MXPA03008998A - Vacuna contra el virus de la fiebre del nilo. - Google Patents

Abstract

La invencion concierne a vectores de expresion in vivo e in vitro que comprenden un polinucleotido que codifica la proteina estructural E del virus de la fiebre del Nilo o el virus WN, opcionalmente asociado con un polinucleotido que codifica la proteina de pre-membrana prM y/o la proteina de membrana M, en particular en la forma que codifica a prM-M-E. Los vectores de expresion in vivo se incorporan en vacunas vivas. Los vectores de expresion in vivo se usan para producir proteinas in vitro que entonces pueden ser usadas en vacunas de subunidad. La invencion tambien concierne vacunas multivalentes que comprenden un constituyente de vacuna en contra del virus WN y un constituyente de vacuna en contra de otro patogeno. La invencion esta disenada en particular para caballos, perros, gatos, ganado, puercos y pajaros.

Description

VACUNA CONTRA EL VIRUS DE LA FIEBRE DEL NILO CAMPO DE LA INVENCION La presente invención tiene por objeto vectores de expresión in vivo e in vi tro que comprenden y expresan al menos un polinucleótido del virus de la fiebre del Nilo, así como composiciones inmunogénicas y vacunas contra la fiebre del Nilo. Ella tiene por objeto además métodos de inmunización y de vacunació contra ese virus. ANTECEDENTES DE LA INVENCION El virus de la fiebre del Nilo (Virus de Nilo Occidental o WNV por sus siglas en inglés) fue identificado por primera vez en 1937 en un horribre en Uganda en la provincia del Nilo Occidental (Zeller H. G. , Med. Trop. 1999, 59, 490-494). Ampliamente difundido en Africa, también se encuentra en la India, en Paquistán y en la Cuenca del Mediterráneo, y fue identificado en los Estados Unidos por primera vez en la ciudad de Nueva York en 1999 (Anderson J. P. et al., Science, 1999, 286, 2331-2333). El virus de la fiebre del Nilo afecta lo mismo a aves que a mamíferos y el hombre. La enfermedad se caracteriza en las aves por un ataque por un ataque del sistema nervioso central y la muerte. Las lesiones incluyen encefalitis, hemorragias en el miocardio y hemorragias y necrosis en el tracto intestinal.

En los pollos, las infecciones experimentales por inoculaciones subcutáneas del virus de la fiebre del Nilo aisladas sobre cornejas van de necrosis del miocardio, nefritis y neumonías de 5 a 10 días después de la inoculación, de encefalitis moderadas a severas, 21 días después de la inoculación (Senne D.A. et al., Avian Disease, 2000, 44, 642-649). El virus - de la fiebre del Nilo afecta también a caballos, especialmente en Africa .del norte y en Europa (Cantile C. et al., Equine Vet. J. , 2000, 32(1), 31-35). Los caballos muestran signos de ataxia, debilitamiento de los miembros posteriores, parálisis que evoluciona hacia una tetraplegia y la muerte. Los caballos y los camélidos son los principales animales que manifiestan signos clínicos bajo la forma de encefalitis. Los anticuerpos anti-WNV son detectados en ciertos roedores, en ganado, especialmente en bovinos y ovinos, en animales domésticos, especialmente perros (Zeller H.G., Med. Trop., 1999, 59, 490-494; Lundstrom J.O., Journal of Vector Ecology, 1999, 24(1)1-39). La especie humana no es la excepción para el virus de la fiebre del Nilo, con numerosos síntomas (Sampson B.A., Human Patology, 2000, 31(5), 527-531; Marra C.M. , Seminars in Neurology, 2000, 20(3), 323-327). El virus de la fiebre del Nilo es transmitido a las aves y los mamíferos por les piquetes de ciertos mosquitos (por ejemplo Culex, Aedes, Anopheles) y garrapatas.

Las aves silvestres y domésticas son un reservorio para el virus de la fiebre del Nilo y un vector de propagación por sus migraciones . Los viriones del virus de la fiebre del Nilo son partículas esféricas de 50 nm de diámetro constituidas de una envoltura lipoprotéica que rodea una nucleocapsula icosahédrica que contiene una sola hebra de ARN de polaridad positiva. Un único cuadro abierto de lectura (COL por sus siglas en francés) codifica para el montaje de proteínas virales bajo la forma de una poliproteína. La escisión y maduración de esa poliproteína conduce a la producción de una decena de proteínas virales diferentes. Las proteínas estructurales son codificadas por la parte 5' del genoma y corresponden a la nucleocapsula llamada C (14 kDa) , la glicoproteína de la envoltura llamada ? (50 kDa) , la proteína premembranal llamada prM (23 kDa) , la proteína membranal • llamada (7 kDa) . Las proteínas no estructurales son codificadas por la parte 13' del genoma y corresponden a las proteínas NS1 (40 kDa) , NS2A (19 kDa) , NS2B (14 kDa) , NS3 (74kDa) , NS4A (15 kDa), NS4B (29 kDa), NS5 (97 kDa) . Parrish C.R. et al. (J. Gen. Virol., 1991, 72, 1645-1653), ulkarni A.B. et al. (J. Virol., 1992, 66(6), 3583-3592) y Hill A.B. et al. (J. Gen. Virol., 1992, 73, 1115-1123) construyeron, a partir del virus de la viruela, de los vectores de ejqpresión in vivo que contienen diversos insertos que corresponden a las secuencias nucleotídicas que codifican para las proteínas no estructurales del virus Kunjin eventualmente asoció una de las proteínas estructurales. Esos vectores son administrados a ratones para evaluar la respuesta inmune celular. Los autores insisten en la importancia de la respuesta celular, respuesta que es esencialmente estimulada por proteínas no estructurales y en particular por NS3, NS4A y NS4B. Esos artículos destacan la dificultad de poner en evidencia lo que sería una buena estrategia de vacunación contra la fiebre del Nilo. Hasta ahora, no existe una vacuna para prevenir la infección por el virus WN. ' La presente invención tiene por objeto proponer un medio de prevención y/o de lucha contra olas enfermedades causadas por el virus WN. Otro objetivo de la invención es el de proponer medios que pueden ser empleados en las diferentes especies de animales sensibles a la enfermedad causada por ese virus y, en particular, las especies equinas y aviarias. Otro objetivo ms de la invención es proponer métodos de inmunización y vacunación de especies blanco u objetivo. Otro objetivo de la invención es proponer medios y métodos que permitan asegurar un diagnóstico diferencial. De este modo, la invención tiene como un primer objeto los vectores de expresión in vitro y/o in vivo que comprende un polinucleótido que codifica para la proteína de la envoltura E del virus WN. Esos vectores comprenden además los elementos necesarios para la expresión de polinucleótido en la células hospedera. Además del polinucleótido que codifica para E, los vectores de expresión según la invención pueden comprender uno o más de otros polinucleótidos que codifican para otras proteínas del virus W , de preferencia proteínas estructurales del virus WN, siendo esas secuencias elegidas de preferencia a aquellas que codifican para la proteína premembranal prM y para la proteína membranal . El vector comprende de preferencia un polinucleótido que forma una sola fase codificadora correspondiente, por ejemplo, a prM-E, -E y de manera más particular prM-M-E. Uh vector que comprende una pluralidad de polinucleótidos separados que codifican para proteínas diferentes (por ejemplo prM y/o M y E) entra también en el marco de la presente invención. El vector, en particular, in vivo, puede también comprender polinucleótidos correspondientes a más de una cepa de virus WN, en particular dos o más polinucleótidos que codifican para E o para prM-M-E de cepas diferentes. Como se vera más adelante, el- vector, en particular in vivo, puede también comprender una o dos secuencias nucleotídicas que codifiquen para el inmunógeno de otros agentes patógenos y/o para citocinas . Según una modalidad preferida de la invención, el vector de expresión comprende un polinucleótido que codifica para prM-E-E y de preferencia en una sola fase de lectura.

Por polinucleótido que codifica para una proteína del virus N, se entiende principalmente un fragmento de ADN que codifica para esa proteína o la hebra complementaria de ese fragmento de ADN. No puede excluirse un ARN. En un sentido de la invención, el término proteína engloba los fragmentos, y comprende péptidos y polipéptidos . Por definición, el fragmento de una proteína es inmunológicamente activo en el sentido que una vez administrado a un hospedero, es susceptible de desencadenar una respuesta inmune del tipo humoral y/o celular dirigida contra la proteína. De preferencia, el fragmento de proteína es tal que posee sustancialmente la misma actividad inmunológica que la proteína entera. Un fragmento de proteína según la invención comprende además un epitopo o determinante antihigiénico. El término epitopo se refiere a un sitio de la proteína capaz de inducir una reacción inmune del tipo humoral (células B) y/o del tipo celular (células T) . La estructura mínima de un polinucleótido es aquélla que codifica para un epitopo o determinante antigénico de la proteína considerada. Un polinucleótido que codifica para un fragmento de la proteína total comprende como mínimo 21 nucleótidos, especialmente al menos 42 nucleótidos y de preferencia al menos 57, 87 ó 150 nucleótidos consecutivos de la secuencia de donde provienen. Las técnicas de determinación de los epitopos son bien conocidas por el experto en la técnica, pero pueden utilizarse, especialmente los bancos de péptidos existentes (Hemmer B. et al., Immunology Today, 1998, 19(4), 163-168), Pepscan (Geysen H. M. et al., Proc . Nat . Acad. Sci . EUA, 1984, 81(13), 3998-4002; Geysen H. M. et al., Proc. Nat. Acad. Sci. EUA,. 1985, 82 (1), 178-182; Van der Zee R. et al., Eur. J. Irnmunol., 1989 19(1), 3-47; Geysen H.M. , Southeast Asian J. Trop. Med. Public Health, 1990, 21(4), 523-533; ultipin® Peptide Synthesis Kits de Chiron) , los algoritmos (De Groot A. et al. , Nature Biotechnology, 1999, 17, 533-561) . En particular, los polinucleótidos según la invención comprenden la secuencia nucleotidica que codifica para uno o más de dos dominios transmembranales, de preferencia los dos, situados en la parte C terminal de la proteína E. Para la cepa WNV NY99 esos dominios corresponden a las secuencias de aminoácidos 742 a 766 y 770 a 791 del GenBank AF196835. Los elementos necesarios para la expresión de los polinucleótidos están presentes. Se trata como mínimo de un codón de inicio (ATG) , de un codón de finalización y de un promotor, así como una secuencia de poliadenilación para los plásmidos y vectores virales diferentes a los poxvirus . Cuando el polinucleótido codifica para un fragmento de la poliproteína, por ejemplo prM-E, M-E, prM- -E, un ATG está colocado en 5' de la fase de lectura y un codón de finalización está colocado en 3' . Como se explicará más adelante, podrán estar presentes otros elementos que permitan el control de la expresión, como secuencias activadoras (en inglés "amplificadora") , secuencias estabilizadoras , secuencia señal que permitan la secreción de la proteína. SUMARIO DE LA INVENCION La presente invención también tiene por objeto preparaciones que comprenden los vectores de expresión. De manera más particular, ella se relaciona con preparaciones que comprenden uno o más vectores de expresión in vivo, que comprenden y expresan uno o más de los polinucleótidos anteriores, donde ellos codifican para E, en un vehículo o excipiente farmacéut camente aceptable. Según una primera modalidad de la invención, los otros vectores en la preparación conprenden y expresan una o más de otras proteínas del virus WN, por ejemplo pr , M, prM-M. Según otra' modalidad, los otros vectores en la preparación comprenden y expresan una o más proteínas de una o más de otras cepas de virus WN. Especialmente, la preparación comprende por lo menos dos vectores que expresan, en particular in vivo polinucleótidos de cepas de WN diferentes, que codifican para las mismas proteínas y/o para proteínas diferentes, de preferencia para las mismas proteínas . Se trata de preferencia de vectores que expresan in vivo E o prM-E de dos o tres o más cepas de WN diferentes.

La invención apunta también hacia las atmósferas de vectores que expresan prM, , E, prM-M, pr -E o M-E de cepas diferentes. Según otra modalidad más, y como se verá con mayor detalle más adelante, los otros vectores en la preparación comprenden y expresan una o más citocinas y/o uno o más inmunogenos en uno o más otros agentes patógenos . La invención apunta también a las diversas combinaciones de esas diferentes modalidades. Las preparaciones que comprenden un vector de expresión in vitro o in vivo que comprenden y expresan un polinucleótido que codifica para prM-M-E constituyen un modo de realización preferido de la invención. Según un modalidad particular de la invención, los vectores de expresión in vivo o in vitro comprenden como único polinucleótido del virus WN, un polinucleótido que codifica para la proteína E, eventualmente asociada con prM y/o , de preferencia codifica para prM-M-E, y eventualmente una secuencia señal del virus WN. Según una modalidad particular, una o más proteínas no estructurales NS2A, NS2B y NS3 son expresadas conjuntamente con proteínas estructurales según la invención, es decir vía .el mismo vector de expresión, es decir, vía un vector de expresión propio. Ellas son de preferencia expresadas conjuntamente a partir de un polinucleótido único.

La invención tiene también ~por objeto un vector de expresión, in vivo o in vitro, que comprende el polinucleotido que codifica para NS2A, NS2B, NS3, sus combinaciones, y de preferencia para NS2A-NS2B-NS3. Básicamente, ese vector puede ser uno de los vectores descritos anteriormente, que comprenda un polinucleotido que codifique para una o dos proteínas estructurales, especialmente E o prM-M-E. En una variante, la invención se relaciona con una preparación como se describió anteriormente, que comprende al menos uno de esos vectores que expresan una proteína no estructural y eventualmente un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. Para realizar los vectores de expresión según la invención el experto en la materia dispone de diferentes cepas de virus y de la descripción de la secuencia nucleotídica de su genoma. Voir notamment Savage H.M. et al.

(Am. J. Trop. Med. Hyg. 1999, 61(4), 600-611), tabla 2, que menciona 24 cepas de virus WN y que da las referencias de acceso a las secuencias polinucleotídicas en el GenBank. Uno puede referirse por ejemplo a la cepa NY99 (GenBank AF196835) . En el GenBank, se precisa para cada proteína la secuencia de ADN correspondiente (nucleótidos 466-741 para pr , 742-966 para 'M, 967-2469 para E, o sea 466-2469 para prM-M-E, 3526-4218 para NS2A, 4219-4611 para NS2B y 4612-6468 para NS3, o sea 3526-6468 para NS2A-NS2B-NS3 ) . Por comparación y alineación de las secuencias, la determinación de un polinucleótido que codifica para una proteína en otra cepa de WNV es inmediata. Como se indicó más arriba por polinucleótido, se entiende la secuencia que codifica para la proteína o un fragmento o un epitopo, específico del virus WN. Por otra parte, por equivalente, el término polinucleótido engloba también las secuencias nucleotídicas correspondientes a diferentes cepas de virus WN y las secuencias nucleotídicas que son diferentes por la degeneración del código. Dentro de la familia de virus WN, la identidad de tres secuencias de aminoácidos de prM-M-E con relación a la NY99 es igual o superior al 90%. También están comprendidos en la invención los polinucleótidos que codifican para una secuencia de aminoácidos donde la identidad con la secuencia de aminoácidos nativa es superior o igual al 90%, especialmente el 92%, de preferencia el 95%, y de manera más particular aún el 98%. También se consideran equivalentes los fragmentos de aquellos polinucleótidos homólogos, que son específicos de virus WN. De este modo, según lo dicho de un polinucleótido del virus WN, ese término engloba las secuencias equivalentes en el sentido de la invención. Se considera también que el término proteína engloba a los polipéptidos y péptidos inmunológicamente activos. Para las necesidades de la invención, esos engloban: a) las proteínas correspondientes a diferentes cepas de virus WN; b) las proteínas que son diferentes pero que conservan con una proteína nativa de WN una identidad superior o igual al 90%, especialmente el 92%, de preferencia el 95%, y de manera más particular aún el 98%. De este modo, según lo dicho de una proteína del virus WN, ese término engloba proteínas equivalentes en el sentido de la invención. Diferentes cepas de virus WN son accesibles a través de colección, especialmente del American Type Culture Collection (ATCC por sus siglas en ingles) , y por ejemplo bajo los números de acceso VR-82 o VR-1267. El virus denominado Kunjin es considerado de hecho un virus WN. Conforme a la invención se prefiere que. el polinucleótido comprenda además una secuencia nucleotídica que codifique para un péptido señal, situada río arriba de la proteína expresante para asegurar la secreción. Puede tratarse de una secuencia endógena, es decir la secuencia señal natural existente (proveniente del mismo virus WN o de otra fuente) . Por ejemplo, para el virus WN NY99, la secuencia señal endógena de E corresponde a los nucleótidos 922 a 966 de la secuencia del GenBank; para prM a los nucleótidos 412 a 465. Puede también tratarse de una secuencia nucleotídica que codifique para un péptido señal heterólogo, especialmente que codifique para un péptido señal del activador tisular del plasminógeno humano (tPA) (Hartikka J. Et al., Human Gene Therapy, 1996, 7, 1205-1217). La secuencia nucleotídica que codifica para el péptido señal es insertada en fase río arriba de la secuencia que codifica para E o sus combinación, por ejemplo prM-M-E. DESCRIPCION DETALLADA DE LAS MODALIDADES PREFERIDAS DE LA INVENCION En una primera modalidad de la invención, los vectores de expresión in vivo son vectores virales. Esos vectores de expresión son venta osamente poxvirus, por ejemplo el virus de la viruela o mutantes atenuados del virus de la viruela por ejemplo el MVA (cepa Ankara) (Stickl H. y Hochstein-Mintzel V., unch. ed. Wschr., 1971, 113, 1149-1153; Sutter G. et al., Proc. Nati.

Acad. Sci. U.S.A., 1992, 89, 10847-10851; cepa comercial ATCC VR-1508; del MVA se obtiene después de más de 570 pasajes de la cepa de la viruela de Ankara sobre fibroblastos de embriones de pollo) o el NYVAC (su construcción es descrita en la US-A-5 494 807, especialmente en los ejemplos 1 a 6; esa patentes describe también al inserción de genes heterólogos en los sitios de ese recombinante y la utilización de promotores adaptados; se reporta igualmente la O-A-96/40241) , las viruelas aviarias (en particular la viruela de los canarios, viruela de aves domésticas, viruela de las palomas, viruela de las codornices) , la viruela porcina, la 'viruela del mapache y la viruela del camello, adenovirus, como los adenovirus aviarios, caninos, porcinos, bovinos, humanos, y herpes virus, como el virus del herpes equino (EHV serotipos 1 y 4) , el virus del herpes canino (CHV) , el virus del herpes felino (FHV) , el virus del herpes bovino (BHV serotipos 1 y 4) , el virus del herpes porcino (PRV) , los virus de la enfermedad de Marek (MDV serotipos 1 y 2) , el virus del herpes del pavo (HVT o MDV serotipo 3) el virus del herpes del pato. Cuando es utilizado un virus del herpes, para la vacunación de una especia aviaria el vector HVT es el preferido, y para la vacunación de caballos se prefiere el vector EHV. Según una de las modalidades preferidas de la invención, el vector de expresión del virus de la viruela es virus un virus de la viruela de los canarios o un virus de la viruela de las aves de corral, esos virus de la viruela pueden ser eventualmente atenuados . Se puede citar el virus de la viruela del canario comercialmente disponible de la ATCC con el número de acceso VR-111. El virus de la viruela del canario aténuado se describe en la US-A-5, 756, 103 y en la WO-A-01/0593 . Las numerosas cepas vacunables del virus de la viruela de las aves de corral se encuentran accesibles, por ejemplo en la vacuna DIFTOSEC CR® comercializada por MERIAL y la vacuna NOBILIS® VARIOLE comercializada por Intervet.

Para los virus de la viruela, el experto en la técnica puede remitirse a la WO-A-90/12882 , y más particularmente para el virus de la viruela a la US-A-4,769,330; US-A-4 , 722 , 848 ; US-A- , 603 , 112 ; US-A-5 , 110 , 587 ; US-A-5, 494, 807; US-A-5 , 762 , 938 ; para la viruela de las aves de corral a la US-A-5, 174 , 993 ; US-A-5 , 505 , 941 ; US-A-5,766,599; para la viruela de los canarios a la US-A-5,756,103; para la viruela de los cerdos US-A-5 , 382 , 425 ; para la viruela del mapache WO-A-00/03030. Cuando el vector de expresión es un virus de la viruela, los sitios de inserción de los polinucleótidos a expresar son en particular el gen de la timidina cinasa (TK) , el gen de la hemaglutinina (HA) , la región de los cuerpos de inclusión del tipo A (ATI) . Cuando se trata de la viruela de los canarios, los sitios de la inserción están situados en particular, o constituidos por, los COL C3, C5 y C6. Cuando se trata de la viruela de las aves de corral, los sitios de inserción se sitúan en particular en, o constituidos por, los F7 y F8. La inserción de genes en el virus VA es descrita en las diversas publicaciones de Carroll . W. et al., Vaccine, 1997, 15(4), 387-394; Stittelaar K. J. et al., J. Virol., 2000, 74(9), 4236-4243; Sutter G. et al., Vaccine, 1994, 12 (11), 1032-1040, aquéllas a que el experto en la materia puede remitirse. El genoma completo del MVA es descrito en Antoine G. , Virology 1998, 244, 365-396 la que permite a un experto en la técnica utilizar otros sitios de inserción u otros promotores. De preferencia, cuando el vector de expresión es un virus de la viruela, o poxvirus, el polinucleótido a expresar es insertado bajo el control de un promotor específico del virus de la viruela o poxvirus, especialmente el promotor de la viruela de 7.5 kDa (Cochran et al., J. Virology, 1985, 54, 30-35), el promotor de la viruela 13L (Riviere et al., J. Virology, 1992, 66, 3424-3434), el promotor de la viruela HA. (Shida, Virology, 1986, . 150, 451-457) , el promotor de la viruela de las vacas ATI (Funahashi et al., J. Gen. Virol., 1988, 69, 35-47), o también el promotor de la viruela H6 (Taylor J. et al. Vaccine, 1988, 6, 504-508; Guo P. et al. J. Virol., 1989, 63, 4189-4198; Perkus M. et al. J. Virol., 1989, 63, 3829-3836). De preferencia para la vacunación de mamíferos, el vector de expresión es uno de la viruela de los canarios. De preferencia para la vacunación de aves, en particular de pollos, patos, pavas y ocas o gansos, el vector de expresión es uno de viruela de los canarios o viruela de las aves de corral . Cuando el vector de expresión es un virus del Herpes HVT, los sitios de inserción apropiados se localizan en particular en el fragmento de BamHI I o en el fragmento de BamHI M del HVT. El fragmento de restricción del BamHI I del HVT comprende una pluralidad de cuadros abiertos de lectura (COL) y tres regiones intergenéticas y comprende una pluralidad de zonas preferidas para la inserción, a saber las tres regiones intergenéticas 1, 2 y 3, que son las regiones preferidas, y el COL UL 55 (FR-A-2 728 795, US-A-5 980 906) . EL fragmento de restricción BamHI del HVT comprende el COL UL43 que es también un sitio preferido de inserción (FR-A-2 728 724, US-A-5 7333 554) . Cuando el vector de expresión es un virus del herpes EHV-1 o EHV-4, los sitios de inserción apropiados son en particular TK, UL43 y UL45 (EP-A-0668355) . De preferencia, cuando el vector de expresión es un virus del herpes, el polinucleotido a expresar es insertado bajo el control de un promotor eucariótico fuerte, de preferencia el promotor CMV-IE. Esos promotores fuertes son descritos más arriba en la parte de la descripción relativa a los plásmidos . Según una segunda modalidad de la invención, los vectores de expresión in vivo son dos vectores plasmídicos llamados plásmidos. El término plásmido se entiende como aquel que cubre toda la unidad de transcripción de ADN bajo la forma de una · secuencia polinucleotídica que comprende un polinucleotido según la invención y los elementos necesarios para la expresión in vivo. Se prefiere la forma plasmídica circular, super enrollada o no. La forma lineal entra igualmente en el marco de la invención.

Cada plásmido comprende un promotor adecuado para asegurar, en las células hospederas, la expresión del polinucleótido insertado bajo su dependencia. Se requiere en general un promotor eucariótico fuerte . El promotor eucariótico fuerte preferido es el promotor precoz de citomegalovirus (C V-IE) , de origen humano o murino, o también eventualmente de otro origen como rata o cobayo. El promotor CMV-IE puede comprender la parte promotora propiamente dicho, asociada o no con la parte activadora (amplificadora) . Puede remitirse a la EP-A-260 148, EP-A-323 597, US-A-5 168 062, US-A-5 385 839, US-A-4 968 615, WO-A-87/03905. Se prefiere el CMV-IE humano (Boshart M. et al., Cell., 1985, 41, 521-530) o murino. De manera más general , el promotor es de origen viral, es decir de origen celular. Como promotor viral fuerte además del CMV-IE, puede citarse al promotor precoz/tardío del virus SV40 o el promotor LTR del virus del Sarcoma de Rous. Como promotor celular fuerte, puede citarse al promotor de un gen del citoesqueleto, como por ejemplo el promotor de la desmina (Kwissa M. et al., Vaccine, 2000, 18 (22), 2337-2344), o también el promotor de lactina (Miyazaki J. et al., Gene, 1989, 79(2), 269-277). Por equivalencia, los subfragmentos de esos promotores, que conservan una actividad promotora adecuada están comprendidos en la presente invención: por ejemplo los promotores CMV-IE truncados según la WO-A-98/00166. La noción del promotor según la invención incluye los derivados y subfragmentos que conservan una actividad promotora adecuada, de preferencia sustancialmente similar a la del promotor propiamente dicho del que proviene. Para el CMV-IE, esa noción comprende la parte promotor proveniente dicho y/o la parte activadora y los derivados y subfragmentos . De preferencia los plásmidos comprenden otros elementos de control de expresión. En particular, es ventajoso incorporar secuencias estábilizadoras del tipo intrón, de preferencia el intrón II del gen de la ß-globina de la lapa (van Ooyen et al. Science, 1979, 260:337-344). Como señal de poliadenilación (poliA) para los plásmidos y los vectores virales diferentes a los virus de los viruela o poxvirus, se puede utilizar especialmente aquélla del gen de la hormona de la cruza bovina (bGH) (US-A-5 122 458) , aquélla del gen de la ß-globina de la lapa o aquélla del virus SV40. Los otros elementos de control de la expresión utilizables en los plásmidos pueden igualmente ser los vectores de expresión del virus del herpes. Según otra modalidad de la invención, los vectores de expresión son vectores de expresión utilizados para expresar in vitro proteínas en un sistema celular apropiado. Las proteínas pueden ser luego recolectadas en el medio de cultivo, después de la secreción o no (si no ocurre la secreción, se procede a una lisis celular) , eventualmente concentradas por las técnicas clásicas de concentración, especialmente por ultrafiltracicn y/o purificadas por los medios de purificación ' clásicos, especialmente las técnicas de cromatografía del tipo de afinidad, intercambio iónico o filtración sobre gel . La producción se efectúa para la transfección de células de mamífero para los plásmidos, para la reproducción de vectores virales sobre células de mamífero o células de aves, o para la reproducción de Baculovirus (US-A-4 745 051; Vialard J. et al. J. Virol . , 1990, 64(1), 37-50; Verne A., Virology, 1988, 167, 56-71), por ejemplo Autographa californica Nuclear Polyhedrosis Virus AcNPV, sobre células de insectos (por ejemplo células Sf9 de Spodoptera frugiperda, depósito ATCC CRL 1711) . Como células de mamífero pueden utilizarse especialmente células de hámster (por ejemplo CHO o BHK-21) , células de mono (por ejemplo COS o VERO) . La invención abarca igualmente vectores de expresión que incorporan un polinucleótido según la invención, las proteínas de W o fragmentos así producidos y las preparaciones que los contienen. La presente invención tiene por objeto también preparaciones purificadas y/o concentradas de proteínas de WN. Cuando el polinculeótido codifica para una pluralidad de proteínas las cuales son escindidas, y las preparaciones de las anteriores que contienen en tal caso las proteínas escindidas.

La invención tiene igualmente por objeto las composiciones inmunogénicas y las vacunas contra el virus WN que comprenden al menos un vector de expresión in vivo según la invención y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable y eventualmente un adyuvante . La noción de composición inmunogénica opera toda la composición susceptible, una vez administrada a la especia blanco u objetivo, de inducir una respuesta inmune dirigida contra el virus WN. Por vacuna, se entiende una composición capaz de inducir una protección eficaz. Las especies blanco son los equinos, los caninos, los felinos, los bovinos, los porcinos, las aves, de preferencia los caballos, los perros, los gatos, los cerdos y para las aves, las ocas, los pavos, los pollos, los patos, mismos que por definición engloban animales reproductores, ponedores y de carne. Los vehículos o excipientes farmacéuticamente aceptables son perfectamente conocidos por un experto en la materia. A titulo de ejemplo, puede citarse a la solución salina de NaCl al 0.9% o de fosfato amortiguador. Los vehículos o excipientes farmacéuticamente aceptables engloban también a todos los compuestos o combinaciones de compuestos que permitan la facilitación de la administración del vector, especialmente la transfección, y/o el mejoramiento de la conservación. Las dosis y los volúmenes de las dosis son definidas más adelante en el marco de la descripción general de los métodos de inmunización y de .vacunación. Las composiciones inmunogénicas y las vacunas según la invención comprenden de preferencia uno o más adyuvantes, elegidos especialmente de entre los adyuvantes usuales . Particularmente muy conveniente en el marco de la presente invención: (1) polímeros de ácido acrílico o metacrílico, polímeros de anhídrido maleico y de derivados de alquenilo, (2) secuencias inmunoestimuladoras (ISS) , especialmente secuencias oligodesoxirribonucleotídicas que tengan uno o más motivos CpG no metilados (Klinman D. M. et al., Proc. Nati. Acad. Sci EUA, 1996, 93, 2879-2883; WO-A1-98/16247) , (3) una emulsión aceite en agua, en particular la emulsión SPT descrita en la página 147 de <<Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach>> editado por M. Powell, M. Newman, Plenum Press 1995, y la emulsión MF59 descrita en la página 183 de medio trabajo, (4) lípidos catiónicos que contengan una sal de amonio cuaternaria, (5) citocinas, o (6) sus combinaciones o mezclas. La emulsión aceite en agua (3) que está particularmente adaptada para los vectores virales, puede ser especialmente una base: - de aceite de parafina líquida ligera (del tipo de la Farmacopea europea) ; de aceite isoprenoide como el escualana, el escualeno; - del aceite resultante de la oligomerización de alquenos, en particular de isobuteno o de deceno; - de ásteres de ácidos o de alcoholes como un grupo alquilo lineal; - de manera más particular aceites vegetales, oleato de etilo, di (caprilato/caprato) de propilen glicol, tri (caprilato/caprato) de glicerol, dioleato de propilen glicol; de ásteres de ácidos o alcoholes graso ramificados, en particular ásteres del ácido isoesteárico . El aceite es utilizado en asociación con emulsificantes para formar la emulsión. Los emulsificantes son de preferencia tensoactivos no iónicos, en particular: - ásteres de una parte de sorbitán, de manida (por ejemplo, oleato de anhidromanitol) , de glicerol, de poliglicerol, o de propilen glicol y de otra parte de ácido oleico, isoesteárico, ricinoleico, hidroxiesteárico , esos esteres están eventualmente etoxilados . los bloques copoliméricos de polioxipropileno-polioxietileno, en particular los Pluronic®, especialmente el L121. Entre los polímeros adyuvantes del tipo (1) , se prefieren los polímeros de ácido acrílico o metacrílico reticulados, especialmente reticulados por ásteres poliacetilénicos de azúcares o polialcoholes . Esos compuestos son conocidos bajo el término de carbomeros (Pharmeuropa vol . 8, n° 2, junio 1996) . El experto en la técnica puede también remitirse a la US-A-2 909 462 que describe los polímeros acrílicos reticulados por un compuesto polihidroxilado con al menos 3 grupos hidroxilo, de preferencia no más de 8, los átomos de hidrógeno de al menos' tres hidroxilos están reemplazados por radicales alifáticos insaturados que contienen al menos 2 átomos de carbono. Los radicales preferidos son aquéllos que contienen de 2 a 4 átomos de carbono, por ejemplo vinilos, alilos y otros grupos etilénicamente insaturados. Los radicales insaturados pueden por sí mismos contener otros sustituyentes, como el. metilo. Los productos vendidos bajo la denominación de Carbopol (BF Goodrich, Ohio, EUA) son particul rmente apropiados. Ellos son particularmente reticulados por una alil sacarosa o por un alilpentaeritritol . Entre ellos, se pueden citar en particular a los Carbopol®974P, 934P y 971P. Entre los copolímeros de anhídrico maleico y derivados de alquenilo, se prefieren a los EMA (Monsanto) que son copolímeros de anhídrico maleico y etileno, lineales o reticulados, por ejemplo reticulados por diviniléter. Uno puede remitirse a J. Fields et al., Nature, 186:778-780, 4 junio 1960. Sobre el plano de su estructura, los polímeros de ácido acrílico o metacrílico y los EMA® están formados de preferencia de motivos de base de la siguiente fórmula: en la cual : - ¾ y R2; idénticos o diferentes, representan H o C¾ -x= 0 ó 1, de preferencia x=l - y= 1 ó 2, con x + y =2 Para los ? ?®, x= 0 y y= 2. Para los carbómeros, x= y = i. Esos polímeros son disociados en agua o en agua fisiológica (NaCl a 20 g/1) y el pH es ajustado a 7.3-7.4 con sosa, para dar la solución adyuvante en la que los vectores de expresión serán incorporados. La concentración de polímero en la composición de la vacuna final puede ser especialmente de 0.01% a 1.5% P/V, de manera más particular de 0.05% a 1% P/V, de preferencia de 0.1 a 0.4% P/V. Los lípidos catiónicos (4) que contienen una sal de amonio cuaternario, están particularmente, más no exclusivamente adaptadas para los plásmidos, son de preferencia aquéllas que responden a la siguiente fórmula: CH3 + - O - CH2- CH - CH2- N R _?2 OR, C H 3 en la que Rl es un radical . alifático lineal, saturado o insaturado, con 12 a 18 átomos de carbono, R2 es otro radical alifático, reservado a 2 ó 3 átomos de carbono, y x es un grupo hidroxilo o amina. Entre esos lipidos catiónicos, se prefiere el DMRIE (N- (2-hidroxietil) -N,N-dimetil-2 , 3-bis (tetradeciloxi) -1-propanamonio; WO-A-96/34109) , de preferencia asociado con un lipido neutro, de preferencia la DOPE (dioleoil-fosfatidil-etanolamina; Behr J. P., 1994, Bioconjugate Chemistry, 5, 382-389) , para formar la DMRIE-DOPE . De preferencia, la mezcla plasmídica con ese adyuvante se hace de manera extemporánea y de preferencia antes de su administración, dando tiempo a la mezcla así constituida para completarse, por ejemplo, durante un tiempo activo de 10 a 60 minutos, especialmente del orden de 30 minutos . Cuando la DOPE está presente, la relación molar DMRIE:DOPE va de preferencia 95:5 a 5:95, de manera más particular de 1:1.

La relación ponderal de plásmido: adyuvante DMRIE o D RIE-DOPE puede ir especialmente de 50:1 -a 1:10, en particular de 10:1 a 1:5, y de preferencia de 1:1 a 1:2. La o las citocinas (5) pueden ser aportadas bajo la forma de proteína a la composición o vacuna, o ser coexpresadas en el hospedero, con o los inmunógenos . La preferencia va hacia la coexpresión dé la o las citocinas, es decir por el mismo vector que aquéllas que expresan el inmunógeno, es decir por un vector propio. Las citocinas pueden ser elegidas especialmente entre: interleucina 18 (IL-18) , interleucina 12 (IL-12) , interleucina 15 (IL-15) , ???-? (proteína inflamatoria de los macrófagos lia; arshall E. et al., Br. J. Cáncer, 1997, 75(12), 1715-1720), GM-CSF (factor de la estimulación de la formación de colonias granulomacrofágicas, o en inglés Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor) ) . Pueden citarse en particular citocinas aviarias, especialmente aquellas del pollo, como la cIL-18 (Schneider K. et al., J. Interferon Cytokine Res., 2000, 20(1=), 879-883), cIL-15 (XinK.-Q. et al., Vaccine, 1999, 17, 858-866), y citocinas equinas, especialmente el GM-CSF equino (WO-A-00/77210) ) . De manera preferida, se utilizan citocinas de la especie a vacunar. La WO-A-00/77210 describe una secuencia nucleotídica y la secuencia de aminoácidos correspondiente al GM-CSF equino, la producción de GM-CSF in vitro y la construcción de vectores (plásmidos y vectores virales) que permiten la expresión del GM-CSF equino in vivo. Esas proteínas, plásmidos y vectores virales, pueden ser utilizados en las composiciones inmunogénicas y las vacunas equinas según la invención. A título de ejemplo, puede utilizarse el.plásmido pJP097 descrito en el ejemplo 3 de esa solicitud anterior o utilizar las enseñanzas de esa solicitud anterior para producir otros vectores o para producir in vi tro GM-CSF equino, e incorporar esos vectores o GM-CSF equino en las composiciones inmunogénicas o vacunas equinas según la invención. La invención tiene aún por objeto composiciones inmunogénicas y vacunas subunitarias, que comprenden al proteína E, y eventualmente una o una pluralidad de otras proteínas de virus WN, especialmente prM o M, de preferencia productos para la expresión in vitro como se describió anteriormente, y por otra parte un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. Los vehículos o excipientes farmacéuticamente aceptables son perfectamente conocidos por el experto en la materia. A título de ejemplo, puede citarse la solución salina de NaCl al 0.9% o de fosfato amortiguador. Las composiciones inmunogénicas y las vacunas subunitarias según la invención comprenden de preferencia uno o más adyuvantes, elegidos especialmente entre los adyuvantes usuales. Particularmente muy convenientes en el marco de la presente invención: (1) un polímero de ácido acrílico o metacrílico, un polímero de anhídrido maleico y derivado de alquenilo, (2) una secuencia inmunoestimuladora (ISS) , especialmente una secuencia oligodesoxirribonucleotídica con uno o más ¦ motivos CpG ' no metilados (Klinman D. M. et al., Proc. Nati. Acad. Sci. EUA, 1996, 93, 2879-2883; W0-A1-98/16247) , (3) una emulsión aceite en agua en particular la emulsión SPT descrita en la página 147 de <<Vaccine Design, The Subunit and Adyuvant Approach>> editado por M. Po ell, M. Newman, Plenum Press 1995, y la emulsión MF59 descrita en la página 183 del mismo trabajo, (4) una emulsión agua en aceite (EP-A-639 071) , (5) saponina, en particular, Quil-A, o (6) hidróxido de aluminio o equivalente. Los diferentes tipos de adyuvantes definidos bajo 1) , 2) y 3) fueron descritos anteriormente con mayor detalle con respecto a vacunas basadas en vectores de expresión. Las dosis y volúmenes de las dosis son definidas más adelante en el marco de la descripción general de los métodos de inmunización y de vacunación. Conforme a la invención, la vacunación contra el virus N puede ser asociada con otras vacunaciones en el marco de programas de vacunación, bajo la forma de equipo de inmunización o de vacunación o aún bajo la forma de composiciones inmunogenicas y vacunas multivalentes, es decir que comprenden al menos un componente de la vacuna contra el virus WN y al menos un componente de la vacuna contra al menos otro agente patógeno. Esto incluye también la expresión por un mismo vector de expresión de genes de al menos dos agentes patógenos, incluido el virus WN. La invención tiene por objeto de este modo una composición inmunogénica multivalente o una vacuna multivalente contra el virus WN y en contra de al menos otro patógeno de la especie blanco u objetivo, utilizando un mismo vector de expresión in vi tro que contiene y expresa al menos un polinucleótido del virus WN según la invención y a menos un polinucleótido que expresa un inmunogeno de otro patógeno. Por "inmunogeno" así expresado, se entiende especialmente una proteína, glicoproteína, polipéptido o péptido, epitopo o derivado, por ejemplo proteína de fusión, que induce una respuesta inmune, de preferencia protectora. Como se describió anteriormente, las composiciones o vacunas multivalentes comprenden de este modo un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable, y eventualmente un adyuvante. La invención tiene igualmente por objeto una composición inmunogénica multivalente o una vacuna multivalente que comprende al menos un vector de expresión zn vivo en el que es insertado al menos un polinucleótido del virus WN según la invención y al menos un segundo vector de expresión en el que es insertado un polinucleótido que codifica para un inmunogeno de otro agente patógeno. Como se describió anteriormente, las composiciones o vacunas multivalentes comprenden de este modo un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable, y eventualmente un adyuvante. Para las composiciones inmunogénicas y las vacunas multivalentes, esos otros patógenos equinos son elegidos especialmente de entre el grupo que comprende los virus de la rinoneumonía equina EHV-1 y/o EHV-4 (de preferencia en asociación con los inmunógenos de EHV-1 y EHV-4) , el virus de la gripe equina EIV, el virus de la encefalitis oriental EEV, virus de la encefalitis Occidental WEV, el virus de la encefalitis Venezolana VEV (se prefiere una combinación de los tres EEV, WEV y VEV) , Clostridium tetani (tétanos) , y sus mezclas. De preferencia, para el EHV se eligen los genes gB y/o gD; para el EIV los genes HA, NP y/o N; para los virus de las encefalitis C y/o E2 ; para Clostridium tetani el gen que codifica para toda o parte de la subunidad C de la toxina tetánica. Esto incluye el uso de los polinucleótidos que codifican para un fragmento inmunológicamente activo o un epitopo de ese inmunógeno. Los otros patógenos aviarios son elegidos especialmente entre el grupo que comprende los virus de la enfermedad de arek DV (serotipos 1 y 2, de preferencia el serotipo 1) , virus de la enfermedad de Newcastle DV, virus de la enfermedad de Gumboro IBDV, virus de la bronquitis infecciosa IBV, virus de la anemia infecciosa CAV, virus de la laringotraqueitis infecciosa ILTV, virus de la encefalomielit'is AEV (o aún el virus de la leucosis aviaria ALV) , virus de la enteritis hemorrágica de los pavos (HEV) , virus de la pneumovirosis (TRTV) , virus de la peste aviaria (influenza aviaria) , virus de la hidropericarditis de . los pollos, reovirus aviarios, Escherichía coli, Mycoplasma gallinarum, Mycoplasma gallisepticum, Haemophilus aviu , Pasteurella gallinarum, Pasteurella multocida gallicida y sus mezclas. De preferencia, para la MDV se eligen los genes gB y/o gD; para la NDV los genes H y/o F; para la IBDV el gen VP2; para la IBV los genes S (y más particularmente SI) , M y/o N; para la CAV para los genes VP1 y/o VP2, para la ILTV los genes gB y/o gD; para la AEV los genes env y/o gag/pro, para la HEV los genes 100K y hexon, para la TRTV los genes F y/o G; para la peste aviaria los genes HA, N y/o NP. Esto incluye el uso de polinucleótidos que codifican para un fragmento inmunológicamente activo o un epitopo de ese inmunógeno. A titulo de ejemplo, en una composición inmunogénica multivalente o una vacuna multivalente según la invención, eventualmente medicada como se describe más arriba, destinada a la especie equina o puede incorporar uno o más de los plásmidos descritos en la WO-A-98/03198 y en particular en los ejemplos 8 a 25 de esa solicitud anterior, y aquéllos descritos en la WO-A-00/77043 y que se relacionan con la especie equina, en particular aquéllos descritos en los ejemplos 6 y 7 de esa solicitud anterior. Para la especie aviaria, se puede incorporar por ejemplo uno o más de los plásmidos descritos en la WO-A1-98/03659 y en particular en los ejemplos 7 a' 27 de esa solicitud anterior. Las composiciones inmunogénicas o las vacunas recombinantes que se describieron anteriormente pueden igualmente ser asociadas con al menos una vacuna clásica (inactiva, viva atenuada, subunitarias) dirigida contra al menos otro patógeno. Del mismo modo, las composiciones inmunogénicas y las vacunas subunitarias según la invención pueden hacer del objeto de la vacunación un asociado. La invención también tiene por objeto composiciones inmunogénicas multivalentes y vacunas multivalentes, que comprenden una de las proteínas según la invención, y uno o más inmunógenos (el término inmunógeno se definió más arriba) del al menos otro agente patógeno (especialmente de entre la lista anterior) , y/o aún otro agente patógeno bajo la forma inactiva o atenuada. Como se describió anteriormente, esas composiciones o vacunas multivalentes comprenden también un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable, y eventualmente un adyuvante. La presente invención tiene por objeto también métodos de inmunización y de vacunación de las especies blanco mencionadas anteriormente . Esos métodos comprenden la administración de una cantidad eficaz de una composición inmunogénica o de una vacuna según la invención. Esa administración puede hacerse especialmente por la' vía parenteral, por ejemplo por administración subcutánea, intradérmica, intramuscular o por la vía oral y/o nasal. Pueden realizarse una o más administraciones, especialmente dos. Las diferentes vacunas pueden ser inyectadas por medio de un inyector de chorro de líquido sin aguja. Para los plásmidos se pueden utilizar también partículas recubiertas de plásmido y proyectadas de modo que penetren en las células de la piel del sujeto a inmunizar (Tang et al., Nature 1992. 356.152-154) . Las composiciones inmunogénicas y las vacunas según ' la invención comprenden una cantidad eficaz de vector de expresión o de polipéptido. En el caso de las composiciones inmunogénicas o de las vacunas a base de plásmido, una dosis comprende de manera general de aproximadamente 10 fig a aproximadamente 2000 µg, especialmente de aproximadamente 50 µg a aproximadamente 1000 µg. Los volúmenes de la dosis pueden estar comprendidos entre 0.1 y 2 mi, de preferencia entre 0.2 y 1 mi. Esas dosis y volúmenes de dosis están bien adaptadas para la vacunación de equinos y mamíferos. Para la vacunación de especies aviarias, una dosis está más particularmente comprendida entre aproximadamente 10 µg y aproximadamente 500 µg, y preferiblemente entre aproximadamente 50 µ y aproximadamente 200 Los volúmenes de dosis pueden estar más particularmente comprendidos entre 0.1 y 1 mi , de preferencia entre 0.2 y 0.5 mi . El experto en la técnica posee la pericia necesaria para optimizar la dosis eficaz de plásmido a utilizar para cada protocolo de inmunización o de vacunación y para definir la mejor vía de administración. En el caso de composiciones inmunogénicas o de vacunas a base de virus de la viruela o poxvirus, una dosis está comprendida de manera general entre aproximadamente 102 ufp y aproximadamente 109 ufp. Para las especies equinas y los mamíferos, cuando el · vector es el virus de la viruela, la dosis está más particularmente comprendida entre aproximadamente 104 ufp y aproximadamente 109 ufp, de preferencia entre aproximadamente 106 y aproximadamente 108 ufp; cuando el vector es el virus de la viruela del canario, la dosis está más particularmente comprendida entre aproximadamente 105 ufp y aproximadamente 109 ufp, de preferencia entre aproximadamente 105'5 o 106 y aproximadamente 108 ufp. Para las especies aviarias, cuando el vector es el virus de la viruela del canario, la dosis está más particularmente comprendida entre 103 ufp y aproximadamente 107 ufp, de preferencia de aproximadamente 104 y aproximadamente 106 ufp; cuando el vector es el virus de la .viruela de las aves de corral, la dosis está particularmente comprendida entre aproximadamente 102 ufp y aproximadamente 105 ufp, de preferencia entre aproximadamente 103 y aproximadamente 105 ufp. En ' el caso de composiciones inmunogénicas o de vacunas a base de un vector viral diferente al virus de la viruela o poxvirus, especialmente el virus del herpes, una dosis está, de manera general, comprendida entre aproximadamente 103 ufp y aproximadamente 108 ufp. En el caso de composiciones inmunogénicas o de vacunas aviarias una dosis está, de manera general, comprendida entre aproximadamente 103 ufp, y aproximadamente 106 ufp. En el caso de composiciones inmunogénicas o vacunas equinas una dosis está, de manera general, comprendida entre aproximadamente 106 ufp y aproximadamente 108 ufp. Los volúmenes de dosis de las composiciones inmunogénicas y las vacunas equinas a base de vectores virales están en general comprendidos entre 0.5 y 2.0 mi, de preferencia entre 1.0 y 2.0 mi, preferiblemente de 1.0 mi. Los volúmenes de las dosis de las composiciones inmunogénicas y vacunas aviarias a base de vectores virales están en general comprendidos entre 0.1 y 1.0 mi, de preferencia entre 0.1 y 0.5 mi, preferiblemente entre 0.2 y 0.3 mi. El experto en la técnica posee también para ese tipo de vacuna la pericia necesaria para utilizar el número de administraciones, la vía de administración y las dosis a utilizar para cada protocolo de inmunización. En particular se preveen dos administraciones en el caballo, por ejemplo a un intervalo de 35 horas. En el caso de composiciones inmunogénicas o de vacunas de subunidades, una dosis comprende de manera general de aproximadamente 10 µg a aproximadamente 2000 µg, especialmente de aproximadamente 50 µ9 a aproximadamente 1000 µg. Los volúmenes de las dosis de las composiciones inmunogénicas y las vacunas equinas a base de vectores virales están en general comprendidos de 1.0 y 2.0 mi, de preferencia entre 0.5 y 2.0 mi, preferiblemente de 1.0 mi. Los volúmenes de las dosis de las composiciones inmunogénicas y de las vacunas aviarias a base de vectores virales están en general comprendidos entre 0.1 y 1.0 mi, de preferencia entre 0.1 y 0.5 mi, preferiblemente entre 0.2 y 0.3 mi. El experto en la técnica posee también para este tipo de vacuna la pericia necesaria para optimizar el número de administraciones, la vía de administración y las dosis a utilizar para cada protocolo de inmunización. La invención se relaciona también con el uso de un vector de expresión in vivo o de una preparación de vectores o de polipéptidos según la. invención para la preparación de una composición inmunogénica o una vacuna destinada a proteger las especies blanco contra el virus W y eventualmente contra al menos otro agente patógeno. Las diferentes características enunciadas en el resto de la descripción se aplican a esos otros objetos de la invención. Una vacuna a base de un plásmido o una vacuna viral que expresa una o más proteínas del virus WN o una vacuna de subunidad de WN según la presente invención, no inducirá en el animal vacunado la protección de anticuerpos contra otras proteínas de virus que no sean las representadas en la composición inmunogénica o vacuna. Esa característica puede ser usada para el desarrollo de métodos de diagnóstico diferencial que permitan hacer la distinción entre los animales infectados por el virus patógeno WN y los animales vacunados con la ayuda de vacunas según la invención. Los últimos, las proteínas y/o anticuerpos dirigidos contra ellos están presentes y pueden ser detectados por una reacción antigenico-anticuerpo . Eso no pasa en el caso en donde los animales vacunados de acuerdo a la invención ' resultan negativos. Para realizar esa discriminación, se utiliza una proteína que no está representada en la vacuna (no presente o no expresada), por ejemplo la proteína C o la proteína NS1, NS2A, NS2B o NS3 , las que no están presentes en la vacuna. La presente invención tiene por objeto el uso de factores, preparaciones y polipéptidos según la invención para la preparación de composiciones inmunogénicas y vacunas que permitan discriminar entre animales vacunados y animales infectados .

Ella tiene también por obj eto un método de inmuni zación y de vacunación asociado con un método de diagnóstico que permite esa discriminación . La proteína seleccionada para el diagnóstico de uno de esos fragmentos o epitopos es usada como antígeno en la prueba de diagnóstico , y/o es usada para producir anticuerpos policlonales o monoclonales . El experto en la materia dispone de los conocimientos y la práctica para producir esos anticuerpos y puede trabajar los antígenos y/o anticuerpos con las técnicas de diagnóstico clásicas, por ej emplo pruebas de ELISA . La invención va a ser ahora descrita con más detalle con la ayuda de los modos de reali zación proporcionados a título de ej emplos no limitantes . E j emplos : Se realizaron utilizando las técnicas estándar de biología molecular ( clonación, digestión por enzimas de restricción , síntesis de un ADN complementario de una sola hebra, amplificación en cadena por medio de la polimerasa, alargamiento de un oligonucleótido por una ADN polimerasa . . . ) descritas por Sambrook J. et al . (Molecular Cloning: A Laboratory Manual . 2da Edición. Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor. New York. 1989 ) . Todos los fragmentos de restricción utilizados por la presente invención, así como los diferentes fragmentos de amplificación en cadena por medio de la polimerasa (= ACP o PCR) , fueron aislados y purificados utilizando el equipo "Geneclean®" (BIO101 Inc. La Jolla, CA) Ejemplo 1: Cultivo del virus de la fiebre del Nilo Para su .amplificación, el virus de la fiebre del Nilo NY99 (Lanciotti R. S. et al., Science, 1999, 286, 2333-7) fue cultivado sobre células VERO (células renales de mono, accesibles de la American Type Culture Collection (ATCC) bajo el número CCL-81) . Las células VERO fueron puestas en cultivo en Falcon de 25 cm2 con medio de Eagle-MEM suplementado con 1% de extracto de levadura y 10% de suero de ternero con un contenido de aproximadamente 100 000 células por mi. Las células fueron cultivadas a +37°C, bajo una atmósfera de 5% de C02. 3 horas después cada capa celular alcanzó la confluencia. El medio de cultivo fue entonces reemplazado por medio de Eagle-MEM suplementado con 1% de extracto de levadura y 0.1% de albúmina de suero bovino y el virus de la fiebre del Nilo se añadió al razón de 5 ufp/célula. Cuando se completó el efecto citopatógeno (CPE) (generalmente 48-72 horas después de iniciar el cultivo) , las suspensiones virales son recolectadas, a continuación clarificadas por centrifugación y congeladas a -70°C. Generalmente son necesarios de 3 a 4 pasajes sucesivos para la producción de un lote viral. El lote viral es almacenado a -70°C. Ejemplo 2: Extracción del ARN viral de virus de la fiebre del Nilo El ARN viral contenido en 100 mi de suspensión viral de la cepa de virus, de la fiebre del Nilo NY99 fue extraído después de descongelación con las soluciones del equipo <<High Puré™ Viral RA Kit» Cat# 1 858 882, Roche Molecular Biochemicals) , de acuerdo a las instrucciones del fabricante para las etapas de extracción. El residuo de AR obtenido al final de la extracción fue resuspendido con 1 a 2 mi de agua destilada estéril sin RNasa. Ejemplo 3: Construcción del plásmido pFClOl El ADN complementario (ADNc) del virus de la fiebre del Nilo NY99 fue sintetizado con el equipo << Gene Amp RNA PCR Kit >> (Cat# N 808 0017, Perkin-Elmer, Norwalk, CT 06859, USA) y utilizado en las condiciones proporcionadas por el fabricante . Se realizó una reacción de transcripción inversa, seguida por una reacción de amplificación en cadena (Reacción << TI-ACP » o << RT-PCR >>) con 50 µ? de la suspensión de ARN viral del virus de la fiebre del Nilo NY99 (ejemplo 2) y con los siguientes oligonucleótidos : FC101 (30 mero) (SEQ ID NO: 1) 5 ' TTTTTTGAATTCGTTACCCTCTCTAACTTC 3' y FC102(33 mero) (SEQ ID NO: 2) 5 ' TTTTTTCTAGATTACCTCCGACTGCGTCTTGA 3 ' . Ese par de oligonucleótidos permiten la incorporación de un sitio de restricción EcoRI y un sitio de restricción Xbal en un codón de alto en 3' del inserto.

La síntesis de la primera hebra de ADNc puede efectuarse mediante el alargamiento del oligonucleótido FC102, seguido por la hibridación de este último a la matriz de AR . Las condiciones de síntesis de la primera hebra de ADNc a una temperatura . de 42°C durante 15 min, a continuación de 99°C durante 5 minutos, y finalmente de 4°C durante 5 min. Las condiciones de la reacción ACP en presencia del par de oligonucleótidos FC101 y FC102 a una temperatura de 95°C durante 2 minutos, después a 35 ciclos (95°C durante 1 min, a continuación 62 °C durante 1 min, y 72 °C durante 2 min) , y finalmente 72°C durante 7 min para producir un fragmento de 302 pb. Ese fragmento es digerido por EcoRI, a continuación por Xbal para su aislamiento, a continuación sometido a electroforesis en gel de agarosa, el fragmento Eco I-Xbal de aproximadamente 290 pb. Ese fragmento es llamado fragmento A. El plásmido de expresión eucariótico pVR1020 (C. J. Luke et al. J. of Infectious Diseases. 1997. 175. 95-97), derivado del plásmido pVR1012 (Figura 1 y ejemplo 7 de la W0-A-98/03199; Hartikka J. et al., 1997, Human Gene Therapy, 7, 1205-1217) , contiene la fase que codifica para la secuencia señal del activador del plasminógeno tisular humano (tPA) . Un plásmido pVR1020 modificado por digestión con BamHI-BglII en la inserción de una secuencia que contiene más sitios de clonación (BamHI, Notl, EcoRi, Xbal, Pmll, PstI, BglII) dio como resultado el apareamiento de los siguientes oligonucleótidos : PB326 (40 mero) (SEQ ID NO: 3) 5' GATCTGCAGCACGTGTCTAGAGGATATCGAATTCGCGGCC 3' y PB329 (40 mero) (SEQ ID NO: 4) 5 ' GATCCGCGGCCGCGAATTCGATATCCTCTAGACACGTGCT 3 ' . El vector así obtenido, con una extensión de aproximadamente 5105 pares de base (o pb) , fue nombrado como pABUO. El fragmento A fue digerido con el plásmido de expresión pABUO previamente digerido por Xbal y EcoRI, por obtener el plásmido pFClOl (5376 pb) . Ese plásmidos contiene, bajo el control del promotor procedente del citomegalovirus humano o hCMV-IE (Citomegalovirus humano Inmediato Inicial) , un inserto que codifica con al secuencia señal del activador de tPA seguido de la secuencia que codifica para la proteína prM. Ejemplo 4: Construcción del plásmido pFC102 El ADN complementario (ADNc) del virus de la fiebre del Nilo NY99 fue sintetizado con el equipo << Gene Amp RNA PCR Kit » (Cat# N 808 0017, Perkin-Elmer, Norwalk, CT 06859, USA) y utilizando las condiciones proporcionadas por el fabricante. Se realizó una reacción de transcripción inversa, seguida de una reacción de amplificación en cadena (Reacción « TI-ACP >> o << RT-PCR >>) con 50 µ? de la suspensión de ARN viral del virus de la fiebre del Nilo NY99 (ej emplo 2 ) y con los siguientes oligonucleótidos : FC103 (30 mero) (SEQ ID NO : 5 ) 5 ' TTTTTTGAATTCTCACTGACAGTGCAGACA 3 ' y FC104 (33 mero) (SEQ ID NO : 6 ) 5 ' TTTTTTTCTAGATTAGCTGTAAGCTGGGGCCAC 3 ' . Ese par de oligonucleótidos permite la incorporación de un sitio de restricción de EcoRI y un sitio de restricción Xbal y de un codón de alto en 3 ' del inserto . La síntesis de la primera hebra de ADNc se efectuó mediante el alargamiento del - oligonucleótido FC104 , después de la hibridación del último a la matriz de ARN . Las condiciones de síntesis de la primera hebra de ADN fue a una temperatura de 42 °C durante 15 minutos , a continuación de 99 ° C durante 5 min, y finalmente de 4 °C durante 5 min. Las condiciones de reacción ACP en presencia del par de oligonucleótidos FC103 y FC104 fueron a una temperatura de 95°C durante 2 min, a continuación 35 ciclos (95°C durante 1 min, a continuación 62 °C durante 1 min, y 72 °C durante 2 min) , y finalmente 72 °C durante 7 min para producir un fragmento de 252 pb. El fragmento fue digerido por EcoRI , después por Xbal para su aislamiento , después sometido a electroforesis en gel de agarosa, el fragmento de EcoRI -Xbal de aproximadamente 240 pb. Ese fragmento fue ligado con el plásmido de expresión pABUO (ej emplo 3 ) previamente digerido por Xbal y EcoRI, para obtener el plásmido pFC102 (5326pb) . Ese plásmido contiene, bajo el control del promotor precoz de citomegalovirus humano o HC V-IE (Citomegalovirus humano Inmediato Inicial) , un inserto que codifica para la secuencia señal del activador de tPA seguido por la secuencia que codifica para la proteína M. Ejemplo 5: Construcción del plásmido pFC103 El ADN complementario (ADNc) del virus de la fiebre del Nilo NY99 fue sintetizado con el equipo « Gene Amp RNA POR Kit » (Cat# N 808 0017, Perkin-Elmer, Noralk, CT 06859, USA) y utilizando las condiciones proporcionadas por el fabricante. Se realizó una reacción de transcripción inversa, seguida de una reacción de amplificación en cadena (Reacción « TI-ACP >> o << RT-PCR >>) con 50 µ? de la suspensión de ARN viral del virus de la fiebre del Nilo NY99 (ejemplo 2) y con los siguientes oligonucleótidos: FC105 (30 mero) (SEQ ID NO: 7) 5' TTTTTTGAATTCTTCAACTGCCTTGGAATG 3' y FC106 (33 mero) (SEQ ID NO: 8) 5' TTTTTTTCTAGATTAAGCGTGCACGTTCACGGA 3 ' . Ese par de oligonucleótidos permite la incorporación de un sitio de restricción de EcoRI y un sitio de restricción Xbal y de un codón de alto en 3' del inserto. La síntesis de la primera hebra de ADNc se efectuó mediante el alargamiento del oligonucleótido FC106, después de la hibridación del último a la matriz de ARN. Las condiciones de síntesis de la primera hebra de ADN fue a una temperatura de 42 °C durante 15 minutos, a continuación de 99°C durante 5 min, y finalmente de 4°C durante 5 min. Las condiciones de reacción ACP en presencia del par de oligonucleótidos FC105 y FC106 fueron a una temperatura de 95°C durante 2 min, a continuación 35 ciclos (95°C durante 1 min, a continuación 62 °C durante 1 min, y 72 °C durante 2 min) , y finalmente 72 °C durante 7 min para producir un fragmento de 1530 pb. El fragmento fue digerido por EcoRI , después por Xbal para su aislamiento, después sometido a electroforesis en gel de agarosa, el fragmento de EcoRI-Xbal de aproximadamente 1518 pb. Ese fragmento fue ligado con el plásmido de expresión ABUO (ejemplo 3) previamente digerido por Xbal y EcoRI , para obtener el plásmido pFC103 (6604pb) . Ese plásmido contiene, bajo el control del promotor precoz de citomegalovirus humano o hCMV-IE (Citomegalovirus humano Inmediato Inicial) , un inserto que codifica para la secuencia señal del activador de tPA seguido por la secuencia que codifica para la proteína E. Ejemplo 6: Construcción del plásmido pFC104 El ADN complementario (ADNc) del virus de la fiebre del Nilo NY99 fue sintetizado con el equipo << Gene Amp RNA PCR Kit >> (Cat# N 808 0017, Perkin-Elmer, Norwalk, CT 06859, USA.) y utilizando las condiciones proporcionadas por el fabricante. Se realizó una reacción de transcripción inversa, seguida de una reacción de amplificación en cadena (Reacción << TI-ACP >> o << RT-PCR >>) con 50 µ? de la suspensión de ARM viral del virus de la fiebre del Nilo NY99 (ejemplo 2) y con los siguientes oligonucleótidos : FC101 (30 mero) (SEQ ID NO: 1) y FC106 (33 mero) (SEQ ID NO: 8) Ese par de oligonucleótidos permite la incorporación de un sitio de restricción de EcoRV y un sitio de restricción Xbal y de un codón de alto en 3' del inserto. La síntesis de la primera hebra de ADNc se efectuó mediante el alargamiento del oligonucleótido FC106, después de la hibridación del último a la matriz de ARN. Las condiciones de síntesis de la primera hebra de ADN fue a una temperatura de 42°C durante 15 minutos, a continuación de 99°C durante 5 min, y finalmente de 4°C durante 5 min. Las condiciones de reacción ACP en presencia del par de oligonucleótidos FC101 y FC106 fueron a una temperatura de 95°C durante 2 min, a continuación 35 ciclos (95°C durante 1 min, a continuación 62°C durante 1 min, y 72°C durante 2 min), y finalmente 72°C durante 7 min para producir un fragmento de 2031 pb. El fragmento fue digerido por EcoRI, después por Xbal para su aislamiento, después sometido a electroforesis en gel de agarosa, el fragmento de EcoRI-Xbal de aproximadamente 2019 pb. Ese fragmento fue ligado con el plásmido de expresión ABUO (ejemplo 3) previamente digerido por Xbal y EcoRI, para obtener el plásmido pFC104 (7105 pb) . Ese plásmido contiene, bajo el control del promotor precoz de citomegalovirus humano o hCMV-IE (Citomegalovirus humano Inmediato Inicial).., un inserto que codifica para la secuencia señal del activador de tPA seguido por la secuencia que codifica para la proteína prM-M-E. Ejemplo 7: Construcción del plásmido pFC105 El ADN complementario (ADNc) del virus de la fiebre del Nilo Y99 fue sintetizado con el equipo << Gene Amp RNA PCR Kit » (Cat# N 808 0017, Perkin-Elmer, Norwalk, CT 06859, USA) y utilizando las condiciones proporcionadas por el fabricante. Se . realizó una reacción de transcripción inversa, seguida de una reacción de amplificación en cadena (Reacción << TI-ACP >> o << RT-PCR ») con 50 µ? de la suspensión de ARN viral del virus de la fiebre del Nilo NY99 (ejemplo 2) y con los siguientes oligonucleótidos : FC107 (36 mero) (SEQ ID NG: 9) 5' TTTTTTGATATCACCGGAATTGCAGTCATGATTGGC 3' y FC106 (33 mero) (SEQ ID NO: 8) Ese par de oligonucleótidos permite la incorporación de un sitio de restricción de EcoRI y un sitio de restricción Xbal y de un codón de alto en 3' del inserto.

La síntesis de la primera hebra de ADNc se efectuó mediante el alargamiento del oligonucleótido FC106, después de la hibridación del último a la matriz de ARN. Las condiciones de síntesis de la primera hebra de ADNc fue a una temperatura de 2°C durante 15 minutos, a continuación de 99°C durante 5 min, y finalmente de 4°C durante 5 min. Las condiciones de reacción ACP en presencia del par de oligonucleótidos FC106 y FC107 fueron a una temperatura de 95°C durante 2 min, a continuación 35 ciclos (95°C durante 1 min, a continuación 62°C durante 1 min, y 72°C durante 2 min) , y finalmente 72°C durante 7 min para producir un fragmento de 2076 pb. El fragmento fue digerido por EcoRV, después por Xbal para su aislamiento, después sometido a electroforesis en gel de agarosa, el fragmento de EcoRV-Xbal de aproximadamente 2058 pb . Ese fragmento fue ligado con el plásmido de expresión pVR1012, previamente digerido por Xbal y EcoRV, para obtener el plásmido pFC105 (6953 pb) . Ese plásmido contiene, bajo el control del promotor precoz de citomegalovirus humano o HCMV-IE (Citomegalovirus humano Inmediato Inicial) , un inserto que codifica para poliproteína prM-M-E. Ejemplo 8: Construcción del plásmido pFClOS El ADN complementario (ADNc) del virus de la fiebre del Nilo NY99 fue sintetizado con el equipo « Gene Amp RNA PCR Kit >> (Cat# N 808 0017, Perkin-Elmer, Norwalk, CT 06859, USA) y utilizando las condiciones proporcionadas por el fabricante . Se realizó una reacción de transcripción inversa, seguida de una reacción de amplificación en cadena (Reacción « TI-ACP >> o << RT-PCR >>) con 50 µ? de la suspensión de ARN viral del virus de la fiebre del Nilo Y99 (ejemplo 2) y con los siguientes oligonucleótidos : FC108 (36 mero) (SEQ ID NO: 10) 5' TTTTTTGATATCATGTATAATGCTGATATGATTGAC 3' y FC109 (36 mero) (SEQ ID NO: 11) 5 ' TTTTTTTCTAGATTAACGTTTTCCCGAGGCGAAGTC 3 ' . Ese par de oligonucleótidos permite la incorporación de un sitio de restricción de EcoRV y un sitio de restricción Xbal y de un codón de alto en 3' del inserto. La síntesis de la primera hebra de ADNc se efectuó mediante el alargamiento del oligonucleótido FC109, después de la hibridación del último a la matriz de ARN. Las condiciones de síntesis de la primera hebra de ADNc fue a una temperatura de 42°C durante 15 minutos, a continuación de 99°C durante 5 min, y finalmente de 4°C durante 5 min. Las condiciones de reacción ACP en presencia del par de oligonucleótidos FC108 y FC109 fueron a una temperatura de 95°C durante 2 min, a continuación 35 ciclos (95°C durante 1 min, a continuación 62°C durante 1 min, y 72°C durante 2 min) , y finalmente 72°C durante 7 min para producir un fragmento de 2973 pb. El fragmento fue 'digerido por EcoRV, después por Xbal para su aislamiento, después sometido a electroforesis en gel de agarosa, - el fragmento de EcoRV-Xbal de aproximadamente 2955 pb. Ese fragmento fue ligado con el plásmido de expresión pVR1012, previamente digerido por Xbal y EcoV, para obtener el plásmido pFC106 (7850 pb) . Ese plásmido contiene, bajo el control del promotor precoz de citomegalovirus humano o hCMV-IE (Citomegalovirus humano Inmediato Inicial) , un inserto que codifica para poliproteína NS2A-NS2B-NS3. Ej emplo 9 : Construcción del plásmido donador para la inserción en el sitio C5 del virus de la viruela de los canarios ALVAC. La figura 16 de la patente US-A-5 , 756 , 103 muestra la secuencia de un fragmento de 3199 pb del ADN genotipico del virus de la viruela de los canarios. El análisis de esa secuencia reveló un cuadro abierto de lectura (COL) que es llamado C5L, que comienza en la posición 1538 y termina en la posición 1859. La construcción de un plásmido de inserción para llevar a la supresión del COL C5L y es un reemplazo por un sitio de clonación múltiple blanqueado por una señal de fin de la transcripción y la traducción a ser realizada como se describió anteriormente.

Una reacción ACP realizada a partir de la matriz constituida por el ADN genómico del virus de la viruela de los canarios y con los siguientes oligonucleotidos: C5A1 (42 mero) (SEQ ID NO: 12) : 5 ' ATCATCGAGCTCCAGCTGTAATTCATGGTCGAAAAGAAGTGC3 ' y C5B1 (73 mero) (SEQ ID NO: 13) : 5 ' GAATTCCTCGAGCTGCAGCCCGGGTTTTTATAGCTAATTAGTCAT TTTTTGAGAGTACCACTTCAGCTACCTC3 ' para aislar un fragmento ACP de 223 pb (fragmento B) . Una reacción ACP a ser realizada a partir de la matriz constituida por el ADN genómico del virus de la viruela de los canarios con los siguientes oligonucleotidos: C5C1 (72 mero) (SEQ ID NO: 14) 5 ' CCCGGGCTGCAGCTCGAGGAATTCTTTTTATTGATTAACTAGTCA TTATAAAGATCTAAAATGCATAATTTC3 ' y C5D1 (45 mero) (SEQ ID NO: 15) : 5 ' GATGATGGTACCGTAAACAAATATAATGAAAAGTATTCTAAACTA para el aislamiento de un fragmento ACP de 482 pb (fragmento C) . Los fragmentos B y C son híbridos conjuntados para servir de matriz a una reacción ACP realizada con los oligonucleotidos C5A1 (SEQ ID NO: 12) y C5D1 (SEQ ID NO: 15) para generar un fragmento ACP de 681 pb. Ese fragmentos digerido por las enzimas de restricción SacI y pnl, para su aislamiento, después de la electroforesis en gel de agarosa, de un fragmento Sacl-Kpnl de 664 pb. Ese fragmento a ser ligado con el vector pBlueScript® II Sk+ (Stratagene . La Jolla, Ca, EUA, Cat#212205) , previamente digerido por las enzimas de restricción SacI y Kpnl, para dar el plásmido pC5L. La secuencia de ese plásmido será verificada por secuenciamiento . Ese plásmido que contiene 166 pb de las secuencias se sitúa corriente arriba del Col C5L (<<brazo flanqueante izquierdo C5>>) , una señal de viruela de finalización precoz de la transcripción, los codones de alto en las 6 fases de lectura, un sitio de clonación múltiple que contiene los sitios de restricción Smal , PstI, Xhol y EcoRI, y finalmente 425 pb de secuencias situados rio abajo del Col C5L (<<brazo flanqueante derecho C5>>) . El plásmido p P528HRH (Perkus M. et al. J. Virol . 1989. 63. 3829-3836) se utilizará como matriz para amplificar la secuencia completa del promotor de la viruela H6 (I\T° de acceso del GenBank M28351) con los siguientes oligonucleótidos : JCA291 (34 mero) (SEQ ID NO: 16) 5 ' AACCCGGGTTCTTTATTCTATACTTAAAAAGTG3 ' y JCA292 (43 mero) (SEQ ID NO: 17) 5 'AAAAGAATTCGTCGACTACGATACAAACTTAACGGATATCGCTG 3 ' para amplificar un fragmento ACP de 149 pb. Ese fragmento será digerido por las enzimas de restricción Smal y EcoRI para el aislamiento, después de la electroforesis en gel de agarosa, de un fragmento de restricción Smal-EcoRI .de 138 pb. Ese fragmento será entonces ligado con el plásmido pC5L, previamente digerido por Smal y EcoRI, para dar el plásmido pFC107. Ejemplo 10: Construcción del virus recombinado VCP1712. Se realizará una reacción ACP utilizando el plásmido pFC105 (ejemplo 7) como matriz y los siguientes oligonucleótidos : FC110 (33 mero) (SEQ ID NO: 18) : 5 ' TTTTCGCGAACCGGAATTGCAGTCATGATTGGC3 ' y FC111 (39 mero) (SEQ ID NO: 19) : 5 ' TTTTGTCGACGCGGCCGCTTAAGCGTGCACGTTCACGGA3 ' para amplificar un fragmento ACP de aproximadamente 2079 pb. Ese fragmento será digerido por las enzimas de restricción NruI y Salí para aislar, después de la electroforesis en gel de agarosa, de un fragmento de restricción NruI-Salí de aproximadamente 2068 pb. Ese fragmento será ligado con el plásmido pFC107 (Ejemplo 9 previamente digerido por las enzimas de restricción NruI y Salí para dar el plásmido pFC108. El plásmido pFC108 es linearizado por Notl, a continuación transfectado en la células primarias de embriones de pollos infectados con el virus de la viruela de los canarios (cepa ALVAC) según la técnica de precipitación con fosfato de calcio previamente descrito (Panicalli y Paoletti Proc. Nat . Acad. Sci . 1982. 79. 4927-4931; Piccini et al. In Methods in Enzymology. 1987. 153. 545-563. Eds . Wu R. y Grossman L. Academic Press) . Las zonas positivas son seleccionadas sobre la base de hibridación con una sonda de radiomarcaje específica de la secuencia nucleotídica de la glicoproteína de la envoltura E. Esas zonas experimentan 4 ciclos sucesivos de selección/purificación de zonas hasta que se aisla una población pura. Una zona representativa de recombinación in vitro entre el plásmido donador pFC108 y el genoma del virus de la viruela de los canarios ALVAC, es entonces amplificada y el patrón del virus recombinado obtenido es designado como VCP1712. Ejemplo 11: Construcción del virus recombinado VCP1713 El plásmido pFC104 (ejemplo 6) es digerido por las enzimas de restricción Salí y Pmll para aislar, después de la electroforesis en gel de agarosa, un fragmento de restricción Pmll-Sall de aproximadamente 2213 pb. Ese fragmento es ligado con el plásmido pFC107 (ejemplo 9) previamente digerido por las enzimas de restricción NruI y Salí para dar el plásmido pFC109. El plásmido pFC109 es linealizado por Notl, a continuación transfectado en células primarias de embriones de pollos infectados con el virus de la viruela de los canarios (cepa ALVAC) según la técnica del ejemplo 10. Una zona representativa de la recombinación in vitro entre el plásmido donador pFC109 y el genoma del virus de la viruela de los canarios ALVAC es seleccionada sobre la base de una hibridación con una sonda marcada radioactivamente específica de la secuencia nucleotídica de la glicoproteína de la envoltura E y es entonces amplificada. La reserva del virus recombinado obtenido es designado como vCP1713. Ejemplo 12: Construcción del virus recombinante VCP171 . El plásmido pFC103 (ejemplo 5) es digerido por las enzimas de restricción Salí y Pmll para aislar, después de la electroforesis en gel de agarosa, un fragmento de restricción Pmll-Salí de aproximadamente 1712 pb. Ese fragmento es ligado con el plásmido pFC107 (ejemplo 9) previamente digerido por las enzimas de restricción NruI y Salí para dar el plásmido pFCllO. El plásmido pFCllO es linealizado por Notl, a continuación transfectado en células primarias de embriones de pollos infectados con el virus de la viruela de los canarios (cepa ALVAC) según la técnica del ejemplo 10. Una zona representativa de la recombinación in vitro entre el plásmido donador pFCllO y el genoma del virus de la viruela de los canarios ALVAC es seleccionada sobre la base de una hibridación con una sonda marcada radioactivamente específica de la secuencia nucleotídica de la glicoproteína de la envoltura E y es entonces amplificada. La reserva del virus recombinado obtenido es designado como VCP1714. Ejemplo 13: Construcción del virus recombinante VCP1715 El plásmido pFC102 (ejemplo 4) es digerido por las enzimas de restricción Salí y Pmll para aislar, después de la electroforesis en gel de agarosa, un fragmento de restricción Pmll-Sall de aproximadamente 434 pb. Ese fragmento es ligado con el plásmido pFC107 (ejemplo 9) previamente digerido por las enzimas de restricción NruI y Salí para dar el plásmido pFClll. El plásmido pFClll es linealizado por Notl, a continuación transfectado en células primarias de embriones de pollos infectados con el virus de la viruela de los canarios (cepa ALVAC) según la técnica del ejemplo 10. Una zona representativa de la recombinación in vitro entre el plásmido donador pFClll y el genoma del virus de la viruela de los canarios ALVAC es seleccionada sobre la base de una hibridación con una sonda marcada radioactivamente específica de la secuencia nucleotídica de la glicoproteína de la envoltura M y es entonces amplificada. La reserva del virus recombinado obtenido es designado como VCP1715. Ejemplo 14: Construcciones del virus recombinante VCP1716 El plásmido pFClOl (ejemplo 3) es digerido por las enzimas de restricción Salí y Pmll para aislar, después de la electroforesis en gel de agarosa, un fragmento de restricción Pmll-Sall de aproximadamente 484 pb. Ese fragmento es ligado con el plásmido pFC107 (eemplo 9) previamente digerido por las enzimas de restricción NruI y Salí para dar el plásmido pFC112-. El plásmido pFC112 es linealizado por Motl, a continuación transfectado en células primarias de embriones de pollos infectados con el virus de la viruela de los canarios (cepa ALVAC) según la técnica del ejemplo 10. Una zona representativa de la recombinación in vitro entre el plásmido donador pFC112 y el genoma del virus de la viruela de los canarios ALVAC es seleccionada sobre la base de una hibridación con una sonda marcada radioactivamente específica de la secuencia nucleotídica de la glicoproteína de premembrana prM y es entonces amplificada. La reserva del virus recombinado obtenido es designado como VCP1716. Ejemplo 15: Construcción de un plásmido donador para la inserción en el sitio C6 del virus de la viruela de los canarios ALVAC La figura 4 de la patente WO-A-01/05934 muestra la secuencia de un fragmento de 3700 pb de ADN genómico del virus de la viruela de los canarios. El análisis de esa secuencia reveló un cuadro abierto de lectura (COL) que es el llamado C6L, que comienza en la posición 377 y termina en la posición 2254. La construcción de un plásmido de inserción da como resultado la supresión del COL C6L y un reemplazo por un sitio de clonación múltiple flanqueado por la señal de la finalización de la transcripción y la traducción se realiza como se describió anteriormente. Se realizó una reacción ACP a partir de la matriz constituida por el ADN genómico del virus de la viruela de los canarios y con los siguientes oligonucleotidos: C6A1 (42 mero) (SEQ ID NO: 20) : 5 'ATCATCGAGCTCGCGGCCGCCTATCAAAAGTCTTAATGAGTT3 ' y C6B1 (73 mero) (SEQ ID NO: 21) : 5 ' GAATTCCTCGAGCTGCAGCCCGGGTTTTTATAGCTAATTAGTCAT TTTTTCGTAAGTAAGTATTTTTATTTAA3 ' para aislar un fragmento ACP de 432 pb (fragmento D) . Se realizó una reacción ACP a partir de la matriz constituida por el ADN genómico del virus de la viruela de los canarios y con los siguientes oligonucleotidos: C6C1 (72 mero) (SEQ ID NO: 22) 5 ' CCCGGGCTGCAGCTCGAGGAATTCTTTTTATTGATTAACTAGTCA AATGAGTATATATAATTGAAAAAGTAA3 ' y C6D1 (45 mero) (SEQ ID NO: 23) : 5 ' GATGATGGTACCTTCATAAATACAAGTTTGATTAAACTTAAGTTG 3' para aislar un fragmento ACP de 1210 pb (fragmento E) . Los fragmentos D y E son hibridados en conjunto para servir de matriz a una reacción ACP realizada con los oligonucleotidos C6A1 (SEQ ID NO: 20) y C6D1 (SEQ ID NO: 23) para generar un fragmento ACP de 1630 pb. Ese fragmento es digerido por las enzimas de restricción SacI y Kpnl , para aislar, después de la electroforesis en gel de agarosa, un fragmento SacI-Kpnl de 1613 pb. Ese fragmento es ligado con el vector pBlueScnpt ® II SK+ (Stratagene, La Jolla, CA, E ..U.A, Cat#212205) , previamente digerido por las enzimas de restricción SacI y Kpnl para dar el plásmido pC6L. La secuencia de ese plásmido es verificada por secuenciamiento. El plásmido contiene 370 pb de la secuencia situados corriente arriba del COL C6L («brazo flanqueante izquierdo C6») , una señal de la viruela que detiene precozmente la transcripción, los codones de alto en las 6 fases de lectura, un sitio de clonación múltiple que contiene los sitios de restricción Smal, PstI, Xhol y EcoRI, y finalmente 1156 pb de las secuencias situados corriente abajo del COL C6L (<<brazo flanqueante derecho C6>>) . El plásmido pMPIVC (Schmitt J.F.C. et al., J. Virol., 1988, 62, 1889-1897; Saiki R. K. et al., Science, 1988, 239, 487-491) es utilizado como matriz para amplificar la secuencia completa del promotor de la viruela 13L con los siguientes oligonucleótidos : FC112 (33 mero) (SEQ ID NO: 24) : 5'AAACCCGGGCGGTGGTTTGCGATTCCGAAATCT3 ' y FC113 (43 mero) (SEQ ID NO: 25) : 5 ' AAAAGAATTCGGATCCGATTAAACCTAAATAATTGTACTTTGT3 ' para amplificar un fragmento ACP de 151 pb. Ese fragmento es digerido por las enzimas de restricción Smal y EcoRI para aislar, después de la electroforesis en gel de agarosa, un fragmento de restricción Smal-EcoRI de aproximadamente 136 pb. Ese fragmento es entonces ligado con el plásmido pC6L, previamente digerido por Smal y EcoRI, para donar el plásmido pFC113. Ejemplo 16: Construcción de los virus recombinantes VCP1717 y VCP1718 Se realiza una reacción ACP utilizando el plásmido pFC106 (ejemplo 8) como matriz y los siguientes oligonucleótidos : FC114 (33 mero) (SEQ ID NO: 26) : 5' TTTCACGTGATGTATAATGCTGATATGATTTGAC 3' y FC115 (42 mero) (SEQ ID NO: 27) : 5 ' TTTTGGATCCGCGGCCGCTTAACGTTTTCCCGAGGCGAAGTC 3 ' para amplificar un fragmento ACP de aproximadamente 2973 pb. Ese fragmento es digerido con las enzimas de restricción Pmll y BamHI para aislar, después de la electroforesis en gel de agarosa, el fragmento de restricción Pmll-BamHI de aproximadamente 2958 pb (fragmento F) . El plásmido pFC113 (ejemplo 15) es digerido por las enzimas de restricción Pmll y BamHI para aislar, después de la electroforesis en gel de agarosa, el fragmento de restricción PmlI-BamHI de aproximadamente 4500 pb (fragmento G) . Los fragmentos F y G son entonces ligados en conjunto para dar el plásmido pFCH4.

El plásmido pFC114 es linearizado por Notl, a continuación -transfectado en células primarias de embriones de pollo infectadas con el virus de la viruela de los canarios VCP1713 (ejemplo 11) según la técnica de precipitación con fosfato de calcio previamente descrita (Panicali et Paoletti Proc . "Nat. Acad. Sci. 1982. 79. 4927-4931; Piccini et al. In" Methods in Enzymology. 1987, 153. 545-563. Eds. u R. and Grossman L. Academic Press) . Las zonas positivas son seleccionadas sobre la base de una hibridación con una sonda marcada radiactivamente específica de la secuencia nucleotídica de la glicoproteina de la envoltura E. Esas zonas son sometidas a 4 ciclos sucesivos de selección/purificación de zonas hasta que se aisle una población pura. Una zona representativa de la recombinación in vitro entre el plásmido donador pCF114 y el genoma del virus de la viruela de los canarios ALVAC es entonces amplificada y la reserva de virus recombinados obtenidos es designada como vCP1717. El plásmido pFC114 linearizado por Notl igualmente sirve para transfectarse a células primarias de embriones de pollos infectados con el virus de la viruela de los canarios VCP1712 (ejemplo 10) según la técnica descrita más arriba. La reserva de virus recombinada así obtenida se designó como VCP1718. Ejemplo 17: Construcción del plásmido pFC115 El ADN complementario (ADNc) del virus de la fiebre del Nilo NY99' es sintetizado Con el equipo << Gene Amp RNA PCR Kit >> (Cat# N 808 0017, Perkin-Elmer, Norwalk, CT 06859, USA) y utilizando las condiciones proporcionadas por el fabricante. Se realiza una reacción de transcripción inversa, seguida de una reacción de amplificación en cadena (Reacción << TI-ACP >> o << RT-PCR >>) con 50 µ? de la suspensión de AR viral del virus de la fiebre del Nilo Y99 (ejemplo 2) y con los siguientes oligonucleótidos : FC116 (39 mero) (SEQ ID NO: 28) 5' TTTTTTGATATCATGACCGGAATTGCAGTCATGATTGGC 3' y FC106 (33 mero) (SEQ ID NO: 8) . Ese par de oligonucleótidos permiten la incorporación de un sitio sin restricciones EcoRV y de un sitio de restricción Xbal, de un codón iniciador en 5' y de un codón de alto en 3' del inserto. La síntesis de la primera hebra de ADNc se hace alargando el oligonucleótido FC106, tras la hibridación del último a la matriz de ARN. Las condiciones de la síntesis de la primera hebra de ADN son una temperatura de 42 °C durante 15 min, a continuación de 99°C durante 5 min, y finalmente de 4°C durante 5 min. Las condiciones de la reacción ACP en presencia del par de oligonucleótidos FC106 y FC116 son una temperatura de 95°C durante 2 min, a continuación 35 ciclos (95°C durante 1 min, a continuación 62°C durante 1 min, y 72°C durante 2 min) , y finalmente 72°C durante 7 min para producir un fragmento de 2079 pb. Ese fragmento es digerido por EcoRV y después por Xbal para aislar, después de la electroforesis en gel de agarosa, el fragmento EcoRV-Xbal de aproximadamente 206.1 pb. Ese fragmento es ligado con el plásmido de expresión pVR1012, previamente digerido por Xbal y EcoRV, para dar el plásmido pFC115 (6956 pb) . Ese plásmido contiene, bajo el control del promotor precoz del citomegalovirus humano o hCMV-IE (Citomegalovirus humano Inmediato Inicial) , un inserto que codifica para la poliproteína prM-M-E. Ejemplo 18: Construcción del virus recombinante VCP2017 Se realiza una reacción ACP utilizando el plásmido pFC115 (ejemplo 17) como matriz y los siguientes oligonucleótidos : FC117 (36 mero) (SEQ ID NO: 29) 5' TTTTCGCGAATGACCGGAATTGCAGTCATGATTGGC 3' y FC111 (39 mero) (SEQ ID NO: 19) . para amplificar un fragmento ACP de aproximadamente 2082 pb. Ese fragmento es digerido con las enzimas de restricción NruI y Salí para aislar, después de la electroforesis en gel de agarosa, el fragmento de restricción NruI y Salí de aproximadamente 2071 pb. Ese fragmento es ligado con el plásmido pFC107 (ejemplo 9) previamente digerido por las enzimas de restricción en NruI y Salí para dar el plásmido pFC116. El plásmido pFC116 es linearizado por Notl, a continuación transfectado en células primarias de embriones de pollos infectados con el virus de la viruela de los canarios (fuente ALVAC) según la técnica del ejemplo 10. Una zona representativa de la recombinación in vivo entre el plásmido donador pFC116 y el genoma del virus de la viruela de los canarios ALVAC es seleccionada sobre la base de una hibridación con una sonda marcada radiactivamente específica de la secuencia nucleotídica de la glicoproteína de la envoltura E y es a continuación amplificada. La reserva de un recombinado obtenido es designado como VCP2017. Ejemplo 19: Producción de vacunas recombinantes Para la preparación de vacunas equinas, el virus recombinante de la viruela de los canarios VCP1712 (ejemplo 10) es puesto en soluciones de carbómero, a saber Carbopol" 974P fabricado por BF Goodrich, Ohio, USA (peso molecular de aproximadamente 3 000 000) . Inicialmente se prepara una solución patrón de 1.5% de Carbopol" 974P en agua destilada con un contenido de 1 g/1 de cloruro de sodio. Esa solución patrón es entonces utilizada para la elaboración de una solución de 4 mg/ml de Carbopol"11 974P en agua fisiológica. La solución patrón es mezclada con un volumen adecuado de agua fisiológica, es decir en una etapa única o en una pluralidad de etapas sucesivas, el valor del pH es ajustado en cada etapa con una solución de hidróxido de sodio 1N (o más concentrados) a fin de obtener un valor final de pH de 7.3-7.4. La solución de Carbopol" 974P lista para ser empleada como se obtiene es usada para reconstituir los virus recombinados liofilizados para diluir soluciones patrón concentradas de virus recombinados . Por ejemplo, para obtener una suspensión viral que contiene 108 ufp por dosis de 1 mi, se diluye una solución viral patrón de manera que se obtenga un título de 108'3 ufp/ml, después de diluir a partes iguales con dicha solución de Carbopol1*1974P lista para emplear a 4 mg/ml. Esas vacunas recombinantes pueden igualmente ser producidas con virus recombinantes de la viruela del canario VCP1713 (ejemplo 11) o VCP1717 (ejemplo 16) o vCP 1718 (ejemplo 16) o vCP 2017 (ejemplo 18) o una mezcla de tres virus de la viruela de los canarios vCP 1714 (ejemplo 12) , VCP1715 (ejemplo 13) y VCP1716 (ejemplo 14) según la técnica descrita más arriba. Ejemplo 20: Prevención de vacunas de ADN para los equinos. Una solución de ADN que contiene el plásmido pFC104 (ejemplo 6) es concentrada por precipitación etanólica como se describe en Sambrook et al (1989) . El residuo de ADN es repuesto por una solución de NaCl al 0.9% de forma que se obtenga una concentración de 1 mg/ml. Preparar una solución de DMRIE-DOPE a 0.75 mM para reconstituir un liofilizado de DMRIE-DOPE para un volumen aceptado de ¾0 estéril . La formación de complejos de ADN plasmídico-lípido es realizada por dilución a partes iguales de la solución a 0.75 mM de DMRIE-DOPE (1:1) para la solución de ADN a 1 mg/ml en NaCl a 0.9%. La solución de ADN es introducida progresivamente con la ayuda de una aguja estéril 26G a lo largo de la pared de un frasco que contiene la solución de lípido catiónico para evitar la formación de espuma. Con un procedimiento de agitación suave las dos soluciones son mezcladas. Se obtiene una composición final que comprende 0.375 mM de DMRIE-DOPE y 500µg/ml de plásmido. Es deseable que para dos soluciones en conjunto sean utilizadas a temperatura ambiente para efectuar las operaciones descritas anteriormente. Tras la complejación del ADN/DMRIE-DOPE se deja reposar a temperatura ambiente durante 30 minutos antes de proceder a la inmunización de los animales. Las vacunas de ADN pueden igualmente ser producidas con soluciones de ADN que contengan los plásmidos pFC104 (ejemplo 6) y pFC106 (ejemplo 8) , o que contengan los plásmidos pFC105 (ejemplo 7) y pFC106, los plásmidos pFC115 (ejemplo 17) y pFC106, o que contengan los plásmidos pFClOl, pFC102 y pFC103 (ejemplos 3 a 5) , o que contengan el plásmido pFC105 o pFC115 según la técnica descrita en el presente ejemplo.

Ejemplo 21: Pruebas de expresión in vitro La expresión de las proteínas WN es probada por cada construcción por los métodos clásicos de inmunofluorescencia indirecta y electroinmunotransferencia Western. Esas pruebas son efectuadas sobre placas de 96 pozos que contienen las células CHO cultivadas en monocapas y transfectadas por plásmidos o que contiene las células CEF cultivadas en monocapas e infectadas por virus recombinantes . Las proteínas WN son detectadas mediante la utilización de sueros de caballos o pollos infectados y antisueros marcados. El tamaño de los fragmentos obtenidos tras la migración sobre gel de agarosa es comparado con las células consideradas. Ejemplo 22: Eficacia sobre los animales. Las vacunas recombinantes y las vacunas plasmídicas son inyectadas dos veces a un intervalo de aproximadamente 2 semanas a pollos EOPS, con edades de aproximadamente 7 días, sin vacunar, por vía intramuscular bajo un volumen de aproximadamente 0.1 mi . Es incorporado al estudio un grupo testigo sin vacunar. Los pollos son probados por la administración subcutánea por el cuello de 103"4 TCID50 de virus WN patógeno. Por una parte se observa la viremia, la respuesta de anticuerpos así como la mortalidad. Se practicaron autopsias para observar las lesiones.

Ejemplo 23: Titulación de anticuerpos neutralizantes anti-WNV Se realizaron series de dilución por cada suero a una razón de 3 en medio de D EM adicionado con 10% de suero de ternera fetal en placas de 96 pozos del tipo de cultivo celular. Se añaden 0.05 mi de suero diluido a 0.05 mi de medio de cultivo con un contenido aproximado de 100 DICC50/ml de WNV. Esa mezcla es incubada durante 2 horas a 37°C en una estufa con una atmósfera con un contenido de 5% de C02. Se agregan a continuación 0.15 mi de una suspensión de células VERO con un contenido de aproximadamente 100 000 células por mi cada mezcla. El efecto citopático (ECP) es observado por microscopía de contraste de fase después de 4-5 horas de cultivo a 37°C en una atmósfera con un contenido de 5% de C02. Los títulos neutralizantes de cada suero son calculados siguiendo el método de Kárber. Los títulos son dados bajo la forma de la dilusión más importante que inhibe el efecto citopático para el 50% de los pozos. Los títulos son expresados en loglO VN50. Cada suero es titulado al menos dos veces, de preferencia cuatro veces. Ejemplo 24: Ensayo sobre caballos de VCP2017. Son inyectadas vacunas recombinantes que contienen vCP2017 (ejemplo 18) formuladas extemporáneamente con 1 mi de adyuvante de carbopol® 974P (4 mg/ml) son inyectadas dos veces a intervalos de 35 horas a caballos, con edades de más de tres meses, sin vacunar, por vía intramuscular bajo un volumen de aproximadamente 1 mi . Son vacunados tres grupos de animales, con dosis de 105"8 DICC50 (es decir io5-64 ufp) para el grupo 1, 106·8 DICC5o (es decir 106-84 ufp) para el grupo 2 y ??7·8 DICC50 (es decir 107-64 ufp) para el grupo 3. Es incorporado en el estudio un grupo testigo sin vacunar. La se observa la serologia, los títulos de anticuerpo neutralizantes establecidos son expresados en loglO VN50 como se indica en el ejemplo 23.' Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el convencional para la manufactura de los objetos a que la misma se refiere.

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Una vacuna para proteger a equinos , caninos , felinos, bovinos, porcinos, aves, contra el virus WN, caracterizada porque comprende uno o más virus recombinantes de la viruela aviaria, NYVAC o MVA, y que expresa las proteínas prM, M y E del virus WN, los virus recombinantes comprenden uno o más polinucleótidos que codifican para una o más proteínas prM, M y E, y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. 2. La vacuna de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque comprende un virus recombinante de viruela aviaria que expresa las tres proteínas prM, M y E. 3. La vacuna de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque comprende un virus recombinante de viruela aviaria que comprende un polinucleótido que forma una fase de lectura codificada por prM-M-E. . La vacuna de conformidad con la reivindicación 1, 2 ó 3, caracterizada porque el virus recombinante es de la viruela de los canarios . 5. La vacuna de conformidad con la reivindicación 1 , 2 ó 3, caracterizada porque el virus recombinante es el de las aves domésticas. 6. La vacuna de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizada porque el polinucleótido codifica también para un péptido señal. 7. La vacuna de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque se trata de un péptido señal del virus WN. 8. La vacuna.de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque se trata de un péptido señal heterólogo. 9. La vacuna de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque se trata de un péptido señal del activador tisular del plasminógeno humano. 10. La vacuna de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizada porque comprende otro polinucleótido que codifica para una proteína de otra cepa de virus WN y/o de otro agente patógeno y/o para una citocina. 11. La vacuna de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizada porque comprende otro vector de expresión que comprende otro polinucleótido que codifica para una proteína de la fuente de virus WN y/o otro agente patógeno y/o para una citocina. 12. La vacuna de confo-miidad con o-ialquiera de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizada porque conprende otro adyuvante. 13. La vacuna de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada porque el adyuvante es elegido de entre (1) polímeros de ácido acrílico y metacrílico y polímeros de anhídrido maleico y derivados de alquenilo, (2) secuencias inmunoestimuladoras, (3) una emulsión aceite en agua, (4) lípidos catiónicos que contienen una sal de amonio cuaternario, (5) citocinas . 1 . La vacuna de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada porque el adyuvante es un carbómero. 15. La vacuna de conformidad con la reivindicación 10 ó 13, caracterizada porque la citocina es. una citocina equina o una citocina aviaria. 16. La vacuna de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada porque la citocina es elegida de entre la interleucina 18, interleucina 12, interleucina 15, MIP-loc, G -CSF. 17. La vacuna de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada porque la citocina es elegida entre las interleucinas aviarias cIL-18, cIL-15. 18. La vacuna de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada porque la citocina es GM-CSF equina. 19. La vacuna de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, caracterizada porque forma una' vacuna multivalente, caracterizada porque comprende un componente de vacuna contra otro agente patógeno. 20. La vacuna de conformidad con la reivindicación 19, caracterizada porque el componente contra otro agente patógeno comprende antígenos bajo la forma de subunidades, bajo la forma de un agente inactivo o bajo la forma de un agente atenuado. 21. La vacuna de conformidad con la reivindicación 19 ó 20, caracterizada porgue comprende un componente de vacuna contra el virus de la rhinoneumonía equina, contra el virus de la gripe equina, contra el virus de la encefalitis Oriental, contra el virus de la Encefalitis Occidental, contra el virus de la Encefalitis Venezolana, contra Clostridium tetani, y sus mezclas. 22. La vacuna de conformidad con la reivindicación 19 ó 20, caracterizada porque comprende un componente de vacuna contra el virus de la enfermedad de Marek, contra el virus de la enfermedad de Newcastle, contra el virus de la enfermedad de Gumboro, contra el virus de la bronquitis infecciosa, contra el virus de la anemia infecciosa, contra el virus de la laringotraqueitis infecciosa, contra el virus de la encefalomielitis , contra el virus de la enteritis hemorrágica, contra el virus de la neumonía viral, contra el virus de la peste aviaria, contra el virus de la hidropericarditis de los pollos, contra reovirus aviarios, contra Escherichia coli, contra Mycoplasma gallinarum, contra Mycoplasma gallisepticum, contra Haemophilus avium, contra Pasteurella gallinaru , contra Pasteurella ultocida gallicida, y sus mezclas.