mysoplasma gallisepticum, Haemophilus avium, Pasteurella gallinarum, Pasteurella multocida gallicida и их смеси. Предпочтительно выбирать для MDV гены gB и/или gD, для NDV - гены HN и/или F, для IBDV - ген VP2, для IBV - гены S (в частности, S1), М и/или N, для CAV - гены VP1 и/или VP2, для ILTV - гены gB и/или gD, для AEV - гены env и/или gag/pro, для HEV - гены 100К и экзон, для TRTV - гены F и/или G, для птичьей чумы - гены НА, N и/или NP. Это включает использование полинуклеотидов, кодирующих иммунологически активный фрагмент или эпитоп данного иммуногена.
В качестве примера в поливалентную иммуногенную композицию или поливалентную вакцину согласно изобретению, в которую при необходимости введен адъювант, как описано выше, и которая предназначена для лошадей, можно включить одну или несколько плазмид, описанных в WO-A-98/03198, в частности, в примерах 8-25 этой более ранней заявки, и плазмиды, описанные в WO-A-00/77043 и предназначенные для лошадей, в частности, плазмиды, описанные в примерах 6 и 7 этой более ранней заявки. Для птиц можно вводить, например, одну или несколько плазмид, описанных в WO-A1-98/03659, в частности, в примерах 7-27 этой заявки.
Иммуногенные композиции или рекомбинантные вакцины, такие как описанные выше, также могут быть ассоциированы, по меньшей мере, с одной традиционной вакциной (инактивированной, живой аттенуированной, субъединичной), направленной против, по меньшей мере, одного другого патогена.
Также иммуногенные композиции и субъединичные вакцины согласно изобретению могут использоваться для сочетанной вакцинации. Следовательно, объектом изобретения являются также поливалентные иммуногенные композиции и поливалентные вакцины, содержащие белок или белки согласно изобретению и один или несколько иммуногенов (термин "иммуноген" был охарактеризован выше), по меньшей мере, одного другого патогенного возбудителя (в частности, содержащегося в приведенным выше перечне) и/или другой патогенный возбудитель в неактивной или аттенуированной форме. Как было описано выше, такие композиции или поливалентные вакцины содержат, кроме того, фармацевтически приемлемый носитель или инертное вещество, а также при необходимости адъювант.
Объектом настоящего изобретения являются, кроме того, методы иммунизации и вакцинации указанных выше целевых животных.
Эти методы предусматривают введение эффективного количества иммуногенной композиции или вакцины согласно изобретению. Такое введение может производиться, в частности, парентерально, например, подкожно, внутрикожно, внутримышечно или через рот или нос. Может проводиться одно или несколько, в частности, два введения.
Разные вакцины могут вводиться струйным инъектором, без применения иглы. Для плазмид можно также применять частицы золота с покрытием плазмидами, наносимые с возможностью проникновения в клетки кожи иммунизируемого субъекта (Tang и др., Nature, 1992 г., №356, стр.152-154).
Иммуногенные композиции и вакцины согласно изобретению содержат в себе эффективное количество экспрессионного вектора или полипептида.
В случае применения иммуногенных композиций или вакцин на основе плазмиды доза составляет, как правило, от около 10 мкг до около 2000 мкг, в частности, от около 50 мкг до около 1000 мкг. Объемы дозы могут составлять от 0,1 до 2 мл, предпочтительно от 0,2 до 1 мл.
Указанные дозы и их объемы хорошо подходят для вакцинации лошадей и млекопитающих.
Для вакцинации видов птиц доза составляет, в частности, от около 10 мкг до около 500 мкг, предпочтительно от около 50 мкг до около 200 мкг. Объемы дозы могут составлять, в частности, от 0,1 до 1 мл, предпочтительно от 0,2 до 0,5 мл.
Специалист обладает необходимыми знаниями, позволяющими оптимизировать эффективную дозу применяемой плазмиды для каждого протокола иммунизации или вакцинации и определить наиболее приемлемый способ введения в организм.
В случае применения иммуногенных композиций или вакцин на основе поксвируса доза составляет, как правило, от около 102 бляшкообразующих единиц (б.о.е.) до около 109 б.о.е.
В том случае, когда вектором является вирус осповакцины, доза для лошадей и млекопитающих составляет, в частности, от около 104 б.о.е. до около 109 б.о.е., предпочтительно от около 106 до около 108 б.о.е.; в том случае, когда вектором является вирус оспы канареек, доза составляет, в частности, от около 105 б.о.е. до около 109 б.о.е., предпочтительно от около 105,5 или 106 до около 108 б.о.е.
В том случае, когда вектором является вирус оспы канареек, доза для видов птиц составляет, в частности, от около 103 б.о.е. до около 107 б.о.е., предпочтительно от около 104 до около 106 б.о.е.; в том случае, когда вектором является вирус оспы домашней птицы, доза составляет, в частности, от около 102 б.о.е. до около 105 б.о.е., предпочтительно от около 103 до около 105 б.о.е.
В случае применения иммуногенных композиций или вакцин на основе вирусного вектора, иного чем поксвирусный, в частности, на основе вируса герпеса, доза составляет, как правило, от около 103 б.о.е. до около 108 б.о.е. В случае применения иммуногенных композиций или вакцин для птиц доза составляет, как правило, от около 103 б.о.е. до около 106 б.о.е. В случае применения иммуногенных композиций или вакцин для лошадей доза составляет, как правило, от около 106 б.о.е. до около 108 б.о.е.
Объемы дозы иммуногенных композиций вакцин для лошадей на основе вирусных векторов составляют, как правило, 0,5-2,0 мл, предпочтительно 1,0-2,0 мл, особо предпочтительно 1,0 мл. Объемы дозы иммуногенных композиций и вакцин для птиц на основе вирусных векторов составляют, как правило, 0,1-1,0 мл, предпочтительно 0,1-0,5 мл, особо предпочтительно 0,2-0,3 мл. Средний специалист обладает и для этого типа вакцины необходимыми знаниями для оптимизации количества введений в организм, способа введения и применяемых доз при каждом протоколе иммунизации. В частности, предусмотрено двухкратное введение для лошадей, например, с интервалом в 35 суток.
В случае применения иммуногенных композиций или субъединичных вакцин доза составляет, как правило, от около 10 мкг до около 2000 мкг, в частности, от около 50 мкг до около 1000 мкг. Объемы дозы иммуногенных композиций и вакцин для лошадей на основе вирусных векторов составляют, как правило, 1,0-2,0 мл, предпочтительно 0,5-2,0 мл, особо предпочтительно 1,0 мл. Объемы дозы иммуногенных композиций и вакцин для птиц на основе вирусных векторов составляют, как правило, 0,1-1,0 мл, предпочтительно 0,1-0,5 мл, особо предпочтительно 0,2-0,3 мл. Для этого типа вакцины средний специалист располагает знаниями, необходимыми для оптимизации количества введений в организм, определения способа введения и применяемых доз для каждого протокола иммунизации.
Изобретение касается также применения вектора экспрессии in vivo и получения векторов или полипептидов согласно изобретению для приготовления иммуногенной композиции или вакцины для защиты целевых животных от вируса лихорадки Западного Нила, а также при необходимости, по меньшей мере, от другого одного патогенного возбудителя. Приведенные в остальной части описания разные признаки относятся к этому объекту изобретения.
Вакцина на основе плазмиды или вирусная вакцина, экспрессирующая один или несколько белков вируса западно-нильской лихорадки, или субъединичная вакцина против западно-нильской лихорадки согласно настоящему изобретению не вызывает у вакцинированного животного образование антител против других белков данного вируса, которые не представлены в иммуногенной композиции или вакцине. Этот признак может быть использован для разработки методов дифференциальной диагностики, которые позволяют выявлять различия между животными, инфицированными патогенным вирусом западно-нильской лихорадки, и животными, вакцинированными с использованием вакцины согласно изобретению. У последних присутствуют эти белки и/или антитела, действующие против них, и они могут быть обнаружены реакцией "антиген - антитело". Иначе обстоит дело в отношении животных, вакцинированных согласно изобретению, реакция которых отрицательная. Для осуществления такой дискриминации используют белок, не представленный в вакцине (отсутствующий или неэкспрессируемый), например, белок С или белок NS1, NS2A, NS2B или NS3, если он не представлен в вакцине.
Следовательно, объектом настоящего изобретения является применение векторов, препаратов и полипептидов согласно изобретению для приготовления иммуногенных композиций и вакцин, позволяющих отличать вакцинированных животных от инфицированных.
Объектом изобретения является также метод иммунизации и вакцинации в сочетании с методом диагностики, обеспечивающим такую дискриминацию.
Белок, выбранный для диагностики, или один из его фрагментов или эпитопов используется в качестве антигена в диагностическом тесте и/или для получения поликлональных или моноклональных антител. Средний специалист обладает знаниями и опытом для получения таких антител и для применения антигенов и/или антител в традиционных методах диагностики, например, в методе ELISA.
Далее изобретение подробнее описывается с помощью вариантов его осуществления, приводимых в качестве не ограничивающих примеров.
Примеры
Все конструкции были получены с использованием стандартных приемов молекулярной биологии (клонирование, расщепление рестрикционными ферментами, синтез комплементарной цепи ДНК, амплификация при помощи полимеразной цепной реакции, элонгация олигонуклеотида ДНК-полимеразой...), описанных Sambrook J. и др. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2-е издание. Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor. New York, 1989 г.). Все рестрикционные фрагменты, использованные в настоящем изобретении, и разные фрагменты, полученные полимеразной цепной реакцией (ПЦР), были выделены и очищены с использованием набора Geneclean® (BIO101 Inc. La Jolla, CA).
Пример 1. Выращивание вируса западно-нильской лихорадки
Для амплификации вирусы западно-нильской лихорадки NY99 (Lanciotti R. S. и др., Science, 1999 г., №286, стр.2333-2337) культивировали на клетках VERO (клетки почки обезьяны, доступные от American Type Culture Collection (ATCC) под номером CCL-81).
Клетки VERO помещали в культуру во флаконы Falcon 25 см2 со средой Eagle-МЕМ, обогащенной 1% дрожжевым экстрактом и 10% коровьей сывороткой, содержащей около 100000 клеток на 1 мл. Клетки культивировали при +37°С в атмосфере с содержанием 5% CO2.
Через 3 суток клеточный слой достигал конфлюэнтности. Культуральная среда была замещена средой Eagle-MEM, обогащенной 1% дрожжевым экстрактом и 0,1% бычьим сывороточным альбумином, вирус западно-нильской лихорадки добавляли в количестве 5 б.о.е. на одну клетку.
По достижении полного цитопатогенного эффекта (СРЕ) (как правило, через 48 -72 часа после добавления в культуру) вирусную суспензию отбирали, осветляли центрифугированием и замораживали при -70°С. Необходимы, как правило, 3-4 последовательных пассажа для получения одной партии вируса. Партию вируса хранили при -70°С.
Пример 2. Экстрагирование вирусной РНК из вируса западно-нильской лихорадки
Вирусную РНК, содержавшуюся в 100 мл вирусной суспензии штамма вируса западно-нильской лихорадки NY99, экстрагировали после размораживания растворами набора "High Pure™ Viral RNA Kit" (Cat #1858882, Roche Molecular Biochemicals) с соблюдением инструкции поставщика по проведению экстрагирования. Осадок РНК, полученный в конце экстрагирования, ресуспендировали в 1-2 мл стерильной дистиллированной воды, свободной от рибонуклеазы.
Пример 3. Конструирование плазмиды pFC101
Комплементарную ДНК (кДНК) вируса западно-нильской лихорадки NY99 синтезировали с помощью набора "Gene Amp RNA PCR Kit" (Cat # N 808 0017, Perkin-Elmer, Norwalk, CT 06859, США) в условиях, предписанных поставщиком.
Реакцию обратной транскрипции, с последующей полимеразной цепной реакцией ("ОТ-ПЦР"), проводили с использованием 50 мкл суспензии вирусной РНК вируса западно-нильской лихорадки NY99 (пример 2) и следующих олигонуклеотидов:
FC101 (30-мер)(SEQ ID NO:l)
5' TTTTTTGAATTCGTTACCCTCTCTAACTTC 3'
и FC102 (33-мер)(SEQ ID NO:2)
5' TTTTTTTCTAGATTACCTCCGACTGCGTCTTGA 3'.
Эта пара олигонуклеотидов позволяет включить рестрикционный сайт EcoRI, рестрикционный сайт Xbal и терминирующий кодон в позиции 3' вставки.
Синтез первой цепи кДНК производился элонгацией олигонуклеотида FC102 после гибридизации последнего с РНК-матрицей.
Условиями синтеза первой цепи кДНК являются: температура 42°С в течение 15 минут, затем 99°С в течение 5 минут и в заключение 4°С в течение 5 минут. Для получения фрагмента длиной 302 п.о. условиями проведения ПЦР в присутствии пары олигонуклеотидов FC101 и FC102 являются: температура 95°С в течение 2 минут, затем 35 циклов (95°С в течение 1 минуты, 62°С в течение 1 минуты, 72°С в течение 2 минут) и в заключение температура 72°С в течение 7 минут.
Этот фрагмент расщепляли сначала с помощью EcoRI, затем с помощью Xbal и использовали для выделения после электрофореза в геле агарозы фрагмента EcoRI-Xbal длиной около 290 п.о. Этот фрагмент называется фрагментом А.
Плазмида для эукариотической экспрессии pVR1020 (C.J.Luke и др., J. of Infectious Diseases. 1997 г., №175, стр.95-97), являющаяся производной плазмиды pVR1012 (фиг.1, пример 7, WO-A-98/03199; Hartikka J. и др., 1997 г., Human Gene Therapy, №7, стр.1205-1217), содержит кодирующую рамку сигнальной последовательности активатора человеческого тканевого плазминогена (tPA).
Плазмиду pVR 1020 модифицировали путем расщепления BamHI-BgIII и инсерции последовательности, содержащей несколько сайтов для клонирования (BamHI, Notl, EcoRI, Xbal, PmII, Pstl, BgIII) и образующейся в результате спаривания следующих олигонуклеотидов:
РВ326 (40-мер) (SEQ ID NO:3)
5' GATCTGCAGCACGTGTCTAGAGGATATCGAATTCGCGGCC 3' и РВ329 (40-мер) (SEQ ID NO:4)
5'GATCCGCGGCCGCGAATTCGATATCCTCTAGACACGTGCT3'.
Полученный таким образом вектор имеет размер около 5105 пар оснований и называется рАВ110.
Фрагмент А лигировали с экспрессионной плазмидой рАВ110, которая предварительно была расщеплена с помощью Xbal и EcoRI, с образованием плазмиды pFC101 (5376 п.о.). Под контролем раннего промотора человеческого цитомегаловируса или hCMV-IE (немедленно-ранний промотор цитомегаловируса человека) эта плазмида содержала вставку, кодирующую сигнальную последовательность активатора человеческого тканевого плазминогена tPA, за которой следовала последовательность, кодирующая белок prM.
Пример 4. Конструирование плазмиды pFC102
Комплементарную ДНК (кДНК) вируса западно-нильской лихорадки NY99 синтезировали с помощью набора "Gene Amp RNA PCR Kit" (Cat #N 8080017, Perkin-Elmer, Norwalk, CT 06859, США) в условиях, предписанных поставщиком.
Реакцию обратной транскрипции, с последующей полимеразной цепной реакцией (реакция "ОТ-ПЦР"), проводили с использованием 50 мкл суспензии вирусной РНК вируса западно-нильской лихорадки NY99 (пример 2) и следующих олигонуклеотидов:
FC103 (30-мер) (SEQ ID NO:5)
5' TTTTTTGAATTCTCACTGACAGTGCAGACA 3'
и FC104 (33-мер) (SEQ ID NO:6)
5' TTTTTTTCTAGATTAGCTGTAAGCTGGGGCCAC 3'.
Эта пара олигонуклеотидов позволяет ввести рестрикционный сайт EcoRI, рестрикционный сайт Xbal и терминирующий кодон в позиции 3' вставки.
Синтез первой цепи кДНК проводили путем элонгации олигонуклеотида FC104 после гибридизации последнего с РНК-матрицей.
Условиями синтеза первой цепи кДНК являются: температура 42°С в течение 15 минут, затем 99°С в течение 5 минут и в заключение 4°С в течение 5 минут. Для получения фрагмента длиной 252 п.о. условиями проведения ПЦР в присутствии пары олигонуклеотидов FC103 и FC104 являются: температура 95°С в течение 2 минут, затем 35 циклов (95°С в течение 1 минуты, 62°С в течение 1 минуты, 72°С в течение 2 минут) и в заключение температура 72°С в течение 7 минут.
Этот фрагмент расщепляли сначала с помощью EcoRI, затем с помощью Xbal с целью выделения после электрофореза в геле агарозы фрагмента EcoRI-Xbal длиной около 240 п.о. Этот фрагмент лигировали с экспрессионной плазмидой рАВ110 (пример 3), которая предварительно была расщеплена с помощью Xbal и EcoRI, с образованием плазмиды pFC102 (5326 п.о.). Под контролем раннего промотора человеческого цитомегаловируса или hCMV-IE (немедленно-ранний промотор цитомегаловируса человека) эта плазмида содержала вставку, кодирующую сигнальную последовательность активатора человеческого тканевого плазминогена tPA, за которой следовала последовательность, кодирующая белок М.
Пример 5. Конструирование плазмиды pFC103
Комплементарную ДНК (кДНК) вируса западно-нильской лихорадки NY99 синтезировали с помощью набора "Gene Amp RNA PCR Kit" (Cat #N 8080017, Perkin-Elmer, Norwalk, CT 06859, США) в условиях, предписанных поставщиком.
Реакцию обратной транскрипции, с последующей полимеразной цепной реакцией (реакция "ОТ-ПЦР") проводили с использованием 50 мкл суспензии вирусной РНК вируса западно-нильской лихорадки NY99 (пример 2) и следующих олигонуклеотидов:
FC105 (30-мер) (SEQ ID NO:7)
5' TTTTTTGAATTCTTCAACTGCCTTGGAATG 3'
и FC106 (33-мер) (SEQ ID NO:8)
5' TTTTTTTCTAGATTAAGCGTGCACGTTCACGGA 3'.
Эта пара олигонуклеотидов позволяет встроить рестрикционный сайт EcoRI, рестрикционный сайт Xbal и терминирующий кодон в позиции 3' вставки.
Синтез первой цепи кДНК проводили путем элонгации олигонуклеотида FC106 после гибридизации последнего с РНК-матрицей.
Условиями синтеза первой цепи кДНК являются: температура 42°С в течение 15 минут, затем 99°С в течение 5 минут и в заключение 4°С в течение 5 минут. Для получения фрагмента длиной 1530 п.о. условиями проведения ПЦР в присутствии пары олигонуклеотидов FC105 и FC106 являются: температура 95°С в течение 2 минут, затем 35 циклов (95°С в течение 1 минуты, 62°С в течение 1 минуты, 72°С в течение 2 минут) и в заключение температура 72°С в течение 7 минут.
Этот фрагмент расщепляли сначала с помощью EcoRI, затем с помощью Xbal с целью выделения после электрофореза в геле агарозы фрагмента EcoRI-Xbal длиной около 1518 п.о. Указанный фрагмент лигировали с экспрессионной плазмидой рАВ110 (пример 3), которая предварительно была расщеплена с помощью Xbal и EcoRI, с получением плазмиды pFC103 (6604 п.о.). Эта плазмида содержала под контролем раннего промотора человеческого цитомегаловируса или hCMV-IE (немедленно-ранний промотор цитомегаловируса человека) вставку, кодирующую сигнальную последовательность активатора человеческого тканевого плазминогена tPA, за которой следовала последовательность, кодирующая белок Е.
Пример 6. Конструирование плазмиды pFC104
Комплементарную ДНК (кДНК) вируса западно-нильской лихорадки NY99 синтезировали с помощью набора "Gene Amp RNA PCR Kit" (Cat #N 8080017, Perkin-Elmer, Norwalk, CT 06859, США) в условиях, предписанных поставщиком.
Реакцию обратной транскрипции с последующей полимеразной цепной реакцией (реакция "ОТ-ПЦР") проводили с использованием 50 мкл суспензии вирусной РНК вируса западно-нильской лихорадки NY99 (пример 2) и следующих олигонуклеотидов:
FC101 (30-мер) (SEQ ID NO:l) и FC106 (33-мер) (SEQ ID NO:8).
Эта пара олигонуклеотидов позволяет встроить рестрикционный сайт EcoRI, рестрикционный сайт Xbal и терминирующий кодон в позиции 3' вставки.
Синтез первой цепи кДНК проводился путем элонгации олигонуклеотида FC106 после гибридизации последнего с РНК-матрицей.
Условиями синтеза первой цепи кДНК являются: температура 42°С в течение 15 минут, затем 99°С в течение 5 минут и в заключение 4°С в течение 5 минут. Для получения фрагмента данной 2031 п.о. условиями проведения ПЦР в присутствии пары олигонуклеотидов FC101 и FC106 являются: температура 95°С в течение 2 минут, затем 35 циклов (95°С в течение 1 минуты, 62°С в течение 1 минуты, 72°С в течение 2 минут) и в заключение температура 72°С в течение 7 минут.
Этот фрагмент расщепляли сначала с помощью EcoRI, затем с помощью Xbal с целью выделения после электрофореза в геле агарозы фрагмента EcoRI-Xbal длиной около 2019 п.о. Указанный фрагмент лигировали с экспрессионной плазмидой рАВ110 (пример 3), которую предварительно расщепляли с помощью Xbal и EcoRI, получая плазмиду pFC104 (7105 п.о.). Эта плазмида содержала вставку, кодирующую сигнальную последовательность активатора человеческого тканевого плазминогена tPA, за которой следовала последовательность, кодирующая белок prM-М-Е, под контролем раннего промотора человеческого цитомегаловируса, или hCMV-IE (немедленно-ранний промотор цитомегаловируса человека).
Пример 7. Конструирование плазмиды pFC105
Комплементарную ДНК (кДНК) вируса западно-нильской лихорадки NY99 синтезировали с помощью набора "Gene Amp RNA PCR Kit" (Cat #N 8080017, Perkin-Elmer, Norwalk, CT 06859, США) в условиях, предписанных поставщиком.
Реакцию обратной транскрипции с последующей полимеразной цепной реакцией (реакция "ОТ-ПЦР") проводили с использованием 50 мкл суспензии вирусной РНК вируса западно-нильской лихорадки NY99 (пример 2) и следующих олигонуклеотидов:
FC107 (30-мер) (SEQ ID NO:9)
5' TTTTTTGATATCACCGGAATTGCAGTCATGATTGGC 3'
и FC106 (33-мер) (SEQ ID NO:8).
Эта пара олигонуклеотидов позволяет ввести рестрикционный сайт EcoRV, рестрикционный сайт Xbal и терминирующий кодон в позиции 3" вставки.
Синтез первой цепи кДНК проводили путем элонгации олигонуклеотида FC106 после гибридизации последнего с РНК-матрицей.
Условиями синтеза первой цепи кДНК являются: температура 42°С в течение 15 минут, затем 99°С в течение 5 минут и в заключение 4°С в течение 5 минут. Для получения фрагмента длиной 2076 п.о. условиями проведения ПЦР в присутствии пары олигонуклеотидов FC106 и FC107 являются: температура 95°С в течение 2 минут, затем 35 циклов (95°С в течение 1 минуты, 62°С в течение 1 минуты, 72°С в течение 2 минут) и в заключение температура 72°С в течение 7 минут.
Этот фрагмент расщепляли сначала с помощью EcoRV, затем с помощью Xbal с целью выделения после электрофореза в геле агарозы фрагмента EcoRV-Xbal длиной около 2058 п.о.
Указанный фрагмент лигировали с экспрессионнной плазмидой pVR1012, которую предварительно расщепляли с помощью Xbal и EcoRV, получая плазмиду pFC105 (6953 п.о.). Эта плазмида содержала вставку, кодирующую полипротеин prM-М-Е, под контролем раннего промотора человеческого цитомегаловируса, или hCMV-IE (немедленно-ранний промотор цитомегаловируса человека).
Пример 8. Конструирование плазмиды pFC106
Комплементарную ДНК (кДНК) вируса западно-нильской лихорадки NY99 синтезировали с помощью набора "Gene Amp RNA PCR Kit" (Cat #N 8080017, Perkin-Elmer, Norwalk, CT 06859, США) в условиях, предписанных поставщиком.
Реакцию обратной транскрипции с последующей полимеразной цепной реакцией (реакция "ОТ-ПЦР") проводили с использованием 50 мкл суспензии вирусной РНК вируса западно-нильской лихорадки NY99 (пример 2) и следующих олигонуклеотидов:
FC108 (36-мер) (SEQ ID NO:10)
5' TTTTTTGATATCATGTATAATGCTGATATGATTGAC 3'
и FC109 (З6-мер) (SEQ ID NO: 11)
5'TTTTTTTCTAGATTAACGTTTTCCCGAGGCGAAGTC 3'
Эта пара олигонуклеотидов позволяет включить рестрикционный сайт EcoRV, рестрикционный сайт Xbal, инициириующий кодон ATG в позиции 5' и терминирующий кодон в позиции 3' вставки.
Синтез первой цепи кДНК проводился путем элонгации олигонуклеотида FC109 после гибридизации последнего с РНК-матрицей.
Условиями синтеза первой цепи кДНК являются: температура 42°С в течение 15 минут, затем 99°С в течение 5 минут и в заключение 4°С в течение 5 минут. Для получения фрагмента длиной 2973 п.о. условиями проведения ПЦР в присутствии пары олигонуклеотидов FC108 и FC109 являются: температура 95°С в течение 2 минут, затем 35 циклов (95°С в течение 1 минуты, 62°С в течение 1 минуты, 72°С в течение 2 минут) и в заключение температура 72°С в течение 7 минут.
Этот фрагмент расщепляли сначала с помощью EcoRV, затем с помощью Xbal с целью выделения после электрофореза в геле агарозы фрагмента EcoRV-Xbal длиной около 2955 п.о.
Указанный фрагмент лигировали с экспрессионной плазмидой pVR1012, которую предварительно расщепляли с помощью Xbal и EcoRV, получая плазмиду pFC106 (7850 п.о.). Эта плазмида содержала вставку, кодирующую полипротеин NS2A-NS2B-NS3, под контролем раннего промотора человеческого цитомегаловируса, или hCMV-IE (немедленно-ранний промотор цитомегаловируса человека).
Пример 9. Конструирование плазмиды-донора для инсерции в сайт С5 вируса оспы канареек ALVAC
На фиг.16 описания изобретения US-A-5 756 103 приведена последовательность фрагмента длиной 3199 п.о. геномной ДНК вируса оспы канареек. Анализ этой последовательности обнаружил открытую рамку считывания (ORF), которую обозначили C5L и которая начинается в позиции 1538 и оканчивается в позиции 1859. Конструирование инсерционной плазмиды, приводящей к делеции ORF C5L и ее замещению сайтом множественного клонирования, фланкированным сигналами прерывания транскрипции и трансляции, проводилось, как описано ниже.
Реакция ПЦР проводилась на основе матрицы, представленной геномной ДНК вируса оспы канареек, с использованием следующих олигонуклеотидов:
С5А1 (42-мер) (SEQ ID NO: 12)
5' ATCATCGAGCTCCAGCTGTAATTCATGGTCGAAAAGAAGTGC 3'
и С5В1 (73-мер) (SEQ ID NO: 13)
5'GAATTCCTCGAGCTGCAGCCCGGGTTTTTATAGCTAATTAGTCATTTTTTGA GAGTACCACTTCAGCTACCTC 3' с целью выделения ПНР-фрагмента длиной 223 п.о. (фрагмент В).
Реакцию ПЦР проводили на основе матрицы, представленной геномной ДНК вируса оспы канареек, с использованием следующих олигнуклеотидов:
С5С1 (72-мер) (SEQ ID NO: 14):
5'CCCGGGCTGCAGCTCGAGGAATTCTTTTTATTGATTAACTAGTCATTATAAA GATCTAAAATGCATAATTTC 3'
и C5D1 (45-мер) (SEQ ID NO: 15):
5'GATGATGGTACCGTAAACAAATATAATGAAAAGTATTCTAAACTA3' с целью выделения ПЦР-фрагмента длиной 482 п.о. (фрагмент С).
Фрагменты В и С подвергли совместной гибридизации для использования в качестве матрицы во время реакции ПЦР, проводившейся с использованием олигонуклеотидов С5А1 (последовательность ID №12) и C5D1 (последовательность ID №15), для получения ПЦР-фрагмента длиной 681 п.о. Этот фрагмент был расщеплен рестрикционными ферментами Sacl и Kpnl для выделения после электрофореза в геле агарозы фрагмента Sacl-Kpnl длиной 664 п.о. Указанный фрагмент лигировали с вектором pBlueScript® II SK+ (Stratagene, La Jolla, CA, USA, Cat # 212205), который предварительно расщепляли рестрикционными ферментами Sacl и Kpnl, для получения плазмиды pC5L. Последовательность этой плазмиды проверялась секвенированием. Эта плазмида содержала 166 п.о. последовательности, расположенной выше ORF C5L ("левое фланкирующее плечо С5"), сигнал раннего прерывания транскрипции вируса осповакцины, терминирующие кодоны в 6 фазах считывания, сайт множественного клонирования, содержащий рестрикционные сайты Smal, Pstl, Xhol и EcoRI, а также 425 п.о. последовательности, расположенной ниже ORP C5L ("правое фланкирующее плечо С5").
Плазмида pMP528HRH (Perkus М. и др., J. Virol, 1989 г., №63, стр.3829-3836) использовалась в качестве матрицы для амплификации полной последовательности промотора Н6 осповакцины (GenBank, номер доступа V28351) с использованием следующих олигонуклеотидов:
JCA291 (34-мер) (SEQ ID NO: 16)
5'AAACCCGGGTTCTTTATTCTATACTTAAAAAGTG 3'
и JCA292 (43-мер) (SEQ ID NO: 17)
5'AAAAGAATTCGTCGACTACGATACAAACTTAACGGATATCGCG3'
для амплификации ПЦР-фрагмента длиной 149 п.о. Этот фрагмент расщепляли рестрикционными ферментами Smal и EcoRI для выделения после электрофореза в геле агарозы рестрикционного фрагмента Smal-EcoRI длиной 138 п.о. Указанный фрагмент был лигирован с плазмидой pC5L, предварительно расщепленной с помощью Smal и EcoRI, для получения плазмиды pFC107.
Пример 10. Конструирование рекомбиниантного вируса vCP1712
Реакцию ПЦР проводили с использованием плазмиды pFC105 (пример 7) в качестве матрицы и следующих олигонуклеотидов:
FC110 (33-мер) (SEQ ID NO:18):
5'TTTTCGCGAACCGGAATTGCAGTCATGATTGGC3'
и FC 111 (39-мер) (SEQ ID NO:19)
5'TTTTGTCGACGCGGCCGCTTAAGCGTGCACGTTCACGGA3'
для амплификации ПЦР-фрагмента длиной около 2079 п.о. Этот фрагмент расщепляли рестрикционными ферментами Nrul и Sall для выделения после электрофореза в геле агарозы рестрикционного фрагмента Nrul-Sall длиной около 2068 п.о. Затем этот фрагмент лигировали с плазмидой pFC107 (пример 9), предварительно расщепленной рестрикционными ферментами Nrul и Sall, для получения плазмиды pFC108.
Плазмиду pFC108 линеаризовали с помощью Notl, затем трансфицировали в первичные клетки куриного эмбриона, инфицированные вирусом оспы канареек (штамм ALVAC), используя описанный выше способ осаждения фосфатом кальция (Panical и Paoletti Proc. Nat. Acad. Sci., 1982 г., №79, стр.4927-4931; Piccini и др., In Methods in Enzymology, 1987 г., №153, стр.545-563. Eds. Wu R. and Grossman L. Academic Press). Положительные бляшки отбирали на основе гибридизации с изотопно-меченным зондом, специфичным к нуклеотидной последовательности гликопротеина оболочки Е. Эти бляшки подвергали четырем последовательным циклам отбора/очистки бляшек до выделения чистой популяции. Бляшку, представляющую результат рекомбинации in vitro между донорной плазмидой pFC108 и геномом вируса оспы канареек ALVAC, затем амплифицировали, и шток полученного рекомбинантного вируса обозначили VCP1712.
Пример 11. Конструирование рекомбинантного вируса VCP1713
Плазмиду pFC104 (пример 6) расщепляли с помощью рестрикционных ферментов Sall и Pmll для выделения после электрофореза в геле агарозы рестрикционного фрагмента Pmall-Sall длиной около 2213 п.о. Этот фрагмент лигировали с плазмидой pFC107 (пример 9), которую предварительно расщепляли рестрикционными ферментами Nrul и Sall, для получения плазмиды pFC109.
Плазмиду pFC109 линеаризировали с помощью Notl, затем трансфицировали в первичные клетки куриного эмбриона, инфицированные вирусом оспы канареек (штамм ALVAC), используя способ из примера 10. Бляшку, представляющую результат рекомбинации in vitro между плазмидой-донором pFC109 и геномом вируса оспы канареек ALVAC, отбирали на основе гибридизации с изотопно-меченным зондом, специфичным к нуклеотидной последовательности гликопротеина оболочки Е, и подвергли амплификации. Шток полученного рекомбинантного вируса обозначили VCP1713.
Пример 12. Конструирование рекомбинантного вируса VCP1714
Плазмиду рFС103 (пример 5) расщепляли с помощью рестрикционных ферментов Sall и Pmll для выделения после электрофореза в геле агарозы рестрикционного фрагмента Pmll-Sall длиной около 1712 п.о. Этот фрагмент лигировали с плазмидой pFC107 (пример 9), которую предварительно расщепляли рестрикционными ферментами Nrul и Sall, для получения плазмиды pFC110.
Плазмиду pFC110 линеаризировали с помощью Noti, затем трансфицировали в первичные клетки куриного эмбриона, инфицированные вирусом оспы канареек (штамм ALVAC), используя способ из примера 10. Бляшку, представляющую результат рекомбинации in vitro между плазмидой-донором pFC110 и геномом вируса оспы канареек ALVAC, отбирали на основе гибридизации с изотопно-меченным зондом, специфичным к нуклеотидной последовательности гликопротеина оболочки Е, и подвергали амплификации. Шток полученного рекомбинантного вируса обозначили vCP1714.
Пример 13. Конструирование рекомбинантного вируса VCP1715
Плазмиду pFC102 (пример 4) расщепляли с помощью рестрикционных ферментов Sall и Pmll для выделения после электрофореза в геле агарозы рестрикционного фрагмента Pmll-Sall длиной около 434 п.о. Этот фрагмент лигировали с плазмидой pFC107 (пример 9), которую предварительно расщепляли рестрикционными ферментами Nrul и Sall, для получения плазмиды pFC111.
Плазмиду pFC111 линеаризировали с помощью Notl, затем трансфицировали в первичные клетки куриного эмбриона, инфицированные вирусом оспы канареек (штамм ALVAC), используя способ из примера 10. Бляшку, представляющую результат рекомбинации in vitro между плазмидой-донором pFC111 и геномом вируса оспы канареек ALVAC, отбирали на основе гибридизации с изотопно-меченным зондом, специфичным к нуклеотидной последовательности гликопротеина мембраны М, и подвергали амплификации. Шток полученного рекомбинантного вируса обозначили VCP1715.
Пример 14. Конструирование рекомбинантного вируса VCP1716
Плазмиду pFC101 (пример 3) расщепляли с помощью рестрикционных ферментов Sall и Pmll для выделения после электрофореза в геле агарозы рестрикционного фрагмента Pmll-Sall длиной около 484 п.о. Этот фрагмент лигировали с плазмидой pFC107 (пример 9), которую предварительно расщепляли рестрикционными ферментами Nrul и Sall, для получения плазмиды pFC112.
Плазмиду pFC112 линеаризировали с помощью Notl, затем трансфицировали в первичные клетки куриного эмбриона, инфицированные вирусом оспы канареек (штамм ALVAC), используя способ из примера 10. Бляшку, представляющую результат рекомбинации in vitro между плазмидой-донором pFC112 и геномом вируса оспы канареек ALVAC, отбирали на основе гибридизации с изотопно-меченным зондом, специфичным к нуклеотидной последовательности гликопротеина предмембраны prM, и подвергали амплификации. Шток полученного рекомбинантного вируса обозначили vCP1716.
Пример 15. Конструирование плазмиды-донора для инсерции в сайт С6 вируса оспы канареек ALVAC
На фиг.4 описания изобретения WO-A-01/05934 представлена последовательность фрагмента длиной 3700 п.о. геномной ДНК вируса оспы канареек. Анализ этой последовательности обнаружил открытую рамку считывания (ORF), которую обозначили C6L и которая начинается в позиции 377 и оканчивается в позиции 2254. Конструирование инсерционной плазмиды, приводящей к делеции ORF C6L и к ее замещению сайтом множественного клонирования, фланкированным сигналами прерывания транскрипции и трансляции, проводилось, как описано ниже.
Реакция ПЦР проводилась на основе матрицы, представленной геномной ДНК вируса оспы канареек, с использованием следующих олигонуклеотидов:
С6А1 (42-мер) (SEQ ID NO:20)
5' ATCATCGAGCTCGCGGCCGCCTATCAAAAGTCTTAATGAGTT 3'
и С6В1 (73-мер) (SEQ ID NO:21)
5'GAATTCCTCGAGCTGCAGCCCGGGTTTTTATAGCTAATTAGTCATTTTTTCGT AAGTAAGTATTTTTATTTAA 3' с целью выделения ПЦР-фрагмента длиной 432 п.о. (фрагмент D).
Реакцию ПЦР проводили на основе матрицы, представленной геномной ДНК вируса оспы канареек, с использованием следующих олигнуклеотидов:
С6С1 (72-мер) (SEQ ID NO:22)
5'CCCGGGCTGCAGCTCGAGGAATTCTTTTTATrGATTAACTAGTCAAATGAGT ATATATAATTGAAAAAGTAA 3'
и C6D1 (45-мер) (SEQ ID NO:23)
5'GATGATGGTACCTTCATAAATACAAGTTTGATTAAACTTAAGTTG3'
с целью выделения ПЦР-фрагмента длиной 1210 п.о. (фрагмент Е).
Фрагменты D и Е подвергали совместной гибридизации для использования в качестве матрицы в реакции ПЦР, проводившейся с применением олигонуклеотидов С6А1 (SEQ ID NO:20) и C6D1 (SEQ ID NO:23), для получения ПЦР-фрагмента длиной 1630 п.о. Этот фрагмент расщепляли рестрикционными ферментами Sacl и Kpnl для выделения после электрофореза в геле агарозы фрагмента Sacl-Kpnl длиной 1613 п.о. Указанный фрагмент лигировали с вектором pBlueScript® II SK+ (Stratagene, La Jolla, CA, USA, Cat # 212205), который предварительно расщепляли рестрикционными ферментами Sacl и Kpnl, для получения плазмиды pC6L. Последовательность этой плазмиды проверялась секвенированием. Эта плазмида содержала 370 п.о. последовательности, расположенной выше ORF C6L ("левое фланкирующее плечо С6"), сигнал раннего прерывания транскрипции вируса осповакцины, терминирующие кодоны в 6 фазах считывания, сайт множественного клонирования, содержащий рестрикционные сайты Smal, Pstl, Xhol и EcoRI, а также 1156 п.о. последовательности, расположенной ниже ORF C6L ("правое фланкирующее плечо С6").
Плазмида pMPIVC (Schmitt J.F.C. и др., J. Virol, 1988 г., №62, стр.1889-1897;
Saiki R.K. и др., Science, 1988 г., стр.487-491) использовалась в качестве матрицы при амплификации полной последовательности промотора 13L вируса осповакцины с использованием следующих олигонуклеотидов:
FC113 (33-мер) (SEQ ID NO:24)
5'AAACCCGGGCGGTGGTTTGCGATTCCGAAATCT3'
и FC113 (43-мер) (SEQ ID NO:25)
5'AAAAGAATTCGGATCCGATTAAACCTAAATAATTGTACTTrGT3'
для амплификации ПЦР-фрагмента длиной 151 п.о. Этот фрагмент расщепляли рестрикционными ферментами Smal и EcoRI для выделения после электрофореза в геле агарозы рестрикционного фрагмента Smal-EcoRI длиной 136 п.о. Этот фрагмент лигировали с плазмидой pC6L, предварительно расщепленной с помощью Smal и EcoRI, для получения плазмиды pFC113.
Пример 16. Конструирование рекомбинантных вирусов vCP1717 и vCP1718
Реакцию ПЦР проводили с использованием плазмиды pFC106 (пример 8) в качестве матрицы и следующих олигонуклеотидов:
FC114 (33-мер) (SEQ ID NO:26)
5'TTTCACGTGATGTATAATGCTGATATGATTGAC3'
и FC115 (42-мер) (SEQ ID NO:27)
5'TTTTGGATCCGCGGCCGCTTAACGTTTTCCCGAGGCGAAGTC3'
для амплификации ПЦР-фрагмента размером около 2973 п.о. Этот фрагмент расщепляли рестрикционными ферментами Pmll и BamHl для выделения после электрофореза в геле агарозы рестрикционного фрагмента Pmll-BamHl размером около 2958 п.о. (фрагмент F). Плазмиду pFC113 (пример 15) расщепляли с помощью рестрикционных ферментов Pmll и BamHl для выделения после электрофореза в геле агарозы рестрикционного фрагмента Pmll-BamHl размером около 4500 п.о. (фрагмент G). Фрагменты F и G лигировали друг с другом для получения плазмиды pFC114.
Плазмиду pFC114 линеаризовали с помощью Notl, затем трансфицировали в первичные клетки куриного эмбриона, инфицированные вирусом оспы канареек vCP1713 (пример 11), используя описанный выше способ осаждения фосфатом кальция (Panicali и Paoletti Proc. Nat. Acad. Sci., 1982 г., №79, стр.4927-4931; Piccini и др.. In Methods in Enzymology, 1987 г., №153, стр.545-563. Eds. Wu R. and Grossman L. Academic Press). Положительные бляшки отбирали на основе гибридизации с изотопно-меченным зондом, специфичным к нуклеотидной последовательности гликопротеина оболочки Е. Эти бляшки подвергали четырем последовательным циклам отбора/очистки до выделения чистой популяции. Бляшку, представлявшую результат рекомбинации in vitro между плазмидой pFC114 и геномом вируса оспы канареек ALVAC, затем амплифицировали, и шток полученного рекомбинантного вируса обозначили vCP1717.
Линеаризованная с помощью Notl плазмида pFC114 также была использована для трансфекции первичных клеток куриного эмбриона, инфицированных вирусом оспы канареек vCP1712 (пример 10), с применением описанного выше способа. Шток полученного при этом рекомбинантного вируса обозначили vCP1718.
Пример 17. Конструирование плазмиды pFC115
Комплементарную ДНК (кДНК) вируса западно-нильской лихорадки NY99 синтезировали с помощью набора "Gene Amp RNA PCR Kit" (Cat # N 8080017, Perkin-Elmer, Norwalk, CT 06859, США) в условиях, предписанных поставщиком.
Реакцию обратной транскрипции с последующей полимеразной цепной реакцией (реакция "ОТ-ПЦР") проводили с применением 50 мкл суспензии вирусной РНК вируса западно-нильской лихорадки NY99 (пример 2) и следующих олигонуклеотидов:
FC116 (39-мер) (SEQ ID NO:28)
5'TTTTTTGATATCATGACCGGAATTGCAGTCATGATTGGC3'
и FC106 (33-мер) (SEQ ID NO:8).
Эта пара олигонуклеотидов позволяет ввести рестрикционный сайт EcoRV, рестрикционный сайт Xbal и инициириующий кодон в позиции 5', а терминирующий кодон в позиции 3' вставки.
Синтез первой цепи кДНК проводится путем элонгации олигонуклеотида FC106 после гибридизации последнего с РНК-матрицей.
Условиями синтеза первой цепи кДНК являются: температура 42°С в течение 15 минут, затем 99°С в течение 5 минут и в заключение 4°С в течение 5 минут. Для получения фрагмента длиной 2079 п.о. условиями проведения ПЦР в присутствии пары олигонуклеотидов FC106 и FC116 являются: температура 95°С в течение 2 минут, затем 35 циклов (95°С в течение 1 минуты, 62°С в течение 1 минуты, 72°С в течение 2 минут) и в заключение температура 72°С в течение 7 минут.
Этот фрагмент расщепляли сначала с помощью EcoRV, затем с помощью Xbal с целью выделения после электрофореза в геле агарозы фрагмента EcoRV-Xbal размером около 2061 п.о.
Указанный фрагмент лигировали с экспрессионной плазмидой pVR1012, которую предварительно расщепляли с помощью Xbal и EcoRV, для получения плазмиды рFС115 (6956 п.о.). Эта плазмида содержала вставку, кодирующую полипротеин prM-М-Е, под контролем раннего промотора человеческого цитомегаловируса, или hCMV-IE (немедленно-ранний промотор цитомегаловируса человека).
Пример 18. Конструирование рекомбинантных вирусов vCP2017
Реакцию ПЦР проводили с использованием плазмиды pFC115 (пример 17) в качестве матрицы и следующих олигонуклеотидов:
FC117 (33-мер) (SEQ ID NO:29)
5'TTTTCGCGAATGACCGGAATTGCAGTCATGATTGGC3'
и FC111 (39-мер) (SEQ ID NO: 19)
для амплификации ПЦР-фрагмента размером около 2082 п.о. Этот фрагмент расщепляли рестрикционными ферментами Nrul и Sall для выделения после электрофореза в геле агарозы рестрикционного фрагмента Nrul-Sall размером около 2071 п.о. Затем эту плазмиду лигировали с плазмидой pFC107 (пример 9), предварительно расщепленной рестрикционными ферментами Nrul и Sall, для получения плазмиды pFC116.
Плазмиду pFC116 линеаризировали с помощью Notl, затем трансфицировали в первичные клетки куриного эмбриона, инфицированные вирусом оспы канареек (штамм ALVAC), используя способ примера 10. Бляшку, представляющую результат рекомбинации in vitro между плазмидой-донором pFC116 и геномом вируса оспы канареек ALVAC, отбирали на основе гибридизации с изотопно-меченным зондом, специфичным к нуклеотидной последовательности глико оболочки Е, и амплифицировали. Шток полученного рекомбинантного вируса обозначили vCP2017.
Пример 19. Приготовление рекомбинантных вакцин
Для приготовления конских вакцин рекомбинантный вирус оспы канареек vCP1712 (пример 10) вводили в растворы карбомера, а именно Carbopol™ 974P, выпускаемый BF Goodrich, штат Огайо, США (молекулярный вес около 3000000).
Резервный 1,5%-ный раствор Carbopol™ 974P приготовили с использованием дистиллированной воды с содержанием 1 г/л хлорида натрия. Этот резервный раствор применяли для приготовления раствора с содержанием 4 мг/мл Carbopol™ 974P в физиологическом растворе. Резервный раствор смешивали с соответствующим объемом физиологического раствора либо в одну стадию, либо в несколько последовательных стадий, при этом значение рН поддерживалось на каждом этапе добавкой 1N раствора гидроксида натрия (или более концентрированного) для получения конечного значения рН 7,3-7,4.
Полученный таким образом готовый к употреблению раствор Carbopol™ 974P использовали для разведения лиофилизированных рекомбинантных вирусов или для разбавления концентрированных резервных растворов рекомбинантных вирусов. Так, например, для получения вирусной суспензии с содержанием 108 б.о.е. на дозу объемом 1 мл резервный вирусный раствор разбавляют до концентрации 108,3 б.о.е. на мл, после чего разбавляют равным объемом указанного готового к употреблению раствора Carbopol™ 974P с концентрацией 4 мг/мл.
Рекомбинантные вакцины могут быть также приготовлены с использованием рекомбинантных вирусов оспы канареек vCP1713 (пример 11) или vCP1717 (пример 16), или vCP1718 (пример 16), или vCP2017 (пример 18), или смеси из трех вирусов оспы канареек vCP1714 (пример 12), vCP1715 (пример 13) и vCP1716 (пример 14), применяя описанный выше способ.
Пример 20. Приготовление конских ДНК-вакцин
Раствор ДНК, содержащий плазмиду pFC104 (пример 6), концентрировали осаждением этанолом, как описано в Sambrook и др. (1989 г.). Осадок ДНК перерастворяли в 0,9%-ном растворе NaCl до концентрации 1 мг/мл. Приготовили 0,75 мМ раствор DMRIE-DOPE растворением лиофилизованного вещества DMRIE-DOPE в соответствующем объеме стерильной воды.
Образования комплексов плазмидной ДНК с липидами достигали разбавлением в равных частях 0,75 мМ раствора DMRIE-DOPE (1: 1) раствором ДНК 1 мг/мл в 0,95%-ном NaCl. Раствор ДНК постепенно вводили через зачеканенную иглу 26G по стенке сосуда с раствором катионного липида, избегая пенообразования. Производили осторожное встряхивание после смешивания обоих растворов. В результате получили композицию с содержанием 0,375 мМ DMRIE-DOPE и 500 мкг/мл плазмиды.
Желательно, чтобы комплект растворов, используемый при всех описанных выше операциях, имел комнатную температуру окружающей среды. Для образования комплекса ДНК/DMRIE-DOPE выдерживали перед иммунизацией животных в течение 30 мин при температуре окружающей среды.
ДНК-вакцины могут быть также получены с помощью растворов ДНК, содержащих плазмиды pFC104 (пример 6) и pCF 106 (пример 8) или плазмиды pFC105 (пример 7) и pCF 106, плазмиды pCF 115 (пример 17) и pFC106 или плазмиды pFC101, pFC102 и pFC103 (примеры 3-5), или плазмиду pFC105 или pFC115 с использованием способа, описанного в данном примере.
Пример 21. Тесты на экспрессию in vitro
Экспрессию белков вируса лихорадки Западного Нила тестировали для каждой конструкции традиционными методами непрямой иммунофлуоресценции и методами Вестерн-блоттинга.
Эти тесты проводились на 96-луночных планшетах, содержавших клетки СНО, выращенные в монослое, и трансфицированных плазмидами или содержавшими клетки CEF, выращенные в монослое и инфицированные рекомбинантными вирусами.
Белки вирусов западно-нильской лихорадки обнаруживали с помощью сывороток инфицированных лошадей или цыплят и меченых антисывороток.
Размер полученных фрагментов после миграции в геле агарозы сравнивали с ожидаемыми размерами.
Пример 22. Эффективность воздействия на животных
Рекомбинантные и плазмидные вакцины вводили в два приема с интервалом около двух недель в организм невакцинированных цыплят EOPS в возрасте около 7 дней внутримышечно в объеме около 0,1 мл. В исследование была включена контрольная невакцинированная группа цыплят.
Цыплятам вводили внутрикожно в шею 103-4 TCID50 патогенного вируса западно-нильской лихорадки.
Наблюдались виремия, антительный ответ и смертность. Вскрытия производились для определения патологических изменений.
Пример 23. Титрование нейтрализующих антител к вирусу лихорадки Западного Нила
Для каждой сыворотки делали серию разведений из расчета 1: 3 в среде DMEM с добавкой 10% эмбриональной телячьей сыворотки в 96-луночных планшетах с клеточной культурой. К 0,05 мл разбавленной сыворотки добавили 0,05 мл культуральной среды, содержавшей приблизительно 100 DICC50/мл вируса западно-нильской лихорадки. Полученную смесь инкубировали в течение 2 часов при температуре 37°С в инкубаторе в атмосфере с 5% CO2.
В каждую смесь затем добавили 0,15 мл суспензии клеток VERO, содержавшей около 100000 клеток на 1 мл. Через 4-5 суток выращивания при температуре 37°С в атмосфере с содержанием 5% СО2 наблюдали через фазово-контрастный микроскоп за цитопатическим эффектом (ЕСР). Нейтрализующие титры каждой сыворотки рассчитывали по методу Кербера. Титры представлены в виде наибольшего разведения, ингибировавшего цитопатический эффект в 50% лунок. Титры выражены в форме log10 VN50. Каждую сыворотку титровали, по меньшей мере, дважды, преимущественно четырежды.
Пример 24. Испытание vCP2017 на лошадях
Рекомбинантные вакцины, содержавшие vCP2017 (пример 18), приготовленные непосредственно перед применением и содержавшие 1 мл адъюванта Carbopol® 974P (4 мг/мл), инъецировали в два приема с интервалом в 35 дней невакцинированным лошадям в возрасте 3 месяцев внутримышечно в объеме около 1 мл. Вакцинировали три группы животных с применением дозы 105,8DICC50 (т.е. 105,64 б.о.е.) для группы 1, 106,8 DICC50 (т.е. 106,64 б.о.е.) для группы 2 и 107,8 DICC50 (т.е. 107,64 б.о.е.) для группы 3. В исследованиях участвовала контрольная невакцинированная группа животных.
Проводили серологическое исследование. Титры нейтрализующих антител были определены и выражены в форме log10 VN50, как указано в примере 23.
Группа | Титры в день 0 | Титры в день 35 |
Титры в день 49 |
1 | <0.6 | <0,78 | 2,66 |
2 | <0,6 | 1,14 | 2,58 |
3 | <0,6 | 1,16 | 2,26 |
Контрольная | <0,6 | <0,6 | <0,6 |
Claims (22)
1. Вакцина для защиты лошадей, собак, кошек, крупного рогатого скота, свиней и птиц от вируса лихорадки Западного Нила, содержащая один или несколько рекомбинантных вирусов оспы птиц NYVAC или MVA и экспрессирующая белки prM, M и Е вируса западно-нильской лихорадки, причем рекомбинантные вирусы содержат один или несколько полинуклеотидов, кодирующих один или несколько белков prM, М и Е, а также содержащая фармацевтически приемлемый носитель или инертное вещество.
2. Вакцина по п.1, отличающаяся тем, что она содержит рекомбинантный вирус оспы птиц, экспрессирующий три белка prM, М и Е.
3. Вакцина по п.1, отличающаяся тем, что она содержит рекомбинантный вирус оспы птиц, содержащий полинуклеотид, образующий рамку считывания, кодирующую prmM-M-E.
4. Вакцина по пп.1, 2 или 3, отличающаяся тем, что рекомбинантным вирусом является вирус оспы канареек.
5. Вакцина по пп.1, 2 или 3, отличающаяся тем, что рекомбинантным вирусом является вирус оспы домашней птицы.
6. Вакцина по любому из пп.1-5, отличающаяся тем, что полинуклеотид кодирует также сигнальный пептид.
7. Вакцина по п.6, отличающаяся тем, что в ней содержится сигнальный пептид вируса лихорадки Западного Нила.
8. Вакцина по п.6, отличающаяся тем, что в ней содержится гетерологичный сигнальный пептид.
9. Вакцина по п.8, отличающаяся тем, что в ней содержится сигнальный пептид тканевого активатора человеческого плазминогена.
10. Вакцина по любому из пп.1-9, отличающаяся тем, что она содержит другой полинуклеотид, кодирующий белок другого штамма вируса западно-нильской лихорадки и/или другого патогенного возбудителя, и/или цитокин.
11. Вакцина по любому из пп.1-10, отличающаяся тем, что она содержит другой экспрессионный вектор, содержащий другой полинуклеотид, кодирующий белок другого штамма вируса западно-нильской лихорадки и/или другого патогенного возбудителя, и/или цитокин.
12. Вакцина по любому из пп.1-11, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит адъювант.
13. Вакцина по п.12, отличающаяся тем, что адъювант выбирают из (1) полимеров акриловой или метакриловой кислоты, полимеров малеинового ангидрида и производного алкилена, (2) иммуностимуляторных последовательностей, (3) эмульсии «масло в воде», (4) катионных липидов, содержащих соль четвертичного аммония, и (5) цитокинов.
14. Вакцина по п.13, отличающаяся тем, что адъювантом является карбомер.
15. Вакцина по п.10 или 13, отличающаяся тем, что цитокином является конский или птичий цитокин.
16. Вакцина по п.15, отличающаяся тем, что цитокин выбирают из интерлейкина 18, интерлейкина 12, интерлейкина 15, MIP-1α, GM-CSF.
17. Вакцина по п.15, отличающаяся тем, что цитокин выбирают из птичьих интерлейкинов cIL-18, cIL-15.
18. Вакцина по п.15, отличающаяся тем, что цитокином является конский GM-CSF.
19. Вакцина по любому из пп.1-18, образующая поливалентную вакцину, отличающаяся тем, что она содержит компонент вакцины против другого патогенного возбудителя.
20. Вакцина по п.19, отличающаяся тем, что вакцинный компонент против другого патогенного возбудителя содержит антиген в виде субъединицы, инактивированного возбудителя или аттенуированного возбудителя.
21. Вакцина по п.19 или 20, отличающаяся тем, что она содержит компонент вакцины против вируса конской ринопневмании, вируса конского гриппа, вируса восточного энцефалита, вируса западного энцефалита, вируса венесуэльского энцефалита, Clostridium tetani и их комбинаций.
22. Вакцина по п.19 или 20, отличающаяся тем, что она содержит компонент против вируса болезни Марека, вируса болезни Ньюкасла (Newcastle), вируса болезни Гумборо (Gwnboro), вируса инфекционного бронхита, вируса инфекционной анемии, вируса инфекционного ларинготрахеита, вируса энцефаломиелита, вируса геморрагического энтерита, вируса пневмовироза, вируса птичьей чумы, вируса гидроперикардита цыплят, птичьего реовируса, Escherichia coli, Mycoplasma gallinarum, Mycoplasma gallisepticum, Haemophilus avium, Pasteurella gallinarum, Pasteurella multocida gallicida и их комбинаций.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
FR01/04737 | 2001-04-06 | ||
FR0104737A FR2823222B1 (fr) | 2001-04-06 | 2001-04-06 | Vaccin contre le virus de la fievre du nil |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2003132455A RU2003132455A (ru) | 2005-04-27 |
RU2283138C2 true RU2283138C2 (ru) | 2006-09-10 |
Family
ID=8862055
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2003132455/13A RU2283138C2 (ru) | 2001-04-06 | 2002-04-05 | Вакцина против вируса западно-нильской лихорадки |
Country Status (22)
Country | Link |
---|---|
EP (2) | EP1377660B1 (ru) |
JP (1) | JP4426761B2 (ru) |
AU (1) | AU2002307971B2 (ru) |
BE (1) | BE2016C021I2 (ru) |
BR (1) | BRPI0208896B1 (ru) |
CA (1) | CA2448796C (ru) |
CY (2) | CY1117676T1 (ru) |
DK (1) | DK1377660T3 (ru) |
ES (2) | ES2566044T3 (ru) |
FR (2) | FR2823222B1 (ru) |
HK (2) | HK1061868A1 (ru) |
HU (2) | HU230122B1 (ru) |
IL (3) | IL158204A0 (ru) |
LT (1) | LTC1377660I2 (ru) |
LU (1) | LU93048I2 (ru) |
MX (1) | MXPA03008998A (ru) |
NL (1) | NL300806I2 (ru) |
PL (2) | PL207584B1 (ru) |
RU (1) | RU2283138C2 (ru) |
SI (1) | SI1377660T1 (ru) |
WO (1) | WO2002081621A2 (ru) |
ZA (1) | ZA200307620B (ru) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US9920347B2 (en) | 2010-11-04 | 2018-03-20 | Academia Sinica | Methods for producing virus particles with simplified glycosylation of surface proteins |
US10307475B2 (en) | 2009-03-27 | 2019-06-04 | Academia Sinica | Methods and compositions for immunization against virus |
Families Citing this family (12)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2004521867A (ja) | 2000-10-27 | 2004-07-22 | イミュノ−アールエックス, インコーポレイテッド | 免疫抑制された患者のためのワクチン免疫療法 |
MXPA04000680A (es) | 2001-07-27 | 2004-04-05 | Wyeth Corp | Vacuna para virus west nile. |
AU2003296974A1 (en) * | 2002-12-13 | 2004-07-14 | Aventis Pasteur, Inc. | Production of alvac on avian embryonic stem cells |
WO2004112694A2 (en) | 2003-05-23 | 2004-12-29 | Chiron Corporation | Immunogenic reagents from west nile virus |
CA2582534A1 (en) | 2004-09-09 | 2006-03-16 | Research Development Foundation | Flavivirus variants having phenotypic variation and immunogenic compositions thereof |
PT2251034T (pt) | 2005-12-02 | 2018-05-22 | Icahn School Med Mount Sinai | Vírus da doença de newcastle quiméricos que apresentam proteínas de superfície não nativas e suas utilizações |
MX2011002071A (es) | 2008-08-29 | 2011-04-05 | Boehringer Ingelheim Vetmed | Vacuna para el virus del nilo occidental. |
WO2010091262A1 (en) | 2009-02-05 | 2010-08-12 | Mount Sinai School Of Medicine Of New York University | Chimeric newcastle disease viruses and uses thereof |
AU2010248761B2 (en) * | 2009-05-15 | 2016-02-11 | Irx Therapeutics, Inc. | Vaccine immunotherapy |
RU2506093C1 (ru) * | 2012-12-06 | 2014-02-10 | Государственное научное учреждение Якутский научно-исследовательский институт сельского хозяйства Российской академии сельскохозяйственных наук | Способ специфической профилактики ринопневмонии, сальмонеллезного аборта и мыта лошадей ассоциированной вакциной в условиях табунного содержания |
BR112015021414B1 (pt) | 2013-03-14 | 2020-11-10 | Icahn School Of Medicine At Mount Sinai | vírus da doença newcastle e seus usos |
WO2015127501A1 (en) | 2014-02-27 | 2015-09-03 | Viralytics Limited | Combination method for treatment of cancer |
Family Cites Families (36)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US2909462A (en) | 1955-12-08 | 1959-10-20 | Bristol Myers Co | Acrylic acid polymer laxative compositions |
US5110587A (en) | 1981-12-24 | 1992-05-05 | Health Research, Incorporated | Immunogenic composition comprising synthetically modified vaccinia virus |
US5505941A (en) | 1981-12-24 | 1996-04-09 | Health Research, Inc. | Recombinant avipox virus and method to induce an immune response |
US5174993A (en) | 1981-12-24 | 1992-12-29 | Health Research Inc. | Recombinant avipox virus and immunological use thereof |
US4769330A (en) | 1981-12-24 | 1988-09-06 | Health Research, Incorporated | Modified vaccinia virus and methods for making and using the same |
US5338683A (en) | 1981-12-24 | 1994-08-16 | Health Research Incorporated | Vaccinia virus containing DNA sequences encoding herpesvirus glycoproteins |
US4722848A (en) | 1982-12-08 | 1988-02-02 | Health Research, Incorporated | Method for immunizing animals with synthetically modified vaccinia virus |
US4603112A (en) | 1981-12-24 | 1986-07-29 | Health Research, Incorporated | Modified vaccinia virus |
US4745051A (en) | 1983-05-27 | 1988-05-17 | The Texas A&M University System | Method for producing a recombinant baculovirus expression vector |
EP0173552B1 (en) | 1984-08-24 | 1991-10-09 | The Upjohn Company | Recombinant dna compounds and the expression of polypeptides such as tpa |
US5168062A (en) | 1985-01-30 | 1992-12-01 | University Of Iowa Research Foundation | Transfer vectors and microorganisms containing human cytomegalovirus immediate-early promoter-regulatory DNA sequence |
US4963481A (en) | 1985-12-18 | 1990-10-16 | Genetics Institute Inc | Promoter system |
US4968615A (en) | 1985-12-18 | 1990-11-06 | Ciba-Geigy Corporation | Deoxyribonucleic acid segment from a virus |
GB2197321B (en) | 1986-09-12 | 1990-10-03 | Genentech Inc | Method and vectors for obtaining continuous production of heterologous protein in a eukaryotic host cell line |
DE3743138A1 (de) | 1987-12-18 | 1989-09-14 | Mayr Christian Gmbh & Co Kg | Schleifringlose, elektromagnetische ueberlastkupplung |
MY109299A (en) * | 1990-08-15 | 1996-12-31 | Virogenetics Corp | Recombinant pox virus encoding flaviviral structural proteins |
US5843456A (en) | 1991-03-07 | 1998-12-01 | Virogenetics Corporation | Alvac poxvirus-rabies compositions and combination compositions and uses |
KR100242671B1 (ko) | 1991-03-07 | 2000-03-02 | 고돈 에릭 | 유전학적으로 처리한 백신 균주 |
US5382425A (en) | 1992-01-13 | 1995-01-17 | Syntro Corporation | Recombinant swinepox virus |
FR2702373B1 (fr) | 1993-03-08 | 1996-06-07 | Rhone Merieux | Emulsions vaccinales fluides eau-dans-l'huile contenant une huile métabolisable. |
EP0668355B1 (en) | 1993-12-20 | 1999-04-07 | Akzo Nobel N.V. | Vaccine for the protection of horses against equine herpesvirus infection |
FR2728795B1 (fr) | 1994-12-30 | 1997-03-21 | Rhone Merieux | Vaccin vivant recombinant aviaire, utilisant comme vecteur un virus herpes aviaire |
FR2728794B1 (fr) | 1994-12-30 | 1997-03-21 | Rhone Merieux | Vaccin recombinant aviaire a base de virus herpes aviaire, notamment contre la maladie de gumboro |
EP0826063A1 (en) | 1995-04-25 | 1998-03-04 | Vical Incorporated | Single-vial formulations of dna/lipid complexes |
DE69740033D1 (de) | 1996-07-03 | 2010-12-09 | Merial Inc | Rekombinanter hunde-adenovirus 2 (cav2), welcher exogene dna enthält |
FR2751227B1 (fr) | 1996-07-19 | 1998-11-27 | Rhone Merieux | Formule de vaccin polynucleotidique contre les pathologies canines, notamment les pathologies respiratoires et digestives |
FR2751225B1 (fr) | 1996-07-19 | 1998-11-27 | Rhone Merieux | Formule de vaccin polynucleotidique aviaire |
FR2751226B1 (fr) | 1996-07-19 | 1998-11-27 | Rhone Merieux | Formule de vaccin polynucleotidique contre les pathologies du cheval |
ATE292980T1 (de) | 1996-10-11 | 2005-04-15 | Univ California | Immunostimulierende oligonucleotidekonjugate |
CZ300172B6 (cs) * | 1997-02-28 | 2009-03-04 | Acambis Inc. | Chimerický živý, infekcní, oslabený virus, lécivopro prevenci nebo lécbu flavivirových infekcí s jeho obsahem a molekula nukleové kyseliny jej kódující |
US7227011B2 (en) * | 1998-06-04 | 2007-06-05 | United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, Centers For Disease Control And Prevention | Nucleic acid vaccines for prevention of flavivirus infection |
US6294176B1 (en) | 1998-07-10 | 2001-09-25 | Schering-Plough Veterinary Corp. | Recombinant raccoonpox virus and uses thereof as a vaccine in mammalian and avian species |
US6416763B1 (en) * | 1998-08-28 | 2002-07-09 | Hawaii Biotechnology Group, Inc. | Recombinant nonstructural protein subunit vaccine against flaviviral infection |
US6645740B1 (en) | 1999-06-10 | 2003-11-11 | Merial Limited | Nucleic acids encodings equine GM-CSF |
JP2003502345A (ja) | 1999-06-10 | 2003-01-21 | メリアル | ペットまたはスポ−ツ用動物のためのdnaワクチン |
FR2796397B1 (fr) | 1999-07-16 | 2006-09-01 | Merial Sas | Genes de calicivirus felin et vaccins notamment vaccins recombines |
-
2001
- 2001-04-06 FR FR0104737A patent/FR2823222B1/fr not_active Expired - Lifetime
-
2002
- 2002-04-05 EP EP02759818.4A patent/EP1377660B1/fr not_active Expired - Lifetime
- 2002-04-05 SI SI200231069A patent/SI1377660T1/sl unknown
- 2002-04-05 BR BRPI0208896A patent/BRPI0208896B1/pt active IP Right Grant
- 2002-04-05 ES ES02759818.4T patent/ES2566044T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2002-04-05 PL PL365210A patent/PL207584B1/pl unknown
- 2002-04-05 CA CA2448796A patent/CA2448796C/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-04-05 IL IL15820402A patent/IL158204A0/xx unknown
- 2002-04-05 PL PL391444A patent/PL210306B1/pl unknown
- 2002-04-05 WO PCT/FR2002/001200 patent/WO2002081621A2/fr active Search and Examination
- 2002-04-05 JP JP2002579985A patent/JP4426761B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 2002-04-05 DK DK02759818.4T patent/DK1377660T3/en active
- 2002-04-05 ES ES15162832T patent/ES2767413T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2002-04-05 RU RU2003132455/13A patent/RU2283138C2/ru active
- 2002-04-05 AU AU2002307971A patent/AU2002307971B2/en not_active Expired
- 2002-04-05 MX MXPA03008998A patent/MXPA03008998A/es active IP Right Grant
- 2002-04-05 EP EP15162832.8A patent/EP2979705B1/fr not_active Expired - Lifetime
- 2002-04-05 HU HU0401868A patent/HU230122B1/hu active Protection Beyond IP Right Term
-
2003
- 2003-09-30 ZA ZA2003/07620A patent/ZA200307620B/en unknown
- 2003-10-01 IL IL158204A patent/IL158204A/en active IP Right Grant
-
2004
- 2004-07-02 HK HK04104755.3A patent/HK1061868A1/zh not_active IP Right Cessation
- 2004-07-02 HK HK16106775.0A patent/HK1219412A1/zh not_active IP Right Cessation
-
2007
- 2007-08-14 IL IL185263A patent/IL185263A0/en active IP Right Grant
-
2015
- 2015-09-18 HU HUS1500047C patent/HUS1500047I1/hu unknown
-
2016
- 2016-04-06 CY CY20161100275T patent/CY1117676T1/el unknown
- 2016-04-19 FR FR16C0014C patent/FR16C0014I2/fr active Active
- 2016-04-20 NL NL300806C patent/NL300806I2/nl unknown
- 2016-04-20 LT LTPA2016011C patent/LTC1377660I2/lt unknown
- 2016-04-26 BE BE2016C021C patent/BE2016C021I2/fr unknown
- 2016-04-26 LU LU93048C patent/LU93048I2/xx unknown
- 2016-05-20 CY CY2016018C patent/CY2016018I2/el unknown
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
LUSTIG S et al. A live attenuated West Nile virus strain as a potential veterinary vaccine. Viral Immunol. 2000; 13(4):401-10. * |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US10307475B2 (en) | 2009-03-27 | 2019-06-04 | Academia Sinica | Methods and compositions for immunization against virus |
US11672853B2 (en) | 2009-03-27 | 2023-06-13 | Academia Sinica | Methods and compositions for immunization against virus |
US9920347B2 (en) | 2010-11-04 | 2018-03-20 | Academia Sinica | Methods for producing virus particles with simplified glycosylation of surface proteins |
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US8535682B2 (en) | Recombinant vaccine against West Nile Virus | |
TWI399213B (zh) | 抗藍舌病病毒之重組疫苗 | |
US20040241191A1 (en) | Recombinant vaccine against West Nile virus | |
RU2283138C2 (ru) | Вакцина против вируса западно-нильской лихорадки | |
US8168200B2 (en) | Vaccine against african horse sickness virus | |
US20040037848A1 (en) | Recombinant vaccine against West Nile Virus | |
US8008268B2 (en) | Vaccines against vesicular stomatitis | |
US20050031641A1 (en) | Recombinant vaccine against West Nile Virus |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
TC4A | Change in inventorship |
Effective date: 20150824 |