ES2767413T3 - Vacuna contra el virus de la fiebre del Nilo - Google Patents

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Abstract

Un vector de expresión que comprende: - un polinucleótido, en el que el polinucleótido codifica las proteínas prM, M y E del virus de la fiebre del Nilo (WN), y - los elementos necesarios para la expresión del polinucleótido en la célula hospedadora, en el que el vector es un vector vírico, siendo el vector vírico un virus de viruela del canario o de la viruela aviar.

Description

DESCRIPCIÓN
Vacuna contra el virus de la fiebre del Nilo
Sector de la técnica
La presente invención tiene por objeto vectores de expresión in vivo e in vitro que comprenden un polinucleótido en el que el polinucleótido codifica las proteínas PrM, M y E del virus de la fiebre del Nilo (Wn , siglas del inglés West Nile, Nilo occidental), y los elementos necesarios para la expresión del polinucleótido en la célula hospedadora, en el que el vector es un vector vírico, siendo el vector vírico un virus de la viruela del canario (canarypox) o de la viruela aviar (fowlpox), así como composiciones inmunógenas y vacunas contra la fiebre del Nilo y que comprenden dicho vector de expresión.
También tiene por objeto un procedimiento de preparación de dicha composición, así como dicho vector de expresión para su uso en métodos de inmunización y de vacunación contra ese virus.
Estado de la técnica
El virus de la fiebre del Nilo (en inglés West Nile Virus o WNV), se identificó por primera vez en el hombre en 1937 en Uganda, en la provincia del Nilo Occidental (Zeller H. G., Med. Trop., 1999, 59, 490-494).
Muy extendido en África, y encontrado también en la India, en Pakistán y en la cuenca mediterránea, se ha identificado en los EE.UU. por primera vez en la ciudad de Nueva York en 1999 (Anderson J. F. y col., Science, 1999, 286, 2331 -2333).
El virus de la fiebre del Nilo afecta tanto a las aves como a los mamíferos y al hombre.
En las aves, la enfermedad se caracteriza por afectación al sistema nervioso central y producir la muerte. Las lesiones incluyen encefalitis, hemorragias en el miocardio y hemorragias y necrosis en el tracto intestinal.
En los pollos, infecciones experimentales por inoculaciones subcutáneas del virus de la fiebre del Nilo aislados en cornejas, han conllevado a necrosis del miocardio, nefritis y neumonías de 5 a 10 días después de la inoculación y encefalitis, moderadas a graves, 21 días después de la inoculación (Senne D. A. y col., Avian Disease, 2000, 44, 642­ 649).
El virus de la fiebre del Nilo afecta también a los caballos, especialmente en África del Norte y en Europa (Cantile C. y col., Equine Vet. J., 2000, 32(1), 31-35). Estos caballos muestran signos de ataxia, debilidad de las extremidades posteriores, paresia que evoluciona hacia tetraplejia y muerte. Los caballos y los camélidos son los principales animales que manifiestan signos clínicos en forma de encefalitis.
Se han detectado anticuerpos anti-WNV en algunos roedores, en el ganado, especialmente en bovinos y ovinos, animales domésticos, especialmente el perro (Zeller H. G., Med. Trop., 1999, 59, 490-494; Lundstrom J. O., Journal of Vector Ecology, 1999. 24(1). 1-39).
La especie humana no se salva del virus de la fiebre del Nilo, con numerosos síntomas (Sampson B. A., Human Pathology, 2000, 31(5), 527-531; Marra C. M., Seminars in Neurology, 2000, 20(3), 323-327).
El virus de la fiebre del Nilo es transmitido a las aves y a los mamíferos por picaduras de determinados mosquitos (por ejemplo, Culex, Aedes, Anopheles) y garrapatas.
Las aves silvestres y domésticas son un reservorio para el virus de la fiebre del Nilo y un vector de propagación por sus migraciones.
Los viriones del virus de la fiebre del Nilo son partículas esféricas de 50 nm de diámetro constituidas por una envoltura lipoproteica que rodea a una nucleocápside icosaédrica que contiene un ARN monocatenario de polaridad positiva.
Un único marco abierto de lectura (ORF, del inglés open read framing) codifica el conjunto de proteínas víricas en forma de una poliproteína. La escisión y la maduración de esta poliproteína conduce a la producción de una decena de proteínas víricas diferentes. Las proteínas estructurales son codificadas por la parte 5' del genoma y corresponden a la nucleocápside denominada C (14 kDa), la glucoproteína de envoltura denominada E (50 kDa), la proteína de premembrana denominada prM (23 kDa) y la proteína de membrana denominada M (7 kDa). Las proteínas no estructurales son codificadas por la parte 3' del genoma y corresponden a las proteínas NS1 (40 kDa), NS2A (19 kDa), NS2B (14 kDa), NS3 (74 kDa), NS4A (15 kDa), NS4B (29 kDa) y NS5 (97 kDa).
Parrish C. R. y col. (J. Gen. Virol., 1991, 72, 1645-1653), Kulkami A. B. y col. (J. Virol., 1992, 66(6), 3583-3592) y Hill A. B. y col. (J. Gen. Virol., 1992, 73, 1115-1123) han construido, a partir del virus de la vacuna, vectores de expresión in vivo que contienen diversos insertos correspondientes a secuencias nucleotídicas que codifican proteínas no estructurales del virus Kunjin asociadas en su caso a proteínas estructurales. Estos vectores se han administrado al ratón para evaluar la respuesta inmunitaria celular. Los autores insisten en la importancia de la respuesta celular, respuesta que es estimulada esencialmente por las proteínas no estructurales y en particular por NS3, NS4A y NS4B. Estos artículos ponen de manifiesto la dificultad de evidenciar cuál sería la estrategia adecuada para la vacunación contra la fiebre del Nilo. El documento WO9837911 describe un virus quimérico de la fiebre amarilla vivo, infeccioso y atenuado cuyo genoma comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la prM-E de un segundo flavivirus, cuyo segundo flavivirus puede ser el virus de la fiebre del Nilo.
En la actualidad, no existe vacuna para prevenir la infección por el virus WN.
Objeto de la invención
La presente invención tiene por objeto proponer un medio de prevención y/o de lucha contra las enfermedades causadas por el virus WN.
Otro objeto de la invención es proponer un medio tal que pueda usarse en las diversas especies animales susceptibles a la enfermedad causada por este virus y; en particular, especies equinas y aviares.
Otro objeto más de la invención es proponer tal medio para su uso en métodos de inmunización y vacunación de especies diana contra el virus WN.
Otro objeto de la divulgación es proponer dichos medios y métodos que permitan garantizar un diagnóstico diferencial.
Descripción detallada de la invención
La invención es tal como se define en las reivindicaciones.
Por tanto, la invención tiene como primer objeto un vector de expresión in vitro y/o in vivo que comprende un polinucleótido en el que el polinucleótido codifica las proteínas prM, M y E del virus de la fiebre del Nilo (WN), y los elementos necesarios para la expresión del polinucleótido en la célula hospedadora, cuyo vector es un vector vírico, cuyo vector vírico es un virus de la viruela del canario o un virus de la viruela aviar.
El vector comprende preferentemente un polinucleótido que forma una sola fase codificante que corresponde a prM-M-E. En el marco de la presente invención, también se incluye un vector tal como se define en las reivindicaciones y que comprende varios polinucleótidos separados que codifican las diferentes proteínas (por ejemplo, prM y/o M y E). El vector, tal como se define en las reivindicaciones, en particular in vivo, puede comprender también polinucleótidos que corresponden a más de una cepa de virus WN, en particular dos o más polinucleótidos que codifican E o prM-M-E de cepas diferentes. Tal como se verá más adelante, el vector, en particular in vivo, puede comprender también una o varias secuencias nucleotídicas que codifican inmunógenos de otros agentes patógenos y/o citocinas.
Por polinucleótido que codifica una proteína del virus WN, se entiende principalmente un fragmento de ADN que codifica esta proteína, o la cadena complementaria de este fragmento de ADN. No se excluye un ARN.
En el sentido de la divulgación, el término proteína engloba los fragmentos, comprendidos los péptidos y polipéptidos. Por definición, el fragmento de proteína es inmunológicamente activo en el sentido de que una vez administrado al hospedador, es susceptible de desencadenar una respuesta inmunitaria de tipo humoral y/o celular dirigida contra la proteína. Preferentemente, el fragmento de proteína es tal forma que posee sustancialmente la misma actividad inmunológica que la proteína entera. Un fragmento de proteína según la divulgación comprende por tanto al menos un epítopo o determinante antigénico. El término epítopo se refiere a un sitio de la proteína capaz de inducir una reacción inmunitaria de tipo humoral (linfocitos B) y/o de tipo celular (linfocitos T).
La estructura mínima del polinucleótido es por tanto la que codifica un epítopo o determinante antigénico de la proteína en cuestión. Un polinucleótido que codifica un fragmento de la proteína total comprende especialmente como mínimo 21 nucleótidos, especialmente al menos 42 nucleótidos y preferentemente al menos 57, 87 o 150 nucleótidos consecutivos de la secuencia de la que procede. El experto en la materia conoce bien técnicas de determinación de epítopos, especialmente pueden utilizarse bancos de péptidos superpuestos (Hemmer B. y col., Immunology Today, 1998, 19(4), 163-168), Pepscan (Geysen H. M. y col., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1984, 81 (13), 3998-4002; Geysen H. M. y col., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1985, 82(1), 178-182; Van der Zee R. y col., Eur. J. Immunol., 1989, 19(1), 43­ 47; Geysen H. M., Southeast Asian J. Trop. Med. Public Health, 1990, 21(4), 523-533; Multipin® Peptide Synthesis Kits de Chiron), algoritmos (De Groot A. y col., Nature Biotechnology, 1999, 17, 533-561).
En particular los polinucleótidos comprenden la secuencia de nucleótidos que codifica uno o los dos dominios de transmembrana, preferentemente los dos, situados en la parte C terminal de la proteína E. Para la cepa WNV NY99 estos dominios corresponden a las secuencias de aminoácidos 742 a 766 y 770 a 791 de GenBank AF196835.
Están presentes los elementos necesarios para la expresión del polinucleótido (o polinucleótidos). Estos son al menos un codón de inicio (ATG), un codón de terminación y un promotor, así como una secuencia de poliadenilación para los plásmidos y los vectores víricos distintos del virus de la viruela aviar. Cuando el polinucleótido codifica un fragmento de la poliproteína, por ejemplo, prM-E, M-E, prM-M-E, un ATG se coloca en posición 5' de la fase de lectura y un codón de terminación se coloca en la posición 3'. Como se explicará más adelante, podrán estar presentes otros elementos que permitan el control de la expresión, tales como secuencias de activación (en inglés “enhancer”), secuencias de estabilización y secuencias de señal que permiten la secreción de la proteína.
La presente invención tiene también por objeto preparaciones que comprenden un vector de expresión según la invención y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.
Según una modalidad de la invención, la preparación comprende dicho vector de expresión según la invención y otros vectores que comprenden y expresan una o varias proteínas de una o varias otras cepas de virus WN. Especialmente, la preparación comprende al menos dos vectores que expresan, en particular in vivo, polinucleótidos de cepas WN diferentes, que codifican las mismas proteínas y/o proteínas diferentes, preferentemente las mismas proteínas, siendo uno de dichos al menos dos vectores, dicho vector de expresión según la invención. Se trata preferentemente de vectores que expresan in vivo E o prM-M-E de dos, tres o más cepas de WN diferentes, siendo uno de dichos vectores dicho vector de expresión según la invención. La invención se refiere también a las mezclas de vectores que expresan prM, M, E, prM-M, prM-E o M-E de cepas diferentes, siendo uno de dichos vectores dicho vector de expresión según la invención.
Según otra modalidad más, y como se verá más adelante con mayor detalle, el o los otros vectores en la preparación, comprenden y expresan una o varias citocinas y/o uno o varios inmunógenos de uno o varios otros agentes patógenos.
La divulgación también se refiere a las diversas combinaciones de estas diferentes modalidades.
Según un modo de realización particular de la invención, el polinucleótido del vector de expresión según la invención comprende además una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido señal situado en dirección 5’ de la proteína expresada, preferentemente una secuencia señal del virus WN.
Según un modo de realización particular, se expresan una o varias de las proteínas no estructurales NS2A, NS2B y NS3, conjuntamente con las proteínas estructurales, ya sea a través del mismo vector de expresión, o bien a través de un vector de expresión propio. Se expresan preferentemente en conjunto a partir de un único polinucleótido.
La divulgación tiene así también por objeto, un vector de expresión, in vivo o in vitro, que comprende el polinucleótido que codifica NS2A, NS2B, NS3, sus combinaciones, y preferentemente NS2A-NS2B-NS3. En un principio, este vector puede ser uno de los vectores descritos anteriormente, que comprende un polinucleótido que codifica una o varias proteínas estructurales, especialmente E o prM-M-E. Como variante, la invención se refiere a una preparación, tal como se ha descrito anteriormente, que incluye además un vector de expresión como se define en las reivindicaciones, expresando al menos uno de esos vectores. una proteína no estructural y, en su caso, un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.
Para realizar los vectores de expresión según la invención, el experto en la materia dispone de diferentes cepas del virus WN y de la descripción de la secuencia de nucleótidos de su genoma. Véase especialmente Savage H. M. y col. (Am. J. Trop. Med. Hyg. 1999, 61(4), 600-611), tabla 2, que menciona 24 cepas de virus WN y proporciona las referencias de registro de secuencias polinucleotídicas en GenBank.
Se puede hacer referencia, por ejemplo, a la cepa NY99 (GenBank AF196835). En GenBank, para cada proteína se especifica la secuencia de ADN correspondiente (nucleótidos 466-741 para prM, 742-966 para M, 967-2469 para E, 466-2469 o bien para prM-M-E, 3526-4218 para NS2A, 4219-4611 para Ns 2b y 4612-6468 para NS3, o bien 3526­ 6468 para NS2A-NS2B-NS3). Por comparación y alineación de secuencias, la determinación de un polinucleótido que codifica dicha proteína en otra cepa de WNV es inmediata.
Anteriormente se ha indicado que, por polinucleótido, se entiende la secuencia que codifica la proteína o un fragmento o un epítopo, específica del virus WN. Además, por equivalencia, el término polinucleótido engloba también las secuencias nucleotídicas correspondientes de las diferentes cepas del virus WN y las secuencias nucleotídicas que difieren según la degeneración del código.
En la familia de los virus WN, la identidad entre secuencias de aminoácidos prM-M-E con respecto a la de NY99 es igual o superior al 90 %. Por tanto, en la divulgación se incluyen los polinucleótidos que codifican una secuencia de aminoácidos cuya identidad con la secuencia en aminoácidos natural es superior o igual al 90 %, especialmente al 92 %, preferentemente al 95%, e incluso más en particular al 98 %. Se considerarán también como equivalentes los fragmentos de estos polinucleótidos homólogos, que son específicos de los virus WN.
Por tanto, si se habla de un polinucleótido del virus WN, este término engloba las secuencias equivalentes al sentido de la divulgación.
Se ha visto también que el término proteína engloba los polipéptidos y péptidos inmunológicamente activos. Para las necesidades de la invención, esto engloba:
a) las proteínas correspondientes de las diferentes cepas de virus WN;
b) las proteínas que difieren de ellas pero que conservan una identidad superior o igual al 90 %, especialmente al 92 %, preferentemente al 95%, y más en particular al 98 %, con una proteína de WN natural.
Por tanto, si se habla de una proteína del virus WN, este término engloba las proteínas equivalentes al sentido de la divulgación.
Se puede acceder a las diferentes cepas de virus WN, a partir de colecciones, en particular de la American Type Culture Collection (ATCC), por ejemplo, con los números de registro VR-82 o VR-1267. De hecho, el virus denominado Kunjin se considera que es un virus WN.
Según la invención, para garantizar la secreción, se prefiere que el polinucleótido comprenda además una secuencia de nucleótidos que codifique un péptido señal situado en dirección 5’ de la proteína expresada. Por tanto, puede tratarse de una secuencia endógena, es decir, de la secuencia señal natural cuando exista (proveniente del mismo virus WN o de otra cepa). Por ejemplo, para el virus WN NY99, la secuencia señal endógena de E corresponde a los nucleótidos 922 a 966 de la secuencia del GenBank; para prM, se trata de los nucleótidos 421 a 465. Puede tratarse también de una secuencia de nucleótidos que codifique un péptido señal heterólogo, especialmente la que codifica el péptido señal del activador tisular del plasminógeno (en inglés: Tissue Plasminogen, tPA) humano (Hartikka J. y col., Human Gene Therapy, 1996, 7, 1205-1217). La secuencia de nucleótidos que codifica el péptido señal se inserta en fase y en dirección 5’ de la secuencia que codifica E o sus combinaciones, por ejemplo, prM-M-E.
Según una primera modalidad de la divulgación, los vectores de expresión in vivo son vectores víricos.
Estos vectores de expresión son ventajosamente poxvirus, por ejemplo, el virus de la variolovacuna o mutantes atenuados de virus de la variolovacuna, por ejemplo, el MVA (cepa Ankara) (Stick1H. y Hochstein-Mintzel V., Munch. Med. Wschr ., 1971, 113, 1149-1153; Sutter G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU., 1992, 89, 10847-10851; cepa comercial ATCC VR-1508; el MVA se obtiene después de más de 570 pases de la cepa de la vacuna Ankara en fibroblastos de embriones de pollo) o NYVAC (su construcción se describe en el documento US-A-5,494,807, en particular en los Ejemplos 1 a 6; esta patente también describe la inserción de genes heterólogos en sitios de este recombinante y el uso de promotores adecuados; véase también el documento WO-A-96/40241), avipox (en particular, virus de la viruela del canario, viruela aviar, viruela de la paloma, viruela de la codorniz), viruela del cerdo, viruela del mapache y viruela del camello, adenovirus, tales como adenovirus aviares, caninos, porcinos, bovinos, humanos, y herpesvirus tales como herpesvirus equino (serotipos 1 y 4 de EHV), herpesvirus canino (CHV), herpesvirus felino (FHV), herpesvirus bovino (serotipos 1 y 4 de BHV), herpesvirus porcino (PRV), virus de la enfermedad de Marek (serotipos 1 y 2 de MDV), herpesvirus del pavo (HVT o MDV serotipo 3), herpesvirus del pato. Cuando se usa un herpesvirus, para la vacunación de la especie aviar se prefiere el vector HVT, y para la vacunación de caballos se prefiere el vector EHV.
Según la invención, el vector de expresión es un virus de la viruela del canario o de la viruela aviar, pudiendo estar estos poxvirus, en su caso, atenuados. Se puede citar el virus de la viruela del canario disponible en el comercio en la ATCC con el número de registro VR-111. En los documentos US-A-5756 103 y WO-A-01/05934, se han descrito virus de la viruela del canario atenuados. Puede accederse a numerosas cepas de vacunas de virus de la viruela aviar, por ejemplo, la vacuna DIFTOSEC CT® comercializada por MERIAL y la vacuna NOBILIS® VARIOLE comercializada por Intervet.
Para los poxvirus, el experto en la materia puede referirse al documento WO-A-90/12882, y más particularmente para el virus de la variolovacuna a los documentos US-A-4769330; US-A-4.722.848; US-A-4603 112; US-A-5 110587; US-A-5494807; US-A-5762938; para el virus de la viruela aviar a los documentos US-A-5 174993; US-A-5505941; US-5766 599; para el virus de la viruela del canario al documento US-A-5756 103; para el virus de la viruela del cerdo al documento US-A-5382425; para el virus de la viruela del mapache al documento WO-A-00/03030.
Cuando el vector de expresión es un virus de la viruela del canario, los sitios de inserción están situados, en particular, en los marcos abiertos de lectura (ORF) C3, C5 y C6, o constituidos por dichos marcos. Cuando se trata de un virus de la viruela aviar, los sitios de inserción están situados, en particular, en los ORF F7 y F8, o constituidos por dichos marcos.
La inserción de genes en el virus MVA se describe en varias publicaciones, incluidas Carroll M. W. y col., Vaccine, 1997, 15 (4), 387-394; Stittelaar K. J. y col., J. Virol., 2000, 74 (9), 4236-4243; Sutter G. y col., Vaccine, 1994, 12 (11), 1032-1040, a las que puede referirse el experto en la técnica. El genoma completo de MVA se describe en Antoine G., Virology, 1998, 244, 365-396, que permite al experto en la técnica usar otros sitios de inserción u otros promotores.
Según la divulgación, cuando el vector de expresión es un poxvirus, el polinucleótido que debe expresarse se inserta bajo el control de un promotor específico de poxvirus, especialmente el promotor de vacuna de 7,5 kDa (Cochran y col., J. Virology, 1985, 54, 30-35), el promotor de vacuna I3L (Riviere y col., J. Virology, 1992, 66, 3424-3434), el promotor de vacuna HA (Shida, Virology, 1986, 150, 451 -457), el promotor de la viruela vacuna ATI (Funahashi y col., J. Gen. Virol., 1988, 69, 35-47), o incluso el promotor de vacuna H6 (Taylor J. y col. Vaccine, 1988, 6, 504-508; Guo P. y col. J. Virol., 1989, 63, 4189-4198; Perkus M. y col. J. Virol., 1989, 63, 3829-3836).
Preferentemente, para la vacunación de mamíferos, el vector de expresión es un virus de la viruela del canario. Preferentemente, para la vacunación de aves, en particular pollos, patos, pavos y gansos, el vector de expresión es un virus de la viruela del canario o de la viruela aviar.
Cuando el vector de expresión es un herpesvirus HVT, los sitios de inserción adecuados se encuentran en particular en el fragmento BamHI I o en el fragmento BamHI M de HVT. El fragmento de restricción BamHI I de HVT comprende varios marcos abiertos de lectura (ORF) y tres regiones intergénicas y comprende varias zonas de inserción preferidas, es decir, las tres regiones intergénicas 1, 2 y 3, que son las regiones preferidas, y el ORF UL55 (documentos FR-A-2 728795, US-A-5980906). El fragmento de restricción BamHI M de HVT comprende el ORF UL43, que también es un sitio de inserción preferido (documentos FR-A-2728794, US-A-5 733554).
Cuando el vector de expresión es un herpesvirus EHV-1 o EHV-4, los sitios de inserción adecuados son, en particular, TK, UL43 y UL45 (documento EP-A-0668355).
Preferentemente, cuando el vector de expresión es un herpesvirus, el polinucleótido a expresar se inserta bajo el control de un promotor eucariota fuerte, preferentemente el promotor de CMV-IE. Estos promotores fuertes se describen a continuación en la parte de la descripción relacionada con los plásmidos.
Según una segunda modalidad de la divulgación, los vectores de expresión in vivo son vectores plasmídicos denominados plásmidos.
El término plásmido pretende incluir cualquier unidad de transcripción de ADN en forma de una secuencia de polinucleótidos que comprende un polinucleótido según la divulgación y los elementos necesarios para su expresión in vivo. Se prefiere la forma de plásmido circular, superenrollada o no. La forma lineal también se incluye en el alcance de esta divulgación.
Cada plásmido comprende un promotor capaz de garantizar, en las células hospedadoras, la expresión del polinucleótido insertado bajo su dependencia. Generalmente se trata de un promotor eucariota fuerte. El promotor eucariota más preferido es el promotor temprano del citomegalovirus (CMV-IE), de origen humano o murino, o en su caso también de otro origen, tal como rata, cobaya. El promotor CMV-IE puede comprender la parte del promotor propiamente dicha, asociada o no a la parte activadora (potenciador). Puede hacerse referencia a los documentos EP-A-260 148, EP-A-323597, US-A-5 168062, US-A-5385839, US-A-4968615, WO-A-87/03905 . Se prefiere el CMV-IE humano (Boshart M. et al., Cell., 1985, 41,521-530) o murino.
Más generalmente, el promotor es de origen vírico o celular. Como promotor vírico fuerte distinto del CMV-IE, se puede mencionar el promotor temprano/tardío del virus SV40 o el promotor LTR del virus del sarcoma de Rous. Como promotor celular fuerte, se puede mencionar el promotor de un gen del citoesqueleto, tal como, por ejemplo, el promotor de desmina (Kwissa M. et al., Vaccine, 2000, 18 (22), 2337-2344), o incluso el promotor de actina (Miyazaki J. et al., Gene, 1989, 79 (2), 269-277).
Por equivalencia, en la presente divulgación, se incluyen los subfragmentos de estos promotores que conservan una actividad promotora adecuada: por ejemplo, los promotores de CMV-IE truncados según el documento WO-A-98/00166. El concepto de promotor según la divulgación, incluye, por tanto, los derivados y subfragmentos que conservan una actividad promotora adecuada, preferentemente sustancialmente similar a la del promotor propiamente dicho del que proceden. Para el CMV-IE, esta idea incluye la parte promotora propiamente dicha y/o la parte activadora y los derivados y subfragmentos.
Preferentemente, los plásmidos comprenden otros elementos de control de la expresión. En particular, es ventajoso incorporar secuencias estabilizadoras del tipo intrón, preferentemente intrón II del gen de la p-globina de conejo (van Ooyen y col. Science, 1979, 206: 337-344).
Como señal de poliadenilación (poliA) para los plásmidos y los vectores víricos distintos del poxvirus, es posible utilizar, en particular, el gen de la hormona de crecimiento bovino (bGH) (documento US-A-5 122458), el de la p-globina de conejo o el del virus SV40.
Los otros elementos de control de la expresión que pueden usarse en plásmidos, también pueden usarse en vectores de expresión de herpesvirus.
Según otra modalidad de la divulgación, los vectores de expresión son vectores de expresión usados para expresar in vitro las proteínas en un sistema celular apropiado. Las proteínas pueden recogerse después en el sobrenadante de cultivo, tras la secreción o no (si no hay secreción, se procede a una lisis celular), concentradas en su caso por técnicas clásicas de concentración, especialmente por ultrafiltración y/o purificadas por medios de purificación clásicos, especialmente las técnicas de cromatografía de tipo afinidad, intercambio iónico o filtración en gel.
La producción se efectúa por transfección de células de mamífero por plásmidos, por replicación de vectores víricos en células de mamífero o células aviares o por replicación de Baculovirus (documento US-A-4745051; Vialard J. y col., J. Virol., 1990, 64(1), 37-50; Verne A., Virology, 1988, 167, 56-71), por ejemplo, virus de la poliedrosis nuclear de Autographa californica AcNPV, en células de insectos (por ejemplo, células Sf9 de Spodoptera frugiperda, depósito ATCC CRL 1711). Como células de mamíferos, se pueden usar especialmente células de hámster (por ejemplo, CHO o BHK- 21), células de mono (por ejemplo, COS o VERO). La divulgación incluye por tanto estos vectores de expresión que incorporan un polinucleótido según la divulgación, las proteínas de W n o fragmentos así producidos y las preparaciones que los contienen.
La presente divulgación, tiene por tanto por objeto las preparaciones purificadas y/o concentradas de proteínas WN. Cuando el polinucleótido codifica varias proteínas éstas se escinden, y las preparaciones anteriores contienen así proteínas escindidas.
La invención también tiene por objeto las composiciones inmunógenas y las vacunas contra el virus WN que comprende al menos un vector de expresión in vivo según la invención y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable y, en su caso, un adyuvante.
La idea de composición inmunógena incluye cualquier composición susceptible, una vez administrada a la especie diana, de inducir una respuesta inmunitaria dirigida contra el virus WN. Por vacuna, se entiende una composición capaz de inducir una protección eficaz. Las especies diana son equinos, caninos, felinos, bovinos, cerdos, aves, preferentemente caballos, perros, gatos, cerdos, y en el caso de aves, gansos, pavos, pollos, patos, que por definición engloban animales reproductores, gallinas ponedoras, animales de carne.
El experto en la materia conoce a la perfección vehículos o excipientes farmacéuticamente aceptables. Como ejemplo, puede tratarse de solución salina NaCl al 0,9 % o de tampón de fosfato. Los vehículos o excipientes farmacéuticamente aceptables engloban también cualquier compuesto o combinación de compuestos que permitan facilitar la administración del vector, especialmente de la transfección, y/o la mejora de la conservación.
Las dosis y los volúmenes de dosis se definen más adelante en el marco de la descripción general de los métodos de inmunización y de vacunación.
Las composiciones inmunógenas y las vacunas según la invención comprenden preferentemente uno o varios adyuvantes, elegidos especialmente entre los adyuvantes habituales. En el marco de la presente invención, son especialmente convenientes: (1) los polímeros del ácido acrílico o metacrílico, los polímeros de anhídrido maleico y de derivado de alquenilo, (2) las secuencias inmunoestimuladoras (ISS), especialmente las secuencias de oligodesoxirribonucleótidos que tienen uno o varios motivos CpG no metilados (Klinman D. M. y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996, 93, 2879-2883; documento WO-A1-98/16247), (3) una emulsión de aceite en agua, en particular, la emulsión SPT descrita en la página 147 de “Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach” editada por M. Powell, M. Newman, Plenum Press 1995, y la emulsión MF59 descrita en la página 183 de la misma obra, (4) los lípidos catiónicos que contienen una sal de amonio cuaternario, (5) las citocinas, o (6) sus combinaciones o mezclas.
La emulsión de aceite en agua (3), que está particularmente adaptada para los vectores víricos, puede tener especialmente como base:
- aceite de parafina líquida ligera (del tipo farmacopea europea);
- aceite isoprenoide, tal como escualano, escualeno;
- aceite resultante de la oligomerización de alquenos, en particular, de isobuteno o de deceno;
- ésteres de ácidos o de alcoholes con grupo alquilo lineal;
- más particularmente, aceites vegetales, oleato de etilo, di(caprilato/caprato) de propilenglicol, tri(caprilato/caprato) de glicerol, dioleato de propilenglicol;
- ésteres de ácidos o de alcoholes grasos ramificados, en particular, ésteres del ácido isoesteárico.
El aceite se usa junto con emulsionantes para formar la emulsión. Los emulsionantes son preferentemente tensioactivos no iónicos, en particular:
- por una parte, ésteres de sorbitano, manida (por ejemplo, oleato de manitol anhidro), glicerol, poliglicerol o propilenglicol y, por otra parte, de ácido oleico, isoesteárico, ricinoleico, hidroxiesteárico, estando en su caso estos ésteres etoxilados,
- copolímeros de bloque de polioxipropileno-polioxietileno, en particular Pluronic®, especialmente L121.
Entre los polímeros adyuvantes de tipo (1), se prefieren los polímeros del ácido acrílico o metacrílico reticulados, especialmente reticulados por éteres polialquenílicos de azúcares o de polialcoholes. Estos compuestos se conocen con el término carbómero (Pharmeuropa vol. 8, n° 2, junio de 1996). El experto en la materia puede referirse también al documento US-A-2909462 que describe dichos polímeros acrílicos reticulados por un compuesto polihidroxilado que tiene al menos 3 grupos hidroxilo, preferentemente no más de 8, estando los átomos de hidrógeno de al menos tres hidroxilos sustituidos por radicales alifáticos insaturados que tienen al menos 2 átomos de carbono. Los radicales preferidos son los que contienen de 2 a 4 átomos de carbono, por ejemplo vinilos, alilos y otros grupos etilénicamente insaturados. Los radicales insaturados pueden contener asimismo otros sustituyentes, tales como metilo. Los productos comercializados con la denominación Carbopol® (BF Goodrich, Ohio, EE.UU.) son particularmente apropiados. Especialmente están reticulados por una alil-sacarosa o por alil pentaeritritol. Entre ellos, se pueden citar en particular los Carbopol® 974P, 934P y 971P.
Entre los copolímeros de anhídrido maleico y de derivado de alquenilo, se prefieren los EMA® (Monsanto) que son copolímeros de anhídrido maleico y de etileno, lineales o reticulados, por ejemplo, reticulados por divinil éter. Es posible referirse a J. Fields y col., Nature, 186: 778-780,4 de junio de 1960.
En el plano de su estructura, los polímeros de ácido acrílico o metacrílico y los EMA® están formados preferentemente por motivos de base de la fórmula siguiente:
Figure imgf000008_0001
en la que:
- R1 y R2, idénticos o diferentes, representan H o CH3
- x = 0 o 1, preferentemente x = 1
- y = 1 o 2, siendo x y = 2
Para los EMA®, x = 0 e y = 2. Para los carbómeros, x = y = 1.
Estos polímeros se disuelven en agua o en agua fisiológica (NaCl a 20 g/l) y el pH se ajusta a 7,3-7,4 con sosa, para dar la solución adyuvante en la que se incorporarán los vectores de expresión.
La concentración de polímero en la composición de vacuna final puede variar especialmente del 0,01 % al 1,5 % P/V, más particularmente del 0,05 al 1 % P/V, preferentemente del 0,1 al 0,4 % P/V.
Los lípidos catiónicos (4) que contienen una sal de amonio cuaternario, que están especialmente adaptados pero no de forma exclusiva a los plásmidos, son preferentemente los que responden a la fórmula siguiente:
Figure imgf000008_0002
en la que R1 es un radical alifático lineal, saturado o insaturado, que tiene de 12 a 18 átomos de carbono, R2 es otro radical alifático, que contiene 2 o 3 átomos de carbono y X un grupo hidroxilo o amina.
Entre estos lípidos catiónicos, se prefiere DMRIE (N-(2-hidroxietil)-N,N=dimetil-2,3-bis(tetradeciloxi)-1-propanamonio; el documento WO-A-96/34.109), asociado preferentemente con un lípido neutro, preferentemente DOPE (dioleoilfosfatidil-etanolamina; Behr J. P., 1994, Bioconjugate Chemistry, 5, 382-389), para formar el DMRIE-DOPE. Preferentemente, la mezcla de plásmido con este adyuvante se realiza de forma extemporánea y se prefiere, antes de su administración, dar tiempo para que la mezcla así constituida forme complejo, por ejemplo, durante un tiempo comprendido entre 10 y 60 minutos, especialmente del orden de 30 minutos.
Cuando hay DOPE, la razón molar de DMRIE:DOPE está comprendida preferentemente entre 95:5 y 5:95, más particularmente es de 1:1.
La relación ponderal de plásmido: adyuvante DMRIE o DMRIE-DOPE, puede estar comprendida especialmente entre 50:1 y 1:10, en particular entre 10:1 a 1:5, y preferentemente de 1:1 a 1:2.
La citocina, o citocinas, (5) puede(n) suministrarse en forma de proteína a la composición o vacuna, o expresarse conjuntamente en el hospedador con el inmunógeno (o inmunógenos). Existe preferencia por la coexpresión de la citocina, o citocinas, ya sea por el mismo vector que el que expresa el inmunógeno o por un vector propio.
Las citocinas pueden elegirse especialmente entre: interleucina 18 (IL-18), interleucina 12 (IL-12), interleucina 15 (IL-15), MIP-1a (macrophage inflammatory protein 1a; Marshall E. y col., Br. J. Cancer, 1997, 75(12), 1715-1720), GM-CSF (factor de estimulación de la formación de colonias de granulocitos-macrófagos, o en inglés Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor). Se pueden citar en particular las citocinas aviares, especialmente las del pollo, tales como clL-18 (Schneider K. y col., J. Interferon Cytokine Res., 2000, 20(10), 879-883), clL-15 (Xin K.-Q. y col., Vaccine, 1999, 17, 858-866), y las citocinas equinas, especialmente g M-c Sf equino (WO-A-00/77210)). De manera preferida, se usan las citocinas de la especie que se va a vacunar.
El documento WO-A-00/77210 describe la secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos que corresponde al GM-CSF equino, de manera que la producción de GM-CSF in vitro y la construcción de vectores (plásmidos y vectores víricos) permiten la expresión de GM-CSF equino in vivo. Estas proteínas, plásmidos y vectores víricos, pueden usarse en las composiciones inmunógenas y las vacunas de equinos según la invención. Como ejemplo, se puede usar el plásmido pJP097 descrito en el ejemplo 3 de esta solicitud anterior o usar la enseñanza de esta solicitud anterior para producir otros vectores o para producir in vitro GM-CSF equino, e incorporar estos vectores o este GM-CSF equino en las composiciones inmunógenas o vacunas de equinos según la invención.
La presente divulgación también tiene por objeto composiciones inmunógenas y vacunas denominadas subunitarias, que comprenden la proteína E, y en su caso, una o varias otras proteínas del virus WN, especialmente prM o M, preferentemente producidas por expresión in vitro como se describe anteriormente, y por otra parte un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.
Los vehículos o excipientes farmacéuticamente aceptables son perfectamente conocidos por el experto en la materia. Como ejemplo, puede tratarse de solución salina NaCl al 0,9 % o de tampón de fosfato.
Las composiciones inmunógenas y las vacunas subunitarias según la invención, comprenden preferentemente uno o varios adyuvantes, elegidos especialmente entre los adyuvantes habituales. Son especialmente convenientes en el marco de la presente invención: (1) un polímero del ácido acrílico o metacrílico, un polímero de anhídrido maleico y de derivado de alquenilo, (2) una secuencia inmunoestimuladora (ISS), especialmente una secuencia de oligodesoxirribonucleótidos que tenga uno o varios motivos CpG no metilados (Klinman D. M. y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996, 93, 2879-2883; documento WO-A1-98/16247), (3) una emulsión de aceite en agua, en particular, la emulsión SPT descrita en la página 147 de “Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach” editado por M. Powell, M. Newman, Plenum Press 1995, y la emulsión MF59 descrita en la página 183 de la misma obra, (4) una emulsión de agua en aceite (documento EP-A-639071), (5) saponina, en particular Quil-A, o (6) hidróxido de aluminio o equivalente. Los diferentes tipos de adyuvantes definidos en 1), 2) y 3) se han descrito anteriormente con más detalle en relación con vacunas basadas en vectores de expresión.
Las dosis y volúmenes de dosis se definen más adelante en el marco de la descripción general de los métodos de inmunización y de vacunación.
De acuerdo con la invención, la vacunación contra el virus WN puede estar asociada a otras vacunaciones en el marco de los programas de vacunación, en forma de kits de inmunización o de vacunación o incluso en forma de composiciones inmunógenas y de vacunas multivalentes, es decir, que comprenden al menos un componente de vacuna contra el virus WN y al menos un componente de vacuna contra al menos otro agente patógeno. Esto incluye también la expresión por un mismo vector de expresión de genes de al menos dos agentes patógenos, incluido el virus WN.
Por tanto, la invención tiene por objeto una composición inmunógena multivalente o una vacuna multivalente contra el virus WN y contra al menos otro patógeno de la especie diana, usando un mismo vector de expresión in vivo que contiene y que expresa al menos un polinucleótido del virus WN según la invención y al menos un polinucleótido que expresa un inmunógeno de otro patógeno.
Por “inmunógeno” así expresado, se entiende especialmente una proteína, glucoproteína, polipéptido o péptido, epítopo o derivado, por ejemplo, proteína de fusión, que induce una respuesta inmunitaria, preferentemente protectora.
Como se ha descrito anteriormente, estas composiciones o vacunas multivalentes comprenden también un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable, y en su caso, un adyuvante.
La invención también tiene por objeto una composición inmunógena multivalente o una vacuna multivalente que comprende al menos un vector de expresión in vivo en el que se inserta al menos un polinucleótido del virus WN según la invención y al menos un segundo vector de expresión en el que se inserta un polinucleótido que codifica un inmunógeno de otro agente patógeno. Como se ha descrito anteriormente, estas composiciones o vacunas multivalentes comprenden también un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable, y en su caso, un adyuvante.
Para las composiciones inmunógenas y las vacunas multivalentes, los dichos otros patógenos equinos se eligen especialmente entre el grupo que comprende los virus de la rinoneumonía equina EHV-1 y/o EHV- 4 (preferentemente se asocia a inmunógenos de EHV-1 y EHV-4), virus de la gripe equina EIV, virus de la encefalitis del este EEV, virus de la encefalitis del oeste WEV, virus de la encefalitis venezolana VEV (se prefiere una combinación de los tres EEV, WEV y VEV), Clostridium tetani (tétanos) y mezclas de los mismos. Preferentemente, para el EHV se eligen los genes gB y/o gD; para el EIV los genes HA, NP y/o N; para los virus de las encefalitis C y/o E2; para Clostridium tetani el gen que codifica toda o parte de la subunidad C de la toxina tetánica. Ello incluye el uso de polinucleótidos que codifican un fragmento inmunológicamente activo o un epítopo de este inmunógeno.
Dichos otros patógenos aviares se eligen particularmente entre el grupo que comprende el virus de la enfermedad de Marek MDV (serotipos 1 y 2, preferentemente serotipo 1), virus de la enfermedad de Newcastle NDV, virus de la enfermedad de Gumboro IBDV, virus de la bronquitis infecciosa IBV, virus de la anemia infecciosa CAV, virus de laringotraqueitis infecciosa ILTV, virus de encefalomielitis AEV (o incluso virus de leucosis aviar ALV), virus de enteritis hemorrágica del pavo (HEV), neumovirus (TRTV), virus de la peste aviar (gripe aviar), virus de la hidropericarditis del pollo, reovirus aviar, Escherichia coli, Mycoplasma gallinarum, Mycoplasma gallisepticum, Haemophilus avium, Pasteurella gallinarum, Pasteurella multocida gallicida y sus mezclas. Preferentemente, para el MDV, se eligen los genes gB y/o gD; para el NDV los genes HN y/o F; para el IBDV el gen VP2; para el IBV los genes S (y más particularmente S1), M y/o N; para el CAV los genes VP1 y/o VP2, para el ILTV los genes gB y/o gD; para el AEV los genes env y/o gag/pro, para el HEV los genes 100K y hexón, para el TRTV los genes F y/o G; para la peste aviar los genes HA, N y / o NP. Esto incluye el uso de polinucleótidos que codifican un fragmento inmunológicamente activo o un epítopo de este inmunógeno.
Como ejemplo, en una composición inmunógena multivalente o una vacuna multivalente según la invención, en su caso con adyuvante, como se describe anteriormente, destinado a especies equinas, se puede incorporar uno o varios de los plásmidos descritos en el documento WO-A-98/03198 y en particular en los ejemplos 8 a 25 de esta solicitud anterior, y los descritos en el documento WO-A-00/77043 y que se refieren a la especie equina, en particular los descritos en los ejemplos 6 y 7 de esta solicitud anterior. Para las especies aviares, es posible incorporar, por ejemplo, uno o más de los plásmidos descritos en el documento WO-A1-98/03659 y en particular en los ejemplos 7 a 27 de esta solicitud anterior.
Las composiciones inmunógenas o las vacunas recombinadas, tales como las descritas anteriormente, también pueden asociarse con al menos una vacuna clásica (inactivada, viva atenuada, subunitaria) dirigida contra al menos otro patógeno.
Del mismo modo, las composiciones inmunógenas y las vacunas subunitarias según la divulgación pueden ser objeto de vacunación asociada. El objeto de la divulgación es, por lo tanto, también composiciones inmunógenas multivalentes y vacunas multivalentes, que comprenden una o más proteínas según la divulgación, y uno o más inmunógenos (el término inmunógeno se definió anteriormente) de al menos otro agente patógeno (en particular de la lista anterior), y/u otro agente patógeno en forma inactivada o atenuada. Como se describió anteriormente, estas composiciones o vacunas multivalentes también comprenden un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable, y en su caso, un adyuvante..
La presente invención también tiene por objeto métodos de inmunización y de vacunación de las especies diana mencionadas anteriormente.
Estos métodos comprenden la administración de una cantidad eficaz de una composición inmunógena o de una vacuna según la invención. Esta administración puede realizarse particularmente por la vía parenteral, por ejemplo por administración subcutánea, intradérmica, intramuscular, o por vía oral y/o nasal. Pueden realizarse una o varias administraciones, particularmente dos.
Las diferentes vacunas pueden inyectarse mediante un inyector de chorro líquido sin aguja. Para los plásmidos se pueden usar también partículas de oro recubiertas de plásmido y proyectadas de manera que penetren en las células de la piel del sujeto que se va a inmunizar (Tang y col. Nature 1992. 356. 152-154).
Las composiciones inmunógenas y las vacunas según la invención comprenden una cantidad eficaz de vector de expresión según la invención.
En el caso de composiciones inmunógenas o de vacunas a base de plásmido, una dosis incluye de manera general de 10 pg aproximadamente a 2000 pg aproximadamente, especialmente de 50 pg aproximadamente a 1000 pg aproximadamente. Los volúmenes de dosis pueden estar comprendidos entre 0,1 y 2 ml, preferentemente entre 0,2 y 1 ml.
Estas dosis y volúmenes de dosis están bien adaptados para la vacunación de equinos y mamíferos.
Para la vacunación de especies aviares, una dosis está más particularmente comprendida entre aproximadamente 10 pg y aproximadamente 500 pg, y preferentemente, entre aproximadamente 50 pg y aproximadamente 200 pg. Los volúmenes de dosis pueden estar más particularmente comprendidos entre 0,1 y 1 ml, preferentemente entre 0,2 y 0,5 ml.
El experto en la materia tiene las habilidades necesarias para optimizar la dosis eficaz de plásmido que se utilizará en cada protocolo de inmunización o vacunación y para definir la mejor vía de administración.
En el caso de las composiciones inmunógenas o de las vacunas a base de poxvirus, de manera general, una dosis comprende entre aproximadamente 102 ufp y aproximadamente 109 ufp.
Para las especies equinas y los mamíferos, cuando el vector es el virus de la variolovacuna, la dosis está más particularmente comprendida entre aproximadamente 104 ufp y aproximadamente 109 ufp, preferentemente entre aproximadamente 106 y aproximadamente 108 ufp; cuando el vector es el virus de la viruela del canario, la dosis está más particularmente comprendida entre aproximadamente 105 ufp y aproximadamente 109 ufp, preferentemente entre aproximadamente 1055 o 106 y aproximadamente 108 ufp.
Para las especies aviares, cuando el vector es el virus de la viruela del canario, la dosis está más particularmente comprendida entre aproximadamente 103 ufp y aproximadamente 107 ufp, preferentemente entre aproximadamente 104 y aproximadamente 106 ufp; cuando el vector es el virus de la viruela aviar, la dosis está más particularmente comprendida entre aproximadamente 102 ufp y aproximadamente 105 ufp, preferentemente entre aproximadamente 103 y aproximadamente 105 ufp.
En el caso de composiciones inmunógenas o vacunas basadas en un vector vírico distinto del poxvirus, en particular un herpervirus, una dosis está generalmente comprendida entre aproximadamente 103 ufp y aproximadamente 108 ufp. En el caso de composiciones inmunógenas o vacunas aviares, una dosis está generalmente comprendida entre aproximadamente 103 ufp y aproximadamente 106 ufp. En el caso de composiciones inmunógenas o vacunas equinas, una dosis está generalmente comprendida entre aproximadamente 106 ufp y aproximadamente 108 ufp.
Los volúmenes de dosis de las composiciones inmunógenas y de las vacunas de equinos basadas en vectores víricos, están generalmente comprendidos entre 0,5 y 2,0 ml, preferentemente entre 1,0 y 2,0 ml, preferentemente es de 1,0 ml. Los volúmenes de dosis de las composiciones inmunógenas y de las vacunas aviares basadas en vectores víricos están generalmente comprendidos entre 0,1 y 1,0 ml, preferentemente entre 0,1 y 0,5 ml, preferentemente entre 0,2 y 0, 3 ml. El experto en la materia también posee, para este tipo de vacuna, las habilidades necesarias para optimizar el número de administraciones, la vía de administración y las dosis que se utilizarán en cada protocolo de inmunización. En particular se prevén dos administraciones en el caballo, por ejemplo, con un intervalo de 35 días.
En el caso de composiciones inmunógenas o de vacunas subunitarias, una dosis generalmente comprende de aproximadamente 10 pg a aproximadamente 2000 pg, en particular de aproximadamente 50 pg a aproximadamente 1 000 pg. Los volúmenes de dosis de las composiciones inmunógenas y de las vacunas equinas basadas en vectores víricos están generalmente comprendidos entre 1,0 y 2,0 ml, preferentemente entre 0,5 y 2,0 ml, preferentemente es de 1,0 ml. Los volúmenes de dosis de las composiciones inmunógenas y de las vacunas aviares basadas en vectores víricos están generalmente comprendidos entre 0,1 y 1,0 ml, preferentemente entre 0,1 y 0,5 ml, preferentemente entre 0,2 y 0, 3 ml. El experto en la materia también posee, para este tipo de vacuna, las habilidades necesarias para optimizar el número de administraciones, la vía de administración y las dosis que se utilizarán en cada protocolo de inmunización.
La invención también se refiere al uso de un vector de expresión in vivo según la invención, para la preparación de una composición inmunógena o de una vacuna destinada a proteger las especies diana contra el virus WN, y en su caso, contra al menos otro agente patógeno. Las diferentes características enunciadas en el resto de la descripción se aplican a este otro objeto de la invención
Una vacuna vírica según la presente invención, no inducirá en el animal vacunado la producción de anticuerpos contra las otras proteínas de este virus que no están representadas en la composición inmunógena o vacuna. Esta característica puede usarse para el desarrollo de métodos de diagnóstico diferencial que permiten establecer la distinción entre los animales infectados por el virus patógeno WN y los animales vacunados con la ayuda de las vacunas según la invención. En estos últimos, estas proteínas y/o anticuerpos dirigidos contra ellas, están presentes y pueden detectarse mediante una reacción de antígeno-anticuerpo. No sucede así en los animales vacunados de acuerdo con la invención, que permanecen negativos. Para realizar esta discriminación, se usa una proteína que no está representada en la vacuna (no presente o no expresada), por ejemplo, la proteína C o la proteína NS1, NS2A, NS2B o NS3 cuando no está representada en la vacuna.
La presente divulgación describe por tanto el uso de un vector según la invención para la preparación de composiciones inmunógenas y de vacunas que permiten discriminar entre animales vacunados y animales infectados.
También tiene por objeto un método de inmunización y de vacunación asociado a un método de diagnóstico que permite esta discriminación.
La proteína seleccionada para el diagnóstico, o uno de sus fragmentos o epítopos, se usa como antígeno en el ensayo de diagnóstico, y/o se usa para producir anticuerpos, policlonales o monoclonales. El experto en la materia dispone de los conocimientos y de la práctica para producir estos anticuerpos y para implementar antígenos y/o anticuerpos en las técnicas de diagnóstico clásicas, por ejemplo, ensayos ELISA.
A continuación se describirá la invención con más detalle utilizando modos de realización tomados como ejemplos no limitativos.
Ejemplos:
Todas las construcciones se realizan usando técnicas convencionales de biología molecular (clonación, digestión por enzimas de restricción, síntesis de un ADN complementario monocatenario, reacción en cadena de la polimerasa, elongación de un oligonucleótido por una ADN polimerasa...) descritas por Sambrook J. y col. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2a edición. Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor. Nueva York. 1989). Todos los fragmentos de restricción usados para la presente invención, así como los diversos fragmentos de amplificación por reacción en cadena de la polimerasa (= RCP o PCR), se aíslan y se purifican usando el kit "Geneclean®" (BIO101 Inc. La Jolla, CA).
Ejemplo 1: Cultivo del virus de la fiebre del Nilo
Para su amplificación, se cultivan virus de la fiebre del Nilo NY99 (Lanciotti R. S. y col., Science, 1999, 286, 2333-7) en células VERO (células renales de mono, accesibles en la American Type Culture Collection (ATCC) con el número CCL-81).
Las células VERO se ponen en cultivo en un matraz Falcon de 25 cm2 con medio Eagle-MEM complementado con extractos de levadura al 1 % y suero de ternera al 10 % que contiene aproximadamente 100000 células por ml. Las células se cultivan a 37 °C, en una atmósfera con CO2 al 5 %.
Después de 3 días, la capa celular llega a la confluencia. El medio de cultivo se sustituye después por medio Eagle-MEM complementado con extractos de levadura al 1 % y albúmina de suero bovino al 0,1 % y se añade el virus de la fiebre del Nilo a razón de 5 ufp/célula.
Cuando se ha completado el efecto citopatógeno (CPE) (generalmente 48-72 horas después del inicio de la puesta en cultivo), las suspensiones víricas se recogen y después se aclaran con centrifugación y se congelan a -70 °C. Generalmente se necesitan de 3 a 4 pases sucesivos para la producción de un lote vírico. El lote vírico se conserva a -70 2C.
Ejemplo 2: Extracción del ARN vírico del virus de la fiebre del Nilo
El ARN vírico contenido en 100 ml de suspensión vírica de la cepa de virus de la fiebre del Nilo NY99 se extrae después de la descongelación con las soluciones del kit “High Pure™ Viral RNA Kit” Cat # 1858882, Roche Molecular Biochemicals), según las instrucciones del proveedor para las etapas de extracción. El sedimento de ARN obtenido al final de la extracción se vuelve a poner en suspensión con 1 a 2 ml de agua destilada estéril sin RNasa.
Ejemplo 3: Construcción del plásmido pFC101
El ADN complementario (ADNc) del virus de la fiebre del Nilo NY99 se sintetiza con el kit “Gene Amp RNA PCR Kit” (Cat # N 8080017, Perkin-Elmer, Norwalk, CT 06859, EE.UU.) usando las condiciones indicadas por el proveedor.
Se realiza una reacción de transcripción inversa, seguida de una reacción de amplificación en cadena (reacción “TI-RCP” o “RT-PCR”), con 50 pl de la suspensión de ARN vírico del virus de la fiebre del Nilo NY99 (ejemplo: 2) y con los siguientes oligonucleótidos:
FC101 (30 meros) (SEQ ID NO: 1)
5'TTTTTT GAATTCGTT ACCCT CT CT AACTT C 3' y
FC102 (33 meros) (SEQ ID NO: 2)
5'TTTTTTTCTAGATTACCTCCGACTGCGTCTTGA 3'.
Este par de oligonucleótidos permite la incorporación de un sitio de restricción EcoRI y de un sitio de restricción Xbal y de un codón de terminación en posición 3' del inserto.
La síntesis de la primera cadena de ADNc se realiza por elongación del oligonucleótido FC102, después de la hibridación de este último en la matriz de ARN.
Las condiciones de síntesis de la primera cadena de ADNc son, una temperatura de 42 °C durante 15 min, después de 99 °C durante 5 min, y finalmente, de 4 °C durante 5 min. Las condiciones de reacción de la PCR en presencia del par de oligonucleótidos FC101 y FC102 son, una temperatura de 95 °C durante 2 min, después 35 ciclos (95 °C durante 1 min, después 62 °C durante 1 min y 72 °C durante 2 min), y finalmente, 72 °C durante 7 min para producir un fragmento de 302 pb.
Este fragmento se digiere con EcoRI y después con Xbal para aislar, después de electroforesis en gel de agarosa, el fragmento EcoRI-Xbal de aproximadamente 290 pb. Este fragmento se denomina fragmento A.
El plásmido de expresión eucariota pVR1020 (C. J. Luke y col. J. of Infectious Diseases. 1997. 175. 95-97), derivado del plásmido pVR1012 (figura 1 y ejemplo 7 del documento WO-A-98/03199; Hartikka J. y col., 1997, Human Gene Therapy, 7, 1205-1217), contiene la fase codificante de la secuencia señal del activador del plasminógeno tisular humano (tPA).
Mediante digestión con BamHI-BglII e inserción de una secuencia que contiene varios sitios de clonación (BamHI, Notl, EcoRI, XbaI, PmlI, PstI, BglII), se modifica un plásmido pVR1020 y se genera el emparejamiento de los siguientes oligonucleótidos:
PB326 (40 meros) (SEQ ID NO: 3)
5'GATCTGCAGCACGTGTCTAGAGGATATCGAATTCGCGGCC 3' y
PB329 (40 meros) (SEQ ID NO: 4)
5' GATCCGCGGGCGCGAATTCGATATCCTCTAGACACGTGCT 3'.
El vector obtenido de esta manera, con un tamaño de aproximadamente 5105 pares de bases (o pb), se denomina pAB110.
El fragmento A se liga con el plásmido de expresión pAB110 digerido previamente con XbaI y EcoRI, para dar el plásmido pFC101 (5376 pb). Este plásmido contiene, bajo el control del promotor temprano del citomegalovirus humano o hCMV-IE (human Cytomegalovirus Immediate Early), un inserto codificante de la secuencia señal del activador del tPA seguido de la secuencia codificante de la proteína prM.
Ejemplo 4: Construcción del plásmido pFC102
El ADN complementario (ADNc) del virus de la fiebre del Nilo NY99 se sintetiza con el kit “Gene Amp RNA PCR Kit” (Cat # N 8080017, Perkin-Elmer, Norwalk, CT 06859, EE.UU.) usando las condiciones indicadas por el proveedor.
Se realiza una transcripción inversa, seguida de una reacción de amplificación en cadena (Reacción “TI-RCP” o “RT-PCR”) con 50 pl de la suspensión de ARN vírico del virus de la fiebre del Nilo NY99 (ejemplo 2) y con los siguientes oligonucleótidos:
FC103 (30 meros) (SEQ ID NO: 5)
5' TTTTTTGAATTCTCACTGACAGTGCAGACA 3' y
FC104 (33 meros) (SEQ ID NO: 6)
5' TTTTTTTCTAGATTAGCTGTAAGCTGGGGCCAC 3'.
Este par de oligonucleótidos permite la incorporación de un sitio de restricción EcoRI y de un sitio de restricción XbaI y de un codón de terminación en posición 3' del inserto.
La síntesis de la primera cadena de ADNc se realiza por elongación del oligonucleótido FC104, después de la hibridación de este último en la matriz de ARN.
Las condiciones de síntesis de la primera cadena de ADNc son, una temperatura de 42 °C durante 15 min, después de 99 °C durante 5 min, y finalmente, de 4 °C durante 5 min. Las condiciones de reacción de la PCR en presencia del par de oligonucleótidos FC103 y FC104 son, una temperatura de 95 °C durante 2 min, después 35 ciclos (95 °C durante 1 min, después 62 °C durante 1 min y 72 °C durante 2 min), y finalmente, 72 °C durante 7 min para producir un fragmento de 252 pb.
Este fragmento se digiere con EcoRI y después con XbaI para aislar, después de electroforesis en gel de agarosa, el fragmento EcoRI-XbaI de aproximadamente 240 pb. Este fragmento se liga con el plásmido de expresión pAB110 (ejemplo 3) digerido previamente con XbaI y EcoRI, para dar el plásmido pFC102 (5326 pb). Este plásmido contiene, bajo el control del promotor temprano del citomegalovirus humano o hCMV-IE (human Cytomegalovirus Immediate Early), un inserto codificante de la secuencia señal del activador del tPA seguido de la secuencia codificante de la proteína M.
Ejemplo 5: Construcción del plásmido pFC103
El ADN complementario (ADNc) del virus de la fiebre del Nilo NY99 se sintetiza con el kit “Gene Amp RNA PCR Kit” (Cat # N 8080017, Perkin-Elmer, Norwalk, CT 06859, EE.UU.) usando las condiciones indicadas por el proveedor.
Se realiza una reacción de transcripción inversa, seguida de una reacción de amplificación en cadena (Reacción “TI-RCP” o “RT-PCR”) con 50 pl de la suspensión de ARN vírico del virus de la fiebre del Nilo NY99 (ejemplo 2) y con los siguientes oligonucleótidos:
FC105 (30 meros) (SEQ ID NO: 7)
5' TTTTTTGAATTCTTCAACTGCCTTGGAATG 3' y
FC106 (33 meros) (SEQ ID NO: 8)
5' TTTTTTTCTAGATTAAGCGTGCACGTTGACGGA 3'.
Este par de oligonucleótidos permite la incorporación de un sitio de restricción EcoRI y de un sitio de restricción Xbal y de un codón de terminación en posición 3' del inserto.
La síntesis de la primera cadena de ADNc se realiza por elongación del oligonucleótido FC106, después de la hibridación de este último en la matriz de ARN.
Las condiciones de síntesis de la primera cadena de ADNc son, una temperatura de 42 °C durante 15 min, después de 99 °C durante 5 min, y finalmente, de 4 °C durante 5 min. Las condiciones de reacción de la PCR en presencia del par de oligonucleótidos FC105 y FC106 son, una temperatura de 95 °C durante 2 min, después 35 ciclos (95 °C durante 1 min, después 62 °C durante 1 min y 72 °C durante 2 min), y finalmente, 72 °C durante 7 min para producir un fragmento de 1530 pb.
Este fragmento se digiere con EcoRI y después con XbaI para aislar, después de electroforesis en gel de agarosa, el fragmento EcoRI-XbaI de aproximadamente 1518 pb. Este fragmento se liga con el plásmido de expresión pAB110 (ejemplo 3) digerido previamente con XbaI y EcoRI, para dar el plásmido pFC103 (6604 pb). Este plásmido contiene, bajo el control del promotor temprano del citomegalovirus humano o hCMV-IE (human Cytomegalovirus Immediate Early), un inserto codificante de la secuencia señal del activador del tPA seguido de la secuencia codificante de la proteína E.
Ejemplo 6: Construcción del plásmido pFC104
El ADN complementario (ADNc) del virus de la fiebre del Nilo NY99 se sintetiza con el kit “Gene Amp RNA PCR Kit” (Cat # N 8080017, Perkin-Elmer, Norwalk, CT 06859, EE.UU.) usando las condiciones indicadas por el proveedor.
Se realiza una reacción de transcripción inversa, seguida de una reacción de amplificación en cadena (Reacción “TI-RCP” o “RT-PCR”) con 50 pl de la suspensión de ARN vírico del virus de la fiebre del Nilo NY99 (ejemplo 2) y con los siguientes oligonucleótidos:
FC101 (30 meros) (SEQ ID NO: 1) y
FC106 (33 meros) (SEQ ID NO: 8).
Este par de oligonucleótidos permite la incorporación de un sitio de restricción EcoRI y de un sitio de restricción XbaI y de un codón de terminación en posición 3' del inserto.
La síntesis de la primera cadena de ADNc se realiza por elongación del oligonucleótido FC106, después de hibridación de este último en la matriz de ARN.
Las condiciones de síntesis de la primera cadena de ADNc son, una temperatura de 42 °C durante 15 min, después de 99 °C durante 5 min, y finalmente, de 4 °C durante 5 min. Las condiciones de reacción de la PCR en presencia del par de oligonucleótidos FC101 y FC106 son, una temperatura de 95 °C durante 2 min, después 35 ciclos (95 °C durante 1 min, después 62 °C durante 1 min y 72 °C durante 2 min), y finalmente, 72 °C durante 7 min para producir un fragmento de 2031 pb.
Este fragmento se digiere con EcoRI y después con XbaI para aislar, después de electroforesis en gel de agarosa, el fragmento EcoRI-XbaI de aproximadamente 2019 pb. Este fragmento se liga con el plásmido de expresión pAB110 (ejemplo 3) digerido previamente con XbaI y EcoRI, para dar el plásmido pFC104 (7105 pb). Este plásmido contiene, bajo el control del promotor temprano del citomegalovirus humano o hCMV-IE (human Cytomegalovirus Immediate Early), un inserto codificante de la secuencia señal del activador del tPA seguido de la secuencia codificante de la proteína prM-M-E.
Ejemplo 7: Construcción del plásmido pFC105
El ADN complementario (ADNc) del virus de la fiebre del Nilo NY99 se sintetiza con el kit “Gene Amp RNA PCR Kit” (Cat # N 8080017, Perkin-Elmer, Norwalk, CT.06859, EE.UU.) usando las condiciones indicadas por el proveedor. Se realiza una reacción de transcripción inversa, seguida de una reacción de amplificación en cadena (Reacción “TI-RCP” o “RT-PCR”) con 50 pml de la suspensión de ARN vírico del virus de la fiebre del Nilo NY99 (ejemplo 2) y con los siguientes oligonucleótidos:
FC107 (36 meros) (SEQ ID NO: 9)
5' TTTTTTGATATCACCGGAATTGCAGTCATGATTGGC 3' y
FC106 (33 meros) (SEQ ID NO: 8).
Este par de oligonucleótidos permite la incorporación de un sitio de restricción EcoRV y de un sitio de restricción Xbal y de un codón de terminación en posición 3' del inserto.
La síntesis de la primera cadena de ADNc se realiza por elongación del oligonucleótido FC106, después de hibridación de este último en la matriz de ARN.
Las condiciones de síntesis de la primera cadena de ADNc son, una temperatura de 42 °C durante 15 min, después de 99 °C durante 5 min, y finalmente, de 4 °C durante 5 min. Las condiciones de reacción de la PCR en presencia del par de oligonucleótidos FC106 y FC107 son, una temperatura de 95 °C durante 2 min, después 35 ciclos (95 °C durante 1 min, después 62 °C durante 1 min y 72 °C durante 2 min), y finalmente, 72 °C durante 7 min para producir un fragmento de 2076 pb.
Este fragmento se digiere con EcoRV y después con Xbal para aislar, después de electroforesis en gel de agarosa, el fragmento EcoRV-Xbal de aproximadamente 2058 pb.
Este fragmento se liga con el plásmido de expresión pVR1012, digerido previamente con Xbal y EcoRV, para dar el plásmido pFC105 (6953 pb). Este plásmido contiene, bajo el control del promotor temprano del citomegalovirus humano o hCMV-IE (human Cytomegalovirus Immediate Early), un inserto codificante de la poliproteína prM-M-E. Ejemplo 8: Construcción del plásmido pFC106
El ADN complementario (ADNc) del virus de la fiebre del Nilo NY99 se sintetiza con el kit “Gene Amp RNA PCR Kit” (Cat # N 8080017, Perkin-Elmer, Norwalk, CT 06859, EE.UU.) usando las condiciones indicadas por el proveedor. Se realiza una reacción de transcripción inversa, seguida de una reacción de amplificación en cadena (Reacción “Tl-RCP” o “RT-PCR”) con 50 pl de la suspensión de ARN vírico del virus de la fiebre del Nilo NY99 (ejemplo 2) y con los siguientes oligonucleótidos:
FC108 (36 meros) (SEQ lD NO: 10)
5' TTTTTTGATATCATGTATAATGCTGATATGATTGAC 3' y
FC109 (36 meros) (SEQ lD NO: 11)
5' TTTTTTTCTAGATTAACGTTTTCCCGAGGCGAAGTC 3'.
Este par de oligonucleótidos permite la incorporación de un sitio de restricción EcoRV y de un sitio de restricción Xbal, de un codón ATG iniciador en posición 5' y de un codón de terminación en posición 3' del inserto.
La síntesis de la primera cadena de ADNc se realiza por elongación del oligonucleótido FC109, después de hibridación de este último en la matriz de ARN.
Las condiciones de síntesis de la primera cadena de ADNc son, una temperatura de 42 °C durante 15 min, después de 99 °C durante 5 min, y finalmente, de 4 °C durante 5 min. Las condiciones de reacción de la PCR en presencia del par de oligonucleótidos FC108 y FC109 son, una temperatura de 95 °C durante 2 min, después 35 ciclos (95 °C durante 1 min, después 62 °C durante 1 min y 72 °C durante 2 min), y finalmente, 72 °C durante 7 min para producir un fragmento de 2973 pb.
Este fragmento se digiere con EcoRV y después con Xbal para aislar, después de electroforesis en gel de agarosa, el fragmento EcoRV-Xbal de aproximadamente 2955 pb.
Este fragmento se liga con el plásmido de expresión pVR1012, digerido previamente con Xbal y EcoRV, para dar el plásmido pFC106 (7850 pb). Este plásmido contiene, bajo el control del promotor temprano del citomegalovirus humano o hCMV-lE (human Cytomegalovirus Immediate Early), un inserto codificante de la poliproteína NS2A-NS2B-NS3.
Ejemplo 9: Construcción del plásmido donador para la inserción en el s itio C5 del virus de la viruela del canario ALVAC
En la figura 16 de la patente US-A-5756 103 se muestra la secuencia de un fragmento de 3199 pb del ADN genómico del virus de la viruela del canario. El análisis de esta secuencia ha revelado un marco abierto de lectura (ORF) que se ha denominado C5L, que comienza en la posición 1538 y termina en la posición 1859. La construcción de un plásmido de inserción que conduce a la deleción del ORF C5L y a su sustitución por un sitio de clonación múltiple flanqueado por señales de detención de la transcripción y de la traducción, se realizó como se describe a continuación.
Se realizó una reacción PCR a partir de la matriz constituida por el ADN genómico del virus de la viruela de canario y con los siguientes oligonucleótidos:
C5A1 (42 meros) (SEQ ID NO: 12):
5' ATCATCGAGCTCCAGCTGTAATTCATGGTCGAAAAGAAGTGC3' y
3’C5B1 (73 meros) (SEQ ID NO:13):
5’GAATTCCT CG AGCTGC AGCCCGGGTTTTT AT AGCT AATT AGT CAT
TTTTTGAGAGTACCACTTCAGCTACGTC 3’ .
para aislar un fragmento de PCR de 223 pb (fragmento B).
Se realizó una reacción PCR a partir de la matriz constituida por el ADN genómico del virus de la viruela del canario y con los siguientes oligonucleótidos:
C5C1 (72 meros) (SEQ ID NO: 14):
5’CCCGGG CTG C AG CT CG AGG AATT CTTTTT ATT G ATT AACTAGT C A
TTATAAAGATCTAAAATGCATAATTTC 3’
y C5D1 (45 meros) (SEQ ID NO: 15):
5' GAT GAT GGT ACCGT AAACAAAT AT AAT GAAAAGT ATT CT AAACT A 3'
para aislar un fragmento de PCR de 482 pb (fragmento C).
Los fragmentos B y C se hibridaron conjuntamente para servir de matriz a una reacción de PCR realizada con los oligonucleótidos C5A1 (SEQ ID NO: 12) y C5D1 (SeQ ID NO: 15) para generar un fragmento de PCR de 681 pb. Este fragmento se digirió con las enzimas de restricción SacI y Kpnl, para aislar, después de electroforesis en gel de agarosa, un fragmento Sacl-Kpnl de 664 pb. Este fragmento se ligó con el vector pBlueScript® Il SK+ (Stratagene, La Jolla, CA, EE.UU., Cat # 212205), digerido previamente con las enzimas de restricción SacI y KpnI, para dar el plásmido pC5L. La secuencia de este plásmido se verificó mediante secuenciación. Este plásmido contiene 166 pb de secuencias situadas en dirección 5' del ORF C5L (“brazo flanqueante izquierdo C5”), una señal de vacuna de detención precoz de la transcripción, codones de terminación en las 6 fases de lectura, un sitio de clonación múltiple que contiene los sitios dé restricción SmaI, PstI, XhoI y EcoRI, y finalmente, 425 pb de secuencias situadas en dirección 3' del ORF C5L (“brazo flanqueante derecho C5”).
El plásmido pMP528HRH (Perkus M. y col. J. Virol. 1989. 63. 3829-3836) se usó como matriz para amplificar la secuencia completa del promotor de vacuna H6 (N° de registro de GenBank M28351) con los siguientes oligonucleótidos:
JCA291 (34 meros) (SEQ ID NO: 16)
5' AAACCCGGGTTCTTTATTCTATACTTAAAAAGTG 3' y
JCA292 (43 meros) (SEQ ID NO: 17)
5' AAAAGAATTCGTCGACTACGATACAAACTTAACGGATATCGCG 3'
para amplificar un fragmento de PCR de 149 pb. Este fragmento se digirió con las enzimas de restricción SmaI y EcoRI para aislar, después de electroforesis en gel de agarosa, un fragmento de restricción SmaI-EcoRI de 138 pb. Este fragmento se ligó después con el plásmido pC5L, previamente digerido con Smal y EcoRI, para dar el plásmido pFC107.
Ejemplo 10: Construcción del virus recombinante vCP1712
Se realizó una reacción de PCR usando, como matriz, el plásmido pFC105 (ejemplo 7) y los siguientes oligonucleótidos:
FC110 (33 meros) (SEQ ID NO: 18):
5' TTTTCGCGAACCGGAATTGCAGTCATGATTGGC 3' y
FC111 (39 meros) (SEQ ID NO: 19):
5' TTTTGTCGACGCGGCCGCTTAAGCGTGCACGTTCACGGA 3'
para amplificar un fragmento de PCR de aproximadamente 2079 pb. Este fragmento se digerió con las enzimas de restricción NruI y SalI para aislar, después de electroforesis en gel de agarosa, un fragmento dé restricción NruI-SalI de aproximadamente 2068 pb. Este fragmento se ligó después con el plásmido pFC107 (ejemplo 9) digerido previamente con las enzimas de restricción NruI y SalI para dar el plásmido pFC108.
El plásmido pFC108 se linealizó con Notl, y después se transfectó en células primarias de embriones de pollo infectadas con el virus de la viruela del canario (cepa ALVAC) según la técnica de precipitación con fosfato de calcio descrita anteriormente (Panicali y Paoletti Proc. Nat. Acad. Sci. 1982. 79. 4927-4931; Piccini y col. In Methods in Enzymology. 1987. 153. 545-563. Eds. Wu R. and Grossman L. Academic Press). Se seleccionaron intervalos positivos basándose en una hibridación con una sonda radiomarcada específica de la secuencia de nucleótidos de la glucoproteína de envoltura E. Estos intervalos se sometieron a 4 ciclos sucesivos de selección/purificación de intervalos hasta haber aislado una población pura. A continuación, se amplificó un intervalo representativo de la recombinación in vitro entre el plásmido donador pFC108 y el genoma del virus de la viruela de canario ALVAC y la reserva de virus recombinante obtenido se denominó vCP1712.
Ejemplo 11: Construcción del virus recombinante vCP1713
El plásmido pFC104 (ejemplo 6) se digirió con las enzimas de restricción SalI y PmlI para aislar, después de electroforesis en gel de agarosa, un fragmento de restricción PmlI-SalI de aproximadamente 2213 pb. Este fragmento se ligó con el plásmido pFC107 (ejemplo 9) digerido previamente con las enzimas de restricción NruI y SalI para dar el plásmido pFC109.
El plásmido pFC109 se linealizó con NotI, y después se transfectó en células primarias de embriones de pollo infectadas con el virus de la viruela del canario (cepa ALVAC) según la técnica del ejemplo 10. Se seleccionó un intervalo representativo de la recombinación in vitro entre el plásmido donador pFC109 y el genoma del virus de la viruela del canario ALVAC basándose en una hibridación con una sonda radiomarcada específica de la secuencia de nucleótidos de la glucoproteína de envoltura E y después se amplificó. La reserva de virus recombinante obtenido se denominó vCP1713.
Ejemplo 12: Construcción del virus recombinante vCP1714
El plásmido pFC103 (ejemplo 5) se digirió con las enzimas de restricción SalI y PmlI para aislar, después de electroforesis en gel de agarosa, un fragmento de restricción PmlI-SalI de aproximadamente 1712 pb. Este fragmento se ligó con el plásmido pFC107 (ejemplo 9) digerido previamente con las enzimas de restricción NruI y SalI para dar el plásmido pFC110.
El plásmido pFC110 se linealizó con Notl, y después se transfectó en células primarias de embriones de pollo infectadas con el virus de la viruela del canario (cepa ALVAC) según la técnica del ejemplo 10. Se seleccionó un intervalo representativo de la recombinación in vitro entre el plásmido donador pFC110 y el genoma del virus de la viruela del canario ALVAC basándose en una hibridación con una sonda radiomarcada específica de la secuencia de nucleótidos de la glucoproteína de envoltura E y después se amplificó. La reserva de virus recombinante obtenido se denominó vCP1714.
Ejemplo 13: Construcción del virus recombinante vCP1715
El plásmido pFC102 (ejemplo 4) se digirió con las enzimas de restricción Sall y Pmll para aislar, después de electroforesis en gel de agarosa, un fragmento de restricción PmlI-SalI de aproximadamente 434 pb. Este fragmento se ligó con el plásmido pFC107 (ejemplo 9) digerido previamente con las enzimas de restricción NruI y SalI para dar el plásmido pFC111.
El plásmido pFC111 se linealizó con NotI, y después, se transfectó en células primarias de embriones de pollo infectadas con el virus de la viruela del canario (cepa ALVAC) según la técnica del ejemplo 10. Se seleccionó un intervalo representativo de la recombinación in vitro entre el plásmido donador pFC111 y el genoma del virus de la viruela del canario ALVAC basándose en una hibridación con una sonda radiomarcada específica de la secuencia de nucleótidos de la glucoproteína de membrana M y después se amplificó. La reserva de virus recombinante obtenido se denominó vCP1715.
Ejemplo 14: Construcción del virus recombinante vCP1716
El plásmido pFC101 (ejemplo 3) se digirió con las enzimas de restricción SalI y Pmll para aislar, después de electroforesis en gel de agarosa, un fragmento de restricción PmlI-SalI de aproximadamente 484 pb. Este fragmento se ligó con el plásmido pFC107 (ejemplo 9) digerido previamente con las enzimas de restricción NruI y SalI para dar el plásmido pFC112.
El plásmido pFC112 se linealizó con Notl, y después, se transfectó en células primarias de embriones de pollo infectadas con el virus de la viruela del canario (cepa ALVAC) según la técnica del ejemplo 10. Se seleccionó un intervalo representativo de la recombinación in vitro entre el plásmido donador pFC112 y el genoma del virus de la viruela del canario ALVAC basándose en una hibridación con una sonda radiomarcada específica de la secuencia de nucleótidos de la glucoproteína de premembrana prM y después se amplificó. La reserva de virus recombinante obtenido se denominó vCP1716.
Ejemplo 15: Construcción del plásmido donador para la inserción en el sitio C6 del virus de la viruela del canario ALVAC
La figura 4 de la patente WO-A-01/05.934 muestra la secuencia de un fragmento de 3700 pb del ADN genómico del virus de la viruela del canario. El análisis de esta secuencia ha revelado un marco abierto de lectura (ORF) que se ha denominado C6L, que comienza en la posición 377 y termina en la posición 2254. La construcción de un plásmido de inserción que conduce a la deleción del ORF C6L y a su sustitución por un sitio de clonación múltiple flanqueado por señales de detención de la transcripción y de la traducción, se realizó como se describe a continuación.
Se realizó una reacción PCR a partir de la matriz constituida por el ADN genómico del virus de la viruela del canario y con los siguientes oligonucleótidos:
C6A1 (42 meros) (SEQ ID NO: 20):
5' ATCATCGAGCTCGCGGCCGCCTATCAAAAGTCTTAATGAGTT 3' y
C6B1 (73 meros) (SEQ ID NO: 21):
5’GAATTCCTCGAGCTGCAGCCCGGGTTTTTATAGCTAATTAGTCAT
TTTTTCGTAAGTAAGTATTTTTATTTAA 3’
para aislar un fragmento de PCR de 432 pb (fragmento D).
Se realizó una reacción PCR a partir de la matriz constituida por el ADN genómico del virus de la viruela del canario y con los siguientes oligonucleótidos:
C6C1 (72 meros) (SEQ ID NO: 22):
5’CCCGGGCTGCAGCTCGAGGAATTCTTTTTATTGATTAACTAGTCA
AATG AGT AT AT AT AATT G AAAAAGT AA 3'
y C6D1 (45 meros) (SEQ ID NO: 23):
5' GATGATGGTACCTTCATAAATACAAGTTTGATTAAACTTAAGTTG 3'
para aislar un fragmento de PCR de 1210 pb (fragmento E).
Los fragmentos D y E se hibridaron conjuntamente para servir de matriz a una reacción PCR realizada con los oligonucleótidos C6A1 (SEQ ID NO: 20) y C6D1 (SeQ ID NO: 23) para generar un fragmento de PCR de 1630 pb. Este fragmento se digirió con las enzimas de restricción SacI y KpnI, para aislar, después de electroforesis en gel de agarosa, un fragmento SacI-KpnI de 1613 pb. Este fragmento se ligó con el vector pBlueScript® II SK+ (Stratagene, La Jolla, CA, EE.UU., Cat # 212205), digerido previamente con las enzimas de restricción SacI y KpnI, para dar el plásmido pC6L. La secuencia de este plásmido se verificó mediante secuenciación. Este plásmido contiene 370 pb de secuencias situadas en dirección 5’ del ORF C6L (“brazo flanqueante izquierdo C6”), una señal de vacuna de detención precoz de la transcripción, codones de terminación en las 6 fases de lectura, un sitio de clonación múltiple que contiene los sitios de restricción Smal, PstI, XhoI y EcoRI, y finalmente, 1156 pb de secuencias situadas en dirección 3’ del ORF C6L (“brazo flanqueante derecho C6”).
El plásmido pMPIVC (Schmitt J. F. C. y col., J. Virol., 1988, 62, 1889-1897; Saiki R. K. y col., Science, 1988, 239, 487­ 491) se usó como matriz para amplificar la secuencia completa del promotor de vacuna I3L con los siguientes oligonucleótidos:
FC112 (33 meros) (SEQ ID NO: 24):
5' AAACCCGGGCGGTGGTTTGCGATTCCGAAATCT 3' y
FC113 (43 meros) (SEQ ID NO: 25):
5' AAAAGAATTCGGATCCGATTAAACCTAAATAATTGTACTTTGT 3'
para amplificar un fragmento de PCR de 151 pb. Este fragmento ha digirió con las enzimas de restricción SmaI y EcoRI para aislar, después de electroforesis en gel de agarosa, un fragmento de restricción Smal-EcoRI de aproximadamente 136 pb. Este fragmento se ligó después con el plásmido pC6L, digerido previamente con SmaI y EcoRI, para dar el plásmido pFC113.
Ejemplo 16: Construcción de virus recombinantes vCP1717 y vCP1718
Se realizó una reacción PCR usando, como matriz, el plásmido pFC106 (ejemplo 8) y los siguientes oligonucleótidos:
FC114 (33 meros) (SEQ ID NO: 26):
5'TTTCACGTGATGTATAATGCTGATATGATTGAC 3' y
FC115 (42 meros) (SEQ ID NO: 27):
5'TTTTGGATCCGCGGCCGCTTAACGTTTTCCCGAGGCGAAGTC 3'
para amplificar un fragmento de PCR de aproximadamente 2973 pb. Este fragmento se digirió con las enzimas de restricción PmlI y BamHI para aislar, después de electroforesis en gel de agarosa, el fragmento de restricción Pmll-BamHl de aproximadamente 2958 pb (fragmento F). El plásmido pFC113 (ejemplo 15) se digirió con las enzimas de restricción PmlI y BamHI para aislar, después de electroforesis en gel de agarosa, el fragmento de restricción PmlI-BamHI de aproximadamente 4500 pb (fragmento G). A continuación, los fragmentos F y G se ligaron conjuntamente para dar el plásmido pFC114.
El plásmido pFC114 se linealizó con NotI, y después se transfectó en células primarias de embriones de pollo infectadas con el virus de la viruela del canario vCP1713 (ejemplo 11) según la técnica de precipitación con fosfato de calcio descrita anteriormente (Panicali y Paoletti Proc. Nat. Acad. Sci. 1982. 79. 4927-4931; Piccini y col. In Methods in Enzymology. 1987. 153. 545-563. Eds. Wu R. and Grossman L. Academic Press). Se seleccionaron intervalos positivos basándose en una hibridación con una sonda radiomarcada específica de la secuencia de nucleótidos de la glucoproteína de envoltura E. Estos intervalos se sometieron a 4 ciclos sucesivos de selección/purificación de intervalos hasta aislar una población pura. A continuación, se amplificó un intervalo representativo de la recombinación in vitro entre el plásmido donador pFC114 y el genoma del virus de la viruela del canario ALVAC y la reserva de virus recombinante obtenido se denominó vCP1717.
El plásmido pFC114 linealizado con NotI también sirvió para transfectar células primarias de embriones de pollo infectadas con el virus de la viruela del canario vCP1712 (ejemplo 10) según la técnica descrita anteriormente. La reserva de virus recombinante obtenido de esta manera se denominó vCP1718.
Ejemplo 17: Construcción del plásmido pFC115
El ADN complementario (ADNc) del virus de la fiebre del Nilo NY99 se sintetizó con el kit “Gene Amp RNA PCR Kit” (Cat # N 8080017, Perkin-Elmer, Norwalk, CT 06859, EE.UU.) usando las condiciones indicadas por el proveedor.
Se realizó una reacción de transcripción inversa, seguida de una reacción de amplificación en cadena (Reacción “TI-RCP” o “RT-PCR”) con 50 ml de la suspensión de ARN vírico del virus de la fiebre del Nilo NY99 (ejemplo 2) y con los siguientes oligonucleótidos:
FC116 (39 meros) (SEQ ID NO: 28)
5' TTTTTTGATATCATGACCGGAATTGCAGTCATGATTGGC 3' y
FC106 (33 meros) (SEQ ID NO: 8).
Este par de oligonucleótidos permite la incorporación de un sitio de restricción EcoRV y de un sitio de restricción XbaI, de un codón iniciador en posición 5' y de un codón de terminación en posición 3' del inserto.
La síntesis de la primera cadena de ADNc se realiza por elongación del oligonucleótido FC106, después de hibridación de este último en la matriz de ARN.
Las condiciones de síntesis de la primera cadena de ADNc son, una temperatura de 42 °C durante 15 min, después de 99 °C durante 5 min, y finalmente, de 4 °C durante 5 min. Las condiciones de la reacción PCR en presencia del par de oligonucleótidos FC106 y FC116 son, una temperatura de 95 °C durante 2 min, después 35 ciclos (95 °C durante 1 min, después 62 °C durante 1 min y 72 °C durante 2 min), y finalmente, 72 °C durante 7 min para producir un fragmento de 2079 pb.
Este fragmento se digirió con EcoRV y después con Xbal para aislar, después de electroforesis en gel de agarosa, el fragmento EcoRV-Xbal de aproximadamente 2061 pb.
Este fragmento se ligó con el plásmido de expresión pVR1012, digerido previamente con Xbal y EcoRV, para dar el plásmido pFC115 (6.956 pb). Este plásmido contiene, bajo el control del promotor temprano del citomegalovirus humano o hCMV-IE (human Cytomegalovirus Immediate Early), un inserto codificante de la poliproteína prM-M-E.
Ejemplo 18: Construcción del virus recombinante vCP2017
Se realizó una reacción PCR usando, como matriz, el plásmido pFC115 (ejemplo 17) y los siguientes oligonucleótidos:
FC117 (36 meros) (SEQ ID NO: 29):
5' TTTTCGCGAATGACCGGAATTGCAGTCATGATTGGC 3' y
FC111 (39 meros) (SEQ ID NO: 19)
para amplificar un fragmento de PCR de aproximadamente 2082 pb. Este fragmento se digirió con las enzimas de restricción NruI y SalI para aislar, después de electroforesis en gel de agarosa, un fragmento de restricción NruI- SalI de aproximadamente 2071 pb. Este fragmento se ligó después con el plásmido pFC107 (ejemplo 9) digerido previamente con las enzimas de restricción Nrul y SalI para dar el plásmido pFC116.
El plásmido pFC116 se linealizó con NotI, y después, se transfectó en células primarias de embriones de pollo infectadas con el virus de la viruela del canario (cepa ALVAC) según la técnica del ejemplo 10. Se seleccionó un intervalo representativo de la recombinación in vitro entre el plásmido donador pFC116 y el genoma del virus de la viruela del canario ALVAC basándose en una hibridación con una sonda radiomarcada específica de la secuencia de nucleótidos de la glucoproteína de envoltura E y después se amplificó. La reserva de virus recombinante obtenido se denominó vCP2017.
Ejemplo 19: Producción de vacunas recombinantes
Para la preparación de vacunas de equinos, al virus recombinante de la viruela del canario vCP1712 (ejemplo 10), se le añade como adyuvante soluciones de carbómero, en concreto Carbopol™ 974P, fabricado por BF Goodrich, Ohio, EE.UU. (con un peso molecular de aproximadamente 3000000).
Se prepara inicialmente una solución de reserva al 1,5 % de Carbopol™ 974P en agua destilada que contiene 1 g/l de cloruro de sodio. A continuación, esta solución de reserva se usa para la elaboración de una solución de Carbopol™ 974P a 4 mg/ml en agua fisiológica. La solución de reserva se mezcla al volumen adecuado de agua fisiológica, bien en una sola etapa o bien en varias etapas sucesivas, y el valor del pH se ajusta en cada etapa con una solución de hidróxido de sodio 1 N (o aún más concentrada) con el fin de obtener un valor final de pH de 7,3-7,4.
La solución de Carbopol™ 974P lista para su uso obtenida de esta manera, se usa para recuperar los virus recombinantes liofilizados o para diluir soluciones de reserva concentradas de virus recombinantes. Por ejemplo, para obtener una suspensión vírica que contenga 108 ufp por dosis de 1 ml, se diluye una solución vírica de reserva de manera que se obtenga un título de 1083 ufp/ml, y después se diluye en partes iguales con dicha solución de Carbopol™ 974P preparada para su uso a 4 mg/ml.
Las vacunas recombinantes también pueden producirse con virus recombinantes de la viruela del canario vCP1713 (ejemplo 11) o vCP1717 (ejemplo 16) o vCP1718 (ejemplo 16) o vCP2017 (ejemplo 18) o con una mezcla de tres virus de la viruela del canario vCP1714 (ejemplo 12), vCP1715 (ejemplo 13) y vCP1716 (ejemplo 14) según la técnica descrita anteriormente.
Ejemplo 20: Producción de vacunas de ADN para equinos
Una solución de ADN que contiene el plásmido pFC104 (ejemplo 6) se concentra por precipitación con etanol, tal como describen Sambrook y col. (1989). El sedimento de ADN se recupera con una solución de NaCl al 0,9 % de forma que se obtiene una concentración de 1 mg/ml. Para recuperar un liofilizado de DMRIE-DOPE, se prepara una solución de DMRIE-DOPE a 0,75 mM con un volumen de H2O estéril adaptado.
La formación de complejos de ADN plásmido-lípido se realiza por dilución, en partes iguales, de la solución de DMRIE-DOPE a 0,75 mM (1:1) por la solución de ADN a 1 mg/ml en NaCl al 0,9 %. Para impedir la formación de espuma, la solución de ADN se introduce progresivamente con una aguja estéril de 26 G a lo largo de la pared del matraz que contiene la solución de lípido catiónico. Una vez mezcladas las dos soluciones, se agita suavemente. Finalmente se obtiene una composición que comprende DMRIE-DOPE 0,375 mM y 500 pg/ml de plásmido.
Es deseable que el conjunto de las soluciones usadas estén a temperatura ambiente para el conjunto de las operaciones descritas anteriormente. Antes de proceder a la inmunización de los animales, se deja que tenga lugar la formación del complejo ADN/DMRIE-DOPE a temperatura ambiente durante 30 minutos.
Las vacunas de ADN también pueden producirse con soluciones de ADN que contengan los plásmidos pFC104 (ejemplo 6) y pFC106 (ejemplo 8), o los plásmidos pFC105 (ejemplo 7) y pFC106, los plásmidos pFC115 (ejemplo 17) y pFC106, o los plásmidos pFC101, pFC102 y pFC103 (ejemplos 3 a 5), o que contengan el plásmido pFC105 o pFC115 según la técnica descrita en el presente ejemplo.

Claims (9)

REIVINDICACIONES
1. Un vector de expresión que comprende:
- un polinucleótido, en el que el polinucleótido codifica las proteínas prM, M y E del virus de la fiebre del Nilo (WN), y
- los elementos necesarios para la expresión del polinucleótido en la célula hospedadora, en el que el vector es un vector vírico, siendo el vector vírico un virus de viruela del canario o de la viruela aviar.
2. El vector de expresión según la reivindicación 1, comprendiendo dicho vector de expresión un polinucleótido que codifica las proteínas prM-M-E del virus WN y formando una sola fase codificante.
3. El vector de expresión según una cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en el que el polinucleótido comprende además, una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido señal situado en dirección 5’ de la proteína expresada.
4. Una composición inmunógena que comprende al menos un vector de expresión según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3 y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.
5. La composición inmunógena según la reivindicación 4, en la que la composición comprende además un adyuvante.
6. La composición inmunógena según la reivindicación 5, en la que el adyuvante es un carbómero.
7. Un procedimiento de preparación de una composición inmunógena según una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, que comprende la mezcla de al menos un vector de expresión según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, con un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.
8. El vector de expresión según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3 o la composición inmunógena según una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, para su uso en un método para inducir una respuesta protectora contra el virus WN.
9. El uso de un vector de expresión según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3 o de una composición inmunógena según una cualquiera de las reivindicaciones 4-6, para la fabricación de un medicamento para inducir una respuesta protectora contra el virus WN.
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