JP2004531521A - ウエストナイル熱ウイルスに対するワクチン - Google Patents
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Abstract
本発明は、ナイル熱ウイルス又はＷＮウイルスの構造タンパク質Ｅをコードするポリヌクレオチドを含み、必要に応じて前駆膜タンパク質ｐｒＭ及び／又は膜タンパク質Ｍをコードし、特にｐｒＭ−Ｍ−Ｅをコードする形態におけるポリヌクレオチドに関連する、インビボ又はインビトロで発現する発現ベクターに関する。生ワクチンは、このようなインビボで発現する発現ベクターを取り込んでいる。本発明は、ＷＮウイルスに対するワクチン成分、及び他の病原性物質に対するワクチン成分を含む多価のワクチンにも関する。本発明の対象は、特に、ウマ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ及びトリである。
Description
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウエストナイル熱ウイルスのポリヌクレオチドを少なくとも１つを含み、インビボ及びインビトロで発現する発現ベクター、及びウエストナイル熱に対する免疫原性を有する組成物並びにワクチンに関する。また、かかるウイルスに対する免疫化及びワクチン接種の方法にも関する。
【０００２】
ウエストナイル熱ウイルス（ウエストナイルウイルス又はＷＮＶ）は、１９３７年に初めてウガンダの西ナイル地方で、ヒトにおいて同定された（非特許文献１）。
【０００３】
アフリカで広まり、インド、パキスタン及び地中海湾でも発見され、１９９９年に、アメリカでは初めてニューヨーク市で同定された（非特許文献２）。
【０００４】
ウエストナイル熱ウイルスは、鳥類、哺乳類及びヒトでも発症する。
【０００５】
鳥類における病気の特徴は、中枢神経系の発作と死である。病変は、脳炎、心筋の出血、並びに腸管の出血及び壊死を含む。
【０００６】
カラスで単離したウエストナイル熱ウイルスを、ニワトリに皮下接種して、実験的に感染させたところ、接種の５〜１０日後に心筋の出血、腎炎及び肺炎を、接種の２１日後には中度から重症の脳炎を誘発した（非特許文献３）。
【０００７】
ウエストナイル熱ウイルスは、特に北アフリカ及びヨーロッパで、ウマでも発症する (非特許文献４)。これらのウマは、失調症、後脚の弱さ、又は四肢麻痺と死へ進行する不全麻痺の兆候を示す。ウマやラクダは、脳炎の臨床的兆候を示す主な動物である。
【０００８】
抗ＷＮＶ抗体が、数種類の齧歯類や、家畜動物、特にウシ及びヒツジや、家庭内動物、特にイヌで検出されている (非特許文献５) 。
【０００９】
ヒトは、ウエストナイル熱ウイルスから隔離されておらず、多くの兆候を示している (非特許文献６、非特許文献７) 。
【００１０】
ウエストナイル熱ウイルスは何種類かの蚊(例：イエカ属、ヤブカ属、ハマダラカ)及びマダニの吸血によって、鳥類及び哺乳類に伝染している。
【００１１】
野鳥及び飼育鳥は、ウエストナイル熱ウイルスの宝庫となっており、鳥の移動によって伝播ベクターとなる。
【００１２】
ウエストナイル熱ウイルスのビリオンは、極性が陽性の一本鎖ＲＮＡを含む二十面体のヌクレオカプシドを取り囲むリポタンパク質エンベロープで構成されている、直径５０ｎｍの球状の粒子である。
【００１３】
単一のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、ポリタンパク質の形の全てのウイルスタンパク質をコードしている。このポリタンパク質の分裂及び熟成は、１０種類程の異なるウイルスタンパク質の生成を導く。構造タンパク質は、ゲノムの５’部分によりコードされ、Ｃと名付けたヌクレオカプシド（１４ｋＤａ）と、Ｅ名付けたエンベロープ糖タンパク質（５０ｋＤａ）と、ｐｒＭと名付けた前駆膜タンパク質（２３ｋＤａ）と、Ｍと名付けた膜タンパク質（７ｋＤａ）とに対応する。非構造タンパク質は、ゲノムの３’部分によりコードされ、タンパク質ＮＳ１（４０ｋＤａ）、ＮＳ２Ａ（１９ｋＤａ）、ＮＳ２Ｂ（１４ｋＤａ）、ＮＳ３（７４ｋＤａ）、ＮＳ４Ａ（１５ｋＤａ）、ＮＳ４Ｂ（２９ｋＤａ）及びＮＳ５（９７ｋＤａ）に対応する。
【００１４】
Parrish C. R. et al. (非特許文献８), Kulkarni A. B. et al. (非特許文献９) 及びHill A. B. et al. (非特許文献１０)は、ワクチンのウイルスから、構造タンパク質と必要に応じて会合するKunjinウイルスの非構造タンパク質をコードするヌクレオチド配列に対応する、様々な挿入を含むインビボの発現ベクターを構築した。免疫細胞反応を調べるために、これらのベクターをマウスに投与した。本発明者らは、非構造タンパク質、特にＮＳ３、ＮＳ４Ａ及びＮＳ４Ｂによって主に刺激される細胞反応の重要性を強調した。これらの文献は、ウエストナイル熱のワクチン接種のストラテジーを強調する難しさを示唆している。
【００１５】
現在までに、ＷＮウイルスによる発症を予防するワクチンはない。
【００１６】
【非特許文献１】
Zeller H. G., Med. Trop., 1999, 59, 490-494.
【非特許文献２】
Anderson J. F. et al., Science, 1999, 286, 2331-2333.
【非特許文献３】
Senne D. A. et al., Avian Disease, 2000, 44, 642-649.
【非特許文献４】
Cantile C. et al., Equine Vet. J., 2000, 32(1), 31-35.
【非特許文献５】
Zeller H.G., Med. Trop., 1999, 59, 490-494; Lundstrom J.O., Journal of Vector Ecology, 1999, 24(1), 1-39.
【非特許文献６】
Sampson B. A., Human Pathology, 2000, 31(5), 527-531.
【非特許文献７】
Marra C. M., Seminars in Neurology, 2000, 20(3), 323-327.
【非特許文献８】
J. Gen. Virol., 1991,72, 1645-1653.
【非特許文献９】
J. Virol., 1992, 66(6), 3583-3592.
【非特許文献１０】
J. Gen. Virol., 1992, 73, 1115-1123.
【００１７】
本発明は、ＷＮウイルスによって発症する病気を予防及び／又は治療する方法を提供することに関する。
【００１８】
本発明の他の目的としては、かかるウイルスによって発症する病気にかかりやすい様々な動物の種類、特にウマと鳥類に使用できるような方法を提供することである。
【００１９】
また、本発明の他の目的としては、標的とする種に対する免疫化及びワクチン接種の方法を提案することである。
【００２０】
さらに、本発明の他の目的としては、識別診断を確実に行うことができる手段と方法を提供することである。
【００２１】
つまり、本発明の第一の目的は、ＷＮウイルスのエンベロープタンパク質Ｅをコードするポリヌクレオチドを含む、インビトロ及び／又はインビボにおける発現ベクターである。これらのベクターは、宿主細胞内のポリヌクレオチドの発現に必要な要素も含む。
【００２２】
Ｅをコードするポリヌクレオチドに加えて、本発明の発現ベクターは、ＷＮウイルスの他のタンパク質、好ましくは、ＷＮウイルスの構造タンパク質をコードする、１つ又は複数の他のポリヌクレオチドを含むことができる。これらの配列は、好ましくは、前駆膜タンパク質ｐｒＭ及び膜タンパク質Ｍをコードするものから選択される。
【００２３】
ベクターは、好ましくは、例えばｐｒＭ−Ｅ、Ｍ−Ｅ、特にｐｒＭ−Ｍ−Ｅに対応する、単一のコードするフレームを形成するポリヌクレオチドを含む。異なるタンパク質（例えばｐｒＭ及び／又はＭ及びＥ）をコードする複数の別個のポリヌクレオチドを含むベクターも、本発明の範囲に含まれる。ベクターは、特にインビボで、１つ以上のＷＮウイルス株に対応するポリヌクレオチド、特に異なる菌株のＥ又はｐｒＭ−Ｍ−Ｅをコードする２つ又はそれ以上のポリヌクレオチドを含むことができる。後述するように、ベクター、特にインビボにおけるベクターは、他の病原性物質(pathogenic agent)である免疫原及び／又はサイトカインをコードする、１つ又は複数のヌクレオチド配列を含むことができる。
【００２４】
本発明の好ましい実施態様によると、発現ベクターはｐｒＭ−Ｍ−Ｅをコードするポリヌクレオチドを、好ましくは単一のリーディングフレームの中に含む。
【００２５】
ＷＮウイルスのタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、主として、このタンパク質をコードするＤＮＡ断片、又はこのＤＮＡ断片の相補鎖を意味する。ＲＮＡは除外されていない。
【００２６】
本発明において、タンパク質という用語は、ペプチドとポリペプチドを含む断片を意味する。定義からは、タンパク質断片は免疫的に活性化しており、つまり一度宿主に投与すると、タンパク質に対する体液性及び／又は細胞性の免疫反応を引き起こすことができる。タンパク質断片は、全タンパク質と実質的に同じ免疫活性を有することが好ましい。したがって、本発明のタンパク質断片は、少なくとも１つのエピトープ又は抗原決定基を含む。エピトープの用語は、体液性型（Ｂ細胞）及び／又は細胞性型（Ｔ細胞）の免疫反応を誘導することができる、タンパク質の部位を意味する。
【００２７】
したがって、ポリヌクレオチドの最少構造は、対象となるタンパク質のエピトープ又は抗原決定基をコードするものである。全タンパク質の断片をコードするポリヌクレオチドは、特に最低２１個のヌクレオチド、特に少なくとも４２個のヌクレオチド、好ましくは、派生している配列の連続したヌクレオチドを少なくとも５７、８７又は１５０個含む。エピトープの決定方法は、当業者にとって公知であり、オーバーラップペプチドライブラリー (Hemmer B. et al., Immunology Today, 1998, 19(4), 163-168)、 Pepscan (Geysen H. M. et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1984, 81(13), 3998-4002; Geysen H. M. et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1985, 82(1), 178-182; Van der Zee R. et al., Eur. J. Immunol., 1989, 19(1), 43-47; Geysen H. M., Southeast Asian J. Trop. Med. Public Health, 1990, 21(4), 523-533; Multipin Peptide Synthesis Kits de Chiron)及びアルゴリズム(De Groot A. et al., Nature Biotechnology, 1999, 17, 533-561) を使用することが可能である。
【００２８】
特に、本発明のポリヌクレオチドは、タンパク質ＥのＣ末端に局在する１又は２つ、好ましくは２つの膜貫通領域をコードするヌクレオチド配列を含む。ＷＮＶ ＮＹ９９株では、これらの領域は、GenBank ＡＦ１９６８３５のアミノ酸配列の７４２〜７６６及び７７０〜７９１に対応する。
【００２９】
１つ又は複数のポリヌクレオチドの発現に必要な要素が存在する。それは、最低限、開始コドン（ＡＴＧ）、停止コドン及びプロモーター、さらにプラスミド及びポックスウイルス以外のウイルスベクターのポリアデニル化の配列である。ポリヌクレオチドが、例えばｐｒＭ−Ｅ、Ｍ−Ｅ、ｐｒＭ−Ｍ−Ｅ等のポリタンパク質の断片をコードするとき、ＡＴＧは、リーディングフレームの５'部分に局在し、停止コドンは３'に局在する。後述するように、発現を制御ことができる他の要素も存在することが可能で、それは例えば、エンハンサー、安定化配列、及びタンパク質の分泌を可能にするシグナル配列である。
【００３０】
本発明はこのような発現ベクターの調製物にも関する。より具体的には、薬剤として許容される媒体又は賦形剤の中で、Ｅをコードする、１つ又は複数の上記ポリヌクレオチドを含み発現する、１つ又は複数のインビボの発現ベクターを含む調製物に関する。
【００３１】
本発明の第１の実施態様によると、調製物の中の１つ又は複数の他のベクターは、例えばｐｒＭ、Ｍ又はｐｒＭ−Ｍ等のＷＮウイルスの１つ又は複数の他のタンパク質を含み、発現する。
【００３２】
他の実施態様によれば、調製物の中の１つ又は複数の他のベクターは、１つ又は複数の他のＷＮウイルス株の、１つ又は複数のタンパク質を含み、発現する。特に、調製物は、特にインビボで、同じタンパク質及び／又は異なるタンパク質、好ましくは同じタンパク質をコードする異なるＷＮ株のポリヌクレオチドを発現する、少なくとも２つのベクターを含む。好ましくは、２、３又はそれ以上の異なるＷＮ株の、Ｅ又はｐｒＭ−Ｍ−Ｅを、インビボで発現するベクターに関する。本発明は、異なる菌株のｐｒＭ、Ｍ、Ｅ、ｐｒＭ−Ｍ、ｐｒＭ−Ｅ又はＭ−Ｅを発現するベクターの混合物にも関する。
【００３３】
さらに他の実施態様によると、後述するように、調製の中の１つ又は複数の他のベクターは、１つ又は複数の病原性物質の、１つ又は複数のサイトカイン及び／又は、１つ又は複数のイムノゲンを含み、発現する。
【００３４】
本発明は、これらの実施態様の様々な組合せにも関する。
【００３５】
ｐｒＭ−Ｍ−Ｅをコードするポリヌクレオチドを含み、発現するインビトロ又はインビボの発現ベクターを含む調製は、本発明の好ましい実施態様を構成する。
【００３６】
本発明の特別な実施態様によれば、インビボ又はインビトロの発現ベクターは、ＷＮウイルスの１つ又は複数のポリヌクレオチドとして、タンパク質Ｅをコードし、必要に応じてｐｒＭ及び／又はＭと会合し、好ましくはｐｒＭ−Ｍ−Ｅをコードする１つのポリヌクレオチドと、必要に応じてＷＮウイルスのシグナル配列とを含む。
【００３７】
さらに特別な実施態様によれば、１つ又は複数の非構造タンパク質ＮＳ２Ａ、ＮＳ２Ｂ及びＮＳ３は、同じ発現ベクター又は独自の発現ベクターにより、本発明による構造タンパク質と関連して発現する。好ましくは、それらは単一のヌクレオチドから、共に発現する。
【００３８】
したがって、本発明は、１つ又は複数の非構造タンパク質ＮＳ２Ａ、ＮＳ２Ｂ及びＮＳ３は、同じ発現ベクター又は独自の発現ベクターを介して本発明の構造タンパク質に一緒に発現する。そのタンパク質は、単一のポリヌクレオチドから発現することが好ましい。
【００３９】
したがって、さらに、本発明は、ＮＳ２Ａ、ＮＳ２Ｂ、ＮＳ３及びそれらの組合せ、好ましくはＮＳ２Ａ−ＮＳ２Ｂ−ＮＳ３をコードするポリヌクレオチドを含む、インビボ又はインビトロの発現ベクターにも関する。基本的に、このベクターは、１つ又は複数の構造タンパク質、特にＥ又はｐｒＭ−Ｍ−Ｅを１つ又は複数コードするポリヌクレオチドを含む、上述したベクターの１つであってもよい。さらに、本発明は、非構造タンパク質を発現するこれらのベクターのうち少なくとも１つと、必要に応じて薬剤として許容される媒体又は賦形剤含む、上述した調製に関する。
【００４０】
本発明の発現ベクターを実施するために、当業者は、様々なＷＮウイルス株、及びそのゲノムのヌクレオチド配列に関する文献を持っている。特に、Savage H. M. et al. (Am. J. Trop. Med. Hyg. 1999, 61(4), 600-611) の表２は、２４個のＷＮウイルス株を示し、GenBankのポリヌクレオチド配列の引用方法を示している。
【００４１】
例えば、ＮＹ９９株を引用することができる（GenBank ＡＦ１９６８３５）。GenBankには、それぞれのタンパク質に対応するＤＮＡ配列が明記されている（ｐｒＭには、ヌクレオチド４６６〜７４１、Ｍには、７４２〜９６６、Ｅには９６７〜２４６９、又はｐｒＭ−Ｍ−Ｅには４６６〜２４６９、ＮＳ２Ａには３５２６〜４２１８、ＮＳ２Ｂには４２１９〜４６１１、及びＮＳ３には４６１２〜６４６８、又はＮＳ２Ａ−ＮＳ２Ｂ−ＮＳ３には、３５２６〜６４６８）。配列を比較し、配置することによって、他のＷＮＶ株のあるタンパク質をコードするポリヌクレオチドの決定を即座に決定できる。
【００４２】
上記において、ポリヌクレオチドの用語が、ＷＮウイルスに特異的なタンパク質、断片又はエピトープをコードする配列を意味すること示した。さらに、同じ様に、ポリヌクレオチドの用語は、異なるＷＮウイルス株に対応するヌクレオチド配列と、コードの縮重により区別されるヌクレオチド配列とを含んでいる。
【００４３】
ＷＮウイルスファミリーの中で、ｐｒＭ−Ｍ−Ｅのアミノ酸配列の同一性は、ＮＹ９９と９０％又はそれ以上である。したがって、本発明には、本来のアミノ酸配列との同一性が９０％又はそれ以上、特に９２％、好ましくは９５％、より好ましくは９８％であるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドが含まれる。ＷＮウイルスに特異的な、これらの相同なポリヌクレオチドの断片も、同等であると考えられるだろう。
【００４４】
したがって、ＷＮウイルスのポリヌクレオチドに関するときは、この用語は、本発明において同等な配列を含む。
【００４５】
タンパク質の用語が、免疫学的に活性な、ポリペプチド及びペプチドも含むことも示した。本発明の必要性に応じて、以下のものも含む。
ａ）異なるＷＮウイルス株に対応するタンパク質；
ｂ）これとは異なるが、ＷＮの未変性タンパク質との同一性が、９０％又はそれ以上、特に９２％、及びより好ましくは９８％の同一性を維持するタンパク質。
【００４６】
したがって、ＷＮウイルスのタンパク質に関するときには、この用語は本発明において同等なタンパク質も含む。
【００４７】
異なるＷＮウイルス株は、コレクションで、特にAmerican Type Culture Collection (ＡＴＣＣ)で、例えばＶＲ−８２又はＶＲ−１２６７のアクセス番号で、入手できる。Kunjinと名付けたウイルスは、実際はＷＮウイルスであると考えられている。
【００４８】
本発明によると、ポリヌクレオチドが、確実に分泌を行うために、発現したタンパク質の上流に局在するペプチドシグナルをコードするヌクレオチド配列を含むことが好ましい。それは、内因性の配列、つまり本来存在している自然のシグナル配列であってもよい。（同じウイルス又は他の株から派生していてもよい）。例えば、ＷＮウイルス ＮＹ９９では、ＥやｐｒＭの内因性のシグナル配列は、GenBank配列のヌクレオチド９２２〜９６６、ヌクレオチド４２１から４６５にそれぞれ対応する。また、異種構造のペプチドシグナルをコードするヌクレオチド配列であってもよく、特にヒト組織プラスミノゲンアクチベーター（ｔＰＡ）のペプチドシグナルをコードしているヌクレオチド配列であってもよい。（Hartikka J. et al., Human Gene Therapy 1996, 7, 1205-1217）。シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列は、Ｅ又はその組合せ、例えばｐｒＭ−Ｍ−Ｅ、をコードする配列の上流にインフレームで挿入する。
【００４９】
本発明の第１の実施態様によると、インビボの発現ベクターはウイルスベクターである。
【００５０】
これらの発現ベクターは、特にポックスウイルスであり、例えばワクシニアウイルス、又はワクシニアウイルスの弱毒化した変異体であり、例えばＭＶＡ（Ankara 株）(Stickl H. et Hochstein-Mintzel V., Munch. Med. Wschr., 1971, 113, 1149-1153; Sutter G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 1992, 89, 10847-10851;市販株ＡＴＣＣ ＶＲ−１５０８；ＭＶＡは、Ankaraワクチン株を、ニワトリの胚の線繊維芽細胞上を約５７０回以上通過させて入手した)、又はＮＹＶＡＣ（その構築は、ＵＳ−Ａ−５４９４８０７の、特に実施例１〜６に記載されている。この特許は、異種の遺伝子の組換え部位への挿入、及び適したプロモーターの利用に関しても記載している。ＷＯ−Ａ−９６／４０２４１も同様に引用できる。）、アビポックス（特にカナリア痘、鶏痘、ハト痘、ウズラ痘）、ブタ痘、アライグマ痘及びラクダ痘、トリ、イヌ、ブタ、ウシ、ヒトアデノウイルス等のアデノウイルス、及びウマヘルペスウイルス（ＥＨＶ血清型１及び４）、イヌヘルペスウイルス（ＣＨＶ）、ネコヘルペスウイルス（ＦＨＶ）、ウシヘルペスウイルス（ＢＨＶ血清型１及び４）、ブタヘルペスウイルス（ＰＲＶ）、マレック病ウイルス（ＭＤＶ血清型１及び２）、七面鳥ヘルペスウイルス（ＨＶＴ又はＭＤＶ血清型３）、及びアヒルヘルペス等のヘルペスウイルス、を含む。ヘルペスウイルスを用いるとき、トリ類のワクチン接種にはベクターＨＶＴが好ましく、ウマのワクチン接種にはベクターＥＨＶが好ましい。
【００５１】
本発明の好ましい実施態様の一つにおいては、ポックスウイルスの発現ベクターは、カナリア痘又は鶏痘であり、これらのポックスウイルスは、必要に応じて弱毒化することができる。アクセス番号ＶＲ−１１１としてＡＴＣＣから市販されているカナリア痘を引用することができる。弱毒化したカナリア痘ウイルスについては、ＵＳ−Ａ−５７５６，１０３及びＷＯ−Ａ−０１／０５６９３４に記載されている。多くの鶏痘ウイルスのワクチン株は入手可能であり、例えばMERIALから市販されているワクチンDIFTOSEC CT株、及びIntervetから市販されているワクチンNOBILIS VARIOLE等である。
【００５２】
ポックスウイルスに関しては、当業者は、ＷＯ−Ａ−９０／１２８８２に、特にワクシニアウイルスに関しては、ＵＳ−Ａ−４７６９３３０；ＵＳ−Ａ−４７２２８４８；ＵＳ−Ａ−４６０３１１２；ＵＳ−Ａ−５１１０５８７；ＵＳ−Ａ−５４９４８０７；ＵＳ−Ａ−５７６２９３８；鶏痘に関しては、ＵＳ−Ａ−５１７４９９３；ＵＳ−Ａ−５５０５９４１；ＵＳ−Ａ−５５０５９４１；ＵＳ−５７６６５９９；カナリア痘に関しては、ＵＳ−Ａ−５７５６１０３；ブタ痘に関しては、ＵＳ−Ａ−５３８２４２５；アライグマ痘に関しては、ＷＯ−Ａ−００／０３０３０、を参照することができる。
【００５３】
発現ベクターがワクシニアウイルスであるとき、発現する１つ又は複数のポリヌクレオチドの挿入部位は、特にチミジンキナーゼ（ＴＫ）、ヘマグルチニン（赤血球凝集素）（ＨＡ）の遺伝子、及びＡ型封入体の領域（ＡＴＩ）である。カナリア痘の場合は、挿入部位は、特にＯＲＦ、Ｃ３、Ｃ５及びＣ６内に局在しているか、またはそれにより構成されている。鶏痘の場合には、挿入部位は、特にＯＲＦ、Ｆ７及びＦ８内に局在するか、それによって構成されている。
【００５４】
ＭＶＡウイルスの遺伝子の挿入に関しては、Carrol M. W. et al., Vaccine, 1997, 15(4), 387-394; Stittelaar K. J. et al., J. Virol., 2000, 74(9), 4236-4243; Sutter G. et al., 1994, Vaccine 12 (11), 1032-1040等、様々な文献に記載されており、当業者が参照することができる。ＭＶＡ完全ゲノムは、Antoine G., Virology, 1998, 244, 365-396に記載されており、これにより、当業者が他の挿入部位又は他のプロモーターを用いることが可能である。
【００５５】
発現ベクターがポックスウイルスである場合、好ましくは、発現するポリヌクレオチドは、ポックスウイルスに特異的なプロモーター、特に、ワクチンプロモーター７．５ｋＤａ(Cochran et al., J. Virology, 1985, 54, 30-35)、ワクチンプロモーターＩ３Ｌ（Riviere et al., J. Virology, 1992, 66, 3424-3434）、ワクチンプロモーターＨＡ(Shida, Virology, 1986, 150, 451-457)、牛痘プロモーターＡＴＩ（Funahashi et al., J. Gen. Virol., 1988, 69, 35-47）、又はワクチンプロモーターＨ６(Taylor J. et al., Vaccine, 1988, 6, 504-508；Guo P. et al. J. Virol, 1989, 63, 4189-4198; Perkus M. et al., J. Virol, 1989, 63, 3829-3836)、の制御下に挿入される。
【００５６】
哺乳類へのワクチン接種では、好ましくは、発現ベクターはカナリア痘である。トリ類のワクチン、特にニワトリ、アヒル、七面鳥及びガチョウのワクチンでは、好ましくは、発現ベクターはカナリア痘又は鶏痘である。
【００５７】
発現ベクターが、ヘルペスウイルスＨＶＴである場合、適切な挿入部位は、特に、ＨＶＴ内のBamHI Ｉ断片又はBam HI M断片に局在する。ＨＶＴのBamHIＩ制限断片は、複数のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）と３つの遺伝子間領域を含み、複数の好ましい挿入ゾーン、すなわち、好ましい領域である遺伝子間領域１、２及び３、並びにＯＲＦ ＵＬ５５（ＦＲ−Ａ−２７２８７９５、ＵＳ−Ａ−５９８０９０６）を含む。ＨＶＴのBamHI Ｍ制限断片は、同様に好ましい挿入部位であるＯＲＦ ＵＬ４３を含む（ＦＲ−Ａ−２７２８７９４、ＵＳ−Ａ−５７３３５５４）。
【００５８】
発現ベクターが、ヘルペスウイルスＥＨＶ−１又はＥＨＶ−４である場合、適切な挿入部位は、特にＴＫ、ＵＬ４３及びＵＬ４５である（ＥＰ−Ａ−０６６６８３５５）。
【００５９】
発現ベクターがヘルペスウイルスである場合、好ましくは、発現するポリヌクレオチドは、強い真核生物プロモーター、好ましくはＣＭＶ−ＩＥプロモーターの制御下に挿入される。この強いプロモーターに関しては、プラスミドに関する部分で後述する。
【００６０】
発明の第２の実施態様によると、インビボの発現ベクターはプラスミドと呼ばれるプラスミドベクターである。
【００６１】
プラスミドの用語は、本発明のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド配列の形におけるすべてのＤＮＡ転写単位と、そのインビボでの発現に必要な要素を含む。スーパーコイル状であっても、そうでなくても、環状のプラスミドが好ましい。直線的な形状も本発明の範囲内である。
【００６２】
各プラスミドは、宿主細胞において、その依存性下に挿入されたポリヌクレオチドの発現を確定するための適切なプロモーターを含んでいる。概ね、それは強い真核生物プロモーターである。好ましい強い真核動物は、ヒト若しくはマウス、又は、必要に応じてラットやモルモット等に由来する、初期サイトメガロウイルスプロモーター（ＣＭＶ−ＩＥ）である。ＣＭＶ−ＩＣプロモーターは、エンヘンサーに関連している又はしていない、本来のプロモーター部分を含むことができる。ＥＰ−Ａ−２６０１４８、ＥＰ−Ａ−３２３５９７、ＵＳ−Ａ−５１６８０６２、ＵＳ−Ａ−５３８５８３９、ＵＳ−Ａ−４９６８６１５、ＷＯ−Ａ−８７／０３９０５を参照することができる。ヒトＣＭＶ−ＩＥ(Boshart M. et al., Cell., 1985, 41, 521-530) 又はマウスＣＭＶ−ＩＥが好ましい。
【００６３】
より一般的な概念では、プロモーターはウイルス又は細胞に由来している。ＣＭＶ−ＩＥ以外の強いウイルスプロモーターとしては、ＳＶ４０ウイルスの初期／後期プロモーター、又はラウス肉腫ウイルスのＬＴＲプロモーターを引用することができる。強い細胞プロモーターとしては、サイトスケルトンの遺伝子のプロモーター、例えばデスミンプロモーター（Kwissa M. et al., Vaccine, 2000, 18(22), 2337-2344）、又はアクチンプロモーター(Miyazaki J. et al., Gene, 1989, 79(2), 269-277) を挙げることができる。
【００６４】
同様に、適切なプロモーター活性を保持するこれらプロモーターの細断片も、本発明に含まれる。例えば、ＷＯ−Ａ−９８／００１６６に従って切断されたＣＭＶ−ＩＥプロモーターを挙げることができる。したがって、本発明には、適切なプロモーター活性、好ましくは由来する本来のプロモーターと実質的に同様のプロモーター活性を保持する、誘導体及び細断片も含まれる。ＣＭＶ−ＩＥには、本来のプロモーター部分及び／又はエンハンサー部分と、それらの誘導体並びに細断片とを含んでいる。
【００６５】
プラスミドには、他の発現調節要素が含まれていることが好ましい。特にイントロン型の安定化配列、好ましくはウサギβ−グロビン遺伝子のイントロンII（van Ooyen et al., Science, 1979, 206: 337-344）を取組むことが有利である。
【００６６】
プラスミド及びポックスウイルス以外のウイルスベクターのポリアデニル化シグナル（polyA）としては、特にウシ成長ホルモン遺伝子（ｂＧＨ）（ＵＳ−Ａ−５１２２４５８）、ウサギβ−グロビン遺伝子又はＳＶ４０ウイルスを用いることができる。
【００６７】
プラスミドにおいて用いることができる他の発現調節要素は、ヘルペスウイルスの発現ベクターにおいても同様に用いることができる。
【００６８】
本発明の他の実施態様によると、発現ベクターは、適切な細胞システムで、インビトロでタンパク質を発現するために用いられる発現ベクターである。タンパク質を、分泌の前後に、培養上澄液で回収し（分泌が行われない場合、細胞溶解を行う）、必要に応じて、従来の濃縮方法、特に限外濾過で濃縮、及び／又は従来の精製方法、特にアフィニティ型、イオン交換又はゲル濾過クロマトグラフィ方法で精製する。
【００６９】
プラスミド、哺乳類若しくはトリ類の細胞でのウイルスベクターの複製、又はバキュロウイルス（ＵＳ−Ａ−４７４５０５１;Vilard J. et al., J. Virol., 1990 64 (1) 37-50; Verne A., Virology, 1988, 167, 56-71）例えば昆虫細胞（例えば、Sf9 Spodoptera frugiperda 細胞、 ＡＴＣＣ ＣＲＬ １７１１）におけるAutographa californica Nuclear Polyhedrosis Virus AcNPVの複製による哺乳類細胞のトランスフェクションにより、作製を行う。哺乳類の細胞としては、特にハムスターの細胞（例えばＣＨＯ又はＢＨＫ−２１）、又はサルの細胞（例えばＣＯＳ又はＶＥＲＯ）を用いることができる。したがって、本発明は、本発明のポリヌクレオチドを組み入れたこれらの発現ベクター、かかる方法で作製されたＷＮタンパク質又は断片、及びそれらを含む調製物に関する。
【００７０】
本発明は、ＷＮタンパク質を濃縮物及び／又は精製された調製物にも関する。ポリヌクレオチドが複数のタンパク質をコードする場合、タンパク質は分割され、上記の調製物は、分割されたタンパク質を含むこととなる。
【００７１】
本発明は、少なくとも１つの本発明のインビボの発現ベクターと、薬剤的として許容される媒体又は賦形剤、及び必要に応じてアジュバントとを含む、免疫原性の組成物及びＷＮウイルスのワクチンにも関する。
【００７２】
免疫原性の組成物の概念は、標的とした種に一度投与して、ＷＮウイルスに対する免疫反応を誘導することができる、全ての組成物を含んでいる。ワクチンの用語は、効果的な予防を誘導することができる組成物を意味する。標的とする種には、ウマ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、トリ、好ましくは、馬、犬、猫、豚や、トリでは、ガチョウ、七面鳥、ニワトリ、アヒルで、つまり、有性生殖動物、卵で繁殖する動物及び胎生動物も含まれる。
【００７３】
薬剤として許容される媒体又は賦形剤は、当業者によく知られている。例えば、０．９％の生理食塩水又はリン酸緩衝液であってもよい。薬剤として許容される媒体又は賦形剤は、ベクターの投与、特にトランスフェクション、及び／又は保存状態の改善を容易にするような全ての化合物、又は化合物の組合せを含む。
【００７４】
用量及び用量体積に関しては、後述の免疫化及びワクチン接種方法の概要の部分で定義する。
【００７５】
本発明の免疫原性の組成物及びワクチンは、好ましくは特に従来のアジュバントから選択される、１つ又は複数のアジュバントを含む。本発明の範囲で特に適しているものは、（１）アクリル酸又はメタクリル酸のポリマー、無水マレイン酸及びアルケニル誘導体ポリマー、（２）免疫刺激配列（ＩＳＳ）、特に１つ又は複数の非メチルＣｐＧユニットを有するオリゴデオキシリボヌクレオチド配列（Klinman D.M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 1966, 93, 2879-2883; ＷＯ−A１−９８／１６２４７）、（３）水中油型エマルジョン、特に、M. Powell, M. Newman, Plenum Press 1995の“Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach”１４７ページに記載のＳＰＴエマルジョンと、同文献の１８３ページに記載のエマルジョンＭＦ５９、（４）四級アンモニウム塩を含む陽イオン性脂質、（５）サイトカイン、又は（６）それらの組合せ又は混合物、である。
【００７６】
（３）の水中油型エマルジョンは、ウイルスベクターに特に適しているが、特に次のものをベースとしてもよい。
−軽質流動パラフィン油(ヨーロッパ薬局方型)；
−スクアラン、スクアレン等のイソプレノイド油；
−アルケン、特にイソブテン又はデセンのオリゴマー形成から生じる油
−酸又は直鎖アルキル基を有するアルコールのエステル
−特に、植物性油脂、オレイン酸エチル、プロピレン・グリコール、ジ（カプリル酸／カプリン酸）、グリセロールトリ（カプリル酸／カプリン酸）及びプロピレングリコールジオレイン酸；
−分枝の脂肪性アルコール又は酸のエステル、特にイソステアリン酸エステル。
【００７７】
油脂を、乳化剤と組み合わせて用いてエマルジョンを形成する。乳化剤は、好ましくは、非イオン性の界面活性剤であり、特に以下のものである。
−ソルビタン、マンナイド（mannide）（例:アンヒドロマンニトールオレイン酸)、グリセロール、ポリグリセロール、又はプロピレングリコ−ルと、オレイン酸、イソステアリン酸、リシノール酸又はヒドロキシステアリン酸とのエステルであり、必要に応じてエトキシレートされたエステル。
−ポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレンのコポリマーブロック、特にプルロニック（Pluronic）、中でもＬ１２１。
【００７８】
タイプ（１）のアジュバントポリマーの中で、架橋したアクリル酸又はメタクリル酸のポリマーが好ましく、特に、糖又はポリアルコールのポリアルケニルエーテルによって架橋されているものが好ましい。これらの化合物は、カルボマー (carbomer)（Pharmeuropa, vol. 8, no. 2, June 1996）の名で知られている。当業者は、少なくとも３つ、好ましくは８つ以下のヒドロキシル基を含み、少なくとも３つのヒドロキシルの水素原子が少なくとも２個のカーボン原子を有する不飽和の、脂肪属のラジカルで置換された、ポリヒドロキシル化合物により架橋されたアクリルポリマーに関して記載したＵＳ−Ａ−２９０９４６２を参照することができる。例えば、ビニール、アリル、及び他のエチレン化した不飽和基等の２〜４個のカーボン原子を含むラジカルが好ましい。不飽和ラジカルも、メチル等他の基質を含むことができる。Carbopol（BF Goodrich社製）の商品名で販売されている製品が特に適切である。その製品は、特にアリルサッカロース又はアリルペンタエリスリトールで架橋されている。その中で、Carbopol ９７４Ｐ、９３４Ｐ及び９７１Ｐを特に引用することができる。
【００７９】
無水マレイン酸及びアルケニル由来のコポリマーの中では、直鎖又は架橋した無水マレイン酸及びエチレンコポリマー、例えばジビニルエーテルで架橋した、ＥＭＡ（Mosanto社製）が好ましい。J. Fields et al., Nature 186:778-780, June 4, 1960を引用することができる。
【００８０】
構造に関しては、アクリル又はメタクリル酸ポリマー及びＥＭＡは、好ましくは下記化学式を有する基本単位で形成されているものが好ましい。
【００８１】
【化１】
式中、
−Ｒ1及びＲ2は、同一又は異なっていてもよく、Ｈ又はＣＨ3を示す。
−ｘ＝０又は１であり、好ましくはｘ＝１である。
−ｙ＝０又は１であり、ｘ+ｙ＝２である。
ＥＭＡでは、ｘ＝０及びｙ＝２である。カルボマーでは、ｘ＝ｙ＝１
である。
【００８２】
これらのポリマーを、水又は生理食塩水（２０ｇ／ｌのＮａＣｌ）に溶解し、ｐＨをソーダで７．３〜７．４に調整し、発現ベクターを取り入れるアジュバント溶液を調製する。
【００８３】
最終的なワクチンの組成物のポリマー濃度は、０．０１〜１．５％ｗ／ｖの範囲内であってもよく、特に０．０５〜１％ｗ／ｖであり、好ましくは０．１〜０．４％ｗ／ｖである。
【００８４】
四級アンモニウム塩を含み、特に、但し排他的ではないがプラスミドに適切である陽イオン性脂質（４）は、好ましくは、以下の化学式を有するものである。
【００８５】
【化２】
式中、Ｒ1は、１２〜１８個のカーボン原子を有する飽和又は不飽和の直鎖の脂肪族ラジカルであり、Ｒ2は、２〜３個のカーボン原子を含む他の脂肪族ラジカルであり、Ｘはヒドロキシル基又はアミン基である。
【００８６】
これらの陽イオン性脂質のなかで、ＤＭＲＩＥ（Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２、３−ビス（テトラデシロキシ）−１−プロパンアンモニウム；ＷＯ−Ａ−９６／３４０１９）が好ましく、好ましくはＤＯＰＥ（dioleoyo-phosphatidyl-ethanol amine; Behr J.P., 1994, Bioconjugate Chemistry , 5, 382-389）と会合し、ＤＭＲＩＥ−ＤＯＰＥを形成する中性脂質が好ましくい。
【００８７】
このアジュバントとプラスミドの混合物は、短時間で形成されることが好ましく、投与する前に、このように形成された混合物に、例えば１０分〜６０分、好ましくは約３０分、複合体となる時間をおくことが好ましい。
【００８８】
ＤＯＰＥが存在するとき、ＤＭＲＩＥ：ＤＯＰＥの分子比率は、好ましくは９５：５〜５：９５であり、特に１：１である。
【００８９】
プラスミド：ＤＭＲＩＥ又はＤＭＲＩＥ−ＤＯＰＥアジュバントの重量比は、特に５０：１〜１：１０であり、中でも１０：１〜１：５、好ましくは１：１〜１：２である。
【００９０】
１つ又は複数のサイトカイン（５）は、タンパク質の形で、組成物又はワクチンに供給されるか、１つ又は複数のイムノゲンと共に宿主で共発現される。イムノゲンを発現するベクターと同じベクター、又は独自のベクターによる、１つ又は複数のサイトカインの共発現が好ましい。
【００９１】
サイトカインは、特に、インターロイキン１８（ＩＬ−１８）、インターロイキン１２（ＩＬ−１２）、インターロイキン１５（ＩＬ−１５）、ＭＩＰ−１α（マクロファージ炎症タンパク質１α；Marshall E. et al, Br. J. Cancer, 1997, 75(12), 1715-1720）又はＧＭ−ＣＳＦ(顆粒球マクロファージコロニー刺激因子)から選択することができる。特にトリのサイトカイン、特にニワトリのサイトカイン、例えばｃＩＬ−１８（Schneider K. et al., J. Interferon Cytokine Res., 2000, 20 (10), 879-883）、ｃＩＬ−１５(Xin K.-Q et al., Vaccine, 1999, 17, 858-866)を引用することができ、ウマのサイトカインに関しては、特にウマＧＭ−ＣＳＦ（ＷＯ−Ａ−００／７７２１０）を引用することができる。ワクチンを接種される種のサイトカインを用いることが好ましい。
【００９２】
ＷＯ−Ａ−００／７７２１０は、ウマＧＭ−ＣＳＦに相当するヌクレオチド配列とアミノ酸配列について述べ、インビトロでのＧＭ−ＣＳＦの作製とインビボでのウマＧＭ−ＣＳＦの発現を可能にするベクター（プラスミド及びウイルスベクター）の構築とに関して記載している。これらのタンパク質、プラスミド及びウイルスベクターを、本発明の免疫原性の組成物及びウマワクチンに用いることができる。例えば、前記先行出願の実施例３記載のプラスミドpJP097を使用することができ、又、かかる先行出願の教示に従い、他のベクターを作製したり、又はウマＧＭ−ＣＳＦをインビトロで作製したり、このベクター又はウマＧＭ−ＣＳＦを本発明の免疫原性の組成物又はウマワクチンに取り込むことができる。
【００９３】
本発明は、タンパク質Ｅと、必要に応じて１つ又は複数のＷＮウイルスの他のタンパク質、特にｐｒＭ又はＭ、好ましくは上述したようにインビトロで発現して作製された１つ又は複数の他のタンパク質と、他方で薬剤として許容される媒体及び賦形剤を含む、免疫原性の組成物及びサブユニットと呼ばれるワクチンに関する。
【００９４】
薬剤として許容される媒体及び賦形剤は、当業者によく知られている。例えば、０．９％ＮａＣｌサリン溶液又はリン酸緩衝液であってもよい。
【００９５】
本発明の免疫原性の組成物及びサブユニットのワクチンは、好ましくは特に従来のアジュバントから選択される、１つ又は複数のアジュバントを含む。本発明の範囲に特に適しているものは、（１）アクリル酸又はメタクリル酸ポリマー、無水マレイン酸及びアルケニル誘導体ポリマー、（２）免疫刺激配列（ＩＳＳ）、特に１つ又は複数の非メチルＣｐＧユニットを有するオリゴデオキシリボヌクレオチド配列（Klinman D.M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 1966, 93, 2879-2883; ＷＯ−A１−９８／１６２４７）、（３）水中油型エマルジョン、特に、M. Powell, M. Newman, Plenum Press 1995の“Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach”１４７ページに記載のＳＰＴエマルジョンと、同文献の１８３ページに記載のエマルジョンＭＦ５９、（４）四級アンモニウム塩を含む陽イオン性脂質、（５）サポニン、特にＱｕｉｌ−Ａ、又は（６）アルミナ水酸化合物又は同等物、である。（１）（２）及び（３）に定義した様々な種類のアジュバントに関しては、発現ベクターをベースにしたワクチンに関して上述した部分で詳細に記載している。
【００９６】
用量及び用量体積に関しては、後述の免疫化及びワクチン接種方法の概要の部分で定義する。
【００９７】
本発明によると、ＷＮウイルスに対するワクチン接種は、免疫化若しくはワクチン接種のキットの形で、又は多価の免疫原性の組成物又はワクチンの形、つまり、ＷＮウイルスに対するワクチン成分を少なくとも１つ含み、少なくとも他の病原性物質に対するワクチン成分を少なくとも１つ含んだ形で、ワクチン接種計画の他のワクチン接種と組み合わせることができる。これは、ＷＮウイルスを含む、少なくとも２つの病原性物質の遺伝子と同じ発現ベクターによる発現も含む。
【００９８】
本発明は、さらに、同じ発現ベクターをインビボで用いて、本発明のＷＮウイルスのポリヌクレオチドを少なくとも１つと、他の病原性物質のイムノゲンを発現するポリヌクレオチドを少なくとも１つ含む、ＷＮウイルスと、標的とする種の少なくとも１つの他の病原性物質とに対する、多価免疫原性の組成物又は多価ワクチンに関する。
【００９９】
ここに記載した「イムノゲン」は、好ましくは予防性のある免疫反応を誘導するタンパク質、糖タンパク質、ポリペプチド又はペプチドで、エピトープ又は誘導体、例えば融合タンパク質を意味する。
【０１００】
上述した通り、これらの多価の組成物又はワクチンは、薬剤として許容される媒体又は賦形剤、及び必要に応じてアジュバントを含む。
【０１０１】
本発明は、同様に、本発明のＷＮウイルスのポリヌクレオチドが少なくとも１つ挿入される少なくとも１つのインビボの発現ベクターと、他の病原性物質のイムノゲンをコードするポリヌクレオチドが挿入されている一つの第２の発現ベクターとを含む、多価の免疫原性の組成物又は多価ワクチンに関する。前述した通り、これら多価の組成物又はワクチンは、薬剤として許容される媒体又は賦形剤、及び必要に応じてアジュバントも含む。
【０１０２】
多価の免疫原性の組成物及びワクチンに関して、他のウマ病原性物質は、ウマ鼻肺炎ウイルスＥＨＶ−１及び／又はＥＨＶ−４（好ましくは、ＥＶ−１及びＥＨＶ−４のイムノゲンを組み合わせる）、ウマインフルエンザウイルスＥＩＶ、東部脳炎ウイルスＥＥＶ、西部脳炎ウイルスＷＥＶ、ベネズエラ脳炎ウイルスＶＥＶ（ＥＥＶ、ＷＥＶ及びＶＥＶの３つの組み合わせが好ましい)、破傷風菌、及びそれらの混合物を含むグループから特に選択される。好ましくは、ＥＨＶは、遺伝子ｇＢ及び／又はｇＤ；ＥＩＶ遺伝子は、ＨＡ、ＮＰ及び／又はＮ；脳炎のウイルスは、Ｃ及び／又はＥ２；及び破傷風菌は、破傷風毒素のサブユニットＣを全て又は一部をコードする遺伝子から選択される。これは、免疫的に活性の断片、又は前記イムノゲンのエピトープをコードする、ポリヌクレオチドの使用を含む。
【０１０３】
他のトリ類の病原性物質は、マレック病ウイルスＭＤＶ（血清型１及び２、好ましくは１）、ニューカッスル病ウイルスＮＤＶ、ガンボロ病ウイルスＩＢＶＤ、感染性気管炎ＩＢＶ、感染性貧血ウイルスＣＡＶ、感染性喉頭気管炎ウイルスＩＬＴＶ、脳脊髄炎ウイルスＡＥＶ（又はトリ白血症ＡＬＶ）、七面鳥の出血性腸炎ウイルス（ＨＥＶ）、肺炎ウイルス病（pneumovirosis）ウイルス（ＴＲＴＶ）、トリペストウイルス（トリ類インフルエンザ）、ニワトリ水心膜炎（hydropericarditis）ウイルス、トリレオウイルス、大腸菌、マイクロプラズマ・ガリナルム(Mycoplasma gallinarum)、マイクロプラズ・ガリセプティカム(Mycoplasma gallisepticum)、ヘモフィルス・アヴイウム (Haemophilud avium)、パスツレラ・ガリナルム(Pasteurella gallinarum)、パスツレラ・ムルトシダ・ガルシダ(Pasteurella multocida gallicida)、及びそれらの混合物、を含むグループから選択される。好ましくは、ＭＤＶは、遺伝子ｇＢ及び／又はｇＤ；ＮＤＶは、遺伝子ＨＮ及び／又はＦ；ＩＢＤＶは、遺伝子ＶＰ２；ＩＢＶには遺伝子Ｓ（さらに具体的にはＳ１）、Ｍ及び／又はＮ；ＣＡＶは、遺伝子ＶＰ１及び／又はＶＰ２；ＩＴＬＶは、遺伝子ｇＢ及び／又はｇＤ；ＡＥＶに遺伝子ｅｎｖ及び／又はｇａｇ／ｐｒｏ；ＨＥＶは、遺伝子１００Ｋ及びヘキソン；ＴＲＴＶは、遺伝子Ｆ及び／又はＧ；及びトリペストは、遺伝子ＨＡ、Ｎ及び／又はＮＰ、から選択される。これは、免疫的に活性な断片、又は前記イムノゲンのエピトープをコードするポリヌクレオチドの使用を含む。
【０１０４】
例えば、上述したように必要に応じてアジュバントが添加された、ウマを対象とした、本発明の多価の免疫原性の組成物又は多価ワクチンは、ＷＯ−Ａ−９８／０３１９８、具体的にはその実施例８〜２５に記載たもの、及びウマの種類に関するＷＯ−Ａ−００／７７０４３、特にその実施例６及び７に記載された、１つ又は複数のプラスミドを組み入れることが可能である。トリ類に関しては、ＷＯ−Ａ１−９８／０３６５９、特にその実施例７〜２７に記載の、１つ又は複数のプラスミドを組み入れることが可能である。
【０１０５】
前記免疫原性の組成物又は組換え型ワクチンは、同様に、少なくとも１つの他の病原性物質に対する、少なくとも１つの従来型ワクチン（不活性、生弱毒性、サブユニット）と組み合わせることができる。
【０１０６】
同様に、本発明の免疫原性の組成物及びサブユニットのワクチンは、複合ワクチンの目的となることができる。したがって、本発明は、本発明の１つ又は複数のタンパク質と、少なくとも１つの他の病原性物質（特に上記のリストの中から選択）の１つ又は複数のイムノゲン（イムノゲンの用語の定義は上述）、及び／又は不活性若しくは弱毒性の他の病原性物質とを含む、多価の免疫原性の組成物及び多価ワクチンにも関する。前述の通り、これら多価の組成物又はワクチンは、薬剤として許容される媒体又は賦形剤、及び必要に応じてアジュバントも含む。
【０１０７】
本発明は、上述した標的とする種に対する免疫化およびワクチン接種の方法にも関する。
【０１０８】
これらの方法は、本発明の免疫原性の組成物又はワクチンの有効量の投与を含む。この投与は、例えば皮下投与、皮内投与、筋肉内投与等の非経口ルート、又は経口及び／又は鼻腔ルートで行ってもよい。１つ又は複数の投与を行ってもよく、特に２つ行ってもよい。
【０１０９】
他のワクチンは、注射針のない液体ジェット式注射器で注入してもよい。プラスミドには、プラスミドで被覆し、免疫化する動物の皮の細胞に注入できるように保護した金の粒子を用いてもよい（Tang et al., Nature 1992, 356, 152-154）。
【０１１０】
本発明の免疫原性の組成物及びワクチンは、発現ベクター又はポリペプチドの有効量を含む。
【０１１１】
プラスミドを基にした免疫原性の組成物又はワクチンには、用量は概ね、約１０μｇ〜約２０００μｇ、特に約５０μｇ〜約１０００μｇである。用量体積は、０．１〜２ｍｌであってもよく、好ましくは０．２〜１ｍｌである。
【０１１２】
これらの用量及び用量体積は、ウマ及び哺乳類のワクチン接種用に最適化されている。
【０１１３】
トリ類のワクチン接種には、用量は特に約１０μｇ〜約５００μｇであり、好ましくは、約５０μｇ〜約２００μｇである。用量体積は、０．１〜１ｍｌであってもよく、好ましくは０．２〜０．５ｍｌである。
【０１１４】
当業者は、各免疫化又はワクチン接種プロトコールに使用するプラスミドの有効量を最適化し、最適な投与ルートを決定する技術を持っている。
【０１１５】
ポックスウイルスを基にした免疫原性の組成物又はワクチンの場合、用量は概ね約１０2ｐｆｕ〜約１０9ｐｆｕである。
【０１１６】
ウマ類及び哺乳類用には、ベクターがワクシニアウイルスである場合、用量は具体的には約１０4ｐｆｕ〜約１０9ｐｆｕであり、好ましくは約１０6ｐｆｕ〜約１０8ｐｆｕである。ベクターがカナリア痘ウイルスである場合、用量は、具体的には約１０5ｐｆｕ〜約１０9ｐｆｕであり、好ましくは約１０5.5又は１０6ｐｆｕ〜約１０9ｐｆｕである。
【０１１７】
トリ類用には、ベクターがカナリア痘ウイルスである場合、用量は具体的には約１０3ｐｆｕ〜約１０7ｐｆｕであり、好ましくは約１０4ｐｆｕ〜約１０6ｐｆｕである。ベクターが鶏痘ウイルスである場合、用量は、具体的には約１０2ｐｆｕ〜約１０5ｐｆｕであり、好ましくは約１０3ｐｆｕ〜約１０5ｐｆｕである。
【０１１８】
ポックスウイルス以外のウイルスベクター、特にヘルペスウイルスを基にした免疫原性の組成物又はワクチンの場合、用量は概ね約１０3ｐｆｕ〜約１０8ｐｆｕである。トリの免疫原性の組成物又はワクチンの場合、用量は、概ね約１０3ｐｆｕ〜約１０6ｐｆｕである。ウマの免疫原性の組成物又はワクチンの場合、用量は、概ね約１０6ｐｆｕ〜約１０8ｐｆｕである。
【０１１９】
ウイルスベクターを基にしたウマの免疫原性の組成物及びワクチンの用量体積は、概ね０．５〜２．０ｍｌであり、好ましくは１．０〜２．０ｍｌ、より好ましくは１．０ｍｌである。ウイルスベクターを基にした免疫原性及びトリワクチンの用量体積は、概ね０．１〜１．０ｍｌであり、好ましくは０．１〜0．５ｍｌ、より好ましくは０．２〜０．３ｍｌである。このワクチンの種類に関しても、当業者は、各免疫化プロトコールの投与回数、投与ルート及び使用量を最適化するために必要な能力を持ち合わせている。特に、ウマには、例えば３５日間隔で、２回の投与を想定している。
【０１２０】
サブユニットの免疫原性の組成物又はワクチンの場合、用量は概ね約１０μｇ〜約２０００μｇ、特に約５０μｇ〜約１０００μｇである。ウイルスベクターを基にしたウマの疫原性の組成物及びワクチンの用量体積は、概ね１．０〜２．０ｍｌであり、好ましくは０．５〜２．０ｍｌ、より好ましくは１．０ｍｌである。ウイルスベクターを基にしたトリの免疫原性及びワクチンの用量体積は、概ね０．１〜１．０ｍｌであり、好ましくは０．１〜0．５ｍｌ、より好ましくは０．２〜０．３ｍｌである。このワクチンの種類に関しても、当業者は、各免疫化プロトコールの投与回数、投与ルート及び使用量を最適化するために必要な能力を持ち合わせている。
【０１２１】
本発明は、ＷＮウイルスと必要に応じて少なくとも１つの他の病原性物質に対して、標的とする種を予防する免疫原性の組成物及びワクチン調製のための、インビボでの発現ベクター、又は本発明のベクター又はポリペプチドの調製物の使用に関する。本明細書に後述する、他の特徴は、このもう一方の目的に関する。
【０１２２】
ＷＮウイルスの１つ又は複数のタンパク質を発現するプラスミドやウイルスワクチンに基づくワクチンや、本発明のＷＮサブユニットワクチンは、ワクチンを接種した動物に、免疫原性の組成物又はワクチンに現れていないこのウイルスの他のタンパク質に対する抗体の作製を誘導しない。この特徴を用いて、ＷＮ病原性物質ウイルスに感染した動物と、本発明のワクチンを接種した動物とを区別できる、差別的な診断方法を発展させることができる。前者では、これらのタンパク質及び／又はそれに対する抗体が存在し、抗原抗体反応によって検出することができる。本発明にしたがってワクチンを接種した動物は、陰性のままである。この区別を行うには、ワクチンに現れていない（存在していないか、発現していない）タンパク質、例えば、ワクチンに現れていない、タンパク質Ｃ、又はタンパク質ＮＳ１、ＮＳ２Ａ、ＮＳ２Ｂ、若しくはＮＳ３が挙げられる。
【０１２３】
したがって、本発明は、ワクチンを接種した動物と感染した動物とを区別することを可能にする免疫原性の組成物及びワクチンを調製するための、本発明のベクター、調製物、及びポリペプチドの使用に関する。
【０１２４】
さらに、この区別を可能にする診断方法に関連した免疫化及びワクチン接種の方法にも関する。
【０１２５】
診断のために選択したタンパク質、又はその断片若しくはエピトープのうちの１つを、診断試験における抗原として使用し、及び／又はポリクロナール若しくはモノクローナル抗体を作製するために使用する。当業者は、これらの抗体を作製し、抗原及び／又は抗体を従来の診断方法技術で利用するための知識と経験を持ち合わせている。
【０１２６】
本発明は、以下に実施例を用いてさらに詳細に記載されるが、これらの実施例は何の制限もないものとする
（実施例）
【０１２７】
全ての構築は、Sambrook J. et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition. Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor. New York, 1989) が開示した分子生物学の標準技術（クローニング、制限酵素による処理、相補一本鎖ＤＮＡ、ポリメラーゼ連鎖反応、ＤＮＡポリメラーゼによるオリゴヌレオチドの伸張等）を用いて行われる。本発明で用いる全ての制限断片及びポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の様々な増幅断片は、“Geneclean”キット (La Jolla社製)を用いて単離、精製した。
【実施例１】
【０１２８】
ウエストナイル熱ウイルスの調製
ウエストナイル熱ウイルスＮＹ９９(Lanciotti R. S. et al., Science, 1999, 286, 2333-7) を、ＶＥＲＯ細胞 (サルの腎細胞、ＣＣＬ−８１番でAmerican Type Culture Collection (ＡＴＣＣ)から入手可能)で培養し、増幅した。
【０１２９】
ＶＥＲＯ細胞を、２５ｃｍ2のFalcon内で、１ｍｌ当たり約１００，０００細胞を含む、１％の酵母エキス及び１０％の子ウシ血清を補充したＥａｇｌｅ−ＭＥＭ培地で培養した。細胞を、３７℃で５％のＣＯ2雰囲気下で培養した。
【０１３０】
３日後、細胞層がコンフルエントとなる。培養培地を、１％の酵母抽出物及び０．１％のウシ血清アルブミンを補充したＥａｇｌｅ−ＭＥＭ培地と置きかえ、ウエストナイル熱ウイルスを、５ｐｆｕ／細胞の割合で添加した。
【０１３１】
細胞変性効果（ＣＰＥ）が完了すると（概ね、培養開始４８〜７２時間後）、ウイルス懸濁液を回収し、遠心分離法により清澄化し、−７０℃で凍結した。ウイルスバッチを作製するには、概ね３〜４の連続した継代が必要である。ウイルスバッチは、−７０℃で保存する。
【実施例２】
【０１３２】
ウエストナイル熱ウイルスからウイルスＲＮＡの抽出
１００ｍｌのウエストナイル熱ウイルス株ＮＹ９９のウイルス懸濁液に含まれるウイルスＲＮＡを、《High Pure Viral RNA Kit》（Roche Molecular Biochemical社製）の溶液で溶解した後に、製造者の指示に従い、抽出した。最終的に抽出したＲＮＡ沈殿物を、Ｒ−Ｎａｓｅを含まない、消毒した蒸留水１〜２ｍｌで再懸濁した。
【実施例３】
【０１３３】
プラスミドpFC101の構築
ウエストナイル熱ウイルスＮＹ９９の相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を、Gene Amp RNA PCR Kit(Perkin-Elmer社製)を用いて、製造者からの条件に従い、合成した。
【０１３４】
逆転写反応と連鎖増幅反応（ＲＴ−ＰＣＲ反応）を、ウエストナイル熱ウイルスＮＹ９９のウイルスＲＮＡ懸濁液５０μｌ（実施例２）と、次のオリゴヌクレオチドと共に行った。
ＦＣ１０１ （３０ｍｅｒ）（配列番号１）
5'TTTTTTGAATTCGTTACCCTCTCTAACTTC3'
；及びＦＣ１０２（３３mｅｒ）（配列番号2）
5'TTTTTTTCTAGATTACCTCCGACTGCGTCTTGA3'
この１組のオリコヌクレオチドは、制限部位EcoRIと制限部位Xbalと挿入物の３'における停止コドンとの取込みを可能にする。
【０１３５】
第１ｃＤＮＡ鎖の合成は、ＲＮＡマトリックスにオリコヌクレオチドＦＣ１０２をハイブリダイゼーションした後、オリゴヌクレオチドＦＣ１０２の伸張によって起こる。
【０１３６】
第１ｃＤＮＡ鎖の合成条件は、４２℃で１５分、次いで９９℃で５分、最後に４℃で５分である。オリゴヌクレオチドＦＣ１０１及びＦＣ１０２の組の存在下でのＰＣＲ反応の条件は、９５℃で２分、次に３５サイクル（９５℃で１分、その後６２℃で１分、さらに７２℃で２分）であり、最後に７２℃で７分行い、３０２ｂｐの断片を作製する。
【０１３７】
この断片をEcoRI、さらにXbalで処理し、アガロースゲル電気泳動の後、約２９０ｂｐのEcoRI-Xbal断片を単離した。この断片は、断片Ａと呼ばれる。
【０１３８】
プラスミドpVR1012（ＷＯ−Ａ９８／０３１９９の図１及び実施例１；Hartikka J. et al., 1997, Human Gene Therapy, 7, 1205-1217）から派生した真核生物発現プラスミドpVR1020 (C. J. Luke et al. J. of Infectious Diseases. 1997. 175. 95-97)は、ヒト組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔＰＡ）のシグナル配列をコードするフレームを含んでいる。
【０１３９】
BamHI-BgIIIによる処理と、複数のクローニング部位（BamHI、 Notl、 EcoRI、Xbal、PmII、Pstl及びBgIII）を含み、次のオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションの結果である配列の挿入とにより、プラスミドpVR1020を修飾した。
ＢＰ３２６（４０ｍｅｒ）（配列番号３）
5'GATCTGCAGCACGTGTCTAGAGGATATCGAATTCGCGGCC3'
ＢＰ３２9（４０ｍｅｒ）（配列番号4）
5'GATCCGCGGCCGCGAATTCGATATCCTCTAGACACGTGCT3'
このように入手したベクターのサイズは約５１０５塩基対（ｂｐ）であり、pAB110と名付ける。
【０１４０】
断片Ａは、事前にXbal及びEcoRIで処理した発現プラスミドｐAB110と結紮し、プラスミドpFC101（５３７６ｂｐ）を作製した。このプラスミドは、ヒトサイトメガロウイルス又はｈＣＭＶ−ＩＥ(最初期ヒトサイトメガロウイルス)の初期プロモーターの制御下で、ｔＰＡのシグナル配列をコードする挿入断片、次にタンパク質ｐｒMをコードする配列を含む。
【実施例４】
【０１４１】
プラスミドpFC102の構築
ウエストナイル熱ウイルスＮＹ９９の相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を、Gene Amp RNA PCR Kit(Perkin-Elmer社製)を用いて、製造者からの条件で合成した。
【０１４２】
逆転写反応と連鎖増幅反応（ＲＴ−ＰＣＲ反応）を、ウエストナイル熱ウイルスＮＹ９９のウイルスＲＮＡ懸濁液５０μｌ（実施例２）と、次のオリゴヌクレオチドと共に行った。
ＦＣ１０３（３０ｍｅｒ）（配列番号５）
5'TTTTTTGAATTCTCACTGACAGTGCAGACA3'
；及びＦＣ１０４（３３ｍｅｒ）（配列番号６）
5'TTTTTTTCTAGATTAGCTGTAAGCTGGGGCCAC3'
この１組のオリコヌクレオチドは、制限部位EcoRIと制限部位Xbalと挿入物の３'における停止コドンとの取込みを可能にする。
【０１４３】
第１ｃＤＮＡ鎖の合成は、ＲＮＡマトリックスにオリコヌクレオチドＦＣ１０４をハイブリダイゼーションした後、オリゴヌクレオチドＦＣ１０４の伸張によって起こる。
【０１４４】
第１ｃＤＮＡ鎖の合成条件は、４２℃で１５分、次に９９℃で５分、最後に４℃で５分である。オリゴヌクレオチドＦＣ１０３及びＦＣ１０４の組の存在下でのＰＣＲ反応の条件は、９５℃で２分、次に３５サイクル（９５℃で１分、その後６２℃で１分、さらに７２℃で２分）であり、最後に７２℃で７分行い、２５２ｂｐの断片を作製した。
【０１４５】
この断片をEcoRI、次にXbalで処理し、アガロースゲル電気泳動の後、約２４０ｂｐのEcoRI−Xbal断片を単離した。この断片を、事前にXbal 及びEcoRIで処理した発現プラスミドpAb110（実施例３）と結紮し、プラスミドpFC102（５３２６ｂｐ）を作製した。このプラスミドは、ヒトサイトメガロウイルス又はｈＣＭＶ−ＩＥ(最初期ヒトサイトメガロウイルス)の初期プロモーターの制御下で、ｔＰＡのシグナル配列をコードする挿入断片、次にタンパク質Mをコードする配列を含む。
【実施例５】
【０１４６】
プラスミドpFC103の構築
ウエストナイル熱ウイルスＮＹ９９の相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）は、Gene Amp RNA PCR Kit (Perkin-Elmer社製)を用いて、製造者からの条件で合成した。
【０１４７】
逆転写反応と連鎖増幅反応（ＲＴ−ＰＣＲ反応）を、ウエストナイル熱ウイルスＮＹ９９のウイルスＲＮＡ懸濁液５０μｌ（実施例２）と、次のオリゴヌクレオチドと共に行った。
ＦＣ１０５（３０ｍｅｒ）（配列番号７）
5'TTTTTTGAATTCTTCAACTGCCTTGGAATG3'
；及びＦＣ１０４（３３ｍｅｒ）（配列番号８）
5'TTTTTTTCTAGATTAAGCGTGCACGTTCACGGA3'
この１組のオリコヌクレオチドは、EcoRI 制限部位と、Xbal制限部位と挿入物の３'における停止コドンとの取込みを可能にする。
【０１４８】
第１ｃＤＮＡ鎖の合成は、ＲＮＡマトリックスにオリコヌクレオチドＦＣ１０６をハイブリダイゼーションした後、オリゴヌクレオチドＦＣ１０６の伸張によって起こる。
【０１４９】
第１ｃＤＮＡ鎖の合成条件は、４２℃で１５分、次に９９℃で５分、さらに４℃で５分である。オリゴヌクレオチドＦＣ１０５及びＦＣ１０６の組の存在下でのＰＣＲ反応の条件は、９５℃で２分、次に３５サイクル（９５℃で１分、その後６２℃で１分、さらに７２℃で２分）であり、最後に７２℃で７分行い、１５３０ｂｐの断片を作製した。
【０１５０】
この断片をEcoRIで、次にXbalで処理し、アガロースゲル電気泳動の後、約１５１８ｂｐのEcoRI−Xbal断片を単離した。この断片を、事前にXbal及びEcoRIで処理した発現プラスミドpAb110（実施例３）で結紮し、プラスミドｐFC103（６６０４ｂｐ）を産出した。このプラスミドは、ヒトサイトメガロウイルス又はｈＣＭＶ−ＩＥ(最初期ヒトサイトメガロウイルス)の初期プロモーターの制御下で、ｔＰＡのシグナル配列をコードする挿入断片、次にタンパク質Eをコードする配列を含む。
【実施例６】
【０１５１】
プラスミドpFC104の構築
ウエストナイル熱ウイルスＮＹ９９の相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）は、Gene Amp RNA PCR Kit(Perkin-Elmer社製)を用いて、製造者からの条件で合成した。
【０１５２】
逆転写反応と連鎖増幅反応（ＲＴ−ＰＣＲ反応）を、ウエストナイル熱ウイルスＮＹ９９のウイルスＲＮＡ懸濁液５０μｌ（実施例２）と、次のオリゴヌクレオチドと共に行った。
ＦＣ１０１（３０ｍｅｒ）（配列番号１）；及び
ＦＣ１０６（３３ｍｅｒ）（配列番号８）
この１組のオリコヌクレオチドは、制限部位EcoRIと、制限部位Xbalと挿入物の３'における停止コドンとの取込みを可能にする。
【０１５３】
第１ｃＤＮＡ鎖の合成は、ＲＮＡマトリックスにオリコヌクレオチドＦＣ１０６をハイブリダイゼーションした後、オリゴヌクレオチドＦＣ１０６の伸張によって起こる。
【０１５４】
第１ｃＤＮＡ鎖の合成条件は、４２℃で１５分、次に９９℃で５分、最後に４℃で５分である。オリゴヌクレオチドＦＣ１０１及びＦＣ１０６の組の存在下でのＰＣＲ反応の条件は、９５℃で２分、次に３５サイクル（９５℃で１分、その後６２℃で１分、さらに７２℃で２分）であり、最後に７２℃で７分行い、２０３１ｂｐの断片を作製した。
【０１５５】
この断片をEcoRI、次にXbalで処理し、アガロースゲル電気泳動の後、約２０１９ｂｐのEcoRI−Xbal断片を単離した。この断片を、事前にXbal及びEcoRIで処理した発現プラスミドpAb110（実施例３）と結紮し、プラスミドpFC104（７１０５ｂｐ）を作製した。このプラスミドは、ヒトサイトメガロウイルス又はｈＣＭＶ−ＩＥ(最初期ヒトサイトメガロウイルス)の初期プロモーターの制御下で、ｔＰＡのシグナル配列をコードする挿入断片、次にタンパク質ｐｒM−M−Eをコードする配列を含む。
【実施例７】
【０１５６】
プラスミドpFC105の構築
ウエストナイル熱ウイルスＮＹ９９の相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）は、Gene Amp RNA PCR Kit(Perkin-Elmer社製)を用いて、製造者からの条件で合成した。
【０１５７】
逆転写反応と連鎖増幅反応（ＲＴ−ＰＣＲ反応）を、ウエストナイル熱ウイルスＮＹ９９のウイルスＲＮＡ懸濁液５０μｌ（実施例２）と、次のオリゴヌクレオチドと共に行った。
ＦＣ１０７（３６ｍｅｒ）（配列番号９）
5'TTTTTTGATATCACAGGAATTGCAGTCATGATTGGC3'
；及びＦＣ１０６（３３ｍｅｒ）（配列番号８）
この１組のオリコヌクレオチドは、制限部位EcoRIと、制限部位Xbalと挿入物の３'における停止コドンとの取込みを可能にする。
【０１５８】
第１ｃＤＮＡ鎖の合成は、ＲＮＡマトリックスにオリコヌクレオチドＦＣ１０６をハイブリダイゼーションした後、オリゴヌクレオチドＦＣ１０６の伸張によって起こる。
【０１５９】
第１ｃＤＮＡ鎖の合成条件は、４２℃で１５分、次に９９℃で５分、さらに４℃で５分である。オリゴヌクレオチドＦＣ１０６及びＦＣ１０７の組の存在下でのＰＣＲ反応の条件は、９５℃で２分、次に３５サイクル（９５℃で１分、その後６２℃で１分、さらに７２℃で２分）であり、最後に７２℃で７分行い、２０７６ｐｂの断片を作製した。
【０１６０】
この断片をEcoRV、次にXbalで処理し、アガロースゲル電気泳動の後、約２０５８ｂｐのEcoRV−Xbal断片を単離した。
【０１６１】
この断片を、事前にXbal及びEcoRVで処理した発現プラスミドpAb1012と結紮し、プラスミドpCF10５（６９５３ｂｐ）を産出した。このプラスミドは、ヒトサイトメガロウイルス又はｈＣＭＶ−ＩＥ(最初期ヒトサイトメガロウイルス)の初期プロモーターの制御下で、ｔＰＡの活性剤のシグナル配列をコードする挿入断片、次にタンパク質ｐｒＭ−Ｍ−Ｅをコードする配列を含む。
【実施例８】
【０１６２】
プラスミドpFC106の構築
ウエストナイル熱ウイルスＮＹ９９の相補ＤＮＡ（ＤＮＡｃ）は、Gene Amp RNA PCR Kit(Perkin-Elmer社製)を用いて、製造者からの条件で合成した。
【０１６３】
逆転写反応と連鎖増幅反応（ＲＴ−ＰＣＲ反応）を、ウエストナイル熱ウイルスＮＹ９９のウイルスＲＮＡ懸濁液５０μｌ（実施例２）と、次のオリゴヌクレオチドと共に行った。
ＦＣ１０８（３６ｍｅｒ）（配列番号１０）
5'TTTTTTGATATCATGTATAATGCTGATATGATTGAC3'
；及びＦＣ１０９（３６ｍｅｒ）（配列番号１１）
5'TTTTTTTCTAGATTAACGTTTTCCCGAGGCGAAGTC3'
この１組のオリコヌクレオチドは、制限部位EcoRIと、制限部位Xbal、挿入物の５'におけるＡＴＧ開始コドン及び３'における停止コドンとの取込みを可能にする。
【０１６４】
第１ｃＤＮＡ鎖の合成は、ＲＮＡマトリックスにオリコヌクレオチドＦＣ１０９をハイブリダイゼーションした後、オリゴヌクレオチドＦＣ１０９の伸張によって起こる。
【０１６５】
第１ｃＤＮＡ鎖の合成条件は、４２℃で１５分、次に９９℃で５分、さらに４℃で５分である。オリゴヌクレオチドＦＣ１０８及びＦＣ１０９の組の存在下でのＰＣＲ反応の条件は、９５℃で２分、次に３５サイクル（９５℃で１分、その後６２℃で１分、さらに７２℃で２分）であり、最後に７２℃で７分行い、２９７３ｐｂの断片を作製した。
【０１６６】
この断片をEcoRV、次にXbalで処理し、アガロースゲル電気泳動の後、約２９５５ｂｐのEcoRV−Xbal断片を単離した。
【０１６７】
この断片を、事前にXbal 及びEcoRVで処理した発現プラスミドpAb1012と結紮し、プラスミドpFC106（７８５０ｂｐ）を作製した。このプラスミドは、ヒトサイトメガロウイルス又はｈＣＭＶ−ＩＥ(最初期ヒトサイトメガロウイルス)の初期プロモーターの制御下で、ｔＰＡのシグナル配列をコードする挿入断片、次にポリタンパク質ＮＳ２Ａ−ＮＳ２Ｂ−ＮＳ３をコードする配列を含む。
【実施例９】
【０１６８】
ＡＬＶＡＣカナリア痘ウイルスのＣ５部位に挿入するドナープラスミドの構築
ＵＳ−Ａ−５７５６１０３の図１６は、３１９９ｂｐのカナリア痘ウイルスのゲノムＤＮＡ断片の配列を示している。この配列の分析により、Ｃ５Ｌと呼ばれ、１５３８番目の位置で開始し、１８５９番目の位置で停止する、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が明らかになった。ＯＲＦ Ｃ５Ｌの欠失を導く挿入プラスミドの構築と、転写及び翻訳停止シグナルが隣接する多重クローニング部位による置換とを、下記の方法で行った。
【０１６９】
ＰＣＲ反応を、カナリア痘ウイルスのゲノムＤＮＡで構成されたマトリックスを基にして、下記オリゴヌクレオチドを用いて行い、２２３ｂｐのＰＣＲ断片（断片Ｂ）を単離した。
Ｃ５Ａ１（４２ｍｅｒ）（配列番号１２）
5'ATCATCGAGCTCCAGCTGTAATTCATGGTCGAAAAGAAGTGC3'
；及びＦＣ１０９（３６ｍｅｒ）（配列番号１３）
5'GAATTCCTCGAGCTGCAGCCCGGGTTTTTATAGCTAATTAGTCATTTTTTGAGAGTACCACTTCAGCTACCTC3'
ＰＣＲ反応を、カナリア痘ウイルスのゲノムＤＮＡで構成されたマトリックスを基にして、下記オリゴヌクレオチドを用いて行い、４８２ｂｐのＰＣＲ断片（断片C）を単離した。
Ｃ５Ｃ１（７２ｍｅｒ）（配列番号１４）
5'CCCGGGCTGCAGCTCGAGGAATTCTTTTTATTGATTAACTAGTCATTATAAAGATCTAAAATGCATAATTC3'
；及びＣ５Ｄ１（４５ｍｅｒ）（配列番号１５）
5GATGATGGTACCGTAAACAAATATAATGAAAAGTATTCTAAACTA3'
断片Ｂ及びＣを共にハイブリダイダイゼーションし、オリゴヌクレオチドＣ５Ａ１（配列番号１２）及びＣ５Ｄ１（配列番号１５）で行ったＰＣＲ反応のマトリックスとして使用し、６８１ｂｐのＰＣＲ断片を作製した。この断片を、制限酵素Sacl及びKpnlで処理し、アガロースゲル電気泳動の後、６６４ｂｐのSacl−Kpnl断片を単離した。この断片を、事前に制限酵素Sacl及びKpnlで処理したpBlueScript II SK+ ベクター（Stratagene社製）と結紮し、プラスミドpC5Lを作製した。このプラスミドの配列は、シークエンシングにより確認した。このプラスミドは、ＯＲＦ Ｃ５Ｌ（《左側面アームＣ５》）の上流に局在する１６６ｂｐの配列、転写初期停止ワクチンシグナル、６つのリーディングフレーム内の停止コドン、制限部位Smal、Pstl、Xhol及びEcoRI を含む多重クローニング部位、及びＯＲＦ Ｃ５Ｌ（右フランキングアームＣ５）の下流に局在する４２５ｋｐの配列を含む。
【０１７０】
プラスミドpMP528HRH（Perkus M. et al. J. Virol. 1989, 63, 3829-3836） を、下記ヌクレオチドと共に、ワクチンプロモーターＨ６（GenBank アクセス番号 Ｍ２８３５１）の完全な配列を増幅するためにマトリックスとして使用し、１４９ｂｐのＰＣＲ断片を増幅した。
ＪＣＡ２９１（３４ｍｅｒ）（配列番号１６）
5'AAACCCGGGTTCTTTATTCTATACTTAAAAAGTG3'
；及びＣ５Ｄ１（４５ｍｅｒ）（配列番号１５）
5'AAAAGAATTCGTCGACTACGATACAAACTTAACGGATATCGCG3'
この断片を制限酵素Smal及びEcoRIで処理し、アガロースゲル電気泳動の後、１３８ｂｐの制限断片Smal−EcoRIを単離した。この断片を、あらかじめ制限酵素Smal及びEcoRIで処理したプラスミドpC5Lと結紮し、プラスミドpFC107を作製した。
【実施例１０】
【０１７１】
組換え型ウイルスｖＣＰ１７１２の構築
ＰＣＲ反応を、プラスミドpFC105（実施例７）をマトリックスとして、及び下記オリゴヌクレオチドを用いて行い、約２０７９ｋｂのＰＣＲ断片を増幅した。
ＦＣ１１０（３３ｍｅｒ）（配列番号１８）
5'TTTTCGCGAACCGGAATTGCAGTCATGATTGGC3'
；及びＦＣ１１１（３９ｍｅｒ）（配列番号１９）
5'TTTTGTCGACGCGGCCGCTTAAGCGTGCACGTTCACGGA3'
この断片を、制限酵素Nrul及びSallで処理し、アガロースゲル電気泳動の後、約２０６８ｂｐのNrul−Sall断片を単離した。この断片を、事前に制限酵素Nrul及びSallで処理したプラスミドpFC107（実施例９）と結紮し、プラスミドpFC108を作製した。
【０１７２】
プラスミドpFC108を、Notlで直線化し、カナリア痘ウイルス（ＡＬＶＡＣ株）を感染した初期ニワトリ胚細胞に、文献（Panicali et Paoletti Proc. Nat. Acad. Sci. 1982, 79, 4927-4931; Piccini et al., In Methods in Enzymology. 1987, 153, 545-563, Eds. Wu R. Grossman L. Academic Press）記載のリン酸カルシウム沈殿法に従って、トランスフェクトした。陽性プラークを、エンベロープ糖タンパク質Ｅのヌクレオチド配列特異的な、放射活性がある標識化したプローブとのハイブリダイゼーションに基づき選択した。これらのプラークは、４回の連続したプラークの選択／浄化サイクルを経て、純粋な個体群を単離した。次に、ドナープラスミドpFC108とＡＬＶＡＣカナリア痘ウイルスのゲノムとのインビトロでの組換えの代表的なプラークを増幅し、その結果得た組換え型ウイルスストックを、ｖＣＰ１７１２と名付けた。
【実施例１１】
【０１７３】
組換え型ウイルスｖＣＰ１１７３の構築
プラスミドpFC104（実施例６）を、制限酵素Sall及びPmllで処理し、アガロースゲル電気泳動の後、約２２１３ｂｐの制限断片Pmll-Sallを単離した。この断片を、事前に制限酵素Nrul及びSallで処理したプラスミドpFC107（実施例９）と結紮し、プラスミドpFC109を作製した。
【０１７４】
プラスミドpFC109を、Notlで直線化し、実施例１０の技法に従って、カナリア痘ウイルス（ＡＬＶＡＣ株）を感染した初期ニワトリ胚細胞内にトランスフェクトした。ドナープラスミドpFC109とＡＬＶＡＣカナリア痘ウイルスのゲノムとのインビトロでの組替えの代表的なプラークを、エンベロープ糖タンパク質Ｅのヌクレオチド配列特異的な、放射活性があると標識化したプローブとのハイブリダイゼーションを基に選択し、次に増幅した。その結果得た組換え型ウイルスストックを、ｖＣＰ１７１３と名付けた。
【実施例１２】
【０１７５】
組換え型ウイルスｖＣＰ１７１４の構築
プラスミドpFC103（実施例５）を、制限酵素Sall及びPmllで処理し、アガロースゲル電気泳動の後、約１７１２ｂｐの制限断片Pmll−Sallを単離した。この断片を、事前に制限酵素Nrul及びSallで処理したプラスミドpFC107（実施例９）と結紮し、プラスミドpFC110を作製した。
【０１７６】
プラスミドpFC110を、Notlで直線化 し、実施例１０の技法に従って、カナリア痘ウイルス（ＡＬＶＡＣ株）に感染した初期ニワトリ胚細胞内にトランスフェクトした。ドナープラスミドpFC110とＡＬＶＡＣカナリア痘ウイルスのゲノムとのインビトロでの組換えの代表的なプラークを、エンベロープ糖タンパク質Ｅのヌクレオチド配列特異的な、放射活性がある標識化したプローブとのハイブリダイゼーションに基づき選択し、次に増幅した。その結果得た組換え型ウイルスストックを、ｖＣＰ１７１４と名付けた。
【実施例１３】
【０１７７】
組換え型ウイルスｖＣＰ１７１５の構築
プラスミドpFC102（実施例４）を、制限酵素Sall及びPmllで処理し、アガロースゲル電気泳動の後、約４３４ｂｐの制限断片Pmll−Sallを単離した。この断片を、事前に制限酵素Nrul及びSallで処理したプラスミドpFC107（実施例９）と結紮し、プラスミドpFC111を作製した。
【０１７８】
プラスミドpFC111を、Notlで直線化し、実施例１０の技法に従って、カナリア痘ウイルス（ＡＬＶＡＣ株）に感染した初期ニワトリ胚細胞内にトランスフェクトした。ドナープラスミドpFC111とＡＬＶＡＣカナリア痘ウイルスのゲノムとのインビトロでの組換えの代表的なプラークを、エンベロープ糖タンパク質Ｅのヌクレオチド配列特異的な、放射活性がある標識化したプローブとのハイブリダイゼーションに基づき選択し、次に増幅した。その結果得た組換え型ウイルスストックを、ｖＣＰ１７１５と名付けた。
【実施例１４】
【０１７９】
組換え型ウイルスｖＣＰ１７１６の構築
プラスミドpFC101（実施例３）を、制限酵素Sall及びPmllで処理し、アガロースゲル電気泳動の後、約４８４ｂｐの制限断片Pmll−Sallを単離した。この断片を、事前に制限酵素Nrul及びSallで処理したプラスミドpFC107（実施例９）と結紮し、プラスミドpFC112を作製した。
【０１８０】
プラスミドpFC112を、Notlで直線化し、実施例１０の技法に従って、カナリア痘ウイルス（ＡＬＶＡＣ株）に感染した初期ニワトリ胚細胞内にトランスフェクトした。ドナープラスミドpFC112とＡＬＶＡＣカナリア痘ウイルスのゲノムとのインビトロでの組換えの代表的なプラークを、エンベロープ糖タンパク質Ｅのヌクレオチド配列に特異的な、放射活性がある標識化したプローブとのハイブリダイゼーションに基づき選択し、次に増幅した。その結果得た組換え型ウイルスストックを、ｖＣＰ１７１６と名付けた。
【実施例１５】
【０１８１】
ＡＬＶＡＣカナリア痘ウイルスのＣ６部位に挿入するドナープラスミドの構築
ＷＯ−Ａ−０１／０５９３４の図４は、３７００ｂｐのカナリア痘ウイルスのゲノムＤＮＡ断片の配列を示している。この配列の分析により、Ｃ６Ｌと呼ばれ、３７７番目の位置で開始し、２２５４番目の位置で停止するオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が明らかになった。ＯＲＦ Ｃ５Ｌの欠失と、転写及び翻訳停止位置シグナルが隣接した多重クローニング部位による置換とを導く挿入プラスミドの構築は、下記の方法で行われた。
【０１８２】
ＰＣＲ反応を、カナリア痘ウイルスのゲノムＤＮＡで構成されたマトリックスを基にして、下記オリゴヌクレオチドを用いて行い、約４３２ｋｂのＰＣＲ断片（断片Ｄ）を単離した。
Ｃ６Ａ１（４２ｍｅｒ）（配列番号２０）
5'ATCATCGAGCTCGCGGCCGCCTATCAAAAGTCTTAATGAGTT3'
；及びＣ６Ｂ１（７３ｍｅｒ）（配列番号２１）
5'GAATTCCTCGAGCTGCAGCCCGGGTTTTTATAGCTAATTAGTCATTTTTTCGTAAGTAAGTATTTTTATTTAA3'
ＰＣＲ反応を、カナリア痘ウイルスのゲノムＤＮＡで構成されたマトリックスを基にして、下記オリゴヌクレオチドを用いて行い、１２１０ｋｂのＰＣＲ断片（断片Ｅ）を単離した。
Ｃ６Ｃ１（７２ｍｅｒ）（配列番号２２）
5'CCCGGGCTGCAGCTCGAGGAATTCTTTTTATTGATTAACTACTAGTCAAATGAGTATATATAATTGAAAAAGTAA 3'
；及びＣ６Ｂ１（７３ｍｅｒ）（配列番号２３）
5'GATGATGGTACCTTCATAAATACAAGTTTGATTAAACTTAAGTTG 3'
断片Ｄ及びＥは、オリゴヌクレオチドＣ６Ａ１（配列番号２０）及びＣ６Ｄ１（配列番号２３）とのＰＣＲ反応のマトリックスにできるように、共にハイブリダイゼーションを行い、１６３０ｂｐのＰＣＲ断片を作製した。この断片を、制限酵素Sacl及びKpnlで処理し、アガロースゲル電気泳動の後、１６１３ｂｐのSacl−Kpnl断片を単離した。この断片を、事前に制限酵素Sacl及びKpnlで処理したbplueScriptc II＋ベクター（Stratagene社製）で直線化し、プラスミドpCL6Lを作製した。このプラスミドの配列はシークエンシングによって確認した。このプラスミドは、ＯＲＦ Ｃ６Ｌ（左フランキングアームＣ６）の上流に局在する３７０ｂｐの配列、初期転写停止ワクチンシグナル、６つのリーディングフレーム内の停止コドン、制限部位Smal、Pstl、Xholを含む多重クローニング部位及びＯＲＦ Ｃ６Ｌ（右フランキングアームＣ６）に局在する１１５６bｐの配列を含む。
【０１８３】
プラスミドpMPIVC(Schmitt J.F.C et al, J. Virol, 1988, 62, 1889-1897; Saiki R. K. et al., Science, 1988, 239, 487-491) は、下記オリゴヌクレオチドと共に、ワクチンプロモーターＩ３Ｌの完全配列を増幅するマトリックスとして用いて、１５１ｋｂのＰＣＲ断片を増幅した。
ＦＣ１１２（３３ｍｅｒ）（配列番号２４）
5'AAACCCGGGCGGTGGTTTGCGATTCCGAAATCT3'
；及びＦＣ１１３（４３ｍｅｒ）（配列番号２５）
5'AAAAGAATTCGGATCCGATTAAACCTAAATAATTGTACTTTGT3'
この断片を、制限酵素Smal及びEcoRIで処理し、アガロースゲル電気泳動の後、約１３６ｂｐの制限酵素Smal−EcoRIを単離した。この断片を、事前にSmal及びEcoR1で処理したプラスミドpC6Lと結紮し、プラスミドpFC113を作製した。
【実施例１６】
【０１８４】
組換え型ウイルスｖＣＰ１７１７及びｖＣＰ１７１８の構築
ＰＣＲ反応を、プラスミドpFC106（実施例８）をマトリックスとして、及び下記ヌクレオチドを用いて行い、約２９７３ｂｐのＰＣＲ断片を増幅した。
ＦＣ１１４（３３ｍｅｒ）（配列番号２６）
5'TTTCACGTGATGTATAATGCTGATATGATTGAC3'
；及びＦＣ１１５（４２ｍｅｒ）(配列番号２７)
5'TTTTGGATCCGCGGCCGCTTAACGTTTTCCCGAGGCGAAGTC3'
この断片を、制限酵素Pmll及びBamHIで処理し、アガロースゲル電気泳動の後、約２９５８ｂｐのPmII−BamHI制限断片（断片Ｆ）を単離した。プラスミドpFC113（実施例１５）を制限酵素PmII及びBamHIで処理し、アガロースゲル電気泳動の後、約４５００ｂｐのPmII−BamHI（断片Ｇ）制限断片を単離した。次に、断片ＦとＧを結紮し、プラスミドpFC114を作製した。
【０１８５】
プラスミドpFC114を、Notlで直線化し、カナリア痘ウイルスｖＣＰ１７１３（実施例１１）を感染した初期ニワトリ胚細胞に、文献（Panicali et Paoletti Proc. Nat. Acad. Sci. 1982, 79, 4927-4931; Piccini et al., In Methods in Enzymology. 1987, 153, 545-563, Eds. Wu R. Grossman L. Academic Press）記載のリン酸カルシウム沈殿法に従って、トランスフェクトした。陽性プラークを、エンベロープ糖タンパク質Ｅのヌクレオチド配列特異的な、放射活性がある標識化したプローブとのハイブリダイゼーションを基に選択した。これらのプラークは、４回の連続したプラークの選択／浄化サイクルを経て、純粋な個体群を単離した。次に、ドナープラスミドpFC114とＡＬＶＡＣカナリア痘ウイルスのゲノムとのインビトロでの組換えの代表的なプラークを増幅し、その結果得た組換え型ウイルスストックを、ｖＣＰ１７１７と名付けた。
【０１８６】
Notlで直線化したプラスミドpFC114を、カナリア痘ウイルスｖCP１７１２（実施例１０）を感染した初期ニワトリ胚細胞を、上述した方法でトランスフェクトするためにも用いた。かかる方法で入手した組換え型ウイルスストックを、ｖＣＰ１７１８と名付けた。
【実施例１７】
【０１８７】
プラスミドpFC115の構築
ウエストナイル熱ウイルスＮＹ９９の相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）は、Gene Amp RNA PCR Kit(Perkin-Elmer社製)を用いて、製造者からの条件で合成した。
【０１８８】
逆転写ポリメラーゼ鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ反応）を、ウエストナイル熱ウイルスＮＹ９９（実施例２）のウイルスＲＮＡ懸濁液５０μｌと、下記オリゴヌクレオチドと共に行った。
ＦＣ１１６（３９ｍｅｒ）（配列番号２８）
5'TTTTTTGATATCATGACCGGAATTGCAGTCATGATTGGC3'
；及びＦＣ１０６（３３ｍｅｒ）（配列番号８）
このオリゴヌクレオチドの対は、制限部位EcoRV、制限部位Ｘbal、挿入物の５'の開始コドン及び、３'における停止コドンの取込みを可能にする。
【０１８９】
第１ｃＤＮＡ鎖の合成条件は、４２℃で１５分、次に９９℃で５分、さらに４℃で５分である。オリゴヌクレオチドＦＣ１０６及びＦＣ１１６の組の存在下でのＰＣＲ反応の条件は、９５℃で２分、次に３５サイクル（９５℃で１分、その後６２℃で１分、さらに７２℃で２分）であり、最後に７２℃で７分行い、２０７９ｋｂの断片を作製した。
【０１９０】
この断片を、EcoRV及びXbalで処理し、アガロースゲル電気泳動の後、約２０６１ｂｐのEcoRV−Xbal断片を単離した。
【０１９１】
この断片を、事前にXbal及びEcoRＶで処理された発現プラスミドpVR1012と結紮し、プラスミドpFC115（６９５６ｂｐ）を作製した。このプラスミドは、ヒトサイトメガロウイルス又はｈＣＭＶ−ＩＥ(最初期ヒトサイトメガロウイルス)の初期プロモーターの制御下で、ｔＰＡのシグナル配列をコードする挿入断片、次にタンパク質ｐｒＭ−Ｍ−Ｅをコードする配列を含む。
【実施例１８】
【０１９２】
組換え型ウイルスｖＣＰ２０１７の構築
ＰＣＲ反応を、マトリックスとしてプラスミドpFC115（実施例１７）を、及び下記オリゴヌクレオチドを用いて行い、約２０８２ｂｐのＰＣＲ断片を増幅した。
ＦＣ１１７（３６ｍｅｒ）（配列番号２９）
5'TTTTCGCGAATGACCGGAATTGCAGTCATGATTGGC3'
：及びＦＣ１１１（３９ｍｅｒ）（配列番号１９）
この断片を、制限酵素Nrul及びSallで処理し、アガロースゲル電気泳動の後、約２０７１ｂｐの制限断片Nrul−Sallを単離した。この断片を、事前にNrul及びSallで処理したプラスミドpFC107（実施例９）と結紮し、プラスミドpFC 116を作製した。
【０１９３】
プラスミドpFC116を、Notlで直線化し、実施例１０記載の方法で、カナリア痘ウイルス（ＡＬＶＡＣ株）を感染した初期ニワトリ胚細胞にトランスフェクトした。ドナープラスミドpFC116及びＡＬＶＡＣカナリア痘ウイルスのゲノムとのインビトロでの組換えの代表的なプラークを、エンベロープ糖タンパク質Ｅの配列に特異的な放射性に標識化したプローブとのハイブリダイゼーションを基に選択し、次に増幅した。その結果得た組換え型ウイルスストックは、ｖＣＰ２０１７と名付けた。
【実施例１９】
【０１９４】
組換え型ワクチンの調製
ウマのワクチンを調製するために、組換え型カナリア痘ウイルスｖＣＰ１７１２（実施例１０）を、BF Goodrichが製造したCarbopol９７４Ｐ（分子量、約３００００００）等のカルボマー溶液でアジュバントした。
【０１９５】
１．５％のCarbopol９７４Ｐ保存溶液を、まず１ｇ／ｌの塩化ナトリウムを含む蒸留水内で調製した。次に、この保存溶液を用いて、生理食塩水内の４ｍｇ／ｍｌのCarbopol９７４Ｐ溶液を生成した。保存溶液と、１回の段階又は複数回の連続した段階を経て、適量の生理食塩水と混合し、ｐＨ値を各段階で１Ｎ（又はさらに濃縮した）の水酸化ナトリウム溶液で調整し、最終的なｐＨ値が７．３〜７．４となるようにした。
【０１９６】
かかる方法で入手した、すぐに使用できるCarbopol９７４Ｐ溶液は、組換え型の凍結乾燥したウイルスの回収、又は組換え型ウイルスが濃縮した保存溶液の希釈に用いる。例えば、用量１ｍｌ当たり１０8ｐｆｕを含むウイルス懸濁液を得るには、１０8.3ｐｆｕ／ｍｌの力価が得られるよう、ウイルス保存溶液を希釈し、その後、同量の、すぐに使用できる前記４ｍｇ／ｍｌのCarbopol９７４Ｐ溶液に希釈する。
【０１９７】
組換え型ウイルスを、組換え型カナリア痘ウイルスｖＣＰ１７１３（実施例１１）、ｖＣＰ１７１７（実施例１６）、ｖＣＰ１７１８（実施例１６）、ｖＣＰ２０１７（実施例１８）、又はｖＣＰ１７１４（実施例１２）、ｖＣＰ１７１５（実施例１３）とｖＣＰ１７１６（実施例１４）の３つのカナリア痘を上記の方法で混合したもので作製することができる。
【実施例２０】
【０１９８】
ウマ用のＤＮＡワクチンの製造
プラスミドpFC104（実施例６）を含むＤＮＡ溶液を、Sambrook et al (1989)に記載の方法で、エタノール沈殿法で濃縮した。ＤＮＡ沈殿物を、０．９％ＮａＣｌ溶液で回収し、１ｍｇ／ｍｌの濃度を得た。０．７５ｍＭのＤＭＲＩＥ−ＤＯＰＥ溶液を、適切な体積の無菌Ｈ2ＯによってＤＭＲＩＥ−ＤＯＰＥ凍結乾燥物を回収して、調製した。
【０１９９】
プラスミド−脂質ＤＮＡ複合体は、０．９％のＮａＣｌ溶液内に、１ｍｇ／ｍｌのＤＮＡ溶液を、同量の０．７５ｍＭのＤＭＲＩＥ−ＤＯＰＥ溶液（１：１）を希釈することにより作製する。ＤＮＡ溶液を、気泡を形成しないように、陽イオン性の脂質溶液を含むフラスコの壁沿いに、２６Ｇの針で徐々に注入した。２種類の溶液の混合後直ちに、ゆっくりと攪拌する。最終的に、０．３７５ｍＭのＤＭＲＩＥ−ＤＯＰＥと５００μｌ／ｍｌのプラスミドとを含む組成物を得た。
【０２００】
上記記載の全ての工程に使用する全ての溶液が、外界温度であることが望ましい。ＤＮＡ／ＤＭＲＩＥ−ＤＯＰＥの複合体は、動物を免疫化する３０分間に、外界温度に放置する。
【０２０１】
ＤＮＡワクチンを、本実施例に記載の方法で、プラスミドpFC104（実施例６）及びpFC106（実施例８）や、プラスミドpFC105（実施例７）及びpFC106や、プラスミドpFC115（実施例１７）及びpFC106や、プラスミドpFC101、pFC102及びpFC103（実施例３〜５）、若しくはプラスミドpFC105又はpFC115を含むＤＮＡ溶液で作製することができる。
【実施例２１】
【０２０２】
インビトロでの発現検査
各構築におけるＷＮタンパク質の発現を、従来の間接免疫蛍光法及びウェスタンブロット法で検査した。
【０２０３】
これらの検査は、単層で培養し、プラスミドでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞、又は単層で培養し、組換え型ウイルスで感染したＣＥＦ細胞を含む、９６ウェルプレートで行った。
【０２０４】
ＷＮタンパク質は、感染したニワトリ又はウマの血清、若しくは標識化した抗血清を用いて検出される。
【０２０５】
アガロースゲルに移した後に入手した断片のサイズを、想定していたものと比較した。
【実施例２２】
【０２０６】
動物への効果
約７日齢の、ワクチンを接種していないＳＰＦのニワトリに、約０．１ｍｌの組換え型ワクチン及びプラスミドワクチンを、約二週間間隔で２回、筋肉内に注入した。ワクチンを接種していない、コントロール群も本研究に含まれる。
【０２０７】
ニワトリの頸部に、１０3-4ＲＣＩＤ50のウイルスＷＮ病原性物質を注入した。
【０２０８】
その結果、ウイルス血症、抗体反応及び死を観察した。病変を観察するために、死体解剖を行った。
【実施例２３】
【０２０９】
抗ＷＮＶ中和抗体の滴定
一連の希釈を、細胞培養用の９６ウェルプレート内の、１０％のウシ胎児血清を添加したＤＭＥＭ培地で、各血清に３の割合で行った。０．０５ｍｌの希釈血清に、約１００のＣＣＩＰ50／ｍｌのＷＮＶを含む０．０５ｍｌの培養培地を添加した。この混合物を２時間、３７℃で５％のＣＯ2を含む雰囲気下の消毒器内でインキュベートした。
【０２１０】
次に、１ｍｌ当たり約１０００００細胞を含むＶＥＲＯ細胞の懸濁液０．１５ｍｌを、各混合物に添加した。３７℃で、５％のＣＯ2を含む雰囲気下で４〜５日培養した後、位相差顕微鏡で細胞変性効果（ＣＰＥ）を観察した。各血清の中和力価を、Karber 法で算出した。５０％のウェルで変性効果を抑制する、最高希釈として力価を示す。力価は、log10 ＶＮ５０で現す。各血清を、少なくとも２回、好ましくは４回滴定する。
【実施例２４】
【０２１１】
馬におけるｖＣＰ２０１７の検査
１ｍｌのCarbopol９７４Ｐ アジュバント（４ｍｇ／ｍｌ）と短時間で作製したｖＣＰ２０１７（実施例１８）を含む組換え型ワクチンを、３５日間隔で、２回にわたり、事前にワクチンを接種していない３ヶ月齢以上の馬に、約１ｍｌの用量を筋肉内に注入した。３つの動物群にワクチン接種し、グループ１には、１０5.8ＣＣＩＤ50（つまり１０5.64ｐｆｕ）、グループ２には１０6.8ＣＣＩＤ50（つまり１０6.64ｐｆｕ）、グループ３には、１０7.8ＣＣＩＤ50（つまり１０7.64ｐｆｕ）の用量を注入した。ワクチンを接種しないコントロール群も本研究に含まれる。
【０２１２】
血清学を観察した。中和抗体力価が築かれ、実施例２３で示したように、log10 ＶＮ５０で表した。
【０２１３】
【表１】
【０００１】
本発明は、ウエストナイル熱ウイルスのポリヌクレオチドを少なくとも１つを含み、インビボ及びインビトロで発現する発現ベクター、及びウエストナイル熱に対する免疫原性を有する組成物並びにワクチンに関する。また、かかるウイルスに対する免疫化及びワクチン接種の方法にも関する。
【０００２】
ウエストナイル熱ウイルス（ウエストナイルウイルス又はＷＮＶ）は、１９３７年に初めてウガンダの西ナイル地方で、ヒトにおいて同定された（非特許文献１）。
【０００３】
アフリカで広まり、インド、パキスタン及び地中海湾でも発見され、１９９９年に、アメリカでは初めてニューヨーク市で同定された（非特許文献２）。
【０００４】
ウエストナイル熱ウイルスは、鳥類、哺乳類及びヒトでも発症する。
【０００５】
鳥類における病気の特徴は、中枢神経系の発作と死である。病変は、脳炎、心筋の出血、並びに腸管の出血及び壊死を含む。
【０００６】
カラスで単離したウエストナイル熱ウイルスを、ニワトリに皮下接種して、実験的に感染させたところ、接種の５〜１０日後に心筋の出血、腎炎及び肺炎を、接種の２１日後には中度から重症の脳炎を誘発した（非特許文献３）。
【０００７】
ウエストナイル熱ウイルスは、特に北アフリカ及びヨーロッパで、ウマでも発症する (非特許文献４)。これらのウマは、失調症、後脚の弱さ、又は四肢麻痺と死へ進行する不全麻痺の兆候を示す。ウマやラクダは、脳炎の臨床的兆候を示す主な動物である。
【０００８】
抗ＷＮＶ抗体が、数種類の齧歯類や、家畜動物、特にウシ及びヒツジや、家庭内動物、特にイヌで検出されている (非特許文献５) 。
【０００９】
ヒトは、ウエストナイル熱ウイルスから隔離されておらず、多くの兆候を示している (非特許文献６、非特許文献７) 。
【００１０】
ウエストナイル熱ウイルスは何種類かの蚊(例：イエカ属、ヤブカ属、ハマダラカ)及びマダニの吸血によって、鳥類及び哺乳類に伝染している。
【００１１】
野鳥及び飼育鳥は、ウエストナイル熱ウイルスの宝庫となっており、鳥の移動によって伝播ベクターとなる。
【００１２】
ウエストナイル熱ウイルスのビリオンは、極性が陽性の一本鎖ＲＮＡを含む二十面体のヌクレオカプシドを取り囲むリポタンパク質エンベロープで構成されている、直径５０ｎｍの球状の粒子である。
【００１３】
単一のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、ポリタンパク質の形の全てのウイルスタンパク質をコードしている。このポリタンパク質の分裂及び熟成は、１０種類程の異なるウイルスタンパク質の生成を導く。構造タンパク質は、ゲノムの５’部分によりコードされ、Ｃと名付けたヌクレオカプシド（１４ｋＤａ）と、Ｅ名付けたエンベロープ糖タンパク質（５０ｋＤａ）と、ｐｒＭと名付けた前駆膜タンパク質（２３ｋＤａ）と、Ｍと名付けた膜タンパク質（７ｋＤａ）とに対応する。非構造タンパク質は、ゲノムの３’部分によりコードされ、タンパク質ＮＳ１（４０ｋＤａ）、ＮＳ２Ａ（１９ｋＤａ）、ＮＳ２Ｂ（１４ｋＤａ）、ＮＳ３（７４ｋＤａ）、ＮＳ４Ａ（１５ｋＤａ）、ＮＳ４Ｂ（２９ｋＤａ）及びＮＳ５（９７ｋＤａ）に対応する。
【００１４】
Parrish C. R. et al. (非特許文献８), Kulkarni A. B. et al. (非特許文献９) 及びHill A. B. et al. (非特許文献１０)は、ワクチンのウイルスから、構造タンパク質と必要に応じて会合するKunjinウイルスの非構造タンパク質をコードするヌクレオチド配列に対応する、様々な挿入を含むインビボの発現ベクターを構築した。免疫細胞反応を調べるために、これらのベクターをマウスに投与した。本発明者らは、非構造タンパク質、特にＮＳ３、ＮＳ４Ａ及びＮＳ４Ｂによって主に刺激される細胞反応の重要性を強調した。これらの文献は、ウエストナイル熱のワクチン接種のストラテジーを強調する難しさを示唆している。
【００１５】
現在までに、ＷＮウイルスによる発症を予防するワクチンはない。
【００１６】
【非特許文献１】
Zeller H. G., Med. Trop., 1999, 59, 490-494.
【非特許文献２】
Anderson J. F. et al., Science, 1999, 286, 2331-2333.
【非特許文献３】
Senne D. A. et al., Avian Disease, 2000, 44, 642-649.
【非特許文献４】
Cantile C. et al., Equine Vet. J., 2000, 32(1), 31-35.
【非特許文献５】
Zeller H.G., Med. Trop., 1999, 59, 490-494; Lundstrom J.O., Journal of Vector Ecology, 1999, 24(1), 1-39.
【非特許文献６】
Sampson B. A., Human Pathology, 2000, 31(5), 527-531.
【非特許文献７】
Marra C. M., Seminars in Neurology, 2000, 20(3), 323-327.
【非特許文献８】
J. Gen. Virol., 1991,72, 1645-1653.
【非特許文献９】
J. Virol., 1992, 66(6), 3583-3592.
【非特許文献１０】
J. Gen. Virol., 1992, 73, 1115-1123.
【００１７】
本発明は、ＷＮウイルスによって発症する病気を予防及び／又は治療する方法を提供することに関する。
【００１８】
本発明の他の目的としては、かかるウイルスによって発症する病気にかかりやすい様々な動物の種類、特にウマと鳥類に使用できるような方法を提供することである。
【００１９】
また、本発明の他の目的としては、標的とする種に対する免疫化及びワクチン接種の方法を提案することである。
【００２０】
さらに、本発明の他の目的としては、識別診断を確実に行うことができる手段と方法を提供することである。
【００２１】
つまり、本発明の第一の目的は、ＷＮウイルスのエンベロープタンパク質Ｅをコードするポリヌクレオチドを含む、インビトロ及び／又はインビボにおける発現ベクターである。これらのベクターは、宿主細胞内のポリヌクレオチドの発現に必要な要素も含む。
【００２２】
Ｅをコードするポリヌクレオチドに加えて、本発明の発現ベクターは、ＷＮウイルスの他のタンパク質、好ましくは、ＷＮウイルスの構造タンパク質をコードする、１つ又は複数の他のポリヌクレオチドを含むことができる。これらの配列は、好ましくは、前駆膜タンパク質ｐｒＭ及び膜タンパク質Ｍをコードするものから選択される。
【００２３】
ベクターは、好ましくは、例えばｐｒＭ−Ｅ、Ｍ−Ｅ、特にｐｒＭ−Ｍ−Ｅに対応する、単一のコードするフレームを形成するポリヌクレオチドを含む。異なるタンパク質（例えばｐｒＭ及び／又はＭ及びＥ）をコードする複数の別個のポリヌクレオチドを含むベクターも、本発明の範囲に含まれる。ベクターは、特にインビボで、１つ以上のＷＮウイルス株に対応するポリヌクレオチド、特に異なる菌株のＥ又はｐｒＭ−Ｍ−Ｅをコードする２つ又はそれ以上のポリヌクレオチドを含むことができる。後述するように、ベクター、特にインビボにおけるベクターは、他の病原性物質(pathogenic agent)である免疫原及び／又はサイトカインをコードする、１つ又は複数のヌクレオチド配列を含むことができる。
【００２４】
本発明の好ましい実施態様によると、発現ベクターはｐｒＭ−Ｍ−Ｅをコードするポリヌクレオチドを、好ましくは単一のリーディングフレームの中に含む。
【００２５】
ＷＮウイルスのタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、主として、このタンパク質をコードするＤＮＡ断片、又はこのＤＮＡ断片の相補鎖を意味する。ＲＮＡは除外されていない。
【００２６】
本発明において、タンパク質という用語は、ペプチドとポリペプチドを含む断片を意味する。定義からは、タンパク質断片は免疫的に活性化しており、つまり一度宿主に投与すると、タンパク質に対する体液性及び／又は細胞性の免疫反応を引き起こすことができる。タンパク質断片は、全タンパク質と実質的に同じ免疫活性を有することが好ましい。したがって、本発明のタンパク質断片は、少なくとも１つのエピトープ又は抗原決定基を含む。エピトープの用語は、体液性型（Ｂ細胞）及び／又は細胞性型（Ｔ細胞）の免疫反応を誘導することができる、タンパク質の部位を意味する。
【００２７】
したがって、ポリヌクレオチドの最少構造は、対象となるタンパク質のエピトープ又は抗原決定基をコードするものである。全タンパク質の断片をコードするポリヌクレオチドは、特に最低２１個のヌクレオチド、特に少なくとも４２個のヌクレオチド、好ましくは、派生している配列の連続したヌクレオチドを少なくとも５７、８７又は１５０個含む。エピトープの決定方法は、当業者にとって公知であり、オーバーラップペプチドライブラリー (Hemmer B. et al., Immunology Today, 1998, 19(4), 163-168)、 Pepscan (Geysen H. M. et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1984, 81(13), 3998-4002; Geysen H. M. et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1985, 82(1), 178-182; Van der Zee R. et al., Eur. J. Immunol., 1989, 19(1), 43-47; Geysen H. M., Southeast Asian J. Trop. Med. Public Health, 1990, 21(4), 523-533; Multipin Peptide Synthesis Kits de Chiron)及びアルゴリズム(De Groot A. et al., Nature Biotechnology, 1999, 17, 533-561) を使用することが可能である。
【００２８】
特に、本発明のポリヌクレオチドは、タンパク質ＥのＣ末端に局在する１又は２つ、好ましくは２つの膜貫通領域をコードするヌクレオチド配列を含む。ＷＮＶ ＮＹ９９株では、これらの領域は、GenBank ＡＦ１９６８３５のアミノ酸配列の７４２〜７６６及び７７０〜７９１に対応する。
【００２９】
１つ又は複数のポリヌクレオチドの発現に必要な要素が存在する。それは、最低限、開始コドン（ＡＴＧ）、停止コドン及びプロモーター、さらにプラスミド及びポックスウイルス以外のウイルスベクターのポリアデニル化の配列である。ポリヌクレオチドが、例えばｐｒＭ−Ｅ、Ｍ−Ｅ、ｐｒＭ−Ｍ−Ｅ等のポリタンパク質の断片をコードするとき、ＡＴＧは、リーディングフレームの５'部分に局在し、停止コドンは３'に局在する。後述するように、発現を制御ことができる他の要素も存在することが可能で、それは例えば、エンハンサー、安定化配列、及びタンパク質の分泌を可能にするシグナル配列である。
【００３０】
本発明はこのような発現ベクターの調製物にも関する。より具体的には、薬剤として許容される媒体又は賦形剤の中で、Ｅをコードする、１つ又は複数の上記ポリヌクレオチドを含み発現する、１つ又は複数のインビボの発現ベクターを含む調製物に関する。
【００３１】
本発明の第１の実施態様によると、調製物の中の１つ又は複数の他のベクターは、例えばｐｒＭ、Ｍ又はｐｒＭ−Ｍ等のＷＮウイルスの１つ又は複数の他のタンパク質を含み、発現する。
【００３２】
他の実施態様によれば、調製物の中の１つ又は複数の他のベクターは、１つ又は複数の他のＷＮウイルス株の、１つ又は複数のタンパク質を含み、発現する。特に、調製物は、特にインビボで、同じタンパク質及び／又は異なるタンパク質、好ましくは同じタンパク質をコードする異なるＷＮ株のポリヌクレオチドを発現する、少なくとも２つのベクターを含む。好ましくは、２、３又はそれ以上の異なるＷＮ株の、Ｅ又はｐｒＭ−Ｍ−Ｅを、インビボで発現するベクターに関する。本発明は、異なる菌株のｐｒＭ、Ｍ、Ｅ、ｐｒＭ−Ｍ、ｐｒＭ−Ｅ又はＭ−Ｅを発現するベクターの混合物にも関する。
【００３３】
さらに他の実施態様によると、後述するように、調製の中の１つ又は複数の他のベクターは、１つ又は複数の病原性物質の、１つ又は複数のサイトカイン及び／又は、１つ又は複数のイムノゲンを含み、発現する。
【００３４】
本発明は、これらの実施態様の様々な組合せにも関する。
【００３５】
ｐｒＭ−Ｍ−Ｅをコードするポリヌクレオチドを含み、発現するインビトロ又はインビボの発現ベクターを含む調製は、本発明の好ましい実施態様を構成する。
【００３６】
本発明の特別な実施態様によれば、インビボ又はインビトロの発現ベクターは、ＷＮウイルスの１つ又は複数のポリヌクレオチドとして、タンパク質Ｅをコードし、必要に応じてｐｒＭ及び／又はＭと会合し、好ましくはｐｒＭ−Ｍ−Ｅをコードする１つのポリヌクレオチドと、必要に応じてＷＮウイルスのシグナル配列とを含む。
【００３７】
さらに特別な実施態様によれば、１つ又は複数の非構造タンパク質ＮＳ２Ａ、ＮＳ２Ｂ及びＮＳ３は、同じ発現ベクター又は独自の発現ベクターにより、本発明による構造タンパク質と関連して発現する。好ましくは、それらは単一のヌクレオチドから、共に発現する。
【００３８】
したがって、本発明は、１つ又は複数の非構造タンパク質ＮＳ２Ａ、ＮＳ２Ｂ及びＮＳ３は、同じ発現ベクター又は独自の発現ベクターを介して本発明の構造タンパク質に一緒に発現する。そのタンパク質は、単一のポリヌクレオチドから発現することが好ましい。
【００３９】
したがって、さらに、本発明は、ＮＳ２Ａ、ＮＳ２Ｂ、ＮＳ３及びそれらの組合せ、好ましくはＮＳ２Ａ−ＮＳ２Ｂ−ＮＳ３をコードするポリヌクレオチドを含む、インビボ又はインビトロの発現ベクターにも関する。基本的に、このベクターは、１つ又は複数の構造タンパク質、特にＥ又はｐｒＭ−Ｍ−Ｅを１つ又は複数コードするポリヌクレオチドを含む、上述したベクターの１つであってもよい。さらに、本発明は、非構造タンパク質を発現するこれらのベクターのうち少なくとも１つと、必要に応じて薬剤として許容される媒体又は賦形剤含む、上述した調製に関する。
【００４０】
本発明の発現ベクターを実施するために、当業者は、様々なＷＮウイルス株、及びそのゲノムのヌクレオチド配列に関する文献を持っている。特に、Savage H. M. et al. (Am. J. Trop. Med. Hyg. 1999, 61(4), 600-611) の表２は、２４個のＷＮウイルス株を示し、GenBankのポリヌクレオチド配列の引用方法を示している。
【００４１】
例えば、ＮＹ９９株を引用することができる（GenBank ＡＦ１９６８３５）。GenBankには、それぞれのタンパク質に対応するＤＮＡ配列が明記されている（ｐｒＭには、ヌクレオチド４６６〜７４１、Ｍには、７４２〜９６６、Ｅには９６７〜２４６９、又はｐｒＭ−Ｍ−Ｅには４６６〜２４６９、ＮＳ２Ａには３５２６〜４２１８、ＮＳ２Ｂには４２１９〜４６１１、及びＮＳ３には４６１２〜６４６８、又はＮＳ２Ａ−ＮＳ２Ｂ−ＮＳ３には、３５２６〜６４６８）。配列を比較し、配置することによって、他のＷＮＶ株のあるタンパク質をコードするポリヌクレオチドの決定を即座に決定できる。
【００４２】
上記において、ポリヌクレオチドの用語が、ＷＮウイルスに特異的なタンパク質、断片又はエピトープをコードする配列を意味すること示した。さらに、同じ様に、ポリヌクレオチドの用語は、異なるＷＮウイルス株に対応するヌクレオチド配列と、コードの縮重により区別されるヌクレオチド配列とを含んでいる。
【００４３】
ＷＮウイルスファミリーの中で、ｐｒＭ−Ｍ−Ｅのアミノ酸配列の同一性は、ＮＹ９９と９０％又はそれ以上である。したがって、本発明には、本来のアミノ酸配列との同一性が９０％又はそれ以上、特に９２％、好ましくは９５％、より好ましくは９８％であるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドが含まれる。ＷＮウイルスに特異的な、これらの相同なポリヌクレオチドの断片も、同等であると考えられるだろう。
【００４４】
したがって、ＷＮウイルスのポリヌクレオチドに関するときは、この用語は、本発明において同等な配列を含む。
【００４５】
タンパク質の用語が、免疫学的に活性な、ポリペプチド及びペプチドも含むことも示した。本発明の必要性に応じて、以下のものも含む。
ａ）異なるＷＮウイルス株に対応するタンパク質；
ｂ）これとは異なるが、ＷＮの未変性タンパク質との同一性が、９０％又はそれ以上、特に９２％、及びより好ましくは９８％の同一性を維持するタンパク質。
【００４６】
したがって、ＷＮウイルスのタンパク質に関するときには、この用語は本発明において同等なタンパク質も含む。
【００４７】
異なるＷＮウイルス株は、コレクションで、特にAmerican Type Culture Collection (ＡＴＣＣ)で、例えばＶＲ−８２又はＶＲ−１２６７のアクセス番号で、入手できる。Kunjinと名付けたウイルスは、実際はＷＮウイルスであると考えられている。
【００４８】
本発明によると、ポリヌクレオチドが、確実に分泌を行うために、発現したタンパク質の上流に局在するペプチドシグナルをコードするヌクレオチド配列を含むことが好ましい。それは、内因性の配列、つまり本来存在している自然のシグナル配列であってもよい。（同じウイルス又は他の株から派生していてもよい）。例えば、ＷＮウイルス ＮＹ９９では、ＥやｐｒＭの内因性のシグナル配列は、GenBank配列のヌクレオチド９２２〜９６６、ヌクレオチド４２１から４６５にそれぞれ対応する。また、異種構造のペプチドシグナルをコードするヌクレオチド配列であってもよく、特にヒト組織プラスミノゲンアクチベーター（ｔＰＡ）のペプチドシグナルをコードしているヌクレオチド配列であってもよい。（Hartikka J. et al., Human Gene Therapy 1996, 7, 1205-1217）。シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列は、Ｅ又はその組合せ、例えばｐｒＭ−Ｍ−Ｅ、をコードする配列の上流にインフレームで挿入する。
【００４９】
本発明の第１の実施態様によると、インビボの発現ベクターはウイルスベクターである。
【００５０】
これらの発現ベクターは、特にポックスウイルスであり、例えばワクシニアウイルス、又はワクシニアウイルスの弱毒化した変異体であり、例えばＭＶＡ（Ankara 株）(Stickl H. et Hochstein-Mintzel V., Munch. Med. Wschr., 1971, 113, 1149-1153; Sutter G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 1992, 89, 10847-10851;市販株ＡＴＣＣ ＶＲ−１５０８；ＭＶＡは、Ankaraワクチン株を、ニワトリの胚の線繊維芽細胞上を約５７０回以上通過させて入手した)、又はＮＹＶＡＣ（その構築は、ＵＳ−Ａ−５４９４８０７の、特に実施例１〜６に記載されている。この特許は、異種の遺伝子の組換え部位への挿入、及び適したプロモーターの利用に関しても記載している。ＷＯ−Ａ−９６／４０２４１も同様に引用できる。）、アビポックス（特にカナリア痘、鶏痘、ハト痘、ウズラ痘）、ブタ痘、アライグマ痘及びラクダ痘、トリ、イヌ、ブタ、ウシ、ヒトアデノウイルス等のアデノウイルス、及びウマヘルペスウイルス（ＥＨＶ血清型１及び４）、イヌヘルペスウイルス（ＣＨＶ）、ネコヘルペスウイルス（ＦＨＶ）、ウシヘルペスウイルス（ＢＨＶ血清型１及び４）、ブタヘルペスウイルス（ＰＲＶ）、マレック病ウイルス（ＭＤＶ血清型１及び２）、七面鳥ヘルペスウイルス（ＨＶＴ又はＭＤＶ血清型３）、及びアヒルヘルペス等のヘルペスウイルス、を含む。ヘルペスウイルスを用いるとき、トリ類のワクチン接種にはベクターＨＶＴが好ましく、ウマのワクチン接種にはベクターＥＨＶが好ましい。
【００５１】
本発明の好ましい実施態様の一つにおいては、ポックスウイルスの発現ベクターは、カナリア痘又は鶏痘であり、これらのポックスウイルスは、必要に応じて弱毒化することができる。アクセス番号ＶＲ−１１１としてＡＴＣＣから市販されているカナリア痘を引用することができる。弱毒化したカナリア痘ウイルスについては、ＵＳ−Ａ−５７５６，１０３及びＷＯ−Ａ−０１／０５６９３４に記載されている。多くの鶏痘ウイルスのワクチン株は入手可能であり、例えばMERIALから市販されているワクチンDIFTOSEC CT株、及びIntervetから市販されているワクチンNOBILIS VARIOLE等である。
【００５２】
ポックスウイルスに関しては、当業者は、ＷＯ−Ａ−９０／１２８８２に、特にワクシニアウイルスに関しては、ＵＳ−Ａ−４７６９３３０；ＵＳ−Ａ−４７２２８４８；ＵＳ−Ａ−４６０３１１２；ＵＳ−Ａ−５１１０５８７；ＵＳ−Ａ−５４９４８０７；ＵＳ−Ａ−５７６２９３８；鶏痘に関しては、ＵＳ−Ａ−５１７４９９３；ＵＳ−Ａ−５５０５９４１；ＵＳ−Ａ−５５０５９４１；ＵＳ−５７６６５９９；カナリア痘に関しては、ＵＳ−Ａ−５７５６１０３；ブタ痘に関しては、ＵＳ−Ａ−５３８２４２５；アライグマ痘に関しては、ＷＯ−Ａ−００／０３０３０、を参照することができる。
【００５３】
発現ベクターがワクシニアウイルスであるとき、発現する１つ又は複数のポリヌクレオチドの挿入部位は、特にチミジンキナーゼ（ＴＫ）、ヘマグルチニン（赤血球凝集素）（ＨＡ）の遺伝子、及びＡ型封入体の領域（ＡＴＩ）である。カナリア痘の場合は、挿入部位は、特にＯＲＦ、Ｃ３、Ｃ５及びＣ６内に局在しているか、またはそれにより構成されている。鶏痘の場合には、挿入部位は、特にＯＲＦ、Ｆ７及びＦ８内に局在するか、それによって構成されている。
【００５４】
ＭＶＡウイルスの遺伝子の挿入に関しては、Carrol M. W. et al., Vaccine, 1997, 15(4), 387-394; Stittelaar K. J. et al., J. Virol., 2000, 74(9), 4236-4243; Sutter G. et al., 1994, Vaccine 12 (11), 1032-1040等、様々な文献に記載されており、当業者が参照することができる。ＭＶＡ完全ゲノムは、Antoine G., Virology, 1998, 244, 365-396に記載されており、これにより、当業者が他の挿入部位又は他のプロモーターを用いることが可能である。
【００５５】
発現ベクターがポックスウイルスである場合、好ましくは、発現するポリヌクレオチドは、ポックスウイルスに特異的なプロモーター、特に、ワクチンプロモーター７．５ｋＤａ(Cochran et al., J. Virology, 1985, 54, 30-35)、ワクチンプロモーターＩ３Ｌ（Riviere et al., J. Virology, 1992, 66, 3424-3434）、ワクチンプロモーターＨＡ(Shida, Virology, 1986, 150, 451-457)、牛痘プロモーターＡＴＩ（Funahashi et al., J. Gen. Virol., 1988, 69, 35-47）、又はワクチンプロモーターＨ６(Taylor J. et al., Vaccine, 1988, 6, 504-508；Guo P. et al. J. Virol, 1989, 63, 4189-4198; Perkus M. et al., J. Virol, 1989, 63, 3829-3836)、の制御下に挿入される。
【００５６】
哺乳類へのワクチン接種では、好ましくは、発現ベクターはカナリア痘である。トリ類のワクチン、特にニワトリ、アヒル、七面鳥及びガチョウのワクチンでは、好ましくは、発現ベクターはカナリア痘又は鶏痘である。
【００５７】
発現ベクターが、ヘルペスウイルスＨＶＴである場合、適切な挿入部位は、特に、ＨＶＴ内のBamHI Ｉ断片又はBam HI M断片に局在する。ＨＶＴのBamHIＩ制限断片は、複数のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）と３つの遺伝子間領域を含み、複数の好ましい挿入ゾーン、すなわち、好ましい領域である遺伝子間領域１、２及び３、並びにＯＲＦ ＵＬ５５（ＦＲ−Ａ−２７２８７９５、ＵＳ−Ａ−５９８０９０６）を含む。ＨＶＴのBamHI Ｍ制限断片は、同様に好ましい挿入部位であるＯＲＦ ＵＬ４３を含む（ＦＲ−Ａ−２７２８７９４、ＵＳ−Ａ−５７３３５５４）。
【００５８】
発現ベクターが、ヘルペスウイルスＥＨＶ−１又はＥＨＶ−４である場合、適切な挿入部位は、特にＴＫ、ＵＬ４３及びＵＬ４５である（ＥＰ−Ａ−０６６６８３５５）。
【００５９】
発現ベクターがヘルペスウイルスである場合、好ましくは、発現するポリヌクレオチドは、強い真核生物プロモーター、好ましくはＣＭＶ−ＩＥプロモーターの制御下に挿入される。この強いプロモーターに関しては、プラスミドに関する部分で後述する。
【００６０】
発明の第２の実施態様によると、インビボの発現ベクターはプラスミドと呼ばれるプラスミドベクターである。
【００６１】
プラスミドの用語は、本発明のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド配列の形におけるすべてのＤＮＡ転写単位と、そのインビボでの発現に必要な要素を含む。スーパーコイル状であっても、そうでなくても、環状のプラスミドが好ましい。直線的な形状も本発明の範囲内である。
【００６２】
各プラスミドは、宿主細胞において、その依存性下に挿入されたポリヌクレオチドの発現を確定するための適切なプロモーターを含んでいる。概ね、それは強い真核生物プロモーターである。好ましい強い真核動物は、ヒト若しくはマウス、又は、必要に応じてラットやモルモット等に由来する、初期サイトメガロウイルスプロモーター（ＣＭＶ−ＩＥ）である。ＣＭＶ−ＩＣプロモーターは、エンヘンサーに関連している又はしていない、本来のプロモーター部分を含むことができる。ＥＰ−Ａ−２６０１４８、ＥＰ−Ａ−３２３５９７、ＵＳ−Ａ−５１６８０６２、ＵＳ−Ａ−５３８５８３９、ＵＳ−Ａ−４９６８６１５、ＷＯ−Ａ−８７／０３９０５を参照することができる。ヒトＣＭＶ−ＩＥ(Boshart M. et al., Cell., 1985, 41, 521-530) 又はマウスＣＭＶ−ＩＥが好ましい。
【００６３】
より一般的な概念では、プロモーターはウイルス又は細胞に由来している。ＣＭＶ−ＩＥ以外の強いウイルスプロモーターとしては、ＳＶ４０ウイルスの初期／後期プロモーター、又はラウス肉腫ウイルスのＬＴＲプロモーターを引用することができる。強い細胞プロモーターとしては、サイトスケルトンの遺伝子のプロモーター、例えばデスミンプロモーター（Kwissa M. et al., Vaccine, 2000, 18(22), 2337-2344）、又はアクチンプロモーター(Miyazaki J. et al., Gene, 1989, 79(2), 269-277) を挙げることができる。
【００６４】
同様に、適切なプロモーター活性を保持するこれらプロモーターの細断片も、本発明に含まれる。例えば、ＷＯ−Ａ−９８／００１６６に従って切断されたＣＭＶ−ＩＥプロモーターを挙げることができる。したがって、本発明には、適切なプロモーター活性、好ましくは由来する本来のプロモーターと実質的に同様のプロモーター活性を保持する、誘導体及び細断片も含まれる。ＣＭＶ−ＩＥには、本来のプロモーター部分及び／又はエンハンサー部分と、それらの誘導体並びに細断片とを含んでいる。
【００６５】
プラスミドには、他の発現調節要素が含まれていることが好ましい。特にイントロン型の安定化配列、好ましくはウサギβ−グロビン遺伝子のイントロンII（van Ooyen et al., Science, 1979, 206: 337-344）を取組むことが有利である。
【００６６】
プラスミド及びポックスウイルス以外のウイルスベクターのポリアデニル化シグナル（polyA）としては、特にウシ成長ホルモン遺伝子（ｂＧＨ）（ＵＳ−Ａ−５１２２４５８）、ウサギβ−グロビン遺伝子又はＳＶ４０ウイルスを用いることができる。
【００６７】
プラスミドにおいて用いることができる他の発現調節要素は、ヘルペスウイルスの発現ベクターにおいても同様に用いることができる。
【００６８】
本発明の他の実施態様によると、発現ベクターは、適切な細胞システムで、インビトロでタンパク質を発現するために用いられる発現ベクターである。タンパク質を、分泌の前後に、培養上澄液で回収し（分泌が行われない場合、細胞溶解を行う）、必要に応じて、従来の濃縮方法、特に限外濾過で濃縮、及び／又は従来の精製方法、特にアフィニティ型、イオン交換又はゲル濾過クロマトグラフィ方法で精製する。
【００６９】
プラスミド、哺乳類若しくはトリ類の細胞でのウイルスベクターの複製、又はバキュロウイルス（ＵＳ−Ａ−４７４５０５１;Vilard J. et al., J. Virol., 1990 64 (1) 37-50; Verne A., Virology, 1988, 167, 56-71）例えば昆虫細胞（例えば、Sf9 Spodoptera frugiperda 細胞、 ＡＴＣＣ ＣＲＬ １７１１）におけるAutographa californica Nuclear Polyhedrosis Virus AcNPVの複製による哺乳類細胞のトランスフェクションにより、作製を行う。哺乳類の細胞としては、特にハムスターの細胞（例えばＣＨＯ又はＢＨＫ−２１）、又はサルの細胞（例えばＣＯＳ又はＶＥＲＯ）を用いることができる。したがって、本発明は、本発明のポリヌクレオチドを組み入れたこれらの発現ベクター、かかる方法で作製されたＷＮタンパク質又は断片、及びそれらを含む調製物に関する。
【００７０】
本発明は、ＷＮタンパク質を濃縮物及び／又は精製された調製物にも関する。ポリヌクレオチドが複数のタンパク質をコードする場合、タンパク質は分割され、上記の調製物は、分割されたタンパク質を含むこととなる。
【００７１】
本発明は、少なくとも１つの本発明のインビボの発現ベクターと、薬剤的として許容される媒体又は賦形剤、及び必要に応じてアジュバントとを含む、免疫原性の組成物及びＷＮウイルスのワクチンにも関する。
【００７２】
免疫原性の組成物の概念は、標的とした種に一度投与して、ＷＮウイルスに対する免疫反応を誘導することができる、全ての組成物を含んでいる。ワクチンの用語は、効果的な予防を誘導することができる組成物を意味する。標的とする種には、ウマ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、トリ、好ましくは、馬、犬、猫、豚や、トリでは、ガチョウ、七面鳥、ニワトリ、アヒルで、つまり、有性生殖動物、卵で繁殖する動物及び胎生動物も含まれる。
【００７３】
薬剤として許容される媒体又は賦形剤は、当業者によく知られている。例えば、０．９％の生理食塩水又はリン酸緩衝液であってもよい。薬剤として許容される媒体又は賦形剤は、ベクターの投与、特にトランスフェクション、及び／又は保存状態の改善を容易にするような全ての化合物、又は化合物の組合せを含む。
【００７４】
用量及び用量体積に関しては、後述の免疫化及びワクチン接種方法の概要の部分で定義する。
【００７５】
本発明の免疫原性の組成物及びワクチンは、好ましくは特に従来のアジュバントから選択される、１つ又は複数のアジュバントを含む。本発明の範囲で特に適しているものは、（１）アクリル酸又はメタクリル酸のポリマー、無水マレイン酸及びアルケニル誘導体ポリマー、（２）免疫刺激配列（ＩＳＳ）、特に１つ又は複数の非メチルＣｐＧユニットを有するオリゴデオキシリボヌクレオチド配列（Klinman D.M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 1966, 93, 2879-2883; ＷＯ−A１−９８／１６２４７）、（３）水中油型エマルジョン、特に、M. Powell, M. Newman, Plenum Press 1995の“Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach”１４７ページに記載のＳＰＴエマルジョンと、同文献の１８３ページに記載のエマルジョンＭＦ５９、（４）四級アンモニウム塩を含む陽イオン性脂質、（５）サイトカイン、又は（６）それらの組合せ又は混合物、である。
【００７６】
（３）の水中油型エマルジョンは、ウイルスベクターに特に適しているが、特に次のものをベースとしてもよい。
−軽質流動パラフィン油(ヨーロッパ薬局方型)；
−スクアラン、スクアレン等のイソプレノイド油；
−アルケン、特にイソブテン又はデセンのオリゴマー形成から生じる油
−酸又は直鎖アルキル基を有するアルコールのエステル
−特に、植物性油脂、オレイン酸エチル、プロピレン・グリコール、ジ（カプリル酸／カプリン酸）、グリセロールトリ（カプリル酸／カプリン酸）及びプロピレングリコールジオレイン酸；
−分枝の脂肪性アルコール又は酸のエステル、特にイソステアリン酸エステル。
【００７７】
油脂を、乳化剤と組み合わせて用いてエマルジョンを形成する。乳化剤は、好ましくは、非イオン性の界面活性剤であり、特に以下のものである。
−ソルビタン、マンナイド（mannide）（例:アンヒドロマンニトールオレイン酸)、グリセロール、ポリグリセロール、又はプロピレングリコ−ルと、オレイン酸、イソステアリン酸、リシノール酸又はヒドロキシステアリン酸とのエステルであり、必要に応じてエトキシレートされたエステル。
−ポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレンのコポリマーブロック、特にプルロニック（Pluronic）、中でもＬ１２１。
【００７８】
タイプ（１）のアジュバントポリマーの中で、架橋したアクリル酸又はメタクリル酸のポリマーが好ましく、特に、糖又はポリアルコールのポリアルケニルエーテルによって架橋されているものが好ましい。これらの化合物は、カルボマー (carbomer)（Pharmeuropa, vol. 8, no. 2, June 1996）の名で知られている。当業者は、少なくとも３つ、好ましくは８つ以下のヒドロキシル基を含み、少なくとも３つのヒドロキシルの水素原子が少なくとも２個のカーボン原子を有する不飽和の、脂肪属のラジカルで置換された、ポリヒドロキシル化合物により架橋されたアクリルポリマーに関して記載したＵＳ−Ａ−２９０９４６２を参照することができる。例えば、ビニール、アリル、及び他のエチレン化した不飽和基等の２〜４個のカーボン原子を含むラジカルが好ましい。不飽和ラジカルも、メチル等他の基質を含むことができる。Carbopol（BF Goodrich社製）の商品名で販売されている製品が特に適切である。その製品は、特にアリルサッカロース又はアリルペンタエリスリトールで架橋されている。その中で、Carbopol ９７４Ｐ、９３４Ｐ及び９７１Ｐを特に引用することができる。
【００７９】
無水マレイン酸及びアルケニル由来のコポリマーの中では、直鎖又は架橋した無水マレイン酸及びエチレンコポリマー、例えばジビニルエーテルで架橋した、ＥＭＡ（Mosanto社製）が好ましい。J. Fields et al., Nature 186:778-780, June 4, 1960を引用することができる。
【００８０】
構造に関しては、アクリル又はメタクリル酸ポリマー及びＥＭＡは、好ましくは下記化学式を有する基本単位で形成されているものが好ましい。
【００８１】
【化１】
−Ｒ1及びＲ2は、同一又は異なっていてもよく、Ｈ又はＣＨ3を示す。
−ｘ＝０又は１であり、好ましくはｘ＝１である。
−ｙ＝０又は１であり、ｘ+ｙ＝２である。
ＥＭＡでは、ｘ＝０及びｙ＝２である。カルボマーでは、ｘ＝ｙ＝１
である。
【００８２】
これらのポリマーを、水又は生理食塩水（２０ｇ／ｌのＮａＣｌ）に溶解し、ｐＨをソーダで７．３〜７．４に調整し、発現ベクターを取り入れるアジュバント溶液を調製する。
【００８３】
最終的なワクチンの組成物のポリマー濃度は、０．０１〜１．５％ｗ／ｖの範囲内であってもよく、特に０．０５〜１％ｗ／ｖであり、好ましくは０．１〜０．４％ｗ／ｖである。
【００８４】
四級アンモニウム塩を含み、特に、但し排他的ではないがプラスミドに適切である陽イオン性脂質（４）は、好ましくは、以下の化学式を有するものである。
【００８５】
【化２】
【００８６】
これらの陽イオン性脂質のなかで、ＤＭＲＩＥ（Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２、３−ビス（テトラデシロキシ）−１−プロパンアンモニウム；ＷＯ−Ａ−９６／３４０１９）が好ましく、好ましくはＤＯＰＥ（dioleoyo-phosphatidyl-ethanol amine; Behr J.P., 1994, Bioconjugate Chemistry , 5, 382-389）と会合し、ＤＭＲＩＥ−ＤＯＰＥを形成する中性脂質が好ましくい。
【００８７】
このアジュバントとプラスミドの混合物は、短時間で形成されることが好ましく、投与する前に、このように形成された混合物に、例えば１０分〜６０分、好ましくは約３０分、複合体となる時間をおくことが好ましい。
【００８８】
ＤＯＰＥが存在するとき、ＤＭＲＩＥ：ＤＯＰＥの分子比率は、好ましくは９５：５〜５：９５であり、特に１：１である。
【００８９】
プラスミド：ＤＭＲＩＥ又はＤＭＲＩＥ−ＤＯＰＥアジュバントの重量比は、特に５０：１〜１：１０であり、中でも１０：１〜１：５、好ましくは１：１〜１：２である。
【００９０】
１つ又は複数のサイトカイン（５）は、タンパク質の形で、組成物又はワクチンに供給されるか、１つ又は複数のイムノゲンと共に宿主で共発現される。イムノゲンを発現するベクターと同じベクター、又は独自のベクターによる、１つ又は複数のサイトカインの共発現が好ましい。
【００９１】
サイトカインは、特に、インターロイキン１８（ＩＬ−１８）、インターロイキン１２（ＩＬ−１２）、インターロイキン１５（ＩＬ−１５）、ＭＩＰ−１α（マクロファージ炎症タンパク質１α；Marshall E. et al, Br. J. Cancer, 1997, 75(12), 1715-1720）又はＧＭ−ＣＳＦ(顆粒球マクロファージコロニー刺激因子)から選択することができる。特にトリのサイトカイン、特にニワトリのサイトカイン、例えばｃＩＬ−１８（Schneider K. et al., J. Interferon Cytokine Res., 2000, 20 (10), 879-883）、ｃＩＬ−１５(Xin K.-Q et al., Vaccine, 1999, 17, 858-866)を引用することができ、ウマのサイトカインに関しては、特にウマＧＭ−ＣＳＦ（ＷＯ−Ａ−００／７７２１０）を引用することができる。ワクチンを接種される種のサイトカインを用いることが好ましい。
【００９２】
ＷＯ−Ａ−００／７７２１０は、ウマＧＭ−ＣＳＦに相当するヌクレオチド配列とアミノ酸配列について述べ、インビトロでのＧＭ−ＣＳＦの作製とインビボでのウマＧＭ−ＣＳＦの発現を可能にするベクター（プラスミド及びウイルスベクター）の構築とに関して記載している。これらのタンパク質、プラスミド及びウイルスベクターを、本発明の免疫原性の組成物及びウマワクチンに用いることができる。例えば、前記先行出願の実施例３記載のプラスミドpJP097を使用することができ、又、かかる先行出願の教示に従い、他のベクターを作製したり、又はウマＧＭ−ＣＳＦをインビトロで作製したり、このベクター又はウマＧＭ−ＣＳＦを本発明の免疫原性の組成物又はウマワクチンに取り込むことができる。
【００９３】
本発明は、タンパク質Ｅと、必要に応じて１つ又は複数のＷＮウイルスの他のタンパク質、特にｐｒＭ又はＭ、好ましくは上述したようにインビトロで発現して作製された１つ又は複数の他のタンパク質と、他方で薬剤として許容される媒体及び賦形剤を含む、免疫原性の組成物及びサブユニットと呼ばれるワクチンに関する。
【００９４】
薬剤として許容される媒体及び賦形剤は、当業者によく知られている。例えば、０．９％ＮａＣｌサリン溶液又はリン酸緩衝液であってもよい。
【００９５】
本発明の免疫原性の組成物及びサブユニットのワクチンは、好ましくは特に従来のアジュバントから選択される、１つ又は複数のアジュバントを含む。本発明の範囲に特に適しているものは、（１）アクリル酸又はメタクリル酸ポリマー、無水マレイン酸及びアルケニル誘導体ポリマー、（２）免疫刺激配列（ＩＳＳ）、特に１つ又は複数の非メチルＣｐＧユニットを有するオリゴデオキシリボヌクレオチド配列（Klinman D.M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 1966, 93, 2879-2883; ＷＯ−A１−９８／１６２４７）、（３）水中油型エマルジョン、特に、M. Powell, M. Newman, Plenum Press 1995の“Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach”１４７ページに記載のＳＰＴエマルジョンと、同文献の１８３ページに記載のエマルジョンＭＦ５９、（４）四級アンモニウム塩を含む陽イオン性脂質、（５）サポニン、特にＱｕｉｌ−Ａ、又は（６）アルミナ水酸化合物又は同等物、である。（１）（２）及び（３）に定義した様々な種類のアジュバントに関しては、発現ベクターをベースにしたワクチンに関して上述した部分で詳細に記載している。
【００９６】
用量及び用量体積に関しては、後述の免疫化及びワクチン接種方法の概要の部分で定義する。
【００９７】
本発明によると、ＷＮウイルスに対するワクチン接種は、免疫化若しくはワクチン接種のキットの形で、又は多価の免疫原性の組成物又はワクチンの形、つまり、ＷＮウイルスに対するワクチン成分を少なくとも１つ含み、少なくとも他の病原性物質に対するワクチン成分を少なくとも１つ含んだ形で、ワクチン接種計画の他のワクチン接種と組み合わせることができる。これは、ＷＮウイルスを含む、少なくとも２つの病原性物質の遺伝子と同じ発現ベクターによる発現も含む。
【００９８】
本発明は、さらに、同じ発現ベクターをインビボで用いて、本発明のＷＮウイルスのポリヌクレオチドを少なくとも１つと、他の病原性物質のイムノゲンを発現するポリヌクレオチドを少なくとも１つ含む、ＷＮウイルスと、標的とする種の少なくとも１つの他の病原性物質とに対する、多価免疫原性の組成物又は多価ワクチンに関する。
【００９９】
ここに記載した「イムノゲン」は、好ましくは予防性のある免疫反応を誘導するタンパク質、糖タンパク質、ポリペプチド又はペプチドで、エピトープ又は誘導体、例えば融合タンパク質を意味する。
【０１００】
上述した通り、これらの多価の組成物又はワクチンは、薬剤として許容される媒体又は賦形剤、及び必要に応じてアジュバントを含む。
【０１０１】
本発明は、同様に、本発明のＷＮウイルスのポリヌクレオチドが少なくとも１つ挿入される少なくとも１つのインビボの発現ベクターと、他の病原性物質のイムノゲンをコードするポリヌクレオチドが挿入されている一つの第２の発現ベクターとを含む、多価の免疫原性の組成物又は多価ワクチンに関する。前述した通り、これら多価の組成物又はワクチンは、薬剤として許容される媒体又は賦形剤、及び必要に応じてアジュバントも含む。
【０１０２】
多価の免疫原性の組成物及びワクチンに関して、他のウマ病原性物質は、ウマ鼻肺炎ウイルスＥＨＶ−１及び／又はＥＨＶ−４（好ましくは、ＥＶ−１及びＥＨＶ−４のイムノゲンを組み合わせる）、ウマインフルエンザウイルスＥＩＶ、東部脳炎ウイルスＥＥＶ、西部脳炎ウイルスＷＥＶ、ベネズエラ脳炎ウイルスＶＥＶ（ＥＥＶ、ＷＥＶ及びＶＥＶの３つの組み合わせが好ましい)、破傷風菌、及びそれらの混合物を含むグループから特に選択される。好ましくは、ＥＨＶは、遺伝子ｇＢ及び／又はｇＤ；ＥＩＶ遺伝子は、ＨＡ、ＮＰ及び／又はＮ；脳炎のウイルスは、Ｃ及び／又はＥ２；及び破傷風菌は、破傷風毒素のサブユニットＣを全て又は一部をコードする遺伝子から選択される。これは、免疫的に活性の断片、又は前記イムノゲンのエピトープをコードする、ポリヌクレオチドの使用を含む。
【０１０３】
他のトリ類の病原性物質は、マレック病ウイルスＭＤＶ（血清型１及び２、好ましくは１）、ニューカッスル病ウイルスＮＤＶ、ガンボロ病ウイルスＩＢＶＤ、感染性気管炎ＩＢＶ、感染性貧血ウイルスＣＡＶ、感染性喉頭気管炎ウイルスＩＬＴＶ、脳脊髄炎ウイルスＡＥＶ（又はトリ白血症ＡＬＶ）、七面鳥の出血性腸炎ウイルス（ＨＥＶ）、肺炎ウイルス病（pneumovirosis）ウイルス（ＴＲＴＶ）、トリペストウイルス（トリ類インフルエンザ）、ニワトリ水心膜炎（hydropericarditis）ウイルス、トリレオウイルス、大腸菌、マイクロプラズマ・ガリナルム(Mycoplasma gallinarum)、マイクロプラズ・ガリセプティカム(Mycoplasma gallisepticum)、ヘモフィルス・アヴイウム (Haemophilud avium)、パスツレラ・ガリナルム(Pasteurella gallinarum)、パスツレラ・ムルトシダ・ガルシダ(Pasteurella multocida gallicida)、及びそれらの混合物、を含むグループから選択される。好ましくは、ＭＤＶは、遺伝子ｇＢ及び／又はｇＤ；ＮＤＶは、遺伝子ＨＮ及び／又はＦ；ＩＢＤＶは、遺伝子ＶＰ２；ＩＢＶには遺伝子Ｓ（さらに具体的にはＳ１）、Ｍ及び／又はＮ；ＣＡＶは、遺伝子ＶＰ１及び／又はＶＰ２；ＩＴＬＶは、遺伝子ｇＢ及び／又はｇＤ；ＡＥＶに遺伝子ｅｎｖ及び／又はｇａｇ／ｐｒｏ；ＨＥＶは、遺伝子１００Ｋ及びヘキソン；ＴＲＴＶは、遺伝子Ｆ及び／又はＧ；及びトリペストは、遺伝子ＨＡ、Ｎ及び／又はＮＰ、から選択される。これは、免疫的に活性な断片、又は前記イムノゲンのエピトープをコードするポリヌクレオチドの使用を含む。
【０１０４】
例えば、上述したように必要に応じてアジュバントが添加された、ウマを対象とした、本発明の多価の免疫原性の組成物又は多価ワクチンは、ＷＯ−Ａ−９８／０３１９８、具体的にはその実施例８〜２５に記載たもの、及びウマの種類に関するＷＯ−Ａ−００／７７０４３、特にその実施例６及び７に記載された、１つ又は複数のプラスミドを組み入れることが可能である。トリ類に関しては、ＷＯ−Ａ１−９８／０３６５９、特にその実施例７〜２７に記載の、１つ又は複数のプラスミドを組み入れることが可能である。
【０１０５】
前記免疫原性の組成物又は組換え型ワクチンは、同様に、少なくとも１つの他の病原性物質に対する、少なくとも１つの従来型ワクチン（不活性、生弱毒性、サブユニット）と組み合わせることができる。
【０１０６】
同様に、本発明の免疫原性の組成物及びサブユニットのワクチンは、複合ワクチンの目的となることができる。したがって、本発明は、本発明の１つ又は複数のタンパク質と、少なくとも１つの他の病原性物質（特に上記のリストの中から選択）の１つ又は複数のイムノゲン（イムノゲンの用語の定義は上述）、及び／又は不活性若しくは弱毒性の他の病原性物質とを含む、多価の免疫原性の組成物及び多価ワクチンにも関する。前述の通り、これら多価の組成物又はワクチンは、薬剤として許容される媒体又は賦形剤、及び必要に応じてアジュバントも含む。
【０１０７】
本発明は、上述した標的とする種に対する免疫化およびワクチン接種の方法にも関する。
【０１０８】
これらの方法は、本発明の免疫原性の組成物又はワクチンの有効量の投与を含む。この投与は、例えば皮下投与、皮内投与、筋肉内投与等の非経口ルート、又は経口及び／又は鼻腔ルートで行ってもよい。１つ又は複数の投与を行ってもよく、特に２つ行ってもよい。
【０１０９】
他のワクチンは、注射針のない液体ジェット式注射器で注入してもよい。プラスミドには、プラスミドで被覆し、免疫化する動物の皮の細胞に注入できるように保護した金の粒子を用いてもよい（Tang et al., Nature 1992, 356, 152-154）。
【０１１０】
本発明の免疫原性の組成物及びワクチンは、発現ベクター又はポリペプチドの有効量を含む。
【０１１１】
プラスミドを基にした免疫原性の組成物又はワクチンには、用量は概ね、約１０μｇ〜約２０００μｇ、特に約５０μｇ〜約１０００μｇである。用量体積は、０．１〜２ｍｌであってもよく、好ましくは０．２〜１ｍｌである。
【０１１２】
これらの用量及び用量体積は、ウマ及び哺乳類のワクチン接種用に最適化されている。
【０１１３】
トリ類のワクチン接種には、用量は特に約１０μｇ〜約５００μｇであり、好ましくは、約５０μｇ〜約２００μｇである。用量体積は、０．１〜１ｍｌであってもよく、好ましくは０．２〜０．５ｍｌである。
【０１１４】
当業者は、各免疫化又はワクチン接種プロトコールに使用するプラスミドの有効量を最適化し、最適な投与ルートを決定する技術を持っている。
【０１１５】
ポックスウイルスを基にした免疫原性の組成物又はワクチンの場合、用量は概ね約１０2ｐｆｕ〜約１０9ｐｆｕである。
【０１１６】
ウマ類及び哺乳類用には、ベクターがワクシニアウイルスである場合、用量は具体的には約１０4ｐｆｕ〜約１０9ｐｆｕであり、好ましくは約１０6ｐｆｕ〜約１０8ｐｆｕである。ベクターがカナリア痘ウイルスである場合、用量は、具体的には約１０5ｐｆｕ〜約１０9ｐｆｕであり、好ましくは約１０5.5又は１０6ｐｆｕ〜約１０9ｐｆｕである。
【０１１７】
トリ類用には、ベクターがカナリア痘ウイルスである場合、用量は具体的には約１０3ｐｆｕ〜約１０7ｐｆｕであり、好ましくは約１０4ｐｆｕ〜約１０6ｐｆｕである。ベクターが鶏痘ウイルスである場合、用量は、具体的には約１０2ｐｆｕ〜約１０5ｐｆｕであり、好ましくは約１０3ｐｆｕ〜約１０5ｐｆｕである。
【０１１８】
ポックスウイルス以外のウイルスベクター、特にヘルペスウイルスを基にした免疫原性の組成物又はワクチンの場合、用量は概ね約１０3ｐｆｕ〜約１０8ｐｆｕである。トリの免疫原性の組成物又はワクチンの場合、用量は、概ね約１０3ｐｆｕ〜約１０6ｐｆｕである。ウマの免疫原性の組成物又はワクチンの場合、用量は、概ね約１０6ｐｆｕ〜約１０8ｐｆｕである。
【０１１９】
ウイルスベクターを基にしたウマの免疫原性の組成物及びワクチンの用量体積は、概ね０．５〜２．０ｍｌであり、好ましくは１．０〜２．０ｍｌ、より好ましくは１．０ｍｌである。ウイルスベクターを基にした免疫原性及びトリワクチンの用量体積は、概ね０．１〜１．０ｍｌであり、好ましくは０．１〜0．５ｍｌ、より好ましくは０．２〜０．３ｍｌである。このワクチンの種類に関しても、当業者は、各免疫化プロトコールの投与回数、投与ルート及び使用量を最適化するために必要な能力を持ち合わせている。特に、ウマには、例えば３５日間隔で、２回の投与を想定している。
【０１２０】
サブユニットの免疫原性の組成物又はワクチンの場合、用量は概ね約１０μｇ〜約２０００μｇ、特に約５０μｇ〜約１０００μｇである。ウイルスベクターを基にしたウマの疫原性の組成物及びワクチンの用量体積は、概ね１．０〜２．０ｍｌであり、好ましくは０．５〜２．０ｍｌ、より好ましくは１．０ｍｌである。ウイルスベクターを基にしたトリの免疫原性及びワクチンの用量体積は、概ね０．１〜１．０ｍｌであり、好ましくは０．１〜0．５ｍｌ、より好ましくは０．２〜０．３ｍｌである。このワクチンの種類に関しても、当業者は、各免疫化プロトコールの投与回数、投与ルート及び使用量を最適化するために必要な能力を持ち合わせている。
【０１２１】
本発明は、ＷＮウイルスと必要に応じて少なくとも１つの他の病原性物質に対して、標的とする種を予防する免疫原性の組成物及びワクチン調製のための、インビボでの発現ベクター、又は本発明のベクター又はポリペプチドの調製物の使用に関する。本明細書に後述する、他の特徴は、このもう一方の目的に関する。
【０１２２】
ＷＮウイルスの１つ又は複数のタンパク質を発現するプラスミドやウイルスワクチンに基づくワクチンや、本発明のＷＮサブユニットワクチンは、ワクチンを接種した動物に、免疫原性の組成物又はワクチンに現れていないこのウイルスの他のタンパク質に対する抗体の作製を誘導しない。この特徴を用いて、ＷＮ病原性物質ウイルスに感染した動物と、本発明のワクチンを接種した動物とを区別できる、差別的な診断方法を発展させることができる。前者では、これらのタンパク質及び／又はそれに対する抗体が存在し、抗原抗体反応によって検出することができる。本発明にしたがってワクチンを接種した動物は、陰性のままである。この区別を行うには、ワクチンに現れていない（存在していないか、発現していない）タンパク質、例えば、ワクチンに現れていない、タンパク質Ｃ、又はタンパク質ＮＳ１、ＮＳ２Ａ、ＮＳ２Ｂ、若しくはＮＳ３が挙げられる。
【０１２３】
したがって、本発明は、ワクチンを接種した動物と感染した動物とを区別することを可能にする免疫原性の組成物及びワクチンを調製するための、本発明のベクター、調製物、及びポリペプチドの使用に関する。
【０１２４】
さらに、この区別を可能にする診断方法に関連した免疫化及びワクチン接種の方法にも関する。
【０１２５】
診断のために選択したタンパク質、又はその断片若しくはエピトープのうちの１つを、診断試験における抗原として使用し、及び／又はポリクロナール若しくはモノクローナル抗体を作製するために使用する。当業者は、これらの抗体を作製し、抗原及び／又は抗体を従来の診断方法技術で利用するための知識と経験を持ち合わせている。
【０１２６】
本発明は、以下に実施例を用いてさらに詳細に記載されるが、これらの実施例は何の制限もないものとする
（実施例）
【０１２７】
全ての構築は、Sambrook J. et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition. Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor. New York, 1989) が開示した分子生物学の標準技術（クローニング、制限酵素による処理、相補一本鎖ＤＮＡ、ポリメラーゼ連鎖反応、ＤＮＡポリメラーゼによるオリゴヌレオチドの伸張等）を用いて行われる。本発明で用いる全ての制限断片及びポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の様々な増幅断片は、“Geneclean”キット (La Jolla社製)を用いて単離、精製した。
【実施例１】
【０１２８】
ウエストナイル熱ウイルスの調製
ウエストナイル熱ウイルスＮＹ９９(Lanciotti R. S. et al., Science, 1999, 286, 2333-7) を、ＶＥＲＯ細胞 (サルの腎細胞、ＣＣＬ−８１番でAmerican Type Culture Collection (ＡＴＣＣ)から入手可能)で培養し、増幅した。
【０１２９】
ＶＥＲＯ細胞を、２５ｃｍ2のFalcon内で、１ｍｌ当たり約１００，０００細胞を含む、１％の酵母エキス及び１０％の子ウシ血清を補充したＥａｇｌｅ−ＭＥＭ培地で培養した。細胞を、３７℃で５％のＣＯ2雰囲気下で培養した。
【０１３０】
３日後、細胞層がコンフルエントとなる。培養培地を、１％の酵母抽出物及び０．１％のウシ血清アルブミンを補充したＥａｇｌｅ−ＭＥＭ培地と置きかえ、ウエストナイル熱ウイルスを、５ｐｆｕ／細胞の割合で添加した。
【０１３１】
細胞変性効果（ＣＰＥ）が完了すると（概ね、培養開始４８〜７２時間後）、ウイルス懸濁液を回収し、遠心分離法により清澄化し、−７０℃で凍結した。ウイルスバッチを作製するには、概ね３〜４の連続した継代が必要である。ウイルスバッチは、−７０℃で保存する。
【実施例２】
【０１３２】
ウエストナイル熱ウイルスからウイルスＲＮＡの抽出
１００ｍｌのウエストナイル熱ウイルス株ＮＹ９９のウイルス懸濁液に含まれるウイルスＲＮＡを、《High Pure Viral RNA Kit》（Roche Molecular Biochemical社製）の溶液で溶解した後に、製造者の指示に従い、抽出した。最終的に抽出したＲＮＡ沈殿物を、Ｒ−Ｎａｓｅを含まない、消毒した蒸留水１〜２ｍｌで再懸濁した。
【実施例３】
【０１３３】
プラスミドpFC101の構築
ウエストナイル熱ウイルスＮＹ９９の相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を、Gene Amp RNA PCR Kit(Perkin-Elmer社製)を用いて、製造者からの条件に従い、合成した。
【０１３４】
逆転写反応と連鎖増幅反応（ＲＴ−ＰＣＲ反応）を、ウエストナイル熱ウイルスＮＹ９９のウイルスＲＮＡ懸濁液５０μｌ（実施例２）と、次のオリゴヌクレオチドと共に行った。
ＦＣ１０１ （３０ｍｅｒ）（配列番号１）
5'TTTTTTGAATTCGTTACCCTCTCTAACTTC3'
；及びＦＣ１０２（３３mｅｒ）（配列番号2）
5'TTTTTTTCTAGATTACCTCCGACTGCGTCTTGA3'
この１組のオリコヌクレオチドは、制限部位EcoRIと制限部位Xbalと挿入物の３'における停止コドンとの取込みを可能にする。
【０１３５】
第１ｃＤＮＡ鎖の合成は、ＲＮＡマトリックスにオリコヌクレオチドＦＣ１０２をハイブリダイゼーションした後、オリゴヌクレオチドＦＣ１０２の伸張によって起こる。
【０１３６】
第１ｃＤＮＡ鎖の合成条件は、４２℃で１５分、次いで９９℃で５分、最後に４℃で５分である。オリゴヌクレオチドＦＣ１０１及びＦＣ１０２の組の存在下でのＰＣＲ反応の条件は、９５℃で２分、次に３５サイクル（９５℃で１分、その後６２℃で１分、さらに７２℃で２分）であり、最後に７２℃で７分行い、３０２ｂｐの断片を作製する。
【０１３７】
この断片をEcoRI、さらにXbalで処理し、アガロースゲル電気泳動の後、約２９０ｂｐのEcoRI-Xbal断片を単離した。この断片は、断片Ａと呼ばれる。
【０１３８】
プラスミドpVR1012（ＷＯ−Ａ９８／０３１９９の図１及び実施例１；Hartikka J. et al., 1997, Human Gene Therapy, 7, 1205-1217）から派生した真核生物発現プラスミドpVR1020 (C. J. Luke et al. J. of Infectious Diseases. 1997. 175. 95-97)は、ヒト組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔＰＡ）のシグナル配列をコードするフレームを含んでいる。
【０１３９】
BamHI-BgIIIによる処理と、複数のクローニング部位（BamHI、 Notl、 EcoRI、Xbal、PmII、Pstl及びBgIII）を含み、次のオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションの結果である配列の挿入とにより、プラスミドpVR1020を修飾した。
ＢＰ３２６（４０ｍｅｒ）（配列番号３）
5'GATCTGCAGCACGTGTCTAGAGGATATCGAATTCGCGGCC3'
ＢＰ３２9（４０ｍｅｒ）（配列番号4）
5'GATCCGCGGCCGCGAATTCGATATCCTCTAGACACGTGCT3'
このように入手したベクターのサイズは約５１０５塩基対（ｂｐ）であり、pAB110と名付ける。
【０１４０】
断片Ａは、事前にXbal及びEcoRIで処理した発現プラスミドｐAB110と結紮し、プラスミドpFC101（５３７６ｂｐ）を作製した。このプラスミドは、ヒトサイトメガロウイルス又はｈＣＭＶ−ＩＥ(最初期ヒトサイトメガロウイルス)の初期プロモーターの制御下で、ｔＰＡのシグナル配列をコードする挿入断片、次にタンパク質ｐｒMをコードする配列を含む。
【実施例４】
【０１４１】
プラスミドpFC102の構築
ウエストナイル熱ウイルスＮＹ９９の相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を、Gene Amp RNA PCR Kit(Perkin-Elmer社製)を用いて、製造者からの条件で合成した。
【０１４２】
逆転写反応と連鎖増幅反応（ＲＴ−ＰＣＲ反応）を、ウエストナイル熱ウイルスＮＹ９９のウイルスＲＮＡ懸濁液５０μｌ（実施例２）と、次のオリゴヌクレオチドと共に行った。
ＦＣ１０３（３０ｍｅｒ）（配列番号５）
5'TTTTTTGAATTCTCACTGACAGTGCAGACA3'
；及びＦＣ１０４（３３ｍｅｒ）（配列番号６）
5'TTTTTTTCTAGATTAGCTGTAAGCTGGGGCCAC3'
この１組のオリコヌクレオチドは、制限部位EcoRIと制限部位Xbalと挿入物の３'における停止コドンとの取込みを可能にする。
【０１４３】
第１ｃＤＮＡ鎖の合成は、ＲＮＡマトリックスにオリコヌクレオチドＦＣ１０４をハイブリダイゼーションした後、オリゴヌクレオチドＦＣ１０４の伸張によって起こる。
【０１４４】
第１ｃＤＮＡ鎖の合成条件は、４２℃で１５分、次に９９℃で５分、最後に４℃で５分である。オリゴヌクレオチドＦＣ１０３及びＦＣ１０４の組の存在下でのＰＣＲ反応の条件は、９５℃で２分、次に３５サイクル（９５℃で１分、その後６２℃で１分、さらに７２℃で２分）であり、最後に７２℃で７分行い、２５２ｂｐの断片を作製した。
【０１４５】
この断片をEcoRI、次にXbalで処理し、アガロースゲル電気泳動の後、約２４０ｂｐのEcoRI−Xbal断片を単離した。この断片を、事前にXbal 及びEcoRIで処理した発現プラスミドpAb110（実施例３）と結紮し、プラスミドpFC102（５３２６ｂｐ）を作製した。このプラスミドは、ヒトサイトメガロウイルス又はｈＣＭＶ−ＩＥ(最初期ヒトサイトメガロウイルス)の初期プロモーターの制御下で、ｔＰＡのシグナル配列をコードする挿入断片、次にタンパク質Mをコードする配列を含む。
【実施例５】
【０１４６】
プラスミドpFC103の構築
ウエストナイル熱ウイルスＮＹ９９の相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）は、Gene Amp RNA PCR Kit (Perkin-Elmer社製)を用いて、製造者からの条件で合成した。
【０１４７】
逆転写反応と連鎖増幅反応（ＲＴ−ＰＣＲ反応）を、ウエストナイル熱ウイルスＮＹ９９のウイルスＲＮＡ懸濁液５０μｌ（実施例２）と、次のオリゴヌクレオチドと共に行った。
ＦＣ１０５（３０ｍｅｒ）（配列番号７）
5'TTTTTTGAATTCTTCAACTGCCTTGGAATG3'
；及びＦＣ１０４（３３ｍｅｒ）（配列番号８）
5'TTTTTTTCTAGATTAAGCGTGCACGTTCACGGA3'
この１組のオリコヌクレオチドは、EcoRI 制限部位と、Xbal制限部位と挿入物の３'における停止コドンとの取込みを可能にする。
【０１４８】
第１ｃＤＮＡ鎖の合成は、ＲＮＡマトリックスにオリコヌクレオチドＦＣ１０６をハイブリダイゼーションした後、オリゴヌクレオチドＦＣ１０６の伸張によって起こる。
【０１４９】
第１ｃＤＮＡ鎖の合成条件は、４２℃で１５分、次に９９℃で５分、さらに４℃で５分である。オリゴヌクレオチドＦＣ１０５及びＦＣ１０６の組の存在下でのＰＣＲ反応の条件は、９５℃で２分、次に３５サイクル（９５℃で１分、その後６２℃で１分、さらに７２℃で２分）であり、最後に７２℃で７分行い、１５３０ｂｐの断片を作製した。
【０１５０】
この断片をEcoRIで、次にXbalで処理し、アガロースゲル電気泳動の後、約１５１８ｂｐのEcoRI−Xbal断片を単離した。この断片を、事前にXbal及びEcoRIで処理した発現プラスミドpAb110（実施例３）で結紮し、プラスミドｐFC103（６６０４ｂｐ）を産出した。このプラスミドは、ヒトサイトメガロウイルス又はｈＣＭＶ−ＩＥ(最初期ヒトサイトメガロウイルス)の初期プロモーターの制御下で、ｔＰＡのシグナル配列をコードする挿入断片、次にタンパク質Eをコードする配列を含む。
【実施例６】
【０１５１】
プラスミドpFC104の構築
ウエストナイル熱ウイルスＮＹ９９の相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）は、Gene Amp RNA PCR Kit(Perkin-Elmer社製)を用いて、製造者からの条件で合成した。
【０１５２】
逆転写反応と連鎖増幅反応（ＲＴ−ＰＣＲ反応）を、ウエストナイル熱ウイルスＮＹ９９のウイルスＲＮＡ懸濁液５０μｌ（実施例２）と、次のオリゴヌクレオチドと共に行った。
ＦＣ１０１（３０ｍｅｒ）（配列番号１）；及び
ＦＣ１０６（３３ｍｅｒ）（配列番号８）
この１組のオリコヌクレオチドは、制限部位EcoRIと、制限部位Xbalと挿入物の３'における停止コドンとの取込みを可能にする。
【０１５３】
第１ｃＤＮＡ鎖の合成は、ＲＮＡマトリックスにオリコヌクレオチドＦＣ１０６をハイブリダイゼーションした後、オリゴヌクレオチドＦＣ１０６の伸張によって起こる。
【０１５４】
第１ｃＤＮＡ鎖の合成条件は、４２℃で１５分、次に９９℃で５分、最後に４℃で５分である。オリゴヌクレオチドＦＣ１０１及びＦＣ１０６の組の存在下でのＰＣＲ反応の条件は、９５℃で２分、次に３５サイクル（９５℃で１分、その後６２℃で１分、さらに７２℃で２分）であり、最後に７２℃で７分行い、２０３１ｂｐの断片を作製した。
【０１５５】
この断片をEcoRI、次にXbalで処理し、アガロースゲル電気泳動の後、約２０１９ｂｐのEcoRI−Xbal断片を単離した。この断片を、事前にXbal及びEcoRIで処理した発現プラスミドpAb110（実施例３）と結紮し、プラスミドpFC104（７１０５ｂｐ）を作製した。このプラスミドは、ヒトサイトメガロウイルス又はｈＣＭＶ−ＩＥ(最初期ヒトサイトメガロウイルス)の初期プロモーターの制御下で、ｔＰＡのシグナル配列をコードする挿入断片、次にタンパク質ｐｒM−M−Eをコードする配列を含む。
【実施例７】
【０１５６】
プラスミドpFC105の構築
ウエストナイル熱ウイルスＮＹ９９の相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）は、Gene Amp RNA PCR Kit(Perkin-Elmer社製)を用いて、製造者からの条件で合成した。
【０１５７】
逆転写反応と連鎖増幅反応（ＲＴ−ＰＣＲ反応）を、ウエストナイル熱ウイルスＮＹ９９のウイルスＲＮＡ懸濁液５０μｌ（実施例２）と、次のオリゴヌクレオチドと共に行った。
ＦＣ１０７（３６ｍｅｒ）（配列番号９）
5'TTTTTTGATATCACAGGAATTGCAGTCATGATTGGC3'
；及びＦＣ１０６（３３ｍｅｒ）（配列番号８）
この１組のオリコヌクレオチドは、制限部位EcoRIと、制限部位Xbalと挿入物の３'における停止コドンとの取込みを可能にする。
【０１５８】
第１ｃＤＮＡ鎖の合成は、ＲＮＡマトリックスにオリコヌクレオチドＦＣ１０６をハイブリダイゼーションした後、オリゴヌクレオチドＦＣ１０６の伸張によって起こる。
【０１５９】
第１ｃＤＮＡ鎖の合成条件は、４２℃で１５分、次に９９℃で５分、さらに４℃で５分である。オリゴヌクレオチドＦＣ１０６及びＦＣ１０７の組の存在下でのＰＣＲ反応の条件は、９５℃で２分、次に３５サイクル（９５℃で１分、その後６２℃で１分、さらに７２℃で２分）であり、最後に７２℃で７分行い、２０７６ｐｂの断片を作製した。
【０１６０】
この断片をEcoRV、次にXbalで処理し、アガロースゲル電気泳動の後、約２０５８ｂｐのEcoRV−Xbal断片を単離した。
【０１６１】
この断片を、事前にXbal及びEcoRVで処理した発現プラスミドpAb1012と結紮し、プラスミドpCF10５（６９５３ｂｐ）を産出した。このプラスミドは、ヒトサイトメガロウイルス又はｈＣＭＶ−ＩＥ(最初期ヒトサイトメガロウイルス)の初期プロモーターの制御下で、ｔＰＡの活性剤のシグナル配列をコードする挿入断片、次にタンパク質ｐｒＭ−Ｍ−Ｅをコードする配列を含む。
【実施例８】
【０１６２】
プラスミドpFC106の構築
ウエストナイル熱ウイルスＮＹ９９の相補ＤＮＡ（ＤＮＡｃ）は、Gene Amp RNA PCR Kit(Perkin-Elmer社製)を用いて、製造者からの条件で合成した。
【０１６３】
逆転写反応と連鎖増幅反応（ＲＴ−ＰＣＲ反応）を、ウエストナイル熱ウイルスＮＹ９９のウイルスＲＮＡ懸濁液５０μｌ（実施例２）と、次のオリゴヌクレオチドと共に行った。
ＦＣ１０８（３６ｍｅｒ）（配列番号１０）
5'TTTTTTGATATCATGTATAATGCTGATATGATTGAC3'
；及びＦＣ１０９（３６ｍｅｒ）（配列番号１１）
5'TTTTTTTCTAGATTAACGTTTTCCCGAGGCGAAGTC3'
この１組のオリコヌクレオチドは、制限部位EcoRIと、制限部位Xbal、挿入物の５'におけるＡＴＧ開始コドン及び３'における停止コドンとの取込みを可能にする。
【０１６４】
第１ｃＤＮＡ鎖の合成は、ＲＮＡマトリックスにオリコヌクレオチドＦＣ１０９をハイブリダイゼーションした後、オリゴヌクレオチドＦＣ１０９の伸張によって起こる。
【０１６５】
第１ｃＤＮＡ鎖の合成条件は、４２℃で１５分、次に９９℃で５分、さらに４℃で５分である。オリゴヌクレオチドＦＣ１０８及びＦＣ１０９の組の存在下でのＰＣＲ反応の条件は、９５℃で２分、次に３５サイクル（９５℃で１分、その後６２℃で１分、さらに７２℃で２分）であり、最後に７２℃で７分行い、２９７３ｐｂの断片を作製した。
【０１６６】
この断片をEcoRV、次にXbalで処理し、アガロースゲル電気泳動の後、約２９５５ｂｐのEcoRV−Xbal断片を単離した。
【０１６７】
この断片を、事前にXbal 及びEcoRVで処理した発現プラスミドpAb1012と結紮し、プラスミドpFC106（７８５０ｂｐ）を作製した。このプラスミドは、ヒトサイトメガロウイルス又はｈＣＭＶ−ＩＥ(最初期ヒトサイトメガロウイルス)の初期プロモーターの制御下で、ｔＰＡのシグナル配列をコードする挿入断片、次にポリタンパク質ＮＳ２Ａ−ＮＳ２Ｂ−ＮＳ３をコードする配列を含む。
【実施例９】
【０１６８】
ＡＬＶＡＣカナリア痘ウイルスのＣ５部位に挿入するドナープラスミドの構築
ＵＳ−Ａ−５７５６１０３の図１６は、３１９９ｂｐのカナリア痘ウイルスのゲノムＤＮＡ断片の配列を示している。この配列の分析により、Ｃ５Ｌと呼ばれ、１５３８番目の位置で開始し、１８５９番目の位置で停止する、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が明らかになった。ＯＲＦ Ｃ５Ｌの欠失を導く挿入プラスミドの構築と、転写及び翻訳停止シグナルが隣接する多重クローニング部位による置換とを、下記の方法で行った。
【０１６９】
ＰＣＲ反応を、カナリア痘ウイルスのゲノムＤＮＡで構成されたマトリックスを基にして、下記オリゴヌクレオチドを用いて行い、２２３ｂｐのＰＣＲ断片（断片Ｂ）を単離した。
Ｃ５Ａ１（４２ｍｅｒ）（配列番号１２）
5'ATCATCGAGCTCCAGCTGTAATTCATGGTCGAAAAGAAGTGC3'
；及びＦＣ１０９（３６ｍｅｒ）（配列番号１３）
5'GAATTCCTCGAGCTGCAGCCCGGGTTTTTATAGCTAATTAGTCATTTTTTGAGAGTACCACTTCAGCTACCTC3'
ＰＣＲ反応を、カナリア痘ウイルスのゲノムＤＮＡで構成されたマトリックスを基にして、下記オリゴヌクレオチドを用いて行い、４８２ｂｐのＰＣＲ断片（断片C）を単離した。
Ｃ５Ｃ１（７２ｍｅｒ）（配列番号１４）
5'CCCGGGCTGCAGCTCGAGGAATTCTTTTTATTGATTAACTAGTCATTATAAAGATCTAAAATGCATAATTC3'
；及びＣ５Ｄ１（４５ｍｅｒ）（配列番号１５）
5GATGATGGTACCGTAAACAAATATAATGAAAAGTATTCTAAACTA3'
断片Ｂ及びＣを共にハイブリダイダイゼーションし、オリゴヌクレオチドＣ５Ａ１（配列番号１２）及びＣ５Ｄ１（配列番号１５）で行ったＰＣＲ反応のマトリックスとして使用し、６８１ｂｐのＰＣＲ断片を作製した。この断片を、制限酵素Sacl及びKpnlで処理し、アガロースゲル電気泳動の後、６６４ｂｐのSacl−Kpnl断片を単離した。この断片を、事前に制限酵素Sacl及びKpnlで処理したpBlueScript II SK+ ベクター（Stratagene社製）と結紮し、プラスミドpC5Lを作製した。このプラスミドの配列は、シークエンシングにより確認した。このプラスミドは、ＯＲＦ Ｃ５Ｌ（《左側面アームＣ５》）の上流に局在する１６６ｂｐの配列、転写初期停止ワクチンシグナル、６つのリーディングフレーム内の停止コドン、制限部位Smal、Pstl、Xhol及びEcoRI を含む多重クローニング部位、及びＯＲＦ Ｃ５Ｌ（右フランキングアームＣ５）の下流に局在する４２５ｋｐの配列を含む。
【０１７０】
プラスミドpMP528HRH（Perkus M. et al. J. Virol. 1989, 63, 3829-3836） を、下記ヌクレオチドと共に、ワクチンプロモーターＨ６（GenBank アクセス番号 Ｍ２８３５１）の完全な配列を増幅するためにマトリックスとして使用し、１４９ｂｐのＰＣＲ断片を増幅した。
ＪＣＡ２９１（３４ｍｅｒ）（配列番号１６）
5'AAACCCGGGTTCTTTATTCTATACTTAAAAAGTG3'
；及びＣ５Ｄ１（４５ｍｅｒ）（配列番号１５）
5'AAAAGAATTCGTCGACTACGATACAAACTTAACGGATATCGCG3'
この断片を制限酵素Smal及びEcoRIで処理し、アガロースゲル電気泳動の後、１３８ｂｐの制限断片Smal−EcoRIを単離した。この断片を、あらかじめ制限酵素Smal及びEcoRIで処理したプラスミドpC5Lと結紮し、プラスミドpFC107を作製した。
【実施例１０】
【０１７１】
組換え型ウイルスｖＣＰ１７１２の構築
ＰＣＲ反応を、プラスミドpFC105（実施例７）をマトリックスとして、及び下記オリゴヌクレオチドを用いて行い、約２０７９ｋｂのＰＣＲ断片を増幅した。
ＦＣ１１０（３３ｍｅｒ）（配列番号１８）
5'TTTTCGCGAACCGGAATTGCAGTCATGATTGGC3'
；及びＦＣ１１１（３９ｍｅｒ）（配列番号１９）
5'TTTTGTCGACGCGGCCGCTTAAGCGTGCACGTTCACGGA3'
この断片を、制限酵素Nrul及びSallで処理し、アガロースゲル電気泳動の後、約２０６８ｂｐのNrul−Sall断片を単離した。この断片を、事前に制限酵素Nrul及びSallで処理したプラスミドpFC107（実施例９）と結紮し、プラスミドpFC108を作製した。
【０１７２】
プラスミドpFC108を、Notlで直線化し、カナリア痘ウイルス（ＡＬＶＡＣ株）を感染した初期ニワトリ胚細胞に、文献（Panicali et Paoletti Proc. Nat. Acad. Sci. 1982, 79, 4927-4931; Piccini et al., In Methods in Enzymology. 1987, 153, 545-563, Eds. Wu R. Grossman L. Academic Press）記載のリン酸カルシウム沈殿法に従って、トランスフェクトした。陽性プラークを、エンベロープ糖タンパク質Ｅのヌクレオチド配列特異的な、放射活性がある標識化したプローブとのハイブリダイゼーションに基づき選択した。これらのプラークは、４回の連続したプラークの選択／浄化サイクルを経て、純粋な個体群を単離した。次に、ドナープラスミドpFC108とＡＬＶＡＣカナリア痘ウイルスのゲノムとのインビトロでの組換えの代表的なプラークを増幅し、その結果得た組換え型ウイルスストックを、ｖＣＰ１７１２と名付けた。
【実施例１１】
【０１７３】
組換え型ウイルスｖＣＰ１１７３の構築
プラスミドpFC104（実施例６）を、制限酵素Sall及びPmllで処理し、アガロースゲル電気泳動の後、約２２１３ｂｐの制限断片Pmll-Sallを単離した。この断片を、事前に制限酵素Nrul及びSallで処理したプラスミドpFC107（実施例９）と結紮し、プラスミドpFC109を作製した。
【０１７４】
プラスミドpFC109を、Notlで直線化し、実施例１０の技法に従って、カナリア痘ウイルス（ＡＬＶＡＣ株）を感染した初期ニワトリ胚細胞内にトランスフェクトした。ドナープラスミドpFC109とＡＬＶＡＣカナリア痘ウイルスのゲノムとのインビトロでの組替えの代表的なプラークを、エンベロープ糖タンパク質Ｅのヌクレオチド配列特異的な、放射活性があると標識化したプローブとのハイブリダイゼーションを基に選択し、次に増幅した。その結果得た組換え型ウイルスストックを、ｖＣＰ１７１３と名付けた。
【実施例１２】
【０１７５】
組換え型ウイルスｖＣＰ１７１４の構築
プラスミドpFC103（実施例５）を、制限酵素Sall及びPmllで処理し、アガロースゲル電気泳動の後、約１７１２ｂｐの制限断片Pmll−Sallを単離した。この断片を、事前に制限酵素Nrul及びSallで処理したプラスミドpFC107（実施例９）と結紮し、プラスミドpFC110を作製した。
【０１７６】
プラスミドpFC110を、Notlで直線化 し、実施例１０の技法に従って、カナリア痘ウイルス（ＡＬＶＡＣ株）に感染した初期ニワトリ胚細胞内にトランスフェクトした。ドナープラスミドpFC110とＡＬＶＡＣカナリア痘ウイルスのゲノムとのインビトロでの組換えの代表的なプラークを、エンベロープ糖タンパク質Ｅのヌクレオチド配列特異的な、放射活性がある標識化したプローブとのハイブリダイゼーションに基づき選択し、次に増幅した。その結果得た組換え型ウイルスストックを、ｖＣＰ１７１４と名付けた。
【実施例１３】
【０１７７】
組換え型ウイルスｖＣＰ１７１５の構築
プラスミドpFC102（実施例４）を、制限酵素Sall及びPmllで処理し、アガロースゲル電気泳動の後、約４３４ｂｐの制限断片Pmll−Sallを単離した。この断片を、事前に制限酵素Nrul及びSallで処理したプラスミドpFC107（実施例９）と結紮し、プラスミドpFC111を作製した。
【０１７８】
プラスミドpFC111を、Notlで直線化し、実施例１０の技法に従って、カナリア痘ウイルス（ＡＬＶＡＣ株）に感染した初期ニワトリ胚細胞内にトランスフェクトした。ドナープラスミドpFC111とＡＬＶＡＣカナリア痘ウイルスのゲノムとのインビトロでの組換えの代表的なプラークを、エンベロープ糖タンパク質Ｅのヌクレオチド配列特異的な、放射活性がある標識化したプローブとのハイブリダイゼーションに基づき選択し、次に増幅した。その結果得た組換え型ウイルスストックを、ｖＣＰ１７１５と名付けた。
【実施例１４】
【０１７９】
組換え型ウイルスｖＣＰ１７１６の構築
プラスミドpFC101（実施例３）を、制限酵素Sall及びPmllで処理し、アガロースゲル電気泳動の後、約４８４ｂｐの制限断片Pmll−Sallを単離した。この断片を、事前に制限酵素Nrul及びSallで処理したプラスミドpFC107（実施例９）と結紮し、プラスミドpFC112を作製した。
【０１８０】
プラスミドpFC112を、Notlで直線化し、実施例１０の技法に従って、カナリア痘ウイルス（ＡＬＶＡＣ株）に感染した初期ニワトリ胚細胞内にトランスフェクトした。ドナープラスミドpFC112とＡＬＶＡＣカナリア痘ウイルスのゲノムとのインビトロでの組換えの代表的なプラークを、エンベロープ糖タンパク質Ｅのヌクレオチド配列に特異的な、放射活性がある標識化したプローブとのハイブリダイゼーションに基づき選択し、次に増幅した。その結果得た組換え型ウイルスストックを、ｖＣＰ１７１６と名付けた。
【実施例１５】
【０１８１】
ＡＬＶＡＣカナリア痘ウイルスのＣ６部位に挿入するドナープラスミドの構築
ＷＯ−Ａ−０１／０５９３４の図４は、３７００ｂｐのカナリア痘ウイルスのゲノムＤＮＡ断片の配列を示している。この配列の分析により、Ｃ６Ｌと呼ばれ、３７７番目の位置で開始し、２２５４番目の位置で停止するオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が明らかになった。ＯＲＦ Ｃ５Ｌの欠失と、転写及び翻訳停止位置シグナルが隣接した多重クローニング部位による置換とを導く挿入プラスミドの構築は、下記の方法で行われた。
【０１８２】
ＰＣＲ反応を、カナリア痘ウイルスのゲノムＤＮＡで構成されたマトリックスを基にして、下記オリゴヌクレオチドを用いて行い、約４３２ｋｂのＰＣＲ断片（断片Ｄ）を単離した。
Ｃ６Ａ１（４２ｍｅｒ）（配列番号２０）
5'ATCATCGAGCTCGCGGCCGCCTATCAAAAGTCTTAATGAGTT3'
；及びＣ６Ｂ１（７３ｍｅｒ）（配列番号２１）
5'GAATTCCTCGAGCTGCAGCCCGGGTTTTTATAGCTAATTAGTCATTTTTTCGTAAGTAAGTATTTTTATTTAA3'
ＰＣＲ反応を、カナリア痘ウイルスのゲノムＤＮＡで構成されたマトリックスを基にして、下記オリゴヌクレオチドを用いて行い、１２１０ｋｂのＰＣＲ断片（断片Ｅ）を単離した。
Ｃ６Ｃ１（７２ｍｅｒ）（配列番号２２）
5'CCCGGGCTGCAGCTCGAGGAATTCTTTTTATTGATTAACTACTAGTCAAATGAGTATATATAATTGAAAAAGTAA 3'
；及びＣ６Ｂ１（７３ｍｅｒ）（配列番号２３）
5'GATGATGGTACCTTCATAAATACAAGTTTGATTAAACTTAAGTTG 3'
断片Ｄ及びＥは、オリゴヌクレオチドＣ６Ａ１（配列番号２０）及びＣ６Ｄ１（配列番号２３）とのＰＣＲ反応のマトリックスにできるように、共にハイブリダイゼーションを行い、１６３０ｂｐのＰＣＲ断片を作製した。この断片を、制限酵素Sacl及びKpnlで処理し、アガロースゲル電気泳動の後、１６１３ｂｐのSacl−Kpnl断片を単離した。この断片を、事前に制限酵素Sacl及びKpnlで処理したbplueScriptc II＋ベクター（Stratagene社製）で直線化し、プラスミドpCL6Lを作製した。このプラスミドの配列はシークエンシングによって確認した。このプラスミドは、ＯＲＦ Ｃ６Ｌ（左フランキングアームＣ６）の上流に局在する３７０ｂｐの配列、初期転写停止ワクチンシグナル、６つのリーディングフレーム内の停止コドン、制限部位Smal、Pstl、Xholを含む多重クローニング部位及びＯＲＦ Ｃ６Ｌ（右フランキングアームＣ６）に局在する１１５６bｐの配列を含む。
【０１８３】
プラスミドpMPIVC(Schmitt J.F.C et al, J. Virol, 1988, 62, 1889-1897; Saiki R. K. et al., Science, 1988, 239, 487-491) は、下記オリゴヌクレオチドと共に、ワクチンプロモーターＩ３Ｌの完全配列を増幅するマトリックスとして用いて、１５１ｋｂのＰＣＲ断片を増幅した。
ＦＣ１１２（３３ｍｅｒ）（配列番号２４）
5'AAACCCGGGCGGTGGTTTGCGATTCCGAAATCT3'
；及びＦＣ１１３（４３ｍｅｒ）（配列番号２５）
5'AAAAGAATTCGGATCCGATTAAACCTAAATAATTGTACTTTGT3'
この断片を、制限酵素Smal及びEcoRIで処理し、アガロースゲル電気泳動の後、約１３６ｂｐの制限酵素Smal−EcoRIを単離した。この断片を、事前にSmal及びEcoR1で処理したプラスミドpC6Lと結紮し、プラスミドpFC113を作製した。
【実施例１６】
【０１８４】
組換え型ウイルスｖＣＰ１７１７及びｖＣＰ１７１８の構築
ＰＣＲ反応を、プラスミドpFC106（実施例８）をマトリックスとして、及び下記ヌクレオチドを用いて行い、約２９７３ｂｐのＰＣＲ断片を増幅した。
ＦＣ１１４（３３ｍｅｒ）（配列番号２６）
5'TTTCACGTGATGTATAATGCTGATATGATTGAC3'
；及びＦＣ１１５（４２ｍｅｒ）(配列番号２７)
5'TTTTGGATCCGCGGCCGCTTAACGTTTTCCCGAGGCGAAGTC3'
この断片を、制限酵素Pmll及びBamHIで処理し、アガロースゲル電気泳動の後、約２９５８ｂｐのPmII−BamHI制限断片（断片Ｆ）を単離した。プラスミドpFC113（実施例１５）を制限酵素PmII及びBamHIで処理し、アガロースゲル電気泳動の後、約４５００ｂｐのPmII−BamHI（断片Ｇ）制限断片を単離した。次に、断片ＦとＧを結紮し、プラスミドpFC114を作製した。
【０１８５】
プラスミドpFC114を、Notlで直線化し、カナリア痘ウイルスｖＣＰ１７１３（実施例１１）を感染した初期ニワトリ胚細胞に、文献（Panicali et Paoletti Proc. Nat. Acad. Sci. 1982, 79, 4927-4931; Piccini et al., In Methods in Enzymology. 1987, 153, 545-563, Eds. Wu R. Grossman L. Academic Press）記載のリン酸カルシウム沈殿法に従って、トランスフェクトした。陽性プラークを、エンベロープ糖タンパク質Ｅのヌクレオチド配列特異的な、放射活性がある標識化したプローブとのハイブリダイゼーションを基に選択した。これらのプラークは、４回の連続したプラークの選択／浄化サイクルを経て、純粋な個体群を単離した。次に、ドナープラスミドpFC114とＡＬＶＡＣカナリア痘ウイルスのゲノムとのインビトロでの組換えの代表的なプラークを増幅し、その結果得た組換え型ウイルスストックを、ｖＣＰ１７１７と名付けた。
【０１８６】
Notlで直線化したプラスミドpFC114を、カナリア痘ウイルスｖCP１７１２（実施例１０）を感染した初期ニワトリ胚細胞を、上述した方法でトランスフェクトするためにも用いた。かかる方法で入手した組換え型ウイルスストックを、ｖＣＰ１７１８と名付けた。
【実施例１７】
【０１８７】
プラスミドpFC115の構築
ウエストナイル熱ウイルスＮＹ９９の相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）は、Gene Amp RNA PCR Kit(Perkin-Elmer社製)を用いて、製造者からの条件で合成した。
【０１８８】
逆転写ポリメラーゼ鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ反応）を、ウエストナイル熱ウイルスＮＹ９９（実施例２）のウイルスＲＮＡ懸濁液５０μｌと、下記オリゴヌクレオチドと共に行った。
ＦＣ１１６（３９ｍｅｒ）（配列番号２８）
5'TTTTTTGATATCATGACCGGAATTGCAGTCATGATTGGC3'
；及びＦＣ１０６（３３ｍｅｒ）（配列番号８）
このオリゴヌクレオチドの対は、制限部位EcoRV、制限部位Ｘbal、挿入物の５'の開始コドン及び、３'における停止コドンの取込みを可能にする。
【０１８９】
第１ｃＤＮＡ鎖の合成条件は、４２℃で１５分、次に９９℃で５分、さらに４℃で５分である。オリゴヌクレオチドＦＣ１０６及びＦＣ１１６の組の存在下でのＰＣＲ反応の条件は、９５℃で２分、次に３５サイクル（９５℃で１分、その後６２℃で１分、さらに７２℃で２分）であり、最後に７２℃で７分行い、２０７９ｋｂの断片を作製した。
【０１９０】
この断片を、EcoRV及びXbalで処理し、アガロースゲル電気泳動の後、約２０６１ｂｐのEcoRV−Xbal断片を単離した。
【０１９１】
この断片を、事前にXbal及びEcoRＶで処理された発現プラスミドpVR1012と結紮し、プラスミドpFC115（６９５６ｂｐ）を作製した。このプラスミドは、ヒトサイトメガロウイルス又はｈＣＭＶ−ＩＥ(最初期ヒトサイトメガロウイルス)の初期プロモーターの制御下で、ｔＰＡのシグナル配列をコードする挿入断片、次にタンパク質ｐｒＭ−Ｍ−Ｅをコードする配列を含む。
【実施例１８】
【０１９２】
組換え型ウイルスｖＣＰ２０１７の構築
ＰＣＲ反応を、マトリックスとしてプラスミドpFC115（実施例１７）を、及び下記オリゴヌクレオチドを用いて行い、約２０８２ｂｐのＰＣＲ断片を増幅した。
ＦＣ１１７（３６ｍｅｒ）（配列番号２９）
5'TTTTCGCGAATGACCGGAATTGCAGTCATGATTGGC3'
：及びＦＣ１１１（３９ｍｅｒ）（配列番号１９）
この断片を、制限酵素Nrul及びSallで処理し、アガロースゲル電気泳動の後、約２０７１ｂｐの制限断片Nrul−Sallを単離した。この断片を、事前にNrul及びSallで処理したプラスミドpFC107（実施例９）と結紮し、プラスミドpFC 116を作製した。
【０１９３】
プラスミドpFC116を、Notlで直線化し、実施例１０記載の方法で、カナリア痘ウイルス（ＡＬＶＡＣ株）を感染した初期ニワトリ胚細胞にトランスフェクトした。ドナープラスミドpFC116及びＡＬＶＡＣカナリア痘ウイルスのゲノムとのインビトロでの組換えの代表的なプラークを、エンベロープ糖タンパク質Ｅの配列に特異的な放射性に標識化したプローブとのハイブリダイゼーションを基に選択し、次に増幅した。その結果得た組換え型ウイルスストックは、ｖＣＰ２０１７と名付けた。
【実施例１９】
【０１９４】
組換え型ワクチンの調製
ウマのワクチンを調製するために、組換え型カナリア痘ウイルスｖＣＰ１７１２（実施例１０）を、BF Goodrichが製造したCarbopol９７４Ｐ（分子量、約３００００００）等のカルボマー溶液でアジュバントした。
【０１９５】
１．５％のCarbopol９７４Ｐ保存溶液を、まず１ｇ／ｌの塩化ナトリウムを含む蒸留水内で調製した。次に、この保存溶液を用いて、生理食塩水内の４ｍｇ／ｍｌのCarbopol９７４Ｐ溶液を生成した。保存溶液と、１回の段階又は複数回の連続した段階を経て、適量の生理食塩水と混合し、ｐＨ値を各段階で１Ｎ（又はさらに濃縮した）の水酸化ナトリウム溶液で調整し、最終的なｐＨ値が７．３〜７．４となるようにした。
【０１９６】
かかる方法で入手した、すぐに使用できるCarbopol９７４Ｐ溶液は、組換え型の凍結乾燥したウイルスの回収、又は組換え型ウイルスが濃縮した保存溶液の希釈に用いる。例えば、用量１ｍｌ当たり１０8ｐｆｕを含むウイルス懸濁液を得るには、１０8.3ｐｆｕ／ｍｌの力価が得られるよう、ウイルス保存溶液を希釈し、その後、同量の、すぐに使用できる前記４ｍｇ／ｍｌのCarbopol９７４Ｐ溶液に希釈する。
【０１９７】
組換え型ウイルスを、組換え型カナリア痘ウイルスｖＣＰ１７１３（実施例１１）、ｖＣＰ１７１７（実施例１６）、ｖＣＰ１７１８（実施例１６）、ｖＣＰ２０１７（実施例１８）、又はｖＣＰ１７１４（実施例１２）、ｖＣＰ１７１５（実施例１３）とｖＣＰ１７１６（実施例１４）の３つのカナリア痘を上記の方法で混合したもので作製することができる。
【実施例２０】
【０１９８】
ウマ用のＤＮＡワクチンの製造
プラスミドpFC104（実施例６）を含むＤＮＡ溶液を、Sambrook et al (1989)に記載の方法で、エタノール沈殿法で濃縮した。ＤＮＡ沈殿物を、０．９％ＮａＣｌ溶液で回収し、１ｍｇ／ｍｌの濃度を得た。０．７５ｍＭのＤＭＲＩＥ−ＤＯＰＥ溶液を、適切な体積の無菌Ｈ2ＯによってＤＭＲＩＥ−ＤＯＰＥ凍結乾燥物を回収して、調製した。
【０１９９】
プラスミド−脂質ＤＮＡ複合体は、０．９％のＮａＣｌ溶液内に、１ｍｇ／ｍｌのＤＮＡ溶液を、同量の０．７５ｍＭのＤＭＲＩＥ−ＤＯＰＥ溶液（１：１）を希釈することにより作製する。ＤＮＡ溶液を、気泡を形成しないように、陽イオン性の脂質溶液を含むフラスコの壁沿いに、２６Ｇの針で徐々に注入した。２種類の溶液の混合後直ちに、ゆっくりと攪拌する。最終的に、０．３７５ｍＭのＤＭＲＩＥ−ＤＯＰＥと５００μｌ／ｍｌのプラスミドとを含む組成物を得た。
【０２００】
上記記載の全ての工程に使用する全ての溶液が、外界温度であることが望ましい。ＤＮＡ／ＤＭＲＩＥ−ＤＯＰＥの複合体は、動物を免疫化する３０分間に、外界温度に放置する。
【０２０１】
ＤＮＡワクチンを、本実施例に記載の方法で、プラスミドpFC104（実施例６）及びpFC106（実施例８）や、プラスミドpFC105（実施例７）及びpFC106や、プラスミドpFC115（実施例１７）及びpFC106や、プラスミドpFC101、pFC102及びpFC103（実施例３〜５）、若しくはプラスミドpFC105又はpFC115を含むＤＮＡ溶液で作製することができる。
【実施例２１】
【０２０２】
インビトロでの発現検査
各構築におけるＷＮタンパク質の発現を、従来の間接免疫蛍光法及びウェスタンブロット法で検査した。
【０２０３】
これらの検査は、単層で培養し、プラスミドでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞、又は単層で培養し、組換え型ウイルスで感染したＣＥＦ細胞を含む、９６ウェルプレートで行った。
【０２０４】
ＷＮタンパク質は、感染したニワトリ又はウマの血清、若しくは標識化した抗血清を用いて検出される。
【０２０５】
アガロースゲルに移した後に入手した断片のサイズを、想定していたものと比較した。
【実施例２２】
【０２０６】
動物への効果
約７日齢の、ワクチンを接種していないＳＰＦのニワトリに、約０．１ｍｌの組換え型ワクチン及びプラスミドワクチンを、約二週間間隔で２回、筋肉内に注入した。ワクチンを接種していない、コントロール群も本研究に含まれる。
【０２０７】
ニワトリの頸部に、１０3-4ＲＣＩＤ50のウイルスＷＮ病原性物質を注入した。
【０２０８】
その結果、ウイルス血症、抗体反応及び死を観察した。病変を観察するために、死体解剖を行った。
【実施例２３】
【０２０９】
抗ＷＮＶ中和抗体の滴定
一連の希釈を、細胞培養用の９６ウェルプレート内の、１０％のウシ胎児血清を添加したＤＭＥＭ培地で、各血清に３の割合で行った。０．０５ｍｌの希釈血清に、約１００のＣＣＩＰ50／ｍｌのＷＮＶを含む０．０５ｍｌの培養培地を添加した。この混合物を２時間、３７℃で５％のＣＯ2を含む雰囲気下の消毒器内でインキュベートした。
【０２１０】
次に、１ｍｌ当たり約１０００００細胞を含むＶＥＲＯ細胞の懸濁液０．１５ｍｌを、各混合物に添加した。３７℃で、５％のＣＯ2を含む雰囲気下で４〜５日培養した後、位相差顕微鏡で細胞変性効果（ＣＰＥ）を観察した。各血清の中和力価を、Karber 法で算出した。５０％のウェルで変性効果を抑制する、最高希釈として力価を示す。力価は、log10 ＶＮ５０で現す。各血清を、少なくとも２回、好ましくは４回滴定する。
【実施例２４】
【０２１１】
馬におけるｖＣＰ２０１７の検査
１ｍｌのCarbopol９７４Ｐ アジュバント（４ｍｇ／ｍｌ）と短時間で作製したｖＣＰ２０１７（実施例１８）を含む組換え型ワクチンを、３５日間隔で、２回にわたり、事前にワクチンを接種していない３ヶ月齢以上の馬に、約１ｍｌの用量を筋肉内に注入した。３つの動物群にワクチン接種し、グループ１には、１０5.8ＣＣＩＤ50（つまり１０5.64ｐｆｕ）、グループ２には１０6.8ＣＣＩＤ50（つまり１０6.64ｐｆｕ）、グループ３には、１０7.8ＣＣＩＤ50（つまり１０7.64ｐｆｕ）の用量を注入した。ワクチンを接種しないコントロール群も本研究に含まれる。
【０２１２】
血清学を観察した。中和抗体力価が築かれ、実施例２３で示したように、log10 ＶＮ５０で表した。
【０２１３】
【表１】
Claims (22)
- ウマ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ及びトリを、ＷＮウイルスから保護するワクチンで、ＷＮタンパク質ｐｒＭ、Ｍ及びＥを発現する、１つ又は複数の組換え型アビポックス、ＮＹＶＡＣ又はＭＶＡウイルスを含み、かかる組換え型ウイルスが、１つ又は複数のタンパク質ｐｒＭ、Ｍ及びＥコードする、１つ又は複数のポリヌクレオチド並びに薬剤として許容される媒体又は賦形剤を含むことを特徴とするワクチン。
- ３つのタンパク質ｐｒＭ、Ｍ及びＥを発現する組換え型アビポックスウイルスを含むことを特徴とする、請求項１記載のワクチン。
- ｐｒＭ−Ｍ−Ｅをコードする１つのリーディングフレームを形成するポリヌクレオチドを含む組換え型アビポックスウイルスを含むことを特徴とする、請求項１記載のワクチン。
- 組換え型ウイルスが、カナリア痘であることを特徴とする、請求項１、２又は３記載のワクチン。
- 組換え型ウイルスが、鶏痘であることを特徴とする、請求項１、２又は３記載のワクチン。
- ポリヌクレオチドが、シグナルペプチドもコードすることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか記載のワクチン。
- ＷＮウイルスのシグナルペプチドであることを特徴とする、請求項６記載のワクチン。
- 異種のシグナルペプチドであることを特徴とする、請求項６記載のワクチン。
- ヒト組織プラスミノゲンアクチベーターのシグナルペプチドであることを特徴とする、請求項８記載のワクチン。
- 他のＷＮ株及び／又は他の病原性物質及び／又はサイトカインのタンパク質をコードする他のポリヌクレオチドを含むことを特徴とする、請求項１〜９のいずれか記載のワクチン。
- 他のＷＮ株及び／又は他の病原性物質及び／又はサイトカインのタンパク質をコードする他のポリヌクレオチドを含む他の発現ベクターを含むことを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか記載のワクチン。
- さらにアジュバントを含むことを特徴とする、請求項１〜１１のいずれか記載のワクチン。
- アジュバントが、（１）アクリル酸又はメタクリル酸のポリマー、及び無水マレイン酸並びにアルケニル誘導体ポリマー（２）免疫刺激配列（３）水中油型エマルジョン（４）四級アンモニウム塩を含む陽イオン性脂質（５）サイトカイン、の中から選択することを特徴とする、請求項１２記載のワクチン。
- アジュバントが、カルボマーであることを特徴とする、請求項１３記載のワクチン。
- サイトカインが、ウマサイトカイン又はトリサイトカインであることを特徴とする、請求項１０又は１３記載のワクチン。
- サイトカインが、特にインターロイキン１８、インターロイキン１２、インターロイキン１５、ＭＩＰ−１α、ＧＭ‐ＣＳＦ、の中から選択されることを特徴とする、請求項１５記載のワクチン。
- サイトカインが、トリインターロイキンｃＩＬ−１８、ｃＩＬ−１５から選択されることを特徴とする、請求項１５記載のワクチン。
- サイトカインがウマＧＭ−ＣＳＦであることを特徴とする、請求項１５記載のワクチン。
- 他の病原性物質に対するワクチン成分を含むことを特徴とする、多価ワクチンを形成する、請求項１〜１８のいずれか記載のワクチン。
- 他の病原性物質に対する成分が、サブユニット、非活性因子、又は弱毒性因子としての抗原を含むことを特徴とする、請求項１９記載のワクチン。
- ウマ鼻肺炎ウイルス、ウマインフルエンザウイルス、東部脳炎ウイルス、西部脳炎ウイルス、ベネズエラ脳炎ウイルス、破傷風菌及びそれらの混合物に対するワクチン成分を含むことを特徴とする、請求項１９又は２０記載のワクチン。
- マレック病ウイルス、ニューカッスル病ウイルス、ガンボロ病ウイルス、感染性気管支炎ウイルス、感染性貧血ウイルス、感染性喉頭気管炎ウイルス、脳脊髄炎ウイルス、出血性腸炎ウイルス、肺炎ウイルス病（pneumovirosis）ウイルス、トリペストウイルス、鶏水膜心炎ウイルス、トリレオウイルス、大腸菌、マイコプラズマ・ガリナルム (Mycoplasma gallinarum)、マイコプラズマ・ガリセプティカム (Mycoplasma gallisepticum)、ヘモフィラス・アヴィウム (Haemophilus avium)、パスツレラ・ガリナルム (Pasteurella gallinarum)、パスツレラ・ムルトシダ・ガリシダ (Pasteurella multocida gallicida)及びそれらの混合物に対するワクチン成分を含むことを特徴とする、請求項１９又は２０記載のワクチン。
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