WO2011131208A1 - Vaccin bivalent a usage vétérinaire anti-entérotoxémie - Google Patents

Vaccin bivalent a usage vétérinaire anti-entérotoxémie Download PDF

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WO2011131208A1
WO2011131208A1 PCT/DZ2011/000001 DZ2011000001W WO2011131208A1 WO 2011131208 A1 WO2011131208 A1 WO 2011131208A1 DZ 2011000001 W DZ2011000001 W DZ 2011000001W WO 2011131208 A1 WO2011131208 A1 WO 2011131208A1
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Fatiha Gacem
Mohamed Amine Madadi
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Institut Pasteur D'algerie
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    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/08—Clostridium, e.g. Clostridium tetani
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
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    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55505—Inorganic adjuvants

Definitions

  • Bivalent vaccine for veterinary use anti-Enterotoxemia.
  • the invention relates to a prophylactic vaccine for veterinary use used for the prevention of enterotoxemia in domestic animals
  • the vaccine of choice is the unpurified, highly effective raw product that has existed for many years.
  • the producer In developing a vaccine strategy for the prevention and control of the disease, the producer considers two essential parameters for establishing the formulation of a vaccine: the causative germ and the symptoms of the infectious disease 2 .
  • the latter mainly, are produced by toxins developed during the growth of the bacteria. Indeed, the symptoms of the infection can be reproduced by injecting the sterile filtrates of the incriminated germs.
  • Vaccines by their composition prevent the establishment of the germ and its development, either by stimulating the production of antibodies that prevent adhesion or antibodies to bactericidal or simultaneously, also by neutralizing the symptoms of infection by development antitoxic immunity.
  • Toxoid and anactivo vaccines whole culture can stimulate both types of immunity, but in other cases, often for technical reasons related to production, only one of these approaches is used.
  • Vaccines based on toxin (toxoid).
  • Clostridial infections 3 The most economically important diseases in sheep, cattle and other animals such as pigs are caused by Clostridial infections 3 .
  • Clostridiales 6 The real threat of gas gangrene in the first and second world war has stimulated research on this disease and literature on toxins produced by Clostridium perfringens concurs 4 '' 5.
  • the main toxins responsible for the disease have been identified and the use of tetanus vaccines for prophylaxis and control of the disease is widely practiced Clostridiales 6.
  • Toxoids are normally produced from the crude toxin by treatment with formaldehyde. Such toxoids are normally adsorbed by an adjuvant, usually a mineral salt such as aluminum phosphate and aluminum or potassium sulfate. For cost reasons, it is usually the most used for veterinary vaccines. The most effective adjuvants are by far the mineral oils or their derivatives (Table 1). However, because of their reactivity on tissues they can not be used for human vaccination and, even in veterinary medicine, despite their effectiveness, their use is severely limited due to the loss of nutritional and commercial value of the vaccine. carcass.
  • an adjuvant usually a mineral salt such as aluminum phosphate and aluminum or potassium sulfate.
  • the most effective adjuvants are by far the mineral oils or their derivatives (Table 1).
  • Table 1 because of their reactivity on tissues they can not be used for human vaccination and, even in veterinary medicine, despite their effectiveness, their use is severely limited due to the loss of nutritional and commercial value of the vaccine. carcass.
  • Clostridial Diseases against which vaccination is practiced is shown in Table 2.
  • the available monovalent and combined vaccines are different in composition and formulations according to the manufacturers in each country in responding to the specific needs of their markets.
  • toxin during bacterial growth can be monitored, monitored and controlled by various techniques. These include measurement of enzymatic activity, for example, lecithinase as well as hemolysis or alternatively, in vivo, by observing guinea pigs, mice and rabbits inoculated using death or skin lesions as an indicator.
  • the toxin values are expressed in terms of indicator effects (minimum lethal dose, minimum hemolytic dose or, alternatively, in terms of standard antitoxin unit equivalence).
  • the LF dose of a toxin is the dose of toxin that, when mixed with one unit of antitoxin, flocculates in a minimal time and L + is the smallest dose of toxin that, when mixed with a unit of antitoxin , kills 50% of inoculated mice of a given weight in a specified time.
  • the concentration is used to recover the low antigenic material, this can be dangerous when concentrating all the components since it increases the antigenic competition phenomenon.
  • Clostridial vaccines in order for a vaccine to be released, the manufacturer must demonstrate that after two injections, given according to a recommended and defined immunization protocol, rabbits (laboratory animals) must respond by producing antitoxin minima (Table 3).
  • the purpose of the manufacturer is to provide vaccines protecting both adult and offspring by passive transfer of antibodies.
  • a typical example was lived in Denmark during the vaccination against enteritis of piglet disease caused by type C Clostridium perfringens. This disease is a haemorrhagic and necrotizing enteritis of piglets that for 10 years has gone from small outbreaks to cover large areas of Jutland and Zeeland.
  • composition of this vaccine was a mixture of Type B, C and D toxoids as well as Type B Anaclogen.
  • the use of this vaccine allowed him to determine the thresholds of the titles necessary for the protection of animals. He proved that if a titre of 10UI (international units) of antitoxin could be achieved in colostrum after vaccination of the sow or young sow, the infant piglets are protected against the disease.
  • This vaccine has been used on a large scale successfully to prevent disease in many herds. However, there was still a small number of cases (5-10%) where the vaccine alone did not treat the disease because of the level of antigenic competition, as well as not having used serotherapy by the administration. of high titre antiserum, use supplement to contain the infection.
  • Clostridium perfringens type C vaccine combined with Escherichia coli (Xentocol vaccine, Wellcome) was specifically designed and marketed, this vaccine simultaneously treats Escherichia coli diarrhea and Clostridium perfringens type C enteritis.
  • This type of Clostridium perfringens type C anatoxin fulfilled all the criteria presented by Hogh 12 , and in many breeding the vaccine was successfully used to simultaneously treat Escherichia coli and enteritis. of piglet. However, in a number of breeding cases the vaccine was totally ineffective in the treatment of piglet enteritis.
  • Table 1 Arithmetic mean antibody titres in lambs at the injected doses of 2 x 2 ml of a multivalent Clostridial vaccine precipitated with potash alum and a 1 ml vaccine dose adsorbed by adjuvant freund's.
  • Clostridium botulinum type C and D Botulism 3 British Veterinary Codex Standards: Minimum serum responses in rabbits (IU / ml) after two injections of a multivalent commercial vaccine at the prescribed doses
  • 3- Composition of a vaccine formulation ensuring a complete and effective vaccination coverage by inducing an immune response by the use of a restricted spectrum of antigens in order to avoid the phenomenon of antigenic competition.
  • Vaccine composed of somatic antigens and toxins (anacanth and toxoid).
  • the figure represents the various steps of production of the enterotoxemia vaccine ( Figure N ° 1). (PRESENTATION OF THE GASOLINE (THE SUBSTANCE) OF THE INVENTION
  • the vaccine intended for the prophylaxis of enterotoxemia in sheep, cattle, goats, camels, rabbits and others is a vaccine inactivated by formalin, adjuvanted with aluminum hydroxide and combining the active principles mentioned below.
  • the vaccine is prepared from Francen and foreign field strains selected for their toxigenic powers and their high immunogenic value.
  • the inactivated bacterial bodies have been preserved in the vaccine preparation to provide the most complete immune response possible.
  • the enterotoxemia vaccine is a mixture of:
  • Atatoxins ⁇ , ⁇ and ⁇ of Clostridium perfringens type C and D are particularly useful atatoxins ⁇ , ⁇ and ⁇ of Clostridium perfringens type C and D.
  • Formaldehyde For the development and production of this vaccine for veterinary prophylactic use against enterotoxemia of animals (cattle, sheep, goats, camelins, rabbits ...), a study was carried out, for the use of a spectrum limited valence to ensure optimal and complete vaccination coverage, by comparison of somatic antigens of Clostridium perfringens strains of different origins.
  • the most important parameter that determines the effectiveness of a vaccine is the choice of the vaccine strain that must allow an adequate response to the pathology that prevails in the field.
  • Each producing state conceives its own composition of the vaccine and this with respect to the specific vaccine strains prevailing on its ground and which are different from one country to another and which become thus specific to the epidemiological situation of this country.
  • the vaccine was produced using the bacterial body and the toxins produced (anactivity and toxoid). 3- Decrease in the number of strains.
  • the effectiveness of a vaccine prepared from bacterial bodies is qualitatively and quantitatively dependent on the antigenic and immunoprotective power of the antigens.
  • the immune system will respond in different ways to each type, and thus one can not obtain the same response for each type of antigen. Therefore the immune response is better in the presence of a reduced number of antigen valences.
  • the bivalent vaccine produced with 02 types of Clostridium perfringens developed at our level, can immunize against all variants (04 types) of causative agents of enterotoxemia disease with greater efficacy and can be also used in other countries and thus becomes a universal vaccine thanks to its more effective immunogenicity.
  • This vaccine allows ruminants to be injected to produce a high level of:
  • Clostridium perfringens antibodies type A, B, C and D Clostridium perfringens antibodies type A, B, C and D.
  • Anaculture and Clostridium perfringens type C and D toxoids are derived from 37% formalin-inactivated anaerobic cultures at 0.6% and heat. (11)
  • the different manufacturing steps for each type of culture are as follows: Revification (1 ') from a freeze-dried flask of a seed lot (1), a preculture is inoculated. (2)
  • preculture (3) serves as an inoculum for the main crop.
  • the main culture is carried out in a semi industrial fermenter for a time and with parameters that vary according to the type of Clostridium.
  • a freeze-drying protector is added, namely 20% skimmed milk after purity and identity control.
  • the 0 production strains (Seed Lot) are preserved by lyophilization in vacuum-stoppered flasks, identified and stored at + 4 ° C.
  • the cultures of the strains are made in a semi-industrial fermenter. (4)
  • the culture parameters temperature, agitation, pH, are programmed and regulated according to the type of Clostridium perfringens. T "of 37 ° C, 5 to 7h for the strain CWC and 18 to 20h for the strain CPD.
  • A2 Purity Test, DMM, Optical Density (OD), PH.
  • the culture of the CPD strain is activated by trypsinization (1% trypsin and incubated at 37 ° C. for 1 h) (7)
  • the cultures are transformed into anactivation and toxoid by the combined action of formalin (37% formaldehyde solution at 0.6%) and heat (14 days at 37 ° C) (8).
  • the anaculture "sterile toxoids are stored at 4 ° C during the inactivation controls.
  • the vaccine is subsequently constituted by a mixture of Clostridium perfringens type C and D anaculture and toxoids ⁇ , ⁇ and ⁇ adsorbed on sterile alumina gel, with slow stirring (9.)
  • the vaccine (10) is then distributed in the sterile room, in sterile vials which are capped and capped.
  • a dose of 2 ml vaccine contains:
  • Adjuvant and stabilizer • 1 IU of Alpha antitoxin.
  • the vaccine is a yellowish suspension with a whitish deposit which is made homogeneous by stirring.

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Abstract

L'invention porte sur un vaccin anti entérotoxémie répondant le mieux à la situation épidémiologique prévalant sur le terrain. Ce travail a été initié après une étude comparative des antigènes somatiques et de la toxinogénèse des différents types de Clostridium perfringens, souches locales et étrangères, afin de choisir les valences les mieux adaptées et les plus appropriées à la composition du vaccin anti-entérotoxémie. Ce travail nous a permis de choisir 2 valences pour la production d'un vaccin universel le mieux adapté à la situation de l'élevage, l'utilisation de souches notamment locales hautement immunogènes, vaccin composé d'antigènes somatiques et de toxines (anaculture et anatoxine) et la diminution du nombre de souches bactériennes composants le vaccin tout en ayant un éventail de protection contre les quatre types de Clostridium Perfringens.

Description

TITRE DE L'INVENTION
Vaccin bivalent à usage vétérinaire, anti— Entérotoxémie.
DOMAINE TECHNIQUE AUQUEL SE RAPPORTE L'INVENTION
L'invention se rapporte^ un vaccin prophylactique à usage vétérinaire utilisé pour la prévention de l'entérotoxémie chez les animaux domestiques
ÉTAT DE LA TECHNIQUE ANTERIEURE
D'importantes conceptions, élaborations et mises au point dans la production de vaccins vétérinaires et médicaux sont décrites. Auparavant, pour leurs fabrications les considérations économiques étaient primordiales, et des produits brut et moins purs avec une efficacité prouvée continuent d'être utilisés. Pour l'utilisation humaine, cependant, la sûreté (l'activité) et l'absence des effets secondaires sont de plus en plus exigées.
Divers exemples de vaccins vétérinaires sont énumérés dans cet exposé, et l'interaction avec les vaccins humains est illustrée en se référant à la maladie de porcelet en Nouvelle-Guinée (vétérinaire) qui est la plus proche et la plus probable avec l'étiologie du syndrome de la mort soudaine infantile (humaine).
Introduction
Dans un éditorial récent aux démarches de la conférence internationale sur la prévention de la méningite de Hib tenues à Barcelone en 1990 1.
Les diverses remarques concernant les vaccins bactériens ont été résumées ainsi :
Pendant plusieurs décennies, l'équilibre entre les approches prophylactiques et thérapeutiques pour le contrôle des maladies bactériennes a tout d'abord favorisé ce dernier en raison du développement et de l'utilisation étendue d'antibiotiques.
En conséquence, la vaccination prophylactique contre les maladies bactériennes a été en grande partie confinée aux vaccins traditionnels qui existaient...
En raison du développement des souches résistantes aux antibiotiques dans les pays développés, et de la non-disponibilité des antibiotiques et des soins médicaux adéquats dans les pays en voie de développement, l'équilibre existant a commencé à être rompu en faveur du développement des vaccins bactériens prophylactiques.
Cependant, provisoirement, en se basant sur l'expérience acquise avec les produits pharmaceutiques et les changements dramatiques du climat politique général concernant l'utilisation et la sécurité de ces produits, le développement d'un nouveau vaccin doit tenir compte non seulement de l'efficacité, mais également de la sécurité en termes de réactions et des effets secondaires engendrés.
En outre, le type brut de préparation utilisé dans les vaccins traditionnels est remplacé ;par des immunogènes , plus pures et mieux caractérisés. La purification ainsi que la constitution des antigènes mis au contact avec le système immunitaire ont également des répercussions sur l'immuno-réaction, en particulier sur la capacité des enfants en bas âge à répondre à ces nouvelles entités. Cependant , il faudrait tenir compte, que la protection par la vaccination est le plus souvent multivalente impliquant plusieurs souches dirigées contre plusieurs maladies à la fois impliquant un certain nombre d'antigènes, cela particulièrement en médecine vétérinaire chez les animaux non domestiques, pour des considérations économiques qui dictent qu'un produit, en plus de l'efficacité et sa sûreté, devrait aussi être rentable.
En prenant en considération toutes ces contraintes, le vaccin de choix est le produit brut non purifié, hautement efficace et qui existe depuis de nombreuses années.
En conséquence ces raisons invoquées n'incitent pas au développement d'un produit hautement purifié, en comparaison aux exigences de la production d'un vaccin à usage humain, à moins qu'une telle approche soit dictée par les considérations d'efficacité.
En développant une stratégie vaccinale pour la prévention et le contrôle de la maladie, le producteur prend en considération deux paramètres essentiels pour établir la formulation d'un vaccin ;le germe causal et les symptômes de la maladie infectieuse 2. Ces derniers, principalement, sont produits par des toxines élaborées pendant la croissance de la bactérie. En effet, les symptômes de l'infection peuvent être reproduits en injectant les filtrats stériles des germes incriminés.
Les vaccins par leur composition empêchent l'installation du germe et son développement, soit en stimulant la production d'anticorps qui empêchent l'adhérence ou des anticorps à pouvoir bactéricides ou, simultanément, en neutralisant aussi les symptômes de l'infection par le développement de l'immunité antitoxique.
Les vaccins à anatoxine et anaculture (culture entière) peuvent stimuler les deux types d'immunité, mais dans d'autres cas, souvent pour des raisons techniques liées à la production, seulement l'une de ces approches est utilisée.
Cette étude passera en revue certains développements qui ont eu lieu pendant les dernières décennies dans l'approche de la production de vaccins. Elle illustrera par des exemples, en particulier des vaccins vétérinaires, l'aspect multivalent de la protection. Ces aspects ne devraient pas être perdus de vue pendant le développement des immunogènes épurés et spécifiques hautement immuno-protecteurs. Vaccins vétérinaires.
Vaccins à base de toxine (anatoxine).
Les maladies les plus importantes économiquement chez les ovins, bovins et autres animaux tels que les porcs sont provoquées par les infections Clostridiales 3.
La menace avérée de la gangrène gazeuse lors de la première et deuxième guerre mondiale a stimulé la recherche sur cette maladie et une littérature sur les toxines produites par Clostridium perfringens abonde dans ce sens 4''5. Les toxines principales, responsables de la maladie ont été identifiées et l'utilisation de vaccins à base d'anatoxine pour la prophylaxie et le contrôle des maladies Clostridiales est largement pratiquée 6.
Les anatoxines sont normalement produites à partir dé la toxine brute par traitement avec du formaldéhyde. De tels toxoïdes sont normalement adsorbés par un adjuvant, habituellement, un sel minéral tel que le phosphate d'aluminium et le sulfate d'aluminium ou de potassium. Pour des raisons de coût, ce dernier est habituellement le plus employé pour les vaccins à usage vétérinaire. Les adjuvants les plus efficaces sont de loin les huiles minérales ou leurs dérivés (tableau 1). Cependant, en raison de leur réactivité sur les tissus ils ne peuvent être utilisés pour la vaccination humaine et, même en médecine vétérinaire, en dépit de leur efficacité, leur utilisation est sévèrement limitée en raison de la déperdition de la valeur nutritionnelle et commerciale de la carcasse.
La gamme des maladies Clostridiales contre lesquelles la vaccination est pratiquée est montrée dans le tableau 2. Les vaccins monovalents et combinés disponibles sont différents par leur composition et leurs formulations selon les fabricants de chaque pays en répondant aux besoins propres de leurs marchés.
En raison des développements enregistrés en biotechnologie et l'utilisation de fermenteur, des rendements élevés en principes actifs sont obtenus en culture pour la production de toxines Clostridiales appropriées et selon le germe utilisé. Après traitement avec du formaldéhyde, les germes sont éliminés, habituellement par centrifugation, et le produit surnageant est utilisé pour la formulation du mélange du principe actif 6.
La production de toxine pendant la croissance bactérienne peut être surveillée, suivie et contrôlée par des techniques variées. Celles-ci incluent la mesure de l'activité enzymatique, par exemple, Lécithinase ainsi que l'hémolyse ou alternativement, in vivo, en observant des cobayes, des souris et des lapins inoculés en utilisant la mort ou des lésions de peau comme indicateur. Les valeurs de la toxine sont exprimées en termes d'effets indicateurs (dose minimale létale, dose hémolytique minimale ou, alternativement, en termes d'équivalence en unité d'antitoxine standard). Par exemple, la dose LF d'une toxine est la dose de toxine qui, une fois mélangée à une unité d'antitoxine, flocule en un temps minimal et L+ est la plus petite dose de toxine qui, mélangée à une unité d'antitoxine, tue 50% de souris inoculées d'un poids donné en un temps indiqué.
En se basant sur l'expérience acquise, les fabricants ont pu formuler des produits à plusieurs composants de sorte qu'ils produisent une réponse équilibrée à tous les antigènes principaux en dépit du phénomène de compétition antigénique induit par de tels vaccins, multivalents 6.
L'une des approches utilisées a été d'obtenir les rendements élevés en toxines spécifiques en fermenteur et de ce fait en tenir compte lors de la dilution du mélange final. D'autres fabricants concentrent des toxoïdes pour obtenir les valeurs nécessaires pour leur utilisation dans le mélange.
Si l'objet dé la concentration est simplement d'enlever les petites substances de poids moléculaires qui peuvent interférer sur l'adsorption de l'adjuvant et/ou alors de diminuer, le volume pour le stockage cela est tout à fait acceptable. Si d'autre part, la concentration est employée pour récupérer le matériel de faible valeur antigénique, ceci peut être dangereux lors de la concentration de tous les composants puisqu'elle augmente le phénomène de compétition antigénique.
Au Royaume-Uni, afin de fournir des vaccins efficaces et sûrs, les fabricants ont dû se conformer aux normes établies de la Pharmacopée Vétérinaires Britannique dont les recommandations ont été plus tard incorporées dans la Pharmacopée Européenne. Ces normes ont été à l'origine formulées après consultation avec les principaux fabricants qui se sont basés sur leurs propres expériences de production de vaccins à efficacités prouvées sur le terrain et pouvaient suggérer ainsi des critères par consensus pour la libération (commercialisation) des produits.
Dans le cas des vaccins Clostridiales, afin qu'un vaccin puisse être libéré, le fabricant doit démontrer qu'après deux injections, données selon un protocole recommandé et défini d'immunisation, les lapins (animaux de laboratoire) doivent répondre en produisant des titres minimums d'antitoxines (tableau 3).
Des études formelles ont prouvé que les vaccins produisant ces titres adéquats chez les lapins, produisent une réponse sérologique proportionnée et protectrice chez l'espèce cible.
Néanmoins, ces critères ont quelques inconvénients, par exemple, ils ne mesurent que les anticorps des toxines majeures létales et ils ne tiennent aucun compte de la mesure des anticorps induits par d'autres toxines et de composants cellulaires qui peuvent être importants de point de vue immunitaire. Ainsi, ils ne distinguent pas l'anaculture à culture entière, et les vaccins à anatoxines. Une autre complication réside au niveau des différences observées dans la réponse chez les différentes races des lapins. Les titres obtenus sur ces derniers peuvent varier du simple au triple par rapport à la même préparation vaccinale. C'est pour cela que l'utilisation d'une préparation standard est exigée pour assurer l'étalonnage efficace des techniques.
Dans le cas des vaccins Clostridiales, aucune de ces procédures en utilisant cette préparation standard n'est par habitude faite en routine lors de la production continue. Plus récemment, les autorités de régulation dans le domaine vétérinaire ont publié des guides de normes de contrôle et des méthodes de l'essai indépendamment des fabricants qui les obligent à suivre un système de bonnes pratiques de production de laboratoires, rigoureux, pour la certification des fabricants pour s'assurer de la qualité des produits fabriqués.
Les animaux adultes sont normalement immunisés par deux injections séparées par au moins 28 jours d'intervalle au cours de la première immunisation. Ensuite, l'immunité peut être davantage amplifiée aux périodes critiques de la vie de l'animal. Une telle période coïncide avec la période des 14 jours avant la parturition pour s'assurer que la quantité maximum d'anticorps est transférée à partir du sérum par l'intermédiaire du colostrum et du lait pour la protection de nouveau-nés. Après la disparition d'une telle protection passive, le jeune animal subit la vaccination prophylactique normalement. Malheureusement ces dernières années, en raison de la concurrence et de la surproduction intenses, les vaccins Clostridiales ont tendance à être considérés comme n'importe quel produit commercial car tous ces vaccins supposés identiques ont été établis et libérés (commercialisé) sur la base des recommandations de la Pharmacopée. En outre, toutes les différences apportées par un des produits ne peuvent être détectées dans une population où l'immunité de base est saine résultant de vaccination ultérieure. Néanmoins, des différences existent entre les produits et des exemples sont donnés ci-dessous. Vaccins à base de Clostridium perfringens.
Le but du fabricant est de fournir des vaccins protégeant à la fois l'adulte et la progéniture par transfert passif d'anticorps.
Des études sur les titres d'anticorps obtenus chez le mouton par deux injections de vaccins commerciaux A et B, notamment, les antitoxines (epsilon) de la souche Clostridium perfringens type C, ont montrées des différences de titres sur les animaux immunisés ou non précédemment. On a pu voir qu'avec le vaccin A, après une première injection simple, 90 % des animaux donnent un titre mesurable en comparaison aux 65.5 % d'animaux obtenant avec le vaccin B le même titre vaccinal en utilisant la moyenne géométrique de groupe.
Ces différences sont observées sur les titres obtenus en première injection simple et également sur les titres obtenus après la deuxième injection, en plus avec le vaccin B deux des animaux n'ont aucun titre mesurable. Les réponses chez les brebis sont reflétées aussi sur les titres d'antitoxine obtenus chez les agneaux après la parturition et, par conséquent, sur le temps de la protection accordé aux agneaux pendant les premières semaines de la vie.
On peut ainsi voir que, même avec deux préparations vaccinales libérées sur la base des normes recommandées par la Veterinary Codex, des différences existent dans le potentiel de protection de l'adulte et du nouveau-né.
Un autre exemple sur le manque de protection engendrée par les vaccins multivalents avec des anatoxines seules et qui sont normalement efficaces, peut être aussi donné. Habituellement dans les cas où de grandes quantités de toxines sont utilisées induisant le phénomène de compétition antigénique en accablant l'immunité anti- toxique et c'est pour cette raison, que quelques fabricants n'enlèvent pas toutes les cellules dés anacultures afin d'obtenir l'immunité antibactérienne et antitoxique.
Un exemple typique a été vécu au Danemark lors de la vaccination contre l'entérite de porcelet maladie provoquée par le type C de Clostridium perfringens. Cette maladie est une entérite hémorragique et nécrosante de porcelets qui, pendant 10 ans, est passée de petits foyers jusqu'à couvrir de grands domaines du Jutland et de la Zélande.
En 1980 , Peter Hogh , dans une étude détaillée, a montré que le germe causal était le type C de Clostridium perfringens et que la maladie pouvait être traité par l'administration de sérums de cheval contenant de hauts titres, de l'antitoxine Bêta (Xento) ,et par la vaccination avec des vaccins contenant l'anatoxine de Clostridium perfringens type B, le seul vaccin (Xento, Burroughs Wellcome), qui existait à ce moment pour le traitement de la dysenterie de l'agneau, une maladie semblable à l'entérite et observée chez les agneaux.
La composition de ce vaccin était un mélange d'anatoxine du type B, C et D ainsi que l'Anaculture du type B. L'utilisation de ce vaccin lui a permis de déterminer les seuils des titres nécessaires pour la protection des animaux. Il a prouvé que si un titre de 10UI (unités internationales) d'antitoxine pouvait être réalisé dans le colostrum après vaccination de la truie ou de la jeune truie, les porcelets nourrisson sont protégés contre la maladie. Ce vaccin a été employé à grande échelle avec succès pour empêcher la maladie dans de nombreux troupeaux. Cependant, il restait toujours un petit nombre de cas (5-10 %) où le vaccin seul n'a pas traité la maladie en raison du niveau du phénomène de compétition antigénique, ainsi que de ne pas avoir utilisé la sérothérapie par l'administration de l'antisérum de haut titre, utiliser en supplément pour contenir l'infection.
Quelques années plus tard, un vaccin à anatoxine de Clostridium perfringens type C combiné avec Escherichia coli (vaccin Xentocol, Wellcome) a été spécifiquement conçu et a été présenté sur le marché, ce vaccin traite simultanément, la diarrhée due à Escherichia coli et l'entérite du à Clostridium perfringens type C. Ce type d'anatoxine de Clostridium perfringens type C a rempli tous les critères présentés par Hogh 12, et dans beaucoup d'élevage le vaccin a été employé avec succès pour traiter simultanément Escherichia coli et l'entérite de porcelet. Cependant, dans un certain nombre de cas d'élevage le vaccin était totalement inefficace dans le traitement de l'entérite du porcelet. Sur des études comparatives effectuées utilisant trois formulations différentes, on a pu voir que l'élimination des cellules de Clostridium perfringens a eu comme conséquence la perte considérable d'efficacité. Les résultats ont indiqué que cela est vrai dans le cas où l'immunité antibactérienne et antitoxique élevée est exigée pour contenir l'infection après challenge 13
On conclue que le développement des vaccins à usage vétérinaire et médical pendant les dernières décennies a pris un chemin semblable, la différence principale étant le degré de purification et de caractérisation des divers antigènes.
Dans le cas des vaccins vétérinaires, il y a eu une tendance croissante vers l'identification des antigènes protecteurs spécifiques en s'assurant que les conditions et les milieux de culture dans lesquels elles sont développées leurs permettent de s'exprimer. Dans le cas des vaccins humains, la production des entités chimiquement pures a permis l'utilisation des méthodes physiques et chimiques pour la caractérisation et l'étalonnage.
Ces approches de la production ont clairement engendré beaucoup d'avantages aux deux types de vaccins du point de vue de l'uniformité de la fabrication, de la mesure précise des antigènes protecteurs spécifiques, du contrôle de la qualité et de la rentabilité en tenant compte des conséquences sur l'utilisation des animaux de laboratoire par l'application de ces méthodes d'essai « in vitro ». Tableau 1: La moyenne arithmétique des titres d'anticorps chez les agneaux aux doses injectées de 2 x 2 ml d'un vaccin Clostridial multivalent précipités par de l'alun de potasse et une dose de vaccin de 1 ml adsorbé par l'adjuvant de freund's.
Figure imgf000009_0001
Clostridium Maladie
Clostridium perfringens type A Infection traumatique, mastite gangréneuse, enté- rotoxémie des agneaux en Californie et Oregon (Agneaux jaunes)
Clostridium perfringens type B, C, D. Entérotoxémie de différentes espèces d'animaux
Œdème malin des chevaux, ovins et caprins.
Clostridium sep ticum
Blackleg chez les ovins et les autres bétails
Clostridium chauvoei
Gangrène gazeuse chez les ovins et le bétail
Clostridium novyi type A
Black disease chez le mouton, mort soudaine chez
Clostridium novyi type B
le bétail et ovin
Clostridium haemolyticum Hémoglobinurie bacillaire chez le bétail
(Clostridium novyi type D)
Clostridium sordelli Gangrène gazeuse
Clostridium tetani Tétanos chez toutes les espèces domestiques
Clostridium botulinum type C et D Botulisme 3 : Normes de la British Veterinary Codex : réponses minimales du sérum chez les lapins (Ul/ml)après deux injections d'un vaccin commercial multivalent selon les doses prescrites
Figure imgf000010_0001
On peut enfin conclure que les données immunologiques, les techniques d'élevage ainsi que la situation épidémiologique prévalant sur le terrain Algérien nous incitent à affirmer, que la prévention anti gangréneuse ;post-traumatique, faisant suite aux caudectomie et aux castrations pratiquées sur le cheptel ovin, dans des pays tels que la Nouvelle-Zélande ou l'Australie, n'est pas nécessaire.
Les études, énumérées précédemment, nous ont permis et encouragés à composer une formulation du vaccin, assurant une couverture vaccinale complète et efficace en induisant une réponse immunitaire par l'utilisation d'un spectre restreint d'antigènes afin d'éviter le phénomène de compétition antigénique. Le choix des souches ayant toutes les propriétés antigéniques et toxinogènes des différents types de Clostridium perfringens utilisés lors de la formulation de vaccins par les différentes firmes fabricants ces produits est de plus en plus nécessaires.
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6- Sterne.M, . Batty, I, . Thomson, A, and Robertson, J.M. 1962. Immunisation of sheep with multicomponent clostridial vaccines . Vet. Rec. 74: 909-913. Le but de l'invention consiste à :
1- La prévention contre l'entérotoxémie qui est présente sur le terrain Algérien (en fonction de la situation épidémiologique).
2- Production d'un vaccin plus efficace adapté à la situation de l'élevage en Algérie (élevage non intensif, pas d'utilisation de caudectomie et castration).
3- Composition d'une formulation de vaccin, assurant une couverture vaccinale complète et efficace en induisant une réponse immunitaire par l'utilisation d'un spectre restreint d'antigènes afin d'éviter le phénomène de compétition antigénique.
4- vaccin universel par :
• L'utilisation de souches notamment locales hautement immunogènes.
• Vaccin composé d'antigènes somatiques et de toxines (anaculture et anatoxine).
• La diminution du nombre de souches bactériennes composant le vaccin tout en ayant un éventail de protection contre les 4 types de Clostridium perfringens pour une réponse immunitaire plus efficace:
a/ Couverture de toutes les possibilités de présence d'antigènes des
4 types de Clostridium perfringens.
b/ Capacité de protéger aussi contre les toxines (α,β et ε) produites
par ces mêmes 4 types de Clostridium perfringens.
5- Participation au règlement d'un des problèmes économiques.
5
ENNONCE DES FIGURES
La figure représente les différentes étapes de production du vaccin anti entérotoxémie (Figure N° 1). (PRESENTATION DE L'ESSENCE ( LA SUBSTANCE) DE L'INVENTION
Le Vaccin destiné à la prophylaxie des entérotoxémie des ovins, bovins, caprins, camelin, lapin et autres est un vaccin inactivé par le formol, adjuvé à l'hydroxyde d'aluminium et associant les principes actifs cités ci-dessous.
5 Le vaccin est préparé à partir des souches de terrain Algérien et étranger sélectionnées pour leurs pouvoirs toxinogènes et leur haute valeur immunogène.
Les corps bactériens inactivés ont été conservés dans la préparation vaccinale afin de fournir une réponse immunitaire la plus complète possible.
Le vaccin anti enterotoxémie est un mélange de :
0 - Anaculture de Clostridium perfringens type C.
- Anaculture de Clostridium perfringens type D.
Ànatoxines α, β et ε de Clostridium perfringens type C et D.
Hydroxyde d'aluminium comme adjuvant.
Formaldéhyde. Pour la mise au point et la production de ce vaccin à usage vétérinaire prophylactique contre l'entérotoxémie des animaux (bovins, ovins, caprins, camelins, lapins...), une étude a été réalisée, pour l'utilisation d'un spectre restreint de valences permettant d'assurer une couverture vaccinale optimale et complète, par comparaison des antigènes somatiques de souches de Clostridium perfringens de différentes origines.
La communauté antigénique existante entre certains types nous a permis de préconiser l'utilisation de 2 valences C et D de Clostridium perfringens pour:
La production d'un vaccin universel le mieux adapté à la situation de l'élevage. La diminution du nombre de souches bactériennes composant le vaccin tout en ayant un éventail de protection contre les 4 types de Clostridium perfringens : a/ Couverture de toutes les possibilités de présence d'antigènes des 4 types de Clostridium perfringens.
b/ Capacité de protéger aussi contre les toxines (α, β et ε) produites par ces même 4 types.
Ce spectre restreint de valences choisis après études approfondies permet de couvrir toutes les possibilités antigéniques (antigène somatique) en plus de leur capacité à protéger aussi contre les toxines synthétisées à savoir α, β et ε, toxines majeurs ainsi que les toxines mineures des quatre types de Clostridium perfringens responsables de la maladie et de ce fait devient par sa composition optimale un vaccin universel.
POSITION DE L'INNOVATION
1- Utilisation de souche locale :
Le plus important paramètre qui conditionne l'efficacité d'un vaccin est le choix de la souche vaccinale qui doit permettre une réponse adéquate à la pathologie qui prévaut sur le terrain.
Chaque état producteur conçoit sa propre composition du vaccin et ceci par rapport aux souches vaccinales bien précises prévalant sur son terrain et qui sont différentes d'un pays à un autre et qui deviennent de ce fait spécifique à la situation épidémiologique de ce pays.
Notre vaccin produit avec une souche locale isolée du terrain Algérien est de ce fait un vaccin efficace plus adapté à l'épidémiologie qui prévaut sur le terrain local que les autres vaccins.
2- Utilisation des antigènes somatiques et de toxines.
Le vaccin a été produit en utilisant le corps bactérien et les toxines produites (anaculture et anatoxine). 3- Diminution du nombre de souches.
L'efficacité d'un vaccin préparé à partir de corps bactériens dépend sur les plans qualitatifs et quantitatifs du pouvoir antigénique et immunoprotecteur que possèdent les antigènes.
Sachant que les anticorps produits après vaccination ainsi que leurs spécificités pour chaque type d'antigène à un taux suffisamment important (pouvant atteindre le seuil de protection) est inversement proportionnel au nombre de valences d'antigènes différentes présentes dans le vaccin et mises au contact avec le système immunitaire dont dépend la réponse.
A chaque fois qu'on introduit dans l'organisme une mosaïque d'antigènes, le système immunitaire répondra de façons différentes à chaque type et de ce fait on ne peut obtenir une même réponse pour chaque type d'antigène. Donc la réponse immunitaire est meilleure en présence d'un nombre réduit de valences d'antigènes.
Pour la mise au point et la production de ce vaccin, une étude a été réalisée, pour l'utilisation d'un spectre restreint de valences permettant d'assurer une couverture vaccinale optimale et complète par comparaison des antigènes somatiques de souches de Clostridium perfringens de différentes origines. Après l'étude de la toxinogénèse et une étude antigénique du Clostridium perfringens Il a été démontré que, les types A et B présentent une homologie antigénique, complète avec le type C et partielle avec le type D et que les types C et D présentent une hétérologie complète.
La communauté antigénique existante entre certains types nous a permis de préconiser l'utilisation de 2 valences C et D de Clostridium perfringens pour:
La production d'un vaccin universel le mieux adapté à la situation de l'élevage.
> Vaccin composé d'antigènes somatiques et de toxines (anaculture + anatoxine).
> La diminution du nombre de souches bactérienne composants le vaccin tout en ayant un éventail de protection contre les 4 types de Clostridium perfringens : a/ couverture de toutes les possibilités de présence d'antigènes des 4 types de Clostridium perfringens A, B, C et D.
b/ Capacité de protéger aussi contre les toxines ( , β et ε) produites par ces mêmes 4 types.
En conclusion, le vaccin bivalent produit avec 02 types de Clostridium perfringens, mis au point à notre niveau, peut Immuniser contre toutes les variantes (04 types) d'agents causales de la maladie de l'entérotoxémie avec une efficacité plus importante et peut être aussi utilisé dans d'autres pays et devient ainsi un vaccin universel grâce à son pouvoir immunogène plus efficace. MODE DE REALISATION DE L'INVENTION
A/ principes généraux :
Ce vaccin permet par injection aux ruminants de susciter la production d'un niveau élevé de :
5 1- Anticorps anti Clostridium perfringens type A, B, C et D.
2- Antitoxines α, β et ε de Clostridium perfringens, capables de neutraliser les toxines produites in vivo au cours des entérotoxémie des ovins, bovins, caprins, camelins et lapins
10 B/ Méthode de fabrication :
Les Anaculture et les anatoxines de Clostridium perfringens type C et D proviennent des cultures anaérobies inactivées par le formol 37% à raison de 0,6% et par la chaleur. (11) Les différentes étapes de fabrication pour chaque type de culture sont les suivantes : Revification (1') à partir d'un flacon lyophilisé d'un lot de semence (1), on ensemence 15 une préculture. (2)
Dés la phase exponentielle de développement des bactéries, la préculture (3) sert d'inoculum à la culture principale. (4)
La culture principale s'effectue en fermenteur semi industriel pendant un temps et avec des paramètres qui varient selon le type de Clostridium.
0 B.l Souches de production : (1)
Les souches de production d'origine Algérienne et étrangère hautement immunogènes ont été sélectionnées pour leur pouvoir toxinogène élevé et leur bonne qualité antigénique. Il s'agit de souches de :
Clostridium perfringens type C CWCR (IPA)
5 - Clostridium perfringens type D CPDA 91.87 (IPP)
Pour produire des lots de semences, on récolte une culture en fin de phase de croissance exponentielle. On y ajoute un protecteur de lyophilisation à savoir du lait écrémé à 20% après contrôle de pureté et d'identité.
Ces lots de semence servent pendant plusieurs mois pour préparer les précultures. Les 0 souches de production (Seed Lot) sont conservées par lyophilisation dans des flacons bouchés sous vide, identifiés et stockés à +4°C.
B.2- Milieu de culture des souches : (2, 3,4)
Ils comportent les constituants de base suivants :
Digestion trypsique et papainique de viande et de foie de bœuf.
5 - Digestion trypsique de caséine.
Extrait de levure.
Facteurs de croissance, vitamine, glucose-Dextrose.
Sels minéraux pour tampon. B.3- Conditions générales de culture
Les cultures des souches sont réalisées dans un fermenteur semi- industriel. (4)
Les paramètres de culture : température, agitation, pH, sont programmés et régulés selon le type de Clostridium perfringens. T" de 37°C, 5 à7h pour la souche CWC et 18 à 20h pour la souche CPD.
Des contrôles de pureté, d'identité, de stérilité, de croissance bactérienne (mesure de la Densité Optique, numération bactérienne) sont effectués chaque heure pendant toute la durée de la fermentation et pour les précultures : (de Al à A4)
Al : Examen microscopique, Test Pureté, Densité optique (D.O), DMM.
A2 : Test Pureté, DMM, Densité optique (DO), PH.
A3 : Contrôle après chaque prélèvement :
Examens Microscopiques, Test de pureté, Densité optique (D.O),DMM /L+, PH. A4 : Contrôles de fin de fermentation :
Examens microscopiques, Test de pureté, DMM /L+, PH, Densité optique (D.O) A5 : Contrôle final du vaccin.
B.4- Récolte, inactivation et détoxification :
En fin de croissance exponentielle (5) et après récolte(6), la culture de la souche CPD est activée par trypsination (trypsine 1% et incubée à 37°C pendant 1 h (7). Les cultures sont transformées en anaculture et anatoxine par action conjuguée du formol (solution de formaldéhyde à 37% à raison de 0.6%) et la chaleur (14 jours à 37°C) (8).
B.5- Constitution du vaccin final :
Les anaculture" et anatoxines stériles sont stockées à 4 °C durant les contrôles d'inactivation.
Le vaccin est par la suite constitué par un mélange d'anaculture de Clostridium perfringens type C et D et d'anatoxines α, β et ε adsorbées sur gel d'alumine stérile, sous agitation lente (9.)
Le vaccin (10) est alors réparti en salle stérile, dans des flacons stériles qui sont bouchés et capsulés.
B.6- Composition : 10
Une dose de vaccin de 2 ml contient :
Principe actif :
Anaculture et anatoxine de Clostridium perfringens type C et D; une quantité suffisantes pour obtenir chez l'animal de contrôle :
· 10 Ul (unité international) d'antitoxine bêta.
• 5 Ul d'anticorps Epsilon.
• 1 Ul d'antitoxine Alpha. Adjuvant et stabilisateur :
• AL3+ entre 1,9 et 2,3 mg/ml
• Formaldéhyde < à 1,6 mg/ml
B.7- Aspect physique du vaccin terminé : A5
Le vaccin est une suspension jaunâtre avec un dépôt blanchâtre qui est rendu homogène par agitation.

Claims

REVENDICATIONS
1- Vaccin bivalent anti-entérotoxémie répondant à la situation épidémiologique prévalant sur le terrain Algérien, caractérisé par sa capacité, compte tenu de la qualité antigénique des deux germes qu'il renferme, de provoquer un large éventail d'immunité solide, spécifique et durable.
2- Vaccin préventif selon la revendication 1, caractérisé par le fait qu'il traite non seulement l'apparition des symptômes de la maladie en aval (dues aux toxines produites par les bactéries) mais aussi l'agent causal en amont.
3- Vaccin préventif selon la revendication 1, caractérisé par le fait qu'il empêche, par son action préventif, les différents mécanismes d'actions de la pathogénicité du germe (multiplication , adhérence, sporulation..).
4- Vaccin selon la revendication 1, caractérisé par le fait que les types A et B de Clostridium perfringens, présentent une homologie antigénique, complète avec le type C et partielle avec le type D et que les types C et D présentent une hétérologie complète.
5- Vaccin selon les revendications 1 à 4, caractérisé par le fait que le type C et le type D de Clostridium perfringens constituent les valences les plus appropriées à la composition de notre vaccin anti- entérotoxémie 6- Vaccin selon les revendications 1 à 5, caractérisé par le choix des 2 valences C et D de Clostridium perfringens pour la production d'un vaccin universel le mieux adapté à la situation de l'élevage.
7- Vaccin selon les revendications 1 à 6, caractérisé par le fait qu'il est composé d'un mélange d'anaculture de Clostridium perfringens type C, d'anaculture de
Clostridium perfringens type D et d'anatoxines α, β et ε de Clostridium perfringens type C et D, adjuvé par l'hydroxyde d'aluminium.
Vaccin selon les revendications 1 à 7, caractérisé par sa capacité à assurer une couverture vaccinale complète et efficace par l'utilisation d'un spectre restreint d'antigènes afin d'éviter le phénomène de compétition antigénique.
9- Vaccin selon les revendications 1 à 8, caractérisé par la diminution du nombre de souches bactériennes composant le vaccin tout en ayant un éventail de protection contre les 4 types de Clostridium perfringens A, B, C et D.
10- Vaccin selon les revendications 1 à 9, caractérisé par sa couverture immunitaire de toutes les possibilités de présence d'antigènes somatiques des 4 types de Clostridium perfringens. 11- Vaccin selon les revendications 1 à 9, caractérisé par sa capacité à protéger également contre toutes les toxines ( α, β et ε) produites par ces mêmes 4 types de Clostridium perfringens A, B, C et D.
Vaccin selon les revendications 1 à 11, caractérisé par le fait qu'il permet, de couvrir toutes les possibilités antigéniques (antigènes somatiques) qui prévalent sur tous les terrains en plus de sa capacité à protéger contre les toxines Alpha, Bêta et epsilon (α, β et ε), toxines majeures des 4 types de Clostridium perfringens, responsables de l'entérotoxémie.
13- Vaccin selon les revendications 1, 4 et 10, caractérisé par le fait que les souches de Clostridium perfringens, rentrant dans sa composition, ont été identifiées selon une nouvelle approche de diagnostic par agglutination sur lame avec des sérums spécifiques.
14- Approche de diagnostic selon la revendication 13, caractérisé par la détermination des antigènes présents à la surface de la paroi bactérienne grâce aux anticorps spécifiques, anti A, B, C, D et E, produits sur lapins et permettant de déterminer le type de Clostridium perfringens à identifier.
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