CN115144591A - 用于检测新冠病毒SARS-CoV-2的试纸条和试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种用于检测新冠病毒SARS‑CoV‑2的试纸条和试剂盒。其中，该试纸条包括N检测线和S检测线，N检测线包被N蛋白重组抗原，S检测线包被S蛋白重组抗原。能够直接对针对N蛋白的IgM(N IgM)抗体和针对S蛋白的IgM(S IgM)抗体进行区分，在检测IgM抗体是否为阳性的同时，排除因接种非灭活疫苗而产生的S IgM抗体阳性情况。能够解决现有技术中需要分次检测，检测效率低的问题，适用于体外诊断领域。

Description

用于检测新冠病毒SARS-CoV-2的试纸条和试剂盒
技术领域
本发明涉及体外诊断领域，具体而言，涉及一种用于检测新冠病毒SARS-CoV-2的试纸条和试剂盒。
背景技术
新冠病毒SARS-CoV-2属于冠状病毒家族，含有棘突状蛋白(Spikeprotein，简称S蛋白)，膜蛋白(membrane protein，简称M蛋白)，包膜蛋白(Envelopeprotein，简称E蛋白)，核衣壳蛋白(Nucleocapsid protein，简称N蛋白)。新冠病毒SARS-CoV-2的致病过程是病毒S蛋白中的受体结合结构域(Receptor Binding Domain，简称RBD)和人体呼吸道上皮细胞表面的ACE2受体进行结合，启动和介导了病毒对人体细胞的入侵和致病。因此S-RBD蛋白是机体中和抗体阻断新冠病毒入侵的主要靶点。当机体受到新冠病毒感染后，会产生许多种抗体，包括针对N、S、E、M蛋白中多种抗原决定簇的抗体。
新冠病毒感染人体之后，首先会在呼吸道系统中繁殖，因此可以通过检测痰液、鼻咽拭子中的病毒核酸判断人体是否感染。感染一段时间后，一般是7-10天之后，人体会产生针对病毒的特异性抗体。免疫球蛋白M(IgM)抗体产生于感染初期，通常在病毒感染后的第7天左右出现，上升至一定程度后呈阳性，在第14天左右达到高峰。此后，在病人逐渐康复过程中IgM抗体也开始下降，且在病毒清除后快速减少并消失(呈阴性)。IgM抗体阳性，说明患者处于感染早期，所以使用免疫学检测方法能够检测这些特异性抗体，判断人体感染病毒的情况。
新型冠状病毒疫苗是指用新型冠状病毒相关组分制作的用于预防接种的生物制品，根据其特性可分为核酸mRNA疫苗、灭活疫苗、减毒流感病毒载体疫苗、腺病毒载体疫苗和重组亚单位多肽疫苗。新冠灭活疫苗能够对新冠病毒的许多蛋白包括N蛋白、S蛋白、M蛋白、E蛋白产生抗体。而非灭活疫苗，目前包括mRNA疫苗，腺病毒疫苗和重组蛋白疫苗均采用了S-RBD(S蛋白的受体结合结构域)作为免疫原，对这部分接种非灭活疫苗的接种者，体内能检测到S蛋白的抗体，N蛋白等其他抗原的检测结果为阴性。
对于血清IgM抗体检测，在接种非灭活疫苗人群中，如果IgM抗体检测结果为阳性，可能为接种疫苗或病毒感染导致。为了区分接种非灭活疫苗人群(主要是针对S-RBD的疫苗)出现阳性系接种疫苗还是感染所致，需要再进行针对N蛋白的IgM抗体检测。基于此，需要一种产品可以直接对针对N蛋白的IgM(N IgM)抗体和针对S蛋白的IgM(S IgM)抗体进行区分，在检测IgM抗体是否为阳性的同时，排除因接种非灭活疫苗而产生的S IgM抗体阳性情况。且现有技术中，在进行血清抗体检测的试纸条中采用的多为全蛋白抗原，检测准确性较低，易发生漏检或错检。因此开发一种效率和准确率更高的血清抗体检测试纸条具有重要意义。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种用于检测新冠病毒SARS-CoV-2的试纸条和试剂盒，以解决现有技术中需要分次检测，检测效率低的问题。
为了实现上述目的，根据本发明的第一个方面，提供了一种用于检测新冠病毒SARS-CoV-2的试纸条，该试纸条包括N检测线和S检测线，N检测线包被N蛋白重组抗原，S检测线包被S蛋白重组抗原。
进一步地，，N蛋白重组抗原包括PA抗原、PB抗原或PC抗原中的至少2个；PA抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，PB抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，PC抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。
进一步地，PA抗原、PB抗原或PC抗原之间以蛋白接头连接，形成N蛋白重组抗原；优选地，N蛋白重组抗原为线性蛋白或环状蛋白。
进一步地，PA抗原、PB抗原、PC抗原和蛋白接头形成第一重组抗原单位，N蛋白重组抗原包括一个或多个第一重组抗原单位，第一重组抗原单位之间以蛋白接头连接；优选地，N蛋白重组抗原包括1-5个第一重组抗原单位；优选地，N蛋白重组抗原的序列如SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21或SEQ ID NO：23所示。
进一步地，S蛋白重组抗原包括PA1抗原、PB1抗原或PC1抗原中的至少2个；PA1抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示，PB1抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示，PC1抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示。
进一步地，PA1抗原、PB1抗原或PC1抗原之间以蛋白接头连接，形成S蛋白重组抗原；优选地，S蛋白重组抗原为线性蛋白或环状蛋白。
进一步地，PA1抗原、PB1抗原、PC1抗原和蛋白接头形成第二重组抗原单位，S蛋白重组抗原包括一个或多个第二重组抗原单位，第二重组抗原单位之间以蛋白接头连接；优选地，S蛋白重组抗原包括1-5个第二重组抗原单位；优选地，S蛋白重组抗原的序列如SEQID NO：8、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22或SEQ ID NO：24所示。
进一步地，蛋白接头包括10～15个氨基酸。
为了实现上述目的，根据本发明的第二个方面，提供了一种试剂盒，该试剂盒包括上述试纸条和待测样本稀释液。
进一步地，待测样本稀释液用于稀释待测样品，待测样本稀释液包括PBS缓冲液和表面活性剂S21；优选地，PBS缓冲液的浓度为0.01M，表面活性剂S21的浓度为0.1％w/v；更优选地，PBS缓冲液的pH为7.4，包括0.2g/L KH2PO4，2.9g/L Na2HPO4·12H2O，8g/L NaCl。
进一步地，待测样品包括血清、血浆或全血。
应用本发明的技术方案，利用上述检测新冠病毒SARS-CoV-2的试纸条，通过将两种蛋白置于同一试纸条上，不仅能提高检测效率，而且采用重组蛋白，相对于全蛋白具有检测准确性更高的优势。
具体实施方式
需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本发明。
如背景技术所提到的，现有技术中在进行血清抗体检测的试纸条中采用的多为全蛋白抗原，检测准确性较低，易发生漏检或错检。且需要分别对不同抗体进行检测，检测效率低。因而，在本申请中发明人尝试开发一种新的用于检测新冠病毒SARS-CoV-2的试纸条，在试纸条上包被N蛋白重组抗原和S蛋白重组抗原，能够同时对2种抗体进行检测，且利用上述重组抗原提高试纸条检测的准确性。因而提出了本申请的一系列保护方案。
在本申请第一种典型的实施方式中，提供了一种用于检测新冠病毒SARS-CoV-2的试纸条，该试纸条包括N检测线和S检测线，N检测线包被N蛋白重组抗原，S检测线包被S蛋白重组抗原。
在一种优选的实施例中，N蛋白重组抗原包括PA抗原、PB抗原或PC抗原中的至少2个；PA抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，PB抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，PC抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。
在上述用于检测新冠病毒SARS-CoV-2的试纸条中，包被有N蛋白重组抗原。在N蛋白重组抗原中含有PA抗原、PB抗原和PC抗原。上述3种抗原均为本申请从新冠病毒N的全蛋白(SEQ ID NO：9)中筛选出的优势表位抗原。针对现有的突变株的突变位点进行比对，筛选出上述未发生过突变的保守表位，利用蛋白接头连接3种抗原，获得了上述N蛋白重组抗原。相较于现有技术中利用全蛋白制备试纸条，该抗原的空间结构简单，3种抗原片段的空间构型互不影响，优势表位能够更好的展开和暴露出来。相较于全蛋白，上述N蛋白重组抗原能够与待测样品中的N IgM抗体的更高效率地结合，增加检测的准确性。
且在生产中，由于该重组抗原空间结构简单，因此在表达时对于重组抗原的修饰、折叠简单，在不同的表达环境、体系下，均易于完成正确的折叠。而全蛋白由于氨基酸数目多、分子量大，所需的修饰、折叠更为复杂。在实际生产中，由于表达该蛋白的细胞并非是该蛋白的实际来源新冠病毒，且在细胞中同时进行大量表达，蛋白容易发生不可预计的、错误的修饰或盘曲折叠，从而影响蛋白与抗原的结合能力，进而影响试纸条的检测准确性。
通过对现有新冠突变株变异位点的分析，发现上述3种优势表位抗原，均为新冠病毒N蛋白中结构稳定、不易发生变异的氨基酸片段，利用上述重组抗原制备的试纸条，对现有的多种新冠病毒均能够进行检测，且对于后续可能出现的其他新冠病毒变异株，也能起到较好的检测效果。
试纸条还可以包括质控线，质控线包被抗鸡IgY抗体。
在一种优选的实施例中，PA抗原、PB抗原或PC抗原之间以蛋白接头连接，形成N蛋白重组抗原；优选地，N蛋白重组抗原为线性蛋白或环状蛋白。
在一种优选的实施例中，PA抗原、PB抗原、PC抗原和蛋白接头形成第一重组抗原单位，N蛋白重组抗原包括一个或多个第一重组抗原单位，第一重组抗原单位之间以蛋白接头连接；优选地，N蛋白重组抗原包括1-5个第一重组抗原单位；优选地，N蛋白重组抗原的序列如SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21或SEQ ID NO：23所示。
在一种优选的实施例中，S蛋白重组抗原包括PA1抗原、PB1抗原或PC1抗原中的至少2个；PA1抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示，PB1抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示，PC1抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示。
在一种优选的实施例中，PA1抗原、PB1抗原或PC1抗原之间以蛋白接头连接，形成S蛋白重组抗原；优选地，S蛋白重组抗原为线性蛋白或环状蛋白。
在一种优选的实施例中，PA1抗原、PB1抗原、PC1抗原和蛋白接头形成第二重组抗原单位，S蛋白重组抗原包括一个或多个第二重组抗原单位，第二重组抗原单位之间以蛋白接头连接；优选地，S蛋白重组抗原包括1-5个第二重组抗原单位；优选地，S蛋白重组抗原的序列如SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22或SEQ ID NO：24所示。
与上述N蛋白重组抗原相同，对于S蛋白重组抗原的结构，为从新冠病毒S蛋白的全蛋白(SEQ ID NO：10)中筛选获得的优势表位抗原。通过蛋白接头的连接，形成与S IgM抗体结合效率高的重组抗原，利用上述S蛋白重组抗原制备的试纸条，能够更准确地完成对样本的检测，防止漏检、错检的发生。
试纸条的两条检测线上分别包被N蛋白重组抗原和S蛋白重组抗原，能够同时对样本中的S IgM抗体和N IgM抗体进行检测，达到通过一次检测即能区分2种抗体的检测要求。尤其是对于接种了非灭活疫苗的受试者，由于接种的非灭活疫苗会导致体内产生S IgM抗体，无法单独通过S IgM抗体的检测判读其是否被新冠病毒感染。利用上述包被N蛋白重组抗原和S蛋白重组抗原的试纸条，通过一次检测既能够判断感染情况，高效快捷，具有很高的应用价值。且同时对S IgM抗体和N IgM抗体进行检测，也能够防止体内由于某种抗体含量低、难以检出而导致的漏检。
在一种优选的实施例中，蛋白接头包括10～15个氨基酸。
蛋白接头包括现有技术中常见的蛋白接头(Linker)，能够提供一定的柔性以允许两侧的蛋白完成各自独立的功能，Linker序列过长可能会降低融合蛋白产量，同时会产生免疫原性问题；Linker序列过短可能会使2个蛋白间距太近，影响彼此高级结构的折叠，从而相互干扰，导致蛋白功能丧失，因此优选蛋白接头序列的氨基酸个数为10～15个。包括但不限于(GGGGS)n或(G)n。在上述N蛋白重组抗原中，PA抗原、PB抗原和PC抗原具有各自独立的空间结构和活性，各自发挥作用，因此其连接顺序可以随意组合。对于N蛋白重组抗原的结构，可以为由2个Linker连接而成的线性蛋白，也可以为3个Linker连接而成的环状蛋白，均不影响重组抗原活性。在重组抗原中的蛋白接头，可选择相同或不同的蛋白接头，均不影响重组抗原的结构和抗体结合能力。在上述S蛋白重组抗原中蛋白接头也发挥相同的作用，S蛋白重组抗原和N蛋白重组抗原可以相同或不同。
在本申请第二种典型的实施方式中，提供了一种试剂盒，该试剂盒包括上述试纸条和待测样本稀释液。
上述试纸条包括N检测线、S检测线，N检测线包被N蛋白重组抗原，S检测线包被S蛋白重组抗原。试纸条还可以包括质控线，质控线包被抗鸡IgY抗体。
在一种优选的实施例中，待测样本稀释液用于稀释待测样品，待测样本稀释液包括PBS缓冲液和表面活性剂S21；优选地，PBS缓冲液的浓度为0.01M，表面活性剂S21的浓度为0.1％w/v；更优选地，PBS缓冲液的pH为7.4，包括0.2g/L KH2PO4，2.9g/L Na2HPO4·12H2O，8g/L NaCl。
待测样本稀释液用于稀释待测样品，待测样本稀释液包括0.01M pH 7.4PBS(0.2g/L KH2PO4，2.9g/L Na2HPO4·12H2O，8g/L NaCl)、0.1％(w/v)表面活性剂S21。待测样本稀释液中的表面活性剂S21能够提高检测的灵敏度。
在一种优选的实施例中，待测样本稀释液用于稀释待测样品，待测样本稀释液包括0.01M pH 7.4PBS和0.1％w/v表面活性剂S21(聚氧乙烯月桂醚，购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，CAS号：9002-92-0)。
在一种优选的实施例中，试纸条用于区分N蛋白感染和S蛋白感染，试纸条检测线上N蛋白重组抗原包被浓度为1.0mg/mL，S蛋白重组抗原包被浓度为1.0mg/mL，质控线上抗鸡IgY抗体包被浓度为1.0mg/mL。
在一种优选的实施例中，待测样品包括血清、血浆或全血。
下面将结合具体的实施例来进一步详细解释本申请的有益效果。
实施例1试纸条的制备
1.抗原、抗体的制备和获取
N蛋白重组抗原(包括PA、PB、PC三种抗原的特异性识别片段)，为深圳市新产业生物医学工程股份有限公司生产。按照常规的重组蛋白表达的操作手段获得。具体地，可以从NCBI网站上查找新冠病毒N蛋白的全长序列SEQ ID NO：9，经过表位分析仅保留PA、PB、PC段抗原的氨基酸序列(分别为SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3)，并使用常规的蛋白接头将三段抗原连接起来，根据选择的抗原和接头序列查询对应的基因序列并进行人工合成，然后通过PCR反应，经克隆测序选择表达正确的克隆进行转化及蛋白表达，最后纯化出相应的重组蛋白。
S蛋白重组抗原(包括PA1、PB1、PC1三种抗原的特异性识别片段)，为深圳市新产业生物医学工程股份有限公司生产。按照常规的重组蛋白表达的操作手段获得。具体地，可以从NCBI网站上查找新冠病毒S蛋白的全长序列SEQ ID NO：10，经过表位分析仅保留PA1、PB1、PC1抗原的氨基酸序列(分别为SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6)，并使用常规蛋白接头将三段抗原连接起来，根据选择的抗原和接头序列查询对应的基因序列并进行人工合成，然后通过PCR反应，经克隆测序选择表达正确的克隆进行转化及蛋白表达，最后纯化出相应的重组蛋白。
新冠N蛋白全蛋白(SEQ ID NO：9)和新冠S蛋白全蛋白(SEQ ID NO：10)的表达，均利用常规的蛋白表达纯化方法制备获得。
利用常规的蛋白表达纯化方法制备获得重组蛋白，如表1所示。
表1
Figure BDA0003724177450000061
以N蛋白重组抗原(N1、N4)、S蛋白重组抗原(S1)为例：
N1包括PA、PB两种抗原的特异性识别片段，使用前述手段获得PA、PB(分别为SEQID NO：1、SEQ ID NO：2)的重组蛋白(SEQ ID NO：11)。
N4包括PA、PB、PC三种抗原的特异性识别片段，使用前述手段获得PA、PB、PC(分别为SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3)重复2次，形成PA-PB-PC-PA-PB-PC结构的重组蛋白(SEQ ID NO：17)，PA、PB和PC之间均使用蛋白接头进行连接。
S1包括PA1、PB1两种抗原的特异性识别片段，使用前述手段获得PA、PB(分别为SEQID NO：4、SEQ ID NO：5)的重组蛋白(SEQ ID NO：12)。
SEQ ID NO：1：DDQIGYYRRATRRIRGGDGK。
SEQ ID NO：2：DGIIWVATEGALNTPKDHIGTRNPANN。
SEQ ID NO：3：QTQGNFGDQELIRQGTDYKH。
SEQ ID NO：4：SKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYH。
SEQ ID NO：5：EVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYN。
SEQ ID NO：6：EIRASANLAATKMSECVLGQSKR。
SEQ ID NO：7：DDQIGYYRRATRRIRGGDGKGGGGSGGGGSDGIIWVATEGALNTPKDHIGTRNPANNGGGGSGGGGSQTQGNFGDQELIRQGTDYKH。
SEQ ID NO：8：SKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYH GGGGSGGGGSEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYN GGGGSGGGGS EIRASANLAATKMSECVLGQSKR。
SEQ ID NO：9：
MSDNGPQNQRNAPRITFGGPSDSTGSNQNGERSGARSKQRRPQGLPNNTASWFTALTQHGKEDLKFPRGQGVPINTNSSPDDQIGYYRRATRRIRGGDGKMKDLSPRWYFYYLGTGPEAGLPYGANKDGIIWVATEGALNTPKDHIGTRNPANNAAIVLQLPQGTTLPKGFYAEGSRGGSQASSRSSSRSRNSSRNSTPGSSRGTSPARMAGNGGDAALALLLLDRLNQLESKMSGKGQQQQGQTVTKKSAAEASKKPRQKRTATKAYNVTQAFGRRGPEQTQGNFGDQELIRQGTDYKHWPQIAQFAPSASAFFGMSRIGMEVTPSGTWLTYTGAIKLDDKDPNFKDQVILLNKHIDAYKTFPPTEPKKDKKKKADETQALPQRQKKQQTVTLLPAADLDDFSKQLQQSMSSADSTQA。
SEQ ID NO：10：
SQCVNLTTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNVTWFHAIHVSGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHKNNKSWMESEFRVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQGNFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDLPQGFSALEPLVDLPIGINITRFQTLLALHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLYQDVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLIGAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQTQTNSPRRARSVASQSIIAYTMSLGAENSVAYSNNSIAIPTNFTISVTTEILPVSMTKTSVDCTMYICGDSTECSNLLLQYGSFCTQLNRALTGIAVEQDKNTQEVFAQVKQIYKTPPIKDFGGFNFSQILPDPSKPSKRSFIEDLLFNKVTLADAGFIKQYGDCLGDIAARDLICAQKFNGLTVLPPLLTDEMIAQYTSALLAGTITSGWTFGAGAALQIPFAMQMAYRFNGIGVTQNVLYENQKLIANQFNSAIGKIQDSLSSTASALGKLQDVVNQNAQALNTLVKQLSSNFGAISSVLNDILSRLDKVEAEVQIDRLITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLAATKMSECVLGQSKRVDFCGKGYHLMSFPQSAPHGVVFLHVTYVPAQEKNFTTAPAICHDGKAHFPREGVFVSNGTHWFVTQRNFYEPQIITTDNTFVSGNCDVVIGIVNNTVYDPLQPELDSFKEELDKYFKNHTSPDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIKWP。
SEQ ID NO：11：DDQIGYYRRATRRIRGGDGK GGGGSGGGGSDGIIWVATEGALNTPKDHIGTRNPANN。
SEQ ID NO：12：SKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYH GGGGSGGGGSEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYN。
SEQ ID NO：13：DDQIGYYRRATRRIRGGDGKGGGGSGGGGSQTQGNFGDQELIRQGTDYKH。
SEQ ID NO：14：SKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHGGGGSGGGGSEIRASANLAATKMSECVLGQSKR。
SEQ ID NO：15：DGIIWVATEGALNTPKDHIGTRNPANNGGGGSGGGGSQTQGNFGDQELIRQGTDYKH。
SEQ ID NO：16：EVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNGGGGSGGGGSEIRASANLAATKMSECVLGQSKR。
SEQ ID NO：17：DDQIGYYRRATRRIRGGDGKGGGGSGGGGSDGIIWVATEGALNTPKDHIGTRNPANNGGGGSGGGGSQTQGNFGDQELIRQGTDYKHGGGGSGGGGSDDQIGYYRRATRRIRGGDGKGGGGSGGGGSDGIIWVATEGALNTPKDHIGTRNPANNGGGGSGGGGSQTQGNFGDQELIRQGTDYKH。
SEQ ID NO：18：SKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHGGGGSGGGGSEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNGGGGSGGGGSEIRASANLAATKMSECVLGQSKRGGGGSGGGGSSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHGGGGSGGGGSEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNGGGGSGGGGSEIRASANLAATKMSECVLGQSKR。
SEQ ID NO：19：DDQIGYYRRATRRIRGGDGKGGGGSGGGGSDGIIWVATEGALNTPKDHIGTRNPANNGGGGSGGGGSQTQGNFGDQELIRQGTDYKHGGGGSGGGGSDDQIGYYRRATRRIRGGDGKGGGGSGGGGSDGIIWVATEGALNTPKDHIGTRNPANNGGGGSGGGGSQTQGNFGDQELIRQGTDYKHGGGGSGGGGSDDQIGYYRRATRRIRGGDGKGGGGSGGGGSDGIIWVATEGALNTPKDHIGTRNPANNGGGGSGGGGSQTQGNFGDQELIRQGTDYKH。
SEQ ID NO：20：SKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHGGGGSGGGGSEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNGGGGSGGGGSEIRASANLAATKMSECVLGQSKRGGGGSGGGGSSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHGGGGSGGGGSEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNGGGGSGGGGSEIRASANLAATKMSECVLGQSKRGGGGSGGGGSSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHGGGGSGGGGSEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNGGGGSGGGGSEIRASANLAATKMSECVLGQSKR。
SEQ ID NO：21：DDQIGYYRRATRRIRGGDGKGGGGSGGGGSDGIIWVATEGALNTPKDHIGTRNPANNGGGGSGGGGSQTQGNFGDQELIRQGTDYKHGGGGSGGGGSDDQIGYYRRATRRIRGGDGKGGGGSGGGGSDGIIWVATEGALNTPKDHIGTRNPANNGGGGSGGGGSQTQGNFGDQELIRQGTDYKHGGGGSGGGGSDDQIGYYRRATRRIRGGDGKGGGGSGGGGSDGIIWVATEGALNTPKDHIGTRNPANNGGGGSGGGGSQTQGNFGDQELIRQGTDYKHGGGGSGGGGSDDQIGYYRRATRRIRGGDGKGGGGSGGGGSDGIIWVATEGALNTPKDHIGTRNPANNGGGGSGGGGSQTQGNFGDQELIRQGTDYKH。
SEQ ID NO：22：SKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHGGGGSGGGGSEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNGGGGSGGGGSEIRASANLAATKMSECVLGQSKRGGGGSGGGGSSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHGGGGSGGGGSEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNGGGGSGGGGSEIRASANLAATKMSECVLGQSKRGGGGSGGGGSSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHGGGGSGGGGSEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNGGGGSGGGGSEIRASANLAATKMSECVLGQSKRGGGGSGGGGSSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHGGGGSGGGGSEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNGGGGSGGGGSEIRASANLAATKMSECVLGQSKR。
SEQ ID NO：23：DDQIGYYRRATRRIRGGDGKGGGGSGGGGSDGIIWVATEGALNTPKDHIGTRNPANNGGGGSGGGGSQTQGNFGDQELIRQGTDYKHGGGGSGGGGSDDQIGYYRRATRRIRGGDGKGGGGSGGGGSDGIIWVATEGALNTPKDHIGTRNPANNGGGGSGGGGSQTQGNFGDQELIRQGTDYKHGGGGSGGGGSDDQIGYYRRATRRIRGGDGKGGGGSGGGGSDGIIWVATEGALNTPKDHIGTRNPANNGGGGSGGGGSQTQGNFGDQELIRQGTDYKHGGGGSGGGGSDDQIGYYRRATRRIRGGDGKGGGGSGGGGSDGIIWVATEGALNTPKDHIGTRNPANNGGGGSGGGGSQTQGNFGDQELIRQGTDYKHGGGGSGGGGSDDQIGYYRRATRRIRGGDGKGGGGSGGGGSDGIIWVATEGALNTPKDHIGTRNPANNGGGGSGGGGSQTQGNFGDQELIRQGTDYKH。
SEQ ID NO：24：SKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHGGGGSGGGGSEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNGGGGSGGGGSEIRASANLAATKMSECVLGQSKRGGGGSGGGGSSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHGGGGSGGGGSEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNGGGGSGGGGSEIRASANLAATKMSECVLGQSKRGGGGSGGGGSSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHGGGGSGGGGSEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNGGGGSGGGGSEIRASANLAATKMSECVLGQSKRGGGGSGGGGSSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHGGGGSGGGGSEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNGGGGSGGGGSEIRASANLAATKMSECVLGQSKRGGGGSGGGGSSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHGGGGSGGGGSEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNGGGGSGGGGSEIRASANLAATKMSECVLGQSKR。
本申请中使用的鼠抗人IgM抗体，来源于深圳盛源生物技术有限公司，货号：M2030；鸡IgY抗体来源于科桥(厦门)生物技术有限公司，货号：QTAB-0104；抗鸡IgY抗体来源于科桥(厦门)生物技术有限公司；货号：QTAB-0203。
2.胶体金制备：采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金；
以生产1000mL胶体金为例，胶体金配制前，在三口圆底烧瓶中加入适量超纯水，煮沸后将沸水倒掉。量取990g的超纯水(体积＝质量÷理论密度)至三口圆底烧瓶中，准确称取10mL 1％氯金酸溶液加入三口圆底烧瓶中，并安装好冷凝回流装置。打开冷凝回流，在340℃，300rpm参数下搅拌加热至沸腾(连续产生大量气泡)，沸腾后在三口圆底烧瓶中加入10mL 1％柠檬酸钠二水合物溶液，待溶液变色后开始计时，15分钟后停止加热。室温下冷却后即得胶体金。
3.免疫胶体金制备：
①检测线(N线和S线)免疫胶体金制备：取10mL胶体金溶液，加入20μL 0.2mol/L碳酸钾溶液，再加入100μL浓度1mg/mL的鼠抗人IgM抗体，室温下在磁力搅拌器上搅拌反应10分钟。再加入100μL 10％BSA溶液混合均匀，在室温下封闭30分钟，然后4℃，10000rpm条件下离心15分钟。离心完成后弃去上清，将沉淀重悬于2mL金标复溶液中，4℃避光保存。金标复溶液成分为100mmol/L的pH8.0 Tris-HCl，3％海藻糖，3％蔗糖，0.2％酪蛋白钠盐，0.1％吐温-20，0.5％PEG6000。
②质控线免疫胶体金制备：取10mL胶体金溶液，加入20μL 0.2mol/L碳酸钾溶液，再加入100μL浓度1mg/mL的兔抗鸡IgY抗体，室温下在磁力搅拌器上搅拌反应10分钟。再加入100μL 10％BSA溶液混合均匀，在室温下封闭30分钟，然后4℃，10000rpm条件下离心15分钟。离心完成后弃去上清，将沉淀重悬于2mL金标复溶液中，4℃避光保存。金标复溶液成分为100mmol/L的pH8.0 Tris-HCl，3％海藻糖，3％蔗糖，0.2％酪蛋白钠盐，0.1％吐温-20，0.5％PEG6000。
③将制备好的检测线免疫胶体金与质控线免疫胶体金按照7：3比例混匀后备用。
4.免疫胶体金垫制备：
①金标垫预处理：将金标垫裁切为30cm×0.68cm的金标垫条，使用喷金划膜仪对每条金标垫进行预处理，金标结合垫预处理液喷量20μL/cm，将预处理后的金标垫转移至鼓风干燥箱中，50℃干燥16小时。金标结合垫预处理液成分为100mmol/L的pH7.4 PBS，3％海藻糖，0.2％酪蛋白钠盐，0.1％吐温-20，0.5％PEG6000，0.01％阻断剂。
②免疫胶体金喷涂：使用喷金划膜仪对每条预处理过的金标垫进行喷金，免疫胶体金喷量33μL/cm。喷金结束后，将免疫胶体金垫置于鼓风干燥箱中，50℃干燥16小时。干燥完成后，将免疫胶体金垫转移至电子防潮箱中保存备用。
5.免疫NC膜制备：
①贴膜：将NC膜(硝酸纤维素膜)裁切后粘贴至PVC底板相应位置。
②划膜包被液配制：划膜包被稀释液为0.01M的PB缓冲液。使用0.01M的PB缓冲液，将N蛋白重组抗原配制成1.0mg/mL浓度，为N线划膜包被液；使用0.01M的PB缓冲液，将S蛋白重组抗原配制成1.0mg/mL浓度，为S线划膜包被液；使用0.01M的PB缓冲液，将鸡IgY抗体配制成1.0mg/mL浓度，为质控线划膜包被液。
③划膜：将检测线(N线和S线)和质控线划膜包被液分别注入喷金划膜仪，设定划膜量为1μL/cm，移动速度为40mm/s，进行喷膜。
④将划膜后的免疫NC膜大板转移到45℃鼓风干燥箱干燥24h，干燥完成后，将免疫NC膜转移至电子防潮箱中保存备用。
6.样品垫预处理：
配制样品垫预处理液，样品垫放入样品垫预处理液中浸透，用镊子将样品垫取出沥干水，放置在筛网上于45℃干燥箱烘干过夜，干燥后裁切成2cm*30cm规格收集到干燥箱中保存备用。样品垫预处理液配方为：0.3％氯化钠，0.5％聚乙烯吡咯烷酮，0.2％吐温-20，1mg/mL抗RBC抗体(购自杭州隆基生物技术有限公司)。
7.大板组装：
将干燥后的免疫NC膜、样品垫、金标垫、吸水垫依次粘贴好。
8.切条组卡：
使用可编程切条机，设置斩切宽度4.0mm，将大板放在可编程切条机上进行切条。将切好的试纸条装在塑料卡底盖的相应位置并卡好，扣好上盖并压紧后置于防潮箱备用。制备得到含有N蛋白重组抗原和S蛋白重组抗原包被的N线和S线的试纸条。
9.试纸条制作
1)重复上述制备过程，利用新冠N蛋白全蛋白(SEQ ID NO：7)和新冠S蛋白全蛋白(SEQ ID NO：8)，制备得到含有全蛋白包被的N线和S线的试纸条。
2)重复上述制备过程，制备得到不同重组抗原包被的试纸条，如表2所示。
表2
试纸条编号 N蛋白重组抗原 选取表位 S蛋白重组抗原 选取表位
NS1 N1 PA+PB S1 PA1+PB1
NS2 N2 PA+PC S2 PA1+PC1
NS3 N3 PB+PC S3 PB1+PC1
NS4 N4 (PA+PB+PC)2 S4 (PA1+PB1+PC1)2
NS5 N5 (PA+PB+PC)3 S5 (PA1+PB1+PC1)3
NS6 N6 (PA+PB+PC)4 S6 (PA1+PB1+PC1)4
NS7 N7 (PA+PB+PC)5 S7 (PA1+PB1+PC1)5
11.样本稀释液的配制
样本稀释液为pH 7.4的0.01M PBS(0.2g/L KH2PO4，2.9g/L Na2HPO4·12H2O；8g/LNaCl)，0.1％(w/v)表面活性剂S21。
实施例2抗干扰及变异株检出率验证
样本中的新型冠状病毒抗体加入到样品垫后，由于毛细作用进入到金标垫，不同蛋白的抗体会与金标垫上胶体金标记的二抗反应结合，同时由于毛细作用继续进入NC膜(硝酸纤维素膜)，在NC膜上开始层析。当结合后的复合分子经过对应的检测线时，会与该检测线上的抗原发生免疫反应实现捕获，而非对应的抗体则不会发生免疫反应，复合分子则继续在NC膜上层析。当检测线上捕获的对应复合分子数量累积到一定数量时，则会显示胶体金颜色。试纸条上的C线，则通过捕获未反应的胶体金颗粒，或者捕获其专门标记的胶体金颗粒显色。
本申请中，目测结果判断和软件结果判读的标准如表3所示。
表3
Figure BDA0003724177450000121
针对新型冠状病毒的S蛋白IgM抗体、N蛋白IgM抗体、SARS IgM抗体、S蛋白、N蛋白IgM混合抗体、甲流IgM抗体、乙流IgM抗体、呼吸合胞病毒IgM抗体等进行检测，另外针对分别针对变异株Omicron、Delta、Alpha、Beta的IgM抗体进行检测，每种抗体平行测试3支试纸条。
使用pH7.4 0.01M PBS将各待测抗体稀释到0.1mg/mL浓度，吸取各样本各75μL，分别加入检测试纸条的样品垫区。反应10分钟后，肉眼读取试纸条上的显色结果，如表4所示。
表4
Figure BDA0003724177450000122
Figure BDA0003724177450000131
实施例3样本稀释液灵敏度验证
利用按照实施例1制备方法制备的试纸，和仅使用0.01M PBS(pH 7.4)作为样本稀释液的对照试纸，对检测灵敏度作比对，使用同一份强阳样本分别用各自的稀释液进行梯度稀释后测试，结果见表5。
表5
Figure BDA0003724177450000132
可见，在样本稀释液中加入非离子型表面活性剂0.1％(m/v)S21后，由于S21具有良好的增溶和乳化性，检测灵敏度较仅使用0.01M PBS(pH 7.4)作为样本稀释液的现有技术显著提高。
实施例4抗体检测试纸条检出率
收集20例急性感染新冠(28天内感染新冠病毒)的全血样本和核酸样本，分别使用上述制备的含有N蛋白重组抗原和S蛋白重组抗原包被的N线和S线的试纸条和核酸试剂盒(新产业生物自产，货号：132101005HB)进行测试。结果如表6所示。
表6
Figure BDA0003724177450000133
Figure BDA0003724177450000141
针对收集样本的血浆、血清检测结果与上述全血结果无差异。
实施例5抗体检测试纸条的样本区分测试
使用上述试纸条对50例近期(7-14d)接种非灭活疫苗的健康血清，50例近期接种疫苗且感染的血清，以及50例未接种疫苗的健康血清进行测试，结果如表7所示。
表7
Figure BDA0003724177450000142
Figure BDA0003724177450000151
使用含有全蛋白包被的N线和S线的对照试纸条对上述样本进行检测，结果如表8所示。
表8
Figure BDA0003724177450000152
Figure BDA0003724177450000161
如表8所示，在接种未感染组中，S IgM抗体未检出率为8％(接种未感染14、33、42、47)；在接种感染组，S IgM抗体和/或N IgM抗体未检出率为16％(接种感染8、16、23、24、27、44、47、50)。尤其是在接种感染24中，对于S IgM抗体和N IgM抗体均未检出。说明使用包被全蛋白制备的对照试纸条的区分度较弱，利用N全蛋白或S全蛋白进行检测，检测准确性均较低。
而如表8所示，利用上述利用N蛋白重组抗原和S蛋白重组抗原制备的试纸条，对于三种人群的检测准确率均为100％。能够同时、准确检测S IgM抗体和N IgM抗体，很好的区分接种非灭活疫苗人群。
实施例6
使用其他重组蛋白包被的试纸条针对50例近期感染新冠的阳性样本进行检测，检测方法和样品同实施例5，结果如表9所示：
表9
Figure BDA0003724177450000162
Figure BDA0003724177450000171
如表9所示，仅使用两种抗原包被的试剂条NS1、NS2和NS3的检出率均较低，推测原因为仅使用两个表位的重组蛋白极易导致漏检。试剂条NS4、NS5、NS6、NS7中，NS4的检出率最高，接近实施例5中N蛋白重组抗原和S蛋白重组抗原制备的试纸条，NS7的检出率较NS4、NS5、NS6较低，原因可能为由于该重组蛋白的抗原位点被掩蔽，导致漏检。
从以上的描述中，可以看出，本发明上述的实施例实现了如下技术效果：本发明中在试纸条上包被N蛋白重组抗原和S蛋白重组抗原，2种重组蛋白相较于N全蛋白和S全蛋白以及仅重组表达两个表位的蛋白，对于S IgM抗体和N IgM抗体的结合能力均有提高，利用2种重组蛋白制备的试纸条可以有效避免漏检情况，具有更高的检测准确性。因而提出了本申请的一系列保护方案。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 深圳市新产业生物医学工程股份有限公司
<120> 用于检测新冠病毒SARS-CoV-2的试纸条和试剂盒
<130> PN185475SZSW
<160> 24
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> VARIANT
<222> (1)..(20)
<223> PA抗原
<400> 1
Asp Asp Gln Ile Gly Tyr Tyr Arg Arg Ala Thr Arg Arg Ile Arg Gly
1 5 10 15
Gly Asp Gly Lys
20
<210> 2
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> VARIANT
<222> (1)..(27)
<223> PB抗原
<400> 2
Asp Gly Ile Ile Trp Val Ala Thr Glu Gly Ala Leu Asn Thr Pro Lys
1 5 10 15
Asp His Ile Gly Thr Arg Asn Pro Ala Asn Asn
20 25
<210> 3
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> VARIANT
<222> (1)..(20)
<223> PC抗原
<400> 3
Gln Thr Gln Gly Asn Phe Gly Asp Gln Glu Leu Ile Arg Gln Gly Thr
1 5 10 15
Asp Tyr Lys His
20
<210> 4
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> VARIANT
<222> (1)..(35)
<223> PA1抗原
<400> 4
Ser Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn Val Val
1 5 10 15
Ile Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu Gly Val
20 25 30
Tyr Tyr His
35
<210> 5
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> VARIANT
<222> (1)..(31)
<223> PB1抗原
<400> 5
Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg
1 5 10 15
Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn
20 25 30
<210> 6
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> VARIANT
<222> (1)..(23)
<223> PC1抗原
<400> 6
Glu Ile Arg Ala Ser Ala Asn Leu Ala Ala Thr Lys Met Ser Glu Cys
1 5 10 15
Val Leu Gly Gln Ser Lys Arg
20
<210> 7
<211> 87
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> VARIANT
<222> (1)..(87)
<223> N蛋白重组抗原
<400> 7
Asp Asp Gln Ile Gly Tyr Tyr Arg Arg Ala Thr Arg Arg Ile Arg Gly
1 5 10 15
Gly Asp Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Gly
20 25 30
Ile Ile Trp Val Ala Thr Glu Gly Ala Leu Asn Thr Pro Lys Asp His
35 40 45
Ile Gly Thr Arg Asn Pro Ala Asn Asn Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
50 55 60
Gly Gly Ser Gln Thr Gln Gly Asn Phe Gly Asp Gln Glu Leu Ile Arg
65 70 75 80
Gln Gly Thr Asp Tyr Lys His
85
<210> 8
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> VARIANT
<222> (1)..(109)
<223> S蛋白重组抗原
<400> 8
Ser Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn Val Val
1 5 10 15
Ile Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu Gly Val
20 25 30
Tyr Tyr His Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Phe
35 40 45
Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile
50 55 60
Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Gly Gly Gly Gly
65 70 75 80
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Arg Ala Ser Ala Asn Leu Ala Ala
85 90 95
Thr Lys Met Ser Glu Cys Val Leu Gly Gln Ser Lys Arg
100 105
<210> 9
<211> 419
<212> PRT
<213> Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2
<400> 9
Met Ser Asp Asn Gly Pro Gln Asn Gln Arg Asn Ala Pro Arg Ile Thr
1 5 10 15
Phe Gly Gly Pro Ser Asp Ser Thr Gly Ser Asn Gln Asn Gly Glu Arg
20 25 30
Ser Gly Ala Arg Ser Lys Gln Arg Arg Pro Gln Gly Leu Pro Asn Asn
35 40 45
Thr Ala Ser Trp Phe Thr Ala Leu Thr Gln His Gly Lys Glu Asp Leu
50 55 60
Lys Phe Pro Arg Gly Gln Gly Val Pro Ile Asn Thr Asn Ser Ser Pro
65 70 75 80
Asp Asp Gln Ile Gly Tyr Tyr Arg Arg Ala Thr Arg Arg Ile Arg Gly
85 90 95
Gly Asp Gly Lys Met Lys Asp Leu Ser Pro Arg Trp Tyr Phe Tyr Tyr
100 105 110
Leu Gly Thr Gly Pro Glu Ala Gly Leu Pro Tyr Gly Ala Asn Lys Asp
115 120 125
Gly Ile Ile Trp Val Ala Thr Glu Gly Ala Leu Asn Thr Pro Lys Asp
130 135 140
His Ile Gly Thr Arg Asn Pro Ala Asn Asn Ala Ala Ile Val Leu Gln
145 150 155 160
Leu Pro Gln Gly Thr Thr Leu Pro Lys Gly Phe Tyr Ala Glu Gly Ser
165 170 175
Arg Gly Gly Ser Gln Ala Ser Ser Arg Ser Ser Ser Arg Ser Arg Asn
180 185 190
Ser Ser Arg Asn Ser Thr Pro Gly Ser Ser Arg Gly Thr Ser Pro Ala
195 200 205
Arg Met Ala Gly Asn Gly Gly Asp Ala Ala Leu Ala Leu Leu Leu Leu
210 215 220
Asp Arg Leu Asn Gln Leu Glu Ser Lys Met Ser Gly Lys Gly Gln Gln
225 230 235 240
Gln Gln Gly Gln Thr Val Thr Lys Lys Ser Ala Ala Glu Ala Ser Lys
245 250 255
Lys Pro Arg Gln Lys Arg Thr Ala Thr Lys Ala Tyr Asn Val Thr Gln
260 265 270
Ala Phe Gly Arg Arg Gly Pro Glu Gln Thr Gln Gly Asn Phe Gly Asp
275 280 285
Gln Glu Leu Ile Arg Gln Gly Thr Asp Tyr Lys His Trp Pro Gln Ile
290 295 300
Ala Gln Phe Ala Pro Ser Ala Ser Ala Phe Phe Gly Met Ser Arg Ile
305 310 315 320
Gly Met Glu Val Thr Pro Ser Gly Thr Trp Leu Thr Tyr Thr Gly Ala
325 330 335
Ile Lys Leu Asp Asp Lys Asp Pro Asn Phe Lys Asp Gln Val Ile Leu
340 345 350
Leu Asn Lys His Ile Asp Ala Tyr Lys Thr Phe Pro Pro Thr Glu Pro
355 360 365
Lys Lys Asp Lys Lys Lys Lys Ala Asp Glu Thr Gln Ala Leu Pro Gln
370 375 380
Arg Gln Lys Lys Gln Gln Thr Val Thr Leu Leu Pro Ala Ala Asp Leu
385 390 395 400
Asp Asp Phe Ser Lys Gln Leu Gln Gln Ser Met Ser Ser Ala Asp Ser
405 410 415
Thr Gln Ala
<210> 10
<211> 1201
<212> PRT
<213> Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2
<400> 10
Ser Gln Cys Val Asn Leu Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr
1 5 10 15
Thr Asn Ser Phe Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg
20 25 30
Ser Ser Val Leu His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser
35 40 45
Asn Val Thr Trp Phe His Ala Ile His Val Ser Gly Thr Asn Gly Thr
50 55 60
Lys Arg Phe Asp Asn Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe
65 70 75 80
Ala Ser Thr Glu Lys Ser Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr
85 90 95
Thr Leu Asp Ser Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr
100 105 110
Asn Val Val Ile Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe
115 120 125
Leu Gly Val Tyr Tyr His Lys Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu
130 135 140
Phe Arg Val Tyr Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser
145 150 155 160
Gln Pro Phe Leu Met Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn
165 170 175
Leu Arg Glu Phe Val Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr
180 185 190
Ser Lys His Thr Pro Ile Asn Leu Val Arg Asp Leu Pro Gln Gly Phe
195 200 205
Ser Ala Leu Glu Pro Leu Val Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr
210 215 220
Arg Phe Gln Thr Leu Leu Ala Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly
225 230 235 240
Asp Ser Ser Ser Gly Trp Thr Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly
245 250 255
Tyr Leu Gln Pro Arg Thr Phe Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr
260 265 270
Ile Thr Asp Ala Val Asp Cys Ala Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr Lys
275 280 285
Cys Thr Leu Lys Ser Phe Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser
290 295 300
Asn Phe Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile
305 310 315 320
Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala
325 330 335
Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp
340 345 350
Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr
355 360 365
Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr
370 375 380
Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro
385 390 395 400
Gly Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp
405 410 415
Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys
420 425 430
Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn
435 440 445
Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly
450 455 460
Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu
465 470 475 480
Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr
485 490 495
Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val
500 505 510
Cys Gly Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn
515 520 525
Phe Asn Phe Asn Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn
530 535 540
Lys Lys Phe Leu Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr
545 550 555 560
Thr Asp Ala Val Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr
565 570 575
Pro Cys Ser Phe Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Thr
580 585 590
Ser Asn Gln Val Ala Val Leu Tyr Gln Asp Val Asn Cys Thr Glu Val
595 600 605
Pro Val Ala Ile His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Thr Trp Arg Val Tyr
610 615 620
Ser Thr Gly Ser Asn Val Phe Gln Thr Arg Ala Gly Cys Leu Ile Gly
625 630 635 640
Ala Glu His Val Asn Asn Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala
645 650 655
Gly Ile Cys Ala Ser Tyr Gln Thr Gln Thr Asn Ser Pro Arg Arg Ala
660 665 670
Arg Ser Val Ala Ser Gln Ser Ile Ile Ala Tyr Thr Met Ser Leu Gly
675 680 685
Ala Glu Asn Ser Val Ala Tyr Ser Asn Asn Ser Ile Ala Ile Pro Thr
690 695 700
Asn Phe Thr Ile Ser Val Thr Thr Glu Ile Leu Pro Val Ser Met Thr
705 710 715 720
Lys Thr Ser Val Asp Cys Thr Met Tyr Ile Cys Gly Asp Ser Thr Glu
725 730 735
Cys Ser Asn Leu Leu Leu Gln Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu Asn
740 745 750
Arg Ala Leu Thr Gly Ile Ala Val Glu Gln Asp Lys Asn Thr Gln Glu
755 760 765
Val Phe Ala Gln Val Lys Gln Ile Tyr Lys Thr Pro Pro Ile Lys Asp
770 775 780
Phe Gly Gly Phe Asn Phe Ser Gln Ile Leu Pro Asp Pro Ser Lys Pro
785 790 795 800
Ser Lys Arg Ser Phe Ile Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val Thr Leu
805 810 815
Ala Asp Ala Gly Phe Ile Lys Gln Tyr Gly Asp Cys Leu Gly Asp Ile
820 825 830
Ala Ala Arg Asp Leu Ile Cys Ala Gln Lys Phe Asn Gly Leu Thr Val
835 840 845
Leu Pro Pro Leu Leu Thr Asp Glu Met Ile Ala Gln Tyr Thr Ser Ala
850 855 860
Leu Leu Ala Gly Thr Ile Thr Ser Gly Trp Thr Phe Gly Ala Gly Ala
865 870 875 880
Ala Leu Gln Ile Pro Phe Ala Met Gln Met Ala Tyr Arg Phe Asn Gly
885 890 895
Ile Gly Val Thr Gln Asn Val Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Leu Ile Ala
900 905 910
Asn Gln Phe Asn Ser Ala Ile Gly Lys Ile Gln Asp Ser Leu Ser Ser
915 920 925
Thr Ala Ser Ala Leu Gly Lys Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala
930 935 940
Gln Ala Leu Asn Thr Leu Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala
945 950 955 960
Ile Ser Ser Val Leu Asn Asp Ile Leu Ser Arg Leu Asp Lys Val Glu
965 970 975
Ala Glu Val Gln Ile Asp Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu
980 985 990
Gln Thr Tyr Val Thr Gln Gln Leu Ile Arg Ala Ala Glu Ile Arg Ala
995 1000 1005
Ser Ala Asn Leu Ala Ala Thr Lys Met Ser Glu Cys Val Leu Gly Gln
1010 1015 1020
Ser Lys Arg Val Asp Phe Cys Gly Lys Gly Tyr His Leu Met Ser Phe
1025 1030 1035 1040
Pro Gln Ser Ala Pro His Gly Val Val Phe Leu His Val Thr Tyr Val
1045 1050 1055
Pro Ala Gln Glu Lys Asn Phe Thr Thr Ala Pro Ala Ile Cys His Asp
1060 1065 1070
Gly Lys Ala His Phe Pro Arg Glu Gly Val Phe Val Ser Asn Gly Thr
1075 1080 1085
His Trp Phe Val Thr Gln Arg Asn Phe Tyr Glu Pro Gln Ile Ile Thr
1090 1095 1100
Thr Asp Asn Thr Phe Val Ser Gly Asn Cys Asp Val Val Ile Gly Ile
1105 1110 1115 1120
Val Asn Asn Thr Val Tyr Asp Pro Leu Gln Pro Glu Leu Asp Ser Phe
1125 1130 1135
Lys Glu Glu Leu Asp Lys Tyr Phe Lys Asn His Thr Ser Pro Asp Val
1140 1145 1150
Asp Leu Gly Asp Ile Ser Gly Ile Asn Ala Ser Val Val Asn Ile Gln
1155 1160 1165
Lys Glu Ile Asp Arg Leu Asn Glu Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser
1170 1175 1180
Leu Ile Asp Leu Gln Glu Leu Gly Lys Tyr Glu Gln Tyr Ile Lys Trp
1185 1190 1195 1200
Pro
<210> 11
<211> 57
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> VARIANT
<222> (1)..(57)
<223> N1
<400> 11
Asp Asp Gln Ile Gly Tyr Tyr Arg Arg Ala Thr Arg Arg Ile Arg Gly
1 5 10 15
Gly Asp Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Gly
20 25 30
Ile Ile Trp Val Ala Thr Glu Gly Ala Leu Asn Thr Pro Lys Asp His
35 40 45
Ile Gly Thr Arg Asn Pro Ala Asn Asn
50 55
<210> 12
<211> 76
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> VARIANT
<222> (1)..(76)
<223> S1
<400> 12
Ser Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn Val Val
1 5 10 15
Ile Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu Gly Val
20 25 30
Tyr Tyr His Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Phe
35 40 45
Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile
50 55 60
Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn
65 70 75
<210> 13
<211> 50
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> VARIANT
<222> (1)..(50)
<223> N2
<400> 13
Asp Asp Gln Ile Gly Tyr Tyr Arg Arg Ala Thr Arg Arg Ile Arg Gly
1 5 10 15
Gly Asp Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Thr
20 25 30
Gln Gly Asn Phe Gly Asp Gln Glu Leu Ile Arg Gln Gly Thr Asp Tyr
35 40 45
Lys His
50
<210> 14
<211> 68
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> VARIANT
<222> (1)..(68)
<223> S2
<400> 14
Ser Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn Val Val
1 5 10 15
Ile Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu Gly Val
20 25 30
Tyr Tyr His Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Arg
35 40 45
Ala Ser Ala Asn Leu Ala Ala Thr Lys Met Ser Glu Cys Val Leu Gly
50 55 60
Gln Ser Lys Arg
65
<210> 15
<211> 57
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> VARIANT
<222> (1)..(57)
<223> N3
<400> 15
Asp Gly Ile Ile Trp Val Ala Thr Glu Gly Ala Leu Asn Thr Pro Lys
1 5 10 15
Asp His Ile Gly Thr Arg Asn Pro Ala Asn Asn Gly Gly Gly Gly Ser
20 25 30
Gly Gly Gly Gly Ser Gln Thr Gln Gly Asn Phe Gly Asp Gln Glu Leu
35 40 45
Ile Arg Gln Gly Thr Asp Tyr Lys His
50 55
<210> 16
<211> 64
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> VARIANT
<222> (1)..(64)
<223> S3
<400> 16
Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg
1 5 10 15
Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Gly
20 25 30
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Arg Ala Ser Ala Asn
35 40 45
Leu Ala Ala Thr Lys Met Ser Glu Cys Val Leu Gly Gln Ser Lys Arg
50 55 60
<210> 17
<211> 184
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> VARIANT
<222> (1)..(184)
<223> N4
<400> 17
Asp Asp Gln Ile Gly Tyr Tyr Arg Arg Ala Thr Arg Arg Ile Arg Gly
1 5 10 15
Gly Asp Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Gly
20 25 30
Ile Ile Trp Val Ala Thr Glu Gly Ala Leu Asn Thr Pro Lys Asp His
35 40 45
Ile Gly Thr Arg Asn Pro Ala Asn Asn Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
50 55 60
Gly Gly Ser Gln Thr Gln Gly Asn Phe Gly Asp Gln Glu Leu Ile Arg
65 70 75 80
Gln Gly Thr Asp Tyr Lys His Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
85 90 95
Ser Asp Asp Gln Ile Gly Tyr Tyr Arg Arg Ala Thr Arg Arg Ile Arg
100 105 110
Gly Gly Asp Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp
115 120 125
Gly Ile Ile Trp Val Ala Thr Glu Gly Ala Leu Asn Thr Pro Lys Asp
130 135 140
His Ile Gly Thr Arg Asn Pro Ala Asn Asn Gly Gly Gly Gly Ser Gly
145 150 155 160
Gly Gly Gly Ser Gln Thr Gln Gly Asn Phe Gly Asp Gln Glu Leu Ile
165 170 175
Arg Gln Gly Thr Asp Tyr Lys His
180
<210> 18
<211> 228
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> VARIANT
<222> (1)..(228)
<223> S4
<400> 18
Ser Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn Val Val
1 5 10 15
Ile Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu Gly Val
20 25 30
Tyr Tyr His Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Phe
35 40 45
Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile
50 55 60
Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Gly Gly Gly Gly
65 70 75 80
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Arg Ala Ser Ala Asn Leu Ala Ala
85 90 95
Thr Lys Met Ser Glu Cys Val Leu Gly Gln Ser Lys Arg Gly Gly Gly
100 105 110
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val
115 120 125
Asn Asn Ala Thr Asn Val Val Ile Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys
130 135 140
Asn Asp Pro Phe Leu Gly Val Tyr Tyr His Gly Gly Gly Gly Ser Gly
145 150 155 160
Gly Gly Gly Ser Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr
165 170 175
Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val
180 185 190
Leu Tyr Asn Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Arg
195 200 205
Ala Ser Ala Asn Leu Ala Ala Thr Lys Met Ser Glu Cys Val Leu Gly
210 215 220
Gln Ser Lys Arg
225
<210> 19
<211> 281
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> VARIANT
<222> (1)..(281)
<223> N5
<400> 19
Asp Asp Gln Ile Gly Tyr Tyr Arg Arg Ala Thr Arg Arg Ile Arg Gly
1 5 10 15
Gly Asp Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Gly
20 25 30
Ile Ile Trp Val Ala Thr Glu Gly Ala Leu Asn Thr Pro Lys Asp His
35 40 45
Ile Gly Thr Arg Asn Pro Ala Asn Asn Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
50 55 60
Gly Gly Ser Gln Thr Gln Gly Asn Phe Gly Asp Gln Glu Leu Ile Arg
65 70 75 80
Gln Gly Thr Asp Tyr Lys His Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
85 90 95
Ser Asp Asp Gln Ile Gly Tyr Tyr Arg Arg Ala Thr Arg Arg Ile Arg
100 105 110
Gly Gly Asp Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp
115 120 125
Gly Ile Ile Trp Val Ala Thr Glu Gly Ala Leu Asn Thr Pro Lys Asp
130 135 140
His Ile Gly Thr Arg Asn Pro Ala Asn Asn Gly Gly Gly Gly Ser Gly
145 150 155 160
Gly Gly Gly Ser Gln Thr Gln Gly Asn Phe Gly Asp Gln Glu Leu Ile
165 170 175
Arg Gln Gly Thr Asp Tyr Lys His Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
180 185 190
Gly Ser Asp Asp Gln Ile Gly Tyr Tyr Arg Arg Ala Thr Arg Arg Ile
195 200 205
Arg Gly Gly Asp Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
210 215 220
Asp Gly Ile Ile Trp Val Ala Thr Glu Gly Ala Leu Asn Thr Pro Lys
225 230 235 240
Asp His Ile Gly Thr Arg Asn Pro Ala Asn Asn Gly Gly Gly Gly Ser
245 250 255
Gly Gly Gly Gly Ser Gln Thr Gln Gly Asn Phe Gly Asp Gln Glu Leu
260 265 270
Ile Arg Gln Gly Thr Asp Tyr Lys His
275 280
<210> 20
<211> 347
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> VARIANT
<222> (1)..(347)
<223> S5
<400> 20
Ser Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn Val Val
1 5 10 15
Ile Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu Gly Val
20 25 30
Tyr Tyr His Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Phe
35 40 45
Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile
50 55 60
Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Gly Gly Gly Gly
65 70 75 80
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Arg Ala Ser Ala Asn Leu Ala Ala
85 90 95
Thr Lys Met Ser Glu Cys Val Leu Gly Gln Ser Lys Arg Gly Gly Gly
100 105 110
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val
115 120 125
Asn Asn Ala Thr Asn Val Val Ile Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys
130 135 140
Asn Asp Pro Phe Leu Gly Val Tyr Tyr His Gly Gly Gly Gly Ser Gly
145 150 155 160
Gly Gly Gly Ser Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr
165 170 175
Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val
180 185 190
Leu Tyr Asn Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Arg
195 200 205
Ala Ser Ala Asn Leu Ala Ala Thr Lys Met Ser Glu Cys Val Leu Gly
210 215 220
Gln Ser Lys Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Lys
225 230 235 240
Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn Val Val Ile Lys
245 250 255
Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu Gly Val Tyr Tyr
260 265 270
His Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Phe Asn Ala
275 280 285
Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn
290 295 300
Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Gly Gly Gly Gly Ser Gly
305 310 315 320
Gly Gly Gly Ser Glu Ile Arg Ala Ser Ala Asn Leu Ala Ala Thr Lys
325 330 335
Met Ser Glu Cys Val Leu Gly Gln Ser Lys Arg
340 345
<210> 21
<211> 378
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> VARIANT
<222> (1)..(378)
<223> N6
<400> 21
Asp Asp Gln Ile Gly Tyr Tyr Arg Arg Ala Thr Arg Arg Ile Arg Gly
1 5 10 15
Gly Asp Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Gly
20 25 30
Ile Ile Trp Val Ala Thr Glu Gly Ala Leu Asn Thr Pro Lys Asp His
35 40 45
Ile Gly Thr Arg Asn Pro Ala Asn Asn Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
50 55 60
Gly Gly Ser Gln Thr Gln Gly Asn Phe Gly Asp Gln Glu Leu Ile Arg
65 70 75 80
Gln Gly Thr Asp Tyr Lys His Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
85 90 95
Ser Asp Asp Gln Ile Gly Tyr Tyr Arg Arg Ala Thr Arg Arg Ile Arg
100 105 110
Gly Gly Asp Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp
115 120 125
Gly Ile Ile Trp Val Ala Thr Glu Gly Ala Leu Asn Thr Pro Lys Asp
130 135 140
His Ile Gly Thr Arg Asn Pro Ala Asn Asn Gly Gly Gly Gly Ser Gly
145 150 155 160
Gly Gly Gly Ser Gln Thr Gln Gly Asn Phe Gly Asp Gln Glu Leu Ile
165 170 175
Arg Gln Gly Thr Asp Tyr Lys His Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
180 185 190
Gly Ser Asp Asp Gln Ile Gly Tyr Tyr Arg Arg Ala Thr Arg Arg Ile
195 200 205
Arg Gly Gly Asp Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
210 215 220
Asp Gly Ile Ile Trp Val Ala Thr Glu Gly Ala Leu Asn Thr Pro Lys
225 230 235 240
Asp His Ile Gly Thr Arg Asn Pro Ala Asn Asn Gly Gly Gly Gly Ser
245 250 255
Gly Gly Gly Gly Ser Gln Thr Gln Gly Asn Phe Gly Asp Gln Glu Leu
260 265 270
Ile Arg Gln Gly Thr Asp Tyr Lys His Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
275 280 285
Gly Gly Ser Asp Asp Gln Ile Gly Tyr Tyr Arg Arg Ala Thr Arg Arg
290 295 300
Ile Arg Gly Gly Asp Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
305 310 315 320
Ser Asp Gly Ile Ile Trp Val Ala Thr Glu Gly Ala Leu Asn Thr Pro
325 330 335
Lys Asp His Ile Gly Thr Arg Asn Pro Ala Asn Asn Gly Gly Gly Gly
340 345 350
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Thr Gln Gly Asn Phe Gly Asp Gln Glu
355 360 365
Leu Ile Arg Gln Gly Thr Asp Tyr Lys His
370 375
<210> 22
<211> 466
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> VARIANT
<222> (1)..(466)
<223> S6
<400> 22
Ser Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn Val Val
1 5 10 15
Ile Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu Gly Val
20 25 30
Tyr Tyr His Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Phe
35 40 45
Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile
50 55 60
Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Gly Gly Gly Gly
65 70 75 80
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Arg Ala Ser Ala Asn Leu Ala Ala
85 90 95
Thr Lys Met Ser Glu Cys Val Leu Gly Gln Ser Lys Arg Gly Gly Gly
100 105 110
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val
115 120 125
Asn Asn Ala Thr Asn Val Val Ile Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys
130 135 140
Asn Asp Pro Phe Leu Gly Val Tyr Tyr His Gly Gly Gly Gly Ser Gly
145 150 155 160
Gly Gly Gly Ser Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr
165 170 175
Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val
180 185 190
Leu Tyr Asn Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Arg
195 200 205
Ala Ser Ala Asn Leu Ala Ala Thr Lys Met Ser Glu Cys Val Leu Gly
210 215 220
Gln Ser Lys Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Lys
225 230 235 240
Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn Val Val Ile Lys
245 250 255
Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu Gly Val Tyr Tyr
260 265 270
His Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Phe Asn Ala
275 280 285
Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn
290 295 300
Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Gly Gly Gly Gly Ser Gly
305 310 315 320
Gly Gly Gly Ser Glu Ile Arg Ala Ser Ala Asn Leu Ala Ala Thr Lys
325 330 335
Met Ser Glu Cys Val Leu Gly Gln Ser Lys Arg Gly Gly Gly Gly Ser
340 345 350
Gly Gly Gly Gly Ser Ser Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn
355 360 365
Ala Thr Asn Val Val Ile Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp
370 375 380
Pro Phe Leu Gly Val Tyr Tyr His Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
385 390 395 400
Gly Ser Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp
405 410 415
Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr
420 425 430
Asn Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Arg Ala Ser
435 440 445
Ala Asn Leu Ala Ala Thr Lys Met Ser Glu Cys Val Leu Gly Gln Ser
450 455 460
Lys Arg
465
<210> 23
<211> 475
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> VARIANT
<222> (1)..(475)
<223> N7
<400> 23
Asp Asp Gln Ile Gly Tyr Tyr Arg Arg Ala Thr Arg Arg Ile Arg Gly
1 5 10 15
Gly Asp Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Gly
20 25 30
Ile Ile Trp Val Ala Thr Glu Gly Ala Leu Asn Thr Pro Lys Asp His
35 40 45
Ile Gly Thr Arg Asn Pro Ala Asn Asn Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
50 55 60
Gly Gly Ser Gln Thr Gln Gly Asn Phe Gly Asp Gln Glu Leu Ile Arg
65 70 75 80
Gln Gly Thr Asp Tyr Lys His Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
85 90 95
Ser Asp Asp Gln Ile Gly Tyr Tyr Arg Arg Ala Thr Arg Arg Ile Arg
100 105 110
Gly Gly Asp Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp
115 120 125
Gly Ile Ile Trp Val Ala Thr Glu Gly Ala Leu Asn Thr Pro Lys Asp
130 135 140
His Ile Gly Thr Arg Asn Pro Ala Asn Asn Gly Gly Gly Gly Ser Gly
145 150 155 160
Gly Gly Gly Ser Gln Thr Gln Gly Asn Phe Gly Asp Gln Glu Leu Ile
165 170 175
Arg Gln Gly Thr Asp Tyr Lys His Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
180 185 190
Gly Ser Asp Asp Gln Ile Gly Tyr Tyr Arg Arg Ala Thr Arg Arg Ile
195 200 205
Arg Gly Gly Asp Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
210 215 220
Asp Gly Ile Ile Trp Val Ala Thr Glu Gly Ala Leu Asn Thr Pro Lys
225 230 235 240
Asp His Ile Gly Thr Arg Asn Pro Ala Asn Asn Gly Gly Gly Gly Ser
245 250 255
Gly Gly Gly Gly Ser Gln Thr Gln Gly Asn Phe Gly Asp Gln Glu Leu
260 265 270
Ile Arg Gln Gly Thr Asp Tyr Lys His Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
275 280 285
Gly Gly Ser Asp Asp Gln Ile Gly Tyr Tyr Arg Arg Ala Thr Arg Arg
290 295 300
Ile Arg Gly Gly Asp Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
305 310 315 320
Ser Asp Gly Ile Ile Trp Val Ala Thr Glu Gly Ala Leu Asn Thr Pro
325 330 335
Lys Asp His Ile Gly Thr Arg Asn Pro Ala Asn Asn Gly Gly Gly Gly
340 345 350
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Thr Gln Gly Asn Phe Gly Asp Gln Glu
355 360 365
Leu Ile Arg Gln Gly Thr Asp Tyr Lys His Gly Gly Gly Gly Ser Gly
370 375 380
Gly Gly Gly Ser Asp Asp Gln Ile Gly Tyr Tyr Arg Arg Ala Thr Arg
385 390 395 400
Arg Ile Arg Gly Gly Asp Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
405 410 415
Gly Ser Asp Gly Ile Ile Trp Val Ala Thr Glu Gly Ala Leu Asn Thr
420 425 430
Pro Lys Asp His Ile Gly Thr Arg Asn Pro Ala Asn Asn Gly Gly Gly
435 440 445
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Thr Gln Gly Asn Phe Gly Asp Gln
450 455 460
Glu Leu Ile Arg Gln Gly Thr Asp Tyr Lys His
465 470 475
<210> 24
<211> 585
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> VARIANT
<222> (1)..(585)
<223> S7
<400> 24
Ser Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn Val Val
1 5 10 15
Ile Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu Gly Val
20 25 30
Tyr Tyr His Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Phe
35 40 45
Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile
50 55 60
Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Gly Gly Gly Gly
65 70 75 80
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Arg Ala Ser Ala Asn Leu Ala Ala
85 90 95
Thr Lys Met Ser Glu Cys Val Leu Gly Gln Ser Lys Arg Gly Gly Gly
100 105 110
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val
115 120 125
Asn Asn Ala Thr Asn Val Val Ile Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys
130 135 140
Asn Asp Pro Phe Leu Gly Val Tyr Tyr His Gly Gly Gly Gly Ser Gly
145 150 155 160
Gly Gly Gly Ser Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr
165 170 175
Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val
180 185 190
Leu Tyr Asn Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Arg
195 200 205
Ala Ser Ala Asn Leu Ala Ala Thr Lys Met Ser Glu Cys Val Leu Gly
210 215 220
Gln Ser Lys Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Lys
225 230 235 240
Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn Val Val Ile Lys
245 250 255
Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu Gly Val Tyr Tyr
260 265 270
His Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Phe Asn Ala
275 280 285
Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn
290 295 300
Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Gly Gly Gly Gly Ser Gly
305 310 315 320
Gly Gly Gly Ser Glu Ile Arg Ala Ser Ala Asn Leu Ala Ala Thr Lys
325 330 335
Met Ser Glu Cys Val Leu Gly Gln Ser Lys Arg Gly Gly Gly Gly Ser
340 345 350
Gly Gly Gly Gly Ser Ser Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn
355 360 365
Ala Thr Asn Val Val Ile Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp
370 375 380
Pro Phe Leu Gly Val Tyr Tyr His Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
385 390 395 400
Gly Ser Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp
405 410 415
Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr
420 425 430
Asn Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Arg Ala Ser
435 440 445
Ala Asn Leu Ala Ala Thr Lys Met Ser Glu Cys Val Leu Gly Gln Ser
450 455 460
Lys Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Lys Thr Gln
465 470 475 480
Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn Val Val Ile Lys Val Cys
485 490 495
Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu Gly Val Tyr Tyr His Gly
500 505 510
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg
515 520 525
Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val
530 535 540
Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
545 550 555 560
Gly Ser Glu Ile Arg Ala Ser Ala Asn Leu Ala Ala Thr Lys Met Ser
565 570 575
Glu Cys Val Leu Gly Gln Ser Lys Arg
580 585

Claims (11)

1.一种用于检测新冠病毒SARS-CoV-2的试纸条，其特征在于，所述试纸条包括N检测线和S检测线，所述N检测线包被N蛋白重组抗原，所述S检测线包被S蛋白重组抗原。
2.根据权利要求1所述的试纸条，其特征在于，所述N蛋白重组抗原包括PA抗原、PB抗原或PC抗原中的至少2个；
所述PA抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述PB抗原的氨基酸序列如SEQ IDNO：2所示，所述PC抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。
3.根据权利要求2所述的试纸条，其特征在于，所述PA抗原、所述PB抗原或所述PC抗原之间以蛋白接头连接，形成所述N蛋白重组抗原；
优选地，所述N蛋白重组抗原为线性蛋白或环状蛋白。
4.根据权利要求3所述的试纸条，其特征在于，所述PA抗原、所述PB抗原、所述PC抗原和所述蛋白接头形成第一重组抗原单位，
所述N蛋白重组抗原包括一个或多个所述第一重组抗原单位，所述第一重组抗原单位之间以所述蛋白接头连接；
优选地，所述N蛋白重组抗原包括1-5个所述第一重组抗原单位；
优选地，所述N蛋白重组抗原的序列如SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQID NO：21或SEQ ID NO：23所示。
5.根据权利要求1所述的试纸条，其特征在于，所述S蛋白重组抗原包括PA1抗原、PB1抗原或PC1抗原中的至少2个；
所述PA1抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示，所述PB1抗原的氨基酸序列如SEQ IDNO：5所示，所述PC1抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示。
6.根据权利要求4所述的试纸条，其特征在于，所述PA1抗原、所述PB1抗原或所述PC1抗原之间以蛋白接头连接，形成所述S蛋白重组抗原；
优选地，所述S蛋白重组抗原为线性蛋白或环状蛋白。
7.根据权利要求6所述的试纸条，其特征在于，所述PA1抗原、所述PB1抗原、所述PC1抗原和所述蛋白接头形成第二重组抗原单位，
所述S蛋白重组抗原包括一个或多个所述第二重组抗原单位，所述第二重组抗原单位之间以所述蛋白接头连接；
优选地，所述S蛋白重组抗原包括1-5个所述第二重组抗原单位；
优选地，所述S蛋白重组抗原的序列如SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQID NO：22或SEQ ID NO：24所示。
8.根据权利要求3或6所述的试纸条，其特征在于，所述蛋白接头包括10～15个氨基酸。
9.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1至8中任一项所述的试纸条和待测样本稀释液。
10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述待测样本稀释液用于稀释待测样品，所述待测样本稀释液包括PBS缓冲液和表面活性剂S21；
优选地，所述PBS缓冲液的浓度为0.01M，所述表面活性剂S21的浓度为0.1％w/v；
更优选地，所述PBS缓冲液的pH为7.4，包括0.2g/L KH2PO4，2.9g/L Na2HPO4·12H2O，8g/L NaCl。
11.根据权利要求10所述的试剂盒，其特征在于，所述待测样品包括血清、血浆或全血。
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