KR20020042533A - 당단백질 ｎｓ１을 이용한플라비바이러스(ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓ)의 조기검출방법 - Google Patents
당단백질 ｎｓ１을 이용한플라비바이러스(ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓ)의 조기검출방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 플라비바이러스 감염의 조기 검출을 위한 방법으로, 생물학적 표본에서 플라비바이러스의 NS1 비구조 글리코 단백질의 동정을 포함한다. 감염의 임상징후 단계동안 적어도 두개의 동일하거나 다른 항체를 실행한다. 첫 번째 항체는 폴리클론 항체나 모노클론 항체로 구성되어 있고, 사전에 상기의 헥사머 형태의 NS1 단백질에 대한 높은 친화성이 선택되었다.
Description
뎅그열은 급성 발열성 열대병인데 원인이 되는 바이러스는 모기에 의해서 전염되는 아르보바이러스(arbovirus)이다. 그 병의 매개물은 아데스(Aedes-황열따위를 전염시키는 모기의 일종) 종류의 모기이며, 특히 Aedes aegypti(열대숲 모기)이고 그것의 유충의 서식지는 대체로 가정과 가정주변이다. 1951년에 차단된, 원인 바이러스는 항원을 만드는 서로 다른 네 가지 타입(den1, den2, den3, den4)으로 분류되었다. 그것은 플라비바이러스의 종류인 플라비바이러스과의 일종에 속한다.
20억이 넘는 인구가 풍토성의 지역에 살고 있으며 바이러스에 의해 감염된 사람의 수는 일년에 1억 명 이상에 달한다. 뎅그열은 매년 500000명의 입원과 수 만 명의 사망 원인이 되고 있으며 특히 대다수가 아동이다.
5일에서 8일간의 잠복기 이후에 임상징후의 시작은 일반적으로 갑작스럽게 나타나며 처음에는 일반 발열과 구분되지 않고 심각한 두통, 요통, 근육통과 관절염, 또한 오한이 동반된다. 발열단계의 3일에서 5일째는 3에서 4일 동안 충혈성 구진(maculo-papuleuse) 발진이 나타날 수 있다.(보통의 뎅그열)
증상이 심각해지면, 감염은 혈관 팽창의 침투성에 의해 전형적인 출혈성 증후군(DHF 또는 dengue haemorrhagic fever) 발진에 이를 수도 있고 지혈에 이상이 생길 수도 있다. 대다수 경우에서 일반적으로 일 주일 내에 발병할 수 있고 질병의 결과는 혈액량 부족(DSS 또는 뎅그열 쇼크 증후군)의 쇼크로 치명적일 수 있다. 이러한 합병증은 기존 면역성의 특히 후천성 뎅그열의 다른 종류의 바이러스(다른 혈청타입)에 의해 최초 감염시에 유래할 수 있을 것이다. 사실 혈청 반응의 다른 두 타입은 뎅그열에 감염된 환자에게서 나타난다. 플라비바이러스에 전혀 감염된 적이 없고 다른 플라비바이러스(황열 바이러스, 일본뇌염 바이러스)에 대해 백신접종을 하지 않은 사람들은 감염의 원인이 되는 바이러스의 특수한 항체가 느리게 나타나는 전형적인 1차성 증세 반응을 나타낼 것이다. 플라비바이러스(예를 들면 다른 뎅그열의 혈청타입)에 감염이 이미 되었거나 다른 플라비바이러스에 대한 백신접종을 한 사람들은 항체가 빠르게 나타나는 전형적인 2차적 증세를 나타낼 것이다.
감염 요인은 플라비바이러스과(Flaviviridae)의 일종에 속하는 뎅그열 바이러스인데, 일본뇌염과 황열 바이러스도 마찬가지로 뎅그열에 속한다. (T.P. Monath et al., (1996) Flaviviruses in B.N Fields, D.M. Knipe, P.M. Howly et al,. (eds) "fields virology" Philadelphia : Lippincott Raven Press Publishers). 이 바이러스들은 11000개 핵산을 포함하고 약 3400개 아미노산의 폴리단백질에 대한 유전정보를 지니는 RNA 모노카트네르(monocatenaire)를 가지고 있다. 폴리단백질은 바이러스 프로테아제와 세포 유래의 프로테아제에 의해서포스트트라딕씨오넬(post-traditionnels)과 세포분열중에 조직의 3가지 단백질과 7가지 비구조 단백질 NS1,NS2A,NS2B, NS3,NS4A,NS4B,NS5과 세가지 단백질로 나뉜다. 비구조 단백질 NS1은 1970년 P.K. 러셀에 의해 처음으로 밝혀졌으며,(J.immunol.,(1970),105,838-845) 1985년 G.W. 스미스에 의해 전형화되었다.(J.Gen Viol.,(1985), 66, 559-571) 특히 뎅그열 바이러스의 4가지 혈청타입과 플라비바이러스의 종류에서 (T.P. Monath 이미 언급된) 분명하게 보존되는 당단백질은 세포내 형태와 세포외 형태로 존재한다. 세포내 형태는 바이러스 복제의 조기 단계에서 생겨날 것이다(Hall R. A. et al., J. Viol.,(1996), 222, 159-168;Rice C. M. et al., J. Viol.,(1997). 71, 9608-9617). 지단백질의 막으로 옮겨지기 전에 단백질 NS1은 하나로 결합된다. 포유류의 세포에서(곤충의 세포에서는 아니고) 단백질 NS1의 일부분은 대부분이 가용성 단백질의 형태이던가 부차적으로 초입자 형태이던가 간에 세포 외의 중간에서 분비된다. 그것이 가용성 형태일 때 단백질은 특히 펜타머나 헥사머 등 저중합체의 형태로 존재한다(Crooks A.J. et al. J.Chrom. (1990), 502, 59-68 et J. Gen. Viol.(1994), 75, 3453-3460). 현재로서는 단백질 NS1의 생물학적인 기능은 알려진 바 없다.
여러 연구들에서는 플라비바이러스 감염에 대한 예방 면역 반응에서 단백질 NS1의 면역우세성 특징을 제안하고 있다. 황열바이러스, 뎅그열, 일본뇌염의 바이러스, 진드기 뇌염과 같은 여러 종의 플라비바이러스로 실행된 실험들은 바이러스 매개체나 백신 타입 또는 아데노 바이러스에 의해 만들어진 단백질 NS1 등을 접종 받은 동물들에 있어서 위에 언급한 바이러스의 치사량에 대한 완전한 또는 부분적인 예방 효과를 보여주었다.(Schlesinger et al., J. Viol(1986), 60. 1153-1155;J. Gen. Viol..(1987), 68, 853-857;Falgout et al., J.Viol.,(1990), 64, 4356-4363:Jacobs et al., J.Viol.,(1992), 66, 2086-2095;Hall et al,. J. Gen. Viol.,(1996), 77, 1287-1294;Konishi et al., Virology, (1991), 185, 401-410).
동일한 세포계에 속하는 항-NS1 항체에 의한 생쥐의 음성 면역화는 마찬가지로 어느 정도의 예방 효과를 제공하였다(Schlesinger et al., J.Immunol(1985), 135, 2805-2809;Goud et al., J. Gen. Viol.,(1986),67,591-595;Henchal et al., J. Gen. Viol.,(1988), 69, 2101-2107 ). 예방시 항-NS1 항체의 역할은 완전히 밝혀지지는 않았다. 감염된 세포 표면의 단백질 NS1 이, 항체가 보체를 고정시키면서 감염된 세포의 용해에 보내는 것에 의해 식별될 수 있다.(Schlesinger et al.,Virology,(1993),192,132-141)
증상을 가지고 있는 환자들에 대한 특별한 치료나 처치 방법은 존재하지 않는다. 기존의 뎅그열의 경우에 치료는 해열작용과 진통의 처방에 기초를 둔다. DHF의 경우에 치료는 보상으로 수력발전 장애의 정확성에 결합된 혈장 유출의 지속주입과 배뇨의 활성화로 이루어져 있다.
뎅그열 바이러스에 유용한 백신은 없다. 그러나 뎅그열 바이러스의 4가지 혈청타입의 약화된 숙주에 의한 보호 예방은 N.Bhamarapravati et al.(뎅그열과 뎅그AGEMORRHAGIC FEVER (1997),367-339)에 의해서 행해졌지만 그리 만족스러운 결과를 내지는 못했다. 따라서 예방 방법은 단지 병원체의 매개물과의 싸움에 달려 있다. 이것은 유충의 섬멸과 성충제 살포 방법이 병행된다.
백신이 없기 때문에 전염병을 감시하고 앞에서 인용한 합병증을 예방하는 것이 필요하다. 그것을 위해서 세계보건기구, WHO는 감시 활동 프로그램을 시작했다. 그리고 이 프로그램은 본질적으로 발열 경우의 주의와 벌레 매개체와, 발열 증상이 있거나 뎅그열에 의한 감염으로 추정되는 사람들의 혈청 검사와 바이러스 검사 등을 포함한다.
뎅그열의 병인은 때때로 환자가 비분화 형태의 유사 뎅그열 발열증상을 나타내는 경우에는 단정짓기가 어렵다. 유사 뎅그열은 다른 아르보바이러스, 유행성 감기 같은 발열증상을 나타내는 바이러스 또는 렙토스피라증과 말라리아같은 질병을 일으키는 비바이러스 인자 등을 유발하는 바이러스들에 의해 일어날 수 있다. 실험을 통해서만 진단을 내릴 수 있다.
현재 뎅그열 진단 방법에는 여러 가지 방법이 존재한다. 그럼에도 불구하고 이해할 수 있는 결과에 도달하기 위해서는 여러 가지 방법을 조합하는 것이 필요하다.
기존의 바이러스 기술에 의해 바이러스를 분리시키는 것, 특히 세포 배양의 감염, 생쥐 뇌로 확산, 또는 모기에 감염에 의해 호흡시 흉강의 확장 그리고 면역형광검사법에 의한 시험이 있다. 이런 방법들은 실행하기 어렵다는 단점이 있으며 조기 채혈과 적합한 보존 조건에 따라 실험 결과가 달라진다는 단점이 있다. 게다가 일주일 이내로 결과가 나올 수 없을 수도 있다. 그 단점들을 보완하기 위해서는 RT/PCR에 의한 테스트 수단을 동원할 수 있다. 그럼에도 불구하고 이 방법은 언제나 믿을만한 것은 아니며 이 방법들은 뎅그열 바이러스의 감염에 노출된 나라들이비용과 장비부족으로 일반적으로 사용할 수 없다.
혈청테스트 : 조기의 혈청진단은 MAC ELISA기술에 의해서 바이러스의 항원을 만드는 특정 IgM을 연구하는 것을 포함한다. 징후시작 후 여러 날 동안 이루어지는 검출방법은 플라비바이러스에 의한 감염가능성의 진단을 가능하게 한다. IgG형태의 항체는 IgM형태의 항체보다 더 늦게 나타난다. 모든 경우에 항체의 연구는 2차례의 채혈을 필요로 한다. 1차 채혈은 임상징후의 초기에, 2차 채혈은 10일에서 28일 이후인데, 적혈구응집(IHA) 억제반응에 의해서나 또는 ELISA에 의해서나 혈청전환을 명백하게 하기 위한 것이다.
마찬가지로 간단하고 그다지 비용이 싸지 않은 면역학 테스트가 제안되었다. 이 방법은 바이러스 노출 국가에서 사용될 수 있으며, 또한 플라비바이러스의 성격을 가진 비구조 단백질에서 유도된 펩티드의 특정한 면역학 반응체처럼 시행할 수도 있다. 미국 특허 5 824 506은 비구조 NS1 단백질의 유도체 펩티드를 사용하는 방법을 기술하고 있으며, 그 방법은 뎅그열 바이러스의 출현에 의해 유도된 항체검출을 가능하게 한다. 그러나 선택된 펩티드는 본질적으로 회복기에 있는 사람으로부터 얻어진 표본을 선발하고, 따라서 처음으로 감염된 사람 보다 두 번째로 감염된 사람을 더 잘 선발할 수 있다. 이러한 기대에 어긋나는 결과들은, 사용된 펩티드가 천연 단백질 항원의 전형적인 특징들이 아니며 따라서 조사된 항원의 잘못된 조사에 이르게 된다는 사실에 의해 설명될 수 있을 것이다.
모든 경우에서, 플라비바이러스에 의한 감염은 늦게 확인될 수 밖에 없다. 알베르 [Sir Albert Sakzewski Virus Research Center Royal /children'shospital, (A.Falconar,1991)] 의 보고서는 DEN2 바이러스에 의해 감염된 환자들의 혈청에서 나타나는 NS1 비구조 당단백질에 대하여 기술하고 있다. 이 보고서의 작성자들은 더블샌드위치 타입의 ELISA 테스트를 개발했다. 이 테스트에서 항-NS1 폴리클론 항체를 포함하고 있는 토끼의 혈청은 포획 항체로 사용되는데 미크로 티라씨옹(microtiration)의 막에 고정되어 있다. 포획된 항원은 NS1 단백질에 대하여 유발된 쥐의 모노클론 항체를 이용하여 검출하는데 DEN2 타입의 뎅그열 바이러스이거나 뎅그열의 복합적인 혈청이 특이종에 의해서이다. 복합적인 항원/항체 형성의 새로운 발견은 산화에 관계된 항수리 셰브르의 IgG에 의해 실현되었다. 이런 방법들에 의해 고안자들은 표준으로서 정제되거나 악화된 이량체 NS1 단백질을 사용하면서 테스트 검출의 정밀도는 새로운 발견의 검사에서처럼 DEN2 모노클론 항체와 함께 약 4ng/ml 이며 그룹의 모노클론 항체와 함께 60ng/mg 이라는 사실을 밝혔다.
그럼에도 불구하고 이 테스트에서는 급성 초기 감염 환자나 회복단계에 환자, 항NS1 항체의 높은 수치가 나타나는 회복 단계의 이차 감염단계에서도 NS1 단백질이 검출되지는 않는다. 고안자(발명인)들은 NS1 단백질은 이차 감염에서 그리고 감염된 동안만은 일시적으로 상당한 양으로 존재해야 한다고 결론지었다.
그런데 발명자들은 헥사머 형태로 플라비바이러스의 NS1 단백질의 불순물제거 진행과정을 개발했고 이를 통해 이 헥사머 형태 단백질의 특정 항체를 선택하게 했다. 그리고 놀랍게도 이 항체들이 순환성 NS1 단백질의 다른 형태들을 확인하기 위한 선택의 수단이 되며, 플라비바이러스에 의한 감염 차원에서, 특히 특정 항체에 의한 반응이 검출 불가능한 조기 검출 단계에서 특히 뎅그열 감염 초기 단계에서 다른 형태들을 검출하게 해준다.
결과적으로, 본 발명은 플라비바이러스 감염의 조기 검출 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 이 방법은 종래 기술 보다 더 유용한 요구들에 부응하는 것으로 다시 말해서 신뢰성이 있고 신속하며 비용이 저렴하고, 의학적 치료 시간을 맞출 수 있어야 한다.
본 발명의 목적은 결과적으로 플라비바이러스 감염의 조기 검출 방법을 제공하기 위한 것이다. 본 발명에 따른 플라비바이러스 감염의 조기 검출 방법은 감염의 임상 단계 모든 기간동안 적어도 두가지 이상의 동일한 또는 다른 두 항체에 면역학적 방법을 적용시키면서 생물 표본에서 하나의 플라비바이러스의 비구조 NS1 당단백질을 검출하는 방법으로서, 감염 임상단계 동안 모든 생물표본에서 플라비바이러스의 비구조성 NS1 당단백질을 검출하는 것을 포함함을 특징으로 한다.
본 발명은 플라비바이러스, 특히 뎅그열 바이러스의 조기 동정 방법과 그 용도에 관한 것이다.
도 1a 및 도 1b는 본 발명에 따른 정제된 세포외 헥사머 NS1 단백질을 각각보여주는 도면.
도 2는 본 발명의 실시 예에 따른 클론 4C에 의해 획득한 혈청타입 1의 뎅그열 바이러스 NS1 단백질의 서열과 이에 대응하는 암호화된 서열을 나타내는 도면.
도 3은 본 발명의 실시 예에 따른 ELISA-포획 기술의 실행과 기술의 내적 상태의 비교 결과를 나타낸 도표.
도 4는 본 발명의 실시 예에 따른 프랑스 Guyane의 혈청타입1의 뎅그열 바이러스에 의해 감염된 환자들의 혈청에 대한 ELISA-포획 테스트에 의한 NS1 단백질의 검출을 설명하기 위한 도면.
도 5는 본 발명의 실시 예에 따른 뎅그열1 바이러스에 의해 감염된 프랑스 Guyane의 4명의 환자에게서 얻어진 결과를 각각 설명하기 위한 그래프.
도 6은 본 발명의 실시 예에 따른 항 NS1 F22와 G18 모노클론 항체의 특성을 나타내기 위한 도표.
도 7은 본 발명의 실시 예에 따른 모노클론 접근을 사용하는 ELISA-포획 테스트에 의해 NS1 단백질의 검출을 설명하기 위한 도표.
도 8은 본 발명의 실시 예에 따른 황열 바이러스에 의해 감염된 환자나, 황열의 특수한 ELISA-포획 테스트에 의한 환자의 혈청에서 NS1 단백질을 강조한 것을 설명하기 위한 도표.
본 방법은 당단백질의 첫번째 항체 또는 포착 항체는 상기 헥사머 플라비바이러스의 NS1 단백질에 대한 면역 포착 방법으로 선별된 폴리클론 항체 또는 상기 플라비바이러스의 NS1 단백질에 대한 고유연성을 위해 미리 선택된 항 NS1 단백질 모노클론 항체들 (이들은 모두 헥사머 형태로서 상기 모노클론 항체들은 곧이어 정제됨)로 된 그룹에서 선별하는 단계와;
-상기 당 단백질의 두 번째 항체나 정보를 주는 항체는 헥사머 형태의 NS1 단백질 방지를 위한 폴리클론 항체 또는 헥사머 형태의 NS1 단백질 방지를 위한 모노클론 항체의 혼합물로 된 그룹에서 선택되는 단계를 포함한다.
본 발명에 있어서 플라비바이러스의 NS1 단백질의 헥사머 형태는 앞에서 언급한 플라비바이러스에 의해 감염된 포유류의 세포배양의 잔여물로부터 얻어지거나 아니면 플라비바이러스의 NS1 단백질의 유전자를 포함하는 발현 시스템에 의해 변형되고 이하 설명되는 본 발명의 방법에 따라 정제된 천연 단백질을 의미한다. 단일 형태나 해당된 이량체 단백질과 같은 다른 형태들과 구분되어지는 헥사머 NS1 단백질은 전기영동에 의한 분석법이나 도 1에 도시된 크로마토그라피 기술에 의해서 명확해진다.
본 발명에 있어서 플라비바이러스 NS1 단백질을 억제하기 위한 폴리클론 항체와 모노클론 항체는 인간을 제외한 포유 동물의 면역화에 의해 얻어진 항체를 의미한다.
- 헥사머 형태의 NS1 단백질,
- 살아있지만 불활성화된 플라비바이러스.
상기 폴리클론 항체는 헥사머 형태의 NS1 단백질에 대한 친화성을 통해 선택되고, 단지 한 단계 정제된 것이다. 그리고 상기 모노클론 항체는 특히 높은 친화성 크로마토그라피 또는 이온 교환과 같은 전형적인 기술에 의해 정제된 헥사머 형태의 NS1 단백질에 대한 높은 친화성을 통해 이전에 선택된 것이다.
본 발명에 있어서 헥사머 형태의 NS1 단백질에 대한 모노클론 항체의 친화성은 그 항체 부위 50%를 포화상태로 만드는데 필요한 당해 단백질의 집중을 의미한다. 이것은 실시예 5에서 보여지는 프로토콜에 따른 당해 항체의 친화성의 일정함에 의해 측정되었다.
본 발명의 다른 형태에서, 높은 공통점에 의해 그것의 일반적인 경향이 10-8M보다 낮은 공통점이 요구된다.
놀랍게도, 생물 표본에서 NS1 단백질을 검출하는데 있어서, 초면역화된 토끼의 전체 혈청대신에, 헥사머 형태의 NS1 단백질을 통해 면역포획에 의해 정제된 폴리클론 항체의 사용 및 정제되어있고 헥사며 형태의 NS1 단백질에 대해 높은 공통점을 나타내는 모노클론 항체를, 초기면역화된 토끼의 전체 혈청대신, 사용할 경우 이 방법에 대한 민감성이 크게 증가한다. 따라서, 감염의 조기단계부터 2차감염 및 초기감염에서도 환자의 혈액에서 순환하는 NS1 단백질의 존재가 명확하게 나타난다.
본 발명에 따른 방법은 여러 가지 장점을 가지고 있다.
본 방법은 조기 단계에서 실행된다. 당단백질 NS1의 존재는, 항체에 대한 반응의 검출이 불가능하기 전인 임상징후의 단계에서 부각된다.
본 방법은 민감하다. 혈청 단백질/ml 의 양이 단백질 1 ng보다 적은 양까지도 검출된다. 그리고 초기 감염의 조기 단계에서 순환하는 NS1 단백질의 검출도 가능하다.
본 방법은 신속하다. 하루동안에도 반응을 얻을 수 있다.
본 방법은 비교적 비용이 저렴하며, 위험한 나라에서도 사용이 가능하다.
본 방법은 최근에 감염된 사람들과 접종 받은 사람들을 플라비바이러스에 의해 구분한다. 왜냐하면 접종을 받은 사람들에게는 NS1 단백질은 없고 그들에게서 항체를 아직은 발견할 수 있기 때문이다.
본 방법의 바람직한 실시 형태에 따르면 플라비바이러스의 감염은 뎅그열에 의한 감염이다.
본 방법의 다른 바람직한 실시 형태에 따르면 첫번째 항체는 특히 적합하고 단단한 지지대에 고정되어 있다. 그리고 두번째 항체는 경우에 따라서는 적합한 (병 또는 유전자 따위의) 표지에 결합되어 있다.
본 방법의 또 다른 바람직한 실시 형태에 따르면 두 번째 항체가 (병 또는 유전자 따위의) 표지에 결합되어 있지 않을 때, 단단한 대에 고정된 NS1 단백질에 대한 결합은 적합한 대에 결합된 세 번째 항체에 의해 검출되는데, 해당되는 세 번째 항체는 통상적으로 사용되는 항체, 예를 들면 두 번째 항체와, 특히 염소나 돼지 또는 당나귀에게서 생산되는 것에 대항해서 정해진 IgG 등이 있다.
사용된 (병 또는 유전자 따위의) 표지 중에서는, 예를 들면 서양고추냉이의 산화작용을 촉매하는 효소(퍼옥시다제)나 알칼리성 포스파타제와 같은, 형광을 내는 표지, 비오틴/스트렙타비딘 시스템, 비동위원소 표지나 효소의 표지를 포함한다.
본 방법의 유리한 다른 실시 형태에 따르면 당해의 세번째 항체는 효소에 결합되어 있다.
본 방법의 또 다른 유리한 실시 형태에 따르면, 첫 번째 항체나 포획항체는 뎅그열 바이러스의 NS1 단백질의 면역포획에 의해 선택된 쥐의 폴리클론 항체로 구성되어 있다. 해당 단백질은 헥사머 형태로 되어 있다. 그리고
두 번째 항체나 분석할 생물 표본에서 NS1 존재의 검출 항체는 뎅그열 바이러스 의 NS1 단백질에 의해 면역된 토끼 폴리클론 항체로 이루어져있다. 당해의 단백질은 헥사머 형태이다. 해당되는 두 번째 항체의 고정은 퍼옥시다제에 결합되고 두 번째 항체에 대항해서 계획된 항체를 포함하는 세 번째 항체에 의해 명확해진다.
본 방법의 더욱 유리한 다른 실시 형태에 따르면, 쥐의 폴리클론 항체는 혈청1 뎅그열의 헥사머 NS1 단백질에 대한 면역포획에 의해 정제되는 것이다.
본 발명은 마찬가지로 플라비바이러스 감염의 자가검진이나 임상 진단 쌍(한벌)을 포함하고 있다. 이 때 다음과 같은 것을 포함하는 것이 바람직하다.
적어도 포획 항체와 적어도 상기 새로 발견된 항체
적어도 플라비바이러스 또는 다른 혈청타입의 NS1 단백질에 의해 이루어지는 양성 검사. 당해의 플라비바이러스는 헥사머 형태인 것이다.
적어도 정상적인 사람의 혈청에 의해 이루어지는 음성 검사.
본 발명에 따른 진단 쌍의 바람직한 실시 양태에 따르면, 상기 헥사머 형태의 NS1 단백질은 감염된 포유류의 세포로부터 얻어진 것이거나, 플라스미드 유전인자에 의해 형질감염된 포유류 세포의 배양 잔류물로부터 얻어진 것이다. 이것은 NS1 단백질의 유전자를 포함하거나 플라비바이러스 게놈의 단편이나 전술된 유전자의 단편을 포함한다. 전술된 단편들은 NS1 단백질의 일부분이나 전체를 의미하는 것이다.
본 발명에 따른 진단 쌍의 다른 바람직한 실시 양태에 따르면, NS1 단백질은 뎅그열 바이러스의 단백질이다.
본 발명에 따른 진단 쌍의 보다 바람직한 실시 양태에 따르면, 유전자 플라스미드는 1999년 6월 7일에 파스퇴르 연구소에 의해 국립 미생물 배양물 수집소에 기탁되어 수탁된 pCIneo-NS1.FGA 플라스미드이다.
본 발명은 마찬가지로 플라비바이러스의 NS1 단백질을 정제하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 하고 있다. 헥사머 형태의 경우, 감염된 포유류의 세포, 유전인자 플라스미드에 의해 형질 감염된 포유류의 세포 또는 배양 잔류물로부터 정제된다. 이것은 플라비바이러스의 NS1 단백질의 유전자나 이 유전자의 단편 또는 플라비바이러스 게놈 유전자의 단편을 포함한다. 이 단편들은 헥사머 형태의 NS1 단백질을 발현시키는데 적절하다. 통상적인 친화성 크로마토그래피와 같은 전형적인 기술에 의한 NS1 단백질의 정제 방법에 있어서 상술한 바와 같은 특정한 단백질의 마이크로 입자물로부터 가용성 NS1 단백질을 원심분리에 의해 침전처리하여 분리시킨다.
예를 들면 원심분리는 10,000g 이상의 속도로 실시한다.
본 발명에 있어서 침전 요인은, 세포의 조각이나 마이크로입자의 단백질을 특이적으로 침전시키는 것이며, 예를 들면 폴리에틸렌글리콜과 같은 요인이다. 전술한 요인은 전형적인 조건에서 사용되었으며, 이 조건들은 가용성 단백질과 세포 단편이나 마이크로입자의 단백질을 분리시킨다.
전술한 정제 방법으로서, 가장 바람직한 방법은, NS1 헥사머 단백질이 뎅그열 바이러스의 단백질, 특히 혈청타입1의 뎅그열 바이러스 단백질인 것이다.
본 발명은 또한, 유효성분으로서 플라비바이러스의 NS1 단백질, 헥사머 단백질, 경우에 따라서는 다른 단백질에 결합된 면역조성물을 목적으로 하며 적합한 약제학적 담체와 결합될 수도 있다.
본 발명에 따른 면역성의 구성이 이루어지는, 가장 많이 선호되는 방법으로, 면역성의 구성은 적어도 뎅그열 바이러스의 다른 혈청에 관계되는 헥사머 형태의 NS1 단백질의 혼합을 포함한다.
본 발명은 또한 면역성의 구성을 목적으로 하는데 구성된 그룹에서 선택된 유효성분을 포함하는 것이 특징지어진 것이다.
-그룹구성은 그 혈청 성분이 무엇이든 간에 뎅그열 바이러스의 NS1 단백질의 부분이나 전체를 설명할 수 있는 다핵산에 의해서 이루어진다.
-그룹구성은 적어도 주입된 숙주(hote)에서 설명할 수 있게 하는 조촉매를 포함하는 추출에 시스템에 의해서이다. AND은 그 혈청 성분이 무엇이든 간에 뎅그열 바이러스의 NS1 단백질을 암호화하고, 상기 AND은 적당한 약제학적 담체와 결합하면서 앞의 단백질을 발현한다.
핵산을 사용하는 백신의 프로토콜은 특히 국제 WO 90/11092의 청구범위에 설명되어 있다.
본 발명은 플라비바이러스의 헥사머 형태의 NS1 단백질이나 또는 발현 시스템들 중 하나의 사용과 생체내 발생을 초래할 수 있는 면역유전 구성의 준비를 목적으로 한다.
전술한 사용에 대해 선호되는 방법으로서, NS1 단백질은 특히 혈청타입1의 뎅그열 바이러스 단백질이다.
본 발명은 적어도 항-NS1 모노클론 항체의 사용을 목적으로 한다. 이 항체는 헥사머 형태의 NS1 단백질에 대해 높은 친화력을 나타낸다.
상기 모노클론 항체는 약의 생산이 불활성 면역효과를 초래할 수 있는데 대해서 그 다음 정제되고 변형되었다.
유리하게는 항체의 변형은 특히 Fab 단편 선택이나 항체 완화이다.
본 발명은 또한 헥사머 형태의 NS1 단백질의 용도를 제공하기 위한 것으로서, 상기 NS1 단백질의 특정 항체가 플라비바이러스에 의한 감염의 조기 진단을 할 수 있는 것을 선택하는 것을 목적으로 한다.
전술한 용도의 바람직한 실시 양태에 있어서, 항체는 폴리클론 항체이다.
전술한 용도의 바람직한 다른 실시 양태에 있어서, 항체는 모노클론 항체이다.
전술한 용도의 바람직한 또 다른 실시 양태에 있어서, 단백질은 특히 혈청타입의 뎅그열 바이러스의 NS1 단백질이다.
모노클론 항-NS1 항체는 적합한 골수종 세포와 헥사머 형태의 NS1 단백질에 의해 면역된 쥐의 비장 세포의 융합에 의해서 얻어지는 것이 바람직하다.
본 발명은 마찬가지로 폴리뉴클레오티드의 조기발현 암호화를 목적으로 한다. SEQ ID N1서열에 정의된 폴리뉴클레오티드의 발현을 포함하여 특징지어지고, 적합한 진핵세포액의 세포에서 앞서 말한 폴리뉴클레오티드의 조촉매에 결합된 뎅그열 바이러스의 NS1 단백질을 목적으로 한다.
본 발명의 다른 특징들과 잇점들은 이하 상세한 설명과 표에 제시된 예시에서 나타난다.
도 1은 정제된 세포외 헥사머 NS1 단백질을 보여준다. 축출된 크로마토그래피후에 단백질은 여과에 의해서 0,5 mg/ml으로 농축되었고 0, 0.5, 5 그리고 50 mM 디메틸수버이미데이트(dimethylsuberimidate)에 의해 처리되었다.
얻어진 생성물은 쿠마시(Coomassie)에 의해 푸른색으로 표시되고 4 내지 20% 구배 아크릴아마이드 겔에서 분리된 램리(laemmli)의 비환원성 탐폰에 놓여진다.
50Mm DMS에 의해 처리된 표본은 비공유 올리고머를 분리하기 위해서 전기 영동에 의한 분석 전에 3분 동안 95℃로 가열한다. (b) 정제된 NS1 단백질은 0.5 내지 1% n-옥틸글루코사이드 (nOG)로 하룻밤동안 37℃에서 처리한다. 그리고 경우에 따라서는 1시간 동안 25mM DMS로 처리하기도 한다. 단백질은 4 내지 20% 구배의 아크릴아마이드 겔에서 구조변화 없이 분리된다. 그리고 참고문헌의 항-NS1 모노클론 항체와 함께 면역블롯에 의해 검출된다.
도 2는 다음의 실시예 2의 클론 4C에 의해 획득한 혈청타입 1의 뎅그열 바이러스 NS1 단백질의 서열을 나타내며 또한 대응하는 암호화된 서열도 나타낸다.
도 3은 순환하는 NS1 단백질 의 용량결정에 의해 획득한 결과들을 설명한다. 뎅그열의 혈청이 회복기에 있는 환자와 급성단계일 때 또한 채취되는 뎅그열 바이러스에 의해 이전에 감염된 환자들에게서 ELISA-포획에 의한 검출방법을 나타낸다.
도 4는 프랑스 Guyane 의 혈청타입1의 뎅그열 바이러스에 의해 감염된 환자들의 혈청에 대한 ELISA-포획 테스트에 의한 NS1 단백질의 검출을 설명한다. 표시된 수치는 카테고리에 의해 분류된 환자의 숫자를 나타낸다.( ELISA-포획에서 양성 또는 음성과 IgM에서 양성 또는 음성)
도 5는 뎅그열1 바이러스에 의해 감염된 프랑스 Guyane의 4명의 환자에게서 얻어진 결과를 설명한다. 이 환자들은 질병 J1에서 J5까지의 임상징후 단계동안 일상적으로 채취되었다. 각각의 그래프는 매일의 채취로써 환자에 관련되어 있다.
동시에, 발전된 ELISA-포획 테스트를 가지고 NS1 단백질의 검출의 결과와 RT-PCR의 결과와 MAC-ELISA기술에 의해 얻은 결과들과도 관련되어 있다. 얻어온 D.O의 가치는 본질적인 잡음의 가치를 한번으로 수정되었다. 양성의 한계가 점이 있는 처리에 의해 표시되었다.
도 6은 항 NS1 F22와 G18 모노클론 항체의 특성을 표시한다.
도 7은 모노클론 접근을 사용하는 ELISA-포획 테스트에 의해 NS1 단백질의 검출을 설명한다. 그리고 실시예 3에서 설명한 것과 같은 폴리클론 접근을 사용하는 ELISA-포획 테스트와 비교하여 NS1 단백질의 검출을 설명한다. 얻어진 결과들은 각각의 분석된 혈청의 용해(10번째, 30번째, 90번째)에 대해 측정된 용도로 마련되고, 부정적인 증거 수단의 가치가 분리된 광학농도의 형태에서 가져왔다.
도 8은 황열 바이러스에 의해 감염된 환자나, 황열의 특수한 ELISA-포획 테스트에 의한 환자의 혈청에서 NS1 단백질을 강조한 것을 설명한다. 테스트된 각각의 혈청이 음성 증거 수단 가치로부터 삭제되어 발전한 테스트에 의해 측정된 광학농도는, 결과가 가변적일 때, 바이러스상의 정제 결과와 황열의 IgM의 특정 MAC-ELISA 테스트에 의해 측정된 광학농도 가치로 옮겨진다.
실시예 1 : 뎅그열 바이러스의 NS1 단백질의 정제, 혈청타입 1
1.
설비와 방법
단백질은 뎅그열 바이러스에 의해 감염된 베로 세포에서 만들어진다. 혈청타입 1, 숙주 FGA/89(P.Despres et al., Virol, (1993), 196, 209-219), ALK Falconar et al., (J.Viol. Meth,(1990), 30, 323-332)에 의해 설명된 방법에 맞추어진 조건에서 만들어지는 것이다.
배양물은 감염 5일 이후에 채취하고 세포 잔여물을 제거하기 위해서 1500g에서 원심분리한다. 원심분리의 잔여물은 20mM Tris-HCl에서 환원시킨다. 1mM 아지화나트륨, 저온 한외여과를 통해 6회 농축하고, 그리고 바이러스성 분리물은 4℃에서 2시간 동안 침전에 의해서 제거된다. 7.5% 폴리에틸렌글리콜(PEG)에서 농축시키고, 다음 10000g에서 30분간 계속 농축한다. 7.5% PEG를 포함하는 정제된 잔여물은 0.05% Tween 20과 아프로티닌 1ml/mg으로 처리한다. 그 다음 항-NS1 모노클론항체는 고정된 면역적 유연성의 기둥(colnne)의 위로 통과시킨다.
단백질은 Falconar et al.,(앞에서 인용)에서 설명된 것과 같이 한외여과와 1mM 아지화나트륨을 포함하는 10mM Tris-HCL pH 7,5 탐폰에 의한, 교환된 분리의 용해로 농축된 디에틸아민에 기술에 따라서 분리된다.
2.
결 과
결과는 도1에 제시하였다.
도 1a 및 도 1b는 NS1 단백질이 헥사머인 것을 보여준다. 헥사머 형태의 비율은 DMS에서 성장하는 농축으로 증가한다.
NS1 세포외 헥사머형태 단백질은 비이온성 세척제인 n-옥틸글루코사이드(nOG)의 존재에서 이량체의 sous-unite(단량체)로 변형된다. n-옥틸글루코사이드(nOG)의가 존재 여부에 관계없이 37℃에서 하룻밤이 지나면, 25mM DMS에 의한 처리는 nOG의 부재에서 선(bande)의 존재가 이량체에 연결되면서 4합체와 6합체에서 nOG가 존재하며, nOG에서 농축에 대한 6합체가 부분적이거나 완전한 분리를 발견하게된다.(도 2 참조)
실시예2 :
베로 세포에 의한 혈청타입1의 뎅그열 바이러스 NS1 단백질의 발현
1. 시설과 방법
파르퇴르 협회의 국립 미생물 배양물 수집소(CNCM)에 기탁된 pClneo-NS1-FGA 유전자 플라스미드는 펩티드 표시를 암호화하는 유전자를 포함하여 NS1 단백질의 유전자를 함유한다.
플라스미드는 박테리아 배양물에서 증폭시키고, 플라스미드 AND 제조물을 전형적인 기술에 의해 정제한다. 정제된 AND은 다른 클론들의 서열(클론 4도의 서열은 표2에서 설명되었다.)을 위해 사용된다. 그리고 양이온의 리포좀으로써 DOTAP(Boehringer-Mannheim), 또는 리포좀의 요인으로, FuGENE(Boehringer-Mannheim)과 같이 있는 그대로 꼭 알맞은 혼합의 도움으로 베로 세포를 변형시키기 위해서도 사용된다. ,FuGENE과 AND은 15분 동안 혈청없이 예비배양한다. 그리고 나서 혼합물은 24시간 동안 세포의 세포 TAPIS와 접촉시킨다. 세포들은 그다음으로 PBS(인산염 완충 식염수)를 이용하여 세척한다. 그리고 세포들은 3% 파라포름알데하이드를 포함하는 PBS의 용해로 주위 실온에서 20분 동안 고정되며 0,5% Triton X-100을 포함하는 PBS로 5분은 투과될 수 없다. NS1 항원의 존재는 특정 항체의 도움으로 드러나며 플루오레세인에 표지되어 융합된 항체에 의해 구분된다.
2. 결 과
변형된 세포가 약 20%가 되면, NS1 바이러스 항원의 특성은 플루오레세인의 높은 표시에 의해 나타날 수 있다.
NS1의 발현은 또한 증명되었으며, 안정된 혈통은 네오마이신과 직면하여 형질감염된 세포 선택의 흔적을 밝힐 수 있다.
도 2는 혈청 타입 1의 뎅그열 바이러스의 NS1 단백질의 서열을 설명하고 있다. 또한 연관되는 암호화된 서열도 설명하고 있다.
실시예 3 : 혈청 타입1의 뎅그열 바이러스에 의한 감염 틀에서 본 발명에 따른 ELISA-포획 기술의 실행과 기술의 내적 상태의 방법으로서의 비교
1.
ELISA-포획 기술의 원리
쥐의 폴리클론 항체에서는 NS1 바이러스 항원을 발견할 수 있다. 그리고 NS1 바이러스 항원은 혈청타입 1에서 뎅그열의 정제된 헥사머 NS1 항원에 대해 면역포획에 의해 사전에 미리 정제되었다.
NS1의 존재는 정제된 헥사머 NS1 단백질에 의해 면역된 토끼의 항체를 통해 드러난다. 이 서양고추냉이의 산화작용을 촉매하는 효소에 결합된 항체에 의해 발견되었다.
2.시설과 방법
a-
NS1 단백질에 대항하여 쥐에게 투여된 폴리클론 항체의 정제
a1-막(membrane)위의 NS1 단백질의 고정
정제된 NS1 단백질은 양성 나일론(Nytran, Schleicher & Schuell)의 진동막(membrane) 흡착작용에 의해 고정되었다. 진동막의 표면은 소의 알부민에 의해 포화상태이며, 인산염 완충 식염수(PBS : 10mM 인산염; pH7.2; 150mM NaCl)에 의해 소금기 있는 완충용액에서 3%의 농축을 나타낸다. PBS로 두번 세척 후에 진동막은 15분 동안 실온에서 0.25% 글루타르알데하이드를 포함하는 PBS로 처리하였다. PBS로 세번 세척한 후에 진동막은 소의 알부민, 100mM 글리신의 탐폰에 의해 중성화 된다. 이후에는 PBS로 2번 세척하고 소듐 1mM의 아지드의 도움으로 PBS에서 4℃에 보관한다.
a2-쥐의 단일종의 폴리클론 항체의 정제(획득 항체)
- 폴리클론복수의 생산 : 유독한 뎅그열 바이러스에 의해 감염된 스위스 새끼쥐의 뇌는 PBS 탐폰 9ml에서 파쇄한다. 생성물은 4℃에서 10분동안 10000g로 원심분리한다.
스위스 쥐에게 바이러스 현탁액을 주사하였다. 이 달력에 따르면
-JO : 넓적다리의 피부밑에 항원 0,5ml
-J3 : 항원0,4ml와 복막 내부의 관에 의한 프로인트 완전보조제 0,1ml
-J25: 복막내부 관에 의한 항원 0,5ml
-J26: 쥐 TG180 의 복수의 0,5ml
-J28: 복막내부 관에 의한 항원 0,5ml
복수는 J42에서 얻어진다.
복수의 수집 후에 엉긴덩어리를(응고덩어리) 실온에서 1시간동안 만들어지게 놓아둔다. 그러고 나서 적어도 30분은 1500 g 원심분리법을 실행시킨다. 잔여물의 pH는 초산2M의 도움으로 4,8로 조정된다. 그리고 잔여물은 같은 조건에서 새로이 원심분리된다. 잔여물의 pH는 탄산나트륨 용액의 첨가에 의해 7,0-7,2로 조정한다. 잔여물은 20℃에서 보관한다.
-혈청타입 1의 뎅그열 바이러스의 특수한 쥐의 항체 정제 :
진동막은 실온에서, 다음에 설명된 것과 같이, 준비된 뎅그열 바이러스의 4혈청타입에 대항하여 폴리클론 복수의 혼합에서 잠재되어 있다.
PBS의 진동막을 세번 세척한 후 NS1 단백질에 고정된 항체는 디에틸아민 pH 11.4 용액으로 분리한다. (100 mM 디에틸아민을 포함하는 Iscove(Gibco)의 변형 둘베코에서). 항체는 한외여과에 의해 농축하고, 1 mM 아지화나트륨을 포함하는 PBS 탐폰에서 교체된다.
b-NS1 단백질에 대항하는 토끼 폴리클론 항체의 준비 (발견의 항체)
토끼의 면역효과는 실시예 1의 방법에 따라서 정제된 헥사머 NS1 단백질의 30mg으로 3 내지 4회의 연속적인 주입에 의해 실행되었다. J0, J7, J21이 사용되었고 경우에 따라서는 J49에서 실행되었고, J83에 흰것에 사혈이 이어졌다. 혈청은 신호에서, 참고문헌에서나 앞에서 설명된 것처럼, 모노클론 항체를 가지는 세파로스의 빌(billes)로써 잠복기에 의해 특수성이 없이 약화되었다.
c-ELISA-포획 실행
c1-발전 표준(courbe etalon)
사람의 혈청을 테스트하는 각각의 ELISA-포획판에 있어서, 종류 표준은 1번에서 설명된 방법에 따라, 정제된 NS1 단백질의 용해로부터 실행된다. 초기상태의 농도는 0,5mg/ml에서부터이며, 3/3으로 희석된다.
C2-급성 단계에서 순환하는 NS1 단백질의 검출
앞에서 설명된 방법에 따라 얻어진 정제된 쥐의 폴리클론 항체는 판 위에 PBS 용해에서 희석되어 고정되어 있다. 그리고 이 항체는 밤 동안 4도씨에서 잠복하고 있다. PBS/Tween 0,05%를 용해하여 5분 동안의 3회 세척 후에, 30분 동안 실내에서, 판은 PBS의 혼합으로, Tween 0,05%와 우유 3%로 포화된다. PBS/Tween 0.05%로 3회 세척한 후 테스트 할 혈청은 희석되거나 안되거나, 침전시킨다. 그리고 여전히 실온에서 1시간동안 반응하게 놓아둔다. 1/10, 1/30, 1/90의 희석은 PBS/Tween 0.05% 용액으로 실행한다. 3회의 세척후에, 항-IgG 항체는 두번째 항체를 예방하는 산화작용을 촉매하는 요소에 의해 표지되었고, 앞에서 말한 항체는 이 분야를 잘 알고 있는 전문가에 의해 준비되었고, 덧붙여 졌으며, 잠복기는 45분동안 37℃에서 실행되었다. 세번의 세척후에, TMB의 용해에 의해 10분간 relever 하였다. 비색반응은 황을 함유하여 멈추어졌다.
3. 결 과
도 3에서 설명된다.
발명에 따른 ELISA-포획 기술은 질병의 급성단계에서 NS1 단백질의 존재를 검출하게 한다. 그리고 이 사실은 환자가 초기 감염인지 두번째 감염인지에는 관계가 없다.
결과는 NS1 단백질의 존재가 일시적이라는 것을 확인한다. 그리고 회복기의 단계에서 실행된 채취에서, 이 단백질은 검출하지 않는다. (표3)
질병의 급성단계에서 채취의 93%는 MAC ELISA 테스트에 의해 음성으로 나타났고 회복기의 단계에서 실행된 채취의 100%는 이 같은 테스트에서 양성으로 나타났다. (도 3 참조)
같은 방법으로는, 회복기에 있는 질병의 급성단계에서 80%의 경우에, 혈액응고의 제지 테스트는 혈청타입1의 뎅그열 바이러스에 의한 감염을 검출하지 못한다. 그러나 이 테스트는 회복단계에서 실행된 채취의 100%의 경우에 양성으로 나타난다. OMS기준에 따르면 회복단계에서 채취된 혈청에서 1280보다 낮은 1HA의 작업과 두번째 뎅그열의 감염에서 1280보다 높은 초기 뎅그열의 감염을 진단하게 해준다. 이 연구에서 양성혈청의 절반은 초기 뎅그열의 경우에 관계가 있고, 다른 절반은 두번째 뎅그열의 경우에 관계가 있다. ELISA-포획 기술은 발명에 따라서 초기나 두번째 뎅그열의 경우에서 NS1 단백질을 검출할 수 있다.
실시예4: 감염창의 정의
1.실행과 방법
a-
뎅그열1 바이러스에 의해 감염된 프랑스 Guyane의 환자들의 인구집단총수를 실행한 연구
채취는 혈청타입의 뎅그열 바이러스에 의해 감염된 환자들에 의해 실행되었다. 이 채취는 임상징후 표시의 발생을 표시하며 회복기 단계의 마지막과 관련이 있다.
채혈은 뎅그열 바이러스 혈청타입 1에 의해 감염된 환자들에게서 이루어진다. 특히 (초기에는 분화되지 않은 열) 임상 표시가 나타나는 J0 타입과 회복기 말기에 나타나는 J66 타입의 환자들에게서 이루어진다.
환자들의 혈청에 대해 실시예 3에서 규정하고 있는 ELISA 포획 방법에 의한 정제 NS1 단백질을 찾고 자료들이 여유가 있을 때 MAC-ELISA로 평가된 특정 IgM에 양성 반응을 통해 얻어진 결과를 비교한다.
b-뎅그열 바이러스 1에 의해 감염된 네 명의 환자들의 일일 검사
J1과 J5 사이의 임상 단계동안 하루에 한 번씩 채혈을 한다. 바이러스 RNA를 명확히 검출하기 위한 RT-PCR 반응과 뎅그열 바이러스의 특수한 IgM 검출을 위한 MAC-ELISA 테스트, 및 상기 ELISA 포획 방법으로 뎅그열 NS1 항원에 대한 연구는 매 혈청 검사마다 이루어진다.
2. 결 과
a-검색 창 결정
결과들은 4번 표에서 기록되어 있다.
J1과 J6 단계 사이에서 순환 NS1 단백질의 검출 가능성은 감염 환자들의 64%(J2 단계)에서 100%(J5 단계)에서 나타난다. J10을 넘어서는 항체에 대한 반응은 우세해 지지만 순환 NS1 단백질은 더 이상 검출되지 않는다.
순환 NS1의 검출이 완전하게 IgM의 존재(바이러스 항체의 특이종)와 관련이 있는 것으로 보이지 않으며 바이러스 항체들은 몇몇의 경우 J3에서도 나타나고 J5부터 정점에 달하며 이것은 J2 단계에서 나타날 수 있는 완벽한 IgG가 나타나는 환자들과는 다른 것이다. 임상학적 단계의 혈청에서 NS1 항원이 검출되지 않는 것은 특별히 NS1 방지를 위한 IgG 존재로 설명될 수 있을 것이다. 본 발명에 의한 ELISA 포획 기술로 NS1 혈청항원 검출 창은 특히 J1과 J6사이에 위치하고 있으며 임상적 징후 후에 나타난다.
b-뎅그열 바이러스에 의해 감염된 4명의 환자들의 일일 검사
결과는 도 5에 제시하였다.
연구된 4명의 환자들에게서 NS1 단백질은 J5까지 계속된 방법으로 검출되었다. 그리고 통증의 초기 보고서에 의하면 채혈의 날이
그리고 어떤 환자들은 단백질의 검출 창이 RT-PCR에 의해 검출된 바이러스 혈증의 시기보다 가장 크게나타났다.
실시예 5: 혈청타입1의 뎅그열바이러스에 의해 감염된 틀에서 모노클론 기구와 함께 ELISA-포획 기술을 실행.
이전에 설명된 ELISA-포획 기술과 비교
1-설비와 방법
2-생산과 혈청타입1 뎅그열의 바이러스의 NS1 단백질에 대해 관리된 생쥐의모노클론 항체의 특징화
a1-단백질 NS1에 대해 관리된 생쥐의 모노클론 항체의 생산
암컷 Balb/C 생쥐의 면역효과는 헥사머, 실시예 1의 방법에 따라서 정제된 혈청1 뎅그열의 바이러스의 NS1 단백질 10mg을 7회 주입하여 실현되었다. 프로인트 완전 보조제와 그 다음 5가지 프로인트 불완전 보조제로 만들어진 첫 주입물은 15일 간격을 두고 피하 경로를 통해 주입하였다. 프로인트 불완전 보조제로 만들어진, 동물의 희생 3일 전에 실행된 마지막 주입은 복강내 경로를 통해 주입하였다.
면역시킨 쥐의 비장 세포는 쥐에 의한 골수종과 함께 하나로 합쳐졌고 규격 프로토콜에 따른 클론의 출현까지 배양했다.
a2-항 NS1 항체를 분비하는 하이브리도마의 동일시
NS1 단백질의 특수한 항체의 검출은 전형적인 ELISA 기술이나 ELISA-포획 기술에 의해 실행되었다.
전형적인 ELISA 기술
실시예 1의 방법에 따른 정제된 헥사머 NS1 단백질은 4℃에서 하룻밤동안 PBS 용액에 1mg/ml의 농도로 판의 흡착작용에 의해 고정시켰다.
PBS/Tween 0.1%(PT) 용액으로 3회 세척한 후에, 단백질은 1시간동안 37℃에서 젤라틴 0.5%를 포함하는 PT(PTG) 용액과 더불어 1/2로 희석된 다른 하이브리도마의 잔여물과 함께 항온처리한다. PT와 함께 3회의 세척후에 PTG에 희석된 퍼옥시다제로 표지된 쥐의 항-IgG 항체를 첨가하여 37℃에서 1시간 동안 항온처리하였다. 3회 세척후에 o-페닐렌디아민에 산소수를 용해하여 발현시킨다.
ELISA-포획 기술
사용된 기술은 실시예 3에서 설명하고 있지만. (cf 급성 단계에서 순환하는 NS1 단백질의 검출) 실험용 세륨의 희석을 혈청 타입 1의 뎅그열 바이러스에 감염이 되거나 그렇지 않은 베로 세포의 배양 잔여물의 PTG 용액의 1/10 희석물로 대체하면서 7% 폴리에틸렌글리콜로 침전시킨다. (cf. 실시예 1: 혈청타입 1의 뎅그열 바이러스의 NS1 단백질의 정제) 감염되지 않은 베로 세포의 배양 잔여물에 대한 다른 하이브리도마의 잔여물들의 반응은 특이하지 않은 신호를 증명하는 구실을 한다.
A3 뎅그 바이러스의 네가지 타입 중 하나에 의한 베로 세포에 대한 간접적인 면역형광검사에 의한 항-NS1 모노클론 항체의 반응성
베로 세포들은 뎅그열 바이러스의 네 가지 혈청 타입들 중 하나로 40시간 이내에 감염되는 것이 확인되었다.
혈청 타입 1 : FGA/89 숙주
혈청 타입 2 : NG 숙주
혈청 타입 3 : H87 숙주
혈청 타입 4 : H241 숙주
PBS 용액으로 한 번 세척을 한 후에 세포들은 실험실 온도에서 30분간 PBS가 3% 함유된 파라포름알데하이드 용액으로 고정시킨다. PBS 용액으로 세척한 세포들은 곧 PBS 용액이 0.5% 함유된 트리톤 X-100 용액에서 10분간 투과된다. PBS용액으로 헹군 후에 세포들은 서로 다른 하이브리도마의 잔여물들과 약 1시간 동안 배양되는데 그 때 ELISA에 양성 반응하게 된다. PBS 용액으로 세번 세척한 후에 플루오레세인으로 표시가 되어 있는 이 실험용 쥐의 항 IgG의 항체가 덧붙여지며 한 시간 동안 배양된다. PBS 용액에서 세 번 세척한 후에 현미경 슬라이드는 얇은 박판으로 덮이고 현미경에는 형광으로 나타난다.
A3 실험용 쥐의 모노클론 복수 준비
모노 클론 복수는 Balb/C 형 실험쥐에서 생산이 된다. 실험쥐들은 프리스탄 0.5ml를 복막내 주사로 투여한다(2,6,10,14 테트라 메틸-펜타디케인, 시그마). 이 주사는 모노클론 항체를 분비하는 하이브리도마 클론의 복막 내부 주사를 투여하기 일 주일 전에 실시한다. 복수는 영하 20℃에서 20분간 원심분리된 복수 형태에 따라 채취한다.
A5 항 NS1 모노클론 항체 동위 원소 결정
항NS1 모노 클론 항체 동위 원소 결정은 쥐에 의한 면역글로불린의 다른 아강에 저항하기 위한 항체의 도움을 받는 ELISA 방법에 의해 실행된다. 면역글로블린의 약한 사슬 결정은 고유의 방법론에 의해 다시 행해진다.
A5 항NS1 모노 클론 항체 친화성의 지속적인 결정(B Friguet et al.,J.Inonunol, (1985),77,305-319)
한 항체의 친화성은 그 항체 부위를 50% 포화시키기 위해서 필수적인 항원으로 농축되는 것과 관련이 있다. 항온처리는 4℃에서 하룻밤 유지되는 동안 지속적인 농축이 필요한 항체와 감소되는 농축이 필요한 항원 사이의 액체에서 이루어진다. 이 과정은 반응의 균형을 이루기 위한 것이다. 균형을 이룬 후 자유 항체에서의 농축은 ELISA 테스트에 의해 결정된다. 혼합은 항원으로 우선적으로 잠복된 판에서 이루어진다. 4도씨에서 20분 동안 인큐베이션이 있은 후에 (균형의 파괴를 막기 위해) ELISA 정보는 효소 반응이 뒤따르는 B형 갈락토시다제와 한 쌍을 이루는 실험쥐의 항IgG 로 이루어진다. KD 해리의 농도가 이렇게 결정된다.
A5 다른 형태의 항NS1 모노클론 항체의 경쟁 반응
본 반응은 동일하거나 또는 상이한 에피토프에 대한 모노클론 항체의 특이성을 결정짓게 해준다. 에피토프의 결정은 하나의 항원에 있어서 표시되지 않은 모노클론 항체에 대한 그리고 비오틴과 한쌍을 이루는 두번째 항체에 대한 반응을 무제로 삼고 있다.
첫번째 표시되지 않은 모노클론 항체는 포화된 농도로 하나의 판에 놓여지고 (이 과정에서 우선적으로 ELISA 테스트를 통해 결정된다) 이 판위에는 이미 37℃에서 두 시간 동안 항원이 고정되어 잠복기를 거쳤다. PT 용액에서 네 차례 세척한 후에 비오틴과 한 쌍을 이루는 두번째 모노클론 항체가 덧붙여 지고 37℃에서 한 시간 잠복기를 거친다. PT 용액에서 네 번의 세척 후 o-페닐렌디아민이 첨가된 산화수 용액으로 정보를 얻게 된다. 분광광도계에서 판독한 내용을 통해 결과를 얻는 것은 두 가지 항체로 식별되는 에피토프들이 다르다는 것을 알려준다. 반대의 경우 두 가지의 모노 클론 항체는 항원의 같은 에피토프에 저항한다는 것이다.
B G18과 F22 모노클론 항체의 정제
G18과 F22 항체는 실시예 3에서 언급했던 대로 면역 유연성으로 정제된다.
C 모노클론 항체를 이용한 ELISA-포획 테스트에 의한 순환 NS1 단백질 검출
정제된 모노클론 항체인 G18과 F22는 희석된 PBS 용액에 혼합되어 있으며 4℃에서 하룻밤 동안 잠복기를 거치게 된다. 본 ELISA 테스트의 다음 단계는 다음 예와 비슷하다.
D 모노클론 접근법을 이용한 ELISA 포획 테스트와 폴리클론 접근을 이용한 테스트의 비교
프랑스의 기얀 혈청 조사 대상은 같은 날에 모노클론식 접근을 이용한 ELISA 포획 테스트와 폴리클론식 접근 테스트를 받았다. 혈청들은 다른 농도, 즉 1/10, 1/30, 그리고 90/1로 희석하였다.
2. 결 과
A 모노 클론 항체의 성격
결과는 도 6에 제시하였다.
G18과 F22항체는 NS1 단백질의 다른 에피토프에 대한 매우 강한 유연성으로 서로 고정시킬 수 있는 능력에 따라 선택되었다. F22항체는 혈청 타입 1에 맞고 G18은 뎅그열 바이러스의 혈청 타입 1과 3에 맞다.
B NS1 항원을 포착하기 위한 모노클론 항체의 사용
결과는 일곱 가지로 나뉘어진다.
선택된 모노클론 항체들은 폴리클론식 접근으로 얻어진 결과를 재생산하는 것 뿐아니라 폴리클론 항체보다 더욱 현저한 반응을 소개한다. 발전된 모노클론의 도구는 특히 그것으로 이루어져야 할 것 같은 진단 이용에 알맞은 것으로 보인다.
실시예 6 : 뎅그열 바이러스의 혈청 또는 다른 플라비바이러스에 의한 감염 차원에서 본 발명에 따른 ELISA 포획 기술의 실행.
1. 재료와 방법
A 배양잔여물의 준비
베로 세포들은 뎅그열 2번 바이러스나 일본 뇌염 바이러스 또는 황열 바이러스를 통해 감염된다. 배양 잔여물은 실시예 1에서 기술하고 있는 방법에 의해 준비된다.
B 일본 뇌염과 황열 바이러스의 NS1 단백질 방지를 위한 모노클론 항체의 정제
8G4, 1A5, 2D10 항체의 모노클론 복수는 황열 바이러스의 NS1 단백질을 방지하며 일본 뇌염 바이러스를 방지하는 171-2-2와 70-14-20 항체는 세파로즈 CL-4B 단백질로 정제한다. 이러한 모노클론 복수는 단백질 A 막에서 4℃에서 하룻밤 동안 항온처리되어야 한다. PBS/Tween 0.05% 함유된 단백질 막을 세번 헹군 후에 단백질 A 막에 고정된 항체들은 pH 3의 글리신 완충 용액으로 분리된다. 그리고 나서 한외 여과로 농축되며 1mM 아지화나트륨을 포함하고 있는 PBS 완충 용액에 다시 놓이게 된다.
C 뎅그열 2번의 배양 잔여물에서 NS1 단백질의 검출
- 사용되는 항체
포착 단계는 3D1과 1A12 모노 클론 항체의 복수를 혼합함으로 만들어 진다. (AKI Falconar et al.,Arch. Virology, (1994), 137, 315-326) 단백질의 식별은 토끼의 두 가지 혈청을 혼합하면서 이루어 진다. 실시예 3에서 언급하고 있는 정제된 단백질로 면역화 시킨 후에 얻어진 혈청과 뎅그열의 네 가지 혈청 타입 바이러스로 면역화 된 후 얻어지는 토끼의 혈청이다.
- ELISA 포획의 과정
여기서 사용하는 기술은 실시예 3에서 언급한 내용과 동일하다.
D 일본 뇌염 바이러스의 배양 잔여물 속에서의 NS1 단백질 검출
- 사용되는 항체
171-2-2와 70-14-20의 정제된 모노클론 항체들은 포착 단계에서 사용된다. 단백질의 식별은 토끼의 두 가지 혈청을 혼합함으로 만들어진다. 이 두 혈청은 우선적으로 일본 뇌염의 NS1 단백질의 결합된 형태의 단백질로 면역이 된 것이다.
- ELISA 포획의 과정
여기서 사용하는 기술은 실시예 3에서 언급한 내용과 동일하다.
E 황열 바이러스의 배양 잔여물 속에서 NS1 단백질 검출과 황열 바이러스 감염 환자들의 혈청
- 사용되는 항체
8G4, 1A5, 2D10의 정제된 모노클론 항체는 PBS 희석 용액에서 혼합되어 포획 항체처럼 사용된다. 여기서 사용되는 황열 NS1의 특이한 두 번째 항체는 황열 17D 바이러스의 NS1 단백질에 대해 미리 면역화된 토끼의 혈청에서 나온다. (J.J.Shlesinger et al., J.immunol(1985), 135, 2805-2809)
- ELISA 포획의 과정
사용되는 방법은 실시예 3에서 언급된 것과 동일하다.
2. 결 과
NS1 단백질의 분비는 시험관에서 다양한 플라비바이러스에 의해 감염되는 세포 배양과 관계가 있었다. 그러한 바이러스들은 DEN2 바이러스(Winkler et al, Virology(1988), 162, 187-196, Pryor et al, Virology(1993)m 194, 769-780), 진드기 뇌염(Lee et al,.J.Gen Virol(1989), 70, 335-343, Crooks et al,. J,Chrom(1990), 502,59-68m Crooks et al,.J,Gen. Virol(1994), 75, 3453-3460), 일본뇌염 (Mason, Virology (1989), 169, 354-364, Fan et al,.Virology (1990), 177, 470-476), 무라이 계곡 뇌염 (Hall et al,. Virology (1991),32,11-20) 과 황열바이러스(Post et al,.Vir.Res.(1990),18,291-302)를 포함한다. 이러한 결과들이 ELISA 테스트의 다양한 기술에 의해 얻어진 것처럼 감염된 포유류의 배양 잔여물에서 본 발명의 ELISA 포획 방식에 의한 단백질의 명확한 검출을 하고자 했다. NS1 단백질은 DEN2 바이러스나 일본 뇌염 바이러스 또는 황열 바이러스에 감염된 베로 세포의 배양 잔여물에서 검출 가능한 것이다.
단백질 역시 8번 예의 결과들이 말해주는 것처럼 황열 바이러스에 감염된 환자들의 혈청에서 이 방법을 통해 검출될 수 있다. Ch.Mathiot가 발표한 18가지의 혈청들 중에서 7가지는 NS1 항원의 양성반응을 보였고 DEN1과 같은 바이러스에서 처럼 순환 NS1 단백질은 특히 황열에 나타나는 IgM에는 무관한 것으로 보인다.
본 발명에 의한 ELISA 포획 기술은 표1a,표1b,표1c(여기서 표의 의미는 연속성을 가지고 있으며 편의상 표 1a,1b,1c로 분할하였음)의 배열리스트에서와 같이다양한 플라비바이러스에 감염된 세포의 배양 잔여물 속에서 그리고 황열에 감염된 환자들의 혈청에서 NS1 단백질을 검출하는 것을 가능하게 한다.
이 기술을 통해서 DEN1 바이러스 외에도 다른 플라비바이러스에 의한 감염을 검출하는데 의료 적용을 가능하게 해준다.
Claims (20)
- 헥사머 형태이고, 플라비바이러스의 NS1 단백질에 대한 면역포획에 의해 예비선발된 폴리클론 항체 및 헥사머 형태이고 상기 플라비바이러스의 NS1 단백질에 대한 높은 친화성에 대하여 예비선발된 뒤 정제된 항-NS1 모노클론 항체로 구성된 그룹 중에서 선택되는 항체로 이루어지는 NS1 당단백질 포획용 항체 또는 제1 항체; 및헥사머 형태인 NS1 단백질에 대하여 유발된 폴리클론 항체 및 헥사머 형태인 NS1 단백질에 대하여 유발된 모노클론 항체의 혼합물로 구성된 그룹 중에서 선택되는 표출 항체 또는 제2 항체를 포함하는 동일하거나 상이할 수 있는 2종 이상의 항체를 이용한 면역 방법으로,감염 임상 단계 전 기간 동안 생물 표본 중에 존재하는 NS1 비구조 당단백질을 검출하는 단계를 포함하는 것이 특징인 플라비바이러스 감염의 조기 검출 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 플라비바이러스 감염이 뎅그열 바이러스에 의한 감염인 것이 특징인 플라비바이러스 감염의 조기 검출 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 제1 항체가 적합한 고체 지지체에 부착되어 있고 상기 제2 항체가 경우에 따라 적합한 표지와 접합되어 있는 것이 특징인 플라비바이러스 감염의 조기 검출 방법.
- 제3항에 있어서, 상기 제2 항체가 표지에 접합되지 않는 경우 상기 고체 지지체에 부착된 NS1 단백질에 대한 결합이 적합한 표지에 접합된 제3 항체에 의해 검출되는 것이 특징인 플라비바이러스 감염의 조기 검출 방법.
- 제4항에 있어서, 상기 제3 항체가 효소에 접합된 것임이 특징인 플라비바이러스 감염의 조기 검출 방법.
- 제5항에 있어서, 상기 제1 항체 또는 포획 항체가 헥사머 형태인 뎅그열 바이러스의 NS1 단백질에 대한 면역포획에 의해 선발된 마우스 폴리클론 항체를 포함하고, 상기 제2 항체 또는 분석될 생물 표본 중에 존재하는 NS1 검출용 항체 또는 제2 항체가 헥사머 형태인 뎅그열 바이러스 혈청형 1의 NS1 단백질로 면역화된 토끼 유래의 폴리클론 항체를 포함하고, 퍼옥시다제가 접합되고 상기 제2 항체에 대하여 지향성인 항체를 포함하는 제3 항체에 의해 상기 제2 항체의 부착이 표현되는 것이 특징인 플라비바이러스 감염의 조기 검출 방법.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 기재된 1종 이상의 포획 항체 및 1종 이상의 표현 항체;헥사머 형태인 플라비바이러스의 NS1 단백질 및/또는 플라비바이러스에 따라 달라지는 다양한 혈청형을 포함하는 1종 이상의 양성 대조군; 및정상인 혈청을 포함하는 1종 이상의 음성 대조군을 포함하는 것이 특징인,플라비바이러스 감염의 조기 검출용 박스 세트.
- 제7항에 있어서, 상기 NS1 단백질이 감염된 포유동물 세포 유래의 배양 상청액 또는 플라비바이러스의 NS1 단백질에 대한 유전자 또는 NS1 단백질 전체 또는 일부를 발현할 수 있는 상기 유전자의 단편 또는 플라비바이러스 게놈의 단편을 포함하는 재조합 플라스미드에 의해 형질감염된 포유동물 세포 유래의 배양 상청액으로부터 수득되는 것이 특징인 플라비바이러스 감염의 조기 검출용 박스 세트.
- 제7항 또는 제8항에 있어서, 상기 NS1 단백질이 뎅그열 바이러스의 NS1 단백질인 것이 특징인 플라비바이러스 감염의 조기 검출용 박스 세트.
- 제8항 또는 제9항에 있어서, 상기 플라스미드가 파스퇴르 연구소의 국립 배양물 미생물 수집소에 1999년 6월 7일자로 기탁된 수탁번호 I-2220의 플라스미드인 것이 특징인 플라비바이러스 감염의 조기 검출용 박스 세트.
- 통상의 기법을 사용하여 NS1 단백질을 정제하기 전에 침전화제로 처리한 뒤 원심분리하여 상기 단백질의 초미립자(microparticulate) 형태로부터 NS1 단백질의 가용성 형태를 분리하는 단계를 포함하는 것이 특징인, 감염된 포유동물 세포 유래의 배양 상청액 또는 플라비바이러스의 NS1 단백질에 대한 유전자 또는 NS1 단백질을 발현할 수 있는 상기 유전자의 단편 또는 플라비바이러스 게놈의 단편을 포함하는 재조합 플라스미드에 의해 형질감염된 포유동물 세포 유래의 배양 상청액으로부터 헥사머 형태인 플라비바이러스의 NS1 단백질을 정제하는 방법.
- 1종 이상의 약학적 허용성 부형제와 함께, 활성 성분으로서 헥사머 형태이고 경우에 따라 다른 단백질에 결합되어 있는 플라비바이러스의 NS1 단백질을 포함하는 것이 특징인 면역원성 조성물.
- 제12항에 있어서, 각종 뎅그열 바이러스의 혈청형에 대응하는 헥사머 형태인 NS1 단백질의 1종 이상의 혼합물을 포함하는 것이 특징인 면역원성 조성물.
- 생체내에서 항체 생산을 유도할 수 있는 면역원성 조성물의 제조에 사용하기 위한, 헥사머 형태의 NS1 단백질 또는 이 단백질의 발현용 시스템의 용도.
- 수동 면역을 유도할 수 있는 의약 제품의 제조에 사용하기 위한, 비분해된 헥사머 형태의 NS1 단백질에 대해 높은 친화성이 있고 정제 및 변형된 1종 이상의 모노클론 항-NS1 항체의 용도.
- 감염 초기 단계에서 플라비바이러스에 의한 감염을 진단할 수 있는 특이적인 항-NS1 항체를 시험관내에서 선발하는데 사용하기 위한, 비분해된 헥사머 형태의NS1 단백질의 용도.
- 혈청형에 관계없이 뎅그열 바이러스의 NS1 단백질 전체 또는 일부분을 발현할 수 있는 폴리뉴클레오타이드, 및혈청형에 관계없이 뎅그열 바이러스의 NS1 단백질을 암호화하는 DNA를 주입된 숙주내에서 발현시킬 수 있는 1종 이상의 프로모터와 상기 단백질을 발현하는 유전자를 포함하는 발현 시스템으로 구성된 그룹 중에서 선택되는 활성 성분을 1종 이상의 약학적 허용성 부형제와 함께 포함하는 것이 특징인 면역원성 조성물.
- 서열 번호 1의 서열에 기재된 폴리뉴클레오타이드에 대한 프로모터와 결합된 상기 폴리뉴클레오타이드를 적합한 진핵 세포에서 발현시키는 단계를 포함하는 것이 특징인, 뎅그열 바이러스의 NS1 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 발현시키는 방법.
- 제11항에 있어서, 상기 플라비바이러스가 혈청형에 관계없이 뎅그열 바이러스인 것이 특징인, NS1 단백질을 정제하는 방법.
- 제11항 또는 제19항에 있어서, 상기 플라비바이러스가 뎅그열 바이러스 혈청형 1 인 것을 특징으로 하는 NS1 단백질을 정제하는 방법.
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