PL210306B1 - Kompozycja szczepionkowa do indukcji zabezpieczającej odpowiedzi immunologicznej przed wirusem zachodniego Nilu (WNV) - Google Patents

Kompozycja szczepionkowa do indukcji zabezpieczającej odpowiedzi immunologicznej przed wirusem zachodniego Nilu (WNV)

Info

Publication number
PL210306B1
PL210306B1 PL391444A PL39144402A PL210306B1 PL 210306 B1 PL210306 B1 PL 210306B1 PL 391444 A PL391444 A PL 391444A PL 39144402 A PL39144402 A PL 39144402A PL 210306 B1 PL210306 B1 PL 210306B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
virus
wnv
prm
vaccine composition
plasmid
Prior art date
Application number
PL391444A
Other languages
English (en)
Inventor
Sheena May Loosmore
Jean-Christophe Francis Audonnet
Original Assignee
Merial Sas
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Merial Sas filed Critical Merial Sas
Publication of PL210306B1 publication Critical patent/PL210306B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5256—Virus expressing foreign proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
    • A61K2039/552—Veterinary vaccine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55522—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55555—Liposomes; Vesicles, e.g. nanoparticles; Spheres, e.g. nanospheres; Polymers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/24011—Poxviridae
    • C12N2710/24041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/24043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/24011—Flaviviridae
    • C12N2770/24111—Flavivirus, e.g. yellow fever virus, dengue, JEV
    • C12N2770/24122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/24011—Flaviviridae
    • C12N2770/24111—Flavivirus, e.g. yellow fever virus, dengue, JEV
    • C12N2770/24134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/24011—Flaviviridae
    • C12N2770/24111—Flavivirus, e.g. yellow fever virus, dengue, JEV
    • C12N2770/24171—Demonstrated in vivo effect

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Description

Przedmiotem niniejszego wynalazku jest kompozycja szczepionkowa do indukcji zabezpieczającej odpowiedzi immunologicznej przed wirusem zachodniego Nilu (WNV) jak również wektory do ekspresji in vivo i in vitro, obejmujące i wyrażające, co najmniej jeden polinukleotyd wirusa gorączki Nilu, oraz immunogenne kompozycje i szczepionki przeciw gorączce Nilu. Opisane są również sposoby immunizacji oraz szczepionka przeciwko temu wirusowi.
Wirus gorączki zachodniego Nilu (West Nile Virus lub WNV lub WN) został zidentyfikowany u czł owieka po raz pierwszy w 1937 roku w Ugandzie w prowincji West Nile (H.G. Zeller, Med. Trop., 1999, 59, 490-494).
Szeroko rozpowszechniony w Afryce, spotykany również w Indiach, Pakistanie i basenie śródziemnomorskim, został po raz pierwszy zidentyfikowany w U.S.A. w mieście Nowy Jork w 1999 (J.F. Anderson i wsp., Science, 1999, 286, 2331-2333).
Wirus gorączki zachodniego Nilu zakaża zarówno ptaki, jak i ssaki oraz człowieka.
U ptaków choroba charakteryzuje się zaję ciem centralnego ukł adu nerwowego i ś miercią . Uszkodzenia obejmują zapalenia mózgu, krwotoki w mięśniu sercowym oraz krwotoki i martwice w przewodzie pokarmowym.
U kurcząt, zakaż enia doświadczalne, przez podskórne wszczepienia wirusa gorączki zachodniego Nilu izolowanego od wron, powodowały martwice mięśnia sercowego, zapalenia nerek oraz zapalenia płuc 5 do 10 dni po wszczepieniu, umiarkowane do ciężkich zapalenia mózgu 21 dni po wszczepieniu (D.A. Senne i wsp., Avian Disease, 2000, 44, 642-649).
Wirus gorączki zachodniego Nilu zakaża również konie, szczególnie w Afryce Północnej i Europie (C. Cantile i wsp., Equine Vet. J., 2000, 32(1), 31-35). Konie te wykazują objawy ataksji, osłabienia kończyn tylnych, niedowładu postępującego do tetraplegii i śmierci. Konie i wielbłądy są głównymi zwierzętami, które manifestują objawy kliniczne w postaci zapaleń mózgu.
Przeciwciała anty-WNV wykryto u pewnych gryzoni, u inwentarza, szczególnie u bydła i owiec, u zwierzą t domowych, szczególnie psów (H.G. Zeller, Med. Trop., 1999, 59, 490-494; J.O. Lundstrom, Journal of Vector Ecology, 1999, 24(1), 1-39).
Wirus gorączki zachodniego Nilu nie oszczędza nawet gatunku ludzkiego, powodując liczne symptomy (B.A. Sampson, Human Pathology, 2000, 31(5), 527-531; C.M. Marra, Seminars in Neurology, 2000, 20(3), 323-327).
Wirus gorączki zachodniego Nilu jest przenoszony na ptaki i ssaki przez ukąszenia pewnych komarów (na przykład Culex, Aedes, Anopheles) i kleszczy.
Dzikie i udomowione ptaki są, dla wirusa gorączki zachodniego Nilu, rezerwuarem i wektorem propagacji przez ich migracje.
Wiriony wirusa gorączki zachodniego Nilu są sferycznymi cząstkami o średnicy 50 nm, zbudowanymi z lipoproteinowej otoczki otaczającej dwudziestościenny nukleokapsyd, zawierający pojedynczy jednoniciowy RNA o pozytywnej polarności.
Jedyna otwarta ramka odczytu koduje wszystkie wirusowe białka pod postacią poliproteiny. Rozpad i dojrzewanie tej poliproteiny prowadzi do wytworzenia dziesiątek różnych białek wirusowych. Białka strukturalne są kodowane przez część 5' genomu i odpowiadają nukleokapsydowi zwanemu C (14 kDa), glikoproteinie otoczki zwanej E (50 kDa), białku przedbłonowemu zwanemu prM (23 kDa), białku błonowemu zwanemu M (7 kDa). Białka niestrukturalne są kodowane przez część 3' genomu i odpowiadają biał kom NS1 (40 kDa), NS2A (19 kDa), NS2B (14 kDa), NS3 (74 kDa), NS4A (15 kDa), NS4B (29 kDa), NS5 (97 kDa).
C.R. Parrish i wsp. (J. Gen. Virol., 1991, 72, 1645-1653), A.B. Kulkami i wsp. (J. Virol., 1992, 66(6), 3583-3592) oraz A.B. Hill i wsp. (J. Gen. Virol., 1992, 73, 1115-1123) skonstruowali, na podstawie wirusa krowianki, wektory ekspresji in vivo, zawierające zmienne inserty odpowiadające sekwencjom nukleotydowym, kodującym niestrukturalne białka wirusa Kunjin, ewentualnie związane z biał kami strukturalnymi. Wektory te był y podawane myszy w celu wytworzenia komórkowej odpowiedzi immunologicznej. Twórcy podkreślają znaczenie odpowiedzi komórkowej, która jest przede wszystkim stymulowana przez białka niestrukturalne, a w szczególności przez NS3, NS4A i NS4B. W artykuł ach tych podkreś lono trudność w dostarczeniu dobrej strategii szczepienia przeciw gorą czce zachodniego Nilu.
Do dnia dzisiejszego nie ma szczepionki do zapobiegania zakażeniu przez wirus WN.
PL 210 306 B1
Przedmiotem niniejszego wynalazku jest kompozycja szczepionkowa do indukcji zabezpieczającej odpowiedzi immunologicznej przed wirusem zachodniego Nilu (WNV) u zwierząt podatnych na WNV, która obejmuje wektor zawierający rekombinowany wirus lub plazmid DNA, który koduje i wyraża in vivo u zwierzęcia WNV E; WNV prM i E; WNV M i E; WNV prM, WNV M i E, poliproteinę prM-E z WNV, poliproteinę M-E z WNV, lub poliproteinę prM-M-E WNV, przy czym gdy wirus jest wirusem ospy ptaków wyrażane białko jest inne niż poliproteina prM-M-E z WNV.
Korzystnie rekombinowany wirus jest rekombinowanym adenowirusem, herpeswirusem lub pokswirusem, korzystniej rekombinowany wirus jest rekombinowanym wirusem ospy, jeszcze korzystniej rekombinowany wirus ospy jest rekombinowanym wirusem ospy ptaków, najkorzystniej rekombinowany wirus ospy ptaków jest rekombinowanym wirusem ospy kanarków lub wirusem ospy drobiu, bardziej korzystnie wirusem ospy kanarków jest ALVAC, a wirusem ospy drobiu jest TROVAC.
W korzystnej kompozycji szczepionkowej cząsteczka kwasu nukleinowego obejmuje ramkę odczytu kodująca poliproteinę prM-M-E.
Równie korzystnie cząsteczka kwasu nukleinowego obejmuje nukleotydy 466-741, 742-966 i 967-2469 z GenBank AF196825 (SEKW ID NR: 66) kodują ce odpowiednio WNV prM, M i E.
Ponadto korzystne jest, gdy cząsteczka kwasu nukleinowego obejmuje nukleotydy 466-2469 z GenBank AF196835 (SEKW ID NR: 66) kodują ce biał ko prM-M-E z WNV.
Równie korzystnie cząsteczka kwasu nukleinowego obejmuje nukleotydy 421-2469 z GenBank AF196835 (SEKW ID NR: 66) kodujące białko prM-M-E z WNV oraz peptyd sygnalny z prM.
Kompozycja szczepionkowa ponadto korzystnie obejmuje adiuwant, korzystniej adiuwantem jest karbomer.
Kompozycja szczepionkowa korzystnie ponadto obejmuje antygen lub immunogen lub epitop z patogenu zwierzęcia inny niż WNV lub wektor, który zawiera i wyraż a in vivo czą steczkę kwasu nukleinowego kodującą antygen, immunogen lub epitop patogenu lub inaktywowany lub atenuowany patogen zwierzęcia inny niż WNV.
Zwierzęciem jest korzystnie kot lub koń.
Kompozycja szczepionkowa korzystnie obejmuje wektor obejmujący rekombinowany wirus lub plazmidowy DNA, który koduje i wyraża in vivo w zwierzęciu poliproteinę prM-M-E z WNV.
Wynalazek dotyczy również zastosowania kompozycji szczepionkowej według wynalazku do wytwarzania szczepionki do indukcji zabezpieczającej odpowiedzi immunologicznej przed wirusem zachodniego Nilu (WNV) u zwierząt podatnych na WNV, przy czym korzystnie zwierzęciem jest kot lub koń.
Wynalazek dotyczy również środków do zapobiegania i/lub zwalczania chorób wywoływanych wirusem WN.
Innym przedmiotem wynalazku jest przedstawienie takiego środka, który mógłby być stosowany u różnych gatunków zwierzą t, podatnych na chorobę wywoływaną przez tego wirusa, w szczególności u koni i ptaków.
Jeszcze innym przedmiotem niniejszego wynalazku jest przedstawienie sposobów immunizacji i szczepienia docelowych gatunków.
Innym przedmiotem wynalazku jest przedstawienie takich środków i sposobów, pozwalających na zapewnienie diagnostyki różnicowej.
Również głównym przedmiotem wynalazku są wektory ekspresji in vitro i/lub in vivo, obejmujące polinukleotyd kodujący białko otoczki E wirusa WN. Wektory te obejmują w dodatku elementy niezbędne do ekspresji polinukleotydu w komórce gospodarza.
Oprócz polinukleotydu kodującego białko E, wektory ekspresji według wynalazku mogą obejmować jeden lub więcej innych polinukletydów, kodujących inne białka wirusa WN, korzystnie białka strukturalne wirusa WN, korzystnie sekwencje te są wybrane spośród takich, które kodują białko przedbłonowe prM i białko błonowe M.
Korzystnie wektor obejmuje polinukleotyd tworzący jedną ramkę odczytu, kodującą odpowiednio np. prM-E, M-E, a szczególniej prM-M-E. Wektor obejmujący liczne oddzielne polinukleotydy kodujące różne białka (np. prM i/lub M i E) wchodzi również w zakres niniejszego wynalazku. Wektor, w szczególnoś ci in vivo, moż e również obejmować polinukleotydy odpowiadające wię cej niż jednemu szczepowi wirusa WN, w szczególności dwa lub więcej polinukleotydy kodujące E lub prM-M-E różnych szczepów. Jak będzie przedstawione dalej, wektor, w szczególności in vivo, może również obejmować sekwencję lub sekwencje nukleotydowe, kodujące immunogeny innych czynników patogennych i/lub cytokiny.
PL 210 306 B1
Według korzystnej postaci wykonania wynalazku wektor ekspresji obejmuje polinukleotyd kodujący prM-M-E i to korzystnie w jednej fazie (ramce) odczytu.
Za polinukleotyd kodujący białko wirusa WN uważa się w szczególności fragment DNA, który koduje to białko, lub nić komplementarną do tego fragmentu DNA. RNA nie jest wykluczony.
W znaczeniu wynalazku termin białko obejmuje fragmenty złożone z peptydów i polipeptydów. Jak sama nazwa wskazuje, fragment białka jest immunologicznie aktywny w tym znaczeniu, że podany raz gospodarzowi jest zdolny uruchomić odpowiedź immunologiczną typu humoralnego i/lub komórkowego, skierowaną przeciwko białku. Korzystnie fragment białka jest takim fragmentem, który posiada, w głównych zarysach, taką samą aktywność immunologiczną, jak całe białko. Fragment białka według wynalazku obejmuje więc co najmniej jeden epitop lub determinantę posiadającą właściwości antygenowe. Termin epitop odnosi się do miejsca w cząsteczce białka zdolnego do wzbudzania reakcji immunologicznej typu humoralnego (komórki B) i/lub typu komórkowego (komórki T).
Strukturą minimalną polinukleotydu jest więc ta, która koduje epitop lub determinantę antygenową pożądanego białka. Polinukleotyd kodujący fragment całego białka obejmuje w szczególności minimum 21 nukleotydów, w szczególności, co najmniej 42 nukleotydy i korzystnie co najmniej 57, 87 lub 150 następujących po sobie nukleotydów sekwencji z której pochodzi. Metody określania epitopów są dobrze znane specjalistom w dziedzinie, w szczególności można wykorzystywać banki zachodzących na siebie peptydów (B. Hemmer i wsp., Immunology Today, 1998, 19(4), 163-168), Pepscan (H.M. Geysen i wsp., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1984, 81(13), 3998-4002; H.M. Geysen i wsp., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1985, 82(1), 178-182; R. Van der Zee i wsp., Eur. J. Immunol., 1989, 19(1), 43-47; H.M. Geysen, Southeast Asian J. Trop. Med. Public Health, 1990, 21(4), 523-533; Multipin® Peptide Synthesis Kits de Chiron), algorytmy (A. De Groot i wsp., Nature Biotechnology, 1999, 17, 533-561).
W szczególności polinukleotydy według wynalazku obejmują sekwencje nukleotydową kodując ą jedną lub dwie domeny przezbłonowe, korzystnie dwie, usytuowane w części C końcowej białka E. Dla szczepu NY99 WNV domeny te odpowiadają sekwencjom aminokwasowym 742 do 766 i 770 do 791 sekwencji z GenBanku AF196835.
Obecne są elementy konieczne do ekspresji polinukleotydu lub polinukleotydów. Zależy to, co najmniej od kodonu inicjatorowego (ATG), kodonu stop i promotora, jak również sekwencji poliadenylacji dla plazmidów i wektorów wirusowych innych niż pokswirusów. W chwili, gdy polinukleotyd koduje fragment poliproteiny, na przykład prM-E, M-E, prM-M-E ATG jest umieszczony na końcu 5' fazy odczytu, a kodon stop jest umieszczony na końcu 3'. Jak będzie wyjaśnione dalej, inne elementy, pozwalające na kontrolę ekspresji, takie jak sekwencje wzmacniające (po angielsku „enhancer), sekwencje wyciszające, sekwencje sygnałowe, pozwalające na wydzielanie białka mogą być również obecne.
Przedmiotem niniejszego wynalazku są również preparaty, zawierające takie wektory ekspresji. Szczególniej wynalazek dotyczy preparatów obejmujących jeden lub kilka wektorów ekspresji in vivo, obejmujących i wyrażających jeden lub kilka polinukleotydów jak powyżej, w tym ten kodujący białko E, w dopuszczalnej farmaceutycznie zaróbce lub podłożu.
Według pierwszego sposobu wykonania wynalazku inny wektor lub wektory w preparacie obejmują i wyrażają jedno lub kilka innych białek wirusa WN, np. prM, M, prM-M.
Według innego sposobu wykonania inny wektor lub wektory w preparacie obejmują i wyrażają jedno lub kilka białek jednego lub kilku innych szczepów wirusa WN. Szczególnie preparat obejmuje co najmniej dwa wektory wyrażające, w szczególności in vivo, polinukleotydy różnych szczepów WN, kodujące te same białka i/lub różne białka, korzystnie takie same białka. W zależności od preferencji wektory wyrażają in vivo E lub prM-M-E dwóch, trzech lub więcej różnych szczepów WN. Wynalazek dotyczy również mieszanin wektorów wyrażających prM, M, E, prM-M, prM-E lub M-E różnych szczepów.
Według jeszcze innego sposobu wykonania i jak będzie można się z tym zapoznać bardziej szczegółowo dalej, inny wektor lub wektory w preparacie obejmują i wyrażają jedną lub kilka cytokin i/lub jeden lub kilka immunogenów jednego lub kilku innych patogennych czynników.
Wynalazek dotyczy również różnorodnych kombinacji tych różnych sposobów wykonania.
Preparaty obejmujące wektor ekspresji, in vitro lub in vivo, obejmujący i wyrażający polinukleotyd kodujący prM-M-E, stanowią korzystną postać wykonania wynalazku.
PL 210 306 B1
Według szczególnej postaci wykonania wynalazku, wektory ekspresji, in vivo lub in vitro, obejmują, jako sam(e) polinukleotyd(y) wirusa WN, polinukleotyd kodujący białko E, ewentualnie połączone z prM i/lub M, korzystnie kodujący prM-M-E i ewentualnie sekwencję sygnałową wirusa WN.
Według szczególnej postaci wykonania jedno lub kilka niestrukturalnych białek NS2A, NS2B i NS3 jest wyraż onych wspólnie ze strukturalnymi biał kami wedł ug wynalazku, to jest przez ten sam wektor ekspresji, bądź przez własny wektor ekspresji. Korzystnie są one wyrażone wspólnie z pojedynczego polinukleotydu.
Przedmiotem wynalazku jest więc również wektor ekspresji, in vivo lub in vitro, obejmujący polinukleotyd kodujący NS2A, NS2B, NS3, ich kombinacje, a korzystnie NS2A-NS2B-NS3. Zasadniczo wektorem tym może być jeden z opisanych powyżej wektorów, obejmujący polinukleotyd kodujący białko lub białka strukturalne, szczególnie E lub prM-M-E. W jednym wariancie wynalazek dotyczy preparatu, takiego jak opisany powyżej, zawierającego ponadto, co najmniej jeden z tych wektorów wyrażających białko niestrukturalne, oraz ewentualnie dopuszczalną farmaceutycznie zaróbkę lub podłoże.
W celu wykonania wektorów ekspresji według wynalazku, specjaliści w dziedzinie dysponują różnymi szczepami wirusa i opisami nukleotydowej sekwencji ich genomu. Szczególnie patrz H.M. Savage i wsp. (Am. J. Trop. Med. Hyg. 1999, 61(4), 600-611), tabela 2, która wymienia 24 szczepy wirusa WN i podaje liczby nadania dla polinukleotydowych sekwencji w GenBanku.
Można na przykład odnieść się do szczepu NY99 (GenBank AF196835). W GenBanku dla każdego białka jest określona odpowiednia sekwencja DNA (nukleotyd 466-741 dla prM, 742-966 dla M, 967-2469 dla E, to jest 466-2469 dla prM-M-E, 3526-4218 dla NS2A, 4219-4611 dla NS2B i 4612-6468 dla NS3, to jest 3526-6468 dla NS2A-NS2B-NS3). Przez porównanie i dopasowanie sekwencji, określenie polinukleotydu, kodującego takie białko w innym szczepie WNV, jest natychmiastowe.
Wskazano wyżej, że przez polinukleotyd rozumie się sekwencję kodującą białko lub fragment lub epitop, przykładowo swoisty dla wirusa WN. Ponadto, równoważnie, termin polinukleotyd włącza również nukleotydowe sekwencje odpowiadające różnym szczepom wirusa WN oraz nukleotydowe sekwencje, które różnią się ze względu na degenerację kodu.
W ramach rodziny wirusów WN identyczność pomię dzy sekwencjami w aminokwasach prM-ME w porównaniu z sekwencją NY99 jest równa lub wyższa od 90%. Wynalazek obejmuje również polinukleotydy kodujące sekwencję aminokwasów, której identyczność z natywną sekwencją aminokwasową jest wyższa lub równa 90%, szczególnie 92%, korzystnie 95%, i jeszcze szczególniej 98%. Będą również uważane za ekwiwalenty fragmenty tych homologicznych polinukleotydów, które są swoiste dla wirusa WN.
Również, jeżeli mówi się o polinukleotydzie wirusa WN, termin ten obejmuje równoważne sekwencje według wynalazku.
Uważa się również, że termin białko obejmuje polipeptydy i aktywne immunologicznie peptydy. Dla potrzeb wynalazku obejmuje to:
(a) białka odpowiadające różnym szczepom wirusa WN;
(b) białka, które się różnią, ale które zachowują z natywnym białkiem WN identyczność wyższą lub równą 90%, szczególnie 92%, korzystnie 95% i jeszcze szczególniej 98%.
Również, w odniesieniu do białka wirusa WN, termin ten obejmuje równoważne białka według wynalazku.
Różne szczepy wirusa WN są dostępne w zbiorach, szczególnie w American Type Culture Collection (ATCC), na przykład pod numerami dostępu VR-82 lub VR-1267. Wirus zwany Kunjin faktycznie jest uważany za wirusa WN.
Zgodnie z wynalazkiem, korzystnie polinukleotyd obejmuje dodatkowo nukleotydową sekwencję kodującą peptyd sygnałowy, umieszczony powyżej wyrażanego białka, żeby zapewnić jego wydzielanie. Może więc chodzić o endogenną sekwencję, to znaczy naturalną sekwencję sygnałową, skoro ona istnieje (pochodzącą od tego samego wirusa lub z innego szczepu). Na przykład dla wirusa WN NY99, endogenna sekwencja sygnałowa dla białka E odpowiada nukleotydom 922 do 966 sekwencji z GenBanku; dla prM chodzi o nukleotydy 421 do 465. Moż e również chodzić o sekwencję nukleotydową kodującą heterogenny peptyd sygnałowy, w szczególności tą, kodującą sygnałowy peptyd aktywatora tkankowego ludzkiego plazminogenu (tPA) (J. Hartikka i wsp., Human Gene Therapy, 1996, 7, 1205-1217). Nukleotydowa sekwencja kodująca peptyd sygnałowy jest wprowadzona w ramce odczytu i powyżej sekwencji kodującej E lub jego kombinacji, np. prM-M-E.
PL 210 306 B1
Zgodnie z pierwszym sposobem wykonania wynalazku, wektorami ekspresji in vivo są wektory wirusowe.
Tymi wektorami ekspresji korzystnie są pokswirusy (wirusy grupy ospy), na przykład wirus krowianki lub atenuowane mutanty wirusa krowianki, np. MVA (szczep Ankara) (H. Sticki i V. Hochstein-Mintzel, Munch. Med. Wschr., 1971, 113, 1149-1153; G. Sutter i wsp., Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A., 1992, 89, 10847-10851; dostępnym na rynku szczepem ATCC VR-1508; MVA otrzymano po ponad 570 pasażach szczepu krowianki Ankara na fibroblastach zarodków kurzych) lub NYVAC (jego budowę opisano w US-A-5 494 807, w szczególności w przykładach 1 do 6; ten opis patentowy przedstawia również wprowadzenie heterogennych genów do miejsc rekombinacji i zastosowanie odpowiednich promotorów; patrz również WO-A-96/40241), wirusy ospy ptaków (w szczególności ospy kanarków, ospy drobiu (ospy kurcząt), ospy gołębi, ospy przepiórek), ospy świń, ospy szopów, ospy wielbłądów, adenowirusy, takie jak adenowirus ptasi, psi, świński, bydlęcy, ludzki i wirusy Herpes, takie jak Herpeswirusy koni (EHV, serotypy 1 i 4), Herpeswirus psów (CHV), Herpeswirus kotów (FHV), Herpeswirusy bydła (BHV serotypy 1 i 4), Herpeswirus świń (PRV), wirusy choroby Mareka (MDV, serotypy 1 i 2), Herpeswirus indyka (HVT lub MDV, serotyp 3), Herpeswirus kaczki. Kiedy jest stosowany Herpeswirus, do szczepienia gatunków ptaków korzystny jest wektor HVT, a do szczepienia koni korzystny jest wektor EHV.
Zgodnie z jednym z korzystnych sposobów według wynalazku, pokswirusowym wektorem ekspresji jest wirus ospy kanarków lub wirus ospy drobiu, te pokswirusy mogą być ewentualnie atenuowane. Można wymienić wirus ospy kanarków, dostępny na rynku w ATCC pod numerem dostępu VR-111. Atenuowane wirusy ospy kanarków opisano w US-A-5756103 i w WO-A-01/05934. Dostępne są liczne szczepionkowe szczepy wirusa ospy kurcząt, na przykład szczepionka DIFTOSEC CT® sprzedawana przez MERIAL i szczepionka NOBILIS® VARIOLE sprzedawana przez Intervet.
Dla pokswirusów specjaliści w dziedzinie mogą powołać się na WO-A-90/12882, a szczególniej dla wirusa krowianki na US-A-4769330; US-A-4722848; US-A-4603112; US-A-5110587; US-A5494807; US-A-5762938; dla wirusa ospy drobiu na US-A-5174993; US-A-5505941; na US-5766599; dla wirusa ospy kanarków do US-A-5756103; dla wirusa ospy świń na US-A-5382425; dla wirusa ospy szopów na WO-A-00/03030.
Kiedy wektorem ekspresji jest wirus krowianki to miejscami insercji polinukleotydu(ów) do wyrażenia są w szczególności gen kinazy tymidynowej (TK), gen hemaglutyniny (HA), region ciała inkluzyjnego typu 2 (ATI). Jeśli chodzi o wirus ospy kanarków, to miejsca insercji są w szczególności umieszczone w, lub utworzone przez, ORF C3, C5 i C6. Jeśli chodzi o wirus ospy drobiu, to miejsca insercji są w szczególności umieszczone w, lub utworzone przez, ORF F7 i F8.
Insercję genów w wirusie MVA opisano w różnych publikacjach, M.W. Carroll i wsp., Vaccine, 1997, 15(4), 387-394; K.J. Stittelaar i wsp., J. Virol., 2000, 74(9), 4236-4243; G. Sutter i wsp., Vaccine, 1994, 12(11), 1032-1040, do których specjaliści w dziedzinie mogą się odwołać. Kompletny genom MVA opisał G. Antoine w Virology, 1998, 244, 365-396, co pozwoli specjalistom w dziedzinie wykorzystywać inne miejsca insercji lub inne promotory.
Korzystnie, jeśli wektorem ekspresji jest pokswirus, wyrażany polinukleotyd jest wprowadzany pod kontrolą swoistego promotora pokswirusa, w szczególności promotora krowianki 7,5 kDa (Cochran i wsp., J. Virology, 1985, 54, 30-35), promotora krowianki I3L (Riviere i wsp., J. Virology, 1992, 66, 3424-3434), promotora krowianki HA (Shida, Virology, 1986, 150, 451-457), promotora krowianki ATI (Funahashi i wsp., J. Gen. Virol., 1988, 69, 35-47), lub promotora krowianki H6 (J. Taylor i wsp., Vaccine, 1988, 6, 504-508; P. Guo i wsp., J. Virol., 1989, 63, 4189-4198; M. Perkus i wsp., J. Virol., 1989, 63, 3829-3836).
Korzystnie do szczepienia ssaków wektorem ekspresji jest wirus ospy kanarków. Korzystnie do szczepienia ptaków, w szczególności kurcząt, kaczek, indyków i gęsi, wektorem ekspresji jest wirus ospy kanarków lub wirus ospy drobiu.
Jeśli wektorem ekspresji jest herpeswirus HVT, odpowiednie miejsca insercji są w szczególności zlokalizowane we fragmencie BamHI I lub we fragmencie BamHI M HVT. Fragment restrykcji BamHI I HVT obejmuje liczne otwarte ramki odczytu (ORF) i trzy regiony międzygenowe oraz obejmuje liczne korzystne strefy insercji, to jest trzy regiony międzygenowe 1, 2 i 3, które są regionami korzystnymi, oraz ORF UL55 (FR-) A-2728795, US-A-5980906). Fragment restrykcyjny BamHI M HVT obejmuje ORF UL43, która jest również korzystnym miejscem insercji (FR-A-2728794, US-A-5733554).
Jeśli wektorem ekspresji jest herpeswirus EHV-1 lub EHV-4, to odpowiednimi miejscami insercji są w szczególności TK, UL43 i UL45 (EP-A-0668355).
PL 210 306 B1
Korzystnie jeśli wektorem ekspresji jest herpeswirus, to wyrażany polinukleotyd jest wprowadzany pod kontrolą silnego promotora eukariotycznego, korzystnie promotora CMV-IE. Te silne promotory są opisane poniżej, w części opisu dotyczącej plazmidów.
Zgodnie z drugim sposobem wykonania wynalazku, wektory ekspresji in vivo są wektorami plazmidowymi, nazywanymi plazmidami.
Termin plazmid obejmuje dowolną jednostkę transkrypcji DNA pod postacią sekwencji polinukleotydowej, obejmującej polinukleotyd według wynalazku i elementy niezbędne do jego ekspresji in vivo. Korzystniejsza jest postać kolista plazmidu, superzwinięta lub nie. Forma liniowa również wchodzi w zakres tego wynalazku.
Każdy plazmid obejmuje promotor zdolny do zapewnienia, w komórkach gospodarzy, ekspresji wprowadzonego polinukleotydu pod jego kontrolą. Zasadniczo będzie to dotyczyć silnych promotorów eukariotycznych. Korzystny silny promotor eukariotyczny jest wczesnym promotorem cytomegalowirusa (CMV-IE), pochodzenia ludzkiego lub mysiego, lub ewentualnie innego pochodzenia, takiego jak szczurze, od świnki morskiej. Promotor CMV-IE może obejmować część wspomnianego właściwego promotora, połączoną lub nie z częścią aktywującą (wzmacniającą). Można odwołać się do EP-A-260148, EP-A-323597, US-A-5168062, US-A-5385839, US-A-4968615, WO-A-87/03905. Korzystny jest ludzki CMV-IE (M. Boshart i wsp., Cell., 1985, 41, 521-530) lub mysi.
Definiując ogólnie promotor jest albo pochodzenia wirusowego, albo pochodzenia komórkowego. Jako silny promotor wirusowy inny niż CMV-IE można wymienić promotor wczesny/późny wirusa SV40 lub promotor LTR wirusa mięsaka Rousa. Jako silny promotor komórkowy można wymienić promotor genu cytoszkieletu, taki jak promotor dezminy (M. Kwissa i wsp., Vaccine, 2000, 18(22), 2337-2344), lub jeszcze promotor aktyny (J. Miyazaki i wsp., Gene, 1989, 79(2), 269-277).
Równoważnie, subfragmenty tych promotorów zachowujące odpowiednią aktywność promotorową są objęte niniejszym wynalazkiem: np. skrócone promotory CMV-IE według WO-A-98/00166. Pojęcie promotora według wynalazku obejmuje więc pochodne i subfragmenty, zachowujące odpowiednią aktywność promotorową, korzystnie ogólnie podobną do tej, jaką posiada wspomniany właściwy promotor, z którego pochodzą. Dla CMV-IE pojęcie to obejmuje wspomnianą część właściwego promotora i/lub część aktywującą oraz pochodne i subfragmenty.
Korzystnie plazmidy obejmują inne elementy kontroli ekspresji. W szczególności korzystne jest wbudowanie sekwencji stabilizujących typu intron, najchętniej intron II genu β-globiny królika (van
Ooyen i wsp., Science, 1979, 206: 337-344).
Jako sygnał poliadenylacji (polyA) dla plazmidów i wirusowych wektorów innych niż pokswirus, można wykorzystywać w szczególności ten z genu bydlęcego hormonu wzrostu (bGH) (US-A-5122458), ten z genu β-globiny królika lub ten z wirusa SV40.
Inne elementy kontroli ekspresji możliwe do zastosowania w plazmidach, mogą również występować w wektorach ekspresji herpeswirusa.
Według innej postaci wykonania wynalazku, wektorami ekspresji są wektory ekspresji stosowane do wyrażenia in vitro białek w odpowiednim układzie komórkowym. Białka, po wydzieleniu lub nie (jeśli nie następuje wydzielenie, przystępuje się do lizy komórkowej), mogą być następnie zebrane na powierzchni hodowli, ewentualnie zatężane klasycznymi technikami zatężania, w szczególności przez ultrafiltrację i/lub oczyszczanie środkami klasycznego oczyszczania, w szczególności technikami chromatografii typu powinowactwa, jonowymiennej lub żelowej.
Efektywne jest wytwarzanie przez transfekcję plazmidami komórek ssaków, przez replikację wektorów wirusowych w komórkach ssaków lub komórkach ptaków, lub przez replikację bakulowirusa (US-A-4745051; J. Vialard i wsp., J. Virol., 1990, 64(1), 37-50; A. Verne, Virology, 1988, 167, 56-71), np. Autographa californica Nuclear Polyhedrosis Virus - wirus AcNPV w komórkach owadów (na przykład komórkach Sf9 Spodoptera frugiperda, zdeponowanych w ATCC pod numerem dostępu CRL 1711). Jako komórki ssaków można zastosować w szczególności komórki chomika (na przykład CHO lub BHK-21), komórki małpy (na przykład COS lub VERO). Wynalazek obejmuje więc również te wektory ekspresji z wbudowanym polinukleotydem według wynalazku, białka WN lub fragmenty w ten sposób wytwarzane i zawierające je preparaty.
Przedmiotem niniejszego wynalazku są również preparaty oczyszczonych i/lub zatężonych białek wirusa WN. Kiedy polinukleotyd koduje liczne białka, to są one odcinane, a powyższe preparaty zawierają wówczas białka odcięte.
PL 210 306 B1
Przedmiotem wynalazku są również kompozycje immunogenne i szczepionki przeciw wirusowi WN, obejmujące co najmniej jeden wektor ekspresji in vivo według wynalazku i dopuszczalną farmaceutycznie zaróbkę lub podłoże oraz ewentualnie adiuwant.
Pojęcie kompozycji immunogennej obejmuje całą uwrażliwiającą kompozycję, która kiedy podana docelowemu gatunkowi, wywoła odpowiedź immunologiczną skierowaną przeciw wirusowi WN. Przez szczepionkę rozumie się kompozycję zdolną do wywołania skutecznej ochrony. Docelowymi gatunkami są konie, psy, koty, bydło, świnie, ptaki, najchętniej koń, pies kot, świnia, a z ptaków gęsi, indyki, kurczaki, kaczki, które to z definicji obejmują zwierzęta rozpłodowe, nioski, zwierzęta hodowane na mięso.
Dopuszczalne farmaceutycznie zaróbki i podłoża są doskonale znane specjaliście w dziedzinie. Przykładowo można wymienić 0,9% roztwór soli NaCl lub bufor fosforanowy. Dopuszczalne farmaceutycznie zaróbki lub podłoża obejmują również każdą mieszaninę lub kombinację mieszanin, pozwalającą na łatwe podawanie wektora, w szczególności transfekcję i/lub poprawę konserwacji.
Dawki i objętości dawki są określone dalej w ramach ogólnego opisu metod immunizacji i szczepienia.
Kompozycje immunogenne i szczepionki według wynalazku obejmują najchętniej jeden lub liczne adiuwanty, wybrane w szczególności spośród konwencjonalnych adiuwantów. W ramach niniejszego wynalazku szczególnie odpowiednie są: (1) polimery kwasu akrylowego lub metakrylowego, polimery bezwodnika maleinowego i pochodnej alkenylowej, (2) immunostymulujące sekwencje (ISS), w szczególnoś ci sekwencje oligodezoksyrybonukleotydowe, posiadają ce jeden lub wiele nie metylowanych motywów CpG (D. M. Klinman i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996, 93, 2879-2883; WO-A1-98/16247), (3) emulsja olej w wodzie, w szczególności emulsja SPT, opisana na stronie 147 „Vacccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach, wydane przez M. Powell, M. Newman, Plenum Press 1995 oraz emulsja MF59 opisana na stronie 183 tej samej pracy, (4) lipidy kationowe, zawierające sól czwartorzędowej grupy amonowej, (5) cytokiny lub (6) ich kombinacje lub mieszaniny.
Emulsja olej w wodzie (3), która jest szczególnie dostosowana do wektorów wirusowych, może w szczególnoś ci być oparta na:
- lekkim ciekł ym oleju parafinowym (typu jak w Europejskiej farmakopei);
- oleju substancji izoprenopochodnej, takiej jak skwalan, skwalen;
- oleju powstałym w wyniku oligopolimeryzacji alkenów, w szczególności izobutenu lub dekenu;
- estrach kwasów lub alkoholi z grupy liniowego alkilu;
- szczegółowiej olejach roślinnych, oleinianie etylowym, di(kaprylanie/kaprynianie) glikolu propylenowym, tri(kaprylanie/kaprynianie) glicerolu, dioleinianie glikolu propylenowego;
- estrach rozgałęzionych kwasów tłuszczowych lub alkoholi, w szczególności estrach kwasu izostearynowego.
Zastosowano olej w połączeniu z emulgatorami do wytworzenia emulsji. Emulgatorami są korzystnie nie jonowe czynniki powierzchniowo czynne, w szczególności:
- estry z jednej strony sorbitanu, mannitu (np. oleinian anhydromannitolu), glicerolu, poliglicerolu lub glikolu propylenowego, a z drugiej strony kwasu oleinowego, izostearynowego, rycynowego, hydroksystearynowego, estry te będą ewentualnie etoksylowane, bloki kopolimerów polioksypropylen-polioksyetylen, w szczególności Pluronic®, w szczególności
L121.
Pośród adiuwantów polimerowych rodzaju (1) korzystne są usieciowane polimery kwasu akrylowego lub metakrylowego, w szczególności usieciowane przez etery polialkenylowe cukrów lub polialkoholi. Te mieszaniny znane są pod nazwą karbomer (Pharmeuropa vol. 8, nr 2, czerwiec 1996). Specjalista w dziedzinie może również odwołać się do US-A-2909462, w którym opisano takie polimery akrylowe usieciowane związkiem polihydroksylowanym posiadającym co najmniej 3 grupy hydroksylowe, korzystnie nie więcej niż 8, przy czym atomy wodoru przynajmniej trzech grup hydroksowych są zastąpione przez nienasycone reszty alifatyczne o przynajmniej dwóch atomach węgla. Korzystne reszty zawierają 2 do 4 atomów węgla, np. grup winylowych, allilowych i innych nienasyconych grup etylenowych. Reszty nienasycone mogą same zawierać inne podstawniki, takie jak metyl. Produkty sprzedawane pod nazwą Carbopol® (BF Goodrich, Ohio, USA) są szczególnie odpowiednie. Są one usieciowane przez allilosacharozę lub przez allilopentaerytrytol. Wśród nich można wymienić w szczególności Carbopol® 974P, 934P i 971P.
Pośród kopolimerów bezwodnika maleinowego i pochodnej alkenylowej korzystne są EMA® (Monsanto), które są kopolimerami bezwodnika maleinowego i etylenu, liniowymi lub usieciowanymi,
PL 210 306 B1 na przykład usieciowanymi eterem diwinylowym. W tej kwestii można się odnieść do J. Fields i wsp., Nature, 186: 778-780, 4 czerwiec 1960.
Z punktu widzenia budowy polimery kwasu akrylowego lub metakrylowego oraz EMA® są korzystnie utworzone z podstawowych jednostek o następującym wzorze:
w którym:
R, R,
-c-<q^>x-c—(ch,) yCOOH COOH
- R1 i R2, które są identyczne lub różne, oznaczają H lub CH3
- x = 0 albo 1, korzystnie x = 1
- y = 1 albo 2, przy czym x + y = 2
Dla EMA® x = 0 i y = 2. Dla karbomerów x = y = 1.
Polimery te są rozpuszczane w wodzie lub soli fizjologicznej (NaCl 20 g/l) a pH doprowadza się do 7,3-7,4 stosując sodę, w celu otrzymania roztworu adiuwantowego, do którego będą wprowadzone wektory ekspresji.
Stężenie polimeru w końcowej kompozycji szczepionkowej może w szczególności wynosić od 0,01% do 1,5% wag./obj. (stężenie wagowe) szczególniej od 0,05 do 1% wag./obj., korzystnie od 0,1 do 0,4% wag./obj.
Lipidy kationowe (4), obejmujące czwartorzędową sól amonową, są szczególnie, ale nie wyłącznie, odpowiednie dla plazmidów, korzystnie te, które odpowiadają następującemu wzorowi:
ch3 „ L
R, - O-CH2-CH-CHj-N-R2-X ORi CH3 w którym R1 jest liniową resztą alifatyczną , nasyconą lub nienasyconą, o 12 do 18 atomach węgla, R2 jest inną resztą alifatyczną zawierającą 2 lub 3 atomy węgla, a X oznacza grupę hydroksylową lub aminową.
Pośród tych kationowych lipidów, korzystny jest DMRIE (N-(2-hydroksyetylo)-N,N-dimetylo-2,3-bis(tetradekoiloksy)-1-propanoamon; WO-A-96/34109), korzystnie zasocjowany z obojętnym lipidem, w szczególności DOPE (dioleilofosfatydyloetanoloamina; J. P. Behr, 1994, Bioconjugate Chemistry, 5, 383-389), do wytworzenia DMRIE-DOPE.
Korzystnie, mieszaninę plazmidu z tym adiuwantem sporządza się bezpośrednio przed użyciem. Ponadto korzystne jest, jeśli przed jej podaniem, pozostawienie jej przykładowo na 10 do 60 minut, w szczególności 30 minut, w celu wytworzenia kompleksów mieszaniny.
O ile DOPE jest obecny stosunek molarny DMRIE:DOPE wynosi korzystnie od 95:5 do 5:95, korzystniej 1:1.
Stosunek wagowy plazmid:adiuwant DMRIE lub DMRIE-DOPE może wynosić w szczególności od 50:1 do 1:10, szczególnie od 10:1 do 1:5, a korzystnie od 1:1 do 1:2.
Cytokina lub cytokiny (5) mogą być dostarczone w postaci białka w kompozycji lub szczepionki, lub być równocześnie wyrażane u gospodarza z immunogenem lub immunogenami. Przewagę ma
PL 210 306 B1 równoczesne wyrażanie cytokiny lub cytokin, przez ten sam wektor, który wyraża immunogen, bądź przez własny wektor.
Cytokiny mogą być w szczególności wybrane spośród: interleukiny 18 (IL-18), interleukiny 12 (IL-12), interleukiny 15 (IL-15), MlP-1a (białko zapalne makrofagów 1a, ang. macrophage inflammatory protein 1a; E. Marshall i wsp., Br. J. Cancer, 1997, 75(12), 1715-1720), GM-CSF (czynnik stymulujący kolonie granulocytów i makrofagów lub po angielsku Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor). W szczególności można wymienić cytokiny ptasie, w szczególności kurcząt, takie jak cIL-18 (K. Schneider i wsp., J. Interferon Cytokine Res., 2000, 20(10), 879-883), cIL-15 (K.-Q. Xin i wsp., Vaccine, 1999, 17, 858-866), i cytokiny koni, w szczególności koński GM-CSF (WO-A-00/77210)). Korzystnym sposobem jest stosowanie cytokin szczepionego gatunku.
WO-A-00/77210 opisuje sekwencję nukleotydową i sekwencję aminokwasową odpowiadającą końskiemu GM-CSF, wytwarzanie GM-CSF in vitro i budowę wektorów (plazmidów i wektorów wirusowych) umożliwiających ekspresję końskiego GM-CSF in vivo. Te białka, plazmidy i wektory wirusowe, mogą być stosowane w kompozycjach immunogennych i szczepionkach dla koni według wynalazku. Przykładowo można zastosować plazmid pJP097 opisany w przykładzie 3 tego poprzedniego zgłoszenia lub zastosować zasadę z tego poprzedniego zgłoszenia do wytwarzania innych wektorów lub wytwarzania in vitro końskiego GM-CSF, i wprowadzać te wektory lub koński GM-CSF do kompozycji immunogennych lub szczepionek dla koni według wynalazku.
Przedmiotem niniejszego wynalazku są ponadto kompozycje immunogenne i szczepionki zwane podjednostkowymi, obejmujące białko E i ewentualnie jedno lub liczne inne białka wirusa WN, w szczególnoś ci prM lub M, korzystnie wytwarzane przez ekspresję in vitro jak opisano powyż ej, jak również dopuszczalną farmaceutycznie zaróbkę lub podłoże.
Dopuszczalne farmaceutycznie zaróbki lub podłoża są doskonale znane specjaliście w dziedzinie. Przykładowo może tu chodzić o fizjologiczny roztwór soli 0,9% NaCl lub bufor fosforanowy.
Kompozycje immunogenne i szczepionki podjednostkowe według wynalazku korzystnie obejmują jeden lub wiele adiuwantów, wybranych spośród konwencjonalnych adiuwantów. Zakresowi niniejszego wynalazku odpowiadają szczególnie: (1) polimer kwasu akrylowego lub metakrylowego, polimer bezwodnika maleinowego i pochodnej alkenylowej, (2) immunostymulująca sekwencja (ISS), w szczególnoś ci sekwencja oligodezoksyrybonukleotydowa, posiadają ca jeden lub wiele nie metylowanych motywów CpG (D. M. Klinman i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996, 93, 2879-2883; WO-A1-98/16247), (3) emulsja olej w wodzie, w szczególności emulsja SPT, opisana na stronie 147 „Vacccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach, wydane przez M. Powell, M. Newman, Plenum Press 1995 oraz emulsja MF59 opisana na stronie 183 tej samej pracy, (4) emulsja woda w oleju (EP-A-639071), (5) saponina, w szczególności Quil-A, lub (6) wodorotlenek glinu lub ekwiwalent. Różne rodzaje adiuwantów określone pod 1), 2) i 3) opisano uprzednio bardziej szczegółowo równocześnie ze szczepionkami na bazie wektorów do ekspresji.
Dawki i objętości dawki określono dalej w ramach ogólnego opisu sposobów immunizacji i szczepienia.
Odpowiednio do wynalazku, szczepienie przeciwko wirusowi WN może być połączone z innymi szczepieniami w ramach programów szczepienia, w postaci zestawów do immunizacji lub szczepienia lub jeszcze w postaci kompozycji immunogennych i wieloważnych szczepionek, to znaczy obejmujących, co najmniej jeden składnik szczepionki przeciw wirusowi WN i co najmniej jeden składnik szczepionki przeciw co najmniej jednemu innemu czynnikowi patogennemu. Obejmuje to również ekspresję, przez ten sam wektor ekspresji, genów co najmniej dwóch czynników patogennych, włączając wirus WN.
Przedmiotem wynalazku jest również wieloważna kompozycja immunogenna lub wieloważna szczepionka przeciw wirusowi WN i przeciw co najmniej jednemu innemu patogenowi docelowego gatunku, wykorzystująca ten sam wektor ekspresji in vivo, zawierający i wyrażający, co najmniej jeden polinukleotyd wirusa WN według wynalazku i co najmniej jeden polinukleotyd wyrażający immunogen innego patogenu.
Przez tak wyrażony „immunogen rozumie się w szczególności białko, glikoproteinę, polipeptyd lub peptyd, epitop lub pochodną, np. białko fuzyjne, wywołujące odpowiedź immunologiczną, korzystnie odpowiedź ochroną.
Jak opisano poprzednio, te kompozycje lub wieloważne szczepionki obejmują również dopuszczalną farmaceutycznie zaróbkę lub podłoże oraz ewentualnie adiuwant.
PL 210 306 B1
Przedmiotem wynalazku jest również wieloważna kompozycja immunogenna lub wieloważna szczepionka, obejmująca co najmniej jeden wektor ekspresji in vivo, do którego wprowadzono co najmniej jeden polinukleotyd wirusa WN według wynalazku i co najmniej drugi wektor ekspresji, do którego wprowadzono polinukleotyd kodujący immunogen innego czynnika patogennego. Jak poprzednio opisano, te wieloważne kompozycje lub szczepionki obejmują również dopuszczalną farmaceutycznie zaróbkę lub podłoże oraz ewentualnie adiuwant.
Dla wieloważnych kompozycji immunogennych i szczepionek inne wymienione wcześniej patogeny koni są w szczególności wybrane z grupy obejmującej wirus poronienia klaczy EHV-1 i/lub EHV-4 (korzystnie połączone są immunogeny EHV-1 i EHV-4), koński wirus grypy EIV, wirus wschodniego końskiego zapalenia mózgu EEV, wirus zachodniego końskiego zapalenia mózgu WEV, wirus wenezuelskiego końskiego zapalenia mózgu VEV (korzystna jest kombinacja trzech EEV, WEV, VEV), Clostridium tetani (tężec) i ich mieszaniny. Korzystnie dla EHV wybiera się geny gB i/lub gD; dla EIV geny HA, NP i/lub N; dla wirusów zapalenia mózgu C i/lub E2; dla Clostridium tetani gen kodujący całość lub część podjednostki C toksyny tężcowej. Włączono tu zastosowanie polinukleotydów kodujących immunologicznie aktywny fragment lub epitop tego immunogenu.
Inne wspomniane wyżej patogeny ptasie są w szczególności wybrane z grupy obejmującej wirusy choroby Mareka MDV (serotypy 1 i 2, korzystnie serotyp 1), wirus choroby Newcastle NDV, wirus choroby Gumboro IBDV, wirus zakaźnego zapalenia oskrzeli u ptaków IBV, wirus zakaźnej niedokrwistości CAV, wirus ptasiego zapalenia krtani i tchawicy ILTV, wirus ptasiego zapalenia mózgu i rdzenia AEV (lub jeszcze wirus białaczki ptasiej ALV), wirus krwotocznego zapalenia jelit indyków (HEV), wirus pneumowirozy (TRTV), wirus pomoru drobiu (influenzy drobiu), wirus puchliny osierdzia kurcząt, reowirusy ptasie, Escherichia coli, Mycoplasma gallinarum, Mycoplasma gallisepticum, Haemophilus avium, Pasteurella gallinarum, Pasteurella multocida gallicida i ich mieszaniny. Korzystnie dla MDV wybiera się geny gB i/lub gD; dla NDV geny HN i/lub F; dla IBDV gen VP2; dla IBV geny S (a szczególniej S1), M i/lub N; dla CAV geny VP1 i/lub VP2, dla ILTV geny gB i/lub gD; dla AEV geny env i/lub gag/pro, dla HEV geny 100K i hekson, dla TRTV geny F i/lub G; dla wirusa pomoru drobiu geny HA, N i/lub NP. Włączono tu zastosowanie polinukleotydów kodujących immunologicznie aktywny fragment lub epitop tego immunogenu.
Przykładowo do wieloważnej kompozycji immunogennej lub wieloważnej szczepionki według wynalazku, ewentualnie wspomaganej jak opisano powyżej, przeznaczonej dla koni, można wprowadzić jeden lub wiele plazmidów opisanych w WO-A-98/03198, w szczególności w przykładach od 8 do 25 tego poprzedzającego zgłoszenia i tych opisanych w WO-A-00/77043, które to dotyczą koni, w szczególności te opisane w przykładach 6 i 7 poprzedzającego zgłoszenia. Dla ptaków można wprowadzić na przykład jeden lub wiele plazmidów opisanych w WO-A1-98/03659, a w szczególności te opisane w przykładach od 7 do 27 tego poprzedzającego zgłoszenia.
Kompozycje immunogenne lub rekombinowane szczepionki takie jak te wcześniej opisane, mogą również być połączone z co najmniej jedną klasyczną szczepionką (inaktywowaną, żywą atenuowaną, podjednostkową) skierowaną przeciw co najmniej jednemu innemu patogenowi.
Tak samo, kompozycje immunogenne i szczepionki podjednostkowe według wynalazku, mogą stanowić przedmiot połączonego szczepienia. Zatem przedmiotem wynalazku są wieloważne kompozycje immunogenne i wieloważne szczepionki, obejmujące białko lub białka według wynalazku, oraz jeden lub wiele immunogenów (termin immunogen został zdefiniowany powyżej) co najmniej jednego innego czynnika patogennego (w szczególności z powyższej listy), i/lub jeszcze innego czynnika patogennego w postaci inaktywowanej lub atenuowanej. Jak to było opisane wcześniej te wieloważne kompozycje lub szczepionki obejmują również dopuszczalną farmaceutycznie zaróbkę lub podłoże i ewentualnie adiuwant.
Przedmiotem niniejszego wynalazku są również sposoby immunizacji i szczepienia wspomnianych powyżej docelowych gatunków.
Sposoby te obejmują podawanie skutecznej ilości kompozycji immunogennej lub szczepionki według wynalazku. Takie podawanie może odbywać się w szczególności drogą pozajelitową, np. przez podawanie podskórne, śródskórne, domięśniowe lub drogą doustną i/lub donosową. Może być realizowany jeden lub wiele sposobów podawania, w szczególności dwa.
Różne szczepionki mogą być wstrzykiwane, za pomocą przyrządu do wstrzykiwań, ciekłym strumieniem bez igły. Dla plazmidów można również zastosować cząstki złota otoczone plazmidem i chronione tak, aby przenikał y do komórek skóry immunizowanego osobnika (Tang i wsp., Nature
1992, 356, 152-154).
PL 210 306 B1
Kompozycje immunogenne i szczepionki według wynalazku obejmują skuteczną ilość wektora ekspresji lub polipeptydu.
W przypadku kompozycji immunogennych lub szczepionek opartych na plazmidzie, dawka wynosi ogólnie od około 10 μg do około 2000 μg, w szczególności od około 50 μg do około 1000 μg. Objętości dawki mogą zawierać się pomiędzy 0,1 a 2 ml, korzystnie pomiędzy 0,2 a 1 ml.
Dawki te i objętości dawki są dobrze dostosowane do szczepienia koni i ssaków.
Do szczepienia gatunków ptaków dawka jest zawarta szczególnie pomiędzy około 10 μg a około 500 μg, a korzystniej pomiędzy około 50 μg a około 200 μg. Objętości dawki mogą być szczególniej zawarte pomiędzy 0,1 a 1 ml, korzystnie pomiędzy 0,2 a 0,5 ml.
Specjalista w dziedzinie posiada kompetencje niezbędne do optymalizowania skutecznej dawki plazmidu do zastosowania w każdym protokole immunizacji lub szczepienia i określenia najlepszej drogi podania.
W przypadku kompozycji immunogennych lub szczepionek opartych na pokswirusie, dawka ogólnie zawierała się pomiędzy około 103 pfu (ang. plaque formit unit, jednostka tworząca łysinki) a około 105 pfu.
Dla gatunków koni i ssaków, jeśli wektorem jest wirus krowianki, dawka jest zawarta korzystnie pomiędzy około 104 pfu a około 109 pfu, korzystnie pomiędzy około 106 pfu a około 108 pfu; jeśli wektorem jest wirus ospy kanarków, dawka jest zawarta szczególniej pomiędzy około 105 pfu a około 109 pfu, korzystnie pomiędzy około 105,5 lub 106 pfu a około 108 pfu.
Dla gatunków ptaków, jeśli wektorem jest wirus ospy kanarków, dawka jest zawarta szczególnie pomiędzy około 103 pfu a około 107 pfu, korzystnie pomiędzy około 104 pfu a około 106 pfu; jeśli wektorem jest wirus ospy drobiu, dawka jest zawarta szczególnie pomiędzy około 102 pfu a około 105 pfu, korzystnie pomiędzy około 103 pfu a około 105 pfu.
W przypadku kompozycji immunogennych lub szczepionek opartych na wektorze wirusowym innym niż pokswirus, w szczególności wirus Herpes, dawka ogólnie zawierała się pomiędzy około 103 pfu a około 108 pfu. W przypadku kompozycji immunogennych lub szczepionek ptasich dawka ogólnie zawiera się pomiędzy około 103 pfu a około 106 pfu. W przypadku kompozycji immunogennych lub szczepionek końskich dawka ogólnie zawiera się pomiędzy około 106 pfu a około 108 pfu.
Objętości dawki kompozycji immunogennych i szczepionek dla koni opartych na wektorach wirusowych ogólnie mieszczą się pomiędzy 0,5 a 2,0 ml, korzystnie 1,0 a 2,0 ml, korzystniej 1,0 ml. Objętości dawki kompozycji immunogennych i szczepionek dla ptaków opartych na wektorach wirusowych ogólnie mieszczą się pomiędzy 0,1 a 1,0 ml, korzystnie 0,1 a 0,5 ml, korzystniej pomiędzy 0,2 a 0,3 ml. Specjalista w dziedzinie posiada również dla tego rodzaju szczepionki kompetencje niezbędne do optymalizowania liczby podań, drogi podania i dawek do stosowania dla każdego protokołu immunizacji. W szczególności przewiduje się dwa podania u konia, na przykład z 35 dniowym odstępem.
W przypadku kompozycji immunogennych lub szczepionek podjednostkowych, dawka wynosi ogólnie od około 10 μg do około 2000 μg, w szczególności od około 50 μg do około 1000 μg. Objętości dawki kompozycji immunogennych i szczepionek dla koni opartych na wektorach wirusowych ogólnie zawierały się pomiędzy 1,0 a 2,0 ml, korzystnie pomiędzy 0,5 a 2,0 ml, korzystniej 1,0 ml. Objętości dawki kompozycji immunogennych i szczepionek dla ptaków opartych na wektorach wirusowych ogólnie mieszczą się pomiędzy 0,1 a 1,0 ml, korzystnie 0,1 a 0,5 ml, korzystniej pomiędzy 0,2 a 0,3 ml. Specjalista w dziedzinie posiada również dla tego rodzaju szczepionki kompetencje niezbędne do optymalizowania liczby podań, drogi podania i dawek do stosowania dla każdego protokołu immunizacji.
Wynalazek dotyczy również zastosowania wektora do ekspresji in vivo lub wytworzenia wektorów lub polipeptydów według wynalazku, do wytwarzania kompozycji immunogennej lub szczepionki przeznaczonej do ochrony docelowych gatunków przed wirusem WN i ewentualnie przed co najmniej jednym innym czynnikiem patogennym. Różne właściwości wymienione w pozostałej części opisu odnoszą się do tego przedmiotu wynalazku.
Szczepionka oparta na plazmidzie lub szczepionka wirusowa wyrażająca jedno lub wiele białek wirusa WN lub szczepionka podjednostkowa WN według niniejszego wynalazku, nie wywoła u szczepionego zwierzęcia wytwarzania przeciwciał przeciw innym białkom tego wirusa, które nie są reprezentowane w kompozycji immunogennej lub szczepionce. Właściwość ta może być wykorzystana do rozwoju metod diagnostyki różnicowej, pozwalających na dokonanie rozróżnienia pomiędzy zwierzętami zarażonymi patogennym wirusem WN, a zwierzętami zaszczepionymi przy pomocy szczepionek
PL 210 306 B1 według wynalazku. U tych ostatnich białka te i/lub przeciwciała przeciwko nim skierowane są obecne i mogą być wykryte poprzez reakcję antygen-przeciwciał o. U zwierząt zaszczepionych stosownie do wynalazku nie ma przypadku, który pozostaje negatywny. W celu zrealizowania tego rozróżnienia, stosuje się białko, które nie jest reprezentowane w szczepionce (nieobecne lub niewyrażone), na przykład białko C lub białko NS1, NS2A, NS2B lub NS3, jeśli nie jest ono reprezentowane w szczepionce.
Przedmiotem niniejszego wynalazku jest zatem zastosowanie wektorów, preparatów i polipeptydów według wynalazku do przygotowania kompozycji immunogennych i szczepionek, pozwalających na rozróżnienie pomiędzy zwierzętami szczepionymi a zwierzętami zakażonymi.
Przedmiotem wynalazku jest również sposób immunizacji i szczepienia, połączony z metodą diagnostyczną, umożliwiającą to rozróżnienie.
Wybrane do diagnostyki białko lub jeden z jego fragmentów lub epitopów zastosowano jako antygen w teście diagnostycznym, i/lub zastosowano do wytwarzania przeciwciał, poliklonalnych lub monoklonalnych. Specjalista w dziedzinie dysponuje wiadomościami i praktyką w wytwarzaniu tych przeciwciał i wykorzystywaniu antygenów i/lub przeciwciał w klasycznych metodach diagnostyki, np. testach ELISA.
Niniejszy wynalazek będzie dalej opisany bardziej szczegółowo, za pomocą nieograniczających przykładów jego realizacji.
Przykłady:
Wszystkie konstrukty realizowano wykorzystując standartowe techniki biologii molekularnej (klonowanie, trawienie enzymami restrykcyjnymi, synteza komplementarnej pojedynczej nici DNA, reakcja łańcuchowa polimerazy, elongacja oligonukleotydu przez polimerazę DNA...) opisane przez J. Sambrook i wsp. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Wyd. II. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989). Wszystkie fragmenty restrykcyjne zastosowane w wynalazku, jak również zmienne fragmenty reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR), izolowano i oczyszczano stosując zestaw „Geneclean® (BIO101 Inc. La Jolla, CA).
Przykład 1: Hodowla wirusa gorączki zachodniego Nilu
W celu jego amplifikacji, wirus gorą czki zachodniego Nilu NY99 (R. S. Lanciotti i wsp., Science, 1999, 286, 2333-7) hodowano na komórkach VERO (komórki nerkowe małpy, dostępne w American Type Culture Collection (ATCC) pod numerem CCL-81).
Komórki Vero umieszczono w hodowli, na płytkach Falcon 25 cm2 z podłożem Eagle-MEM uzupełnionym 1% ekstraktami drożdży i 10% surowicą cielęcą, zawierające około 100000 komórek na ml. Komórki hodowano w 37°C, w atmosferze 5% CO2.
Po 3 dniach warstwa komórkowa ulega zlaniu. Podłoże hodowli zastąpiono przez podłoże Eagle-MEM uzupełnione 1% ekstraktami drożdży i 0,1% albuminą surowicy bydlęcej i dodano wirus gorączki zachodniego Nilu w stosunku 5 pfu/komórkę.
Jeśli efekt cytopatogenny (CPE) jest całkowity (generalnie 48-72 godziny od początku założenia hodowli), zawiesiny wirusowe są zbierane, następnie oczyszczane przez wirowanie i zamrażane w -70°C. Zasadniczo 3 do 4 kolejnych pasaży jest niezbędnych do wytworzenia partii cząstek wirusa. Partię wirusową przechowywano w -70°C.
Przykład 2: Ekstrakcja wirusowego RNA z wirusa gorączki zachodniego Nilu
Wirusowy RNA, zawarty w 100 ml wirusowej zawiesiny szczepu wirusa gorączki zachodniego Nilu NY99, ekstrahowano po rozmrożeniu roztworami zestawu „High Pure™ Viral RNA Kit (nr kat. 1858882, Roche Molecular Biochemicals), zgodnie z instrukcjami dostawcy dotyczącymi etapów ekstrakcji. Osad RNA otrzymany na końcu ekstrakcji ponownie zawieszano w 1 do 2 ml sterylnej wody destylowanej bez RNAzy.
Przykład 3: Konstrukcja plazmidu pFC101
Komplementarny DNA (cDNA) wirusa gorączki zachodniego Nilu NY99 syntetyzowano przy użyciu zestawu „Gene Amp RNA PCR Kit (nr kat. N8080017, Perkin-Elmer, Norwalk, CT 06859, USA) stosując warunki podane przez producenta.
Reakcję odwrotnej transkrypcji z następującą po niej łańcuchową reakcją polimerazy („RTPCR) przeprowadzono z 50 μΐ zawiesiny wirusowego RNA wirusa gorączki zachodniego Nilu NY99 (przykład 2) i z następującymi oligonukleotydami:
FC101 (30 mer) (SEK Nr ID:1)
5'TTTTTTGAATTCGTTACCCTCTCTAACTTC3' i FC102 (33 mer) (SEK Nr ID:2)
PL 210 306 B1
5'TTTTTTTCTAGATTACCTCCGACTGCGTCTTGA3'.
Ta para oligonukleotydów umożliwia wprowadzenie miejsca restrykcyjnego EcoRI i miejsca restrykcyjnego Xbal oraz kodonu stop na końcu 3' insertu.
Synteza pierwszej nici cDNA dokonuje się przez wydłużanie oligonukleotydu FC102, po hybrydyzacji tego ostatniego na matrycy RNA.
Warunki syntezy pierwszej nici cDNA to temperatura 42°C przez 15 minut, następnie 99°C przez 5 minut i w końcu 4°C przez 5 minut. Warunki reakcji PCR w obecności pary oligonukleotydów FC101 i FC102 to temperatura 95°C przez 2 minuty, następnie 35 cykli (95°C przez 1 minutę, następnie 62°C przez 1 minutę i 72°C przez 2 minuty) i w końcu 72°C przez 7 minut do wytworzenia fragmentu 302 pz.
Fragment ten jest trawiony przez EcoRI, następnie przez Xbal, w celu izolacji fragmentu EcoRIXbaI około 290 pz po elektroforezie na żelu agarozowym. Fragment ten nazwano fragmentem A.
Eukariotyczny plazmid ekspresji pVR1020 (C.J. Luke i wsp., J. of Infectious Diseases, 1997, 175, 95-97), pochodna plazmidu pVR1012 (figura 1 i przykład 7 z WO-A-98/03199; J. Hartikka i wsp., 1997, Human Gene Therapy, 7, 1205-1217), zawiera fazę kodującą sekwencję sygnalną aktywatora tkankowego ludzkiego plazminogenu (tPA).
Plazmid pVR1020 modyfikowano przez trawienie BamHI-Bglll i wprowadzenie sekwencji zawierającej wiele miejsc klonowania (BamHI, Notl, EcoRI, Xbal, Pmll, Pstl, Bglll) i powodującej dobieranie do pary następujących oligonukleotydów:
PB326 (40 mer) (SEK Nr ID:3)
5'GATCTGCAGCACGTGTCTAGAGGATATCGAATTCGCGGCC3' i PB329 (40 mer) (SEK Nr ID:4)
5'GATCCGCGGCCGCGAATTCGATATCCTCTAGACACGTGCT3'.
Również otrzymany wektor, wielkości około 5105 par zasad (bp lub pz) nazwano pAB110.
Fragment A połączono z plazmidem ekspresyjnym pAB110 uprzednio trawionym przez Xbal i EcoRI, żeby otrzymać plazmid pFC101 (5376 pz). Plazmid ten zawiera, pod kontrolą wczesnego promotora ludzkiego cytomegalowirusa lub hCMV-IE (human Cytomegalovirus Immediate Early), insert kodujący sekwencję sygnalną aktywatora tPA po czym następuje sekwencja kodującej białko prM.
Przykład 4: Konstruowanie plazmidu pFC102
Komplementarny DNA (cDNA) wirusa gorączki zachodniego Nilu NY99 syntetyzowano przy użyciu zestawu „Gene Amp RNA PCR Kit (nr kat. N8080017, Perkin-Elmer, Norwalk, CT 06859, USA) stosując warunki podane przez producenta.
Reakcję odwrotnej transkrypcji z następującą po niej łańcuchową reakcją polimerazy (reakcja „RT-PCR) przeprowadzono z 50 μl zawiesiny wirusowego RNA wirusa gorączki zachodniego Nilu NY99 (przykład 2) i z następującymi oligonukleotydami:
FC103 (30 mer) (SEK Nr ID:5)
5'TTTTTTGAATTCTCACTGACAGTGCAGACA3' i FC104 (33 mer) (SEK Nr ID:6)
5'TTTTTTTCTAGATTAGCTGTAAGCTGGGGCCAC3'.
Ta para oligonukleotydów umożliwia wprowadzenie miejsca restrykcyjnego EcoRI i miejsca restrykcyjnego Xbal oraz kodonu stop na końcu 3' insertu.
Synteza pierwszej nici cDNA dokonuje się przez elongację oligonukleotydu FC104, po jego hybrydyzacji do matrycy RNA.
Warunki syntezy pierwszej nici cDNA to temperatura 42°C przez 15 minut, następnie 99°C przez 5 minut i w końcu 4°C przez 5 minut. Warunki reakcji PCR w obecności pary oligonukleotydów FC103 i FC104 to temperatura 95°C przez 2 minuty, następnie 35 cykli (95°C przez 1 minutę, następnie 62°C przez 1 minutę i 72°C przez 2 minuty) i w końcu 72°C przez 7 minut do wytworzenia fragmentu 252 pz.
Fragment ten jest trawiony przez EcoRI, następnie przez Xbal, po elektroforezie na żelu agarozowym, w celu izolacji fragmentu EcoRI-Xbal około 240 pz. Fragment ten połączono z plazmidem ekspresyjnym pAB110 (przykład 3) uprzednio trawionym przez Xbal i EcoRI, żeby otrzymać plazmid pFC102 (5326 pz). Plazmid ten zawiera, pod kontrolą wczesnego promotora ludzkiego cytomegalowirusa lub promotora hCMV-IE (human Cytomegalovirus Immediate Early), insert kodujący sekwencję sygnałową aktywatora tPA po czym następuje sekwencja kodująca białko M.
PL 210 306 B1
Przykład 5: Konstruowanie plazmidu pFC103
Komplementarne DNA (cDNA) wirusa gorączki zachodniego Nilu NY99 syntetyzowano przy użyciu zestawu „Gene Amp RNA PCR Kit (nr kat. N8080017, Perkin-Elmer, Norwalk, CT 06859, USA) stosując warunki podane przez producenta.
Reakcję odwrotnej transkrypcji z następującą po niej łańcuchową reakcją polimerazy (reakcja „RT-PCR) przeprowadzono z 50 μΐ zawiesiny wirusowego RNA wirusa gorączki zachodniego Nilu NY99 (przykład 2) i z następującymi oligonukleotydami:
FC105 (30 mer) (SEK Nr ID:7)
5'TTTTTTGAATTCTTCAACTGCCTTGGAATG3' i FC106 (33 mer)(SEK Nr ID:8)
5'TTTTTTTCTAGATTAAGCGTGCACGTTCACGGA3'.
Ta para oligonukleotydów umożliwia wprowadzenie miejsca restrykcji EcoRI i miejsca restrykcji Xbal oraz kodonu stop na końcu 3' insertu.
Synteza pierwszej nici cDNA dokonuje się przez elongację oligonukleotydu FC106, po hybrydyzacji tego ostatniego na matrycy RNA.
Warunki syntezy pierwszej nici cDNA to temperatura 42°C przez 15 minut, następnie 99°C przez 5 minut i w końcu 4°C przez 5 minut. Warunki reakcji PCR w obecności pary oligonukleotydów FC105 i FC106 to temperatura 95°C przez 2 minuty, następnie 35 cykli (95°C przez 1 minutę, następnie 62°C przez 1 minutę i 72°C przez 2 minuty) i w końcu 72°C przez 7 minut do wytworzenia fragmentu 1530 pz.
Fragment ten jest trawiony przez EcoRI, następnie przez Xbal, w celu izolacji fragmentu EcoRIXbal około 1518 pz po elektroforezie na żelu agarozowym Xbal. Fragment ten połączono z plazmidem ekspresyjnym pAB110 (przykład 3) uprzednio trawionym przez Xbal i EcoRI, tak żeby otrzymać plazmid pFC103 (6604 pz). Plazmid ten zawiera, pod kontrolą wczesnego promotora ludzkiego cytomegalowirusa lub promotora hCMV-IE (human Cytomegalovirus Immediate Early), insert kodujący sekwencję sygnałową aktywatora tPA po czym następuje sekwencja kodująca białko E.
Przykład 6: Konstruowanie plazmidu pFC104
Komplementarne DNA (cDNA) wirusa gorączki zachodniego Nilu NY99 syntetyzowano przy użyciu zestawu „Gene Amp RNA PCR Kit (nr kat. N8080017, Perkin-Elmer, Norwalk, CT 06859, USA) stosując warunki podane przez producenta.
Reakcję odwrotnej transkrypcji z następującą po niej łańcuchową reakcją polimerazy (reakcja „RT-PCR) przeprowadzono z 50 μl zawiesiny wirusowego RNA wirusa gorączki zachodniego Nilu NY99 (przykład 2) i z następującymi oligonukleotydami:
FC101 (30 mer) (SEK Nr ID:1) i FC106 (33 mer) (SEK Nr ID:8)
Ta para oligonukleotydów umożliwia wprowadzenie miejsca restrykcji EcoRI i miejsca restrykcji Xbal oraz kodonu stop na końcu 3' insertu.
Synteza pierwszej nici cDNA dokonuje się przez elongację oligonukleotydu FC106, po jego hybrydyzacji do matrycowego RNA.
Warunki syntezy pierwszej nici cDNA to temperatura 42°C przez 15 minut, następnie 99°C przez 5 minut i w końcu 4°C przez 5 minut. Warunki reakcji PCR w obecności pary oligonukleotydów FC101 i FC106 to temperatura 95°C przez 2 minuty, następnie 35 cykli (95°C przez 1 minutę, następnie 62°C przez 1 minutę i 72°C przez 2 minuty) i w końcu 72°C przez 7 minut do wytworzenia fragmentu 2031 pz.
Fragment ten jest trawiony przez EcoRI, następnie przez Xbal, w celu izolacji fragmentu EcoRI-Xbal około 2019 pz po elektroforezie na żelu agarozowym. Fragment ten połączono z plazmidem ekspresyjnym pAB110 (przykład 3) uprzednio trawionym przez Xbal i EcoRI, żeby otrzymać plazmid pFC104 (7105 pz). Plazmid ten zawiera, pod kontrolą wczesnego promotora ludzkiego cytomegalowirusa lub hCMV-IE (human Cytomegalovirus Immediate Early), insert kodujący sekwencję sygnałową aktywatora tPA po której następuje sekwencja kodującej białko prM-M-E.
Przykład 7: Konstruowanie plazmidu pFC105
Komplementarny DNA (cDNA) wirusa gorączki zachodniego Nilu NY99 syntetyzowano przy użyciu zestawu „Gene Amp RNA PCR Kit (nr kat. N8080017, Perkin-Elmer, Norwalk, CT 06859, USA) stosując warunki podane przez producenta.
PL 210 306 B1
Reakcję odwrotnej transkrypcji z następującą po niej reakcją łańcuchową polimerazy (reakcja
RT-PCR) przeprowadzono z 50 μΐ zawiesiny wirusowego RNA wirusa gorączki zachodniego Nilu NY99 (przykład 2) i z następującymi oligonukleotydami:
FC107 (36 mer) (SEK Nr ID:9)
5'TTTTTTGATATCACCGGAATTGCAGTCATGATTGGC3' i FC106 (33 mer) ( SEK Nr ID:8).
Ta para oligonukleotydów umożliwia wprowadzenie miejsca restrykcyjnego EcoRV i miejsca restrykcyjnego Xbal oraz kodonu stop na końcu 3' insertu.
Synteza pierwszej nici cDNA dokonuje się przez elongację oligonukleotydu FC106, po jego hybrydyzacji z matrycą RNA.
Warunki syntezy pierwszej nici cDNA to temperatura 42°C przez 15 minut, następnie 99°C przez 5 minut i w końcu 4°C przez 5 minut. Warunki reakcji PCR w obecności pary oligonukleotydów FC106 i FC107 to temperatura 95°C przez 2 minuty, następnie 35 cykli (95°C przez 1 minutę, następnie 62°C przez 1 minutę i 72°C przez 2 minuty) i w końcu 72°C przez 7 minut do wytworzenia fragmentu 2076 pz.
Fragment ten jest trawiony przez EcoRV, następnie przez Xbal, w celu izolacji fragmentu EcoRV-Xbal około 2058 pz po elektroforezie na żelu agarozowym.
Fragment ten połączono z plazmidem ekspresyjnym pVR1012, uprzednio trawionym przez Xbal i EcoRV, żeby otrzymać plazmid pFC105 (6953 pz). Plazmid ten zawiera, pod kontrolą wczesnego promotora ludzkiego cytomegalowirusa lub hCMV-IE (human Cytomegalovirus Immediate Early), insert kodujący poliproteinę prM-M-E.
Przykład 8: Konstruowanie plazmidu pFC106
Komplementarny DNA (cDNA) wirusa gorączki zachodniego Nilu NY99 syntetyzowano przy użyciu zestawu „Gene Amp RNA PCR Kit (nr kat. N8080017, Perkin-Elmer, Norwalk, CT 06859, USA) stosując warunki podane przez producenta.
Reakcję odwrotnej transkrypcji z następującą po niej łańcuchową reakcją polimerazy (reakcja „RT-PCR) przeprowadzono z 50 μl zawiesiny wirusowego RNA wirusa gorączki zachodniego Nilu NY99 (przykład 2) z następującymi oligonukleotydami:
FC108 (36 mer) (SEK Nr ID:10)
5'TTTTTTGATATCATGTATAATGCTGATATGATTGAC3' i FC109 (36 mer) (SEK Nr ID:11)
5'TTTTTTTCTAGATTAACGTTTTCCCGAGGCGAAGTC3'
Ta para oligonukleotydów umożliwia wprowadzenie miejsca restrykcyjnego EcoRV i miejsca restrykcyjnego Xbal, kodonu inicjującego ATG na końcu 5' oraz kodonu stop na końcu 3' insertu.
Synteza pierwszej nici cDNA dokonuje się przez elongację oligonukleotydu FC109, po jego hybrydyzacji z matrycą RNA.
Warunki syntezy pierwszej nici cDNA to temperatura 42°C przez 15 minut, następnie 99°C przez 5 minut i w końcu 4°C przez 5 minut. Warunki reakcji PCR w obecności pary oligonukleotydów FC108 i FC109 to temperatura 95°C przez 2 minuty, następnie 35 cykli (95°C przez 1 minutę, następnie 62°C przez 1 minutę i 72°C przez 2 minuty) i w końcu 72°C przez 7 minut do wytworzenia fragmentu 2973 pz.
Fragment ten jest trawiony przez EcoRV, następnie przez Xbal, w celu izolacji fragmentu EcoRV-XbaI około 2955 pz po elektroforezie na żelu agarozowym.
Fragment ten połączono z plazmidem ekspresyjnym pVR1012, uprzednio trawionym przez Xbal i EcoRV, tak aby otrzymać plazmid pFC106 (7850 pz). Plazmid ten zawiera, pod kontrolą wczesnego promotora ludzkiego cytomegalowirusa lub hCMV-IE (human Cytomegalovirus Immediate Early), insert kodujący poliproteinę NS2A-NS2B-NS3.
Przykład 9: Konstruowanie plazmidu-dawcy do insercji w miejscu C5 wirusa ospy kanarków ALVAC
Figura 16 opisu patentowego US-A-5756103 przedstawia sekwencję fragmentu 3199 pz genomowego DNA wirusa ospy kanarków. Analiza tej sekwencji ujawniła otwartą ramkę odczytu (ORF), którą nazwano C5L, która zaczyna się w pozycji 1538, a kończy się w pozycji 1859. Konstruowanie plazmidu insercyjnego prowadzącego do delecji ORF C5L i jego zastąpienie przez miejsce wielokrotnego klonowania oflankowanego sygnałami końca transkrypcji i transdukcji wykonano jak opisano poniżej.
PL 210 306 B1
Reakcję PCR przeprowadzono na matrycy utworzonej przez genomowy DNA wirusa ospy kanarków z następującymi oligonukleotydami:
C5A1 (42 mer) (SEK Nr ID:12):
5'ATCATCGAGCTCCAGCTGTAATTCATGGTCGAAAAGAAGTGC 3' i C5B1 (73 mer) (SEK Nr ID:13):
5'GAATTCCTCGAGCTGCAGCCCGGGTTTTTATAGCTAATTAGTCATTTTTTGAGAGTACC ACTTCAGCTACCTC 3' w celu wyizolowania fragmentu PCR o 223 pz (fragment B).
Reakcję PCR przeprowadzono na matrycy utworzonej przez genomowy DNA wirusa ospy kanarków z następującymi oligonukleotydami:
C5C1 (72 mer) (SEK Nr ID:14):
5'CCCGGGCTGCAGCTCGAGGAATTCTTTTTATTGATTAACTAGTCATTATAAAGATCTAA
AATGCATAATTTC 3' i C5D1 (45 mer) (SEK Nr ID:15):
5'GATGATGGTACCGTAAACAAATATAATGAAAAGTATTCTAAACTA 3' w celu wyizolowania fragmentu PCR o 482 pz (fragment C).
Fragmenty B i C wspólnie hybrydyzowano, żeby posłużyły za matrycę w reakcji PCR przeprowadzonej z oligonukleotydami C5A1 (SEK Nr ID: 12) i C5D1 (SEK Nr ID: 15) w celu wytworzenia fragmentu PCR o 681 pz. Fragment ten trawiono enzymami restrykcyjnymi SacI i KpnI, w celu izolacji fragmentu Sacl-Kpnl z 664 pz po elektroforezie na żelu agarowym. Fragment ten połączono z wektorem pBlueScript® II SK+ (Stratagene, La Jolla, CA, USA, nr kat. 212205), najpierw trawionym przez enzymy restrykcyjne SacI i KpnI, żeby otrzymać plazmid pC5L. Sekwencje tego plazmidu zweryfikowano przez sekwencjonowanie. Plazmid ten zawiera 166 pz sekwencji umieszczonych powyżej ORF C5L („lewe ramię flankujące C5), sygnał przedwczesnego zatrzymania transkrypcji z wirusa krowianki, kodony stop w 6 fazach odczytu, miejsce wielokrotnego klonowania zawierające miejsca restrykcji Smal, Pstl, Xhol i EcoRI i w końcu 425 pz sekwencji umieszczonych poniżej ORF C5L („prawe ramię flankujące C5).
Plazmid pMP528HRH (M. Perkus i wsp., J. Virol. 1989, 63, 3829-3836) zastosowano jako matrycę do amplifikacji kompletnej sekwencji promotora wirusa krowianki H6 (Nr dostępu GenBanku M28351) z następującymi oligonukleotydami:
JCA291 (34 mer) (SEK Nr ID:16)
5'AAACCCGGGTTCTTTATTCTATACTTAAAAAGTG 3' i JCA292 (43 mer) (SEK Nr ID:17)
5'AAAAGAATTCGTCGACTACGATACAAACTTAACGGATATCGCG 3' w celu amplifikacji PCR 149 pz fragmentu. Fragment ten trawiono enzymami restrykcyjnymi
Smal i EcoRI w celu wyizolowania, po elektroforezie na żelu agarowym, 138 pz fragmentu restrykcyjnego Smal-EcoRI. Fragment ten połączono wówczas z plazmidem pC5L, najpierw trawionym przez Smal i EcoRI, żeby otrzymać plazmid pFC107.
Przykład 10: Konstruowanie rekombinowanego wirusa vCP1712
Reakcję PCR przeprowadzono stosując plazmid pFC105 (przykład 7) jako matrycę z nastę pują cymi oligonukleotydami:
FC110 (33 mer) (SEK Nr ID:18):
5'TTTTCGCGAACCGGAATTGCAGTCATGATTGGC 3' i FC111 (39 mer) (SEK Nr ID:19): 5'TTTTGTCGACGCGGCCGCTTAAGCGTGCACGTTCACGGA 3' w celu amplifikacji PCR okoł o 2079 pz fragmentu. Fragment ten trawiono enzymami restrykcji
Nrul i Sall w celu wyizolowania, po elektroforezie na żelu agarozowym, około 2068 pz fragmentu restrykcji Nrul-Sall. Fragment ten połączono następnie z plazmidem pFC107 (przykład 9), uprzednio strawiony przez enzymami restrykcyjnymi Nrul i Sall, w celu otrzymania plazmidu pFC108.
Plazmid pFC108 przeprowadzono za pomocą Notl w postać liniową, następnie transfekowano do pierwotnych komórek embrionalnych kurcząt zainfekowanych wirusem ospy kanarków (szczep ALVAC) zgodnie z wcześniej opisaną techniką precypitacji w fosforanie wapnia (Panicali i Paoletti Proc. Nat. Acad. Sci., 1982, 79, 4927-4931; Piccini i wsp., In Methods in Enzymology, 1987, 153, 545563, Red. R. Wu i L. Grossman Academic Press). Pozytywne łysinki selekcjonowano w oparciu o hybrydyzację ze znakowaną radioaktywnie sondą, swoistą dla nukleotydowej sekwencji glikoproteiny otoczki E. Łysinki te poddawano 4 kolejnym cyklom selekcji/oczyszczania łysinek, aż wyizolowano
PL 210 306 B1 czystą populację. Reprezentatywną łysinkę dla rekombinacji in vitro, pomiędzy plazmidem dawcą pFC108 a genomem wirusa ospy kanarków ALVAC, następnie amplifikowano, a szczep otrzymanego rekombinowanego wirusa oznaczono jako vCP1712.
Przykład 11: Konstruowanie rekombinowanego wirusa vCP1713
Plazmid pFC104 (przykład 6) trawiono enzymami restrykcyjnymi Sall i Pmll w celu izolowania, po elektroforezie na żelu agarowym, około 2213 pz fragmentu restrykcyjnego Pmll-Sall. Fragment ten połączono z plazmidem pFC107 (przykład 9), uprzednio trawionym przez enzymy restrykcyjne Nrul i Sall, w celu otrzymania plazmidu pFC109.
Plazmid pFC109 przeprowadzono za pomocą Notl w postać liniową, następnie transfekowano do pierwotnych komórek embrionalnych kurcząt zainfekowanych wirusem ospy kanarków (szczep ALVAC) zgodnie z wcześniej opisaną techniką z przykładu 10. Reprezentatywną łysinkę po rekombinacji in vitro, pomiędzy plazmidem-dawcą pFC109 a genomem wirusa ospy kanarków ALVAC selekcjonowano w oparciu o hybrydyzację ze znakowaną radioaktywnie sondą, swoistą dla nukleotydowej sekwencji glikoproteiny otoczki E, a następnie amplifikowano. Szczep otrzymanego rekombinowanego wirusa oznaczono jako vCP1713.
Przykład 12: Konstruowanie rekombinowanego wirusa vCP1714
Plazmid pFC103 (przykład 5) trawiono enzymami restrykcyjnymi Sall i Pmll w celu wyizolowania, po elektroforezie na żelu agarowym, około 1712 pz fragmentu restrykcyjnego Pmll-Sall. Fragment ten połączono z plazmidem pFC107 (przykład 9), najpierw trawionym przez enzymy restrykcyjne Nrul i Sall, żeby otrzymać plazmid pFC110.
Plazmid pFC110 przeprowadzono za pomocą Notl w postać liniową, następnie transfekowano do pierwotnych komórek embrionalnych kurcząt zainfekowanych wirusem ospy kanarków (szczep ALVAC) zgodnie z wcześniej opisaną techniką z przykładu 10. Reprezentatywną łysinkę po rekombinacji in vitro, pomiędzy plazmidem-dawcą pFC110 a genomem wirusa ospy kanarków ALVAC selekcjonowano w oparciu o hybrydyzację ze znakowaną radioaktywnie sondą, swoistą dla nukleotydowej sekwencji glikoproteiny otoczki E, a następnie amplifikowano. Szczep otrzymanego rekombinowanego wirusa oznaczono vCP1714.
Przykład 13: Konstruowanie rekombinowanego wirusa vCP1715
Plazmid pFC102 (przykład 4) trawiono enzymami restrykcyjnymi Sall i Pmll w celu wyizolowania, po elektroforezie na żelu agarowym, około 434 pz fragmentu restrykcyjnego Pmll-Sall. Fragment ten połączono z plazmidem pFC107 (przykład 9), uprzednio trawionym przez enzymy restrykcyjne Nrul i Sall, żeby otrzymać plazmid pFC111.
Plazmid pFC111 przeprowadzono za pomocą Notl w postać liniową, a następnie transfekowano do pierwotnych komórek embrionalnych kurcząt zainfekowanych wirusem ospy kanarków (szczep ALVAC) zgodnie z wcześniej opisaną techniką z przykładu 10. Reprezentatywną łysinkę po rekombinacji in vitro, pomiędzy plazmidem-dawcą pFC111 a genomem wirusa ospy kanarków ALVAC, selekcjonowano w oparciu o hybrydyzację ze znakowaną radioaktywnie sondą, swoistą dla nukleotydowej sekwencji glikoproteiny błonowej M, a następnie amplifikowano. Szczep otrzymanego rekombinowanego wirusa oznaczono jako vCP1715.
Przykład 14: Konstruowanie rekombinowanego wirusa vCP1716
Plazmid pFC101 (przykład 3) trawiono enzymami restrykcyjnymi Sall i Pmll w celu wyizolowania, po elektroforezie na żelu agarowym, około 484 pz fragmentu restrykcyjnego Pmll-Sall. Fragment ten połączono z plazmidem pFC107 (przykład 9), uprzednio trawionym przez enzymy restrykcyjne Nrul i Sall, tak aby otrzymać plazmid pFC112.
Plazmid pFC112 przeprowadzono za pomocą Notl w postać liniową, następnie transfekowano do pierwotnych komórek embrionalnych kurcząt zainfekowanych wirusem ospy kanarków (szczep ALVAC) zgodnie z wcześniej opisaną techniką z przykładu 10. Reprezentatywną łysinkę po rekombinacji in vitro, pomiędzy plazmidem-dawcą pFC112 a genomem wirusa ospy kanarków ALVAC, selekcjonowano w oparciu o hybrydyzację ze znakowaną radioaktywnie sondą, swoistą dla nukleotydowej sekwencji glikoproteiny przedbłonowej prM, a następnie amplifikowano. Szczep otrzymanego rekombinowanego wirusa oznaczono vCP1716.
Przykład 15: Konstruowanie plazmidu dawcy do insercji w miejscu C6 wirusa ospy kanarków ALVAC
Figura 4 z opisu patentowego WO-A-01/05934 przedstawia sekwencję fragmentu 3700 pz genomowego DNA wirusa ospy kanarków. Analiza tej sekwencji ujawniła otwartą ramkę odczytu (ORF), którą nazwano C6L, która zaczyna się w pozycji 377 a kończy się w pozycji 2254. Konstruowanie
PL 210 306 B1 plazmidu insercji prowadzącego do delecji ORF C6L i jego zastąpienie przez miejsce wielokrotnego klonowania oflankowanego sygnałami końca transkrypcji i transdukcji wykonano jak opisano poniżej.
Reakcję PCR przeprowadzono na podstawie matrycy utworzonej przez genomowy DNA wirusa ospy kanarków z następującymi oligonukleotydami:
C6A1 (42 mer) (SEK Nr ID:20):
5'ATCATCGAGCTCGCGGCCGCCTATCAAAAGTCTTAATGAGTT 3' i C6B1 (73 mer) (SEK Nr ID:21):
5'GAATTCCTCGAGCTGCAGCCCGGGTTTTTATAGCTAATTAGTCATTTTTTCGTAAGTAA GTATTTTTATTTAA 3' w celu wyizolowania fragmentu PCR z 432 pz (fragment D).
Reakcję PCR przeprowadzono na matrycy utworzonej przez genomowy DNA wirusa ospy kanarków z następującymi oligonukleotydami:
C6C1 (72 mer) (SEK Nr ID:22):
5'CCCGGGCTGCAGCTCGAGGAATTCTTTTTATTGATTAACTAGTCAAATGAGTATATATA
ATTGAAAAAGTAA 3' i C6D1 (45 mer) (SEK Nr ID:23):
5'GATGATGGTACCTTCATAAATACAAGTTTGATTAAACTTAAGTTG 3' w celu wyizolowania fragmentu PCR z 1210 pz (fragment E).
Fragmenty D i E wspólnie hybrydyzowano, żeby posłużyły za matrycę w reakcji PCR przeprowadzonej z oligonukleotydami C6A1 (SEK Nr ID:20) i C6D1 (SEK Nr ID:23) w celu wytworzenia fragmentu PCR o 1630 pz. Fragment ten trawiono enzymami restrykcyjnymi SacI i KpnI, w celu izolacji fragmentu Sacl-Kpnl z 1613 pz po elektroforezie na żelu agarowym. Fragment ten połączono z wektorem pBlueScript® II SK+ (Stratagene, La Jolla, CA, USA, nr kat. 212205), uprzednio trawionym przez enzymy restrykcyjne SacI i KpnI, żeby otrzymać plazmid pC6L. Sekwencje tego plazmidu zweryfikowano przez sekwencjonowanie. Plazmid ten zawiera sekwencję 370 pz umieszczoną powyżej ORF C6L („lewe ramię flankujące C6), sygnał przedwczesnego zatrzymania transkrypcji z wirusa krowianki, kodony stop w 6 fazach odczytu, miejsce wielokrotnego klonowania zawierające miejsca restrykcyjne Smal, Pstl, Xhol i EcoRI i w końcu 1156 pz sekwencji umieszczonych poniżej ORF C6L („prawe ramię flankujące C6).
Plazmid pMPIVC (J.F.C. Schmitt i wsp., J. Virol. 1988, 62, 1889-1897; R.K. Saiki i wsp., Science, 1988, 239, 487-491) zastosowano jako matrycę do amplifikacji kompletnej sekwencji promotora wirusa krowianki I3L z następującymi oligonukleotydami:
FC112 (33 mer) (SEK Nr ID:24):
5'AAACCCGGGCGGTGGTTTGCGATTCCGAAATCT 3' i FC113(43 mer) (SEK Nr ID:25):
5'AAAAGAATTCGGATCCGATTAAACCTAAATAATTGTACTTTGT 3' aby zamplifikować PCR 151 pz fragment. Fragment ten trawiono enzymami restrykcyjnymi
Smal i EcoRI w celu wyizolowania, po elektroforezie na żelu agarowym, fragmentu restrykcyjnego Smal-EcoRI o długości około 136 pz. Fragment ten połączono następnie z plazmidem pC6L, trawionym uprzednio przez Smal i EcoRI, żeby otrzymać plazmid pFC113.
Przykład 16: Konstruowanie rekombinowanych wirusów vCP1717 i vCP1718
Reakcję PCR przeprowadzono wykorzystując plazmid pFC106 (przykład 8) jako matrycę oraz następujące oligonukleotydy:
FC114 (33 mer) (SEK Nr ID:26):
5'TTTCACGTGATGTATAATGCTGATATGATTGAC 3' i FC115 (42 mer) (SEK Nr ID: 27):
5'TTTTGGATCCGCGGCCGCTTAACGTTTTCCCGAGGCGAAGTC 3' w celu amplifikacji PCR okoł o 2973 pz fragmentu. Fragment ten trawiono enzymami restrykcyjnymi Pmll i BamHI w celu wyizolowania, po elektroforezie na żelu agarozowym, około 2958 pz fragment restrykcyjny Pmll-BamHI (fragment F). Plazmid pFC113 (przykład 15) trawiono enzymami restrykcyjnymi Pmll i BamHI, żeby wyizolować, po elektroforezie na żelu agarowym, około 4500 pz fragment restrykcyjny Pmll-BamHI (fragment G). Fragmenty F i G następnie ligowano, aby docelowo otrzymać plazmid pFC114.
Plazmid pFC114 przeprowadzono za pomocą Notl w postać liniową, następnie transfekowano do pierwotnych komórek embrionalnych kurcząt zainfekowanych wirusem ospy kanarków vCP1713 (przykład 11) zgodnie z wcześniej opisaną techniką precypitacji w fosforanie wapnia (Panicali
PL 210 306 B1 i Paoletti Proc. Nat. Acad. Sci., 1982, 79, 4927-4931; Piccini i wsp., In Methods in Enzymology, 1987, 153, 545-563, wyd. R. Wu i L. Grossman Academic Press). Pozytywne łysinki selekcjonowano w oparciu o hybrydyzację ze znakowaną radioaktywnie sondą, swoistą dla nukleotydowej sekwencji glikoproteiny otoczki E. Łysinki te poddawano 4 kolejnym cyklom selekcji/oczyszczania łysinek, aż wyizolowano czystą populację. Reprezentatywną łysinkę po rekombinacji in vitro, pomiędzy plazmidem-dawcą pFC114 a genomem wirusa ospy kanarków ALVAC, następnie amplifikowano, a szczep otrzymanego rekombinowanego wirusa oznaczono jako vCP1717.
Plazmid pFC114 przeprowadzono za pomocą Notl w postać liniową, następnie transfekowano do pierwotnych komórek embrionalnych kurcząt zainfekowanych wirusem ospy kanarków vCP1712 (przykład 10) zgodnie z opisaną powyżej techniką. Szczep otrzymanego rekombinowanego wirusa oznaczono vCP1718.
Przykład 17: Konstruowanie plazmidu pFC115
Komplementarne DNA (cDNA) wirusa gorączki zachodniego Nilu NY99 syntetyzowano przy użyciu zestawu „Gene Amp RNA PCR Kit (nr kat. N8080017, Perkin-Elmer, Norwalk, CT 06859, USA) stosując warunki podane przez producenta.
Reakcję odwrotnej transkrypcji następującą po łańcuchowej reakcji polimerazy (RT-PCR) przeprowadzono z 50 μl zawiesiny wirusowego RNA wirusa gorączki zachodniego Nilu NY99 (przykład 2) i z następującymi oligonukleotydami:
FC116 (39 mer) (SEK Nr ID:28)
5' TTTTTTGATATCATGACCGGAATTGCAGTCATGATTGGC 3' i FC106 (33 mer) (SEK Nr ID:8).
Ta para oligonukleotydów umożliwia wprowadzenie miejsca restrykcji EcoRV i miejsca restrykcji Xbal, kodonu inicjatorowego na końcu 5' oraz kodonu stop na końcu 3' insertu.
Synteza pierwszej nici cDNA dokonuje się przez elongację oligonukleotydu FC106, po hybrydyzacji tego ostatniego na matrycy RNA.
Warunki syntezy pierwszej nici cDNA to temperatura 42°C przez 15 minut, następnie 99°C przez 5 minut i w końcu 4°C przez 5 minut. Warunki reakcji PCR w obecności pary oligonukleotydów FC106 i FC116 to temperatura 95°C przez 2 minuty, następnie 35 cykli (95°C przez 1 minutę, następnie 62°C przez 1 minutę i 72°C przez 2 minuty) i w końcu 72°C przez 7 minut do wytworzenia fragmentu 2079 pz.
Fragment ten jest trawiony przez EcoRV, następnie przez Xbal, w celu izolacji fragmentu EcoRV-Xbal z około 2061 pz po elektroforezie na żelu agarowym.
Fragment ten połączono z plazmidem ekspresyjnym pVR1012, uprzednio trawionym przez Xbal i EcoRV, aby otrzymać plazmid pFC115 (6956 pz). Plazmid ten zawiera, pod kontrolą wczesnego promotora ludzkiego cytomegalowirusa lub hCMV-IE (human Cytomegalovirus Immediate Early), insert kodujący poliproteinę prM-M-E.
Przykład 18: Konstruowanie rekombinowanych wirusów vCP2017
Reakcję PCR przeprowadzono stosując plazmid pFC115 (przykład 17) jako matrycę i następujące oligonukleotydy:
FC117 (36 mer) (nr ID Sek:29):
5' TTTTCGCGAATGACCGGAATTGCAGTCATGATTGGC 3' i FC111 (39 mer) (nr ID Sek:19) w celu amplifikacji PCR około 2082 pz fragmentu. Fragment ten trawiono enzymami restrykcyjnymi Nrul i Sall w celu wyizolowania, po elektroforezie na żelu agarowym, około 2071 pz fragmentu restrykcyjnego Nrul-Sall. Fragment ten następnie ligowano z plazmidem pFC107 (przykład 9), najpierw trawionym enzymami restrykcji Nrul i Sall, w celu uzyskania plazmidu pFC116.
Plazmid pFC116 przeprowadzono za pomocą Notl w postać liniową, następnie transfekowano do pierwotnych komórek embrionalnych kurcząt zainfekowanych wirusem ospy kanarków (szczep ALVAC) zgodnie z techniką z przykładu 10. Reprezentatywną łysinkę po rekombinacji in vitro, pomiędzy plazmidem-dawcą pFC116 a genomem wirusa ospy kanarków ALVAC, selekcjonowano w oparciu o hybrydyzację ze znakowaną radioaktywnie sondą, swoistą dla nukleotydowej sekwencji glikoproteiny otoczki E, a następnie amplifikowano. Szczep otrzymanego rekombinowanego wirusa oznaczono jako vCP2017.
PL 210 306 B1
Przykład 19: Wytwarzanie rekombinowanych szczepionek
W celu wytworzenia szczepionki dla koni rekombinowany wirus ospy kanarków vCP1712 (przykład 10) dodano do roztworów karbomeru, to znaczy Carbopol™ 974P, wyprodukowanego przez BF Goodrich, Ohio, USA (masa cząsteczkowa około 3000000).
Roztwór podstawowy 1,5% Carbopolu™ 974P jest początkowo przygotowywany w wodzie destylowanej, zawierającej 1 g/l chlorku sodu. Ten roztwór podstawowy jest wówczas stosowany do przygotowania roztworu 4 mg/ml Carbopolu™ 974P w soli fizjologicznej. Roztwór podstawowy zmieszano z odpowiednią objętością soli fizjologicznej, bądź w pojedynczym etapie, bądź w kolejnych wielu etapach, w każdym etapie regulowano wartość pH roztworem wodorotlenku sodu 1N (lub jeszcze bardziej stężonym), żeby otrzymać końcową wartość pH 7,3-7,4.
Otrzymany w ten sposób gotowy do użycia roztwór Carbopolu™ 974P stosowano do rekonstytucji rekombinowanego liofilizowanego wirusa lub do rozcieńczania stężonych roztworów podstawowych rekombinowanego wirusa. Na przykład, żeby otrzymać wirusową zawiesinę, zawierającą 108 pfu na 1 ml dawki, rozcieńczano podstawowy roztwór wirusowy w taki sposób, żeby otrzymać miano 108,3 pfu/ml, dalej rozcieńczano w równych częściach wspomniany gotowy do użycia roztwór Carbopolu™ 974P do 4 mg/ml.
Rekombinowane szczepionki mogą również być wytwarzane z rekombinowanymi wirusami ospy kanarków vCP1713 (przykład 11), lub vCP1717 (przykład 16), lub vCP1718 (przykład 16) lub vCP2017 (przykład 18), lub mieszaniną trzech wirusów ospy kanarków vCP1714 (przykład 12), vCP1715 (przykład 13) i vCP1716 (przykład 14) zgodnie z techniką opisaną powyżej.
Przykład 20: Wytwarzanie szczepionek DNA dla koni
Roztwór DNA zawierający plazmid pFC104 (przykład 6) zatężano poprzez precypitację etanolem jak opisano w Sambrook i wsp. (1989). Osad DNA jest ponownie umieszczany w 0,9% roztworze NaCl tak, żeby otrzymać stężenie 1 mg/ml. 0,75 mM roztwór DMRIE-DOPE przygotowano przez rekonstytucję liofilizatu DMRIE-DOPE przez odpowiednią objętość sterylnej H2O.
Tworzenie kompleksów plazmidowy DNA-lipid realizowano przez rozcieńczenie w równych częściach 0,75 mM roztworu DMRIE-DOPE (1:1) roztworem 1 mg/ml DNA w 0,9% NaCl. Roztwór DNA stopniowo wprowadzano przy pomocy oprawionej igły 26G wzdłuż ścianki flakonu zawierającego roztwór kationowego lipidu tak, żeby uniknąć tworzenia się piany. Przystąpiono do łagodnego mieszania od chwili, gdy zmieszano te dwa roztwory. Na koniec otrzymano kompozycję obejmującą 0,375 mM DMRIE-DOPE i 500 μg/ml plazmidu.
Pożądane jest, żeby wszystkie ze stosowanych roztworów były w temperaturze otoczenia dla wszystkich z opisanych powyżej zabiegów. Pozwolono na chelatowanie DNA/DMRIE-DOPE w miejscu o temperaturze pokojowej przez 30 minut przed przystąpieniem do immunizacji zwierząt.
Szczepionki DNA mogą być również wytwarzane z roztworami DNA zawierającymi plazmidy pFC104 (przykład 6) i pFC106 (przykład 8), lub zawierającymi plazmidy pFC105 (przykład 7) i pFC106, plazmidy pFC115 (przykład 17) i pFC106, lub zawierającymi plazmidy pFC101, pFC102 i pFC103 (przykłady od 3 do 5), lub zawierającymi plazmid pFC105 lub pFC115 zgodnie z techniką opisaną w niniejszym przykładzie.
Przykład 21: Testy ekspresji in vitro
Ekspresję białek WN testowano dla każdego układu klasycznymi metodami immunofluorescencji pośredniej i Western Blot.
Testy wykonywano na 96 studzienkowych płytkach, zawierających komórki CHO hodowane w monowarstwach i transfekowane plazmidami lub zawierających komórki CEF hodowane w monowarstwach i zakażone rekombinowanymi wirusami.
Białka WN wykrywano stosując surowice zakażonych koni lub kurcząt i znakowane surowice odpornościowe.
Wielkość fragmentów otrzymanych po migracji na żelu agarowym porównywano z wielkościami oczekiwanymi.
Przykład 22: Skuteczność na zwierzętach
Szczepionki rekombinowane i szczepionki plazmidowe wstrzykiwano dwukrotnie, w odstępie około dwóch tygodni, uprzednio nie szczepionym kurczętom SPF (SPF - wolne od specyficznego patogenu), w wieku około 7 dni, drogą domięśniową, w objętości około 0,1 ml. Kontrolną grupę nie szczepioną włączono do badania.
Kurczęta poddawano testowi prowokacji przez podanie podskórne w szyję 103-4TCID50 (50-procentowa dawka infekcyjna dla hodowli komórkowej) patogennego wirusa.
PL 210 306 B1
Z jednej strony zaobserwowano wiremię, odpowiedź w przeciwciałach, jak również śmiertelność. Wykonano autopsje w celu obserwacji wytworzonych uszkodzeń.
Przykład 23: Mianowanie przeciwciał neutralizujących anty-WNV.
Dla każdej surowicy wykonano serie rozcieńczeń ze stosunkiem 3 na podłożu DMEM zmieszanym z 10% płodową surowicą bydlęcą w 96 studzienkowych płytkach do hodowli komórkowej. Do 0,05 ml rozcieńczonej surowicy dodano 0,05 ml podłoża hodowlanego zawierającego w przybliżeniu 100 DICC50/ml WNV. Mieszaninę tą inkubowano przez 2 godziny w 37°C w termostacie w atmosferze zawierającej 5% CO2.
0,15 ml zawiesiny komórek VERO, zawierającej około 100000 komórek na ml dodano następnie do każdej mieszaniny. Efekt cytopatyczny (ECP) obserwowano pod mikroskopem fazowokontrastowym po 4-5 dniach hodowli w 37°C w atmosferze zawierającej 5% CO2. Miana neutralizujące każdej surowicy obliczano metodą Karbera. Miana otrzymano w postaci najwyższego rozcieńczenia hamującego efekt cytopatyczny w 50% studzienek. Miana wyrażono jako log10 VN50. Każdą surowicę mianowano co najmniej dwa razy, korzystnie cztery razy.
Przykład 24: Próba vCP2017 na koniach.
Szczepionki rekombinowane zawierające vCP2017 (przykład 18) przygotowane bezpośrednio przed podaniem z 1 ml adiuwanta Carbopol® 974P (4 mg/ml) wstrzykiwano dwukrotnie, w odstępie 35 dni, uprzednio nie szczepionym koniom w wieku powyżej 3 miesięcy, drogą domięśniową w objętości około 1 ml. Zaszczepiono trzy grupy zwierząt dawkami 105,8 DICC50 (to jest 105,64 pfu) dla grupy 1, 106,8 DICC50 (to jest 106,64 pfu) dla grupy 2 i 107,8 DICC50 (to jest 107,64 pfu) dla grupy 3. Nie szczepioną grupę kontrolną włączono do badania.
Obserwowano parametry serologiczne. Ustalono miana przeciwciał neutralizujących i wyrażono jako log10 VN50 jak wskazano w przykładzie 23.
Grupa Miana w dniu 0 Miana w dniu 35 Miana w dniu 49
1 <0,6 <0,78 2,66
2 <0,6 1,14 2,58
3 <0,6 1,16 2,26
kontrolna <0,6 <0,6 <0,6
PL 210 306 B1 < 11 0 >
< 120 >
<130>
<160>
<170> <210> <21i> 12> 13>
20> 23> C0>
Μ Μ Μ Μ Ο Bl + W Μ U U U (Ό ω rt + Μ Μ MMMM o a + W Μ ΙΌ ΙΌ
Lista sekwencji
Merial
Kompozycja szczepionkowa do indukcji zabezpieczającej odpowiedzi immunologicznej przed wirusem zachodniego Nilu (WNV)
ΧΧΧΧ
Patentln wersja 3.1 1
DNA
S z t u c z n ci oligonukleotyd ttttgaat tcgttaccct ctctaacttc
10> 2 11> 33
12> DNA 13> Sztuczna
20>
23> oligonukleotyd 0G> 2 tttttcta gattacctcc gactgcgtct tga
10> 3 il> 40 12> DNA 13> Sztuczna
20>
23> oligonukleotyd 00> 3 tctgcagc acgtgtctag aggatatcga attcgcggcc
<2 10 > 4
<211> 40
<212 > DNA
<213 > Sztuczna
PL 210 306 B1
- 21 Ο > 9 <211> 36 <212 > DNA
PL 210 306 B1 <213> Sztuczna <220>
<223> oligonukleotyd <400> 9 ttttttgata tcaccggaat tgcagtcatg attggc 36 <210> 10 <211> 36 <212> DNA <213> Sztuczna <220>
<223> oligonukleotyd <400> 10 ttttttgata tcatgtataa tgctgatatg attgac 36 <210> 11 <211> 36 <212> DNA <213> Sztuczna <220>
<223> oligonukleotyd <400> 11 tttttttcta gattaacgtt ttcccgaggc gaagtc 36 <210> 12 <211> 42 <212> DNA <213> Sztuczna <220>
<223> oligonukleotyd <400> 12 atcatcgagc tccagctgta attcatggtc gaaaagaagt qc 42 <210> 13 <211> 73 <212> DNA <213> Sztuczna <220>
<223> oligonukleotyd <400> 13 gaattcctcg agctgcagcc cgggttttta tagctaatta gtcatttttt gagtacca
PL 210 306 B1 cttcagctac ctc <210> 14 <211> 72 <212> DNA <213> Sztuczna <220>
<223> oligonukleotyd <400> 14 cccgggctgc agctcgagga attcttttta ttgattaact agtcattata aagatctaaa 60 atgcataatt tc <210> 15 <211> 45 <212> DNA <213> Sztuczna <220>
<223> oligonukleotyd <400> 15 gatgatggta ccgtaaacaa atataatgaa aagtattcta aacta 45 <210> 16 <211> 34 <212> DNA <213> Sztuczna <220>
<223> oligonukleotyd <400> 16 aaacccgggt tctttattct atacttaaaa agtg <210> 17 <211> 43 <212> DNA <213> Sztuczna <220>
<223> oligonukleotyd <400> 17 aaaagaattc gtcgactacg atacaaactt aacggatatc gcg 43 <210> 18 <211> 33 <212> DNA
PL 210 306 B1 <213> Sztuczna <220>
<223> oligonukleotyd <400> 18 ttttcgcgaa ccggaattgc agtcatgatt ggc 33 <210>
<211>
<212>
<213>
DNA
Sztuczna <220>
<223> Oligonucleotide FC111 used in PCR reaction <400> 19 ttttgtcgac gcggccgctt aagcgtgcac gttcacgga 39 <210>
<211>
<212>
<213>
DNA
Sztuczna <220>
<223> oligonukleotyd <400> 20 atcatcgagc tcgcggccgc ctatcaaaag tcttaatgag tt 42 <210>
<211>
<212>
<213>
DNA
Sztuczna <220>
<223>
<400>
oligonukleotyd gaattcctcg agctgcagcc cgggttttta tagctaatta gtcatttttt cgtaagtaag 60 tatttttatt taa <210>
<211>
<212>
<213>
DNA
Sztuczna <220>
<223> oligonukleotyd
PL 210 306 B1 <400> 22 cccgggctgc agctcgagga attcttttta ttgattaact agtcaaatga gtatatataa 60 ttgaaaaagt aa <210>
<211>
<212>
<213>
DNA
Sztuczna <220>
<223> oligonukleotyd <400> 23 gatgatggta ccttcataaa tacaagtttg attaaactta agttg 45 <210>
<211>
<212>
<213>
DNA
Sztuczna <220>
<223 > oligonukleotyd <400> 24 aaacccgggc ggtggtttgc gattccgaaa tct 33 <210> 25 <211> 43 <212> <213>
DNA
Sztuczna <220>
<223> oligonukleotyd <400> 25 aaaagaattc ggatccgatt aaacctaaat aattgtactt tgt 43 <210>
<211>
<212>
DNA <213> Sztuczna <220>
<223> oligonukleotyd <400> 26 tttcacgtga tgtataatgc tgatatgatt gac 33
PL 210 306 B1
<21O> 27
<211> 42
<212> DNA
<213> Sztuczna
< 2 2 C >
<22 3 > oligonukłeotyd
<400> 27
ttttggatcc gcggccgctt aacgttttcc cgaggcgaag cc 42
<2 10> 28
<211> 39
< 212 > DNA
< 213 > Sztuczny oligonukłeotyd
<4 00> 28
111111 39 gata tcatgaccgg aattgcagtc atgattggc
< 21C > 29
<2 11 > 36
< 212 > DNA
< 212 > Sztuczny oligonukłeotyd
<4C0> 2 9
1111 cg cgaa tgaccggaat tgcagtcatg attggc

Claims (17)

1. Kompozycja szczepionkowa do indukcji zabezpieczającej odpowiedzi immunologicznej przed wirusem zachodniego Nilu (WNV) u zwierząt podatnych na WNV, znamienna tym, że obejmuje wektor zawierający rekombinowany wirus lub plazmid DNA, który koduje i wyraża in vivo u zwierzęcia WNV E; WNV prM i E; WNV M i E; WNV prM, WNV M i E, poliproteinę prM-E z WNV, poliproteinę M-E z WNV, lub poliproteinę prM-M-E WNV, przy czym gdy wirus jest wirusem ospy ptaków wyrażane białko jest inne niż poliproteina prM-M-E z WNV.
2. Kompozycja szczepionkowa według zastrz. 1, znamienna tym, że rekombinowany wirus jest rekombinowanym adenowirusem, herpeswirusem lub pokswirusem.
3. Kompozycja szczepionkowa według zastrz. 2, znamienna tym, że rekombinowany wirus jest rekombinowanym wirusem ospy.
4. Kompozycja szczepionkowa według zastrz. 3, znamienna tym, że rekombinowany wirus ospy jest rekombinowanym wirusem ospy ptaków.
5. Kompozycja szczepionkowa według zastrz. 4, znamienna tym, że rekombinowany wirus ospy ptaków jest rekombinowanym wirusem ospy kanarków lub wirusem ospy drobiu.
6. Kompozycja szczepionkowa według zastrz. 5, znamienna tym, że wirusem ospy kanarków jest ALVAC a wirusem ospy drobiu jest TROVAC.
7. Kompozycja szczepionkowa według zastrz. 1 albo 5, albo 6, znamienna tym, że cząsteczka kwasu nukleinowego obejmuje ramkę odczytu kodująca poliproteinę prM-M-E.
8. Kompozycja szczepionkowa według zastrz. 1, znamienna tym, że cząsteczka kwasu nukleinowego obejmuje nukleotydy 466-741, 742-966 i 967-2469 z GenBank AF196825 (SEKW ID NR: 66) kodujące odpowiednio WNV prM, M i E.
9. Kompozycja szczepionkowa według zastrz. 1, znamienna tym, że cząsteczka kwasu nukleinowego obejmuje nukleotydy 466-2469 z GenBank AF196835 (SEKW ID NR: 66) kodujące białko prM-M-E z WNV.
10. Kompozycja szczepionkowa według zastrz. 1, znamienna tym, że cząsteczka kwasu nukleinowego obejmuje nukleotydy 421-2469 z GenBank AF196835 (SEKW ID NR: 66) kodujące białko prM-M-E z WNV oraz peptyd sygnalny z prM.
11. Kompozycja szczepionkowa według zastrz. 1, znamienna tym, że ponadto obejmuje adiuwant.
12. Kompozycja szczepionkowa według zastrz. 11, znamienna tym, że adiuwantem jest karbomer.
13. Kompozycja szczepionkowa według zastrz. 1, znamienna tym, że ponadto obejmuje antygen lub immunogen lub epitop z patogenu zwierzęcia inny niż WNV lub wektor, który zawiera i wyraża in vivo cząsteczkę kwasu nukleinowego kodującą antygen, immunogen lub epitop patogenu lub inaktywowany lub atenuowany patogen zwierzęcia inny niż WNV.
14. Kompozycja szczepionkowa według zastrz. 1, znamienna tym, że zwierzęciem jest kot lub koń.
15. Kompozycja szczepionkowa według zastrz. 1, znamienna tym, że obejmuje wektor obejmujący rekombinowany wirus lub plazmidowy DNA, który koduje i wyraża in vivo w zwierzęciu poliproteinę prM-M-E z WNV.
16. Zastosowanie kompozycji szczepionkowej jak określonej w zastrz 1-15 do wytwarzania szczepionki do indukcji zabezpieczającej odpowiedzi immunologicznej przed wirusem zachodniego Nilu (WNV) u zwierząt podatnych na WNV.
17. Zastosowanie według zastrz. 16, znamienne tym, że zwierzęciem jest kot lub koń.
PL391444A 2001-04-06 2002-04-05 Kompozycja szczepionkowa do indukcji zabezpieczającej odpowiedzi immunologicznej przed wirusem zachodniego Nilu (WNV) PL210306B1 (pl)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR0104737A FR2823222B1 (fr) 2001-04-06 2001-04-06 Vaccin contre le virus de la fievre du nil

Publications (1)

Publication Number Publication Date
PL210306B1 true PL210306B1 (pl) 2011-12-30

Family

ID=8862055

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL365210A PL207584B1 (pl) 2001-04-06 2002-04-05 Szczepionka do ochrony koni, psów, kotów, bydła, świń oraz ptaków przed wirusem zachodniego Nilu (WN)
PL391444A PL210306B1 (pl) 2001-04-06 2002-04-05 Kompozycja szczepionkowa do indukcji zabezpieczającej odpowiedzi immunologicznej przed wirusem zachodniego Nilu (WNV)

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL365210A PL207584B1 (pl) 2001-04-06 2002-04-05 Szczepionka do ochrony koni, psów, kotów, bydła, świń oraz ptaków przed wirusem zachodniego Nilu (WN)

Country Status (22)

Country Link
EP (2) EP1377660B1 (pl)
JP (1) JP4426761B2 (pl)
AU (1) AU2002307971B2 (pl)
BE (1) BE2016C021I2 (pl)
BR (1) BRPI0208896B1 (pl)
CA (1) CA2448796C (pl)
CY (2) CY1117676T1 (pl)
DK (1) DK1377660T3 (pl)
ES (2) ES2566044T3 (pl)
FR (2) FR2823222B1 (pl)
HK (2) HK1061868A1 (pl)
HU (2) HU230122B1 (pl)
IL (3) IL158204A0 (pl)
LT (1) LTC1377660I2 (pl)
LU (1) LU93048I2 (pl)
MX (1) MXPA03008998A (pl)
NL (1) NL300806I2 (pl)
PL (2) PL207584B1 (pl)
RU (1) RU2283138C2 (pl)
SI (1) SI1377660T1 (pl)
WO (1) WO2002081621A2 (pl)
ZA (1) ZA200307620B (pl)

Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2004521867A (ja) 2000-10-27 2004-07-22 イミュノ−アールエックス， インコーポレイテッド 免疫抑制された患者のためのワクチン免疫療法
MXPA04000680A (es) 2001-07-27 2004-04-05 Wyeth Corp Vacuna para virus west nile.
AU2003296974A1 (en) * 2002-12-13 2004-07-14 Aventis Pasteur, Inc. Production of alvac on avian embryonic stem cells
WO2004112694A2 (en) 2003-05-23 2004-12-29 Chiron Corporation Immunogenic reagents from west nile virus
CA2582534A1 (en) 2004-09-09 2006-03-16 Research Development Foundation Flavivirus variants having phenotypic variation and immunogenic compositions thereof
PT2251034T (pt) 2005-12-02 2018-05-22 Icahn School Med Mount Sinai Vírus da doença de newcastle quiméricos que apresentam proteínas de superfície não nativas e suas utilizações
MX2011002071A (es) 2008-08-29 2011-04-05 Boehringer Ingelheim Vetmed Vacuna para el virus del nilo occidental.
WO2010091262A1 (en) 2009-02-05 2010-08-12 Mount Sinai School Of Medicine Of New York University Chimeric newcastle disease viruses and uses thereof
EP2411049B1 (en) 2009-03-27 2020-01-15 Academia Sinica Methods and compositions for immunization against virus
AU2010248761B2 (en) * 2009-05-15 2016-02-11 Irx Therapeutics, Inc. Vaccine immunotherapy
TWI537385B (zh) 2010-11-04 2016-06-11 中央研究院 產生具簡單醣基化之表面蛋白質之病毒顆粒的方法
RU2506093C1 (ru) * 2012-12-06 2014-02-10 Государственное научное учреждение Якутский научно-исследовательский институт сельского хозяйства Российской академии сельскохозяйственных наук Способ специфической профилактики ринопневмонии, сальмонеллезного аборта и мыта лошадей ассоциированной вакциной в условиях табунного содержания
BR112015021414B1 (pt) 2013-03-14 2020-11-10 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai vírus da doença newcastle e seus usos
WO2015127501A1 (en) 2014-02-27 2015-09-03 Viralytics Limited Combination method for treatment of cancer

Family Cites Families (36)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2909462A (en) 1955-12-08 1959-10-20 Bristol Myers Co Acrylic acid polymer laxative compositions
US5110587A (en) 1981-12-24 1992-05-05 Health Research, Incorporated Immunogenic composition comprising synthetically modified vaccinia virus
US5505941A (en) 1981-12-24 1996-04-09 Health Research, Inc. Recombinant avipox virus and method to induce an immune response
US5174993A (en) 1981-12-24 1992-12-29 Health Research Inc. Recombinant avipox virus and immunological use thereof
US4769330A (en) 1981-12-24 1988-09-06 Health Research, Incorporated Modified vaccinia virus and methods for making and using the same
US5338683A (en) 1981-12-24 1994-08-16 Health Research Incorporated Vaccinia virus containing DNA sequences encoding herpesvirus glycoproteins
US4722848A (en) 1982-12-08 1988-02-02 Health Research, Incorporated Method for immunizing animals with synthetically modified vaccinia virus
US4603112A (en) 1981-12-24 1986-07-29 Health Research, Incorporated Modified vaccinia virus
US4745051A (en) 1983-05-27 1988-05-17 The Texas A&M University System Method for producing a recombinant baculovirus expression vector
EP0173552B1 (en) 1984-08-24 1991-10-09 The Upjohn Company Recombinant dna compounds and the expression of polypeptides such as tpa
US5168062A (en) 1985-01-30 1992-12-01 University Of Iowa Research Foundation Transfer vectors and microorganisms containing human cytomegalovirus immediate-early promoter-regulatory DNA sequence
US4963481A (en) 1985-12-18 1990-10-16 Genetics Institute Inc Promoter system
US4968615A (en) 1985-12-18 1990-11-06 Ciba-Geigy Corporation Deoxyribonucleic acid segment from a virus
GB2197321B (en) 1986-09-12 1990-10-03 Genentech Inc Method and vectors for obtaining continuous production of heterologous protein in a eukaryotic host cell line
DE3743138A1 (de) 1987-12-18 1989-09-14 Mayr Christian Gmbh & Co Kg Schleifringlose, elektromagnetische ueberlastkupplung
MY109299A (en) * 1990-08-15 1996-12-31 Virogenetics Corp Recombinant pox virus encoding flaviviral structural proteins
US5843456A (en) 1991-03-07 1998-12-01 Virogenetics Corporation Alvac poxvirus-rabies compositions and combination compositions and uses
KR100242671B1 (ko) 1991-03-07 2000-03-02 고돈 에릭 유전학적으로 처리한 백신 균주
US5382425A (en) 1992-01-13 1995-01-17 Syntro Corporation Recombinant swinepox virus
FR2702373B1 (fr) 1993-03-08 1996-06-07 Rhone Merieux Emulsions vaccinales fluides eau-dans-l'huile contenant une huile métabolisable.
EP0668355B1 (en) 1993-12-20 1999-04-07 Akzo Nobel N.V. Vaccine for the protection of horses against equine herpesvirus infection
FR2728795B1 (fr) 1994-12-30 1997-03-21 Rhone Merieux Vaccin vivant recombinant aviaire, utilisant comme vecteur un virus herpes aviaire
FR2728794B1 (fr) 1994-12-30 1997-03-21 Rhone Merieux Vaccin recombinant aviaire a base de virus herpes aviaire, notamment contre la maladie de gumboro
EP0826063A1 (en) 1995-04-25 1998-03-04 Vical Incorporated Single-vial formulations of dna/lipid complexes
DE69740033D1 (de) 1996-07-03 2010-12-09 Merial Inc Rekombinanter hunde-adenovirus 2 (cav2), welcher exogene dna enthält
FR2751227B1 (fr) 1996-07-19 1998-11-27 Rhone Merieux Formule de vaccin polynucleotidique contre les pathologies canines, notamment les pathologies respiratoires et digestives
FR2751225B1 (fr) 1996-07-19 1998-11-27 Rhone Merieux Formule de vaccin polynucleotidique aviaire
FR2751226B1 (fr) 1996-07-19 1998-11-27 Rhone Merieux Formule de vaccin polynucleotidique contre les pathologies du cheval
ATE292980T1 (de) 1996-10-11 2005-04-15 Univ California Immunostimulierende oligonucleotidekonjugate
CZ300172B6 (cs) * 1997-02-28 2009-03-04 Acambis Inc. Chimerický živý, infekcní, oslabený virus, lécivopro prevenci nebo lécbu flavivirových infekcí s jeho obsahem a molekula nukleové kyseliny jej kódující
US7227011B2 (en) * 1998-06-04 2007-06-05 United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, Centers For Disease Control And Prevention Nucleic acid vaccines for prevention of flavivirus infection
US6294176B1 (en) 1998-07-10 2001-09-25 Schering-Plough Veterinary Corp. Recombinant raccoonpox virus and uses thereof as a vaccine in mammalian and avian species
US6416763B1 (en) * 1998-08-28 2002-07-09 Hawaii Biotechnology Group, Inc. Recombinant nonstructural protein subunit vaccine against flaviviral infection
US6645740B1 (en) 1999-06-10 2003-11-11 Merial Limited Nucleic acids encodings equine GM-CSF
JP2003502345A (ja) 1999-06-10 2003-01-21 メリアル ペットまたはスポ−ツ用動物のためのｄｎａワクチン
FR2796397B1 (fr) 1999-07-16 2006-09-01 Merial Sas Genes de calicivirus felin et vaccins notamment vaccins recombines

Also Published As

Publication number Publication date
HK1061868A1 (zh) 2004-10-08
BR0208896A (pt) 2004-07-20
IL158204A0 (en) 2004-05-12
EP1377660B1 (fr) 2016-01-13
JP4426761B2 (ja) 2010-03-03
HUS1500047I1 (hu) 2017-03-28
RU2003132455A (ru) 2005-04-27
EP1377660A2 (fr) 2004-01-07
FR2823222A1 (fr) 2002-10-11
FR2823222B1 (fr) 2004-02-06
HU230122B1 (hu) 2015-08-28
WO2002081621A3 (fr) 2003-02-20
HUP0401868A2 (hu) 2004-12-28
PL365210A1 (pl) 2004-12-27
ZA200307620B (en) 2005-07-27
ES2566044T3 (es) 2016-04-08
RU2283138C2 (ru) 2006-09-10
CA2448796A1 (en) 2002-10-17
WO2002081621A2 (fr) 2002-10-17
DK1377660T3 (en) 2016-03-29
MXPA03008998A (es) 2004-10-15
IL185263A0 (en) 2008-01-06
NL300806I2 (pl) 2016-06-09
CY2016018I1 (el) 2016-12-14
HUP0401868A3 (en) 2011-06-28
FR16C0014I1 (pl) 2016-05-27
AU2002307971B2 (en) 2008-01-17
EP2979705A1 (fr) 2016-02-03
PL207584B1 (pl) 2011-01-31
ES2767413T3 (es) 2020-06-17
CY1117676T1 (el) 2016-12-14
CA2448796C (en) 2012-11-20
CY2016018I2 (el) 2016-12-14
EP2979705B1 (fr) 2019-10-23
IL158204A (en) 2013-03-24
LU93048I2 (fr) 2016-06-27
LTC1377660I2 (lt) 2017-04-25
JP2004531521A (ja) 2004-10-14
SI1377660T1 (sl) 2016-05-31
BRPI0208896B1 (pt) 2016-06-07
FR16C0014I2 (fr) 2016-09-09
HK1219412A1 (zh) 2017-04-07
BE2016C021I2 (pl) 2021-03-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US8535682B2 (en) Recombinant vaccine against West Nile Virus
TWI399213B (zh) 抗藍舌病病毒之重組疫苗
KR102526219B1 (ko) Ｆｍｄｖ 재조합 백신 및 이의 용도
US20030104008A1 (en) Recombinant vaccine against west nile virus
JP2009528361A (ja) マイコプラズマ・ハイオニューモニエワクチン
ES2767413T3 (es) Vacuna contra el virus de la fiebre del Nilo
JP2018529718A (ja) イヌパルボウイルス（ｃｐｖ）ウイルス様粒子（ｖｌｐ）ワクチン及びその使用
US20140120133A1 (en) Vaccine Against African Horse Sickness Virus
US20040037848A1 (en) Recombinant vaccine against West Nile Virus
WO2008097267A2 (en) Vaccines against vesicular stomatitis
US20050031641A1 (en) Recombinant vaccine against West Nile Virus
BRPI0210229B1 (pt) kit de vacinação, usos de plasmídeos e uso de vetores virais