MX2015002688A

MX2015002688A - Vacuna indicadora.

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Publication number: MX2015002688A
Application number: MX2015002688A
Authority: MX
Inventors: Smith Hans De; Benjamin Lamp; Hans Tillmann Ruemenapf; Eveline Wentz
Original assignee: Intervet Int Bv
Priority date: 2012-08-29
Filing date: 2013-08-28
Publication date: 2015-05-12
Also published as: ZA201500656B; CN104619720A; BR112015003785A2; US20150290314A1; EP2890707A1; WO2014033149A1; RU2015111179A; NZ631110A; JP2015533478A; AU2013307310A1

Abstract

La presente invención se refiere a virus de la diarrea viral bovina de replicación competente (BVDV), virus de la fiebre porcina clásica (CSFV), virus de la enfermedad incierta ovina (BDV) y pestivirus atípicos que tienen una modificación en un epítope de una proteína viral, a su uso como un medicamento, a su uso como una vacuna, a vacunas que comprenden dicho BVDV de replicación competente, CSFV, pestivirus atípicos o BDV, y a pruebas de diagnóstico para la detección de anticuerpos contra dichos virus y para distinguir animales vacunados de animales infectados en el campo.

Description

VACUNA INDICADORA MEMORIA DESCRIPTIVA La presente invención se refiere a virus de la diarrea viral bovina de replicación competente (BVDV), virus de la fiebre porcina clásica (CSFV), virus de la enfermedad incierta ovina (BDV) y pestivirus atípicos que tienen una modificación en un epítope de una proteína viral, a su uso como un medicamento, a su uso como una vacuna, a vacunas que comprenden dicho BVDV de replicación competente, CSFV, pestivirus atípicos o BDV, y a pruebas de diagnóstico para la detección de anticuerpos contra dichos virus y para distinguir animales vacunados de animales infectados en el campo.

El género Pestivirus es un género dentro de la familia Fiaviviridae que comprende, entre otros, el virus de la diarrea viral bovina (BVDV), el virus de la fiebre porcina clásica (CSFV), el virus de la enfermedad incierta ovina (BDV) y un grupo de virus conocidos como pestivirus atípicos, tales como el virus HoBi y el virus Khon Kaen.

El BVDV, el CSFV, los pestivirus atípicos o el BDV pueden inducir varias enfermedades con pérdidas económicas notables a nivel mundial.

El virus de la diarrea viral bovina (BVDV), un miembro de los pestivirus que es el agente causal de la diarrea viral bovina, causa una enfermedad económicamente importante del ganado vacuno a nivel mundial. Las pérdidas económicas mayores causadas por las infecciones por el BVDV son fertilidad reducida, abortos y la generación de terneras persistentemente infectadas, las cuales pueden desarrollar la "enfermedad de las mucosas" fatal.

El CSFV causa la fiebre porcina clásica, una enfermedad altamente contagiosa y a veces fatal en cerdos que puede causar pérdidas económicas considerables.

La enfermedad incierta (BD) es una enfermedad viral congénita de ovejas y cabras. Los signos clínicos vistos con más frecuencia en ovejas incluyen ovejas estériles, abortos, partos de un feto muerto y el nacimiento de pequeñas ovejas débiles. El CSFV, el BVDV, los pestivirus atípicos y el virus de la enfermedad incierta ovina, están genéticamente y estructuralmente estrechamente relacionados.

Los animales pueden ser protegidos, entre otros, contra el CSFV y BVDV mediante la vacunación: vacunas vivas inactivadas o modificadas convencionales para la protección de cerdos y ganado contra, por ejemplo, la infección por CSFV y el BVDV, se conocen en la téenica y están disponibles comercialmente.

El genoma de los pestivirus consiste de un ARN de cadena sencilla de orientación positiva. El ARN tiene una longitud de por lo menos 12.3 kb, y contiene un gran marco de lectura abierto (ORF), el cual está flanqueado por reglones no traducidas (NTR) en ambos extremos del genoma. El ORF pestlviral es traducido en una poliproteína, la cual es procesada co-traducclón y post-traducción en por lo menos 12 proteínas maduras por proteasas virales y celulares.

La primera proteína del ORF pestlviral es Npro (proteasa N-termlnal). Npro es una autoproteasa no estructural que se separa por sí misma del resto de la poliproteína codificada por el ORF, y crea de esta manera su propio extremo C-terminal y también el extremo N-terminal correcto para la primera proteína estructural en el ORF, la proteína C (de la cápslde).

La proteína C en el ORF va seguida de otras proteínas estructurales: ERNS, El, E2 (en ese orden). En conjunto, la proteína de la cápside (C) y las tres proteínas glucosiladas de la cubierta (ERNS, El, E2) forman el virión pestivlral. Las proteínas estructurales van seguidas de las proteínas no estructurales (p7, NS2-NS3 y NS3, NS4A, NS4B, NS5A y NS5B). La NS3 (serlna proteasa) y la NS5 (actividad de ARN pollmerasa dependiente de ARN) están directamente implicadas en la repllcaclón viral.

Los estudios sobre la replicación de los pestlvlrus han sido facilitados considerablemente por los sistemas de la genética Invertida y el descubrimiento de moléculas de ARN subgenómico de replicación autónoma (replicones) (Behrens et a!, (1998), Mcyers et al, (1996b), Lamp, B. (2011)).

Se Investigaron los requerimientos mínimos para la replicación del CSFV, por ejemplo, creando genomas de CSFV defectuosos que carecen de las secuencias de genes para las proteínas estructurales. Se encontró que los genomas de CSFV defectuosos se replicaban aún y podrían ser empacados en partículas virales cuando eran Introducidos en células SK-6 junto con ARN de A187-CAT auxiliar (Moser etal (1999)).

Un genoma de BVDV autónomo de replicación defectuosa, el cual carece de parte de la secuencia de genes de Npro, así como los genes que codifican para C, Ems, El, E2, p7 y NS2, había sido descrito por Behrens etal (1998).

En la actualidad, diferentes procedimientos para tratar con la infección por pestivirus se aplican en los varios países en donde los pestivirus causan daño económico. El hecho de que estos diferentes procedimientos se usen en paralelo causa sin embargo problemas, como es ilustrado más adelante para el BVDV. El problema es sin embargo un problema universal para todos los pestivirus.

El BVDV y el BDV ocurren en todos los países con unas cuantas excepciones, a nivel mundial, en donde se producen rumiantes.

Los pestivirus circulan también en los animales de vida silvestre, y éstos forman de esta manera un reservorio del cual el virus puede esparcirse en el ganado doméstico.

El desarrollo de pruebas de diagnóstico del BVDV ha hecho posible detectar hatos infectados por el BVDV y hallar y remover los animales persistentemente Infectados.

Este desarrollo, en combinación con severas restricciones de movimiento y medidas sanitarias, les ha permitido a los países escandinavos erradicar prácticamente el BVDV del ganado doméstico. Sin embargo, como una consecuencia, la vacunación ha sido prohibida ahora en estos países.

Una situación un poco comparable ocurrió para el CSFV en Europa: al momento en el que el CSFV fue prácticamente erradicado en los Estados Unidos a través de la vacunación, una política de no vacunación fue introducida desde la década de los ochentas en adelante.

Sin embargo, con mucho, la mayoría de otros países han decidido, debido a la alta densidad del ganado, el comercio intenso y la alta frecuencia del BVDV, para seguir aún el procedimiento de vacunación.

La existencia paralela de estos dos diferentes procedimientos cuando se trata con ia infección por el BVDV o la infección por el CSFV, ha llevado a la siguiente situación opuesta: el ganado vacunado no puede ser fácilmente discriminado del ganado infectado en el campo, debido a que en ambos casos los anticuerpos contra los virus estarán presentes. De esta manera, se desconoce ampliamente si los animales positivos para los anticuerpos del BVDV son positivos para los anticuerpos debido a la infección (en cuyo caso pueden llevar el virus) o la vacunación. Y por esta razón, entre otras, los países escandinavos no permitirán la importación de carne y animales positivos para los anticuerpos del BVDV.

Este problema puede resolverse teóricamente a través del uso de las denominadas vacunas indicadoras. Dichas vacunas carecen de una o más de las proteínas virales inmunógenas, como resultado de lo cual los animales vacunados con la vacuna indicadora no producirán anticuerpos contra todas las proteínas virales inmunógenas. Las diferencias en la gama de anticuerpos entre los animales vacunados e infectados pueden mostrarse en pruebas de diagnóstico diseñadas para este propósito. Dichas pruebas permiten de esta manera la discriminación entre los animales vacunados e infectados.

Este procedimiento ha sido seguido, por ejemplo, por el desarrollo de una vacuna indicadora contra el CSFV. Esta vacuna indicadora es de hecho una vacuna subunitaria basada en la proteína de la cubierta E2 del CSFV. Dichas vacunas subunitarias son seguras y eficaces, pero un inconveniente estriba en el hecho de que pueden ser un poco menos eficaces cuando se comparan con las vacunas de virus enteros inactivados y vacunas vivas modificadas con respecto al inicio de inmunidad.

De esta manera, existe la necesidad de vacunas que tengan un perfil de eficacia mejorado y sean adecuadas como una vacuna indicadora.

Es un objetivo de la presente invención proveer dichas vacunas indicadoras mejoradas.

Se encontró ahora en forma sorprendente que dichas vacunas indicadoras mejoradas pueden obtenerse a través de la modificación de un epítope de un dominio de helicasa de la proteína no estructural NS3.

La proteína no estructural NS3 tiene una doble función: tiene una actividad de serina proteasa y una actividad de ARN helicasa. Se asume que la función primaria de la helicasa de los pestivirus es el desenrollamiento de las cadenas de ARN más y menos del genoma después de la reacción de la polimerasa. Además, existe fuerte evidencia expuesta por Riedel et aL, 2012, de que la helicasa es importante en el ensamble intracelular de las partículas virales infecciosas.

El rol y la función de ambas actividades enzimáticas han sido descritos, entre otros, por Tautz, N. (2000), Ming Xiao (2008), Wei Cheng (2007), Tackett, A. J. (2001), Deregt, D. (2005) y por Jian Xu (1997). La publicación por Jian Xu (1997) muestra explícitamente cómo la región NS3 relacionada y bien conservada, más específicamente la helicasa dentro de la proteína NS3, está entre, por ejemplo, el BVDV y el CSFV.

La helicasa de la proteína NS3 ha sido el principal objetivo para el desarrollo de pruebas de detección de anticuerpos de diagnóstico tales como pruebas de ELISA basadas en anticuerpos monoclonales. La razón de esto es clara: la helicasa de NS3 es 1) muy inmunógena, y 2) está altamente conservada entre los pestivirus: ninguna mutación o prácticamente ninguna mutación se encuentra en la helicasa. Véase, por ejemplo Collet, M. S. (1992) y Bathia, S. (2008). Desde un punto de vista de diagnóstico, esto tiene la ventaja de que: 1) los anticuerpos contra la helicasa de NS3 son fácilmente inducidos en el animal, y 2) debido al alto nivel de conservación de la helicasa, una prueba de detección de anticuerpos contra la helicasa reconocerá, por ejemplo, todas las cepas de BVDV o CSFV.

El Cuadro A da un resumen de las pruebas de diagnóstico disponibles comercialmente que comprenden anticuerpos monoclonales reactivos con la región NS3.

CUADRO A Un mutante de, por ejemplo, el BVDV o el CSFV, que tenga un dominio de helicasa con un epítope modificado, bien podría formar la base de una vacuna indicadora: la administración de dicha vacuna a un animal induciría un panel de anticuerpos que difiere de aquel de un virus de tipo silvestre, y de esta manera la vacunación podría ser discriminada de la infección de tipo silvestre.

Sin embargo, debido a este nivel de conservación muy alto, la helicasa de NS3 sería aproximadamente la región menos preferida del genoma viral para permitir o producir mutaciones por la siguiente razón: la helicasa es una enzima esencial para el virus, es decir, el virus no es capaz de replicarse sin la actividad de helicasa, es decir, no es de replicación competente. La razón del alto nivel de conservación de la helicasa es común a muchas enzimas: la helicasa es altamente dependiente de su estructura primaria, secundaria y terciaria para su acción, y en consecuencia las mutaciones perturbarían la actividad de helicasa, haciendo de esta manera que el virus sea no viable. De esta manera, sería por supuesto la región menos preferida del genoma viral para producir mutaciones.

Se ha encontrado ahora en forma sorprendente que inesperadamente existen ciertas regiones específicas dentro de los dominios de helicasa que permiten mutaciones, mientras que los virus que poseen dichas mutaciones son aún de replicación competente. Además, estas mutaciones podrían producirse en epítopes de dominios de helicasa, de modo que estos epítopes modificados no son más reconocidos por los anticuerpos monoclonales reactivos con la forma de tipo silvestre de estos epítopes.

Dichos virus tienen de esta manera la ventaja de que por una parte son aún capaces de mostrar replicación, y de esta manera son adecuados como una base para vacunas vivas, mientras que por otra parte pueden ser discriminados de todos los demás BVDV, BVD, pestivirus atípicos o CSFV en el sentido de que han perdido, contrario al BVDV de tipo silvestre, BDV, pestivirus atípicos o CSFV, su reactividad con uno o más anticuerpos específicos del BVDV, el BVD, los pestivirus atípicos o el CSFV. Además, no inducen más estos anticuerpos en un animal.

De esta manera, los inventores han encontrado que, contrario a lo que se esperaba, la helicasa de la proteína NS3 del BVDV, el BDV, los pestivirus atípicos o el CSFV comprende epítopes que pueden ser modificados como resultado de lo cual dejan de reaccionar con (o inducen) anticuerpos contra el epítope correspondiente en la proteína NS3 de tipo silvestre, pero no hacen que el virus pierda su competencia de replicación. Esta invención le permite ahora al experto en la téenica generar mutantes del BVDV de replicación competente, el BDV, los pestivirus atípicos o el CSFV que pueden formar la base de una vacuna indicadora.

De esta manera, una primera modalidad de la presente solicitud se refiere a un BVDV de replicación competente, CSFV, pestivirus atípicos o BDV que tienen una modificación en un epítope de una proteína viral como resultado de lo cual el epítope deja de ser reactivo con un anticuerpo monoclonal contra ese epítope en un BVDV de tipo silvestre, CSFV, pestivirus atípicos o BDV, en donde el epítope se localiza es un dominio de helicasa en la proteína no estructural NS3.

Como se define en la presente, un BVDV de replicación competente, CSFV, pestivirus atípicos o BDV, es un virus que puede aún replicarse, es decir, es capaz de producir virus de progenie infecciosa. El virus de progenie infecciosa puede ser virus de progenie infecciosa de replicación competente o virus de progenie infecciosa de replicación defectuosa.

Dichos BVDV de replicación competente, CSFV, pestivirus atípicos o BDV, pueden ser un virus que comprende material genético suficiente para ser capaz de producir virus de progenie infecciosa que se replican además en células recién infectadas (virus de progenie infecciosa de replicación competente).

Puede ser también un virus que carece de información genética al grado de que no es capaz de producir virus de progenie infecciosa que se replica además en células recién infectadas pero es capaz, cuando está presente en una célula complementaria, de producir virus de progenie infecciosa capaces de mostrar infección de un sólo ciclo (virus de progenie infecciosa de replicación defectuosa). Meramente como un ejemplo del último tipo de virus: un genoma de BVDV que carece del gen que codifica para la proteína estructural E2 o Erns, si está presente en una línea de células complementaria que produce la proteína E2 o Ems, puede llevar a la producción de virus de BVD de progenie infecciosa capaces de mostrar infección de un sólo ciclo, es decir: virus de progenie infecciosa de replicación defectuosa.

Se entenderá que la tasa de replicación y la cantidad de virus de progenie pueden ser mayores o menores que las producidas por el virus de tipo silvestre.

Como se define en la presente, se considera que un "epítope que no es más reactivo con un anticuerpo monoclonal reactivo con dichos BVDV, CSFV, pestivirus atípicos o BDV en su forma de tipo silvestre", es un epítope que no es reactivo con dicho anticuerpo monoclonal al nivel de reacción que un epítope de tipo silvestre exhibiría cuando reacciona con dichos anticuerpos monoclonales.

El nivel de reacción entre un epítope y un anticuerpo monoclonal reactivo con ese epítope puede determinarse de acuerdo con métodos conocidos en la téenica. Un método simple para la determinación del nivel de reacción entre el anticuerpo monoclonal y (un epítope del) virus, es la siguiente IPMA estándar: un virus muíante y un virus de tipo silvestre se cultivan en paralelo en células susceptibles, tales como células SK6 o células MDBK. Las células se fijan entonces por 20 minutos a 4°C con paraformaldehído a 4% en PBS y se permeabilizan con Triton-X 100 a 0.5%. Después de este paso, las células se incuban con el anticuerpo monoclonal en cuestión y se diluyen hasta una concentración óptima en PBS con Tween 20 a 0.1%. Una IgG anti-ratón de cabra secundaria conjugada con HRP y solución de substrato de 3-amino-9-etilcarbazol se aplican para la detección de señales.

Un virus que comprenda una modificación en un epítope de un dominio de helicasa de la proteína no estructural NS3 de conformidad con la invención no reaccionará en esta IPMA, es decir: no dará una reacción de tinción. Sin embargo, las células infectadas con el virus de tipo silvestre serán teñidas.

Otro método aún más simple para la determinación del nivel de reacción entre un anticuerpo monoclonal (y un epítope del) virus, es la siguiente ELISA estándar: la NS3 mutante y la NS3 de tipo silvestre (o Incluso fragmentos más cortos de éstas, que comprendan el epítope relevante) se expresan en un sistema de expresión tal como, por ejemplo, un sistema de expresión basado en £ co/i o baculovirus. Las proteínas expresadas son recubiertas en la cavidad de una placa de microtítulo. Después de este paso, las células se incuban con un anticuerpo monoclonal contra el epítope de tipo silvestre, diluido hasta una concentración óptima en PBS con Tween 20 a 0.1%. Una IgG anti-ratón de cabra secundaria conjugada con HRP y solución de substrato de TMB se aplican para la detección de señales.

Una construcción de NS3 que comprenda una modificación en un epítope de un dominio de helicasa de la proteína no estructural NS3 de conformidad con la invención, reaccionará en esta ELISA con el anticuerpo monoclonal a un menor grado que una NS3 de tipo silvestre. Y esto será reflejado por un valor de densidad óptica (DO) menor de la ELISA para la NS3 mutante que para la NS3 de tipo silvestre.

De preferencia, se provee un mutante de conformidad con la invención que tiene un epítope de helicasa modificado que no muestra reacción sustancial entre el anticuerpo monoclonal y el epítope modificado, es decir, la DO de la prueba de ELISA en la cual el mutante se pone a prueba, no excede sustancialmente la DO del nivel de fondo. Sin embargo, puede ser el caso de que exista una reacción débil entre el anticuerpo monoclonal y el epítope modificado en lugar de una reacción de todo o nada.

Un epítope que tenga un nivel de reacción de menos de 80% medido mediante la DO en una prueba de ELISA cuando se compara con el epítope de tipo silvestre, es considerado no más reactivo.

Como se mencionó anteriormente, la proteína NS3 de los pestivirus, y más específicamente la región de helicasa de la proteína NS3, se ha descrito extensivamente en la literatura. Existen tres regiones en la helicasa que comprenden epítopes que son reactivos con el antisuero producido contra el BVDV, el CSFV, los pestivirus atípicos o el BDV.

La posición tentativa del dominio de helicasa depende de hecho del número de aminoácidos que preceden a la región de la helicasa. Puede haber una ligera variación entre los varios miembros del CSFV, el BVDV y el BDV, incluso dentro de un género. Por esa razón, la posición tentativa de los dominios de helicasa 1, 2 y 3 para muchas cepas de CSFV, BVDV y BDV conocidas, se da en el cuadro 1.

La figura 6 provee una alineación de la región de helicasa para estas cepas, permitiendo que el experto en la téenica identifique los dominios de helicasa en otras cepas de CSFV, BVDV y BDV sobre la base del consenso entre la secuencia de helicasa de dichas cepas y la secuencia de helicasa de las cepas como se dan en la figura 6.

Una forma preferida de esta modalidad se refiere a un BVDV de replicación competente, CSFV, pestivirus atípicos o BDV de conformidad con la invención, caracterizada porque el dominio de helicasa se selecciona del grupo que consiste del dominio de helicasa 1, 2 o 3.

La posición de la región de proteasa y los dominios de helicasa de NS3 en los clones de longitud completa para varias cepas de BVDV y CSFV, se da en el cuadro 1 siguiente. La numeración de la poliproteína para los virus dada en el cuadro comienza con "MEL".

CUADRO 1 Posición de la región de proteasa v dominios de helicasa de NS3 en clones de longitud completa para varias cepas del BVDV v el CSFV. La numeración de la poliproteína para los virus dada en el cuadro, comienza con "MEL" Una forma más preferida de la presente invención se refiere a un BVDV de replicación competente, CSFV, pestivirus atípicos o BDV de conformidad con la invención, caracterizada porque el dominio de helicasa es un dominio de helicasa seleccionado del grupo que consiste del CSFV Alfort Tuebingen, localizado entre la posición de aminoácido 1782 y la posición 2272, BVDV-1 CP7, localizado entre la posición de aminoácido 1791 y la posición 2281, BVDV-1 NCP7, localizado entre la posición de aminoácido 1782 y la posición 2272, BVDV-1 NADL, localizado entre la posición de aminoácido 1872 y la posición 2362, BVDV-1 Oregon C24V, localizado entre la posición de aminoácido 1782 y la posición 2272, BVDV-2 890, localizado entre la posición de aminoácido 1856 y la posición 2346 y BDV X818, localizado entre la posición de aminoácido 1779 y la posición 2269.

La sección de ejemplos provee varias mutaciones específicas en estos dominios que dan un virus de replicación competente de conformidad con la invención, y el método para generar dichos virus de replicación competente es generalmente aplicable. De esta manera, el experto en la téenica que desee producir virus de replicación competente adicionales de conformidad con la invención además de los virus descritos en la sección de ejemplos, encontrará una amplia guía para hacerlo de esta manera más adelante.

Básicamente, lo que se necesita es por lo menos un anticuerpo monoclonal reactivo con la región de helicasa de la proteína NS3.

Para obtener anticuerpos monoclonales contra la región de helicasa de la proteína NS3, basta expresar la región de helicasa entera o una parte de dicha región que comprenda uno de los dominios, o una parte de un dominio. La manera más eficiente de obtener anticuerpos monoclonales contra un epítope de la región de helicasa, es usar una de las muchas técnicas disponibles para identificar (un fragmento de ADN que codifica para) un epítope, y expresar sólo este epítope.

En este momento, una enorme variedad de técnicas simples está disponible para identificar fácilmente (un fragmento de ADN que codifica para) un epítope.

Entre los métodos más antiguos están, entre otros, el método descrito por Gcysen et a!. (solicitud de patente WO 84/03564, solicitud de patente WO 86/06487, patente de los Estados Unidos No. 4,833,092, Proc. Nati Acad. Sci. 81: 3998-4002 (1984), J. Imm. Meth. 102, 259-274 (1987), el denominado método PEPSCAN. Este es un método fácil de llevar a cabo, rápido y bien establecido para la detección de epítopes. El método es bien conocido por los expertos en la técnica. Este método (empírico) es especialmente adecuado para la detección de epítopes de células B.

Asimismo, dada la secuencia del gen que codifica para cualquier proteína, algoritmos de cómputo están disponibles para localizar epítopes específicos sobre la base de su acuerdo secuendal y/o estructural con epítopes que son ahora conocidos. La determinación de estas regiones se basa en una combinación de los criterios de hidrofilicidad de acuerdo con Hopp T. P. y Woods, K. R. (1981), y los aspectos de estructura secundarios de acuerdo con Chou y Fasman ((1987) y la patente de los Estados Unidos 4,554,101).

Métodos basados en métodos modernos son descritos, entre otros, por Meyer, B. y Peters, Th. (2002), y por Yingming Zhao y Chalt, B. T. (1994).

Para la expresión de la región de helicasa o una parte de dicha región que comprende uno de los dominios o una parte de un dominio, los sistemas de expresión de células de bacterias, levaduras, hongos, insectos y vertebrados, son sistemas usados con mucha frecuencia. Dichos sistemas son bien conocidos en la téenica y están abundantemente disponibles comercialmente.

Otra guía amplia con respecto a la expresión en procariontes y eucariontes se da, entre otros, en revisiones recientes y libros de texto sobre la expresión, tales como: Trepe, K., Applied Microbiology and Biotechnology, volumen 72, número 2 (2006), 211-222 Production of Recombinant Proteins: Novel Microbial and Eukaryotic Expression Systems, editado por Gellissen, G. Publisher: Wilcy-VCH, ISBN: 3527310363 edición 2005 Expression systems, editado por Michael Dyson e Yves Durocher, Scion Publishing Ltd, ISBN 9781904842439 edición 2007.

Pueden producirse convenientemente anticuerpos contra epítopes como se provee en la sección de ejemplos. Otros anticuerpos contra otros epítopes de la región de helicasa pueden obtenerse expresando simplemente otras partes o partes más grandes de la región de helicasa, y usando éstas para la inducción de anticuerpos.

La producción de anticuerpos monoclonales se ha descrito extensivamente en la técnica. Anticuerpos monoclonales, reactivos con la región de helicasa pueden prepararse inmunizando a ratones endógamos mediante técnicas también conocidas por décadas en la técnica (Kohler y Milstein (1975)).

Métodos para la producción de anticuerpos a gran escala de conformidad con la invención, se conocen también en la técnica. Dichos métodos dependen en ia clonación de fragmentos de) la información genética que codifica para la proteína de conformidad con la invención en un fago filamentoso para la exhibición de fagos. Dichas técnicas se describen, entre otros, en artículos de revisión por Córtese, R. et al. (1994), por Clackson, T. y Wells, J. A. (1994), por Marks, J. D. etal (1992), por Winter, G. et al (1994) y por Little, M. etal (1994). Los fagos se usan posteriormente para seleccionar colecciones de expresión de camélido que expresan anticuerpos de cadena pesada de camélido (véase Muyldermans, S. y Lauwereys, M. (1999) y Ghahroudi, M. A. et al. (1997)). Las células de la colección que expresan los anticuerpos deseados pueden ser replicadas y usadas posteriormente para la expresión de anticuerpos a gran escala.

La producción de anticuerpos monoclonales específicamente reactivos con pestivirus se ha descrito ya dos décadas atrás por Deregt (1990) y por Corapi (1990).

Aún más específicamente, y en relación directa con la proteína NS3, una amplia guía para la producción de anticuerpos monoclonales reactivos con NS3 es dada, entre otros, por Deregt (2005), quien describe el mapeo de dos dominios antigénicos de la proteína NS3. Además, varias pruebas de ELISA disponibles comercialmente y no disponibles comercialmente basadas en anticuerpos reactivos con la proteína NS3, han sido descritas por Bourdeau, F. (2001), Chimenzo Zoth, S. (2006), Kramps, J. A. (1999), Bathia, S. (20008) y por Makoschey, B. (2007).

Por lo tanto, en conclusión, un anticuerpo monoclonal reactivo con un epítope de la región de helicasa de la proteína NS3 basta para seleccionar virus de conformidad con la invención que tienen una modificación en ese epítope de la región de helicasa. La sección de ejemplos provee varios ejemplos de anticuerpos monoclonales adecuados, y la literatura mencionada anteriormente provee una amplia guía para desarrollar otros anticuerpos monoclonales reactivos con la región de helicasa.

La sección de ejemplos provee también ejemplos de virus que tienen una modificación en un dominio de la región de helicasa de conformidad con la invención. Los ejemplos describen también métodos generales para obtener dichos virus. Por lo tanto, la sección de ejemplos le provee una amplia guía al experto en la téenica que desee obtener otros virus de conformidad con la invención, en lugar de usar los virus descritos en la sección de ejemplos.

La producción/selección de BVDV de replicación competente, CSFV, pestivirus atípicos o BDV que tienen una modificación en un epítope de un dominio de helicasa de la proteína no estructural NS3, de modo que dicho epítope es no más reactivo con un anticuerpo monoclonal reactivo con dicha proteína no estructural NS3 del BVDV, el CSFV, los pestivirus atípicos o el BDV en su forma de tipo silvestre, es meramente un asunto de producir clones de longitud completa infecciosos que tengan una modificación en la región de helicasa de la proteína NS3. La construcción de clones de longitud completa infecciosos fue descrita ya hace dos décadas.

Copias de ADN infeccioso de longitud completa han sido descritas, entre otros, para el BVDV (Meyers etal, J. (1996)b) y para el CSFV (Meyers et al. (1996)a, Moormann et a! (1996), Riedel, C. et al, PLoS Pathog. 2012; 8(3): el002598. doi: 10.1371/journal.ppat.l002598. Epub Marzo 22 de 2012).

Su disponibilidad les permite a los científicos llevar a cabo ingeniería genética inversa para desarrollar cepas atenuadas de BVDV o CSFV.

Si se desea, el experto en la técnica podría elegir incluso evitar un paso de mutagénesis dirigida a sitio cuando se hace una modificación en un epítope de un dominio de helicasa de la proteína no estructural NS3. En ese caso, un fragmento de ADN que comprende ya una modificación en un epítope de un dominio de helicasa de la proteína no estructural NS3 puede ser sintetizado simplemente por el experimentador, o puede obtenerse comercialmente. Puede intercambiarse entonces con la región del ADN de tipo silvestre que codifica para ese epítope de helicasa en un clon de ADNc de longitud completa inmediatamente usando tecnología básica de ADN recombinante.

El clon infeccioso de longitud completa, una vez obtenido, puede ser transfectado en una célula de mamífero, y el cultivo de células puede verificarse posteriormente para la presencia o ausencia de virus de progenie.

Los clones de longitud completa que tengan una modificación letal en la región de helicasa de la proteína NS3 no satisfarán el requerimiento de replicación competente, y en consecuencia no darán virus de progenie, de modo que este paso hacia el BVDV de replicación competente, el CSFV, los pestivirus atípicos o el BDV de conformidad con la invención, es autoselectivo.

El siguiente paso, la prueba de la reactividad de un virus que tiene una modificación en un epítope de la región de helicasa de la proteína NS3 con un anticuerpo monoclonal reactivo con el epítope de tipo silvestre, es también una prueba simple y directa. El BVDV de replicación competente, el CSFV, los pestivirus atípicos o el BDV obtenidos de conformidad con el primer paso pueden ponerse a prueba, por ejemplo, en una IPMA clásica como se describió anteriormente (véase anteriormente).

Otra forma preferida de esta modalidad de la presente invención se refiere a un BVDV de replicación competente, CSFV, pestivirus atípicos o BDV de conformidad con la invención, en donde dicho epítope es no más reactivo con un anticuerpo monoclonal seleccionado del grupo que consiste de los siguientes anticuerpos monoclonales: mAb BVD/C16-INT, mAb 8.12.7aNS3h, Code4 y mAb 14E7aNS3h, GL3h6 como es depositado con la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM), Institut Pasteur, 25 Rué du Docteur Roux, F-757242 París Cedex 15, bajo los siguientes números de depósito: BVD/C16-INT, fase-2, 09-07-2012; además referido brevemente como BVD/C16-INT (CNCM 1-4658), mAb 8.12.7aNS3h, Code4 (CNCM 1-4668) y mAb 14E7aNS3h, GL3h6 (CNCM 1-4667).

El mAb 8.12.7aNS3h, Code4 (CNCM 1-4668) fue provisto para Intervet International B. V. por la Cornell Universlty ("CORNELL"), como es representada por el Cornell Center for Technology Enterprise and Commercialization C'CCTEC"), con oficinas en 395 Pine Tree Road, Suite 310, Ithaca, NY 14850. Intervet International B.V. obtenido el derecho para depositar este mAb a través de una licencia de acuerdo con la Cornell University.

Otra forma preferida de esta modalidad se refiere al BVDV de replicación competente, el CSFV, los pestivirus atípicos o el BDV de conformidad con la invención, en donde la modificación se localiza en la región que abarca el aminoácido 193 al aminoácido 683 en la NS de longitud completa; la NS3 comienza con la secuencia de aminoácidos conservada "GPAVCKK".

Una forma más preferida de esta modalidad se refiere al BVDV de replicación competente, el CSFV, los pestivirus atípicos o el BDV de conformidad con la invención, en donde dicha modificación se localiza en la secuencia de aminoácidos 2262IQLAYNSHENQIPVLLPKIKNGEVTDSYENYTYLNARKLGEDVPVYVYATEGEDLAVDLLGMDW2325, que abarca la región del aminoácido 2262 a 2325 en la cepa 890 del BVDV-2, o la secuencia de aminoácidos comparable 2188IQLAYNSYETQVPVLFPKIRNGEVTDTYDNYTFLNARKLGDDVPPYVYATEDEDLAVELLGLDW2251, que abarca la región del aminoácido 2188 a 2251 en la cepa p447 del CSFV.

Esta región se une al anticuerpo monodonal BVD/C16-INT. El anticuerpo monoclonal BVD/C16-INT se une a la región de helicasa de la proteína NS3 de todos los aislados del CSFV, BVDV y BDV. La unión requiere la presencia de varios dominios de la helicasa.

El anticuerpo monoclonal es reactivo en sistemas de ELISA establecidos tales como la ELISA directa y la ELISA de bloqueo. El anticuerpo monoclonal es reactivo con la proteína NS3 de longitud completa y un dominio de helicasa de NS3 cuando es expresado en un sistema de expresión eucariótico. El anticuerpo monoclonal no es reactivo en Western blots.

Meramente como un ejemplo, el reemplazo de la secuencia de aminoácidos anterior con la secuencia modificada IQLAYNSLETPVPVAFPKVKNGEVTDAHETYELMTCRKLEKDPPIYLYATEEED, provee un virus de replicación competente que sin embargo no es más reconocido por el anticuerpo monoclonal BVD/C16-INT. Dicho virus satisface los requerimientos de un BVDV de replicación competente, CSFV, pestivirus atípicos o BDV de conformidad con la invención, y es de esta manera adecuado como un virus para una vacuna indicadora.

Otra forma más preferida de esta modalidad se refiere al BVDV de replicación competente, el CSFV, los pestivirus atípicos o el BDV de conformidad con la invención, en donde dicha modificación se localiza en la secuencia de aminoácidos GQKHPIEEFIAPEVMKGEDLGSEYLDIAGLKIPVEEMKN, que abarca la región del aminoácido 1950 a 1988 en p447 del CSFV o la región comparable en el BVDV.

Esta región se une al anticuerpo monoclonal mAb 8.12.7aNS3h, Code4, que se une a la región de helicasa de la proteína NS3 de todos los aislados del CSFV, BVDV y BDV. El anticuerpo monoclonal es reactivo en sistemas de ELISA establecidos tales como la ELISA directa y la ELISA de bloqueo. El mAb 8.12.7aNS3h, Code4 es reactivo con la proteína NS3 de longitud completa y un dominio de helicasa de NS3. Además, es reactivo con estas regiones sin tener en cuenta si es expresado en un sistema de expresión procariótico o eucariótico. El anticuerpo monoclonal es también reactivo en Western blots.

De nuevo, meramente como un ejemplo, el reemplazo de la secuencia de aminoácidos GQKHPIEEFIAPEVMKGEDLGSEYLD IAGLKIPVE1984 por GQKFTIEEWVPEVMKGEDLADDYIEIAGLKVPKK, provee un virus de replicación competente que sin embargo es no más reconocido por el anticuerpo monoclonal mAb 8.12.7aNS3h, Code4 (se encontraron mutaciones compensatorias en Q2108L y Y2492H).

Una mutación de la región MKGE por MKLE por otra parte es letal, es decir, no se obtiene virus de progenie replicante.

De nuevo otra forma más preferida de esta modalidad se refiere al BVDV de replicación competente, el CSFV, los pestivirus atípicos o el BDV de conformidad con la invención, en donde dicha modificación se localiza en la secuencia de aminoácidos 2174LLISEDLPAAVKNIMA2189 (BVDV-1 CP7), 2239LLISEDLPAAVKNIMA2254 (BVDV-2 890) o ziesLLISEELPMAVKNIMAziso (CSFV Alfort Tuebingen/p447).

Esta región se une al anticuerpo monoclonal mAb 14E7aHNS3h, GL3h6, que se une a la región de helicasa de la proteína NS3 de todos los aislados del BVDV, CSFV y BDV. El anticuerpo monoclonal es reactivo en sistemas de ELISA establecidos tales como la ELISA directa y la ELISA de bloqueo. El anticuerpo monoclonal es reactivo con la proteína NS3 de longitud completa y un dominio de helicasa de NS3, e incluso con sólo el dominio 3 de helicasa. Además, es reactivo con estas regiones sin tener en cuenta si son expresadas en un sistema de expresión procariótico o eucariótico. El anticuerpo monoclonal es también reactivo en Western blots.

De nuevo, meramente como un ejemplo, el reemplazo de la secuencia de aminoácidos LLISEDLPAAVKNIMA por LLISRDLPWTKNIMA provee un virus de replicación competente que sin embargo es no más reconocido por el anticuerpo monoclonal mAb 14E7aHNS3h, GL3h6.

Como se mencionó anteriormente, el virus de conformidad con la invención debe ser de replicación competente, puesto que de otra manera no puede ser producido y por lo tanto no se usará prácticamente, por ejemplo, en una vacuna o para propósitos de diagnóstico.

Sin embargo, esto no necesariamente significa que la vacuna debe replicarse en el animal objetivo para actuar como una vacuna. Un virus de conformidad con la presente invención posee inherentemente sus características indicadoras (por ejemplo, un epítope en la helicasa es no más reactivo con un anticuerpo reactivo con ese epítope en un virus de tipo silvestre). Por lo tanto, el virus funciona como una vacuna indicadora en el animal objetivo, sin tener en cuenta si se replica o no en el animal objetivo.

De esta manera, otra forma de la presente modalidad se refiere al BVDV de replicación competente, el CSFV, los pestivirus atípicos o el BDV de conformidad con la invención, en donde dichos BVDV, CSFV, pestivirus atípicos o BDV, son inactivados.

Otra modalidad de la presente invención pretende proveer vacunas indicadoras que comprendan un BVDV, BDV, pestivirus atípicos o CSFV de conformidad con la invención.

Las vacunas indicadoras pueden basarse en un virus entero de conformidad con la invención, el cual ha sido inactivado (vacunas inactivadas). Dichas vacunas tienen la ventaja de que, debido a su carácter inactivado, son seguras. Además, tienen la ventaja sobre las vacunas indicadoras basadas en subunidades mencionadas anteriormente que, puesto que comprenden el virus entero, desencadenan una mejor respuesta inmune. El BVDV, el CSFV, los pestivirus atípicos y el BDV pueden ser inactivados de muchas maneras conocidas en la téenica para la inactivación del BVDV, el CSFV, los pestivirus atípicos o el BDV. Ejemplos de inactivación física son la radiación UV, la radiación de rayos X, la radiación gamma y el calentamiento. Ejemplos de agentes químicos para la inactivación tales como la b-propiolactona, el glutaraldehído, la etilenimina binaria, el formaldehído y similares son bien conocidos en la técnica y son igualmente aplicables. Es claro que otras formas de inactivación del virus, se describen también en la presente invención.

En forma alternativa, las vacunas indicadoras de conformidad con la invención pueden ser vacunas vivas atenuadas, que comprenden un virus atenuado vivo de conformidad con ia invención el cual induce una respuesta inmune protectora en el animal hospedero, pero no invoca la enfermedad viral debido a una mutación en su genoma. Las vacunas atenuadas vivas tienen la ventaja sobre las vacunas inactivadas, de que imitan más estrechamente la infección natural. Como consecuencia, proveen en general un mayor nivel de protección que sus contrapartes inactivadas.

Los virus atenuados vivos existentes (no indicadores) pueden formar el material de partida para obtener una vacuna indicadora de conformidad con la invención. Dichos virus atenuados vivos se han descrito extensivamente en la técnica (véase anteriormente).

Virus atenuados vivos para el BVD y el CSF se conocen en la técnica, y vacunas de virus atenuados vivos para el BVD y el CSF están disponibles comercialmente.

De esta manera, otra modalidad de la presente invención se refiere a vacunas que comprenden un BVDV de replicación competente, CSFV, pestivirus atípicos o BDV de conformidad con la invención, o un BVDV de replicación competente inactivado, CSFV, pestivirus atípicos o BDV de conformidad con la invención, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Algunas de las vacunas prometedoras comprenden una deleción en el gen Npr0 y/o en el gen Ems, y son de preferencia de un biotipo citopático. Vacunas de pestivirus sobre la base de dichas deleciones han sido descritas, entre otros, en la solicitud de patente del PCT WO 99/64604, la solicitud de patente de los Estados Unidos US 2004/0146854, la solicitud de patente europea EP 1104676, La solicitud de patente europea 1013757, La solicitud de patente europea 1440149, la patente europea EP 1751276, y por Mayer, D., etal. (2004).

Por ejemplo, en el documento EP1161537, se han descrito mutantes del CSFV de los cuales el gen que codifica para la proteína Ems ha sido deletado (y complementado en trans).

Risatti et al. (2007), describen mutantes del CSFV con sustituciones en la región E2 que muestran un fenotipo atenuado. Maurer et al. (2005) describen también mutantes de E2 del CSFV que carecen de la totalidad o parte del gen E2 que mostró protección parcial contra el desafío letal con un CSFV altamente virulento. Mcyers et a!. (1999) describen mutantes del CSFV con mutaciones en el gen que codifica para la proteína Ems que llevan a mutaciones. Mutantes por deleción de Erns complementados en trans del CSFV fueron descritos por Widjojoatmodjo et al (2000).

Se ha sugerido también usar mutantes por deleción de Npro del CSFV y el BVDV como candidatos de vacuna. Un mutante de Npr0 del CSFV fue descrito ya en Tratschin, J. et a i Reemplazaron el gen Npro por secuencias de ubiquitina de murino (el mutante fue denominado vA187-Ubi), y concluyeron que la actividad proteolítica de Npro (generación del extremo N-terminal correcto de la proteína C) es esencial para la replicación viral, pero que esta actividad puede ser reemplazada por la actividad proteolítica de la ubiquitina. Se encontró que el mutante era completamente avirulento en cerdos.

Tratschin et al encontraron que ningún virus viable se obtenía cuando el gen Npro era deletado y no reemplazado con otra proteasa.

Mutantes, en donde Npr0 fue reemplazado por ubiquitina de murino, fueron puestos a prueba también para su uso como una vacuna atenuada viva (véase Mayer et al, 2004).

En otros proyectos de investigación, la secuencia codificante completa de Npro del BVDV fue deletada, y el mutante resultante se propuso como un candidato de vacuna. En el documento EP1013757 se describe un mutante por deleción de Npro del BVDV, basado en la cepa citopática NADL, que carece de la secuencia de Npro completa. Se estableció que el mutante resultante es mucho menos infeccioso en cultivo de células, y que se replicó lentamente en comparación con su contraparte de tipo silvestre. Se sugirió que su tasa de crecimiento lenta confiere un fenotipo atenuado.

Asimismo, Lai etal (2000) describieron un mutante nulo de Npr0 del BVDV basado en la cepa NADL. Era altamente defectuoso en replicación, y logró un nivel de producción de por lo menos 10 veces menor que el virus de tipo silvestre. Este mutante, debido a su capacidad de replicación restringida, puede usarse también como un candidato de vacuna. En el documento W02005111201 se describen mutantes del BVDV, en los cuales se hicieron deleciones en el gen Npr0 y el gen Erns. Se concluyó que sólo una mutación de Npr0 o una mutación de Ems, no era suficiente para prevenir la infección del feto en vaquillas preñadas. Sólo en mutantes dobles, basados en una cepa NY93 tipo 2 del BVDV, la infección del feto en las vaquillas preñadas pudo prevenirse (el mutante doble sin embargo fue sólo puesto a prueba contra un desafío de tipo 2, sea con otra cepa tipo 2, y no contra un desafío tipo 1 del BVDV).

Los mutantes puestos a prueba carecían de casi los 4 aminoácidos N-terminales de la secuencia de Npr0.

Se observó que los mutantes desarrollados eran considerablemente menores que para el virus de tipo silvestre. Para obtener un mejor crecimiento, se construyeron virus mutantes en donde un fragmento del gen de ubiquitina de bovino o un fragmento de la secuencia codificante de LC3 de bovino reemplazó a la parte principal del gen Npro.

Como sigue de lo anterior, virus atenuados vivos (no indicadores) de, por ejemplo, el CSFV y el BVDV, se han descrito extensivamente en la téenica, y para el BVDV y el CSFV están Incluso disponibles comercialmente. Y de esta manera, como se mencionó anteriormente, dichos virus constituyen un material de partida muy adecuado para la construcción de virus de conformidad con la invención, es decir, BVDV de replicación competente, CSFV, pestivirus atípicos o BDV que tienen una modificación en un epítope de un dominio de helicasa de la proteína no estructural NS3, en donde dicho epítope es no más reactivo con un anticuerpo monoclonal reactivo con dicho BVDV, CSFV, pestivirus atípicos o BDV en su forma de tipo silvestre.

Dichos virus se comportan inherentemente atenuados en comparación con sus contrapartes de tipo silvestre, y pueden usarse de esta manera como base para virus indicadores en una vacuna indicadora.

Por lo tanto, una forma preferida de esta modalidad se refiere a vacunas que comprenden un BVDV de replicación competente, CSFV, pestivirus atípicos o BDV de conformidad con la invención, en donde dichos BVDV de replicación competente, CSFV, pestivirus atípicos o BDV poseen una mutación atenuante en el gen Ems o el gen Npro.

Huelga decir que dichos virus se darían en las cantidades y a través de las vías de vacunación indicadas por el fabricante, o como se indica en la literatura.

El BVDV, el CSFV, los pestivirus atípicos y el BDV son sólo unos cuantos ejemplos de los muchos agentes que causan enfermedad en rumiantes, cerdos y ovejas/cabras, respectivamente. En la práctica, los rumiantes, cerdos y ovejas/cabras son vacunados contra muchos virus o microorganismos patógenos.

Por lo tanto, es altamente atractivo, por razones prácticas y económicas, combinar una vacuna de conformidad con la invención para una especie animal específica con un inmunógeno adicional de un virus o microorganismo patógeno para esa especie animal, o información genética que codifica para un inmunógeno de dicho virus o microorganismo.

De esta manera, una forma preferida de esta modalidad se refiere a una vacuna de conformidad con la invención, en donde esa vacuna comprende un inmunógeno adicional de un virus o microorganismo patógeno para el animal que va a ser vacunado, un anticuerpo contra dicho inmunógeno, o información genética que codifica para un inmunógeno de dicho virus o microorganismo. Un inmunógeno es un compuesto que induce una respuesta inmune en un animal. Puede ser, por ejemplo, un virus entero o bacteria, o una proteína o una porción de azúcar de ese virus o bacteria.

Los virus y microorganismos más comunes que son patógenos para rumiantes son el rotavirus bovino, el virus de la enfermedad hemorrágica epizoótica, el virus de la fiebre del valle del Rift, el virus de la fiebre efímera bovina, el virus del herpes bovino, el virus tipo 3 de la parainfluenza, el paramlxovirus bovino, el virus de la pelagra, el virus Orthobunya, el virus de la glosopeda, Mannheimia haemolytica, Pasteurel/a muitocida el virus sincicial respiratorio bovino.

Por lo tanto, una forma más preferida de la invención se refiere a una vacuna de conformidad con la invención, en donde el virus o microorganismo patógeno para los rumiantes se selecciona del grupo de rotavirus bovino, virus de la enfermedad hemorrágica epizoótica, virus de la fiebre del valle del Rift, virus de la fiebre efímera bovina, virus del herpes bovino, virus tipo 3 de la parainfluenza, paramixovirus bovino, virus de la pelagra, virus Orthobunya, virus de la glosopeda, Mannheimia haemolytica, Pasteureiia muitocida y virus sincicial respiratorio bovino.

Los virus y microorganismos patógenos más comunes que son patógenos para los cerdos son Brachyspira hyodysenteriae, el virus de la fiebre porcina africana, el virus Nipah, el circovirus porcino, el virus Torque Teño porcino, el virus de la pseudorrabia, el virus de la Influenza porcina, el parvovirus porcino, el virus del síndrome respiratorio y reproductivo porcino (PRRS), el virus de la diarrea epidémica porcina (PEDV), el virus de la glosopeda, el virus de la gastroenteritis transmisible, rotavirus, Escherichia coii, Erysipeia rhusiopathiae, Bordeteiia bronchiseptica, Saimoneiia cho/erasuis, Haemophiius parasuis, Pasteureiia muitocida, Streptococcus suis, Mycopiasma hyopneumoniae y Actinobaci/ius p/europneumoniae.

Por lo tanto, una forma igualmente más preferida de la invención se refiere a una vacuna de conformidad con la invención, en donde el virus o microorganismo patógeno para cerdos se selecciona del grupo de Brachyspira hyodysenteriae, el virus de la fiebre porcina africana, el virus Nipah, el circovirus porcino, el virus Torque Teño porcino, el virus de la pseudo-rabia, el virus de la influenza porcina, el parvovirus porcino, el virus del síndrome respiratorio y reproductivo porcino (PRRS), el virus de la diarrea epidémica porcina (PEDV), el virus de la glosopeda, el virus de la gastroenteritis transmisible, rotavirus, Escherichia coii, Erysipeia rhusiopathiae, Bordeteiia bronchiseptica, Saimoneiia cho/erasuis, Haemophiius parasuis, Pasteureiia muitocida, Streptococcus suis, Mycopiasma hyopneumoniae Actinobadiius p/europneumoniae.

Los virus y microorganismos patógenos más comunes que son patógenos para ovejas/cabras, son el virus de la glosopeda, el virus de la peste de pequeños rumiantes, el virus de la fiebre del valle del Rift, el virus Orthobunya, Louping III, el virus de la enfermedad de las ovejas de Nairobi, el virus de la pelagra, el virus de la encefalitis artrítica caprina (CAEV), el virus del herpes ovino, E coii, Chiamydia psittaci, Ciostridium perfringens, Ciostridium septicum, C/ostridium titani, Ciostridium novyi, Ciostridium chauvoei, Toxopiasma gondii, Pasteureiia haemolytica y Pasteureiia treha/osi.

Por lo tanto, de nuevo una forma igualmente más preferida de la invención se refiere a una vacuna de conformidad con la invención, en donde el virus o microorganismo patógeno para ovejas/cabras se selecciona del grupo del virus de la glosopeda, el virus de la peste de pequeños rumiantes, el virus de la fiebre del valle del Rift, el virus Orthobunya, Louping III, el virus de la enfermedad de las ovejas de Nairobi, el virus de la pelagra, el virus de la encefalitis artrítica caprina (CAEV), el virus del herpes ovino, E coii, Chlamydia psittaci, C/ostr/dfum perfríngens, Clostrídium septicum, Clostrídium titán i, Clostrídium novyi, Clostrídium chauvoei, Toxopiasma gondii, Pasteureiia haemoiytica y Pasteureiia treha/osi.

Las vacunas en general, pero especialmente las vacunas que comprenden virus atenuados vivos deben ser almacenadas a baja temperatura, o tienen que estar en una forma llofilizada. Las vacunas llofillzadas pueden mantenerse bajo condiciones de enfriamiento moderado o incluso a temperatura ambiente. Con frecuencia, la vacuna se mezcla con estabilizadores, por ejemplo, para proteger a las proteínas propensas a la degradación de que sean degradadas, para mejorar la vida útil en depósito de la vacuna, o para mejorar la eficiencia de la llofilizaclón. Estabilizadores útiles son, entre otros, SPGA, carbohidratos por ejemplo, sorbltol, manitol, trehalosa, almidón, sacarosa, dextrán o glucosa, proteínas tales como albúmina o caseína o los productos de degradación de las mismas, y reguladores de pH tales como fosfato de metal alcalino.

Por lo tanto, de preferencia, una vacuna de conformidad con la Invención está en una forma liofillzada.

Además, la vacuna puede ser suspendida en un dlluyente fisiológicamente aceptable. Dichos reguladores de pH pueden ser, por ejemplo, agua estéril, un regulador de pH, y similares.

Huelga decir, que diluyentes y compuestos para emulsionar o estabilizar virus, se describen también en la presente invención.

Una cantidad adecuada de un virus de conformidad con la invención en una vacuna estaría entre 102 y 108 TCID50, dependiendo del nivel de atenuación del virus usado. La literatura citada anteriormente y el conocimiento en la téenica le darían al experto en la técnica una amplia guía para determinar la cantidad de virus necesaria. En caso de que las cepas de la vacuna usadas se basen en las cepas existentes del virus que están disponibles comercialmente y que comprenden una deleción atenuante, tal como una deleción en el gen Npro y/o en el gen Ems, las instrucciones del fabricante bastarían para saber qué tanta cantidad de virus debe usarse.

Como un método práctico para, por ejemplo, cepas que poseen una mutación en el gen Npro y/o el gen Erns, una cantidad de 105 TCID50 sería una cantidad muy adecuada de virus.

Las vacunas de conformidad con la invención pueden administrarse por medio de las vías de administración conocidas. Dichas vías comprenden, entre otras, las vías intranasal, Intramuscular, Intravenosa, ¡ntradérmlca, oral y subcutánea.

Otra modalidad de la Invención se refiere a un BVDV de repllcaclón competente, CSFV, pestivirus atípicos o BDV de conformidad con la invención, para su uso como un medicamento.

De nuevo otra modalidad de la invención se refiere a BVDV de replicación competente, CSFV, pestivirus atípicos o BDV de conformidad con la invención, para su uso en una vacuna.

Y de nuevo otra modalidad de la invención se refiere a un BVDV de replicación competente, CSFV, pestivirus atípicos o BDV de conformidad con la invención, para su uso en la profilaxis de infección por pestivirus en un mamífero.

Una vacuna indicadora se usará en principio en combinación con una prueba de diagnóstico. Dicha prueba de diagnóstico normalmente se usará para la prueba de muestras colectadas de animales que contienen anticuerpos (por ejemplo, suero, plasma, saliva). Debe ser capaz de discriminar entre anticuerpos reactivos con virus de tipo silvestre y anticuerpos reactivos con el virus indicador o vacuna indicadora.

Una prueba de diagnóstico puede basarse, por ejemplo, en pruebas de diagnóstico estándar conocidas en la téenica, tales como pruebas de ELISA de bloqueo de fase líquida o pruebas de ELISA en sandwich. Dichas pruebas han sido descritas, entre otros, por Wensvoort G. et a! (1988), por Robiolo B. etal (2010) y por Colijn, E. O. etal (1997).

En una forma básica, dicha prueba de diagnóstico puede comprender la versión de tipo silvestre de un epítope en un dominio de helicasa de la proteína no estructural NS3 que fue modificado en el virus de conformidad con la invención. Dicha prueba podría comprender, por ejemplo, cavidades que son recubiertas con un epítope de un dominio de helicasa de la proteína no estructural NS3. Esto puede lograrse fácilmente expresando dicho epítope de un dominio de helicasa de la proteína no estructural NS3 en un sistema de expresión, seguido del recubrimiento de las cavidades con la proteína obtenida de esta manera (véase anteriormente). Huelga decir que el sistema de expresión usado debe permitir la expresión del epítope en o cerca de su conformación nativa, es decir, de modo que el epítope sea reconocido por los anticuerpos producidos contra el virus de tipo silvestre.

Meramente como un ejemplo de dicha prueba: la prueba puede comprender un epítope que comprende la secuencia LLISEDLPAAVKNIMA (un epítope de tipo silvestre, reconocido por el anticuerpo monoclonal mAb 14E7aHNS3h, GL3h6), mientras que el virus indicador comprende un epítope que comprende la secuencia LUSRDLPWTKNIMA (el epítope modificado, no reconocido por el anticuerpo monoclonal mAb 14E7aHNS3h, GL3h6).

Los animales vacunados con la vacuna de conformidad con la invención no producirán anticuerpos contra el epítope de tipo silvestre que comprende la secuencia LLISEDLPAAVKNIMA usada en la prueba de diagnóstico. Como consecuencia, este epítope de tipo silvestre no será bloqueado. Si, después de un paso de lavado, la cavidad se incuba con el mAb 14E7aHNS3h conjugado con HRPO, GL3h6, este mAb se unirá, lo cual llevará a una reacción de color después de que el substrato, por ejemplo, TMB, se añade.

Un animal infectado con el virus de tipo silvestre habrá producido sin embargo anticuerpos contra el epítope de tipo silvestre, de modo que estos anticuerpos reaccionan con el epítope de tipo silvestre usado en la prueba de diagnóstico. Como consecuencia, este epítope de tipo silvestre será bloqueado. Si, después de un paso de lavado, la cavidad se incuba con el mAb 14E7aHNS3h, GL3h6, este mAb no se unirá, de modo que ninguna o sólo una reacción de color limitada se observa después de que se añade el substrato.

De esta manera, dicha prueba de diagnóstico puede usarse para discriminar entre los animales infectados con un virus de tipo silvestre y los animales que fueron vacunados con un virus de conformidad con la invención. Asimismo, los animales vacunados y posteriormente los animales infectados pueden ser discriminados de los animales meramente infectados. Es claro que aunque el epítope de tipo silvestre como tal puede usarse en una prueba de diagnóstico de conformidad con la invención, puede ser conveniente usar una proteína que comprenda la proteína NS3 completa, en lugar del epítope relativamente corto como tal. Especialmente cuando el epítope se usa, por ejemplo, para el recubrimiento de una cavidad en una prueba de ELISA estándar, puede ser más eficiente usar una proteína más grande que comprenda el epítope, para el paso de recubrimiento.

En otra forma de prueba de diagnóstico, las cavidades pueden ser recubiertas, por ejemplo, con un anticuerpo (monoclonal o policlonal monoespecífico) reactivo con la forma de tipo silvestre de un epítope en un dominio de helicasa de la proteína no estructural NS3 que fue modificada en el virus de conformidad con la invención. De nuevo meramente como un ejemplo: el anticuerpo monoclonal usado para el recubrimiento podría ser, por ejemplo, uno de los anticuerpos monoclonales depositados: mAb 14E7aHNS3h GL3h6 para la NS3 de captura, mientras que para la detección de la proteína NS3 capturada, podría usarse un anticuerpo policlonal monoespecífico de NS3 de suero de conejo.

Una prueba de diagnóstico basada en este principio podría comprender, por ejemplo, una cavidad recubierta con ese anticuerpo monoclonal. Como un primer paso de esa prueba, los anticuerpos obtenidos de un animal que se va a poner a prueba pueden ser preincubados en un tubo con la proteína NS3 de tipo silvestre solubilizada, y puede dejarse que se unan a los epítopes del dominio de helicasa, en el paso de preincubación. Si el animal que se va a poner a prueba ha sido infectado con un virus de tipo silvestre, los anticuerpos producidos en el animal se unirán a la proteína NS3 en el tubo que comprenda todos los epítopes de tipo silvestre. Como resultado de esto, dicho epítope será bloqueado en el procedimiento de preincubación.

Si, por otra parte, el animal que se va a poner a prueba ha sido vacunado con un virus de conformidad con la invención, ningún anticuerpo se unirá al epítope de NS3 que fue modificado en el virus de la vacuna. Como resultado de esto, dicho epítope no será bloqueado, y de esta manera continuará estando disponible para la unión a los anticuerpos monoclonales recubiertos reactivos con dicho epítope específico.

Si la mezcla de reacción de la cavidad de preincubación se añade posteriormente a las cavidades de la prueba, el epítope se unirá a los mAb's recubiertos para las cavidades si no es bloqueado por los anticuerpos del animal que se va a poner a prueba (es decir: el animal es vacunado pero no infectado). La proteína NS3 capturada puede ser detectada entonces en un siguiente paso, por ejemplo, por una IgG anti-bovino conjugada de cabra. El substrato será activado, y puede medirse una señal (color).

Si, sin embargo, todos los epítopes de NS3 fueron bloqueados por los anticuerpos del animal que se va a poner a prueba (es decir: el animal ha sido infectado con el virus de tipo silvestre), el epítope no se unirá a los mAb's recubiertos a las cavidades. Un paso de lavado subsiguiente removerá todas las proteínas NS3, de modo que ninguna señal (color) aparecerá.

Como consecuencia, la unión o la falta de unión de la proteína NS3 preincubada a las cavidades es indicativa de la historia del animal que se va a poner a prueba: vacunado (unión y por lo tanto una reacción de color) o infectado en el campo (ninguna unión y por lo tanto ninguna reacción de color).

Es también posible usar, en pruebas de diagnóstico tales como, por ejemplo, las dos pruebas descritas anteriormente, un epítope de NS3 modificado de conformidad con la invención, en lugar del epítope de tipo silvestre. Los virus de conformidad con la invención que comprenden ese epítope modificado producirán en muchos casos anticuerpos contra ese epítope. De nuevo, meramente como un ejemplo: dicha prueba puede comprender un epítope que comprende la secuencia LLISRDLPWTKNIMA (el epítope modificado, no reconocido por el anticuerpo monoclonal mAb 14E7aHNS3h, GL3h6).

Los animales vacunados con la vacuna de conformidad con la invención producirán anticuerpos contra la secuencia LLISRDLPWTKNIMA (el epítope modificado, no reconocido por el anticuerpo monoclonal mAb 14E7aHNS3h, GL3h6). Como consecuencia, este epítope será bloqueado. Si, después de un paso de lavado, la cavidad se incuba con el mAb 14E7aHNS3h, GL3h6, este mAb no se unirá, lo cual llevará a una falta de reacción de color después de que el substrato se añade.

Un animal infectado con el virus de tipo silvestre no habrá producido sin embargo anticuerpos contra el epítope modificado, de modo que ningún anticuerpo reaccionará con el epítope modificado usado en la prueba de diagnóstico. Como una consecuencia, este epítope de tipo silvestre no será bloqueado. Si, después de un paso de lavado, la cavidad se incuba con el mAb dirigido contra el epítope modificado, este mAb se unirá, de modo que se desarrollará una reacción de color después de que el substrato se añade.

Lo mismo se aplica m.m. para la segunda prueba descrita anteriormente: en ese caso, el paso de preincubación se hace con una proteína NS3 con un epítope modificado en lugar del epítope de tipo silvestre.

De esta manera, dichas pruebas de diagnóstico pueden usarse igualmente para discriminar entre animales infectados con un virus de tipo silvestre y animales que fueron vacunados con un virus de conformidad con la invención.

De esta manera, de nuevo otra modalidad de la presente invención se refiere a una prueba de diagnóstico para distinguir mamíferos vacunados con una vacuna de conformidad con la invención, de mamíferos que han sido infectados con un BVDV de tipo silvestre, CSFV, pestivirus atípicos o BDV, caracterizada porque dicha prueba de diagnóstico comprende un epítope de NS3 de un BVDV de tipo silvestre, CSFV, pestivirus atípicos o BDV.

Otra forma de esta modalidad se refiere a una prueba de diagnóstico para distinguir mamíferos vacunados con una vacuna de conformidad con la invención, de mamíferos que han sido infectados con un BVDV de tipo silvestre, CSFV, pestivirus atípicos o BDV, caracterizada porque dicha prueba de diagnóstico comprende un anticuerpo contra un epítope de NS3 de un BVDV de tipo silvestre, CSFV, pestivirus atípicos o BDV.

De nuevo otra forma de esta modalidad se refiere a una prueba de diagnóstico para distinguir mamíferos vacunados con una vacuna de conformidad con la invención, de mamíferos que han sido infectados con un BVDV de tipo silvestre, CSFV, pestivirus atípicos o BDV, caracterizada porque dicha prueba de diagnóstico comprende un epítope de NS3 modificado como se describe en la invención.

Otra forma de esta modalidad se refiere a una prueba de diagnóstico para distinguir mamíferos vacunados con una vacuna de conformidad con la invención, de mamíferos que han sido infectados con un BVDV de tipo silvestre, CSFV, pestivirus atípicos o BDV, caracterizada porque dicha prueba de diagnóstico comprende un anticuerpo contra un epítope de NS3 modificado como se describe en la invención.

Otra modalidad de la presente invención se refiere al uso de una prueba de diagnóstico de conformidad con la invención para distinguir mamíferos vacunados con una vacuna de conformidad con la invención, de mamíferos que han sido infectados con un BVDV de tipo silvestre, CSFV, pestivirus atípicos o BDV.

Lcyendas de las figuras Figura 1: Code4, diluido 1:5, muestra unión distinta al dominio 2 de helicasa de NS3 así como a la helicasa de NS3. Cada campo comprende 50 ng de proteína purificada. Campo 1: pL200 (helicasa de NS3); campo 2: pW3 NS3h-Dl), campo 3: pW5(NS3h-D2), campo 4: pWl (NS3h-D3).

Figura 2: Los MAbs Code4 y 49DE reaccionan en la prueba de inmunoperoxidasa indirecta. El signo "+" positivo, significa que el antígeno pudo ser detectado por el anticuerpo correspondiente; negativo, significa que el antígeno no pudo ser detectado por el anticuerpo correspondiente. Para Vpl756, ninguna unión de Code4 y DE49 pudo ser detectada, mientras que p447 (control positivo) efectuó la unión con ambos anticuerpos monoclonales. Un anticuerpo monoclonal anti-E2 usado como control negativo pudo unirse a Vpl756, mostrando que Vpl756 está replicándose en forma comparable al control Vp447.

Figura 3A: Vista esquemática de construcciones quiméricas del pestivirus CSFV/Non-BVDV/CSFV/BDV en D3 de NS3 para expresión transitoria. Las secuencias del pestivirus Non-BVDV/CSFV/BDV se dan en negro; la secuencia del CSFV en gris; se indican los aminoácidos que terminan la secuencia del pestivirus Non-BVDV/CSFV/BDV. La unión de BVDV/C16-INT se detectó para pWlll exclusivamente, mientras que el mAb WB103 reaccionó también con pW109. Figura 3B: Alineación de la secuencia de la cepa Alfort del CSFV y Ncp7 del BVDV o el pestivirus Non-BVDV/CSFV/BDV, respectivamente (Strider 1.4f6); secuencia consenso abajo; asterisco: el aminoácido está conservado; barra: el aminoácido no está conservado. La secuencia de ácido nucleico completa del pestivirus non-BVDV/CSFV/BDV de NS3 se muestra en SEQ ID No.: 1, la secuencia de aminoácidos se da en SEQ ID No.: 2.

Figuras 4A y 4B: Alineación de la secuencia putativa del epítope 14E7 (Figura 4A), y secuencia mutada insertada en pW95 (Figura 4B); los aminoácidos sustituidos están subrayados.

Figura 5: Western blot del lisado de células infectado por VpW95. 14E7 detecta a NS3 a 125 kDa en p447 CSFV Alfort, pero no en el mutante VpW95. Campo 1: VpW95, Campo 2: Vp447, Campo 3: Células pseudoinfectadas.

Figura 6: Alineación de la helicasa de la región de NS3 de 6 pestivirus (favor de anotar: non-B = pestivirus non-BVDV/CSFV/BDV).

EJEMPLOS EJEMPLO 1 Anticuerpos monodonales Se produjo el MAb Code4 (mAb 8.12.7aNS3h, Code4; Corapi et al, 1988) contra el BVDV 1 "Singer". Este anticuerpo monoclonal muestra una amplia reactividad con los pestlvirus, y reconoce un epítope dentro de la proteína no estructural 3 (NS3). La proteína NS3 del pestlvirus Non-BVDV/CSFV/BDV no es reconocida por el mAb Code4. Se cultivaron células de hibridoma en medio ISF libre de suero (Seromed). El sobrenadante se cosechó y se depuró mediante centrifugación. El hibridoma se obtuvo de E. J. Dubovi, Cornell University, Ithaca, NY).

Se produjo el MAb 49DE usando el BVDV 1 "NADL". Este anticuerpo monoclonal muestra una amplia reactividad con los pestlvirus, y reconoce un epítope dentro de NS3 (Moenning et al, 1987; Beaudeau et al, 2000). La proteína NS3 del pestlvirus Non-BVDV/CSFV/BDV no es reconocida por el mAb 49DE. Una ELISA de diagnóstico del BVD/BD que contiene a 49DE está disponible comerclalmente a través del Laboratoire Service International, 69380 Lissieu, Francia. El sobrenadante de 49DE del hibridoma fue provisto amablemente por Ernst Peterhans, Institute of Vlrology, University of Bern, Suiza.

Se produjo el MAb C16 (mAb BVD/C16-INT; Peters et al, 1986) contra el BVDV 1, "NADL". Este anticuerpo monoclonal muestra una amplia reactividad con los pestivirus, y reconoce un epítope dentro de NS3 (Edwards et al, 1991). La proteína NS3 del pestivirus Non-BVDV/CSFV/BDV no es reconocida por el mAb C16. MAb C16 se obtuvo a través de MSD animal health.

Se produjo el MAb WB103 contra el BVDV 1 "Oregon C24V" (Edwards et al, 1988; Patón et al, 1991). Este anticuerpo monoclonal muestra una amplia reactividad con los pestlvirus, y reconoce un epítope dentro de NS3. La proteína NS3 del pestlvirus Non-BVDV/CSFV/BDV no es reconocida por el mAb WB103. El mAb WB103 forma parte de una prueba de ELISA de diagnóstico (PrioCHECK, Prlonlcs AG), y se adquirió de VLA Wcybrldge, Reino Unido.

Se produjo el mAb WB112 contra el BVDV 1 "Oregon C24V" (Edwards et al, 1988; Patón et al, 1991). Este anticuerpo monoclonal muestra una amplia reactividad con pestivirus que incluyen al pestivirus Non-BVDV/CSFV/BDV, y reconoce un epítope dentro de NS3. El mAb WB112 forma parte de una prueba de ELISA de diagnóstico (PrioCHECK, Prionics AG), y se adquirió de VLA Weybridge, Reino Unido.

Se produjo el MAb 14E7 (mAb 14E7aNS3h, GL3h6) contra un subdominio 3 de helicasa de NS3 expresado por bacterias del BVDV 1 "NCP7" en el Institute of Virology, Justus-Liebig University, Giessen, Alemania. Este anticuerpo monoclonal muestra una amplia reactividad con los pestivirus, y reconoce un epítope en la parte C-terminal de NS3. La proteína NS3 del pestivirus Non-BVDV/CSFV/BDV no es reconocida por el mAb 17E7. Se cultivaron células de hibridoma en medio ISF libre de suero (Seromed).

Células Se cultivaron células BHK 21 y SK-6 (Kaszas, 1972) en medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) complementado con suero de ternera fetal (FCS) a 10% inactlvado con calor. Las células se mantuvieran a 37°C y CO2 a 5%.

Generación de la helicasa de NS3 truncada expresada por bacterias Se generaron truncamientos de la helicasa de NS3 del BVDV introduciendo deleciones en el plásmido pL200 que codifica para el dominio de helicasa de NS3 de NCP7 del BVDV con un marcador de polihistidina C-terminal. La helicasa se dividió en tres dominios de acuerdo con el modelo de NS3 de la molécula de NS3 relacionada del virus de la hepatitis C (HCV). Se construyó una serie de plásmidos en la cual sólo un dominio individual de NS3 marcado con polihistidina fue expresado (Dl-his de NS3, D2-his de NS3, D3-his de NS3). Se llevó a cabo mutagénesis mediante PCR usando los iniciadores enlistados en el cuadro 1, como es recomendado por el proveedor (Pfu, ADN polimerasa, Promega). Todas las construcciones se confirmaron mediante secuenciación de nucleótidos (SeqLab).

CUADRO 1 Iniciadores v plásmidos usados para la generación de plásmidos de expresión bacteriana Para la construcción de pW5 (que codifica para NS3 Dl+D2-his), se diseñó el plásmido intermedio pW3.

En forma alternativa, se insertaron sustituciones del pestivirus Non-BVDV/CSFV/BDV para intercambios de aminoácidos y secuencias del CSFV Alfort, en el plásmido pl039 (Lamp, 2010). El plásmido pL282 que contiene el dominio de helicasa de NS3 del pestivirus Non-BVDV/CSFV/BDV y el marcador de hepta-His N-term¡nal, se usó como donador para las secuencias del pestivirus Non-BVDV/CSFV/BDV. Muchos plásmidos se usaron como plásmidos intermedios para la clonación (pl708, pl717a, pl720, pl716, pl727a, pl722, pl729 y pl372). Para incrementar la estabilidad, se construyeron dos plásmidos denominados pl710 y pl711 en la estructura de base del vector pMT/BiP (Invitrogen). P1710 contiene la NS3 completa del CSFV Alfort en una estructura de base del vector pMT/BiP, mientras que pl711 contiene la helicasa de NS3 completa del pestivirus Non-BVDV/CSFV/BDV en la misma estructura de base de pMT. Se usaron P1710 y pl711 como moldes en la PCR. Las Inserciones resultantes fueron ligadas en un vector de expresión bacteriano petlla (Clontech). Con base en estos plásmidos, se generaron muchas construcciones con sustituciones de pestivirus Non-BVDV/CSFV/BDV en el tramo N-terminal del subdominio 2 de helicasa de NS3. Se generó P1763 insertando mutaciones de punto MK1987LE en posición para el plásmido pl039 con iniciadores. Las secuencias codificantes de NS3 mutagenizadas fueron clonadas en un vector pl039 por medio de los sitios de restricción Xhol y BglII. Los plásmidos resultantes (pl723, pl734, pl742) se usaron para la expresión en bacterias, de una NS3 quimérica recién generada en células Rosetta pLys.

CUADRO 2 Sustituciones del pestivirus Non-BVDV/CSFV/BDV en la secuencia del CSFV al nivel de aminoácidos: los números se refieren al oenoma del CSFV Alfort (Gen Bank: U90951.1) CUADRO 3 Iniciadores y plásmidos usados para la generación de piásmidos precursores v olásmidos de expresión bacteriana (favor de anotar; non-B = pestivirus non-BVDV/CSFV/BDVl CUADRO 4 Estrategias de donación para plásmidos de expresión bacteriana (favor de anotar: non-B = pestivirus rton-BVDV/CSFV/BDVl Preparación de proteínas recombinantes Proteínas recombinantes marcadas con histidina fueron expresadas en células Rosetta 2 de £ cotí (Novagen). La expresión se llevó a cabo a 30°C por 2 horas después de la adición de isopropil- -D-tiogalactopiranósido (IPTG, AppliChem) l mM a una densidad óptica de 0.8. Para la cosecha, las células se centrifugaron y se resuspendieron en regulador de pH de lisis A (Na2P04 50 mM, NaCI 300 mM, pH 7.0 a 8.0), y se sometieron a tres ciclos de congelación y descongelación. La ultracentrifugación a 105 x g por 1 hora, llevó a la separación en una fracción soluble y una fracción insoluble. Pudo detectarse la helicasa de NS3 de longitud completa (pL200) en la fracción soluble. En contraste, los dominios de NS3 individualmente expresados requirieron solubilización usando urea 8 M. Las proteínas se purificaron usando cromatografía de afinidad por iones de metal (IMAC) con columnas de N¡2+ sepharose (HisTrap; GE Healthcare). La pureza y el rendimiento de la proteína se determinaron en electroforesis en gel de dodecil sulfato de sodio y poliacrilamida (SDS-PAGE), y se confirmó en el análisis immunoblot con un anticuerpo monoclonal anti - His como control. Las proteínas purificadas sirvieron como antígenos de prueba en el análisis Western blot y en la ELISA.

SDS-PAGE e Immunoblottína La separación de las proteínas o los Usados de células ocurrió respectivamente en un sistema de gel de pollacrilamida-trlcina (Schágger, 1987). Después, las proteínas se transfirieron sobre una membrana de nltrocelulosa (Pall Corporation). La membrana fue bloqueada en solución de leche descremada en polvo a 4% en PBS con Tween 20 a 0.1%. Se usó reactivo de qulmlolumlnlscencia (Western Lightnlng Plus ECL; Perkin-Elmer) para la detección de señales.

Generación de clones quiméricos de longitud completa Los plásmldos de expresión bacteriana pl719, pl723, pl734 o pl742, respectivamente, fueron digeridos con las endonucleasas de restricción Salí y EcoRI, y las inserciones que codifican para NS3 fueron ligadas por medio de pl372 (replicón del CSFV) en p447 (clon de longitud completa del CSFV) (véase el cuadro 6). Los plásmidos fueron linealizados usando Smal y transcritos usando ARN polimerasa de SP6. 2 mg de los transcritos de ARN fueron electroporados en 5x 106 células SK6 como se describió previamente (Riedel, 2010). Las células electroporadas se sembraron en placas de 96 cavidades y se incubaron por 2 a 3 días. La replicación del virus se evaluó mediante la prueba indirecta de monocapa de peroxidasa (IPMA) usando un anticuerpo monoclonal específico de E2 (A18). Los sobrenadantes de células positivas para el CSFV se usaron para la infección de nuevas células SK-6 para propagar adicionalmente el virus para permitir la prueba de la reactividad con los mAbs Code4 y 49DE. Para la construcción de pW95, en un primer paso, se introdujeron mutaciones en p989 (nucleótidos 4440 a 8340 insertados en un vector pET-lla), dando como resultado pW94. En un segundo paso, la inserción que codifica para NS3 fue clonada por medio de EcoRI y NgoMIV en el clon de longitud completa p447, dando lugar al clon de longitud completa pW95.

CUADRO 5 Resumen de las secuencias de aminoácidos del pestivirus Non-BVDV/CSFV/BDV sustituidas en el clon P447 de longitud completa del CSFV CUADRO 6 Estrategias de donación para plásmidos de expresión bacteriana CUADRO 7 Iniciadores v plásmidos usados para la generación de clones de longitud completa Aislamiento de ARN Para evaluar las reversiones potenciales de las mutaciones introducidas en el CSFV viable después de la transfección, se preparó ARN del virus de células infectadas usando kits RNeasy (Qiagen). El ARN purificado fue transcrito en forma inversa usando la transcriptasa inversa 2 Superscript (Invitrogen), y los iniciadores específicos del CSFV llevaron a tres fragmentos de ADNc que abarcan a NS3. Posteriormente, los fragmentos fueron clonados en plásmidos y secuenciados. Si podía encontrarse una mutación en el fragmento, las mutaciones correspondientes eran insertadas en el clon original de longitud completa, y el virus era verificado para crecimiento en cultivo de células y en la IPMA según se describió.

Prueba de inmunoperoxidasa indirecta Células SK6 y BHK fueron fijadas por 20 minutos a 4°C con paraformaldehído a 4% en PBS, y permeabilizadas con Triton-X 100 a 0.5%. Después de la fijación, las células se incubaron con el anticuerpo monoclonal en cuestión, y se diluyeron hasta una concentración óptima en PBS con Tween 20 a 0.1%. Una IgG anti-ratón secundaria de cabra conjugada con HRP y solución de substrato de 3-amino-9-etilcarbazol (AEC, Sigma Aldrich) se aplicaron para la detección de señales.

Generación de plásmidos pCite de oestivirus CSFV/Non-BVDV/CSFV/BDV Los epítopes para los mAbs WB103, WB112 y C16 fueron difíciles de mapear, debido a que estos anticuerpos ni eran reactivos en el análisis Western blot ni en la ELISA usando proteínas expresadas por bacterias. Por lo tanto, se usó la expresión eucariótica transitoria de derivados de NS3. Para este propósito, los genes de helicasa de NS3 en pestivirus CSFV/Non-BVDV/CSFV/BDV quiméricos fueron clonados en el vector pCite 2a(+). Este vector contiene un promotor de T7 y un sitio de entrada interno del ribosoma (IRES) que permite la expresión eficiente de las proteínas citoplásmicas en conjunto con el virus de la vaccinia recombinante MVA T7 que expresa la ARN polimerasa de T7. Con base en la helicasa de NS3 del CSFV que contiene el plásmido pCite pL270, cada subdominio de helicasa de NS3 (DI, D2, D3) fue reemplazado por el dominio análogo de la NS3 del virus Bugowannah. Como se describió anteriormente, pL282 sirvió como donador para las secuencias de helicasa de NS3 del pestivirus Non-BVDV/CSFV/BDV. pW91 (que contiene la NS3 con el dominio D3 del pestivirus Non-BVDV/CSFV/BDV) y pW92 (que contiene la NS3 con el dominio DI del pestivirus Non-BVDV/CSFV/BDV) fueron construidos mediante clonación basada en la PCR. En el caso de pW93, se amplificó a NS3 a partir de un plásmido ya existente (pl708) que codifica para una NS3, mientras que DI y D3 se originan del CSFV, y el dominio D2 se origina del pestivirus Non-BVDV/CSFV/BDV.

Además, se diseñaron plásmidos que contienen la helicasa de NS3 con un D3 quimérico (pW109, pWllO y pWlll) con base en pL270 y pW91. En el caso de pW119, la mitad N-terminal de D3 fue reemplazada por el pestivirus Non-BVDV/CSFV/BDV (83 aa). En pWllO, los 82 aminoácidos restantes en el extremo C-terminal de SD3 de NS3h fueron reemplazados por la secuencia del pestivirus Non-BVDV/CSFV/BDV. pWlll es un plásmido en donde sólo los últimos 38 aminoácidos de D3 fueron sustituidos.

CUADRO 8 Iniciadores v plásmidos usados para la construcción de clones pCite quiméricos; los sitios de escisión insertados están subrayados (favor de anotar: non-B = oestivirus non- BVDV/CSFV/BDV1 Generación de plásmidos pCite deletados y truncados Los plásmidos en los cuales los dominios individuales fueron deletados, se prepararon con base en pL270, y dieron como resultado pW106 (NS3AD1), pW107 (NS3AD3) y pW108 (NS3AD2). Una colección de plásmidos (pWlOO, pWlOl, pW102, pW103 y pW104) representa genes de NS3 con truncamientos C-terminales de D3. PL105 es un plásmido basado en pCite en el cual sólo D3 es expresado.

CUADRO 9 Iniciadores v plásmidos usados para la construcción de clones pCite truncados Expresión transitoria de plásmidos pCite Una monocapa confluente de células BHK fue infectada con el virus de la vaccinia MVA 77 a una multiplicidad de infección de 100 por dos horas, para permitir la producción de la ARN polimerasa de 77. Entonces, las células fueron transfectadas con los plásmidos quiméricos basados en pCite con subdominio deletado y truncados descritos usando Superfect (Qiageñ), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Todos se usaron previamente en la prueba de transfección de la vaccinia. Los plásmidos pL270 (helicasa de NS3), pL95 (NS3 de longitud completa) y pL261 (proteasa de NS3) sirvieron como controles. Se llevó a cabo la prueba de inmunoperoxidasa como se describió anteriormente.

Mapeo de epítopes para los mAbs Code4/49DE Propiedades de unión a las proteínas expresadas por bacterias Code4 y 49DE funcionan bien en el Western blot, y fueron puestos a prueba con subdominios individuales de helicasa de NS3 expresados por bacterias y con la helicasa de NS3 de longitud completa como control. Ambos anticuerpos monoclonales mostraron unión distinta al subdominio 2 de la helicasa de NS3 (Code4 mostrado en la figura 1). La unión de Code4 y 4DE contra el D2 de la helicasa de NS3 se confirmó mediante ELISA.

En el Western blot con la helicasa de NS3 del pestivirus CSFV/Non-BVDV/CSFV/BDV quimérico expresado por bacterias, 49DE y Code4 mostraron patrones de unión similares. Como era de esperarse, ninguna unión pudo detectarse cuando el D2 de NS3 fue reemplazado por la secuencia del pestivirus Non-BVDV/CSFV/BDV. La sustitución del tercer extremo N-terminal de D2 de NS3 (pl719; aal950-2003) no inhibió la unión de ambos anticuerpos monoclonales. En otros experimentos, el cuerpo principal del epítope pudo ser estrechado hasta una región que abarca entre los aminoácidos 1950 a 1975 de NS3 del CSFV. El mAb 49DE no mostró reactividad con una NS3 que poseía los aminoácidos 1950 a 1975 del pestivirus Non-BVDV/CSFV/BDV. Existe evidencia de que el epítope de Code4 (y 49DE) contiene probablemente los aminoácidos 1987 y 1988, puesto que la mutación MK^LE en pl763 llevó a una reducción notable en la unión.

CUADRO 10 Resumen de resultados del immunoblottina con el antíaeno quimérico de helicasa de NS3: ninguna unión se ha detectado; se ha detectado la unión del anticuerpo monoclonal: "+/-": reducción de señal considerable Reconocimiento de epftopes mutados en virus recombinantes Debido a que el propósito principal de ese estudio fue generar un virus viable que inhibe la unión de anticuerpos monoclonales seleccionados, secuencias quiméricas que evitan la unión de Code4 con el antígeno expresado por bacterias fueron clonadas en el clon p447 del CSFV de longitud completa. La mayoría de los virus quiméricos con secuencias insertadas del pestivirus Non-BVDV/CSFV/BDV, no fueron viables. Un clon (pl725) requirió 2 a 3 días después de la electroporación para producir la progenie del virus. La secuenciación del virus rescatado Vpl725 reveló que las posiciones Q2108L y Y2492H fueron cambiadas. La importancia funcional de estas mutaciones de rescate se mostró con la construcción de pl756. El cuadro 11 da un resumen de los clones de longitud completa construidos y sus características en cultivo de células.

CUADRO 11 Resumen de los clones de longitud completa construidos para el mapeo de epítooes de Code4 v 49DE; propiedades características en cultivo de células Sólo los clones de longitud completa que se replicaron en cultivo de células pudieron ser puestos a prueba para la unión de los mAbs Code4 y 49DE. Esto incluye a pl744 y el revertiente pl756. El clon de longitud completa pl756 no es reconocido por el mAb Code4 ni el mAb 49DE en la IPMA y el Western blot, llevando a la conclusión de que los epítopes de estos anticuerpos monoclonales son idénticos o se localizan alrededor de la misma área de la molécula de NS3. La reactividad de los mAbs Code4 y 49DE se resume en la figura 2 y en el cuadro 12.

CUADRO 12 Reactividad de los mAbs Code4 v 49PE en la prueba de inmunoperoxidasa indirecta: ninguna unión se ha detectado: se ha detectado la unión del anticuerpo monodonal: reducción de señal considerable Se construyeron Vpl751 y Vpl752 para confirmar las mutaciones compensatorias en pl756. Cada clon de longitud completa conserva la secuencia de Vpl725 más una mutación compensatoria de Vpl756 (Q2IOSL en Vpl751 y Y2492H en Vpl752). Ambos virus crecen bien en cultivo de células después de 2 a 3 días, y habían establecido la mutación compensatoria faltante idéntica a la presente en pl756.

Mapeo de epítopes para los mAbs C16/WB103 Los MAbs C16 y WB103 no mostraron reactividad alguna en el Western blot o en la ELISA con los antígenos expresados por bacterias. Además, ninguna unión al lisado de células infectadas por el CSFV o el BVDV pudo detectarse en el análisis Western blot, Indicando que C16 y WB103 reconocen epítopes discontinuos, posiblemente con modificación post-traducción. En consecuencia, una expresión eucariótica transitoria basada en el virus de la vaccinia MVA T7 se estableció como sistema indicador.

Propiedades de unión de los mAbs a las proteínas expresadas transitorias de MVA T7 Se llevó a cabo prueba de inmunoperoxidasa indirecta en una monocapa de células BHK transitorias de T7 de la vaccinia transfectadas con varios plásmidos derivados de pCite para mapear los mAbs C16 y WB103. Ambos mAbs, C16 y WB103, se unieron claramente al dominio de helicasa de NS3, mientras que no pudo detectarse unión alguna con el dominio de proteasa. Las sustituciones de las secuencias del CSFV por el pestivirus Non-BVDV/CSFV/BDV revelaron que los mAbs C16 y WB112 se unen al dominio 3 de NS3. Cuando D3 fue truncado C-terminalmente, la unión de ambos mAbs fue abortada cuando los aminoácidos 2235 a 2272 o un tramo más largo de aminoácidos fue removido (aa2272 representa el extremo C-terminal de D3 de NS3). Por lo tanto, D3 fue dividido en dos partes, mientras que el extremo N-terminal (pW109, aa2108-2207) o el extremo C-termlnal (pWllO, aa2208-2272) representaron secuencias del pestivirus Non- BVDV/CSFV/BDV. Además, se preparó un plásmido con un segmento más pequeño del pestivirus Non-BVDV/CSFV/BDV (pWlll, aa2235-aa2272) (figuras 3A y 3B). Las diferencias en la afinidad de unión de los mAbs C16 y WB103 pudo observarse con pW109. El mAb C16 falló, mientras que el mAb WB103 reconoció claramente células transfectadas con pW109. Por lo tanto, el cuerpo principal del epítope de WB103 se localiza entre el aa 2207 y el aa 2265. El epítope del mAb C16 probablemente incluye los aminoácidos N-terminales del aa 2207.

El mAb C16, así como el mAb WB103, no se unieron al D3 de NS3 expresado individualmente ni a construcciones en donde D3 fue expresado en contexto con DI o D2. Sin embargo, los experimentos con la helicasa de NS3 quimérica indican claramente la unión con D3 de NS3. Por lo tanto, se supone que C16 y WB103 se unen a epítopes estructurales sensibles que son incapaces de plegarse correctamente, salvo en una helicasa de NS3 de longitud completa que consiste de los tres subdominios.

CUADRO 13 Unión de C16 v WB103, respectivamente, a las variantes de NS3 expresadas transitoriamente. señal positiva, se detecté la unión del mAb: señal negativa. ninguna unión se detectó Mapeo de epítopes para el mAb WB112 Como para los mAbs C16 y WB103, el mAb WB112 no reaccionó con proteínas expresadas por bacterias en el Western blot o en ELISA. Por lo tanto, se usó un sistema de expresión eucariótlco transitorio.

Propiedades de unión a la helicasa de NS3 del pestivirus CSFV/Non-BVDV/CSFV/BDV quimerico expresado transitoriamente Se puso a prueba el mAb WB112 en un sistema de expresión eucariótico usando células BHK infectadas por el virus de la vacdnia transfectadas con la construcción de plásmido enlistada en el cuadro 14. El mAb WB112 reconoce a NS3 dentro del dominio de helicasa, y reacciona en forma cruzada con los dominios intercambiados de NS3 del pestivirus Non-BVDV/CSFV/BDV. Mediante el uso de construcciones de NS3 que carecen de dominios individuales, la unión era suprimida si D2 era deletado. Muy probablemente, el epítope del mAb WB112 se localiza dentro de D2 de NS3.

CUADRO 14 Unión del mAb WB112 a las variantes de NS3 expresadas transitoriamente. señal positiva, se detectó la unión del mAb: señal negativa, ninguna unión se detectó Mapeo de epítopes para el mAb 14E7 Propiedades de la unión a proteínas expresadas por bacterias Se estableció 14E7 inmunizando a ratones con NS3 expresada por bacterias. El mAb 14E7 es reactivo con varios pestivirus en el Western blot, la ELISA y la IPMA, pero no con los pestivirus Non-BVDV/CSFV/BDV.

Mapeo del mAb 14E7 usando el D3 de NS3 truncado Se produjo el mAb 14E7 contra D3 de NS3 que abarca 180 aminoácidos. Para mapear el epítope, un truncamiento C-termlnal consecutivo de aproximadamente 16 codones se llevó a cabo con base en el plásmido pL200. El mAb 14E7 pierde su reactividad con la deleción de los aminoácidos 2185LLISEDLPAAVKNIMA2200, indicando que el epítope lineal se localiza dentro o alrededor de este tramo de aminoácidos. La alineación con otros aislados de pestlvirus indicó cuatro cambios de aminoácido de D3 de NS3 del pestlvirus Non-BVDV/CSFV/BDV dentro de la secuencia de péptidos de otra manera bien conservada (14/16 aa). Mediante el uso de los iniciadores CST482 y CST483, la secuencia correspondiente fue cambiada a "LUSRDLPWTKNIMA" en el clon pW95 de longitud completa (secuencias mutadas subrayadas, véase también las figuras 4A y 4B). El virus (VpW95) rescatado de la transfección de pW95 fue viable y se replicó indistinguiblemente del CSFV de tipo silvestre. La NS3 mutada, presente en células infectadas por VpW95, no fue detectada por el mAb 14E7 (figura 5). Esto se aplicó también a la NS3 expresada por bacterias que posee las mismas mutaciones dentro del epítope del mAb 14E7.

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Claims

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Virus de la diarrea viral bovina de replicación competente (BVDV), virus de la fiebre porcina clásica (CSFV), pestivirus atípico o virus de la enfermedad incierta ovina (BDV) que tienen una modificación en un epítope de una proteína viral como resultado de lo cual el epítope es no más reactivo con un anticuerpo monoclonal contra ese epítope en un BVDV de tipo silvestre, CSFV, pestivirus atípicos o BDV, caracterizado porque el epítope se localiza en el dominio 2 de helicasa en la proteína no estructural NS3.

2.- El BVDV de replicación competente, CSFV, pestivirus atípico o BDV de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque dicho dominio de helicasa es el dominio 2 de helicasa seleccionado del grupo que consiste del CSFV Alfort Tuebingen, localizado entre la posición de aminoácido 1950 y la posición 2107, BVDV-1 CP7, localizado entre la posición de aminoácido 1959 y la posición 2116, BVDV-1 NCP7, localizado entre la posición de aminoácido 1950 y la posición 2107, BVDV-1 NADL, localizado entre la posición de aminoácido 2040 y la posición 2197, BVDV-1 Oregon C24V, localizado entre la posición de aminoácido 1950 y la posición 2107, BVDV-2 890, localizado entre la posición de aminoácido 2024 y la posición 2181 y BDV X818, localizado entre la posición de aminoácido 1947 y la posición 2104.

3.- El BVDV de replicación competente, CSFV, pestivirus atípico o BDV de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizado además porque dicho epítope es no más reactivo con el anticuerpo monoclonal mAb 8.12.7aNS3h.

4.- El BVDV de replicación competente, CSFV, pestivirus atípico o BDV de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado además porque dicho BVDV, CSFV, pestivirus atípico o BDV es inactivado.

5.- Una vacuna que comprende un BVDV de replicación competente, CSFV, pestivirus atípico o BDV de las reivindicaciones 1 a 3, o un BVDV de replicación competente inactivado, CSFV, pestivirus atípico o BDV de la reivindicación 4, y un vehículo farmaceuticamente aceptable.

6.- La vacuna de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada además porque dicho BVDV de replicación competente, CSFV, pestivirus atípicos o BDV posee una mutación atenuante en el gen Erns o el gen Npr0.

7.- La vacuna de conformidad con la reivindicación 5 o 6, caracterizada además porque dicha vacuna comprende un inmunógeno adicional de un virus o microorganismo patógeno para el animal que va a ser vacunado, un anticuerpo contra dicho inmunógeno o información genética que codifica para un inmunógeno de dicho virus o microorganismo.

8.- La vacuna de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada además porque el virus o microorganismo patógeno para el animal que va a ser vacunado se selecciona del grupo de rotavirus bovino, virus de la enfermedad hemorrágica epizoótica, virus de la fiebre del valle del Rift, virus de la fiebre efímera bovina, virus del herpes bovino, virus tipo 3 de la parainfluenza, paramixovirus bovino, virus de la pelagra, virus Orthobunya, virus de la glosopeda, Mannheimia haemolytica, Pasteurella multocida y virus sincicial respiratorio bovino.

9.- La vacuna de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada además porque el virus o microorganismo patógeno para el animal que va a ser vacunado se selecciona del grupo de Brachyspira hyodysenteriae, virus de la fiebre porcina africana, virus Nipah, circovirus porcino, virus Torque Teño porcino, virus de la pseudo-rabia, virus de la influenza porcina, parvovirus porcino, virus del síndrome respiratorio y reproductivo porcino (PRRS), virus de la diarrea epidémica porcina (PEDV), virus de la glosopeda, virus de la gastroenteritis transmisible, rotavirus, Escherich/a coli, Erysipela rhusiopathiae, Bordetella bronchiseptica, Salmonella cholerasuis, HaemophHus parasuis, Pasteurella multocida, Streptococcus suis, Mycoplasma hyopneumoniae y Actinobad/lus pleuropneumonlae.

10.- La vacuna de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada además porque el virus o microorganismo patógeno para el animal que va a ser vacunado se selecciona del grupo de virus de la glosopeda, virus de la peste de pequeños rumiantes, virus de la fiebre del valle del Rift, virus Orthobunya, Louping III, virus de la enfermedad de las ovejas de Nairobi, virus de la pelagra, virus de la encefalitis artrítica caprina (CAEV), virus del herpes ovino, £ coli, Chlamydia psittaci, Ctostridium perfringens, C/ostridium septicum, Clostridium titani, Qostridium novyi, C/ostridium chauvoei, Toxoplasma gondii, Pasteurella haemolytica y Pasteurella treha/osl.

11.- El BVDV de replicación competente, CSFV, pestivirus atípico o BDV de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, para usarse como un medicamento.

12.- El BVDV de replicación competente, CSFV, pestivirus atípico o BDV de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, para usarse en una vacuna.

13.- El BVDV de replicación competente, CSFV, pestivirus atípico o BDV de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, para usarse en la profilaxis de infección por pestivirus en un mamífero.

14.- Una prueba de diagnóstico para distinguir mamíferos vacunados con una vacuna de cualquiera de las reivindicaciones 5 a 10 a partir de mamíferos que han sido infectados con un BVDV de tipo silvestre, CSFV, pestivirus atípico o BDV, caracterizada porque dicha prueba de diagnóstico comprende un epítope de NS3 de un BVDV de tipo silvestre, CSFV, pestivirus atípico o BDV.

15.- Una prueba de diagnóstico para distinguir mamíferos vacunados con una vacuna de cualquiera de las reivindicaciones 5 a 10 a partir de mamíferos que han sido infectados con un BVDV de tipo silvestre, CSFV, pestivirus atípico o BDV, caracterizada porque dicha prueba de diagnóstico comprende un anticuerpo contra un epítope de NS3 de un BVDV de tipo silvestre, CSFV, pestivirus atípico o BDV.

16.- Una prueba de diagnóstico para distinguir mamíferos vacunados con una vacuna de cualquiera de las reivindicaciones 5 a 10 a partir de mamíferos que han sido infectados con un BVDV de tipo silvestre, CSFV, pestivirus atípico o BDV, caracterizada porque dicha prueba de diagnóstico comprende un epítope de un dominio de helicasa en la proteína no estructural NS3, dicho epítope teniendo una modificación como resultado de lo cual el epítope es no más reactivo con un anticuerpo monoclonal contra ese epítope en un BVDV de tipo silvestre, CSFV, pestivirus atípico o BDV.

17.- Una prueba de diagnóstico para distinguir mamíferos vacunados con una vacuna de cualquiera de las reivindicaciones 5 a 10 a partir de mamíferos que han sido infectados con un BVDV de tipo silvestre, CSFV, pestivirus atípico o BDV, caracterizada porque dicha prueba de diagnóstico comprende un anticuerpo contra un epítope de un dominio de helicasa en la proteína no estructural NS3, dicho epítope teniendo una modificación como resultado de lo cual el epítope es no más reactivo con un anticuerpo monoclonal contra ese epítope en un BVDV de tipo silvestre, CSFV, pestivirus atípico o BDV.

18.- El uso de una prueba de diagnóstico de cualquiera de las reivindicaciones 14 a 17 para distinguir mamíferos vacunados con una vacuna de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 5 a 10 a partir de mamíferos que han sido infectados con un BVDV de tipo silvestre, CSFV, pestivirus atípico o BDV.

19.- El uso de un BVDV de replicación competente, CSFV, pestivirus atípico o BDV como se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la elaboración de un medicamento.

20.- El uso de un BVDV de replicación competente, CSFV, pestivirus atípico o BDV como se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la elaboración de una vacuna.

21.- El uso de un BVDV de replicación competente, CSFV, pestivirus atípico o BDV como se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la elaboración de una composición para la profilaxis de infección por pestivirus en un mamífero.