HU230122B1 - Rekombináns vakcina West Nile vírus ellen - Google Patents

Rekombináns vakcina West Nile vírus ellen Download PDF

Info

Publication number
HU230122B1
HU230122B1 HU0401868A HUP0401868A HU230122B1 HU 230122 B1 HU230122 B1 HU 230122B1 HU 0401868 A HU0401868 A HU 0401868A HU P0401868 A HUP0401868 A HU P0401868A HU 230122 B1 HU230122 B1 HU 230122B1
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
virus
vaccine
immunogenic composition
west
use according
Prior art date
Application number
HU0401868A
Other languages
English (en)
Inventor
Jean-Christophe Audonnet
Sheena May Loosmore
Jules Maarten Minke
Original Assignee
Merial
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Merial filed Critical Merial
Publication of HUP0401868A2 publication Critical patent/HUP0401868A2/hu
Publication of HUP0401868A3 publication Critical patent/HUP0401868A3/hu
Publication of HU230122B1 publication Critical patent/HU230122B1/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5256—Virus expressing foreign proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
    • A61K2039/552—Veterinary vaccine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55522—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55555—Liposomes; Vesicles, e.g. nanoparticles; Spheres, e.g. nanospheres; Polymers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/24011—Poxviridae
    • C12N2710/24041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/24043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/24011—Flaviviridae
    • C12N2770/24111—Flavivirus, e.g. yellow fever virus, dengue, JEV
    • C12N2770/24122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/24011—Flaviviridae
    • C12N2770/24111—Flavivirus, e.g. yellow fever virus, dengue, JEV
    • C12N2770/24134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/24011—Flaviviridae
    • C12N2770/24111—Flavivirus, e.g. yellow fever virus, dengue, JEV
    • C12N2770/24171—Demonstrated in vivo effect

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Description

A találmány tárgyát W vívó és: m Wőo «.vpressztös vektorok képezik, amelyek a West: Nile vfcas legalább e.gy pölmnöeotldját tartalmazzák és expresszálják. valamint inummogén készttmények és vakcinák 'West:
Nile vírus ebes, A találmány tárgyát képezik továbbá eljárások ezen vírus ellem bunmmzálására és vaksmálásra.
A West Nile vírust (WNV i először í93?-beo azonosították emberben Uganda West Nile íartemátiyában [Zeller B, G„ MM; Trop. 59,. 490-494. oki. (1999)].
Flterjedí Afrikában, és ínegtalálbató Indiában, Pakisztánban és a Meditonrán Medencében. és először
1999-ben azonosították az USÁ-hsn New York városában [Andersen, 3. F. és misak, Science 286, 233 í -2333.
old. (1999)].
A West Nlle vfcas madarakat és emlősöket fertőz meg, köztük az embert is,
A lázat madarakban a központi idegrendszer megtámadása és halál sebem/i A hatások közé tartozik az esketnlitisz, a míokatduán vérzése, és a bélrendszer vérzése és nekrözisa.
Csirkékben a varjakból izolált West Nlie vfets: sznbkutás oltással előidézett kísérleti fertőzése a.
mtokardiam. uelabzisáboz, ns&bekbez és tüdögyuliadásboz vezetett 5-1Ö nappal az okás után, és közepes-sályes enkeiaiidszhez 21 nappal az oltás: sión (Senne, D, A. és mtsal., Avasra Dtsense 44,642-649. old. (20ÖS)1,
A West Ntle virns megtámad lovakat is, különösen Észak-Attikában és Etoőpában jCaetile, C. és mtsai., Equtne Vet. .1. 32,31-35, óid. (2900)]. A lovak at&xiát mutatnak* a hátsó végtagok gyengeségét, részleges bénulást, amely tatotplegiává alakot, és elpusztulnak, A lovak és tevék a legfontosabb állatok, amely klinikai tá2Ö neteket mutatnak enkefelitisz formájában.
Aöh-WNV ellenanyagokat detektáltak bizonyos rágcsálókban, Imszonállatokban, különösen szarvasmarhák bán és jultökbatt, vst&mmi ttázisiialökhas, ktllöhősen kutyában is [Zeller B G., Mód. Trop. 59,490-494. old. (1999); Lsíndsircsni, X Ö„ foumelöf Veetor Ecology 24, 1-39.old. (1999)].
A West bilié vírus számos Alneltef hat az emberelcre is (Sampson, B, A„ Humán Pathetegy 31,527-53 L 2S old. (2000)? Merre. C. M., Seminars in Nsumiogy 30,323-327, old. i2O0ö)].
A West Miié vírust s inaderekrs és emlősökre bizonyos: szúnyogfóidk (például Gofeb .dedós·,: Amybndes) és: kullancsok csípése viszi át
A vad és házi: madarak a West Nile vírus hordozói, és a terjesztő vektorai a vándorlásuk következményeképpen.
A West Ntle vírus virioniát 50 nm áitnérőjő gömb alakú részecskék, amelyek bpoproteln bürökből állnak, amely egy pozitív polárüású, egyszálü RbiS-t tartalmazó ikozatóronos sukleokapszidot fog közül.
Egyetlen nyílt leolvasási fázis (GSF) kódolja az összes viráliu fshétjél poiiprotem formájában. Ennek a poltprotemuek a hasítása és érése körülbelül tíz különböző vitális fehérje tofAtolddéséhez: vezet. A szerkezeti fehérjéket a genom 5’ vége kódolja,: amely megfelel: a C lein nukleokapszídnak (14 kDa), az B jelö barok3.5 giíkoprotehnek (50 Ws), a pr'M jelű pre-membrán fehérjének (23 kDa)* és az M jelű otemferánfehérjének (7 kDa)> A nstmszerfcezen fehérjéket a genom: 3’ vége kódolja, amely megfelel az :NS 1 (49 kDa), NS2 A (19 kDa), NS2B (14 kDa), W (79 kDa), NS4A (15 kDa), biS4S (29 kDa) és NSS (97 kDa) fehésjéknek.
Pátriák és misül, fX Gén. Virol, 72, 1645-1053. old. (1991)], Kulkatoi és mísal, (X Virol. 66, 3SS33592. old, (1992)] és Bili és misei [X Gén.. Virol.. 73, fi 15-1123. old:. (1992)):......a FdcfenW vírus alapján -99591-141924.
-2külónléle inzerteket tartalmazó 1® vívó expresszíös vektorokat álhíohgk efő, mstelyek megfelelték a £anjm vitás nem szerkezeti fehárléft kódoló szekvenciáknak, adott esette szerkezeti fehérjékhez kapcsolódva, Ezeket a vektorokat egeretek beadták, hogy értékeljék az, asramsejíek válaszát A szerzők tagshiyozzék a ssjtválasz fontosságát, amelyet lényegébe® a nem-sserkezctl fehérjék síimslálnsk, különöse® az NS3, NS4A ás NSéB.
Esek a cikkek feltárják a WestNHe vírus elleni jó vokcmáíási sh-atégia ínegvaiósftásferuk a nehézségét.
Mindeddig nem létezik vakcina a West Nile vírus általi fertőzés megelőzésére,
A találmány tárgya West Nile vsras által okozott betegségek megelőzése és/vagy leküzdése,
A találmány egy másik célja olyan megoldások biztosítása^ amelyek alkalmazhatok lovakban,
A talábnány egy másik eéíja a cálíajsfe kmmmízáiására és vakcmálásárs szolgáló eljárások biztosítása.
A találmány egy még további célja differenciális diagnózis lehetővé tételére szolgáló módok és eljárások biztosítása..
Ily módon a találmány első célját /» vlft-o dteegy fe vAo expresszibe vektorok képezik, amelyek a West Nile vírus B barokfehérjéjét kódoló polhmkíeoddot tartalmaznak. Ezek a. vektorok tartalmazzák a poimnkíeotid gsztíasejtben történő expresszáítaíásáfeoz szükséges elemeket is.
Az E fehérjét kódoló poíbakleotíd mellett a találmány szerinti expressztös vektor tartalmaz egy vagy több olyan pofínükleotldot is, amelyek' a. West Nile vírus más fehérjéit, a prM pre-memhránfebérjét vagy az. fel menthránfebéíjét kódolják,
Á vektor előnyösen egyeben ködőié nyílt leolvasási fázist alkotó pohnteeotldot tartalmaz, amely megfelel példáéi prfel-E, M~B szekvetteiánsk. előnyöse® a prM-M-E szekvenciának, A különböző (péfdásf prfeí
20: és/vagy M. és; Ej fehérjéket kódoló, több köiööáífó pohnukleotldot: tartalmazó vektor szintén a találmány oltalmi körébe tartozik, A vektor — különösen 1® vívó — tartalmazhat; olyan poiinskleotidokst is, amelyek megfelelnek egynél több West Nile vírus törzsnek, különöset? tartalmazhat két vagy' több po&nklaotidöt, amelyek külösbözŐ törzsek B vagy prkf-M-E fehérjéit kódolják. Amint a későbbiekben, megmutatják,, a vektor—különösen m vivő ......tartalmazhat egy·· vagy több olyan m.iklectid-szekvenciát, amelyek más patogén; ágensek: ésfvagy citokfnek imimmogénjelt. kódolják.
A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerbi az expressziós vektor prM-M-E fehérjét kódoló pofetiklsoftáoí tartalmaz, előnyösen egyetlen nyílt leolvasást fázisban.
A West Kilo vírus fehérjéiét kódoló polisískleotfű kifejezés alatt lóként a fehérjét, kódoló DNSfragmenst értjük, vagy a DNS-lragmsas kompismewr szálát. Az KNS-t sem zárjuk ki.
3Θ: A találmány szertári éi-telei&te a fehérje kifejezés alatt fehérjéket, beleértve peptidekei és polípepfidskoí értünk. A definíció szerint a fehérjefmgtnens hmmmológiajfag aktív abban az értelemben, hogy ha egyszer beadjak a gazdának, akkor képes; a feltétje ellen irányuló humoraik; ós/vagy sete tipegő: mmmuvá· faszt kiváltam.
A fehérjeö-agmens előnyösen olyan, hogy lényegében azonos az immunológiai aktivitása, mint az· egész fehérjóste. Ily módon egy találmány szedni? febétjefagnténs legalább egy epiíopot; vagy antigén-detemónánst tartalmaz. Az epítóp kifejezés alatt olyan fehérje-helyet értünk, amely képes hmnorálls típusú (B-sejtes) és/'v&gy sejtes típusút (T-sejtes) hnmnoválaszí kiváltani.
Ily módon; a. poíínukleetld minimális szerkezete az, -amely a kérdéses fehérje epitópját vagy' aotígéndetermlnánsát kódolja, Az; egész fehérje egy ífagmensét kódoló pohmüíeoíid .közelebbről legalább 21 nukfeotídot tartalmaz, különösen legalább 42 nnkleoífdot, előnyös legalább 57, S7 vagy 150 összefüggő nökleotiöoí a kérdéses szekvenelábél. Epitépok meghatározására alkalmas eljárások jól ismerlek a szakember számára, és közelebbről átfedő peplidkónyvtámkat pfemner, ö. és misai., ímmunology Today ÍS, 163-108. éld, (1998)), FeprcHw-í [Geyssa, 3-f. M és mtsaí., Froe. Mail. Aead. Sas. USA 81, 399S-4G82. old. (1984):: Geysen, fi. M. és mtsai., Froe. Natk Acsd:. Sej, USA 82, 178-182. old. (1985);: Van derZee, R. és mtsaL Eor. 3, tamástól 19, 43-47. old. (1989); Géyses, fí. M,, Soutbeasí Áslak I, Ifop. MM Puklié Health 21,523-533, éld, (1998); Pepiibe ő^srAes»· Ο» Gkíronj és algoritmusokat [De Örsei, A. és misül,, Natúré
Bioíeebnology 17, 533-561. oki. (1999)! alkalmaznak,
Közelebbről a találmány szerinti poHoukleoudsk azΈ fehérje terminális C részében t&láfeaíó egy vagy 10 kél transzmembráa dosrént kódolö nakleobd-szekvessíát tartalfstaznak, elösyösea keltőt közli lük. Á WNV NY99 törzs esetében ezek a domének megfelelnek a. GenBank API96835 szekvencia 742»7óó. es 770-791, amsnosav-szekvenciáinak.
A. pölixíukleoíid vagy polinukleotidak expresszáltatásához: szükséges elemek is jeles vasnak. Minimálisán Inlcláciös kodnní (ATG), stopkodont és pröínóíerí jeleni, vajasból pofladénfláeids szekvenciái a hlmlőví15 rnsoktól kSlősbőzö phzmídok és vektorok esetében. Amikor a polmukleoíid egy pollprotein hagmenst kódol (például prM-E, M-E, prM-M-E). egy ATG kodont helyesünk az nyílt leolvasási fázis 5' végére, és egy stöpkodont a 3' végére. Amint később elmagyarázzuk, az expressziét lehetővé tévő más elesnek is jelen lehetnek, mini például eohanszer szekvenciák, stabilizáló szekvenciák, és szígaálszekveneiák, amelyek lehetővé teszik a fehérje szekrécióját.
A találmány tárgyát képezik az ilyen sxgresszjős vektorokat tariaksaző készítmények Is, Közelebbről a találmány tárgyát képezik olyan készítmények, amelyek egy vagy több ló vmo expressziős: vektort tapaltnazaak, amelyek a fenti polinuklecáidok közöl......beleértve az E, prM. és M fehérjét kódolót — egyet vagy főbbet tartalmaznak és expresszálnuk, győgyászamag elfogadható kötészetben vagy Imrdozohan,
A találmány egy első megvalósítási módja szerint a készííménybes található más vektor vagy vektorok.
a West N’lle vírus egy vagy több más fehérjéjét tartalmazzák és expresszáijáfc, mint például a prM, Μ» prM-M
Egy másik megvalósítási mód szerint a készítményben található más vektor vagy vektorok egy vagy több ínás West Nlle vírus törzs egy vagy több más fehérjéjét tartalmazzák vagy expresszáhák. Közelebbről a készítmény legalább két vektor tartalmaz, amelyek......különösen h? vivő— különböző West Ni. le vírus törzsek
3:0 poiimsklsoíídalt expresszálják, amelyek ugyanazokat a fehérjékéi és/vagy különböző fehérjéket, előnyösen ugyanazokat a fehérjéket kódolják. Ez különösen két vágj· bárom vagy több különböző West Nüe vírus törzs E vagy grM-M~E fehérjéit in yivo expresszáló vektorokat jelent. Á találmány tárgyát képezik ktiiötrbözö törzsek prhí, Μ, E, prM-Μ. prM-E vagy hd-E fehérjéit expresszáló vektorok keverékei is.
Egy még: másik megvalósítási mid szerint.....amint azt később részletesebben Is bemutatjuk......a készítményben: található más vektor vagy vektorok egy vagy több más pálosén ágens egy vagy több dtekinját és/vagy egy vagy több innmmpgéajét tartalmazzák és expresszáiják.
A találmány tárgyát -képezik továbbá ezeknek a különböző megvalósítási módoknak a különböző kombinációi is.
Á prM-M-E fenénét kédföló pollnakleotidét tartalmazó és exgresszáló te vföm vagy te tevő expresszié*: vektort tartalmazó készitotéoyek a ísláhtotey előnyös megvalósítási médiát képezik,
A találmány egy speciális megvalósítási módja szerint as 6? v,w vagy 'b W expressziós vektorok a W«sí Niíe vihss- egyetlen polhmkleoódjakesí: vagy pelfeukleotldj álként az E fehérjét fcóáoló pöloácte^ídot, egyén prAé-snel es/vagy M-mel, előnyösen a prM-M-E fehérjét kódoló polínukieöíiáot, és adok esettet a West Élte vírus szigoáiszekveneiáját tartalmazzák.
Egy speciális megvalósítási mód szériát az KS2Á, US2E és NS3 nem-szerkezeti fehérjék közül egy vagy több együrt van expresszálfatva a találmány szeriéti szerkezeti fehérjékkel, akár ugyanazon az expresszié* vektoron, akár a saját expzesszlős vektorukén. Azok előnyösen egyetlen polínnkfeötiáről varrnak együtt expresszáltatva.
Ily módon a t&látetey tárgyát képezi olyas fe vte vagy :fe v?w expressziős vektor, amely az NS2A, NS2B, NS3 tetejét, azok kombinációit,. előnyösen: az NS2A-NS2S-N53 kombinációt kódoló polteokieoiidot tartalmazza. Alapvetően a vektor leket a fent ismertetett vektorok egyike, amely egy vágj' több szerkezeti fehérjét, különösen az E vagy prkl-M-E fehérjét kódoló peltenkleotidot tartalmazza. Más megoldásképpen a talál15 teny tárgya olyan korábba® ismertetést készítmény, amely tartalmazza továbbá ezen nem-szerkezeti fehérjéket expresszié vektorok: legalább egyikét, és adott esetben gyOgyászadlag elfogadható hordósát vagy kötöszen.
Annak érdekében, hogy megvalósítsa a találmány sserrníi expresszlós vektorokat, a szakember szántára rendelkezésre álteák a West hűié véres kSlőnbőső törzsei, és azok genomjának s mfefeoüd-szekvencája, vő. különösen S&vsge, HL. M és mfsaí. közlését [Ám. 1 I'top, Med. Hyg, él, 600-611. old, (1999)1, 2. táblázat, atneiy'20 ben. 24 West Ntle vírus törzset murainak be, és megadják ássák. polhuíkicotid-szekveneláfeak a GeoBank referenciáit.
Utalunk az ΝΎ99 törzsre (GenSask ÁF19683S), A GsnBank-ba® minden egyes fehérjére megadják a megfelelő DÚS-szekvenciái is (a 466-74I, oaklentidnk a pr\f esetében, a 742*966. nukleoíldok az M esetében, a 967-2469. bökleoddök az £ esetében vagy a 466-2469. nukleontól a prM-M-E esetében, á 3526-4218, mikleotídék az, NS2A esetében, a 4219-4611. tmkieoiidok az NS28 esetében és a 46 i2-6468. nakieoticlok az NS3 esetében, vagy a 3526-6468, nekleotidok az NS2A-NS2B-NS5 esetében). A szekvenciák összéSíasenlitásával és agymás alá rendezésével az ilyen fehéíjét egy másik WUV törzsbért kódoló pohnnkfeodd: sneeteásözáss azonnali.
Korábban már jeleztük, hogy polinukleoíid alatt a West Nlle vírusra specifikus fehérjét vagy·· fragmenst vagy epífepót kódoló: szekvenciát: értitek. Ezenfeiüi......ekvivalens módon — a poiinukseotíd kifejezés alatt értjük a klllöabözó West Ulfe váns törzsek megfelelő nukleotíd-szekveseíáit Is, és a genetikai kőd degeneráitsága miatt külítebözó nuklentid-szekveneíákai is.
A West Nile vírusok családján belül a prM-M-E mnteosav-szekveteámák az azonossága az MY99 törzshöz víszonyte* nagyobb vagy egyenlő, nrfet 96%. Ily modort a találmány tárgyát képezik olyan pölimtkleoddok, amelyeknek az szenossága a temtészéftet eBforddÓ amteosav-szekvenoiával nagyobb vagy egyenlő, mini. 98%, különösen 92%, előnyösen 95% és előnyösebben 98%, Ezeknek a West Níle vírusok fektntotében homológ polinakleotidoknak a tfagmensei szintén ekvivalenseknek toklmendöfc.
Ily módon s West Miié vírus polínukleofidjám történő blvaiközás esetén ez alatt a kifejezés alap értjük a találmány szerinti értelemben az ekvivalens szekvenciákat is.
Azt is láttuk, hegy s fehérje kifejezés alatt értjúk az ímmunoíógiailag aktív pepddeket és pobpeptídeket is. A taldbnósy szerinti értelembes ez alatt értendők az alábbiak:
a) különböző West Nile viríts törzsek megfelelő fehérjéi,
b) az azokíól khlőnfeőzö fehérjék, melyek azonban a természetben előforduló WeA Nile vírus iebásjé5 vei sagyofeb vagy- «gyeslő, mint 90%, különösen 92%, előnyösen 83% és előnyösebben 98% azonosságúak, ily módon: a West Nile vírus fehérjéiére történő hivatkozás esetén ez alatt a kifejezés alatt értjük a találmány szerinti értelemben az ekvivalens fehérjéket is.
Különböző West Miié vírus törzsek hözzáférhetők gyűjteményekben, különösen az 'Atseeiean Type Cultnre Coileetion' (ATCC) gyűjteményben, példán! a VR-82 vagy VF-1267 hozzáférést szám alatt. A Kunjin vírust valójában West Ntls vírusnak tekintjük.
A találmány szerint a po&ukleofid előnyösen szlgnálpeptidel ködeié ttukieodd-szekvendát is tartalmaz, amely az expresszáltatott íéhériétői leolvasással ellentétes irányban található, annak érdekében, hogy biztosítsuk annak szekrécióját. Ennek következtében az lehet endogén szekvencia, azaz a természetben előforduló szignálszekveucia, ha létezik (ugyanabból a West Ntle vfcösbőlvsgy törzsből szAtmazö):. Például az W99 West bi le vírus törzs esetében az E fehérje endogén szignáíszekvenciája megfelel a GenSahk szekvencia 922-966.
trakleotidjaiaak, és a prM esetében a42M6S, mskleofíábknak. A szlgnálszekvenda lehet az egy heteroióg szigsáfezekveueíát kódoló nukteodd-szekveseia is, khlssősen olyan, amely humán szöveti píazminegétr aktivátorí (tPA) kódol [Mártikká, X és mtsai., i-hnnan Gene Therapv 7, 1205-1217. old, (1996)]. A szlgnélpeptidef kódoló mikleobd-szekvendáí az £ fehérjétől vagy annak kombinációitól. például prM-M-E fehérjéiől leolvasással eilen20 feles irányban fázisban: helyezzük el.
Az is vöm expressziós vektorok virális vektorok, msáárhimlő (különösen kanárihiínlő, számysshúalő, gaiambbimlő, Süjhim lő),
A vírus expresszíos vektor kanárihkníd vagy íürjhímlö vírus, és az ilyen himíovírnsok is is gyengítsetök. Itt hivatkozni lehet az ÁTCC-tŐl kereskedelmi: forgalomban kapható kanárlhimiöre, amelynek a hozzáférési szánta, Vk~i I i, Legyengített kanánhtmlő vírusokat fámák fel az 5 756 103.. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratban és a WO 81/95934. számú nemzetközi: közséf ételi iratban, Számos ftirjhlmiő vírus vakemáiási törzs áll rendelkezésre, példán! a W-TÖSSC CTO törzs, amelyet a MBRTAL forgalmaz, és a MWZW lAíA/UIA vakéba, amelyet az fatervef forgalmaz,
A himlővímsok esetében a szakember hivatkozhat a WÖ 90/12882. számé nemzetközi közzétételi irat30 ra; fbrihímlő esetében az 5 174 993.: 5 505 941, és 5 7ŐÓ 599. számé amerikai egyeséit államokbeli szabadalmi iratokrat kasárihunlő esetében az S 756 103. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratra; seríéshlmio esetében az 5 382 425. számó: amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratra és mosótnödvehúnlö esetében a WO 08/83838. számú nemzetközi közzétételi inaira.
Az expresszálahdo poímukleotid vagy polinukísofídok hrzereiős helye különösen: a nyílt leolvasási fázi35 sokban helyezkednek el, vagy azokból állnak, például a C3, €5 és Cő ÖRE-okban. Az inzereiós helyek különösen a nyílt leolvasási fázisokban helyezkednek el, vagy azokból állnak, például: s F7 és FS ÖSP-okhan,
Előnyösen az expresszálsnáó poiinukleotldoi specifikus himlövírus prumőter szabályozása alá helyezzük, különösén a 7,5 kDs mérető Eöönnüí promőter [Cochran és rntsai., 3. Virology 54, 30-35, old. (1983)], az i3L Laeebriu prornoísr (Kiviére és mtsaL .1 Vlrology ód, 3424-3434. old, (1992)], a ff A Fbeemtíf premőíer (>
(Shida, Virology 188, 48 1 -45?. old. (X9Sé)j, az Áll sznnsuimsrhahímlö promóíer (Pbnahashi és mssai., 3. Gén, Virol, 69, 35-47. old. (X9S8}jvagy a US kííecüdn promótsr (Tayior, l. és mtsai., Vacsine -6S S84-5ÓS. éld, <X988); Quo, P, és mtsaí,, 1. Virul. 63, 4189-4198,. old, (1939); Perkus, M. ás misská. Virol. 63, 3829-3S3Ó, old. (1989)) szabályozása alá.
Az expressziós vektor előnyöse» hmWA. A leírás ismertet fehérjéknek megfelelő s«jtr«ndszerekbes történő in vi/co expresszáliatásárs alkalmas expressziós vektorokat is, A fehérjéket begyüjthetjtík á tenyészet felölászójábói szekréció után vagy anélkül (ha Ebes szekréció, akkora sejtet ilzá^nk),: adott esetben keacontráljuk hagyományos töntértyitö öljárásokkal, fefcssen tdirasz&éssei és/vagy megtisztítják hagyományos tisztítási «(járásokkal, Wbsösen aíTiniiásl, ioncserélő vagy gálszárésí kromatográfiás eljárásokkal,.
Az előállítás «mlossejtéknek plazmiáokkai történő transzfektálásával, virális: vektoroknak emlős vagy madár sejtekben történd replikácíójávai vagy bahnfovírus ;replíkSoiájávai történik (4 '748 051. szántó amerikai egyesük államokbeli szabadalmi irat; Vssiasd, 1. és xntsai., 1. Virol.. 64, 37-5Ü. old. (1.99®); Verne, A., Virology 167, 56-71. old. (1988)], például: Aí4ísgr®vm cs/lfezsica sejtmagi poíihedrézis viros: (ÁeUPV) alkalmazásával rovarsejtekbe» (például SS sítekben, ATCC CRL 1711). Az alkalmazható emlőssejtek különösen höresögseitek(példán! CUO vagy BUR-Slí vagy nsajomsejtek (példáid COS vagy VERŐ). Ily módon a találmány tárgyát: képezik olyan expressziós; vektorok, amelyek találmány szerinti polmukfeístídot tartalmaznak, az Így előállított West felié vírus fehétjék vagy rragmensek és az ezeket tartalmazó készítmények.
Ily módon a találmány tárgyát képezik koncentrált és/vagy tisztított West felle vírus fehérjét tartalmazó készítmények. Amikor a polínukleot td több fehérjét kódol, azok e&asítödnak, és a feni említeti, készibnények
2(1 azután tartalmazzak a hasított fehérjéket.
A találmány tárgyát képezik imimmogéh készítmények és vakcinák West fellé vírus elles, amint az: igénypontok ismertetik.
Az immtmogéa készítmény kifejezés afett bármilyen olyan késztetését értőnk amid) a < élfejssk történd beadás után West felié vírus ellen irányuló ímmtmválaszí: indukál. Á vakcina kifejezés sfetí h tíasos védelem kiváltására képes: készítményt: értünk. A cél&jök lofelék.
A gyögyásxatílag elfogadható hordozók vagy kötószerek jól ismertek a szaketnber számára. Például az lehet Q,9% fesd sóoldát vagy foszfát-pú ifor. A gvógyászarilag elfogadható hordozók és: kőfoszerek alatt bármilyen olyan vegyületeí vagy vegyüfelkombmáciökat is értünk, amelyek elősegítik a vektor beadását, különösen a iramfefektálásáí és/vagy javítják a tartósságát
3Q A dózisokat és dözistérfogatokat a későbbiekben definiáljuk az immmuzáiási és. vakoínálásí eljárások ismertetésénél,
A találmány szerinti ímmunogen készítmények és vakcinák előnyösen egy vagy több adjavámst tartalmaznak, különösen a hagyományos udjuvánsok bármelyikét. Oiönöseu alkalmas találmány szerinti adjutánsok az alábbiak: (1) akrllsav s,tgv motakríisav polimerjeí, mafeinsav-aiáddríű és alkenil-származék polimerek, (2) immunstmadáns szekvenciák ílSSX kfoösösett olígoáezoxirihonukíedtid-szgkveaeiák, amelyekben egy vagy több metíiálatlan CpG egység található [Rlinmati, XX M. és mísan, Rroc. feati. Aead. bei., USA, 93,2879- 2883·, old. (1996); WO 98/16247. száma nemzeíkdzi közzétételi irat]. (3) olaj-víz emulzió, különösen SX’T emulzió („Vaeolne Design, The Sohunií: and Adjuvarrt Apgroaeh” 147. old., szerk.; M. Poweli, M. feewtan, kiad.:
Plenont Press (1995)j és az MF59 esnstziö (amelyet: a. festi! irodalmi fedy 183. oldalán ismersotnek), (4) kvmorner sstmőninsnsót: toíalmsaő kaiionöslipidok, (5) eitckinek, vagy (6) essek kömbinacló vagy kévétekéi
Vitális vektorok esetében különösen megfelelő ol&j-viz esmfei&t (3) elösyősen -ax alábbiak oikoínakt
- könnyő íolyékonypsrsíímölsj (európai gyógyszerkönyv! tfpns),
- izoprenoid olaj, mlntpéldánl szkvaléa, szkvaién,
- elkenek, különösen szobaién, és «ekés ohgomerlzáciöjábő! szárnz&z© c-ksj,
- egyenesláncá nlkilesepöftöt tartalmazó savak vagy aikobelok észterei,
- előnyösebben rsövényt olajok, etii-oieát, propllén-giikoh di(kapritábkaprát), g&erhr tritkapríládkaprát) és propilén-glíkni-díotöát,
- elágazó zsiralkoholok vagy savak észterei., különösen izosztearms&v-észterek.
Az olajat entnlgeátorokkal kombinálva alkalmazzuk az -amtólió kialakításához, A? emulgeátorok előnyösen namionos felületaktív anyagok, különösem
- egyrészről szörbítán, manóid (példán! ankidroman&ifol-^báí), glicerin, potigbeorm vagy propiiénglikol, és másrészről olajsav, izosAearmsav, rioonhj&av vagy hsdroxiszfearmsav észterei. amelyek adott esetben etoxdálsak,
- pöliöxipropílén-peflcxietiiéo kopöiimet blokkok, különösen ίΊηηοκίο®, előnyösen 1..I2 I.
Az: (1) ífpssü aájaváns: polimerek közöl előnyösek a kereszlkötütt akrllsav vagy metakrllsav polimerek, kölönösení cukrok vagy poliatkobolok kereszíkőlöüpoiiaikenit-éterei, Ezek a vegyítetek karbomer néven ismertek (Fharmearopa, 8, kötet, 2, szám, 'iM június), A szakember számára. ismert: a 2 909 462, számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat is, amelyben ilyen, polibidtoxlkvegySletekkel keresztkötöit akrilpelimsrekeí társak fel, előnyösen nent több, mint nyolc csoport kersszíkőtésévol, amelyben legalább Mse® hidroxil-esópert hidrogénatomjai belyettostee vannak legalább két szénatomot tartalmazó alifás gyökökkel, Az előnyös gyökök a. 2-4 szénatomot tartalmazok, példán! vbni, sllif és más telítetlen etilént tartalmazó csoportok, A telítetlen gyökök tartalmazhatnák más szubsziiiuenseket is, mint példást metélt, A Chrőppohb néven forgal25 mázott (βΡ Goodrich, Ohíc, USA) termékek különösen alkalmasak, Ezek ténylegesen allil-szaebarőzzal vagy allii-pesmioritótolkd vannak kereszíkötve, Közölök különösen előnyös a Cnröopcd® 974F. 9349 és 97l:P,.
A malehisav-anhidríd-ídkeoil származék kopotimerek: közül előnyös síz £M4© (Mohsánío), antclyék egyenes láncú vagy kereszrköiött etilén-mafeítísav-áahidrid: kopoiimerek, és: példán! diviml-áterrel vannak keresztkötve p, Fieids és mtsakv Nátare 186, 718-780, old. ()960)),
A szerkezetükéi tekintve az ak-Hsav vagy metakrsissv pol nnexek és az EM,-W előnyösen az: alábbí: képlett! alapegységekből állnak:
amelyben::
- R! és R2 lehet Ugyanaz vagy különböző, és jelentése H vagy Ctk
- X értéke Ö vágj·· 1, előnyösen .x .** 1:
- y érteke 1 vagy 3, ahol x t y -2,
EMAC5 esetében χ ~ 9és y ~ 2, és a harbometek: esetében x ~ y ~ L
Ezeket a polimereket vlzbeo vagy Szlológiás sőoldaífesn (29 g/i Naö) oldjuk fel, és a p£l-i 7,3-7,4 ártóköze állítjuk be szódával, olyan sdíováns-öldal «verése érdekében, amelybe^ m expressztós vektort felokltejak.
A polkáé? ksoeemrámöiz » végső vakclna-készíiot&ryben a. 8,91 és LS% vdv, elörtyösezt a 8,95 és 1% wfv és előnyösebben a 8,1 és 0,4% v7v későid tartományban lehet.
A kvasemer rorunörü',misét tartalmazó kationé» lipídek (4)......amelyek különösen, de nem kizárólag alkalmasak piazntidök alkalmazása esetében ----- az alábbi képlettel írhatok le:
RrO““CK^IjlH^CH^bl—R“X OR CH3 amelyben R3 jelentése telkeit vagy telítetlen hosszóláncö, 12-15 szénatomot tartalmazó áldás gyök, K2 jelentése egy másik, 2 vagy 3 szénatomot tartalmazó áldás gyök, és X jelentése amin vagy feldroxii csoport.
Ezek közöl a kationos liptáék közöl előnyös & D.MEIE :!N~(2-hidroxíetsl}'74,M-dimetil~2,3bísz(tetrsdeclloxl>3-pröpán-ammönrum;. WO W34109, számú nemzetközi közzétételi fest), előnyösen: együtt semleges Epiddel, előnyösen SÖRé-vsl (dioiooll-föszlatidil-etmíolmsin; Bohr, X p,, Bloconiagale Chemisíry 5, 352-3S9, old. {1984)] , DMR1E-DOPP keveréket létrehozva.
Előnyösen az admvénsssi létrehozott plazmidkeveteket rögtönözve hozzak létre, előnyösen annak beadását megelőzően, és az így létmhösöit keveréknek hagyunk idői komplaxálőd-ti, példáéi 19 és 98 percen keresztül, előnyösen 39 percen kérésztől.
Mikor O0ES van jelen, a f>MRÍB:.DÖRE mőiaránya előnyösen 95:5 és 5:9 5 közötti, előnyösebben 1:1.
A BMK.1É vagy ÖMEIB-ÖÖPE adjnvárís:pbzmid tömegaránya 59:1 és 1:19 közötti, előnyösen 19:1 és 1:5 közötti, és előnyösebben. I ::1 és 1:2 közötti,
A cítokfed vagy ctekíneket (5I fehérje tornában bizlosídwok a készttntsoybeo vagy vakcinában, vagy együtt expresszáltathatjok a gazdában az immanogénnel vagy ÍKtmtatogéríekkei, A oltoklu vagy cltokinek együtt expresszállaiása előnyös, akár ugyanazon a vektoron, mint amelyik az hstntmogéül expresszálja, akár a saját külön vektorján,
A eitokmeket előnyösen az alábbiak közül választhatják: interleukín-19 (IL-I S), intezleakm-12 (IL-I2), mterletikin-l 5 (11,-151. MHM« jmskrofág Inflatsmtatorskns fehérje 1-as; Marsba!!, B. és mtsai,, Br,Cancer 75, 1715-1729. old, (Ι9°7)ΐ, GM-CS.F (gpmuíocita-roakrsfag: kofeísstkmríáló faktor). Különösen előnyösek a madár csokisok, különösen a csirkéből származék, mint például a elL-18 fSchneider. K. és mtsai.. X Interferon Oytokiste Rés. 28, 879-333, old. (2998)], clE-15 (Xís, K.-Q. és mísak, Vsecine 17, S58-5ŐŐ. old. {1999}), és lé dtokinek, különösért a lő GM-GSE (WÖ 98(77218, számé nemzetköz! közzétételt irat):. Előnyösen a vakcmdíemló táj eitokirtjaíl alkalmazzak,
A Wö 98(77218, számú nemzetközi közzétételi irat feltárja a lé GM-CSF sekfeotid- és omtltosavszekvencláiáí, a OM-GS.F in νότο előállítását, és vektorok (pisznriá és vitális vektorok) konstruálását, amelyek lehetővé teszik .& GM-CSf /« w exprssszáíiatásái. Ezek a fehérjék, plszmlsok és virálls vektorok alkateazhaíok találmány szerinti tmnmsogen készítményekben és: lővakchtákbsn. Például a korábbi dátümú bejelentés 3, példájában Ismertetett pJPÖ97 pfezmlciot alkahnszhatjuk, vagy az utóbbi kltam'tásá.t alkabnatóatjuk annak érdekében, hogy más vektorokat állítsunk «lő a ló GM-CSF in vío·® előállltóára, és a vektorok vagy a ló GM-CSFssek találmány szerinti ssímóogéís készítményekbe vagy ióvakeioskhs OtéaS beépítéséig·.
A leírás ismertet immunogén készítményeket és úgynevezett alegység-vak© mákat is, amelyek a West 5 Mii© vfeas E-fehérjéjét és adott esetben más íébéjjéit is tartahnazzák, küiónőser a prM vagy M fehérjét, és amelyeket előnyösen tó v>o expresszlőval áiitónk elő a bírásban korábban feltárt módon, valamint amelyek gyógyászátilag elfogadható hordozót vagy kötőszert tartalmaznak.
A gyógyászatiiag elfogadható hordozók vagy kötöszerek ismertek a szakember számára, és Isifolnek például G,9%:NaCl söoldai vagy foszfot-puSér.
Az ismertetett kntmmogén készítmények és alegység-vakemák előnyösen egy vagy több adjnvánsí tartalmaznák, amelyeket előnyösen a hagyományos adjuvánsok közül választónk. Ezek kÖSsősea az U) akrilsav vagy melakrllsav polimer, maiemsav-ashiddd és átkerül származék polimer, (2) immnnstnnal.ans szekvencia pSS), kölönősen ellgodczosalbonaklsotid székveneia, amely egy vagy több dteblálaílatt Cpö-egységet tartalmaz (Klinman, 1>. M„ és misai, Proc. háti. Áad, Seí, SSA 93, 2879-3383. old. (199$)·. WÖ §8/10247. számú nemzetközi közzétételi kall, (3) olaj-víz emulzió, különösen SPT emálzió („Vaceine Design, The Shbnslt and Adjovant Approaeh”, 1.47, old,, sasrk.: M. Pmvell, M· Newmmm, kiad,: Kenum Press (1995)j és az W59 emulzió (amelyet a fenti irodalmi hely 183. oldalán ismerteinek), (4) vlz-olaj: emnlzió (EP 639 Ö71. szánni európai szabadalmi irat), (5) szapsafo, káiönősen Quil-Á, vagy (ó) alnmfohmt-hidroxid, vagy ezek ekvivalense. Az 1 2) és 3) pontba tartozó sdjuvánsok különböző típusait részletesebben is ismertetőik a leírás korábbi részében az exp ressziós vektor alapú vakcinákkal kapcsolatban,
A dózisokat és áózisiérfogalokat a tóás későbbi részében dehnláljuk az Immonízálást és vakcinától eljárások általános leírásával kapcsolatban,
A találmány szerint a West öble vírus elleni vakcinától kombmálhsíjnk más vakcinátóokfeai vakcmálási programok keretében, mmmmsációs vagy vakcinától reagenskészletek tómájóbatt vagy hsmmogés készítmények és rmdtsvatós vakéinak formájában, azaz amelyek legalább egy, West Nile vírus elleni vakcinakomponenst és legalább égj’, legalább egy másik patogéh ágens elleni legalább egy másik vakcma-komponsnst tartalmaznak. Ez magában foglalja legalább két paíogén ágam, köztük: & a West bilis yím gémeinek azonos expressziós vektorról történő expresszáltaiásál:,
A találmááy tárgyát képezik: mokívaieas Immimogén készítmények vagy multivalens: vakcinák is a West
Nile vírus és a céhbl legalább egy másik patogénie ellen, ugyanazon 1« vivő expressziős vektor alkalmazásával, nnmly találmány szerinti West öble vírus prM, M és E fehérjét expresszáló polinuklcotídot és egy másik paíogén immnnogénjdt expresssUö legalább egy potinakleotidöt tartalmaz és expresszál.
Az így expresszáltatott „imntunogén” alatt fehérjét, glíkoprofemt, polipeptlóet, pepiidet, epltópot vagy szárntazőkoi értőnk, például fúziós fehérjét,, amely Immunválaszt indukál, előnyős védő természetűt.
Amint a leírásban korábban megáliaphottok, ezek a muitivafeas készítmények vagy vakcinák tartalmaznak gyógyászátilag elfogadható hordozót vagy kötőszón: Is, és adód esetben adjy vánst
A találmány tárgyát képezi máltivalens immusogén készítmény vagy muhivalcns vakcina is, amely legalább egy Ι» vöm expréssztós vektort tartalmaz, amelybe a West Nile vírss legalább egy, prM, M és E lebétjét expjesszáio rckouib náns potinukmehd a van acmzertálva és isgdább „\s?> mtsodik expresszsos sektort mrtal- 10 ísaz, amelybe egy másik patogén ineríunpgémét kódoló polínnkleodd vas beinzsrtáls's. Amint főnt enrlitetiuk, ezek a moliív&lens készílmények vagy* vakcinák gyógyászaírlsg elfogadháíő hordozót vagy kSrőszert is hatalmaznak, és adóit esetbm adjovósst
Az immunogén készíunónyek és muitivaiens vakcinák ©setében s más ló pálosénak khlőnősen az aláb5 biok közöl kerttlheMek ki: EHV- i és/vagy BiV-4 lő rmopnetunőnls vtmsok (és előnyösen az:EHV-i és; EHV-4 iunntmogénjemek a kombinációi), EIV lő iaflnsszavbus, EEV keleti enkefaiitlsz vírus, WEV nyugati eskefalhisr vlros, VEV venezuelai «akefalitiss vlrtss (előnyösei· az EEV, WEV és VEV közöl mindhárom kombinációja), Cúj.síz/íéwm i'etxns (tetanusz) és ezek keverékei Ciouyösen az EHV esetében a gB és/vagy gD génekel; az EJV esetében a HA, NF és/vagy N géneket; az enkeíahiisz vírusok esetében C ss/vsgy E2 géneket; és a
Cfeövóííns M esetében a tetanusztoKin C alegységének az egészét vagy' egy·' részét kódoló gén választható kt. Ezek közé tartózik az immunogén aktív fragnrehsét vágy epitópjái kódoló pöílsukleo&fök alkalmazása Is,
A más madár paíogének közé tartoznak különösen az alábbiak: Marek-íéle betegség vírusa {MDV, I · és 2, szerotípns. előnyösen az !.}, Neweastle betegség vírusa ÖŐDV),, Duntfeoro betegség vírusa (1BDV), fertőző brencfeitisz vírus IB V, fertőző anémia vírus €ÁV, fertőző laringőtraeheltlsz vírus· ILIV, AEV eukeföfömfölitisz vírus (vagy madár bukézís vírus, ÁL Vb pulykák vérzéses entsnfe: vírusa (HÉV), pnsttmovirózís vírus (TRTV), számyaspesíis vírus (ntadárittíluenza). csirke iúdropsrik&röstísz vírus, madár reoviirasok, ákcheí'fcá/o cn/7, b/j-’cop/ösmö gnEmm-ií?», ő/yc<yuka'»m .gű/föeprtcw, Mzewphí/ss ovim», TusíenreEa gaíEnorunr, /WenzeEa ζνκ/ΐοζΆο göE/cföh, és ezek keverékei. Előnyösen az MDV esetében a gB és/vagy gD gének, az MDV esetében a HN és/vagy F gének; az IBDV esetééhen a VP2 gén, az 18V cselében az 5 ielőnyösebben az
SÍ y M es vagy N gén. a CAV esetiben a VPi es vagy V f‘2 gűn, az H CV esetében t, gö es vagy gD gén, v AEV esetében az, env és/vagy gag/pra gének; s HÉV esetében a ' 00K cs bevon gének; a TRTV esetében az F és/vagy ö gének és a szárnyaspertfe eseteben a HA, K és/vagy HE gének vőbszíbatők ki. Ezek közé tartozik az hmnunogéi' akin íragmeosét vagy epilópját kódoló peimukleotidök alkalmazása is,
Srcm'elő lésként egy találmány·' szerinti mnltivalens inmmnogén készítmény vagy xnoitívaiens vakcina esetében, amelyhez a leírás szerint adott ecetben adjnvánst adtunk,, és amely tófajokban történő alkalmazásra várj szánva, lehetséges egy vagy több plazmíd alkahnazása a Wö 9S/S31TS számú nemzetközi közzétételi iratban feltártak közöl, különösén nsnsk S-25. példásban, és a WO 00/77843, számú nemzeiikbzí közzétételi iratban föllártaké, amelyek lófajokkal kapcsolatban alkalmazhatók, különösen a fi. és 7. példában feltártak. Madárfajok esetében lehetséges például egy vagy' főbb plazmid alkalmazása a WO W03ŐS9, számú nemzetközi közzétételi iratban föltártak közök különösen a 7-27. példákban föltártak közöl.
Az eddlgiekhen ismertetett ímmssmgés készítményeket és rekombináns vakcinákat kömbmálhatfök legalább egy hagyományos: vakcinával (iosklivált. élő legyengített, alegység), amely legalább egy' más patogén ellen Iránytű.
A leírás ismertet eljárásokat is a föntebb említett cálfajok immunizálására és vafceinálssára,
Ezek az eljárások a találmány szerinti mmnmogén készítmény vagy vakcina hatásos mennyiségének a beadását tartalmazzák. Ezt a beadást különösen a. psrentsráíis úton végezhetjük, például szobkotáu, nhradermális vagy intramnszkulárís beadással, vagy orális és/vagy nazális ötön. Egy vagy több beadást végezhetőnk, előnyösen két beadást.
A kdiSdbózö vakcbákat tü nélküli, folyadékjnjektörral adhatjuk be. Plaznrtdok .esetébe» az is lefeetségss, hogy·' & ptesmiidóaí bevont tsmnyrészessfcéker alkahnaznnk, és oly módon adjak be, hogy azok áthatoljanak az mmstózálandö alany bőrének a sejtjein [Targ és rnísal,, Natúré 356,152-154, öld. (1992)}.
A találmány szerinti inxrnunogé» készítmények és vakcinák hatásos mennyiség# expresszjős vektort S vagy polipeptiitet tartalmazuak.
A pktzntidalapü asmnnogéa készrtetenyek: cselében .a dózis :áhaláhan körűibe®! 19 jíg. és. körülbelül: 2991): közötti, előnyösen: körülbelül 50 g.g és köríObelöl 1.099 pg közötti mennyiséget tartalmaz. A dózis térfogata 0,1 és 2 ml között, előnyösen: 0,2. és 1 úti között lehet.
Ezek a ddziaok és dőzistérfögatok alkalmasak Jófélék vakcinálásáta.
A bhnlsvirnsökon alapuló tenmunogén készlimények és vakcinák esetében a dózis általában kötSlbelöl lő2 pia és körülbelül I9'! pfu közötti.
A vitális vektorokon alapuló iranatsmgén készítmények és ióvakcmák dózistesiög&ta áhalaban 0,5 és 2,9 snl közötti, előnyösen 1,9 és 2,9 ml közötti:, előnyösen f ,9 ml. Az Ilyen vakcinákkal. kapcsolatban a szakember képes optimalizálni a szükséges: beadások számát, a beadás ólját ős az egyes immunizálási pmtokoliekhan .15 alkalmazandó dózisokat, Közelebbről Inban példáid két beadás lehet, például 35. napos időközzel.
A találmány tárgyal: képezi találmány szerinti m vivő expressztős vektor vagy vektorkészítnsény vagy polipeptídek alkalmazása célfájnak West: Hite vírus, és lehetséges módos legalább egy másik paiogés ágens ellent védelmére szánt inanrusogén készítmény vagy vakcina előállítására, A leírásban bemutatott különféle j:eliegzetességek alkalmazhatók a találmány ezen célja esetében Is.
A taláknány szeriníl, West hitte vírus egy vagy több fehérjéjét expresszálő vitális vakcina nem indukálja a vakcináit állatban ellenanyagok termetesét a vims más fehérjéi ellen, amelyek öém találhatók meg az ímmanogén készitenényben vagy vakcinában:. Ezt a ml®don$ágot kStasználhatjuk díSereseiális diagnosztikai eljárások kifejlesztésére, amelyek lehetővé teszik a megkülönböztetést a patogén W'est hí he vírussal megfertőzött állatok és a Salálmány szerinti vakcinával vakcinák állatok közök. Az előbbiek esetében ezek a fehérjék ss/vsgy az ellenük termelt ellenanyagok jelen vannak, és detektálhatok antigén-elterurnyag reakcióval. Nem ez a helyzet a találmány szerinti vakcinák állatok esetében, amelyek negatívak maradnak. Ezen megkülönböztetés érdekében olyas fehérjéi alkalmazunk, amely nincs jelen a vakcinában (a» találkáié meg vagy nem expresszálódsk), például a C fehérjét vágj' az NS 1, NS2A, NS2B vagy NS3 fehérjét, amikor az nincs jelen a vakcinában.
Ily módos a leírás ismerteti találmány szerinti; vektorok, készítmények és polipeptláek alkalmazásai olyan inmatmogén készítmények és vakcinák eíSáitiiásársg amelyek lehetővé teszik k vakcináit állatok és a fertőzőit: állatok közötti megkülönböztetést
A leírás ismertet olyan immunlzáclős és vaketnálási eljárást, amely az ilyen megkülönböztetését lehetővé tevő diagnosztikai eljáráshoz kapcsolódik,
A diagnózishoz kiválasztott fehérjét vagy annak íragmenselnek vagy epköpjaisak az egyikét: aikakrsaz35 zuk: antigénként a diagnosztikai reagenskészfeíben és/vagy poliklonális vagy monokíonális ellenanyag előállítására:, A szakember elegendő gyakorlati Ismerettel rendelkezik ezen ellenanyagok előállításához, és az antigének és/vagy ellenanyagok bsgymnányos diagnosztikai eljárásokban, például BUSA tesztekben történő alksimszásához.
• 12 A találmányt részletesehbéo is bemteadtei: wt korlátozó példásak tekinthető megvalósítási módok «1kaimazásávni.
AW
S
Az összes konstrukciót szokásos molékteárís: biológiai eljárásokkal (klónozás, restrikciós enzimes emésztés, komplementer égyszálá DOS szintézise, polimeráz-lástcreakció, oílgormkleotid meghosszabbítása DNS-polimerázzat..,,) állít!ok elő, amelyeket Satnbrook és misai. („Moíeealar Cloning: A Láboraíory Maimai”, 2. kiadás, kiad,: Colé Sprbg Sarbor Laboraíory, Cold Sprmg Hatkor, Afesv York, 1989) imák le, Á találmány1:0 bán alkalmazott összes restrikciós: Aagmenst, valamim a különféle polimeráz-láscreakciós (PCR) temtékeket a CéímehwO reagenskészlet (BIO 101 1 tie, La 1 te la, C A) alkalmazásával izoláljak és tisztRiók.
A ,4 htesf A2fe? rfras tenmaiám
Az amplifikálás végett az NY99 West Nile vírnsokat (kanelodi, R. S. és mtsai., Scienes 2Ső, 23332337, old. pl 999)1 VERŐ sejteken (majkssvese sejtek) tenyésztjük, amelyek az ^American Type Ctetere
Cöheeihm’'-tól (A FCC) szerezhetők beCCU-81 szánt alatt
A VERŐ sejteket 25 cmM:s Falcon edényekben tenyésztjük eogdo-AOé tápközegbe», amely 5% élesztőkivonaííal és 1 0% bopószérmnmai van kiegészítve, megközelítőleg 109099 sej tárd sűrűségben. A sejteket *37 ':'G-os tenyésztjük 554 CCy atmoszférába!-?:,
Rárom udp elteltével a sejtréteg eléri az össseítöiíállapötot. A tenyésztő tápkőzeget ázásán belyetíesií20 jük angíe-A/EM lápközeggek amely ki van egészítve 1% élesztókivon&ttel és: ö,l% maíhaszérnm-alktnnínnsl, és a Y est \de vírust hozzáadjuk 5 phhsoit mennyiségben.
Amikor a cltopatogeniktís hatás (CPE) teljes (általában 48-72 órával a tenyésztés kezdetét követően), a: vlrossznszpenziőkat hegydjtjdk, cmítrthigáiással feiiiszn'ijok, és. letagyaszfjnk -70 *C-on, Általában 3-4 egymást követő passzálás szükséges a virnstenyészef elpálltfeához, amelyet -79 AAors iároltstk.
2, jtéfifaí JArdAs hAW á&vmdsa « Λ iW« v&nsőd/
Az NY99 West (tele vírus törzs 190 ml-nyl vimssznszpeaziőjában található virális RhíS-t a /Agő R«re Fteot KM) A7r (kát, sz, 1, S5R 8S.2, Roehe Mólectear Sioehemicms) oldatokkal történő felolvasztás után vonjak ki, a szállító utasításait követve az exíraksiós felsőkben. Az extrahált végén kapott RNS-e»apadékot álra felsznszpendáljok 1-2 ml RMáz-mentes steril desztillált vízben.
A ytefe; A pFCWjpte&f tetehfefee
Az NY99 West bilis virss: törzs kowlstnenter BblS-Ói (DMSe) a öfea ,4mp &Y4 ?CR fó (kát, sst. N 898 ©Öl?, Rerkin-Elmer, Niorwaik, CT ÖÖS59, USA) alkalmazásával szintetizáljak meg a gyártó által adott körülmények között
A reverz-íranszkripídz poiimeráz-láncreakciót (RT-FCR reakeió) az MY99 West NOe vitás törzs (2.
példa) 50 pl virális RNS-sznszpenziéiával hajtjuk végre, és az alábbi olsgonukleotidokkal:
CE1Ö1 (30-tagó) (!. azonosítószámú szekvencia)
- _ΓΠ·Γ rrc áatt cgtt accctctcta ÁCTTC-3’ és FC102 (33-tagá) (2. azonosítószámú szekvencia)
S'-TTTTTTTCTAGArrACCTCCGACTGCGTCTTGA-s’
Ez az oligoíuskleotid'pár lehetővé teszi egy Ece&í restrikciós hely, egy Xbái restrikciós hely, és egy stsptafes beépítésit o inzert 3’ végére.
Az első DNSe szál szintézise az FCI02 oligonokleotid meghosszafebhásávtil megy végbe, az niőhhisak 5 az RNS-»S)átríxsza) történő hibridízálását követően.
Az első DNSc szál szintézisének a körülményei sz alábbiak; 42 *€ hőmérséklet 15 percen keresztül, azután: 99 ’C 5 percen kérésztől és végezetül 4 eC 5 perces keresztül. Az FG1ÖI és FC102 oíígomfoleoíid^ár jelenlétébe® végzett FCR-reakciŐ körülményes az alábbiak: 95 X hőmérséklet 2 percen, kcresAül, azután 3:5 ciklus (95 X 1 percen keresztül; majd 62 *C I percen keresztül és 72 °C 2 percen keresztül), és végezetül 72 ’’JC 7 perlő een keresztül, egy 302 bp hosszúságú fragjnensl eredményezve.
Ezt a fragmenst megemésztjük EcoRí és azután Xfeal restrikciós enzimmel, annak érdekében, hogy agarőz-géleloktreldrézist követésű izoláljak a megközelítőleg 290 bp hosszáságú EeoRl-Xbal íragmensí, .«mélyet A-lragmensnek nevezitek.
A pVR 182b eukariöta expressziós plazmid ÍC. J, Luké és mtsai,, ísfécttöüs: Diseascs 175, 95-97, shi, .15 <1997», sunsly a VR1ŐÍ2 plazmlábói származik |a WO 98 Ö3199. számú nemzetközi közzétételi irat L ábrája és 7, példája; íhutikka, J. é&ndssi., Humán Gene Ther&py 7, 1205-1217. old. (1997)] tartalmazza a humán szöveti phzrsüoögén aktivátor (IPA) szignálszekveneiájá; kódoló olvasási fázist,
A pVRIíVO plazmidot BamHi-Sglil emésztéssel és számos klónozó helyet (Sauű-O, Boti, EcnSl, M, Emil, Esd, Bglll) tartalmazó szék versein idzedálásával módoslljbk, az alábbi oligouukleöddok hibrtdtzálá2Ö sáuak eredményeképpen:
BP326 (40-tagú) (3. azonos ítőszámá szekvencia)
5*-GATCTGCAGCACGTGTCTTACAGGATATCGAATTCGCOOCC-3’éS'
BP329 (40-tagú) (4. azonosítószámú szekvencia)
S’-GATCCGCÖGCCGCÖÁATT€ÖATATCCTCTAGA€ACGT<3CT«3’
Az Így kapott vektort — amelynek a mérete mégközelitöfeg 5185 bázispár (vagy bp) --- ρΑΒ 11 Őrnek nevezzük.
Az A-fríigmenst összeligáljuk a pAB 11:9 expressziős plazmáddal, amelyet korábban megemésztehünk Ábal és EeoR.1 enzimekkel, annak: érdekébes, hogy megkapjuk a pFClbl plazmidoí fó3?S bp). A humán cííomegafovírös korai promóteréuek (hCMV-lE, komán citontegáiovírus közvetlen korai) szabályozása alatt a
3D plazmád olyas. inzertet tartalmaz, amelyben a tPA aktivátor szignálasekvenéiaját a prM fehérjét kódoló szekvencia követi.
A pdkfor A ptevmű eMUstá*
Az NY99 West Nile vírus törzs komplementer DNS~éí (DNÍSé) a ííene Amp RAA ACA ®f (kai. sz. N S08 8017, PerkhnEimer, Nortvaik, CT 06859, OSA) alkalmazáséval szmtetizáijük meg a gyártó által adott kö35 rSlméayek között
A revsrz-trauszkripiáz: polhueráz-láncreakteóí (RT-PGR reakció) az N'¥99 West Ntle vírus törzs (2, példa) 5Ö pl virálls RNS-sznszpenziöjával hajtjuk végre, és az alábbi niig&nukleotidokkal:
FC183 (30-1 ago) ^5. azonosítószámú szekvencia)
5'~TTTTTTGAATTCTCACTGACAG TGCAG ACA-3'
- 14 és FC194 (33-ugú) (6, azonosítószámú szekvencia) ’-ΤΓΓΓΎΪΤσί AGA'rTAGCTÖTAAGCTGGGGCCAC-3 ’
Ez az oligonükleoti.d-pár lehetővé teszi egy EcoRÍ restrikciós hely, egy M resbákclós hely, és egy stspköíkm beépítésé? az inzert 3' végére.
Az első DNSc szálai az FC 104 ollgcjmkicotid meghosszabbításával szintetizálipk meg, az utóbbinak az
RNS-ntetrbíszal történő hilrfrőrzálésaí kővetően.
Az első DNSc szál. szintézisének a körülményei az alábbiak:: 42 °C ÜSírterséklet 1:5 percen keresztül, azután 99 ÖC 5 percen kérésziül és végezetül 4 BC 5 percen keresztül. Az 1C103 és FC104 olígonnkicotid-pár jelenlétében végzett PCR-makcié körülményei: az.alábbiak: 95 ’C hőmérséklet 2 percen keresztül, azután.35 ciklus
W (95 °C 1 percen keresztel, mükí 62 -’C I percet· keresztel és 72 °C 2 percen keresztül), és végezetül 72: °C 7 perces keresztel, egy 252 kp hosszúságú fmgsnensí eredményezve.
Ezt a íragsnens; megemésztjük EcoRÍ és azután Xbal restrikciós enzimmel, annak érdekében, hogy agaréz-géielektroíörézbt kővetően izoláljak a megközelítőleg: 240 l>p bosszóságü BcoRÍ-Rbsl §agm«nsí· W a iragmsnst ősszsligáljsik a pABÖ-ő expresszlős plaswdöál (3, példa), amelyet korábban megesnésziettenk Xbai
1.5 és EcoRÍ restrikciós: srtzá-nekket, Insgy megkaplak a pFCítte plásnióor (S32§ bpj.A bitmán cticanegafovbus korai proraóíerének (hCMV-lE, humán cltomeg&bvhus közvetlen korai) szabályozása alatt a piazmki olyan inzertet tartalmaz, amelyben a IPA aktivátor szignálszekvenci^át az M fehérjét kódoló szekvencia követi, .?. te&,· ApFCW ptervvé terWMte
Az NY99 West· Nite vírus törzs komplementer ÖNS-ét (DNSe) a öbné Amp RNA PCR O (kát. sz.
N SOS 0917, Pcrkin-Elmer, Norwalk, CT 00839, WA) alkalmazásával szintetizáljuk meg a gyártó által adott körülmények között,
A reverz-transzkripláz pőlímefáz-Iáncreakcíóí (RT-PÜR reakció) az MVW West Nlls vtras törzs (2. példa) S9 μ! vitális RNS-szaszpenziöjával bajtjuk: végre, és az alábbi eligonukleotidekkal:
FCÍ05 (30-tagú) (í.azönositőszámü szekvencia)
5-’nTrTFÖAATTCTTCAACTGCC1'TGGAATÖ-3' és FClöb (33-tsgú)0$. azenosltószánte szekvencia)
Ez az ölígöntíkleöíid-pár lehetővé teszi egy EcoRi restrikciós hely és egy Xfcal restrikciós hely beépítését az inzert 3’ végére, egy stopkodonnaí együtt,
Az első DNSc szál szintézise az -FCW& nltgösakteteld megbesszabbhásával megy végbe, az RNSmáírbeszai történő hibridlzálást követően.
Az első DNSc szál szintézisének a körülményei az alábbiak: 42 BC hőmérséklet 15 percen keresztel, azután 99 5 percen keresztül és végezetei 4 SC 5 percen keresztül, Az.FCl.95 és FClŐboBgOtetefentid-pár jelenteiében végzett FCR-rcakció körülményei az alábbiak; 95 CC hőmérséklet.2 percen keresztel, azután 35 ciklus (95 '°C 1 percen kérésziül, maid 62 °C 1 percen keresztel és 72 SG 2 percen keresztel), és végezetül 72 *€ 7 percen keresztül, .egy IS30 bphosszúságú tragsnenst eredményezve.
Ezt a Irsgsrenst megemésztjük EcnRi és azután Xbul restrikciós enzimmel, annak érdekében, hegy agaróz-gélefekíröforéztst követően izoláljuk a megközelítőleg 1518 bp hosszúságú EcoRI-Xbsí fagmensí, Ezt a fragmenst összeitgáljuk a pAEílü exprssszlős plnznhddaí (3. pékig), amelyet korábban megemésztettünk Xbai
-15•ás EeoRl restrikciós: enslínekkci, hogy megkapjuk a pFC 1 03 piazmidot (6Ő04 bp), A humán cttomcgalovírus korai promóterések (hCMV-fg, humán eítomegafovírus közvetlen korai í szabályozása kinti a: plazmid olyan martét tartalmaz, amelyben 3 tPA aktivátor wgnalszekvmriájái az E fehérjéi kódoló szekvencia követi, ó, péh&í,- .-1 /sA'C/PV pfcvrid e/óW/óőSí?
Az NY99 West NHe vírus törzs kőmgtenesttsr DNS-eí (DNSc) a.ö« Xzvp &¥4 FCE .Of (kai, sz.
H SÓS 0017, Perkin-Elmcr, Norwlk, CT 0ŐS59, CíEA) alkafeíazásávalszrístetizáljökmegagyértóáltaladoitköruiményck között,
A reverz-transzkriptáz. poíimeráz-iáncreakciót (RT-PCR reakció) sz ΝΎ99 West N'ils vírus törzs (2, példa) 50 pl vlrábs RNS-sznszpenziójával halijuk végre, és az alábbi oligonukieotidokkal:
FGlbl (30-tsgú) (1. azoríösítószáísá szekvencia) és
FClÖő (35-íágá) (8. azösosíiöszámú szekvesteia)
Ez az oligonnkleetiö-gár lehetővé teszi egy EcoRÍ restrikciós beiv, egy Xbal restrikciós hely, és egy stepkedsn beépítései az inzert 3’ végére.
Az első DNSc szál szintézise az FCtöé obgsnukfefööd meghösszabblrásával megy végbe, az RNS15 mátrixszal történő h ibrid izálást követően.
Az első DNSc szál szintézisének a körülményei az alábbiak: 42 CC hőmérséklet 15 percen keresztül, azután 99 5 percen kérésztől és végezetül 4 *C 5 percen kérésztől. Az FC101 és FC1Ö6 öiigsoukleorid-pár jelenlétében végzett FCR-reakcíő körülményét az alábbiak: 93 eC bóínérséklet 2 percen kérésztől, azután,3$ ciklus (95 °-C 1 percen keresztül, majd 62 *C 1 perce» keresztül és 72 UC 2 percen keresztül), és végezetül 72 ’C 7 per20 eea keresztül, egy 2Ő31 bp hosszúságú fragmsss előállítása érdekében.
Ezt a íragmensi megsmészriők: EeoRl és azután Xbal restrikciós enzimmel, annak érdekében, hogy agaróz-géleiekEoforézisí köt rtösn izoláljuk a megközelítőleg 2019 bp hosszúságú EcoRí-Xbal Sragmenst Ezt: a fegmenst összclígáljttk a-pAál Í0 expressAösplazmiddal (3. példa), amelyet korábban megemésztettünk Xbsl és EeeRl restrikció» enzimekké', hogy megkapjuk á pEClM plazmidot (71 05 bp). A humán cltontegaiovirus ko25 rai pröotóterének (hCM V4E, humán eltostegslovtrns közvetlen korai) szabályozása alatt a plazmád olyan Inzertet tartalmaz, amelyben a tFA aktiváíor szignálszekveneláját az prM-M-E fehérjét kódoló szekvencia követi,
7, péüte: ,4 /? FC7 Öá párrtwk/ dM&a
Az NY99 West Hite vírus törzs koroplsmeníer DN$~ét (DNSc) a öeue Xmp AAN FÜR O (kai. sz. N SÖS 0Ö I7, Ferisis-Eltner, Nönvsik, CT 9őö59, VSA) alkalmazásával szintetizáljuk meg a gyártó által adott kb30 rUhnéayek között..
A reverz-transzkripíáz pobmeráz-láncreakeiót (RT-ECR reakció) az NY99 West Nile vírus törzs (2, példa) 5ü pl virálls RNS-szuszpcnziójával hajijuk végre, és az alábbi oligonukieotidokkal:
CFIÖ7 ioó-tagú) (9. azonosítószámú szekvencia)
FCIOó (33-tagú) {§. azonosítószámú szekvencia).
Ez az olígoauMeotíd-pár lehetővé teszi egy' EcoRY restrikciós hely, egy·· Xbal resírikeiős hely, és egy siopkedon beépítését az inzert .3' végére.
Az ehö DNSc szál szintézise az FCsÖó obgonukleotid meghosszabbításával megy végbe. az. RNSmáírixszal történő brhriáizálást követőért.
- 16Az első WSe szál szmtézssések a kőrtilményei sz alábbiak: 42 X hőmérséklet 15 pem kérésztől,, azután 99 :'C5 percen keresztül és végezetül 4 *€ 5 perces keresztül. AzPCiOőésI CI07 ollgonukíeolid-pár jelenlétében végzett PCR-reakciő körülményei az alábbiak: 95 °C hőmérséklet 2 percen keresztül, azután .35 ciklus (95 ®C í percen keresztül /majd 62 CC 1 percen keresztül és 72 eC 2 percen keresel «s végezetül 72 eC 7 per5 een keresztül, egy 2976 bp hmsáságö .fragnsexss előállítása érdekében.
Ez· a fegmenst megemésztjük EcoRV és azután Xbaí restrikciós enzimmel, annak érdekében, hogy agaróz-géielekírotbréztst követően izoláljuk a megközelítőleg 2958 bp hosszúságú ReoKV-Xbat fragnaenst
Ezt a íragrnenst összeligáljuk a pVR1012 expressziós piazmíddál amelyet korábban megemésztettünk Xhal és EcpRV enzimekkel, annak érdekében, hogy megkapjuk a pFClü? plaznhdot (6953 bpy A humán citomegalovírus korai promőterénefc (hCMV-íR, bontás cítomegalovírus közvetlen korai) szabályozása alatt & plazmád olyan inzertéi tartatez, amely a.prM-M-E poi (proteint kódolja.
& pébtox pFOMpbWd
Az XY99 West Nlle vírus törzs komplementer WS-ét <J)NSe) a öcsé Xmp AAh PGS O (kát, sz, N SOS 9017, Eerkb-Ekner, Monyaik, CT 96859, (ISA) atote&u&ávat szmietizáliuk mega gyártó által aáeii kö15 rührsények: közök.
A reverz-trans2krÍpsáz ponmeráz-láncmakcióí (RT-ECR reakció) az NY99 West Nile vírus törzs (2. példa) 50 pl virális RNS-szuszpenrtójával hajtjuk végre, és az slábbt oligonnkleotidokkaí:
FOSS (Só-tagú) (19, azonosítószámú szekvencia)
S’-TTTTrTÖATATCAWATAATCCröATATGATTÖAC-S·* és EC199 (36-tngís) (11. azonosítószámú szekvencia)
S’-TTTTTTTC’lAG A ri'AACÖTTTTCCCG AGGCGA.AÖTC-3'
Ez az oiígonuklöotid-pár fehetővé teszi egy EcoRV restrikciós hely. egy Xbaí restrikciós hely, egyA'FG iniciáeiős kodon: beépítését az tanért 5’ végére, és egy stopkodon beépítését az inzert 3’ végére.
Az első EfiHSc szál szintézise az TC169 olígönnkleottd meghosszabbításával megy végbe, az RhlS25 mátrixszal történő hibridizálást kővetően.
Az első DhSc szál szintézisének a körülményei az alábbiak: í2 °C hőmérséklet 15 percen keresztül, azután 99 9C 5 percen keresztül és végezetül 4 >C 5 percen kérésziül Az i V t08 és EC! 99 oiigotmkieoíid-pár -eleníótében végzett EGR-reaketó körühuényei oz alábbiak: 95 **€ hőmérséklet 2 percen keresztül,azután 35 ciklus (95 °C 1 percen keresztül, majd <52 CC 1 percen kuíc.-rtúi és 72 eC 2 perces kérésziül), és végezetül 72 *€ 7 per36 cen keresztül, egy 2973 bp hosszúságú ibagmeus előállítása érdekében.
Ezt a fragmeast megemésrtjük EcoRV és azután Xfeal restrikciós enzimmel, annak érdekében, hogy agaroz-gélclektroibrézistkövetőon izolálják a megközelítőleg 2955 fep hosszúságú EcoRV-Xbaí fragmenst.
Ért a frsgmeKst ősszchgáljA a pVRIöi2 expressziős plazmíddal. amelyet korábban megemésztettünk Xbaí és EcoRV enzimekkel, annak érdekében, hogy megkapjuk a pFClÖó plazmidot (?H5ö bp). A humán eitomegálpvhüs korsí promőterének (hCMV-lE, humán citomegalovirus közvetlen korai) szabályozása áksb á piartuld olyan inzertet tartalmaz, amely az NS2A-MS2R-NS3 poíiproteint kódolja,
9. péá&.- ííomtzpfemtd'eH£e ar XE KdCáüadz/áimtW rtrets €5 ídrtéh#twrtíhhs toph ra
Az 5 755183, számú amerikai egyeséit úilssnokbelí: szabadalmi kai 14, ábráján a ksmkrtbhnlö vútss 3199 fep hosszúságú gexmmiáfe fmgmemsét ttmlapáfc be, Ennek a szekvenciának az elemzés® egy C5L nevezeté aySt leolvasási lazist (ORF) tárt. lel. mely az 1538, pozicióhass fcssáMK· és az 1839, pozieiómii ér végei, A CLS ŐRE delécldjához, és asmsk transdoápciss és transzlációs stepszignákskkal szegélyezett többszörös kiöso5 zó Wlyeí történő helyettesítéséhez vezető mzemiós plazmlá előállítását az alábbi módon valósítottuk meg;
EGR-rsakeiót végezténk .a kauárthitslS vlras genonóális DNS mátrixa alapján, az alábbi olígmmklsntííkík alkaimszásávak
C5A1 (42-tagÖ) (12, ázö.nosiíószámú szekvencia);
S'-ATCATCOAGCTCCAGCfGTAATTCATGOTCGAAÁAG/WjTGCVr 10 és C5B1 (?3-tagú) (13. azfönositószáirtú szekvencia);
5-GAATrCCTCGAGCTGCAÖ€aJ3OGTTTTTATAöCAU'rrAGTCAlTrTrfÖAGAGTACCA CTTCAG€TACCTC~3', annak érdekében, bog}·' izclállttak egy 223 bp hosszúságú PCR-ftagmettsí ÍB-tragmsms).
ECíGreakciőt végeztúnk a Ikaoánhúniö vírus genomlálís. DNS má&lxa alapján, az alábbi 15 öligonnkleoíldok alkalmazásával:
C5C1 (72-tagú) (14. azonositészátná szekvencia);
S’-CCCGGGCTGCAGCTCGAGGMTrCTTTrrATTÖATrAACTAOTCATTATAÁAGATCTÁAA
ATGCATAATTTC-S’ ás C5D1 {45-tagúí {15, azonosítószámú szék véne iák 20 5’-GATGATGGTzWCÖTAAACAAATATAÁlGAAAAGTATTCTAAACTA-3A annak érdekében, hogy izoláljank egy 482 t?p hosszúságú PC8.-ftagES.enst (G-fegmens)
A B~ és C-fragmettsí összehlbrldizáltak, hogy tnátríxkéttt szolgáljanak egy olyas Pt' 8 -reakeibbás, amelyet a 05A1 (42, azonosítószámú szekvencia) és CSDí (15, azonosítószámú szekvesoa) ohgonukleetidökkal hajtódnak végre, egy 481: hp hosszúságú PCR-tragmsns előállítása érdekében. Ezt a ffamnensí megemésztehók
2:5 Sael és Kpsí restrikciós: enzimekkel, annak érdekében, hogy agaróz-géieiekíroibrézist követően: izoláljunk egy megközelítőleg öö4 hp hosszúságú Saci-hpnl fmgmensí. Ezt a iragmenst összehgaltok a pAiGcSmvpr© 1/ 5S1+ vektomai (Stratagene, La Jolin, GEA, kát. sz. 212295), amelyet korábban megemésztettősk Eael és Rpnl mstrlkclős enzimekkel, mnmk érdekében, hegy megkapjak a pCSL plazmáét. Értnek a plazmádnak a szekvenciáját szekvenálással igazoltak. Ez a plazmái az alábbiakat tartalmazza; 1§Ő bp a C5.L ÖRF leolvasással ellentétes
Irányban lévő zégiőjábel (a GS baloldali szegélyező ága), egy korai koctwüf transzkripciós siopszignál, stopkodímok 4 olvasást lázasban, egy többszörös klónozó hely, amely SmaT, Pstl, Xbol és EeoRI helyeket tartalmaz, és végezetül 425 bp a CL 5 ŐRE leolvasással megegyező irányban lévő régiójáből(a C5 jobboldali szegélyező ága).
A pW:52:§HRH pisztmáöt: [Perfes, M, és mtsai., J, Viröi. ő3, 3829-3S36. old. (1989)1 alkalmaztak mátrixként á Elő lAzzmmb pramdíer (Gerdáitok hozzáférési szám: M28351) teljes szekvenciájának az; ampliíikálására az alábbi digonokieetiáokkai:
JCA291 (34-tagú) (lő, azonosítószámúszekvencia): S'-AMCCCGGGTTCTTTAITCTATACTTÁAAAAGTÖ-S’ és JCA292 (43-tagú) 1I7. azonoshószsznó szekvencia)
38§’»AAAAGAAriCÖTCGACTACÖATA€AAACTTAAC0GATAFC0CUr3\.
egy 149 bp hosszúságú PCR-dagmess aamlifikálása érdekében, Ezt a hagmenst: mssgsmészteít^í Smal
BS EooRl restrikciós: cszhnekkel, annak érdekében, hogy agarőz-géleiektröíörézist kővetően izóláhtmk egy megközelítőleg i 38 bp hosszúságú Smaí-EcoRl tragmenst, -Ezt a íragmemz Ssszeilgákúk a pC5E ptadááál, amelyet korábban mege?né,$ztetlö!?k Stnai és EcoRI restrikciós enzimekkel, sósak érdekében, hogy megkapjak a pFC · 0? pkestaldoi;
/0. pdfto X «£WW rífáwhinte «tor «Mfo
PCR-reakcióí hsjte-wk végre a pPCIŐS píaz?nid (7, példa) utáírbíkéní történő alkalmazásával, ás az alábbi olígonukleotidokkak
FC110 (33-ta.gú) (Ό. azonnsftdszámú szekvencia):
5TITTCGCGAACCGGA ATTGC AGTC ATGATWöC-3 ’ és PCI 1.1 (39-lagú) (19. azonositúszátnú szekvencia): S’-TnTGTCGACCCGCCCCCTTAAOCCTGCACOrrCACÖGA-S’».
egy snegközelhőleg 2Ö79 bp hosszúságú PCR-fragmeos amplitskáktsa. érdekében, Ezt a frag;nenst meg15 emészisítök hírül és ball restrikciós enzimekkel, awak érdekében, hágj' agaróz-géleíektrofetrézíst követően izoláljunk egy mcgközelltöisg 2ÍW bp hosszúságú Ntul-Salí fragmetsst. Ezt a fragmsnst összeíigáltuk apFClÖ? piazísiddal (9. példa), amelyet korábbat? :8?eges??észtebünk hírül és Sáli restrikciós esziokkkel, axtaafc érdekében, hagy megkapj uk a pEC 108 plazmidol,
Á pPClŐb píazmidöl Imeurizaituk Nőd restrikciós enzimmel, és azután irasszStktáltnk elsődleges cslr20: keembrió sejtekbe, amelyek nteg voltak tonőzve a kanárihimlő vírussal (az. ÁLVAC törzzsel):, a korábba·? leírt kaklttm-fosziát kicsapásos módszer alkshnazásávaí {Fanicaíi és Eaobtii, Érne, Nati. Acad, Sei. USA 79, 4927» 4931. old. (1982); Picéiül és rotsaí. Metbods in Enzymology 153, 545-563. old. (1987) szerk.: Wu, R. és Grossmao, L,, kiad,: Academls Press], A pozitív tarfbltokst rudioaktlvan jelölt próbával történő hibridizáció alapján: választottuk ki, amely az £ jelű bmek-giikoprotem. nnkieatid-szekvescl;^ára vett specifikus, Ezeket a
25' tartóitokat 4 egymást követő alkalommal szelsktáltokdisztitettak, amíg tiszta populációt ízölálíaok, Azt kővetően a pEÜlOR donor plazmád és az ALVAC kaítáríbímlö geneuga közötti m vto· rékömhináciőnak óregfsielő reprezentatív tarfoltoi ampijfikáit?ínk, és rekombináns vírastőrzseí állítottunk elő, amelyet vCP! 7 T2~nek rsevezetönk el.
7/, pélkö; ,4 vCiP/7/.? refmmútoss rfrus efúOíáan
A pFC!04 plazmidoi ló, példa) megemösztetihk Sáli és PasS resbttelós enzimekkel, annak érdekében, hogy agaróz-gélelektrolorézísí kövsífer izoláljunk egy megközelítőleg: 220 bp hosszúságú Wnil-Sall restrikciós hagrmmst. Ezt a feagmenst üsszeligáhuk a pFC 107 ptatdddsl (9, példa), amelyet korábban megemésztettünk hírül és Saif restrikciós eszanekksl, annak érdekében, hogy megkapják apFCíöÓ plazmidot.
A pEülO9 plaztnidoé línesrtzálíuk Wl restrikciós etndmmel, és azután transzfektáltuk elsődleges csírkeembrió sejtekbe, amelyek meg voltak tes-íózve a kauárihmúö vírussal (az AEVAC törzzsel), a lő. példában bírt eijárás szerint. Arc követben a pPClÖá donor piamnid és az ALVAC kanáríbimlő gesmmja közötti át váza *eköíöbisáciratak megfelelő reprezentatív tarkáim választottunk ki az E jelű burok-ghkoprefem nuktóiá- 19 szekvenciájára specifikus, radioaktlvan jelölt próbával történő bibridizáció alapján,, és azután amplifikáltuk azé A kapott rekombloáss vbsjstömset VCR7í3-nak ne vsaink ek
JA ρΑΑν A í</J ? B ra»b'?f?nW«ám vfe sőbfó'íbírn
A pFClO.3 piaz-nidot (5, példa) megemésztettük Sa.ll és Pmii restrikciós enzimekkel, annak érdekében. 5 hogy agarőz-géleiektroforézist követően izoláljunk egy megközelítőleg 1712 bp hosszúságú Fmlí-SAf :resbikcios fegmenst. Eri a fr&gmeust összalígátak a pFC 187 plazmíddal (9. példa), amelyet korábban nvagemésAettőnk
Nsaf és ball restrikciós: enzimekkel, annak érdekében, hogy megkapjak a pFC 110 plazjsíöot,
A pFCl 10 plazmláot feeanz&ltak Nőd restrikciós enzónmel, és azután transzíektátek elsődleges csirkeembrió sejtekbe, amelyek meg voltak fertőzve a kanárlhirulö vírussal (az ALVAC törzzsel), a 10, példában feI-Ö irt eljárás szerint. Azt követően :a pFC 110 donor píazntid és az ALVAC kanáribimlő genorujaközötti I» vl.w rekombinációsak megfelelő reprezentatív tarlóból váiasztotatnk ki az B jeiS btírök-giikoprötein ttnklAAí'dszekvencfájúra specifikus, radioáktívnn. jelölt próbával történd hibridizáció alapját·, és azután amph Ilkáitok azt, A kapott rekosnbisáss; víraslörzset YCFl714-nek neveztük el.
JA példáé A: 7*5 refcmáíkíms vte «Mm
A pFClSC phzmidöt (4. példa) msgefnészlídllik Sáli és Ptoil restrikciós cnzimekkef, annak érdekében, hogy aguróz-géielektrofórézlst kővetően izoláljunk egy megközelítőleg: 434 bp bosszúságé Pmll-Ssli restrikciós fragmenat, Ezt a fragmenst Ssszcfigáituk a pFClb? plazmiddal <9. példa), amelyet korábban megemésztótitak Nmi és Sa’d restrikciós enzimekkel, hegy megkapjuk a pFCBl pfesmidet.
A pl V111 pteiaiáot linearízáituk: líoti restrikciós enzimmel, és azután. íraoszíetólink elsődleges esir~
2Ö keemhriő sejtekbe, aerelyek meg voltak fertőzve a kaoárininilö Arassa! (az ALVAC törzzsel), a ifi. példában, teirt eljárás szerint, AA követően o pK 11I donor piazmtd és az ALVAC kanárlfelmlő gesomja közötti í» vára rekombinációnak megfelelő reprezentatív táj finnt választottunk ki az M jelű mcmbrán-glíkoprolem nákleotldszekvenciájára specifikus, radloaklrvaa jelölt próbával: tőrténS hibridizáció alapján, és azután amplifikáliuk ári. A kapott rekombmáhs virastörzseí VCF1 715-nak neveztük el
JA péőA: A v«7 ?/ö /«ánmá/sdn.v Áras AAAAAse
A pFC iÖl plazmidot (3, példa) megemészt jók Sáli és PmlL restrikciós enzimekkel, annak érdekében, ángy agároz-géieiektrofbrézist követően izoláljunk egy msgközelltöbg 484 bp hosszúságú Fmli-Safi restrikciós fragmeast, .Eri a íragmenst összellgáljuk a pFü 107 pbzmlddai (9. példa), amelyet korábban megsmészíeitüns Kral és Sáli restrikciós enzimekkel, begy megkapjuk a pFCll.2 plazmkfot
A pFGi 12 piazmidot finearizáfeífc N«I restrikciós, enzimmel, és azután transzfekiálmk elsődleges cslrkeernbriö sejtekbe, amelyek meg voltak fertőzve .a kanárilfirnlö vírussal (az: ALVAC törzzsel), a lő. példában leírt eljárás szerint. Azí köveiden a pFC 112 donor piazmid és az ALVAC kanárihimlö genomja közöd! 1» vára rekombinációnak megfelelő reprezentatív tartóitól választottunk ki a prM jelú pre-membrámgiíkogreteln nnkleotid-szekvcnciájára specifikus, roöioaktsvan jelölt próbával történő hibridizáció alapján, és azután abtplifikáfisk ári. A kapós rekotnbinans vbusfőrzset VCF17ió-nsk neveztük el.
/5, pd&ía.’ öoíwrptern/d ^áWzdre a?. A£ MC Asffrfr/AWÓ' w?«s Có áerédre ídróbm /sceridkA ed/jdra
A WO 01705934. számú nemzetközi közzeisiélt irat 4, ábráján a kanárihimlö vírus 3700 bp hosszúságú genomiális hagmeósét mutatják be Ennek a. szekvenciának az elemzése egy Gól., nevezető nyílt leolvasási fázist
-20(GRF) tárt fel, amely g 377, pozícióban kezdődik, és a 2254. pozíciónál ér véget, A CEö ÖRF deiéelójáboz, és annak tmsszkdpclős és transzlációs stopszigsátekkal szegélyezett többszörös klónozd hellyel történő helyettestléséhez vezető ínzerciós pktzntid előállítását az alábbi módon valósítottuk meg:
ECR-reakeioi végezténk a kaoánhimlő vírus genontiálh; DNS saőtrixa alapján, az alábbi 5 ©ligomkfeotlduk alkalmazásával:
•CöAl (42-tagú) (20. azonoaitőszámú szekvencia)::
5'’ATCA'rCOAGCTCGCÖGCCGCCTATCAAAAGTCrrAATGAGTT-3’ és C6B1 (73-tagú) (21. azoousltóssteú szekvencia):
S’-GAAI TCCrCGAGCTGCAGCCCGGCÍTTnsTA'fAGCTAATTAGTCATTTTTTCGTAAGTAAG 10 TAT ΓΠ'ΪΑΤΤΤΑ A-3 ’, hogy izoláljunk egy 432 bp hosszúságit EGR-fegmesst (D-íragmens).
FGR-reakcióí végeztünk a kanárihimlő vírus genomlálix DNS mátrixa alapján, az alábbi ohgomrklcotldok nlkahnazásávak
C6CI (72-tagú) (22, azonosítószámú szekvencia):
5'-CCCOGGCTGCAGCT€GAGGAATTCTrrnATTöATTAACTAÖTCAAATGAGTATATATAz\ 'nGÁAAAÁGTÁÁ-r· és CbDl (45-tagű) (23, szonoshószárnü szekvencia):
5’-GATG ATGGTACC'l'TCATAAATACAAGnTG AITAAACTTAAGTTG-3 hogy izoláljunk egy 1210 bp hosszúságú PCR-fragtuenst (E-fragmens).
AD- és E~tragmsnst ősszshibrídisáltuk, hogy mátrixként szolgáljanak egy olyan FCR-reaksIcfean, amelyet a C&Al (2ik azonosítószámú szekvencia) és GÖD I (23, azönositószámú szekvencia) obgdnakleötiáökkal haj tonnák végre, egy IŐ3S bp hosszúságú P€R~ihtg.mens előállítása érdekében. Ezt a fragmenst megemésztettük §ad és Kpnl restrikciós enzimekkel:, annak érdekében, hogy agaréz-géielektrnlbrémst kővetően: izoláljunk egy megközelítőleg i é l '3 bp hosszúságú SaeI~Kp.nl fragmenst:, Ezt a Itagmenst összelígáltük a .// 5A425 vektorral (Stratngene, I,a .iolia, VSA, kát, sz, 212205), amelyet korábban megeutésztcitífek Sael és Kpnl restrikciós enzimekkel, annak érdekében, hogy megkapjuk a pCóX, plazmióot, Ennek a plazmídnak a szekvenciáját szekvenálással igazoltok. Ez a plazmlá az. alábbiakat: tstíalrnazza: 370 bp a GÓL ŐRE leolvasással ellentétes irányban lévő régiójából (a C6 baloldali szegélyező ága), egy komi: Kwhw transzkripciós stcpszignál, stopkoábnok á hat olvasási fázisban, egy többszörös klónozó hely, amely Smal, Esti, Xfeof és BeoRi helyeket turíateaz, és végezetül 115ő bp a CG6 Ö&F leolvasással: megegyező Irányban Mvö régiójábóifa Cő jobboldalt szegélyező ága).
A.pMPIVC ptoidoí [Schmitt, J. F. C. és mtsai, .1. Virul. 62, 1 §89-1397 old (19S8): Saíki, E, K. és tnísas., Science 239, 487-491 - old, (1983)] alkalmaztuk mátrixként az 13E lőscemm promóter teljes szekvenciájának az arnpiíiikálására az alábbi ölsgontikleoíidökkai:
FC112 (33-tagú) (24. asonosltószámú szekvencia):
5'-AAACCCGGGCGGTGGTFTGCGATO<X3AAAT€T^ és EC113 (43-tagú) (25. azonosítószámú szekvencia):
S’-AAAAGAATTCGGATCCGATTAAACCTAAATAATOTAC'I’TTGT^', egy 151 bp hosszúságii PCR-ffagmeíts antplitíkálássérdekében. Ezt a fragsnensí megemésztettük Smal és EeoRI restrikciós enzimekkel, annak érdekében, bőgj' agarozz-gélgiektroforézist kővetően izoláljunk egy öregközelítőleg 136 bp hosszúságú Smal-EcoSI ftsgmenst. Ezt a. fragmesst összeiígálíuk a pC6l, plazmlddal, sásékor korábban megemésztsiíürsk . Emsl és BeöRf restrikciós enzimekkel, annak érdekében, hogy megkapjuk a pECI 13 plazmidot.
M pdő&z A WÍFÍM víWZfS rgá«f??áó?ífes ribísoá eMTWe
PCR-rsakciőí hajíotsattk végre a pFCIOá plazmid (8, példa) mátrixként törlésé aikaknazásával. és az alábbi Gigöimkleofldökkal:
'FC! 14 (33-tagú) (26. azonosítószámú szekvencia): í 0 5 '-TFTCACG TG ATG TATA ATÖCTGATATGATTOAC-3 ’ és FCF15 (42-tagú) (23, azonosítószámú szekvencia):
5’~TTT'TGGá'FCCóCGGCCGCTTAáCGTTT7'CGCGAGGGGAAGTC-3’( egy 2973 bp hosszúságú FCR-frsgtsess ampliflkálása érdekéber F zt >s fragmeast megearésrietílík Emii és Sandái restrikciós enzimekkel, annak érdekében, hogy agsrőz-géielekgöibrérist kővetően izoláljunk egy
IS megközelítőleg 2958 bp hosszúságú Fmlí-BamHl fragstensi (F-íragibens), A pFCHJ plazmldőt (IS, példa) megemésztettük FmlI és BamHl restrikciós enzimekkel, annak érdekében, hogy ugaróz-géleiektroíbrezlst követően szólaljunk egy megközelítőleg 4500 bp hosszúságú Pmlí-BamHI &agmmst (ö-fttgmerss). Az F és Gr fragme' sí Gigáitok a pFCl 14 plazmid előállításához,
A pECI 114 pbzmidoí Imearlzsltuk NotI restrikciós enzimmel, és azután transzfektáltük elsődleges
20' éstrkeemhrió sejtekbe, amelyek meg voltak fertőzve a VCFi 713 ka-táríhímiö vírussal (11. példa), a korábban leid kaiemm-fössriúí klesapásos módszer alkalmazásával (Faniésii és Paölstti, Proc. Mail, Aesri. .Set USA 79, 4927-4931,. öld, (1982): Picéin! és mism,, Methoás InEnzvatölögy 153, 545-563,. old. (1987) szerk,: Wu, X. és Grossman, L,, kiad,: Acsdsmic Press), A pozitív taribkekaí radioaktivan jelölt próbával történő hibridizáció alapján választottak ki, amely az F, jelű: bnrok-gbköproteln sukieoüd-szekvencíájára volt specifikus. Ezeket a tartóitokat 4 egymást követő ciklusban szelektáltuk/tisztítöttuk, amíg tiszta populációt izoláltunk. Azt kővetően a p'fCfid donor plazmid és az ALVAC kaoárihsmíö genomja közötti is vúro rekombinációnak megfelelő reprezentatív larfokot ampliftkáknnk, és rc-kotífoináns vírastöEzztet állifoilunk elő, amelyet vGPl?17-nek nevszedisk el.
A ΉοίΙ. enzimmel lineárisait pBCll4 plozmidöt Is aikaisrmzítsk vCP 1712 kanáriblmlö vírus: (10. példa) elsődleges csirkeembnó sejtek izanszíektalására a íímtehb isiit eljárás alkalmazásával, Á kapott rekombináris virustőrzset VCP17Í8-nak neveztük el,
77, pd/do; A pőzcpríd nWl&ztö
Az NY99 West Nsie vírus törzs komplementer DNS-ét (G19Sc) a Gene Atsp P7&4 FC/? O (kát. sz, bl 81)8 Ő917, Eerkin-EImsr, Notvmlk, CT ÖÓ859, USA) alkalmazásúval szintetizáltuk üreg a gyártó állal aduit fcő.35 rülmények közölt.
A reverz-ítnsszkripsáz polirnssőz-láncreakclőt (RT-FCR reakció) az 19Y99 West hőle vírus törzs (2, példa) 50 pl viráíis RNS-szaszpenztőiávs! hajtottuk végre, és az alábbi oligonükleotidokkal:
FC116 (39-tagú) (28. azsmosíföszámú szekvencia) ’ -TTTTTTG ATATCATGACCGG AATTGC AGTCATGATTGGC-3 ’ ésFCtOó <33~tagú) szernssítőszámö szekvencia).
Ez az <d.igosuklcotiíl-pár lehetővé teszi egy EeoRV resüikelós hely, egy XbnI restrikciós hely, egy ioieiáelős kodon beépítését az· inzert 5’ végére, és egy stöpkodon beépítését üz inzert 3’ végére;
Az. első DHSe szél szintézise az EGlÖó eiigonuklemíd rsígghösszabbításával megy végbe, a.z RNS5 mátrixszal történő bibridizáiást kővetően.
Az első DNSc szál szintézisének .a körülményei az alábbiak: 42 °C hőmérséklet 15 percen keresztül, azután 99 *€ 5 percen keresztül és végezetül 4 <lC 5 percen keresztül, ÁzFCÍÖb és PCI iö oligoouklemid-pár jelenlétében végzett PCR-resfeeiö körülményei az alábbiak: 95 *€ hőmérséklet 2 perces keresztül, azután 35 ciklus (95 °C 1 perces keresztül, majd ő2 °C 1 percen keresztül és '72 °C 2 percen keresztül), és végezetül 72 CC 7 per10 ccn kereszthl, egy 2979 bp hosszúságii íragmesst eredményezve,
Ezt a bragtnensl megemészfjük EcoRV és azután Xhal restrikciós ssmmmel, hogy agarósv gélelektrolbrézisf követően izoláljuk a megközelítőleg 2061 bp hosszúságú Eco'EY-Xbal frngmensí.
Est a fragmerst összeiigáljnk a pVRlöhz exprcssziös piazmiádal, amelyet korábbanmegemésztettünk. Xbal és EeoRY enzimekkel, hegy megkaptok a pFCl 15 plazmidot (őSóő bp). A humán cltbmegalovirus korai
1,5 prontóteréaék 0OW-ÍE, bűmén chömegalovkus közvetlen korai) szsMyösása alatt a piazmiá olyan inzertet tartalmaz, amely a prM-M-E poliproteint. kódolja.
M pcóíb; ,4 i’Cpypf 7 í-skíjmhímím vám® «ftsWbhm
EGR-rcakeíót hajtottunk végre a pFCl 15 plazuúd (17, példa) mátrixként, történő aikafeazásávai, és az.
alábbi oligotmkleöítdökkal:
FCí 17 (36-tagó) (29. azonosítószámú szekvencia)·
5’-Tl'TTCGCGAATOACCGOAATT6CAGTCATOATTGÖC-35 és ECl 11 (39-tagú) (19, azonoshőssáíná szekvencia), egy 2082 bp bosszúságó xKCR-ífsgmens amplifikálása érdekében. Ezt a Iragmenst megemésztettük Nrol és Sáli restrikciós enzimekkel, hogy agaróz-géleiektroíorózist követben vulMjörsk egy megközelítőleg: 21171 bp hosszúságú Nrul-Saii tragmenss. Ezt a fragmenst össxeligátók a pi-Y107 plazmiááal (9, példa), amelyet feertibban megemésztet-űnk Nrul és Sáli restrikciós enzimekkel, bőgj-megkaptok a pi'Clló piazmtáöi.
A pFCl lő plazmidut ímeartzáiísk Nötl restrikciós enzimmel, és szótan transzfektaiwk elsődleges csirkeembrló sejtekbe, amelyek meg voltak fertőzve a kanármimiö vírussal < az AEVAG törzzsel), a 1Ö. példában leirt eljárás alkalmazásával. Azt követően a pFClló demor plazmid cs az ALVAC kanarihimlö genomja közötti ót vbzö rekombinációnak megfelelő reprezsntsüiv tsriöltot választottunk kt az: E jelit borofe-giütoprotels nuktentíöszekveneiájára specifikus, radioaktívon jelölt próbával: történő hibridizáció alapján, és azután: mnpiiilkáifuk azt. A kapott rekotn&máns vírastőrzset YGF201.7-nek neveztük el,
7E pdbm.- .tónmúmfe mYúYÁ YAYZóósu lovakéinál előállítása esetében a vCF1712 rekombmáns kanáribimlő vírust (10. példa) karbomer ulda35 tokkal adjovánsozsuk, nevezetesen Cnróöpm W?4P-vvj (BP Goodnek, Ohio, Amerikai Egyesült Államok, molekulatömege körülbelül 3000000).
Eredetileg 1,5¾ íörzsoldatot álltunk elÖ 1 gd nálrívm-kloridöt tartalmazó- desztillált vízben. Ezt a töfzsoldatot alkalmazzak szntán 4 mg/mí oldat előállítására fiziológiás söóid&t” bős. A törzsoldaíot összekeverjük a megjelelő térfogatú fiziológiás söoldahab akár egy lépésben, akár több
23egymast kővető lépésben, és a pB értékét minden lépésben beállítjuk 1 N (vagy' akár még: töményebb) nátrlumhidroxid oldattal, annak érdekében, hogy 7,3-7,4 végső pB-értéket kapjunk.
Az Ily módon kapott, felhasználásra kész oldatot alkalmazzak lioffizálí mkembfeáss.
vírusok feloldására vagy koncentrált rekojnbínáns vtms-törzsoídafok hígítására. Például B5spfe/1 ml dózlts ter5 udmaző virális szuszpenzió előállításához vitális törzseidétől ágy krgstnnk, hogy lóSif pfeúnl titert kapjunk, majd tovább hígítjuk azonos térfogatú felhasmáiásra kész 4 rugón! €Wő&y>o/TMUéP oldattal feekombmáss vakcinákat előállíthatunk az alábbi rékotnbmáns: kasártbhniő vírusokkal is: VCT1713 (13. példa) vagy vCEl717 (16. példa) vagy VCEI718 (lő, példa) vagy vCP2öl? (1§. példa.) vagy az alábbi bárom kanárlkímlö vírus keverékével: vClU?t4 (12. példa), vCPí7l5 (13. példa) és vCPl Víé (14. .példa), a fen10 tebb leírt eljárás alkalmazásával,
20. pé&fef,* DA’ő-vukcőidk edoWfífeé édfd/dk szdMra
A pFClÖ4 plazmidot (6. példa) tartalmazó DNB-oldatof befőményltjök etanolos kiesapással a Sasnbrook és mtssí (1989) által leírt módom A DMS-osopadékot Ö,9% MaCl eídatfesn oldjuk fel, oly módon, hogy l mg/ntl koncentrációt kapjunk. 0,75 mM DMRIE-DÖFE oldatot álllmok elő QMMIE-DOPE liofilizáo.mmak alkalmas steril vízben történő feloldásával
A plazmiá-lípid-lőBS komplexek kialakulását a 0,9% NaCi-ben lévő I mg/ml DNS-oldamak azonos térfegasú ö,5 mM DMRIE-DÖPE oldattal (1:1) történő hígításával érjük el, A DNS-oldatot fokozatosan juttatjuk be 26G hullámos szélű tővel a katíonos llpídet tartalmazó edény fala mellett, begy megelőzzük a hab kialakulását. Óvatos keverést kezdőnk, amíat a. két oldatot összekevertük. Végezetül 0,375 ΛΙ BMRIE-BÖBE-t és
2Ö 500 ngfml plazmidót tartalmazó készítményt kapunk.
Kívánatos, hogy az összes alkalmazott oldat környezeti hőmérsékletű legyen a fentebb: leírt műveletek folyamán, A DBS/DM.R1E-DOPE komplexálődása 30 pere alatt megy végbe szobahőmérsékleten, mielőtt az állatokat: immoni.zóljuk.
DhíS-yakeinákat előállíthatunk a pFCl94 (Ő. példa) és pFElÖő (k. példa) plazntídokaí: tartalmazd DNS25 oldatokkal is, vagy a pEC 105 (7. példa) és pFC 106 plazmiáöfckal, pEC 115 (17. példa) és pEG 10ó plazmídokkal, vagy a pEClÖl, pEClÖ2 és: pEClöd (3-5, példa) pjazmídokka!, vagy a pEClöS vagy pFGl 15 plazmídokkal, a jelen példában leld eljárássík alkalmazásával,
23. pé&hrt la vítro gvpre.wös zessfeá
Teszteljük a WN fehétjék expresszlőjaí az egyes konstrukciókról, hagyományos ínálrekí 30 smntim&mreszeencts és Western-hloí eljárások alkalínazásával.
Ezeket a teszteket 9ő-méröhelyes rmkrotítértetuezekau hajtjuk végre, amelyek plazmidokltai transzformált CNÖ sejteket tartalmaznak egysejtes rétegben tenyésztve, vagy rekombmáns vírusokkal fertőzöd CEE sejteker tertafasznak, egysejtes rétegben tenyésztve,
A WN fehérj éket fertőzött csirke- vagy lőszerutnokkaí és jelölt anííszérunrokkat detektáljuk,
Az agarózgélben történő feítatás alán kapuit fmgmenssk: méretét összehasonlítjuk a várt értékekkel,
22, péM?,' A/Arfoázm mért Oöíáííwsdg
A rekombináss vakcinákat és plazmidv&kcináka· megközelítőleg két hét: Időközzel két alkalommal Injektáljuk be, megközelítőleg hétsapos, vakcinálatlan SPF csirkékbe ismamuszktiíárls úton, megközelítőleg 0,1 ml térfogatban. Vakcinálatlan kontroli csoportot is alkalmazunk a vizsgálatban.
-24 A csirkéket megfertőzzük a nyakba szabkután .sá-oU pstogén West Nile vírussal (103 * ΪCíD5SX
Virémtát, efienauygg-vélaszt és mortalitást figyelünk meg, Boaceíást hajtunk végre a sérülések megfigyelésére.
J3, jvábfe; IfW-sm&gm/íö' etecrtyőgok rtírá/ás«
Háromszoros hígítás? sorozatokat készítünk az egyes szertanokból 13MEM tápközegben, amelyhez 10% magzati hotjószérumot adtunk, s^tteyésztö típusú 96m?érőhelyes mifaöfiíettemezekes. Ö,b5 ml hígított szérumhoz hozzáadunk 0.05 űrt tenyésztő tápközeget, amely megközelítőleg 1ÖÖ CClP5ym? WNV-í tartalmaz. Ezt az efegyet 2 órán kérésztől ittkubáljttk 37 *C-os tennoszíáíban .5% €Ort íartsfataző atmoszférában,
A tnl-eukén! megközelítőleg 1Ö8Ö0Ö VERŐ sejtet tartalmazó szuszpenziö ő,t 5 ml-éí sáluk azután hozw zá mindegyik eíegyhez, A cítopásíás hatást (CPE) fáziskontrsszt mikroszkóppal figyeltük meg 4-5 napos teayésztés után 37 cC-on 5% CO;-t tartalmazó atmoszférában. Az egyes szérumok semlegesítő· ikerét a Karberíéle eljárással számítjuk ki. .A űtereket a. mérőhelyek 50%-ábtm a citopátíás hutást gátló legnagyobb hígításként adjuk meg A litereket log'W VNSS-kéht fejezzükki, Mindegyik szérumot legalább kétszer megtítcáljnk, előnyösen négy alkalommal.
JA pé&fe: .4 vCPMí 7
A VCP2fi l7-t (Hí, példa) feírtahnazó, felhasználás előtt 1 ml. Cteőoperth 97AF adjuvánssal (4 mgársfl rögtönözve kiszerelt rekombínáns vakcisákat két alkalommal injektáltuk be 35 nap időközzel három hónaposnál Idősebb lovakba, amelyek korábban nem voltak vakcináivá, az infeimmszkuláris utat és megközelítőleg 1 ml tétfogatot afealmazva. Állatok három .csoportjai takcináhuk, ΙΌ’3 i CIO< (<!zaz ίΟ’·*4 pf«) dózissal az L csoport esetében, lífe8 CC1D=,q títzaz 'W^ pm) dózisai a 2. csoport: esetében és W?> CCÍDjo (azaz iO^pfujdoztssala 3. csoport esetében, Vakeináfeíla® kontroll csoportot is alkalmaztunk a vizsgálatban.
Megfigyeltük a szexológiai Megállapítottuk a semlegesítő ellenanyag-titereket, loglö értékként kifejezve, amint a 23, példában bemutattuk.
Csoport l iter a ö. napon Titer a 35. napon Titer a 49. napon
1 <0,6 «178 2,66
2 i «3,6 U4 2,?S
«tő 1,16 2,26
Kontroli } <0,6 i <0,6 <0,6
Miután részleteset? feltártuk a találmány előnyös megvalósítási módiak, nyilvánvaló, hogy a mellékeit igénypontok: állal megbatározott íalálmásty m kofiátnzédik & fent? leírásban ismertetett részletekre, mivel számos nyilvánvaló variáció lehetséges anélkül, hogy eltérnénk a találmány szellemétől és olíshni körétől
A szekveoei&listábas található szabad szövegek fordítása <2!8> 1 <223> Revetz-traoszkdptáz PCR-bea alkalmazott, CF10Í jelű ollgonökleotUi 5 <2IO> 2 <223> ReverzAmoáztóptáz PCR-bsn alkalmazott, FC102 jelű öhgesnkleoííd <2H)> 3 <223> A p VR t Ö2& piazmíá módosításához alkat mázott BR32Ő jelű hlbndlzálő oligomíkleetíd <21 í> 4 <223> A pVRlQ2© plszzmó módosításához alkalmazott BP329 jelit híbrídfeáló ollgooukleotld <2,te> S <223> Reverz^temszktipíázFCR-bsB alkalmazott, FC1&3 jelű oligomdcleotíá <2iö> 6 <223> Reverz-haBSzktiptáz FCR-hea alkalmazói;. FC104 jelű ollgosokleotld <21ö> 7 <223> Revetz-traBSzkripíázFCR-bea alkalmazott, FC 103 jelű ollgoshkleotld <210> § <223> Reverz-fe&osztópíáz FGR-bea alkalmazott, FG 10b jelű oligomskleotld <21:0> 9 <223> Revetz transzkriptáz PCR-beo alkalmazott, CF107 jelt oltgötmkBööd <2:0> m <223> Reverz-femszkriptáz RCE-bes alkalmazott, FC10S jelű ölígmmkleotid <210> 11 <223> Rsverz-tmaszkt ipfe? ICR-bea alkalmazott, FC199 jelű ollgonokleotld <210> 12 <223> Reverz-trasszkrlptáz RCR-ben alkalmazóik C5A1 jelű öllgOBokleotid
-2b~ <219> 13 <223> Raverz4?»E5szkriptáz:FCR~feea alkalmazott, C5B1 jelű oligoasátleetid <219> 14 <223> Revetz-trsnszksdptáz PCR-bsn alkalmazott C5C; jeli: ölígömádeodd <210> 15 <223> Reverz-transzkriptáz FCR-bsn alkalmazott, C5D1 jelű obgormkleotlö <210> 16 <223> A MS Ftóefepfomótsr ampllíikátására alkalmazott 3CA291 jelű oílgormkleotid <210> 17 <223> A MS 1 drcx/nrfcf pfomótsí amplíflkáldsáza alkalmazod JCA292 jelű öltgormkleoíiíl IS <2tt> 18 <223> Reverz-iranszkrípíáz PCR-ben alkalmazóid FC1 lö jelit oligonukleotld <21ö> 19 <223> Röverz-tmoszkríptáz PCE-hen alkalamaott, FC111 jelű: oltgosuklsötid <210> 20 <223> 'Reverz^tfaosKkelptázPCR-bes alkalamzod, CőAi jelit oligojmkleotid <21Ö> 21 <223> Revorz-traoszkbptáz FCR-bes alkaboazod, CdR l jelű ollgonukleodd <210> 22 <223> Reverz-trartszkrlpfe PCR-bso alkalmazott, CSC 1 jelit ollgmrnkleotid 30 <210> 23 <223> Reverz-ttanszkAptáz FCR-beo alkalmazott, CőD i jelű olsgormlíleetld <2i6> 24 <223> Revora-ts-anszkn'ptáz FCR-bes altetboazoií, FC'l 12 jelű obgottökleodd <210> 25 <223> Rovorzdraoszkriptáz FCR-%eo alkalmazott, FC113 jelit aílgormkleoítd <2 ÍO> 26
<223> ReverzArassskripfe: P€R-bs® alkalma íoU:. FC114 jelű almormkieooá
<21Ö> 27 *% ^''3 *j '•v T^v>\/ZSúi»>s· 4*>kS>AYS'vJz^»i#«S‘{*A>:y ί5/**”’ΐί f-»í !>»» í*\x A‘ -r/r.vX 12*Ζ^'ί 1 **£ <'Λ'ί·2Λ xt yíX-xví’S'» vS.*‘f .’X^'x'í'VXV
v?· ^Ζ-Λς?··3, Ιν£ν£ΓζίΡΛΗ5ΖΚΤφΜΖ rtK*DW &3&3ΑΏΜ ivlíj rl i í-> j£iu JiígOnw\ÍCvu.<4
<2iÖ> 28 ••C?’? -v”> R£v^T‘z*t^íts<yirFTOÍs£^': ΡΓ^&/>43ί*ϊ*' Jí lísrsíwft zívtí ΐ 1 & fí*!·' fíAfttf!?!>>* <í'b't
v X^sx.^.'·' x\A2 < <xi &* νκΛΛ<ίΛΖΑχ.χ ί:^}κΛΛν·Λ A..ÍA. Wwk <5λΛΐ5.ϊ}λϊ:ΐχ. GVtÁ j i V* 4 V JVixA· v’s' &.VklAsJS. JsJSJ VSx4.
0 <21Ö> 29 <223> Reverz-transzkí iptáz PCR-ben alkalma /.oH, FC117 jelű öisgonuklecHíd
Szabad® bú igénypontok

Claims (11)

  1. Szabad® bú igénypontok
    1, iuummogén készítmény löfólék West Ni te vírus elleni védelmében történő alkalmazásra vagy vakcina lófélék West Hite vírus dlenl védelmében történő alkalmazásra, amely
    5 tartalmaz: agy vagy több rekambbém madárhlmiB vírust, és exptesszálja a vírus ptM, Mi és B, West Nilc fehérjéié amely rekombinmts vírusok egy vagy több prM, M és E fehérjét kódolóegy vagy több pollnukleotldoí tarteímaznak: és gyógyászatilag elfogadható hordozót vagy k.Ólőszeré
  2. 2. Az; I. igénypont szerinti ítomunogéP készítmény vagy vakcina alkalmazásra, amely
    10 a. prM, M és E fehérjék közöl mindhármát enpresszálö rekombinans madárhbnlö vírust tartalmaz,
  3. 3; áz 1. igénypont szerinti imumnogéu készítmény vagy vakcina alkalmazásra, amely a prM-M-E olvasási fázist alkotó polinnkleotidnt tartalmazó rckombiuáns madárhimte vírust tartalmaz.
    15
  4. 4. áz 1-Á igénypontok bármelyike szerinti Immtmogén készítmény vagy vakcina. ab kalmazásra. amelyben a rekomhináns vírus kanáribimiő viros.
  5. 5. Áz 1-3. Igénypontok bármelyike szerbit nnmnnogén készítmény vagy vakcina alkalmazásra, amelyben a rekomhináns vírus szánryashizntó vírus.
    ó. \ ' ,vcoeve' ke - \ ?'' '<sae - ' C' mm ' i\eve'20 kalmazásra, amelyben a. polmokleoiid. szígnálpeptidet Is kódol,
  6. 7. A ő. igénypont szerinti immnnogen készítmény vagy vakcina alkalmazásra, amelyben a szignálpeptid West bitié vírus szignál pepiid.
    S, A ő, Igénypont szerinti: immnnogén készítmény vagy vakcina alkalmazásra, amelybéna szignálpepiid heterolög szignálpeptid.....................................................
    25 9, A 8. igénypont szerinti: immonogén készítmény vagy vakcina alkalmazásra, amelyben a szignálpeptid: komán szöveti, plnzminogén akíiválor szignálpeptidle.
    lő. Az 1-9. igénypontok bármelyike szerinti immtmogén készítmény vakcina alkalmazásra, amely egy másik pofbttkleohdot is tartalmaz, amely egy átesik West Nile vírus törzsből és/vagy egy másik patogén ágensból származó fehérjét, és/vagy tetokint ködök
    30 11, Az 1-lfb igénypontok bármelyike szerinti Immunogén készítmény vagy vakcina alkalmazásra, amely egy másik expressziős vektort ís tartalmaz, amely egy másik West Nile vírus törzsből és/vagy egy: másik patogén ágensből származó lekéri ét, és/vagy eitokiot ködolo mást k po lm akieoridot tortáim az.
  7. 12. Az 1-11. igénypontok bármelyike szerinti hnmunogén készítmény vagy vakcina
    3S alkalmazásra, amely adptvánsí is tartalmaz.
  8. 13. A 12, igénypont szerinti immunogén készítmény vagy vakcina alkalmazásra, amelyben az adjuváns az alábbiak bármelyike; (.1) akritsav vagy metaknlsay polimetjei és mak'msuvanbídnd es .dí-meb\. .urna K pabomrck, mmmmdm.éans .\.'ek\e;vue,k edio s. emnbuo gB kuttunu aummomínxet urtalnuro kvivnos lipidek, <5t etukutd',
    5 1.4, A 13, igénypont szerinti immnnogéat készítmény vagy vakcina alkalmazásra, amelyben az adjnváns karbemer,
    B \ H(. sags I b gungpom -'.-ermu mmenmgen ke\. mm m. xuke'nu .ékeim.*zásra, amelyben a ekekin ló eitokin vagy madár ebokin, lo Λ 15, igen)pom ,<ermn mmmncgen kévémmé \,o> x.Aunu alkthtuusra KI \ ' V l \ ' *'s ' \ ' s V \
    MlP-lu, öM-CSP.
    17. A 15. igénypont szerinti immunogén készítmény vagy vakcina alkalmazásra, amelyben a eitokin. lé GM-GSF,
    18. Az 1-17. igénypontok bármelyike szerinti immunogén készítmény vagy vakcina
  9. 15 , \ e ·> \ft ύ v ' A·. m „s x ' , χ \ \ patogén ágens elleni immunogén-készítmény- vagy vakcina-komponenst is tartalmaz.
  10. 19. A 18. igénypont szerinti immunogén készítmény vagy vakcina alkalmazásra, amelyben az egy másik patogén ágens elleni ímmunogémkésziünény- vagy vakcinakmepmiene a.· anugení nleg>\ed mm in. A tn ah .gmuekent \.<g> kmuunw ágensként tóul·
  11. 20 mázzá,
    20.. A 18. vagy 19. igénypont szerinti immnnogén készítmény vagy vakcina alkalmazásra,. amely lö rínopnenmónfe, ló Wloenzavírus, keleti enkeíaiitísz vírus, nyugati mkelabbsz vírus, venezuelai enkefálitisz vírus, totoní, és ezek keverékei elleni immunogénkészítmény- vagy vakéIna-komponenst tartalmaz.
    2:5 21. A 18. vagy 19. igénypont szerinti immnnogén készítmény vagy vakolna alkalmazásra;, amely Marék-féle betegség vírusa íMDV), Nemeestie betegség vírusa (NDV), Gnrnboto betegség vírusa, Ibríbze bronéhitisz vírus (IBV), fertőző .anémia vírus, fertőző „ ' \ v, \si 'I'V s . 'k v'O' \ , ' ' ' rns, számyaspestis vírus, csirke'hidroperikarditisz vírus, madár reovírusok, Ambezíe/bn co/í,
    30 á/yvep/esma jgbbrwwg Mzv:yKzsmo s>nAKgeuem?j, DnemryAFyv i?vím?p wámeíub guKmíds, és ezek keverékei elleni immnnogénkészítmény· vagy vakcina-komponenst tartalmaz.
HU0401868A 2001-04-06 2002-04-05 Rekombináns vakcina West Nile vírus ellen HU230122B1 (hu)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR01/04737 2001-04-06
FR0104737A FR2823222B1 (fr) 2001-04-06 2001-04-06 Vaccin contre le virus de la fievre du nil
PCT/FR2002/001200 WO2002081621A2 (fr) 2001-04-06 2002-04-05 Vaccin contre le virus de la fievre du nil

Publications (3)

Publication Number Publication Date
HUP0401868A2 HUP0401868A2 (hu) 2004-12-28
HUP0401868A3 HUP0401868A3 (en) 2011-06-28
HU230122B1 true HU230122B1 (hu) 2015-08-28

Family

ID=8862055

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU0401868A HU230122B1 (hu) 2001-04-06 2002-04-05 Rekombináns vakcina West Nile vírus ellen
HUS1500047C HUS1500047I1 (hu) 2001-04-06 2015-09-18 Rekombináns vakcina West Nile vírus ellen

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HUS1500047C HUS1500047I1 (hu) 2001-04-06 2015-09-18 Rekombináns vakcina West Nile vírus ellen

Country Status (22)

Country Link
EP (2) EP1377660B1 (hu)
JP (1) JP4426761B2 (hu)
AU (1) AU2002307971B2 (hu)
BE (1) BE2016C021I2 (hu)
BR (1) BRPI0208896B1 (hu)
CA (1) CA2448796C (hu)
CY (2) CY1117676T1 (hu)
DK (1) DK1377660T3 (hu)
ES (2) ES2566044T3 (hu)
FR (2) FR2823222B1 (hu)
HK (2) HK1061868A1 (hu)
HU (2) HU230122B1 (hu)
IL (3) IL158204A0 (hu)
LT (1) LTC1377660I2 (hu)
LU (1) LU93048I2 (hu)
MX (1) MXPA03008998A (hu)
NL (1) NL300806I2 (hu)
PL (2) PL207584B1 (hu)
RU (1) RU2283138C2 (hu)
SI (1) SI1377660T1 (hu)
WO (1) WO2002081621A2 (hu)
ZA (1) ZA200307620B (hu)

Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2004521867A (ja) 2000-10-27 2004-07-22 イミュノ−アールエックス， インコーポレイテッド 免疫抑制された患者のためのワクチン免疫療法
MXPA04000680A (es) 2001-07-27 2004-04-05 Wyeth Corp Vacuna para virus west nile.
AU2003296974A1 (en) * 2002-12-13 2004-07-14 Aventis Pasteur, Inc. Production of alvac on avian embryonic stem cells
WO2004112694A2 (en) 2003-05-23 2004-12-29 Chiron Corporation Immunogenic reagents from west nile virus
CA2582534A1 (en) 2004-09-09 2006-03-16 Research Development Foundation Flavivirus variants having phenotypic variation and immunogenic compositions thereof
PT2251034T (pt) 2005-12-02 2018-05-22 Icahn School Med Mount Sinai Vírus da doença de newcastle quiméricos que apresentam proteínas de superfície não nativas e suas utilizações
MX2011002071A (es) 2008-08-29 2011-04-05 Boehringer Ingelheim Vetmed Vacuna para el virus del nilo occidental.
WO2010091262A1 (en) 2009-02-05 2010-08-12 Mount Sinai School Of Medicine Of New York University Chimeric newcastle disease viruses and uses thereof
EP2411049B1 (en) 2009-03-27 2020-01-15 Academia Sinica Methods and compositions for immunization against virus
AU2010248761B2 (en) * 2009-05-15 2016-02-11 Irx Therapeutics, Inc. Vaccine immunotherapy
TWI537385B (zh) 2010-11-04 2016-06-11 中央研究院 產生具簡單醣基化之表面蛋白質之病毒顆粒的方法
RU2506093C1 (ru) * 2012-12-06 2014-02-10 Государственное научное учреждение Якутский научно-исследовательский институт сельского хозяйства Российской академии сельскохозяйственных наук Способ специфической профилактики ринопневмонии, сальмонеллезного аборта и мыта лошадей ассоциированной вакциной в условиях табунного содержания
BR112015021414B1 (pt) 2013-03-14 2020-11-10 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai vírus da doença newcastle e seus usos
WO2015127501A1 (en) 2014-02-27 2015-09-03 Viralytics Limited Combination method for treatment of cancer

Family Cites Families (36)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2909462A (en) 1955-12-08 1959-10-20 Bristol Myers Co Acrylic acid polymer laxative compositions
US5110587A (en) 1981-12-24 1992-05-05 Health Research, Incorporated Immunogenic composition comprising synthetically modified vaccinia virus
US5505941A (en) 1981-12-24 1996-04-09 Health Research, Inc. Recombinant avipox virus and method to induce an immune response
US5174993A (en) 1981-12-24 1992-12-29 Health Research Inc. Recombinant avipox virus and immunological use thereof
US4769330A (en) 1981-12-24 1988-09-06 Health Research, Incorporated Modified vaccinia virus and methods for making and using the same
US5338683A (en) 1981-12-24 1994-08-16 Health Research Incorporated Vaccinia virus containing DNA sequences encoding herpesvirus glycoproteins
US4722848A (en) 1982-12-08 1988-02-02 Health Research, Incorporated Method for immunizing animals with synthetically modified vaccinia virus
US4603112A (en) 1981-12-24 1986-07-29 Health Research, Incorporated Modified vaccinia virus
US4745051A (en) 1983-05-27 1988-05-17 The Texas A&M University System Method for producing a recombinant baculovirus expression vector
EP0173552B1 (en) 1984-08-24 1991-10-09 The Upjohn Company Recombinant dna compounds and the expression of polypeptides such as tpa
US5168062A (en) 1985-01-30 1992-12-01 University Of Iowa Research Foundation Transfer vectors and microorganisms containing human cytomegalovirus immediate-early promoter-regulatory DNA sequence
US4963481A (en) 1985-12-18 1990-10-16 Genetics Institute Inc Promoter system
US4968615A (en) 1985-12-18 1990-11-06 Ciba-Geigy Corporation Deoxyribonucleic acid segment from a virus
GB2197321B (en) 1986-09-12 1990-10-03 Genentech Inc Method and vectors for obtaining continuous production of heterologous protein in a eukaryotic host cell line
DE3743138A1 (de) 1987-12-18 1989-09-14 Mayr Christian Gmbh & Co Kg Schleifringlose, elektromagnetische ueberlastkupplung
MY109299A (en) * 1990-08-15 1996-12-31 Virogenetics Corp Recombinant pox virus encoding flaviviral structural proteins
US5843456A (en) 1991-03-07 1998-12-01 Virogenetics Corporation Alvac poxvirus-rabies compositions and combination compositions and uses
KR100242671B1 (ko) 1991-03-07 2000-03-02 고돈 에릭 유전학적으로 처리한 백신 균주
US5382425A (en) 1992-01-13 1995-01-17 Syntro Corporation Recombinant swinepox virus
FR2702373B1 (fr) 1993-03-08 1996-06-07 Rhone Merieux Emulsions vaccinales fluides eau-dans-l'huile contenant une huile métabolisable.
EP0668355B1 (en) 1993-12-20 1999-04-07 Akzo Nobel N.V. Vaccine for the protection of horses against equine herpesvirus infection
FR2728795B1 (fr) 1994-12-30 1997-03-21 Rhone Merieux Vaccin vivant recombinant aviaire, utilisant comme vecteur un virus herpes aviaire
FR2728794B1 (fr) 1994-12-30 1997-03-21 Rhone Merieux Vaccin recombinant aviaire a base de virus herpes aviaire, notamment contre la maladie de gumboro
EP0826063A1 (en) 1995-04-25 1998-03-04 Vical Incorporated Single-vial formulations of dna/lipid complexes
DE69740033D1 (de) 1996-07-03 2010-12-09 Merial Inc Rekombinanter hunde-adenovirus 2 (cav2), welcher exogene dna enthält
FR2751227B1 (fr) 1996-07-19 1998-11-27 Rhone Merieux Formule de vaccin polynucleotidique contre les pathologies canines, notamment les pathologies respiratoires et digestives
FR2751225B1 (fr) 1996-07-19 1998-11-27 Rhone Merieux Formule de vaccin polynucleotidique aviaire
FR2751226B1 (fr) 1996-07-19 1998-11-27 Rhone Merieux Formule de vaccin polynucleotidique contre les pathologies du cheval
ATE292980T1 (de) 1996-10-11 2005-04-15 Univ California Immunostimulierende oligonucleotidekonjugate
CZ300172B6 (cs) * 1997-02-28 2009-03-04 Acambis Inc. Chimerický živý, infekcní, oslabený virus, lécivopro prevenci nebo lécbu flavivirových infekcí s jeho obsahem a molekula nukleové kyseliny jej kódující
US7227011B2 (en) * 1998-06-04 2007-06-05 United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, Centers For Disease Control And Prevention Nucleic acid vaccines for prevention of flavivirus infection
US6294176B1 (en) 1998-07-10 2001-09-25 Schering-Plough Veterinary Corp. Recombinant raccoonpox virus and uses thereof as a vaccine in mammalian and avian species
US6416763B1 (en) * 1998-08-28 2002-07-09 Hawaii Biotechnology Group, Inc. Recombinant nonstructural protein subunit vaccine against flaviviral infection
US6645740B1 (en) 1999-06-10 2003-11-11 Merial Limited Nucleic acids encodings equine GM-CSF
JP2003502345A (ja) 1999-06-10 2003-01-21 メリアル ペットまたはスポ−ツ用動物のためのｄｎａワクチン
FR2796397B1 (fr) 1999-07-16 2006-09-01 Merial Sas Genes de calicivirus felin et vaccins notamment vaccins recombines

Also Published As

Publication number Publication date
HK1061868A1 (zh) 2004-10-08
BR0208896A (pt) 2004-07-20
IL158204A0 (en) 2004-05-12
EP1377660B1 (fr) 2016-01-13
JP4426761B2 (ja) 2010-03-03
HUS1500047I1 (hu) 2017-03-28
RU2003132455A (ru) 2005-04-27
EP1377660A2 (fr) 2004-01-07
FR2823222A1 (fr) 2002-10-11
FR2823222B1 (fr) 2004-02-06
WO2002081621A3 (fr) 2003-02-20
PL210306B1 (pl) 2011-12-30
HUP0401868A2 (hu) 2004-12-28
PL365210A1 (en) 2004-12-27
ZA200307620B (en) 2005-07-27
ES2566044T3 (es) 2016-04-08
RU2283138C2 (ru) 2006-09-10
CA2448796A1 (en) 2002-10-17
WO2002081621A2 (fr) 2002-10-17
DK1377660T3 (en) 2016-03-29
MXPA03008998A (es) 2004-10-15
IL185263A0 (en) 2008-01-06
NL300806I2 (hu) 2016-06-09
CY2016018I1 (el) 2016-12-14
HUP0401868A3 (en) 2011-06-28
FR16C0014I1 (hu) 2016-05-27
AU2002307971B2 (en) 2008-01-17
EP2979705A1 (fr) 2016-02-03
PL207584B1 (pl) 2011-01-31
ES2767413T3 (es) 2020-06-17
CY1117676T1 (el) 2016-12-14
CA2448796C (en) 2012-11-20
CY2016018I2 (el) 2016-12-14
EP2979705B1 (fr) 2019-10-23
IL158204A (en) 2013-03-24
LU93048I2 (fr) 2016-06-27
LTC1377660I2 (lt) 2017-04-25
JP2004531521A (ja) 2004-10-14
SI1377660T1 (sl) 2016-05-31
BRPI0208896B1 (pt) 2016-06-07
FR16C0014I2 (fr) 2016-09-09
HK1219412A1 (zh) 2017-04-07
BE2016C021I2 (hu) 2021-03-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5215865B2 (ja) ノロウイルス抗原およびサポウイルス抗原
KR100921592B1 (ko) 키메라 플라비바이러스 벡터
Calvo-Pinilla et al. Multiserotype protection elicited by a combinatorial prime-boost vaccination strategy against bluetongue virus
HUT65366A (en) Expression of specific immunogens using viral antigens
US11638750B2 (en) Methods for generating a Zikv immune response utilizing a recombinant modified vaccina Ankara vector encoding the NS1 protein
JP2004089185A (ja) フラビウイルス組換えポックスウイルスワクチン
HU230122B1 (hu) Rekombináns vakcina West Nile vírus ellen
JP2002517200A (ja) フラビウイルス感染の予防のための核酸ワクチン
HU228708B1 (en) Feline calicivirus genes and vaccines, in particular recombined vaccines
US7084256B2 (en) Self antigen vaccines for treating B cell lymphomas and other cancers
KR101245154B1 (ko) 간염 ｃ 바이러스에 대한 백신 조성물
JP2000501930A (ja) 組換体ポックスウイルス―ネコ感染性腹膜炎ウイルス、その組成物およびそれらの製造および使用方法
CN113186171B (zh) 一种黄病毒属病毒的减毒病毒及其用途
JP2005502361A (ja) 感染性ウシウイルス性下痢ウイルスクローン
CN1646157B (zh) 多重性和多价性蛋内dna疫苗
JP4217611B2 (ja) Ｄｎａおよび抗原の併用により作用増強したワクチン製剤
EP2563388A1 (en) Parapoxvirus expressing the vp60 major capsid protein of the rabbit haemorrhagic disease virus
JPH07503843A (ja) マレック病ウイルス組換えポックスウイルスワクチン
Ogrina et al. Bacterial expression systems based on Tymovirus-like particles for the presentation of vaccine antigens
JP2010528603A (ja) ネコ抗原のアライグマポックスウイルス発現遺伝子
CN106337038B (zh) 一种通过转肽酶剪切制备疫苗的方法及其应用
US20210353735A1 (en) Chimeric Flavivirus Lyssavirus Vaccines
TWI354560B (en) Flavivirus ns1 subunit vaccine
JPH07170982A (ja) ワクチンおよびその製造方法
TWI336626B (en) Flavivirus ns1 subunit vaccine

Legal Events

Date Code Title Description
AA1S Information on application for a supplementary protection certificate

Free format text: PRODUCT NAME: WEST NILE RECOMBINANT CANARYPOX VIRUS; REGISTRATION NO/DATE: EU/2/11/129 20110805

Spc suppl protection certif: S1500047

Filing date: 20150918

Expiry date: 20220405

FG4S Grant of supplementary protection certificate

Free format text: PRODUCT NAME: WEST NILE RECOMBINANT CANARYPOX VIRUS (VCP2017 VIENS); REGISTRATION NO/DATE: EU/2/11/129/001-004 20110810

Spc suppl protection certif: S1500047

Filing date: 20150918

Expiry date: 20220405

Extension date: 20260810