Procédé de préparation de vaccins antigènes somatiques
La présente invention concerne la production de vaccins antigènes somatiques. Ces vaccins antigènes somatiques sont des préparations de bactéries inactivées lysées qui favorisent ou suscitent la formation d'anticorps lors de leur administration.
Un procédé typique de préparation de vaccins bac tériens consiste à cultiver des bactéries sur un milieu de culture convenable, à récolter la culture résultante, à étalonner ou normaliser la concentration des organismes et ensuite à inactiver ou à détruire les bactéries par la chaleur, par un antiseptique ou par ces deux moyens à la fois.
Des vaccins bactériens peuvent être préparés à partir de souches de bactéries de laboratoire ou de bactéries provenant directement du corps animal ou humain recevant le vaccin. Dans ce dernier cas on les désigne sous le nom de vaccins autogènes. Des vaccins renfermant plusieurs souches de bactéries sont appelés vaccins poly- valents. Des vaccins renfermant des bactéries appartenant à deux ou plusieurs espèces sont dits vaccins mixtes.
On peut également préparer des vaccins à partir de fractions de bactéries ou d'exsudats bactériens. Les toxoïdes de la diphtérie et du tétanos sont des exemples de ces derniers. Dans le cas de la présente invention, les bactéries sont totalement lysées de sorte que tous les antigènes bactériens internes et externes sont présents sous une forme efficace. Ce type de vaccin peut être appelé vaccin antigène somatique. Les vaccins préparés par la présente invention peuvent être du type monovalent, polyvalent ou mixte.
La titulaire au cours de recherches antérieures, avait déjà mis au point un procédé de préparation de vaccins antigènes somatiques dans lequel on opère la lyse de cellules mortes de bactéries pathogènes en les soumettant à l'action d'un enzyme protéolytique tel que la Dornase (désoxyribonucléase) qui provoque la lyse des cellules sans destruction du pouvoir antigénique.
L'invention montre que la lyse des cellules peut être grandement facilitée si l'on cultive les cellules dans un milieu renfermant un constituant à base d'amino acides ou des constituants qui favorisent le développement des parois de cellules affaiblies. Il en résulte que les bactéries affaiblies sont très facilement lycées une fois qu'elles ont été inactivées par un antiseptique ou un bactéricide approprié tel que le a Thimerosal > . Le mot Thimero- sal est la dénomination commerciale de l'éthyl mercurithiosalicylate de sodium et on le préfère pour le moment comme antiseptique ou agent de destruction ;
on peut toutefois en utiliser d'autres, tels que le thymocrésol, le chlorure de benzalconium et le phénol. Dans la présente invention on a utilisé le Thimerosal > vendu par la Société Eli Lilly and Company sous la marque déposée Merthiolate .
L'utilisation de glycine pour la rupture des cellules de bactéries a déjà été décrite par E. S. Maculla et P. B.
Cowles dans Science, Vol. 107, p. 376 (1948). Dans cette publication la glycine est ajoutée, à des concentrations relativement élevées, à la masse des cellules après la récolte. L'examen microscopique révèle toutefois que la rupture est minime et les extraits obtenus sont probablement dus à l'élution de la substance intracellulaire dans la solution de glycine. Dans un mode de réalisation pré féré de la présente invention, la glycine est ajoutée au départ au milieu de culture de manière que les bactéries résultantes présentent des parois de cellules particulièrement sensibles à la lyse. En effet, on a constaté que dans certains cas ces cellules subissaient une autolyse suffisante pour éviter ainsi des traitements secondaires.
Des essais de préparation de vaccins antigènes somatiques par la technique de Maculla et Cowles n'ont pas été fructueux. A titre de comparaison, on a réalisé une série d'essais avec certains organismes staphylococciques en ajoutant de la glycine à des cultures vivantes à des concentrations de 0, 5 à 3, 5 %. On a effectué un autre essai avec des organismes de la typhoïde et, dans ce cas, on a utilisé une concentration de 7, 5 % de glycine.
Aucune lyse des cellules n'a pu être mise en évidence au cours de ces essais et aucune rupture véritable des cellules n'a pu être enregistrée bien que l'on estime que la concentration d'azote protéinique a augmenté dans le liquide surnageant. Des contrôles d'efficacité ultérieurs sur des animaux expérimentaux ont révélé que ni les vaccins de staphylocoques ni les vaccins de la typhoïde préparés de cette manière ne présentaient une activité immunisante sensible.
La présente invention a donc pour objet un procédé perfectionné pour la production de vaccins antigènes somatiques dans lequel on inactive et lyse une culture de bactéries, les bactéries étant cultivées sur un milieu de culture renfermant un ou plusieurs des aminoacides utilisés ou associés à la synthèse de structures cellulaires par lesdites bactéries en une quantité suffisante pour donner lieu à la formation de bactéries plus sensibles à la lyse.
Un important mode de réalisation de la présente invention consiste à préparer un vaccin de mastite pouvant être utilisé pour l'immunisation des vaches contre la mastite. La mastite ou mammite est habituellement provoquée par des organismes staphylococciques ou streptococciques ou par un mélange des deux types. La mastite peut également être provoquée, en partie au moins, par d'autres organismes tels que l'Escherichia coli. Le vaccin de mastite de la présente invention peut par conséquent être un vaccin staphylococcique, un vaccin streptococcique, un vaccin streptococcique et staphylococcique mixte ou l'un de ces trois vaccins auquel a été ajouté le vaccin E. coli antigène somatique.
On prépare le vaccin E. coli antigène somatique de la présente invention en réalisant, en combinaison, une croissance initiale dans de la glycine et une lyse consécutive activée par un enzyme protéolytique approprié, tel que par exemple la Pronase) > (marque déposée). Un autre mode de réalisation de l'invention consiste à préparer un vaccin antigène somatique avec le Clostridium. Par exemple, le vaccin de Clostridium chauvoei pour le charbon du bétail a été préparé suivant une méthode identique à celle du vaccin E. coli et essayé avec succès.
Selon une caractéristique complémentaire de la présente invention, un procédé de préparation de vaccins antigènes somatiques de bactéries telles que Staphylococcus, Streptococcus, Neisseria et Clostridium comprend les stades de croissance des bactéries dans un milieu renfermant de la glycine, à une concentration favorisant la lyse de 0, 01-5 % environ en poids.
Selon une autre caractéristique de l'invention, dans un procédé de préparation d'un vaccin antigène somatique de bactéries telles que Staphylococcus, Streptococcus, Neisseria et Clostridium, la glycine se trouve dans le milieu de culture à un taux suffisant pour assurer la formation de bactéries possédant des parois de cellules affaiblies, ce qui facilite la lyse de telles cellules une fois que les bactéries ont été inactivées par des antiseptiques appropriés. Le milieu de culture devra de préférence contenir entre environ 0, 1 et environ 5 % en poids de glycine.
Les vaccins antigènes somatiques ont été préparés et contrôlés conformément à l'invention présentement dé- crite. On donne ci-après certains exemples de préparation typiques et des contrôles d'essai qui ont été effectués sur ces préparations. Ces exemples et contrôles sont purement illustratifs.
Les souches bactériennes mentionnées dans le présent exposé sont toutes déposées à la Culture Collection of the Laboratory of Hygiène. Department National Health and Welfare) > , Ottawa. Canada, sous les numéros et lettres de référence indiqués.
Sans que des remarques théoriques puissent être considérées comme susceptibles de limiter l'invention. on pense que le degré élevé de pouvoir antigénique résul- tant de la mise en oeuvre de la présente invention est dû à la rétention dans le vaccin de ces substances antigènes qui semblent être responsables de l'immunité. Les vaccins sont en général relativement limpides avec absence presque totale de dépôt et de cellules entières.
On peut faire varier dans de larges limites la concentration optimale en glycine, en fonction de l'organisme.
Pour la plupart des organismes examinés la concentration optimale se situe entre environ 0. 1 et 5 % en poids.
D'une manière générale on a observé que plus le taux d'aminoacide pouvant être utilisé sans influer défavora- blement la croissance est élevé, plus la lyse est rapide.
Bien que le milieu utilisé pour la préparation des vaccins de quelques-uns des exemples qui suivent soit un milieu de Frantz modifié [Watson & Scherp, J. Immunol. 81, p. 331 (1958)] il va sans dire que, dans certaines conditions, on pourra préférer d'autres milieux.
Solution A :
Acides Casamino (Tech) DIFCO 10 g
Cystine (solution à 1, 2'Vo dans du HCI
0, 1 N) 1 ml
KC1 0, 09 g
Na2HPO4. 12H, O 6, 5 g
Rouge Phénol solution à 0, zoo 8, 0 ml
Eau distillée q. s. p. 1000ml
Solution B :
MgSO4. 7HaO 2, 4 g
Glucose 20 g
Eau distillée q. s. p. 1000ml
Les acides Casamino sont un hydrolysat de caséine renfermant une substance à bas poids moléculaire. Chaque solution a été ajustée à PH 7, 4 avec NaOH et mise à l'autoclave pendant 15 mn à 1210 C. Normalement. lorsqu'on utilise le milieu de Frantz la solution B est ajoutée aseptiquement à la solution A à raison de 25 ml/l pour les utilisations générales.
L'expérience a montré que certaines espèces de bactéries se comportent mieux lorsqu'on fait varier cette proportion ; on a par exemple trouvé qu'il est préférable d'utiliser les proportions suivantes pour les divers organismes ci-après :
Neisseria-50 ml de B pour 1 litre de A
Staphylococcus-15 ml de B pour 1 litre de A
Streptococcus-40 ml de B pour 1 litre de A
Exemple 1 :
Priparatioti d'rtn vaccita mening=ococciqrte
Les cultures de germes ont été transférées directement à partir d'ampoules lyophilisées dans des flacons renfermant 250 ml du milieu de 1'exemple 1 et mis à l'incubation pendant une nuit à 370 C (environ 18 heures) sur un agitateur à secousses réglé à 40 t/mn. 20 ml provenant desdits flacons ont été transplantés dans des flacons de 1 litre contenant 500 ml du milieu de Frantz modifié renfermant 1 % en poids/volume de glycine. La glycine peut être ajoutée à la solution A au moment de la fabrication ou de façon aseptique au mélange avant l'ensemencement. Les flacons ensemencés ont été mis à incuber de la même manière que les flacons de germe sur un agitateur à secousses à raison de 40 t/mn pendant 18 à 20 heures.
Après l'incubation, les flacons ont été retirés de l'incubateur et une solution 1 : 100 de < Mer- thiolate > a été ajoutée à chaque flacon de 500 ml en vue d'une concentration finale en Merthiolate de 1 : 10000. On a ensuite laissé reposer les flacons pendant une semaine à la température ordinaire. Pendant ce temps, le vaccin qui, au départ, donne une valeur au néphélomètre équivalant à 3 à l'échelle Mc Farland, s'était complètement clarifié et indiquait zéro. Les vaccins ont été ensuite contrôlés quant à leur stérilité, leur innocuité, leur toxicité, leur action pyrogénique, et leur efficacité (voir exemple 3).
Meningococcus est le nom commun du Neisseria meningitidis de la famille Neisseriaceae. Pour cet exemple, on a utilisé les souches méningococciques suivantes :
M1027 (S. Branham)
Zl (Lapeyssonie) M129 (Lapeyssonie)
La méthode d'essai pour le vaccin méningococcique consistait à immuniser 60 souris, en utilisant 20 souris pour chacune des 3 dilutions séparées comme indiqué dans le tableau 1. Vingt souris ont été conservées comme témoins. Deux à trois semaines plus tard, les animaux ont été traités par une souche méningococcique vivante virulente (Neisseria meningitidis) et les animaux mis en observation pendant une semaine. Les résultats d'un essai typique sont consignés dans le tableau 1.
La souche utilisée pour cette expérience était la souche Zl. On a utilisé une culture cultivée sur milieu de
Frantz pendant 4 heures sur agitateur à secousses et portée à l'incubation à 370 C. La dose à injecter a été mise en suspension dans de la mucine à 4 % et a été administrée par voie intrapéritonéale à raison de 1, 0ml par souris.
Tableau 1
Tués
Dilution 24 h 48 h 72 h 144 h Survivants Vaccins de Meningo non dilué 0/20 2/20 2/20 2/20 18/20
PSA ? 1 1-5 3/20 6/20 6/20 6/20 14/20
Lots 2 et 3 réunis 1-10 6/20 7/20 9/20 10/20 10/20 Vaccins de Meningo non dilué 2/18 2/18 2/18 2/18 16/18
PSA ? 1 1-5 0/20 0/20 0/20 0/20 20/20
Lots 4 et 5 réunis 1-10 5/20 11/20 11/20 11/20 9/20
Témoins 15/20 18/20 18/20 18/20 2/20
Les résultats du tableau 1 indiquent que ce vaccin antigène somatique a conféré une bonne protection aux souris.
Exemple 2 :
Preparation de vaccins staphylococciques
Des vaccins staphylococciques ont été essentiellement préparés comme dans 1'exemple 1, mais on a trouvé que dif férentes concentrations de glycine étaient nécessaires pour une lyse optimale des différentes souches comme indiqué ci-après :
/o de souches
Groupe de phage No de souche Type de phage /0 de glycine dans le vaccin humain
I 584763 (80/81) 3, 5 30
II 596535 (3A/3B/3C) 3, 5 30
III 596510 7/47/53/54/75 + 3, 5 30
IV 596297 42D 4, 5 5
M ? 6032 KS6 3, 5 5
On a constaté que les vaccins staphylococciques conservaient leur efficacité après séjour à l'autoclave à 1200 C et sous 1, 4 kg/cm2 pendant 15 minutes.
Exemple 3
Préparation d'un vaccin de mastite
Ce vaccin qui est une combinaison d'organismes staphylococciques et streptococciques est préparé de façon différente en ce sens que les organismes ont été cultivés sur un milieu solide plutôt que dans un fluide. Les germes de souches ont d'abord été cultivés sur agar nutritif à 2 % pendant environ 18 heures à 37 C et la culture a été extraite par lavage soit avec de l'eau distillée stérile soit avec une solution saline à 0, 5 %. La lyse est plus longue avec la solution saline. Les organismes récoltés ont une concentration d'environ 3 X 101 organismes par ml et fournissent une valeur de 10 au néphélometre de Me Farland.
Il est bien évident que des cellules peuvent être cultivées en bouillon nutritif plutôt que sur agar solide, auquel cas la concentration des cellules peut être de l'ordre d'environ 1 X lot-1 X 109 par ml. Les cellules étaient presque complètement lysées entre les 7 et 10 jours qui ont suivi l'addition du < (Merthiolate) jusqu'à une concentration finale de 1 : 10000. La concentration de glycine optimale pour la réalisation de la lyse varie avec l'organisme.
Selon l'expérience acquise les concentrations en glycine les plus appropriées pour diverses souches cultivées sur de l'agar sont les suivantes :
"/o de souches
dans le vaccin
de mastite
Souche de Staphylocoque 584763
3, 0 lo glycine 15
Souche de Staphylocoque 596535
3, 0 O/o glycine 10
Souche de Staphylocoque 596510
3, 0 /0 glycine 15
Souche de Staphylocoque 6032
3, 5"/o glycine 20
Souche de Staphylocoque 596297
3, 5% glycine 10
Souche sur chien de Staphyloco
que-1, 5% glycine 10
Souche de Streptocoque A 36
(1118)-1, 0 /0 glycine 10
Souche de Streptocoque C (1628)
1. 5"/o glycine 10
Si,
d'autre part, on supprime les organismes streptococciques A36 (1118) et 30C (1628) une combinaison convenable serait :
"/o de souches
dans le vaccin
de mastite
Souche 584763-3, 0 O/o glycine 15
596535-3, 0 /0 glycine 15
) s 596510-3, 0 /0 glycine 25
6032-3, 5 O/o glycine 30
596297-3, 5 le glycine 10
Souche sur chien de Staphyloco
que-1,
5 O/o glycine 5
Exemple 4
Preparation d'un vaccin streptococcique
Souches humaines utilisées Type A 36 1118
Type A 19 616
Type A 12 602
Des ampoules lyophilisées ont servi à ensemencer des flacons de bouillon à base d'infusion de coeur et ont été cultivées à 37 C pendant une nuit. 10 ml de culture ont été ajoutés à chacun des lots de 500 ml de milieu de
Frantz renfermant 2 % de glycine et ils ont été mis à incuber pendant 20 heures à 37 C sur un agitateur à secousses. On a procédé au dénombrement des organismes vivants et ajouté suffisamment de solution mère de Merthiolate 1 : 100 pour avoir une concentration finale de 1 : 10000.
Les flacons ont été maintenus à la température ambiante jusqu'à achèvement de la lyse, ce qui a nécessité 7 à 10 jours. Les contrôles de stérilité, de toxicité, de sécurité et d'efficacité ont été effectués après que les organismes eurent été complètement lyses.
Les tableaux suivants 2 et 3 sont des exemples de résultats obtenus au cours d'essais réalisés sur des lapins avec du vaccin de mastite préparé à la fois à partir d'organismes staphylococciques et streptococciques. On a utilisé quatre lapins par lot individuel. Chaque lapin a reçu 1 ml de vaccin par voie intramusculaire et 0, 2 ml par voie intradermique dans chacun des 5 points sur le dos du lapin. Deux semaines plus tard, deux des animaux d'essai ont reçu par voie intradermique une dose de 0, 1 ml de 15 souches différentes de staphylocoques et les deux autres ont reçu par voie intradermique une dose de 0, 1 ml de 15 souches streptococciques différentes. Quatre lapins témoins (non vaccinés) ont reçu la même dose des mêmes souches en même temps et par la même voie que les animaux vaccinés. Deux ont reçu des staphylocoques et les deux autres des streptocoques.
Les lapins ont été mis en observation pendant 2 à 4 jours. Au bout de cette période. les lapins témoins présentaient une grande surface nécrosée à l'endroit de chaque injection alors que les points d'injection des lapins immunisés étaient clairs ou relativement clairs.
Dans les tableaux suivants, on a indiqué les résultats des dimensions des zones obtenues dans un des présents essais. Les dimensions sont exprimée en millimètres.
x indique la présence de pus et de nécrose.
Tableau 2
Lapins vaccinés avec un vaccin staph. (humain) et ayant reçu 15 souches staphylococciques, à une dilution 1 : 75, à partir d'ampoules lyophilisées. 0, 1 ml par point.
Lapins témoins Staph. PSA vaccin lot 7-3 (séché)
Lapin N > 4 Lapin N 3 Lapin N 5 Lapin N 6
Staphylocoque Staphylocoque Staphylocoque Staphylocoque 20x 10 20x 25x 15x 20x 0 0 0 0 0 0 15x 15x 25x20x 20x 25x050005 15x 10 25x 15 10 25x 0 0 0 5 0 0 20x 20x 25x 15x 15 25x 5 0 5 5 5 5 25x 25x 20x 25x 25x 15x 10 10 0 5 5 0
Tableau 3
Des lapins vaccinés avec du vaccin de mastite et auxquels ont été injectées par voie intradermique 15 souches staphylococciques ou 15 souches streptococciques.
Lapins vaccinés
avec du vaccin de mastite
Lapins témoins Vaccin No 4-3G
Staphylocoque Streptocoque Staphylocoque Streptocoque
lOx 25x 20x 20x 15 10 0 0 10 20x 0 5
25x 30x 0 30x 25x 20 10 10 5 0 10 5
5 50x 10 10 15 10 10 5 5 0 0 0
35x 20x 40x 10 20x lOx 10 0 5 0 0 0 40x 30x 30x 25x 20x 15 5 5 5 0 0 0
Observé une rougeur Pas de rougeur
Injection de 15 souches de Staphylocoques, dilution 1 : 75 0, 1 ml par point.
Injection de Streptocoques, dilution 1 : 50 0, 1 ml par point.
Il est évident que l'on obtient un degré de protection élevé avec les vaccins de la présente invention. On a constaté que les vaccins antigènes somatiques préparés à l'aide du procédé de la présente invention sont plus efficaces que les vaccins conventionnels correspondants entièrement bactériens et provoquent moins de réactions secondaires chez l'homme que les vaccins conventionnels entièrement bactériens.
La méthode d'essai pour le vaccin méningococcique consistait à immuniser 60 souris, en utilisant 20 souris pour chacune des 3 dilutions séparées comme indiqué dans le tableau 1. Vingt souris ont été conservées comme témoins. Deux à trois semaines plus tard, les animaux ont été traités par une souche méningococcique vivante virulente (Neisseria meningitidis) et les animaux mis en observation pendant une semaine. Les résultats d'un essai typique sont consignés dans le tableau 1.
Exemple 5
Préparation d'un vaccin streptococcique
Souches humaines utilisées Type A 36 1118
Type A 19 616
Type A 12 602
Des ampoules lyophilisées ont servi à ensemencer des flacons de bouillon à base d'infusion de coeur et ont été cultivées à 37O C pendant une nuit. 10 ml de culture ont été ajoutés à chacun des lots de 500ml de milieu de
Frantz renfermant 2 % de glycine et ils ont été mis à incuber pendant 20 heures à 37 C sur un agitateur à secousses. On a procédé au dénombrement des organismes vivants et ajouté suffisamment de solution mère de (Merthiolate)) I : 100 pour avoir une concentration finale de 1 : 10000. Les flacons ont été maintenus à la température ambiante jusqu'à achèvement de la lyse, ce qui a nécessité 7 à 10 jours.
Les contrôles de stérilité, de toxicité, de sécurité et d'efficacité ont été effectués après que les organismes eurent été complètement lyses.
Exemple 6
Des souches d'Escherichia coli (E. coli) ont été cultivées sur un milieu de Frantz modifié comme dans 1'exemple 1. On a ajouté au milieu suffisamment de glycine pour avoir une concentration de 1, 5 % de poids/volume. L'incubation a été effectuée à 37 C pendant 18 à 24 heures sur un agitateur à secousses. On a ensuite ajouté du Merthiolate > pour avoir une concentration finale de 1 : 10000. Les cultures ont été ensuite remises à l'incubation sur un agitateur à secousses pendant 18 à 24 heures. Des contrôles de viabilité ont été effectués à ce stade pour s'assurer de l'inactivation de toutes les bactéries.
Pendant qu'elles se trouvaient encore sur l'agitateur à secousses on a ajouté aux flacons en une ou deux fois un enzyme protéolytique provenant du
Streptomyces griseus. Entre les additions on a ajouté avec agitation pendant 24 heures un total de 10 microgrammes de l'enzyme. On a poursuivi l'agitation pendant 1 à 3 jours jusqu'à achèvement de la lyse. On a recueilli un vaccin relativement limpide qui a été reconnu efficace pour la protection des souris contre le traitement par des souches d'E. coli homologues de la souche du vaccin. Dans le tableau 4, on donne un exemple d'un essai typique. Ce vaccin peut être ajouté en faible proportion à un vaccin de mastite étant donné que l'E. coli peut, dans certains cas, être responsable de la mastite bovine.
Il peut également trouver une utilisation chez l'homme pour la lutte contre la diarrhée infantile provoquée par FE. coli.
Résultats Tableau 4
Souche d'Escherichia coli Résultats de l'injection
Souche ? Vaccin Injection Nombre de souris Survivants
A 634760 0-26 0-26 10 9
Témoin-0-26 10 0
B 634760 0-26 0-26 9 7
Témoin-0-26 10 0 Exerttple 7
PrÚparation du vaccin du charbon
Germe
Cinq souches de Clostridium chauvoei à savoir u WHW . F) > . Deal, Oklahoma et Tosper ont été cultivées en bouillon de foie au thioglycolate pendant 24 heures à 37O C. Ces cultures de germe ont été ensuite utilisées pour l'ensemencement du milieu de production à raison de 1. 0 ml par 100 ml de milieu.
La composition du milieu de production est la suivante :
IngrÚdients % en poids/volume Tryptone 4, 0
Chlorure de sodium 0, 5
Extrait de levure 0, 5 (Amber X)
L-Cystéine 0, 05
Glycine 0, 25-0, 75 (varie selon la souche) MgSOX. 7HaO 0,
Dextrose 0, 5 (ajouté de façon aseptique à partir
d'une solution mère stérile à 50 il0).
Le pH a été ajusté à 7. 8 avec NaOH5N avant mise à l'autoclave pendant l5 mn à 121 < C en vue de la stérilisation.
Référence J. Comp. Path. 67. 157 (1957) Prodluction
Les cultures de production ont été cultivées pendant 24 heures à 37 C et ensuite inactivées à l'aide de formaline a 0. 5 %. On a ajouté alors de la o Pronase à raison de 5. 0 mcg/ml Ó partir d'une solution mère renfermant 0. 25 mg/ml. Après addition de l'enzyme. le pH a été ajusté à 0. 8L avec NaOH5N. On a activé pendant une heure à 45"C dans un bain d'eau et laissé à la température ambiante pendant 7 à 10 jours, on a examiné journellement les variations de pH et ajusté au besoin. et on a suivi la progression de la lyse.
Lorsque la lyse a été totale. le lysat a été contrôlé de la manière habituelle quant à sa stérilité. sa sécurité et son efficacité.
Contrôle-Efficacité
Cinq cobayes ont été vaccinés par voie intramusculaire avec 1, 0 ml de vaccin de Clostridium chauvoei préparé à partir de cellules entièrement lycées comme décrit plus haut. Dix jours plus tard. on a administré par la meme voie une injection de rappel de I ml. Dix jours après l'injection de rappel. ces cinq cobayes ont reçu par voie intramusculaire, en même temps que cinq cobayes témoins non vaccinés, 0, 5 ml d'une suspension titrée de spore de Clostridium chauvoei renfermant 10 M. L. D. dans 0. 5 ml de suspension. Quatre (80 %) des cinq cobayes vaccinés ont survécu. Tous les cinq cobayes non vaccinés sont morts.
Exemple 8 Lyse avec d'arrtres aminoacides
Alors que la glycine est un aminoacide préféré, d'autres aminoacides peuvent accélérer la lyse de cellules bactériennes de la même manière pour fournir des vaccins utiles, comme l'indique le tableau 5.
Tableau 5
Nombre d'organismes
Souche Staph. Souche Staph.
Aminoacide Concentration"/o N"584763 N"596297 Lyse L.-Arginine 1. 7, 107 8, 5-10+
Acide D. L-Aspartique 2, 5 1 107 3 107
L-Histidine 1, 5 1 X 10 8 X 10-
D. L-Valine 3, 0 5 Y 108-10+
L-proline 3, 0 2 X106X10-
Glycine (témoin) 3, 5 2 L 107 12 vx lOi
D'autres souches de bactéries ayant été utilisées pour la préparation de vaccins utiles sont les suivantes :
Staphylococcus 1645, 591714, 598022, 597497, 595354,
598074, 6003.
Streptococcus 1510T35, 589T1, 601T11, 618T22,
599T9.
Meningococcus D2 (Lapeyssonnie), Ml 11, N1 (Lapeys
sonnie), 962 (Brannon), M132 (Lapeys sonnie).
Des bactéries présentant un intérêt particulier sont celles des familles : Micrococcaceae, Lactobacteriaceae.
Bacillaceae et Enterobacteriaceae. Dans ces familles on trouve les espèces Neisseria. Staphylococcus. Streptococcus, Escherichia et Clostridium.