FR2871888A1 - Methode de diagnostic ou de depistage d'une infection clinique ou asymptomatique par un flavivirus du groupe encephalitique - Google Patents

Abstract

La présente invention est relative à une méthode de diagnostic ou de dépistage d'une infection clinique ou asymptomatique par un flavivirus appartenant au groupe encéphalitique et en particulier le virus du Nil Occidental, chez l'Homme ou l'animal, à l'aide d'anticorps anti-NS1 de flavivirus reconnaissant la forme sécrétée de la protéine NS1 dudit flavivirus appartenant au groupe encéphalitique, ainsi qu'aux dits anticorps anti-NS 1 de flavivirus.

Description

La présente invention est relative à une méthode de diagnostic ou de

dépistage d'une infection clinique ou asymptomatique par un flavivirus du groupe encéphalitique, en particulier le virus du Nil Occidental, chez l'Homme ou l'animal.

La présente invention est également relative à des anticorps monoclonaux anti-NSI de flavivirus, utiles pour la mise en oeuvre de ladite méthode.

Le groupe des flavivirus encéphalitiques (ou flavivirus à encéphalite) englobe le complexe sérologique de l'encéphalite japonaise qui comprend, outre le virus de l'encéphalite japonaise (JE), le virus du Nil Occidental (West-Nile ou WN), le virus de l'encéphalite de Saint Louis (SLE), le virus Kunjin (KJ) et le virus de l'encéphalite de la vallée de Murray (MVE), ainsi que le complexe sérologique des encéphalites à tiques (TBE pour Tick-borne encephalitis). L'ensemble de ces virus présente la structure classique des flavivirus comprenant un ARN génomique monocaténaire de polarité positive, associé à plusieurs copies de la protéine de capside C pour former la nucléocapside. Celle-ci est entourée d'une enveloppe virale constituée d'une double couche lipidique issue des membranes du réticulum endoplasmique (RE) dans lesquelles sont ancrées la protéine d'enveloppe E et la protéine de membrane M. L'ARN génomique contient un unique cadre de lecture ouvert d'environ 10500 nucléotides, flanqué de deux courtes régions non-codantes à ses extrémités 5' et 3'. Le génome est traduit en une polyprotéine d'environ 3400 acides aminés qui est le précurseur des protéines structurales C, prM (le précurseur intracellulaire de M) et E et de sept protéines non-structurales (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B et NS5) (Campbell et al., Lancet In Dis., 2002, 2, 519-529; Petersen et al., Emerg. Infect. Dis., 2001, 7, 611-614).

En particulier, le virus WN qui est transmis à son hôte par un vecteur moustique, le plus souvent du genre Culex, est responsable de zoonoses impliquant principalement les oiseaux, réservoir naturel du virus, mais également les chevaux et d'autres animaux tels que les amphibiens et les reptiles (Campbell et al., précité ; Petersen et al., JAMA, 2003, 290, 524-528; Petersen et al., 2001, précité). Le virus WN a été isolé pour la première fois en 1937 en Ouganda, et a depuis été observé régulièrement en Afrique, en Australie, au Moyen-Orient et en Europe (Hayes, Ann., N_ Y. Acad. Sei., 1999, 951, 25-37). Cette infection virale peut également se manifester chez l'Homme de manière accidentelle et provoquer, dans certains cas, des signes neurologiques sévères. Récemment, des épidémies ayant affecté plusieurs centaines d'individus ont été rapportées en Roumanie (1996; Campbell et al., Ann. N. Y. Acad. Sci., 2001, 951, 94, 101; Tsai et al., Lancet, 1998, 352, 767-771), en Israël (2000; Bin et al., Ann. N. Y. Acad. Sci., 2001, 951, 127-142) et aux Etats-Unis (1999-2003; Jonhson et al., Curr. Neurol. Neurosci Rep., 2002, 2, 496-500; Marfin et al., Clin. Infect. Dis., 2001, 33, 1713-1719; Marfin et al., Emerg_ Infect. Dis., 2001, 7, 730-735; Meek et al., Curr. Opin. Pediatr., 2002, 14, 72-77; Motashari, Lancet, 2001, 358, 261-264; Nash et al., N. Engl. J. Med., 2001, 344, 1807-1814; Pepperell et al., Cmaj, 2003, 168, 1399-1405; Zeller et al., Eur J. Clin. Microbiol. Infect. Dis, 2004, 23; 147-156).

Dans le cas d'une infection naturelle par le virus WN, environ 30% des individus présentent des symptômes bénins et moins de 1% développent une méningo-encéphalite qui peut s'avérer fatale dans 5 à 20% des cas (Motashari et al. précité ; Petersen et al., 2003, précité). La période d'incubation entre une piqûre de moustique et le début des symptômes varie approximativement de 3 à 15 jours. Le virus peut être détecté dans le sang 1 à 2 jours après l'introduction du virus WN dans l'organisme et la durée moyenne de la virémie est de 6 jours.

Toutefois, même si le virus n'est pas responsable de nombreux cas cliniques chez l'Homme, la forte proportion d'infections asymptomatiques, associée à une virulence particulièrement élevée du virus WN, représente un risque potentiel de transmission de l'infection lors de dons de sang ou d'organes. En effet, plusieurs cas d'encéphalite mortelle ont été observés aux Etats-Unis chez des sujets transfusés par du sang ou transplantés par des organes contaminés par le virus WN (Biggerstaff et al., Transfusion, 2002, 42, 1019-1026; Pealer et aI., N. ENGL. J. MED., 2003, 349, 1236- ; Iwamoto et al., N. ENGL. J. MED., 2003, 348, 2196-2203; Harrington et al., Transfusion, 2003, 43, 1018-1022) . Le diagnostic de l'infection par le virus WN repose actuellement sur les méthodes suivantes: - l'isolement du virus, par des techniques de virologie classique, notamment par infection de cultures de cellules ou propagation en cerveau de souri- ceaux ou amplification par inoculation aux moustiques, suivi de la détection de protéines virales par un test d'immunofluorescence à l'aide d'anticorps monoclonaux spécifiques du virus WN. Cette méthode présente l'inconvénient d'être très difficile à mettre en oeuvre et de dépendre de la précocité du prélèvement et de bonnes conditions de conservation; de plus les premiers résultats ne peuvent être obtenus en moins d'une semaine, - la détection d'anticorps (IgM ou IgG) dirigés contre le virus WN par un test ELISA (Tardei et al., J. Clin. Microbiol., 2000, 38, 2232-2239; Martin et al., Clin. Diagn., Lab. Immunol., 2002, 9, 544-549; Malan et al. , Am. J. Clin. Pathol., 2003, 119, 508-515). Cette méthode ne permet pas un diagnostic précoce de l'infection dans la mesure où les anticorps les plus précoces (IgM) apparaissent dans les premiers jours suivant le début des signes cliniques. De plus, elle n'est pas spécifique du virus WN, du fait des réactions sérologiques croisées entre le virus WN et les virus du même sérogroupe comme le virus de l'encéphalite de Saint-Louis (SLE) et le virus de l'encéphalite japonaise (JE). En conséquence, pour établir le diagnostic de l'infection par le virus WN, cette méthode doit être combinée à la mise en évidence d'anticorps neutralisants spécifiques du virus WN par un test de neutralisation en culture cellulaire, qui est difficile à mettre en oeuvre et implique un délai supplémentaire d'une semaine pour obtenir les premiers résultats (Lanciotti et al., J. Clin. Microbiol., 2000, 38, 4066-4071), - la détection de l'ARN viral par des méthodes d'amplification des acides nucléiques viraux, notamment par RT-PCR quantitative en temps réel (Kauffman et al., J. Clin. Microbiol., 2003, 41, 3661-3667; Lanciotti et al., précité).

Depuis juin 2003, la recherche du virus, à l'aide des kits commercialisés par ROCHE et GENPROBE-CHIRON est obligatoire pour tous les dons de sang ou d'organes aux Etats-Unis (CDC-MMWR Morb. Mortal. Wkly Rep., 2003, 52, 769-772). Cette méthode ne peut pas être utilisée en routine dans tous les pays concernés par l'infection par le virus WN pour des raisons de coût et d'équipement et n'est pas toujours fiable. En effet, malgré un dépistage systématique des dons de sang ou d'organes aux Etats-Unis, quelques cas de transmission du virus WN après transfusion ou transplantation ont été rapportés (CDC-MMWR Morb Mortal Wkly Rep, 2003, 52, 916-919). Les donneurs incriminés avaient un niveau de virémie indétectable par R"l--PCR et n'avaient pas encore d'IgM au moment du don.

Dans ce contexte, il existe un réel besoin de disposer d'autres méthodes de diagnostic susceptibles de faciliter la mise en évidence des infections par 5 le virus WN et en particulier des infections asymptomatiques.

La protéine non structurale NS 1 qui est une glycoprotéine hautement conservée dans la famille des flavivirus, apparaît comme essentielle pour la viabilité du virus. A l'heure actuelle, la fonction biologique de la protéine NS1 n'est pas connue. Dans les cellules infectées par des flavivirus, NS1 est associée aux organelles intracellulaires (Mackenzie et al., Virology, 1996, 220, 232-240; Westaway et al., J. Virol., 1997, 71, 6650-6661) ou transportée à la surface cellulaire par la voie de sécrétion (Schlesinger et al., J. Gen. Virol., 1990, 71, 593-599). Dans les cellules de mammifères, mais pas dans les cellules d'insectes, une partie de la protéine NS1 est libérée dans le milieu extracellulaire sous forme d'une protéine hexamérique soluble (forme sécrétée ou extracellulaire), selon un processus dépendant de la glycosylatiun (Crooks A.J. et al., J. Gen. Virol., 1994, 75, 3453-3460; Flamand et al., J. Viral., 1999, 73, 6104-61 10; Demandes FR 99/07290 et FR 99/07361 et Demande Inter-nationale PCT WO 00/75665).

Cette forme sécrétée de NS1 a été détectée dans le surnageant de culture de cellules de mammifères infectées, in vitro, par certains flavivirus dont le virus de la dengue (Winkler et al., Virology, 1988, 162, 187-196; Pryor et al., Virology, 1993, 194, 769-780; Flamand et al., précité ; Demandes FR 99/07290 et FR 99/07361 et Demande Internationale PCT WO 00/75665), de l'encéphalite à tique (Lee et al., J. Gen. Virol., 1989, 70, 335-343, Crooks et al., J. Chrom., 1990, 502, 59- 68, Crooks et al., J. Gen. Virol., 1994, 75, 3453-3460), de l'encéphalite japonaise (Mason, Virology, 1989, 169, 354-364; Fan et al., Virology, 1990, 177, 470-476 Demande Internationale PCT WO 00/75665), de l'encéphalite de la vallée de Murray (Hall et al., J. Viral. Meth., 1991, 32, 11-20) et de la fièvre jaune (Post et al., Vir. Res., 1990, 18, 291- 302; Demande Internationale PCT WO 00/75665).

Cette forme sécrétée de NSI a également été détectée dans le sérum de patients en phase aiguë d'infection primaire par le virus de la dengue ou de la fièvre jaune et représente un marqueur utile pour la détection précoce de l'infection par le virus de la dengue ou de la fièvre jaune. L'infection est détectée par un procédé d'immunocapture (ELISA sandwich) utilisant deux anticorps ou mélange d'anticorps différents spécifiques de la protéine NS1 du virus à détecter: (i) un mélange d'anticorps monoclonaux de souris dirigés contre la protéine NS1, fixé sur un support solide, pour la capture de l'antigène NSI soluble éventuellement présent dans le sérum à tester, et (ii) un mélange d'anticorps polyclonaux de lapin dirigés contre la protéine NS1, pour la détection de l'antigène NSI capturé (Demandes FR 99/07290 et FR 99/07361 et Demande Internationale PCT WO 00/75665).

Les Inventeurs ont maintenant mis en évidence la forme sécrétée de la protéine NSI dans le surnageant de cellules de mammifères infectées in vitro par le virus WN, ainsi que dans le sérum d'individus (homme ou animal), infectés par le virus WN, et ils ont notamment montré que la fenêtre de détection de la protéine NS] est plus large que la durée de la virémie.

En outre, les Inventeurs ont isolé de nouveaux anticorps qui reconnaissent cette forme sécrétée de la protéine NSI de flavivirus appartenant au groupe encéphalitique et en particulier du virus WN, de façon sensible et spécifique.

Du fait de la découverte d'une protéine NS1 sécrétée, détectable dans le sérum des individus infectés, et de l'isolement d'outils appropriés à sa détec- tion, les Inventeurs proposent une nouvelle méthode de diagnostic ou de dépistage des infections par les flavivirus appartenant au groupe encéphalitique et en particulier le virus WN, par immunocapture de la protéine NS1.

La sensibilité de la détection de la protéine NS1 dans les échantillons analysés, permet d'envisager l'utilisation de ces anticorps, aussi bien pour le diagnos- tic précoce de l'infection clinique chez l'Homme ou l'animal que pour le dépistage de l'infection asymptomatique chez l'Homme à partir de prélèvements de sang ou d'organes destinés respectivement à la transfusion et à la transplantation.

En conséquence, la présente invention a pour objet une méthode de diagnostic ou de dépistage d'une infection clinique ou asymptomatique par un flavivirus appartenant au groupe encéphalitique, en particulier le virus du Nil Occidental, chez l'Homme ou l'animal, laquelle méthode est caractérisée en ce qu'elle comprend au moins: (a) la mise en contact d'un échantillon biologique in vitro, avec au moins un anticorps anti-NS1 de flavivirus reconnaissant la forme sécrétée de la protéine NS1 dudit flavivirus du groupe encéphalitique, en particulier du virus du Nil Occidental, et (b) la détection par tout moyen approprié de la présence de la protéine NS1 dans ledit échantillon biologique, par exemple par EIA, ELISA, RIA, ou par immunofluorescence.

Conformément à l'invention le groupe des flavivirus encéphalitiques ou flavivirus à encéphalite englobe outre le virus du Nil Occidental (virus WN), le virus de l'encéphalite japonaise, le virus de l'encéphalite de St Louis, le virus Kunjin, le virus de l'encéphalite de la vallée de Murray et les virus des encéphalites à tiques.

Le dépistage et/ou le diagnostic de l'infection peuvent être effectués chez tous les individus humains ou animaux sensibles à l'infection par un flavivirus appartenant au groupe à encéphalite, en particulier le virus WN, à partir d'un échantillon biologique contenant la protéine NS1 sécrétée.

La méthode selon l'invention peut être utilisée aussi bien en vue du diagnostic et/ou du dépistage systématique de l'infection, qu'à des fins de surveillance ou d'étude épidémiologique des infections par les flavivirus du groupe encéphalitique. comme en particulier le virus WN.

Le diagnostic de l'infection est réalisé de préférence à partir d'un prélèvement de sang.

Le dépistage de l'infection asymptomatique est réalisé en particulier dans des prélèvements de sang ou d'organes destinés respectivement à la transfusion et à la transplantation, notamment chez l'Homme.

Dans la présente invention, sont considérées comme infections asymptomatiques ou inapparentes, les infections qui induisent une virémie sans pour autant conduire au développement de signes cliniques (réplication virale à bas bruit 15 difficile à détecter par réaction de polymérisation en chaîne (PCR) ou réplication virale à taux élevé dans un organisme résistant ou non susceptible).

Selon un mode de mise en oeuvre avantageux de ladite méthode. ledit anticorps anti-NS1 de flavivirus est un anticorps monoclonal reconnaissant la 5 forme sécrétée de la protéine NS1 du virus du Nil Occidental.

Selon une disposition avantageuse de ce mode de mise en (tu re. ledit anticorps monoclonal est sélectionné dans le groupe constitué par: l'anticorps dirigé contre la protéine NS1 du virus du Nil Occidental, dénommé WN 8E7, qui correspond à l'hybridome déposé sous le n 1-3178, le 4 mars 2004, auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, l'anticorps dirigé contre la protéine NS1 du virus du N i l Occidental, dénommé WN 11B2, qui correspond à l'hybridome déposé sous le n 1-3179, le 4 mars 2004, auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, l'anticorps dirigé contre la protéine NSI du virus du N i] Occidental, dénommé WN 11C10, qui correspond à l'hybridome déposé sous le n 1-3180, le 4 mars 2004, auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, l'anticorps dirigé contre la protéine NS1 du virus du Nil Occidental, dénommé WN 14F6, qui correspond à l'hybridome déposé sous le n 1-3181, le 4 mars 2004, auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, l'anticorps dirigé contre la protéine NS1 du virus du Nil Occidental, dénommé WN 17Al2 qui correspond à l'hybridome déposé sous le n" 1-3182, le 4 mars 2004, auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, l'anticorps dirigé contre la protéine NS1 du virus du Nil Occidental, dénommé WN 17B5, qui correspond à l'hybridome déposé sous le n 1-3183, le 4 mars 2004, auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, l'anticorps dirigé contre la protéine NS1 du virus de la dengue de sérotype 4, dénommé D4 7G9, qui correspond à l'hybridome déposé sous le n I-3184, le 4 mars 2004, auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, l'anticorps dirigé contre la protéine NS1 du virus de la dengue de sérotype 3, dénommé D3 4F7, qui correspond à l'hybridome déposé sous le n 1-3185, le 4 mars 2004, auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, l'anticorps dirigé contre la protéine NS1 du virus de la dengue de 10 sérotype 2, dénommé D2 17Al2, qui correspond à l'hybridome déposé sous le n I-3186, le 4 mars 2004, auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, et l'anticorps dirigé contre la protéine NSI du virus de la valléc de Murray, dénommé MVE 4G4.

Selon un autre mode de mise en oeuvre avantageux de ladite méthode, l'étape (a) comprend: (ai) la mise en contact dudit échantillon biologique avec au moins un premier anticorps qui est fixé sur un support approprié (anticorps de capture de NS 1), notamment une microplaque, (a2) le lavage dudit support, et (a3) l'addition d'au moins un second anticorps, identique ou diflcrent du premier (anticorps de révélation), ledit anticorps étant éventuellement conjugué à un marqueur approprié.

Cette méthode qui permet de capturer la protéine NSI présente dans l'échantillon biologique est également dénommé méthode d'immunocapture. Selon une disposition avantageuse de ce mode de mise en ouvre de ladite méthode: - l'anticorps de capture de NSI est sélectionné dans le groupe constitué par: le mélange des anticorps MVE 4G4 et D2 17Al2, ou le mélange des 30 anticorps MVE 4G4 et D3 4F7, et - l'anticorps de révélation de NS1 est le mélange des anticorps 11 V l 20 4G4, D2 17Al2, D3 4F7 et D4 7G9, de préférence conjugués à un marqueur approprié, notamment une enzyme comme la peroxydase de raifort.

Selon une autre disposition avantageuse de ce mode de mise en oeuvre de ladite méthode: - l'anticorps de capture de NS1 est l'anticorps MVE 4G4. et - l'anticorps de révélation de NS1 est le mélange des anticorps I)2 17Al2 et D4 709, de préférence conjugués à un marqueur approprié, notamment une enzyme comme la peroxydase.

L'étape (b) de détection des complexes antigène NS1-anticorps formés est réalisée, soit directement à l'aide d'un anticorps anti-NS1 conjugué à un marqueur apte à produire un signal détectable et/ou quantifiable, soit indirectement à l'aide d'un anti-anticorps marqué, dirigé contre ledit anticorps anti-NS I: ledit anticorps anti-NS1 est l'anticorps de révélation dans le cas d'une méthode d'immunocapture.

Lorsque ledit marqueur est une enzyme telle que la peroxydase de raifort ou la phosphatase alcaline, les complexes antigènes NS1-anticorps sont détectés à l'aide d'un substrat approprié, notamment un substrat coloré, fluorescent ou chimioluminescent.

Selon un autre mode de mise en oeuvre avantageux de ladite méthode, l'étape b) de détection de ladite protéine NS1 est réalisée à l'aide d'un anticorps conjugué à une enzyme et d'un substrat chimioluminescent. L'utilisation d'un tel couple enzyme/substrat pour la révélation des complexes antigène NS1-anticorps formés, permet avantageusement d'augmenter la sensibilité de détection de la protéine NS 1.

La présente invention a également pour objet un kit ou coffret de dépistage et/ou de diagnostic d'une infection clinique ou asymptomatique par un flavivirus du groupe à encéphalite et en particulier le virus du Nil Occidental. caractérisé en ce qu'il comprend: au moins un anticorps monoclonal anti-NS1 de Ib. i\ irus 30 reconnaissant la forme sécrétée de la protéine NS1 du virus du Nil Occidental. tel que défini précédemment, au moins un contrôle positif constitué par la protéine NS1 d'un flavivirus appartenant au groupe à encéphalite, en particulier du virus du Nil Occidental, et - au moins un contrôle négatif constitué par un sérum normal.

Selon un mode de réalisation avantageux du coffret de diagnostic selon l'invention, ladite protéine NSI est préparée à partir d'un surnageant de culture, soit de cellules de mammifères infectées, soit de cellules de mammifères modifiées par un vecteur recombinant permettant l'expression de ladite protéine NS 1 sous forme sécrétée.

De préférence, ladite protéine NS1 est préparée selon le procédé de purification tel que décrit dans la Demande Internationale PCT WO 00/75665.

Selon une disposition avantageuse de ce mode de réalisation dudit coffret de diagnostic, ledit contrôle positif est préparé à partir de cellules 2 3 T transduites de façon stable à l'aide d'un plasmide dénommé pTR!Pr\t13.('IR1V- NS1(WNV), qui ont été déposées sous le n I-3215, le 18 mai 2004, auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, 25 rue du Docteur Roux_ 75724 Paris Cedex 15.

La présente invention a également pour objet les anticorps monoclonaux dénommés respectivement WN 8E7, WN 11 B2, WN 11('10, WN 14E6, WN 17Al2, WN 17B5, D4 7G9, D3 4F7, D2 17Al2 et MVE 4G4 tels que définis ci-dessus, déposés respectivement sous le n I-3178, I-3179, I-3180, I-3181. 1-3182. I-3183, I-3184, I-3185 et I-3186, le 4 mars 2004, auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15.

La réactivité de ces anticorps vis-à-vis de la forme sécrétée de la protéine NS1 des différents flavivirus du groupe encéphalitique et en particulier du virus WN est illustrée par les tableaux II et III.

Selon un mode de réalisation avantageux dudit anticorps. il est conjugué à un marqueur apte à produire un signal détectable et/ou quantifiable.

Parmi les marqueurs utilisés, on peut citer à titre d'exemple nonlimitatif, les marqueurs fluorescents, le système biotine/streptavidine, les marqueurs non isotopiques ou les enzymes, comme par exemple la peroxydase de raifort ou la Il phosphatase alcaline. L'utilisation de la peroxydase en combinaison avec un substrat chimioluminescent permet avantageusement d'augmenter la sensibilité de détection de la protéine NS 1.

La présente invention a également pour objet, un anticorps mono- clonai anti-NS1 tel que défini ci-dessus ou un mélange desdits anticorps monoclonaux anti-NS1, comme réactif de diagnostic et/ou de dépistage d'une infection clinique ou asymptomatique par un flavivirus appartenant au groupe encéphalitique, en particulier le virus du Nil occidental, chez l'Homme ou l'animal.

Le diagnostic et/ou le dépistage sont réalisés par toute méthode 10 immunologique connue de l'Homme du métier, notamment par immunolluoresccncc, RIA, ELISA, RIA.

La présente invention a également pour objet, un anticorps monoclonal anti-NS1 tel que défini ci-dessus ou un mélange desdits anticorps monoclonaux anti-NSI, comme médicament pour la prévention et/ou le traitement d'une infection par un flavivirus appartenant au groupe encéphalitique, en particulier le virus du Nil occidental (immunisation passive), chez I'Homme ou l'animal.

Les anticorps monoclonaux selon l'invention sont produits i1 partir d'hybridomes obtenus par fusion de lymphocytes B d'un animal immunisé par une protéine NS1 de flavivirus, notamment d'un flavivirus appartenant au groupe encéphalitique, en particulier le virus WN, avec des myélomes, selon la technique de Kdhler et Milstein (Nature, 1975, 256, 495-497) ; Ies hybridomes sont cultisés in vitro, notamment dans des fermenteurs ou produits in vivo, sous forme d'ascite. Ils sont purifiés par les techniques classiques connues de l'Homme du métier, notamment par chromatographie d'affinité ou échanges d'ions.

Les différents réactifs dérivés des anticorps sont préparés et utilisés selon les techniques classiques de biologie moléculaire et d'immunologie. en suivant les protocoles standards tels que ceux décrits dans Current Protocoles in mloleeirlar Biology (Frederick M. AUSUBEL, 2000, Wiley and Son Inc., Library ol (')ngress. USA), dans Current Protocols in Immunology (John E. Cologan, 2000, Wiley and Son Inc. Library of Congress, USA) et dans Antibodies: A Laboratory Maniuil (1o:. f lowell and D Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988).

La méthode de diagnostic et/ou de dépistage d'une infection clinique ou asymtomatique par un flavivirus appartenant au groupe encéphalitiquc_ et en particulier le virus du Nil Occidental selon l'invention, notamment la méthode d'immunocapture selon la présente invention, présente les avantages suivants: - elle est sensible: on peut détecter jusqu'à 1 ng de protéine ml de sérum avec une révélation colorimétrique classique; lorsqu'un substrat chimioluminescent est utilise a la place d'un substrat coloré, la sensibilité augmente d'un facteur 100 et l'on peut détecter jusqu'à 0,01 ng de protéine/ml de sérum.

- elle est rapide: on peut obtenir une réponse dans la journée, - elle peut-être réalisée pendant toute la phase clinique de la maladie, aussi bien pendant la phase précoce, lorsque les anticorps spécifiques ne sont pas encore détectable que pendant la phase plus tardive, lorsque la viréniic n'est plus détectable, - elle est utilisable pour n'importe quelle souche de lavivirus 15 appartenant au groupe encéphalitique, en particulier du virus du Nil Occidental. du tait de la conservation de certains épitopes de la protéine NS1.

D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaissent dans la suite de la description et des exemples illustrés par les figures dans lesquelles: - la figure 1 illustre la détection en ELISA de la forme sécrétée de la protéine NS 1 du virus WN, sous forme native ou recombinée, - la figure 2 illustre la réactivité en ELISA des anticorps monoclonaux anti-NS1, - la figure 3 illustre l'immunocapture de la protéine NS 1 du virus WN en ELISA, avec les différents anticorps anti-NS1 seuls ou en combinaison. La révélation est effectuée avec différents mélanges des anticorps MVE 4(14, I)2 17:A 12. D3 4F7 et D4 7G9 couplés à la peroxydase.

- la figure 4 illustre la courbe étalon du test ELISA d'immunocapture selon l'invention: test ELISA de spécificité (A) et de sensibilité (^) . "Test LI.ISA de spécificité ; anticorps de capture: MVE 4G4 et anticorps de révélation: (D2 17Al2+D4 7G9) couplés à la peroxydase. Test ELISA de sensibilité : anticorps de capture: MVE 4G4+D2 17Al2 ou MVE 4G4+D3 4F7 et anticorps de révélation: (MVE 4G4+D2 17Al2+D3 4F7+D4 7G9) couplés à la peroxydase. l e seuil de positivité est indiqué par une ligne en pointillés.

- la figure 5 illustre la cinétique de détection de la protéine NS I \VN dans le sérum d'animaux infectés expérimentalement, par le test 11.15.1 d'immunocapture selon l'invention (ELISA de sensibilité av cc NIV[ 4G4+ D2 17Al2 comme anticorps de capture). Le seuil de positivité est indiqué par une ligne en pointillés. Chaque animal est individualisé sous forme de point (A) ou de courbe (B) A: Souris inoculées par voie intra- péritonéale (É), souris contrôle (;1); le nombre de sérums dont la DO est similaire est indiqué entre parenthèses. B Poulets inoculés par voie sous- cutanée; poulet 12 (É), poulet 13 (II), poulet 14 (A), poulet 15 (É), - la figure 6 illustre la détection de la protéine NS I WN (Lins (les sérums de chevaux infectés par le virus WN (épidémie 2000, Camargue. France), par le test ELISA d'immunocapture selon l'invention. 47 sérums ont été analysés avec l'ELISA de sensibilité (MVE 4G4+D3 4F7 comme anticorps (le capture).('inq sérums ont été testés en ELISA de spécificité . Chaque symbole représente un sérum de cheval positif (É) ou suspecté positif (0) ou un sérum négatif-(0) (Lins le test (le sensibilité . Le nombre de sérums dont la DO est similaire est indiqué entre parenthèses. Le seuil de positivité est indiqué par une ligne en pointillés, - la figure 7 illustre la détection de la protéine NSI \VN (Lins (les sérums ou LCR de patients infectés par le virus WN (épidémie 1996, Roumanie), par le test ELISA d'immunocapture selon l'invention. 35 sérums et 13 1,CR ont été analysés avec l'ELISA de sensibilité (MVE 4G4+D2 17Al2 comme anticorps (le capture), 11 sérums et 2 LCR ont également été testés en ELISA de spécificité .

Chaque symbole représente un sérum humain positif (É) ou suspecté positif (e), un sérum négatif (0) ou un LCR (A) dans le test de sensibilité . Le nombre (le sérums ou de LCR dont la DO est similaire est indiqué entre parenthèses. Le seuil (le positivité est indiqué par une ligne en pointillés.

- la figure 8 illustre la sensibilité de la détection de la protéine NS! WN par le test ELISA d'immunocapture selon l'invention, en utilisant un substrat coloré pour la révélation de la réaction immunoenzymatique. A: "l'est FI1SA (le sensibilité ; anticorps de capture: MVE 4G4+D2 17Al2 et anticorps de révélation: (MVE 4G4+D2 17Al2+D3 4F7+D4 7G9) couplés à la peroxydase. R: "Test V1.1S \ de spécificité ; anticorps de capture: MVE 4G4 et anticorps de révélation: (D2 17A 12+ D4 7G9) couplés à la peroxydase.

- la figure 9 illustre la sensibilité de la détection de la protéine NS1 WN par le test ELISA d'immunocapture selon l'invention, en utilisant un substrat chimioluminescent pour la révélation de la réaction immunoenzymatique. : "lest ELISA de sensibilité ; anticorps de capture: MVE 4G4+D2 17Al2 et anticorps de révélation: (MVE 4G4+D2 17Al2+D3 4F7+D4 7G9) couplés à la peroxydase. B Test ELISA de spécificité ; anticorps de capture: MVE 4G4 et anticorps (le révélation: (D2 17Al2+ D4 7G9) couplés à la peroxydase.

- la figure 10 illustre la comparaison de la sensibilité de la détection de la protéine NS1 WN par le test ELISA d'immunocapture selon l'invention. en utilisant un substrat coloré ou chimioluminescent pour la révélation de la réaction immunoenzymatique. Test ELISA de sensibilité ; anticorps de capture: N'1VN 4G4+D2 17Al2 et anticorps de révélation: (MVE 4G4+D2 17Al2 I D3 417 1) 4 7G,)) couplés à la peroxydase A: substrat coloré. B: substrat chimioluminescent.

Exemple 1: Mise en évidence de la forme sécrétée de la protéine NS 1 du virus WN Des cellules Vero infectées ou non par le virus du Nil occidental ont été maintenues à 37 C en présence de 5% CO2, et les surnageants de cultures cellulaires ont été récoltés à 72 h. Des cellules HEK293 transduites 4 ou 5 fois avec le plasmide pTRIPAU3.CMV-NS1 (WNV) tel que décrit à l'exemple 2, ont été maintenues à 37 C en présence de 5% CO2 et les surnageants de cultures cellulaires ont été récoltés à 36 h. La présence de la forme sécrétée de NS1 a été recherchée par E.1.ISA d'immunocapture selon le procédé décrit à l'exemple 4, en utilisant pour la capture. l'anticorps MVE 4G4 et pour la révélation, un mélange d'anticorps anti-NS 1 [)I:N reconnaissant la protéine NS 1 du virus WN, marqués à la peroxidase.

Les surnageants de cellules Vero non infectées ou de cellules HEK293 non transduites sont totalement négatifs. Dans les autres surnageants. la protéine NSI est détectable jusqu'à une dilution supérieure ou égale au 1 64 Figure I). La protéine NS1 WN est sécrétée par les cellules infectées comme par les cellules exprimant la protéine recombinée, indépendamment des autres protéines virales. Les modes de production étant différent, les taux de protéine ne peuvent être comparés directement.

Exemple 2: Préparation de protéine NS1 recombinante du virus WN à partir de cellules transduites par un vecteur recombinant Une lignée de cellules transduites par le plasmide p'l R11'-11!3.CMVNSI (WNV), a été isolée en utilisant les protocoles classiques d'amplification, de purification, de clonage, d'analyse et de transfection de l'ADN tels que ceux décrits dans Current Protocols in Molecular Biology (Frederick M. AUS( "BEL, 2000, If M'y and son Inc, Library of Congress, USA). Une lignée contrôle transduite par le plasmide lentiviral pTRIPAU3.CMV-NS1 (DEN1) a été isolée de façon analogue.

1) Préparation d'une lignée de cellules transduites par le plasmide pTRIPAU3.CMV-NS1 (WNV) a) Construction du plasmide pTRIPAU3.CMV-NSI (WNV) Un fragment d'ADNc de la souche IS-98-STI du virus WN (Demande FR 01 04599 et Genbank AF481864) codant pour la glycoprotéine NS1 avec son peptide signal (acides aminés 767 à 1143 de la polyprotéine virale) a été cloné entre les sites BamHI et KpnI du plasmide pTRIPAU3.CMV-I:GF1' (I) eniandc WO 01/27302) pour produire le plasmide recombiné pTRIPAU3.CMV-NS 1 (WNV).

Un plasmide recombinant dénommé pTRIP<<1l' 3.0 NIV-NS 1 (DENT) a été construit de façon similaire, à partir d'un fragment d'AI)Nc du virus de la dengue de sérotype 1.

b) Préparation d'une lignée de cellules transduites par le plasmide_pTRI'1l 3.CNI\'-NSI (WNV) La lignée de cellules 293T (ATCC) a été transfgctée avec le plasmide pTRIPAU3.CMV-NSI (WNV) ou le plasmide pTRIP:1J3.C11MV-NS 1 (DEN1) tels que définis ci-dessus. Deux lignées de cellules 293 transduites de façon stable, respectivement par le plasmide pTRIPAU3.CMV-NSI (WNV) et le plasmide pTRIPAU3.CMV-NS1 (DEN1) ont été isolées à partir des cellules co-transfectées.

La lignée dénommée 293T.NS1 [WN] a été déposée sous le n I-3215, le 18 mai 2004, auprès de la Collection Nationale de ('ultures de Microorganismes, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15.

La lignée dénommée 293T.NS1 [DENT] a été déposée sous le 5 n 1-3216 le 19 mai 2004, auprès de la Collection Nationale de ('ultuie des Microorganismes, 25 rue du Docteur Roux, 75724 PARIS Cedex 15.

2) Purification de la protéine NS1 extracellulaire recombinante de forme hexamérique La protéine NS1 extracellulaire recombinante de forme hexainérique est purifiée à partir du surnageant de cellules 293T transduite par le plasmide recombinant ainsi obtenu, selon le protocole tel que décrit dans la Demande Internationale PCT WO 00/75665.

Exemple 3: Isolement d'anticorps monoclonaux reconnaissant la protéine NS1 du virus WN 1) Matériel et méthode Les anticorps monoclonaux sont produits à partir d'hybridomes obtenus par fusion de lymphocytes B de souris avec des myélomes, selon la technique originellement décrite Kahler et Milstein (Nature, 1975, 256, 495-497). Les protocoles utilisés sont les protocoles standards tels que décrits dans AntiboJu'.s: l /,abpralurJ.

Alarmai, E. Howell and D Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 19R<4. a) Production d'hybridomes L'immunisation des souris OFI femelles a été réalisée par injections de 5 g de protéine NS1 hexamérique du virus WN, purifiée selon la méthode décrite dans la Demande Internationale PCT WO 00/7566. l,a première injection en adjuvant complet de Freund, la deuxième et la troisième injection en adjuvant incomplet de Freund, et la 4e'ne injection sans adjuvant sont réalisées par voie sous-cutanée et intrapéritonéale, à 3 semaines d'intervalle. La dernière injection, pratiquée trois jours avant le sacrifice de l'animal, est effectuée sans adjuvant_ par voie intrapéritonéale et intra-veineuse.

Les cellules de la rate des souris immunisées sont fusionnées avec la lignée de myélome murin Sp2/0-Ag14 jusqu'à l'apparition de clones d'hvhridonies qui sont testés en ELISA, en Immunofluorescence indirecte et en Western-Plot vis-a-sis de la protéine NSI. Les clones positifs sont ensuite reclonés par dilution limite. testés à nouveau comme précédemment puis amplifiés, selon les protocoles standards.

Les hybridomes sont cultivés dans du milieu DMEIv1 contenant 15 de sérum de veau foetal, 1 % de HES (SIGMA) et I 0-0 de mélange pénicilline/streptomycine, à 37 C, en présence de 5 % de CO. Leur temps de doublement est inférieur à 24 h, on obtient environ 15 millions de cellules flacon de culture de 75 cm'. Le temps optimal entre chaque passage est de 48 h et les cellules adhérentes sont dissociées dans du tampon (référence C5914, SIGMA) et divisés au huitième ou au dixième à chaque passage. Les hybridomes sont récoltés à 75 00 de confluence et congelés dans 90 % de sérum de veau foetal additionné de 10 de DMSO (2 à 5 millions de cellules dans 0,5 ml/ampoule).

b) Identification d'hybridomes sécrétant des anticorps anti-NS 1 La détection des anticorps spécifiques de la protéine NS1 a été réalisée, par immunofluorescence indirecte, par ELISA classique et par Western- 13lot.

Les techniques ci-après sont utilisées pour tester la réactivité des anticorps monoclonaux anti-NS1 purifiés ou non-purifiés (surnageant d'hybridome, liquide d'ascite).

-Technique ELISA classique La protéine NS1 hexamérique purifiée, préparée comme décrit à l'exemple 2, est adsorbée sur une plaque à la concentration de 2 Etg/ml dans du tampon PBS, pendant une nuit à 4 C. Après 3 lavages avec du tampon P13S'Twcen 0,1 '% (tampon PT), la protéine est incubée avec l'anticorps monoclonal anti-NS 1 dilué dans le même tampon contenant 0,5% de gélatine (tampon PTG), pendant 1 h à 37"C. Après 3 lavages avec le tampon PT, l'anticorps anti-IgG de souris marqué à la pero\ydase dilué dans le tampon PTG est ajouté et incubé pendant 1h à 37 C. Après 3 lavages, dans le même tampon que précédemment, les complexes antigène-anticorps formés sont révélés par une solution d'eau oxygénée en présence d'orthophénylénediamine.

- Immunofluorescence indirecte Les cellules Véro sont infectées 40h avec l'un des flavivirus suivant: - virus de la dengue de sérotype 1: souche FGA 89 (Després et al.. Virol., 1993. 196, 209-219) - virus de la dengue de sérotype 2: souche NG (New Guinea) - virus de la fièvre jaune: souche FNV - virus du Nil Occidental: souche IS-98-ST1 (Demande FR 01 1}4599 et (icnhank AF481864) Après 1 lavage avec du tampon PBS, les cellules sont fixée par une solution de paraformaldéhyde à 3% dans du PBS pendant 30 minutes à la température du laboratoire. Les cellules rincées avec du PBS sont ensuite perméabilisées par une solution de Triton X-100 à 0,5% dans du PBS, pendant 10 minutes. Après rinçage avec du PBS, les cellules sont incubées pendant lh avec l'anticorps monoclonal anti- NS1. Après 3 lavages avec du PBS, l'anticorps anti-IgG de souris marqué fi la fluorescéine est ajouté et incubé pendant lh. Après 3 lavages avec du 1'135. les laines sont recouvertes d'une lamelle et observées sous un microscope à fluorescence.

- Immunoblot Des cellules HEK 293 transduites par le plasmide pl'RIP \1 L 3.('NiV- NS1(WNV) ont été lavées avec du PBS puis lysées avec du tampon de dépit préparé selon Laemmli et contenant du 13-mercaptoéthanol. Les échantillons ont ensuite été bouillis 10 minutes.

Un aliquot de lysat de cellules transduites, et à titre de controle. un aliquot de cellules non infectées ont été séparés sur un gel SI)S à 10''o de polyacrylamide puis transférés sur une membrane de nitrocellulose. Après blocage dans une solution de PBS/lait 5%/Tween 0,1% et lavage en PBS Tween 0,10'0, cette membrane a été hybridée pendant une nuit à 4 C avec l'anticorps monoclonal anti-NS 1 dilué dans le tampon PBS/BSA 1%/Tween 0,1%. Après lavage en l'13S Tween, une hybridation secondaire a été réalisée à l'aide d'anticorps polyclonaux de chèvre dirigés contre les chaînes lourdes et légères des immunoglobulines G de souris et couples à la phosphatase alcaline (BI 2513, BIOSYS). Les anticorps fixés ont été rév étés à l'aide des réactifs NBT et BCIP (5380C et 5381C, PROMEGA). La protéine NS1 hexamérique purifiée préparée comme décrit à l'exemple 1 sert de conte le positi 1.

c) Préparation des ascites monoclonales de souris Les ascites monoclonales sont produites chez des souris Swiss nude.

Les souris reçoivent une injection intrapéritonéale de 0,5 ml de pristanc (2,6,10.14- tetramethyl-pentadecane, SIGMA), 3 à 5 semaines avant l'injection intrapéritonéale du clone d'hybridome sécrétant l'anticorps monoclonal. Les ascites sont prélevées au fia-et à mesure de leur formation, centrifugées à 2500 rpm pendant 10 minutes et conservées à -20 C.

d) Détermination de l'isotype des anticorps monoclonaux anti-NS 1 La détermination de l'isotype de l'anticorps anti-NS 1 s'effectue par ELISA à l'aide d'anticorps dirigés contre les différentes sous-classes d'immunoglobulines murines: IgGI, IgG2a, IgG2b, IgG3. La détermination de l'isotype de la chaîne légère de l'immunoglobuline est réalisée suivant une méthodologie identique.

e) Purification des anticorps monoclonaux Les anticorps sont purifiés par immunoaffinité comme décrit dans la Demande Internationale PCT WO 00/75665.

f) Marquage des anticorps Les anticorps purifiés sont marqués à la peroxydase ou à la hiotine. selon les protocoles standards tels que décrits dans Antibodies: A Laborato/T _1/mural, E. Howell and D Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988.

2) Résultats Dix anticorps monoclonaux (AcM) de souris reconnaissant la protéine NS1 du virus WN ont été identifiés. La référence de ces anticorps et le numéro de dépôt des neuf anticorps qui ont été déposés à la Collection Nationale de Cultures des Microorganismes de l'Institut Pasteur de Paris, sont présentés dans le Tableau I. Tableau I: Anticorps monoclonaux reconnaissant la protéine NS1 du virus WN Origine de la protéine NS1 Référence Numéro de dépôt utilisée pour la préparation de l'anticorps monoclonal Virus WN WN 8E7 CNCM 1-3178 Virus WN WN 11B2 CNCM I-3179 Virus WN WN 1IC10 CNCM I-3180 Virus WN WN 14F6 CNCM I-3181 Virus WN WN 17Al2 CNC;1 1-3182 Virus WN WN 17B5 CNCi1 I-3183 Virus DEN4 ou D4 D4 7G9 CNCM 1-3184 Virus DEN3 ou D3 D3 4F7 _ CNCM 1-3185 Virus DEN2 ou D2 D2 17A 12 CNCM [ I 318(, Virus MVE MVE 4G4 La réactivité des anticorps a été étudiée par innunofluotescence indirecte, par Western blot et par ELISA (figure 2) et leur isotype a également été déterminé. L'ensemble des résultats est regroupé dans les tableaux II et Ill.

Trois anticorps dirigés contre la protéine NSI du virus de la dengue de sérotype 2, 3 et 4 (D2 17Al2, D3 4F7 et D4 709) ainsi qu'un anticorps dirigé contre la protéine NS1 du virus de l'encéphalite de la vallée de Murray (MVI. 4G4). présentant une réaction croisée avec la protéine NS1 de WN ont été identifiés ("1 ahlcau II).

Tableau II: Caractéristiques des anticorps anti-NS1 Dengue et anti-NSI Kunjin présentant une réaction croisée avec la NS1 du virus WN Anticorps anti-NS1 Dengue Anticorps 1, anti-NS1

MVE

DEN 2 DEN 3 DEN 4 D2 17Al2 D3 4F7 D4 7G9 MVE 4G4

REACTIVITE EN

IMMUNOFLUORESCENCE

INDIRECTE

Cellules infectées DEN 1* + + + ND Cellules infectées DEN 2 + + + + Cellules infectées Fi + +1- + + Cellules infectées EJ + + + Cellules infectées WN + + _ + +

REACTIVITE EN ELISA

NS1 WN hexamérique + + +1- + purifiée REACTIVITE EN + + +1- +

IMMUNOBLOT

ISOTYPE tgG1 I IgG1 IgG1 * abréviations: Dengue 1 ou 2 (DEN 1, DEN2), Fièvre Jaune (H). Encéphalite Japonaise (EJ), West Nile (WN), non déterminé (ND).

Six anticorps spécifiques du virus WN ont également été identifiés (17Al2, 11B2, 17B5, 11C10, 8E7 et 14F6; Tableau III). Tous ces anticorps à l'exception de l'anticorps monoclonal 17B5 réagissent exclusivement avec le virus WN et le virus de l'encéphalite japonaise qui appartiennent au même complexe. sérologique des flavivirus à encéphalite (aucune réactivité avec le virus de la dengue et de la fièvre jaune qui appartiennent à un complexe sérologique différent).

Tableau III: Caractéristiques des anticorps anti-NSI WN.

Anticorps anti-NS1 WN 17Al2 11B2 17B5 11C10 14F6 8E7

REACTIVITE EN

IMMUNOFLUORESCENCE

INDIRECTE

Cellules infectées DEN 1 - - - - -

-

Cellules infectées DEN 2.. - +1- - - Cellules infectées FJ - +l- +1- - Cellules infectées EJ + + +l- + + + Cellules infectées WN + + + + + _+

REACTIVITE EN ELISA

NS1 WN hexamérique + + + + + + purifiée REACTIVITE EN + + + + + +

IMMUNOBLOT

ISOTYPE IgG2b IgG1 IgG2b IgG1 IgG1 1 IgG1 * Abréviations: Dengue 1 ou 2 (DEN 1, DEN2), Fièvre Jaune (FJ). Encéphalite Japonaise (EJ), West Nile (WN).

Exemple 4: Mise au point d'un test ELISA d'immunocapture de la forme sécrétée de la protéine NS1 du virus WN Deux tests ELISA d'immunocapture de la forme sécrétée de la protéine NS1 du virus WN (ELISA de sensibilité et ELISA de spécificité ) selon le principe d'immunocapture de la protéine NS1 de flavivirus, décrit dans la Demande Internationale PCT WO 00/75665, ont été mis au point à l'aide de: la protéine NS I hexamérique purifiée du virus WN (NS1 WN), préparée comme décrit à l- exemple 2.

les anticorps monoclonaux tels que décrits à l'exemple 3, et un substrat coloré pour la révélation de la réaction immunoenzymatique (orthophénylènediamine).

L'efficacité des anticorps pour la détection de la protéine NS I \\N a été analysée et différentes combinaisons de ces anticorps ont été testés pour la capture et la détection de la protéine NSI. Le seuil de détection de la protéine NSI avec Ics combinaisons optimales d'anticorps de capture et de révélation a ensuite été déterminé pour les deux tests ELISA.

a) Combinaisons d'anticorps de capture et de révélation pour test ULIS:\ de sensibilité Les anticorps ont d'abord été testés seuls pour l'immunocapture de la protéine NSI du virus WN en ELISA, la NS1 capturée étant ensuite détectée par le mélange des anticorps MVE 4G4, D2 17Al2 et D4 7G9, couplés à la peroxydase (mélange de révélation). Les meilleurs anticorps pour la détection de la protéine NS1 du virus WN sont les suivants, dans l'ordre décroissant: MVE 404. WN I 1('10. WN 17Al2, WN 1 1B2 et WN 8E7 (figure 3).

Différentes combinaisons de ces anticorps avec ou sans le \v1V1; 404 ont été testées pour la capture de la protéine NS1. La protéine NSI capturée étant ensuite détectée par différents mélanges de révélation utilisant les anticorps \IV E; 4G4, D2 17Al2, D3 4F7 et D4 7G9. Les combinaisons de capture incluant le \ IVE 4G4 sont les meilleures, et les anticorps D3 4F7 et D2 17Al2 en combinaison avec le MVE 4G4 améliorent la sensibilité de la détection de la protéine NS 1 WN.

Les meilleures combinaisons de révélation sont: le mélange des anticorps MVE 4G4+D2 17Al2+D3 4F7+D4 7G9 marqués à la peroxydase et le mélange des anticorps MVE 4G4+D2 17Al2+D3 4F7 marqués à la peroxydase, avec une sensibilité de détection de la protéine NSI WN 2,5 fois supérieure à celle de la combinaison anticorps MVE 4G4 pour la capture et MVE 4(14 marqué à la peroxydase pour la révélation.

En conséquence, les couples d'anticorps MVE 4041)2 17Al2 ou MVE 4G4/D3 4F7 pour la capture, et le mélange des anticorps 4041)2 17Al2/D3 4F7/D4 7G9 marqués à la peroxydase pour la révélation ont été choisis pour l'ELISA de sensibilité .

b) Combinaisons d'anticorps de capture et de révélation pour le test lS1 de spécificité Le test ELISA de spécificité met en oeuvre des anticorps de capture et de révélation qui ne reconnaissent pas les mêmes épitopes. la capture est réalisée avec l'anticorps MVE 4G4 et la révélation avec le mélange des anticorps D2 I7Al2 et D4 7G9 conjugués à la peroxydase.

c) Seuil de détection des deux tests ELISA La sensibilité du test ELISA d'immunocapture de la ferme sécrétée de la protéine NS1 du virus WN a été déterminée à partir d'une courbe étalon établie pour des concentrations connues en protéine NS1 hexamérique recombinante purifiée. Le seuil de positivité des échantillons est fixé à trois fois la valeur moyenne des densités optiques (DO) obtenues par des sérums négatifs. Toutefois. les sérums présentant un signal 2 fois supérieur à cette valeur moyenne sont suspectés positifs.

La limite de détection de la protéine NS 1 du virus WN avec les deux tests ELISA utilisant un substrat coloré est déterminée approximativement à 1 iig ml (Figure 4). La portion linéaire de la courbe standard est comprise entre 1-100 ng m l et est utilisée pour estimer les quantités de NS1 WN présentes dans les échantillons à tester.

Exemple 5: Détection de la forme sécrétée de la protéine NS1 lors d'infections 20 naturelles ou expérimentales par le virus WN La forme sécrétée de la protéine NS1 (NS1 WN) présente chez les individus infectés de façon naturelle ou expérimentale par le virus WN, a été analysée à l'aide du test ELISA-capture de sensibilité, et éventuellement avec le test 1'1 [SA-capture de spécificité, tels que définis à l'exemple 4.

1) Infections expérimentales a) Matériel et méthode Des souris ont été inoculées par voie intrapéritonéale avec 100 Unités Formant Plage (UFP) du virus WN (souche IS-98 ST1 (Demande FR 01 04599 et Genbank AF481864), dans PBS Dulbecco/ 0,2% BSA.

Des poulets ont été inoculés par voie sous-cutanée avec 100 111;1' du virus WN (souche égyptienne 101; Eg101 AF260968 et Chanel et al.. A'irology. 2003, 315, 381-388), dans PBS Dulbecco/ 0,2% BSA.

Les animaux contrôle ont reçu une injection par la même voie de PBS Dulbecco/ 0,2% en BSA.

Les sérums ont été prélevés à différents temps après l'inoculation des animaux et la protéine NS1 sérique a été dosée en ELISA-capture, à partir des sérums dilués au b) Résultats - chez a l sour is

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Les infections expérimentales ont montré que la protéine NS 1 WN est présente dans les sérums de souris entre le 4e1pe et le 7è",e jour postinoculation avec un maximum au 6eme jour où le taux de protéine est estimé à environ 10 nghnl. (Figure 5A). Une mortalité des souris est observée dans tous les cas entre le 8"'' et le 9e'" jour.

- çhez_le-poulet La présence de l'antigène sérique NSI WN a été mise en évidence chez les 4 poulets au 15eme et 28eme jours, chez 3 poulets au 3l" jour et chez 2 poulets au 38eme jour (Figure 5B). Aucun des poulets ne meurt jusqu'au 38è" jour post-inoculation, jour de leur sacrifice. Les poulets, réservoir naturel du virus, apparaissent moins sensibles que les souris au virus WN. La quantité de protéine NS I détectée dans le sang peut varier de quelques ng/mL (poulet 12) à environ 3 pu/ml. (poulet 13) au 15e11C jour et 200 ng/mL au 38e1ne jour (poulet 13).

2) Infections naturelles a) Chez le cheval 47 sérums de chevaux camarguais, infectés par le virus l\'N durant l'épidémie de 2000 au sud de la France, issus de la collection du (entre National de Référence (CNR, Lyon, France) ont été analysés. Ces chevaux présentaient des signes d'atteinte du système nerveux central (fièvre, ataxie, parésie et paralysie} lors des prélèvements. L'infection par le virus WN avait été diagnostiquée par la présence d'IgM et d'IgG reconnaissant le virus WN et pour certains par la présence d'anticorps neutralisants spécifiques du virus WN. 10

La protéine NS1 WN a été détectée dans 38 0 des sérums de chevaux (8 sérums positifs (17%) et 10 sérums suspectés positifs (2131'10 selon les critères tels que définis à l'exemple 2; Figure 6). Cinq sérums positifs avec le test de sensibilité ont été également testés avec le test de spécificité (Figure 6)..,vvcc ce dernier test, 4 sérums ont été observés positifs et un négatif, confirmant la présence d'antigène NS1 mais avec une sensibilité plus faible d'environ 0.5 log 1.e taux de NS1 WN est compris entre 1 ng/mL à 3 gg/mL. Aucune corrélation significative n'a pu être mise en évidence entre la forme sérique de la protéine NS I WN et la présence d'IgM ou d'IgG reconnaissant le virus WN produites durant l'infection, le type de symptômes cliniques ou bien encore la valeur du titre de neutralisation.

b) Chez l'homme Des sérums humains ainsi que des prélèvements de liquides céphalo-rachidiens (LCR) d'individus ayant présentés des signes neurologiques sév ères (encéphalites, méningites), lors de l'épidémie WN de 1996 en Roumanie ont été testés. L'infection par le virus WN avait été diagnostiquée par la présence d'IgM reconnaissant le virus WN (MAC-ELISA).

La protéine NS1 WN a été détectée dans 70 % des sérums humains (35 sérums au total; 13 positifs (37,1%) et suspectés positifs (34.3 o). (Figure 7). Parmi 7 sérums positifs avec l'ELISA de sensibilité , 4 étaient toujours positifs avec le test de spécificité , les 3 autres étant devenus négatifs (Figure 7). Ainsi, la protéine NS1 WN sérique est détectée avec l'ELISA de spécificité mais avec une sensibilité moindre d'environ 0,5 log. Le taux de NS1 WN circulante dans le sang peut varier de 1 ng/mL à 200 ng/mL.

La présence de la protéine NS1 WN n'a été observée dans aucun des 25 13 LCR. Toutefois, plusieurs études ont montré que le virus n'était pas forcément présent dans les LCR lors d'infection par le virus WN.

Chez l'homme, le temps entre l'inoculation du virus WN par le moustique vecteur et le début des signes cliniques est relativement court, approximativement entre 2-6 jours. Le virus peut être détecté dans le sang des le 1 jour post-infection avec une durée moyenne de la virémie de 6 jours environ (compris entre 1 et 11 jours).

Il est intéressant de noter que l'antigène NSI \V'N a été troue é circulant dans le sang dès les premiers jours après le début des signes cliniques et jusqu'à 16 jours chez les humains, 22 jours chez les chevaux et jusqu'à plus de 30 jours chez les poulets dans le cas d'infections expérimentales. Ainsi la période pendant laquelle il est possible de détecter la protéine NSI sérique est plus longue que la durée de virémie. L'ELISA d'immunocapture de NS1 WN pourrait représenter un test avantageux pour diagnostiquer des infections WN dans la mesure où la fenêtre (le détection est plus large que celle des méthodes d'isolement viral ou de détection de l'ARN viral.

l0 Exemple 6: Sensibilité du test ELISA d'immunocapture de la protéine NSI du virus WN Afin d'augmenter encore la sensibilité du test ELISA tel que défini à l'exemple 3, la révélation classique de la réaction immunoenzymatique par un substrat coloré a été comparée à la révélation par un substrat chimioluminescent (Super Signal Elisa Pico, référence 37070, SIGMA).

Les résultats présentés aux figures 8 et 9 montrent que le substrat chimioluminescent augmente la sensibilité de détection de 2 log environ dans le lest ELISA-capture de sensibilité et de 1,5 log dans le test 11. 1S\-capture (le spécificité , par rapport au substrat coloré.

Ces deux méthodes de révélation ont ensuite été comparées sur 7 sérums roumains dont 3 étaient positifs, 1 suspecté positif et 3 négatifs (dilution V) avec une révélation utilisant un substrat coloré (Figure 10). Le substrat chimioluminescent a permis de mettre en évidence la protéine NS1 du virus WN dans 6 des sérums, le 7ème étant suspecté positif à la dilution '/z (Figure 10). A la dilution 1/10, 5 sérums sont encore positifs et 2 suspectés positifs avec la révélation chimioluminescent e, alors qu'ils étaient tous négatifs avec une révélation colorimétrique.

Les résultats présentés avec une révélation classique colorimétrique ont montré que l'on pouvait détecter au minimum 1 ng/mL de protéine NS l WN dans les sérums de poulets, de chevaux et d'humains testés (Exemple 4). L'utilisation d'un substrat chimioluminescent a permis d'améliorer lasensibilité de 2 log, mettant ainsi le seuil de détection du test en antigène NS1 WN à 0,01 ng/mL.

Ces résultats permettent d'envisager la mise en oeuvre du test 1-1.1S.\ d'immunocapture de la protéine NS1, à l'aide des anticorps sélectionnés. pur le diagnostic précoce des infections cliniques et le dépistage des infections asymptomatiques par le virus WN, chez l'Homme ou l'animal.

Claims (12)

REVENDICATIONS

1 ) Méthode de diagnostic ou de dépistage d'une infection clinique ou asymptomatique par un flavivirus appartenant au groupe encéphalitique et en particulier le virus du Nil Occidental, chez l'Homme ou l'animal, laquelle méthode est caractérisée en ce qu'elle comprend au moins: (a) la mise en contact d'un échantillon biologique in vitro, avec au moins un anticorps anti-NS1 de flavivirus reconnaissant la ferme sécrétée de 1a protéine NSI dudit flavivirus appartenant au groupe encéphalitique, et (b) la détection de la présence de la protéine NS 1 dans ledit IO échantillon biologique.

2 ) Méthode selon la revendication 1, caractérisée en cc que ledit anticorps anti-NS1 de flavivirus est un anticorps monoclonal reconnaissant la l'orme sécrétée de la protéine NSI du virus du Nil Occidental.

3 ) Méthode selon la revendication 2, caractérisée en ce que ledit 15 anticorps monoclonal est sélectionné dans le groupe constitué par: l'anticorps dirigé contre la protéine NSI du iras du Nil Occidental, dénommé WN8E7, qui correspond à l'hybridome déposé sous le n 1-3178, le 4 mars 2004, auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 1.55, l'anticorps dirigé contre la protéine NSI du virus du Nil Occidental, dénommé WN 11B2, qui correspond à l'hybridome déposé sous le n I-3179, le 4 mars 2004, auprès de la Collection Nationale de Cultures (le Microorganismes, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, l'anticorps dirigé contre la protéine NSI du virus du Nil Occidental, dénommé WN 11C10, qui correspond à l'hybridome déposé sous le n 1-3180, le 4 mars 2004, auprès de la Collection Nationale (le Cultures (le Microorganismes, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, l'anticorps dirigé contre la protéine NSI du virus du Nil Occidental, dénommé WN 14F6, qui correspond à l'hybridome déposé sous ie n 1-3181, le 4 mars 2004, auprès de la Collection Nationale (le Cultures de Microorganismes, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, l'anticorps dirigé contre la protéine NSI du vinas du Nil Occidental, dénommé WN 17Al2 qui correspond à l'hybridome déposé sous le n I-3182, le 4 mars 2004, auprès de la Collection Nationale de Cultures (le Microorganismes, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, l'anticorps dirigé contre la protéine NS1 du virus du Nil Occidental, dénommé WN 17B5, qui correspond à l'hybridome déposé sous le n I-3183, le 4 mars 2004, auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, l'anticorps dirigé contre la protéine NS1 du virus de la dengue de sérotype 4, dénommé D4 7G9, qui correspond à l'hybridome déposé sous le n I-3184, le 4 mars 2004, auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, l'anticorps dirigé contre la protéine NSI du virus de la dengue de sérotype 3, dénommé D3 4F7, qui correspond à l'hybridome déposé sous le n 1-3185, le 4 mars 2004, auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes. 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, l'anticorps dirigé contre la protéine NS1 du virus de la dengue (le sérotype 2, dénommé D2 17Al2, qui correspond à l'hybridome déposé sous le n I-3186, le 4 mars 2004, auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, et l'anticorps dirigé contre la protéine NSI du virus de l'encéphalite de la vallée de Murray, dénommé MVE 4G4.

4 ) Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 3 3, caractérisée en ce que l'étape (a) comprend: (ai) la mise en contact dudit échantillon biologique avec au moins un premier anticorps tel que défini à l'une quelconque des revendications 1 à 3, lequel anticorps est fixé sur un support approprié (anticorps de capture de NS 1).

(a2) le lavage dudit support, et (a3) l'addition d'au moins un second anticorps tel que défini à l'une 30 quelconque des revendications 1 à 3, identique ou différent du premier (anticorps (le révélation).

5 ) Méthode selon la revendication 4, caractérisée en ce que: l'anticorps de capture de la protéine NS1 est sélectionné dans le groupe constitué par: le mélange des anticorps MVE 4G4 et D2 17Al2, ou le mélange des anticorps MVE 4G4 et D3 4F7, et - l'anticorps de révélation de la protéine NS1 est le mélange des anticorps MVE 4G4, D2 17Al2, D3 4F7 et D4 7G9.

6 ) Méthode selon la revendication 4, caractérisée en ce que: l'anticorps de capture de la protéine NS1 est l'anticorps MVE 4G4, 10 et l'anticorps de révélation de la protéine NS1 est le mélange des anticorps D2 17Al2 et D4 7G9.

7 ) Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 caractérisée en ce que l'étape b) de détection de ladite protéine NS1 est réalisée à l'aide d'un anticorps conjugué à une enzyme et d'un substrat chimioluminescent.

8) Kit ou coffret de dépistage ou de diagnostic d'une infection clinique ou asymptomatique par un flavivirus appartenant au groupe encéphalitique et en particulier le virus du Nil Occidental, caractérisé en ce qu'il comprend: - au moins un anticorps anti-NS 1 de flavivirus tel que défini à l'une

quelconque des revendications 2 à 7,

- au moins un contrôle positif constitué par la protéine NS1 d'un flavivirus appartenant au groupe encéphalitique et en particulier du virus du Nil Occidental, et - au moins un contrôle négatif constitué par un sérum normal.

9) Anticorps monoclonal tel que défini à la revendication 3, déposé sous le n 1-3178, I-3179, I-3180, I-3181, I-3182, I-3183, I-3184, I-3185 ou I3186, le 4 mars 2004, auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15.

10 ) Anticorps selon la revendication 9, caractérisé en ce qu'il est 30 conjugué à un marqueur apte à produire un signal détectable et/ou quantifiable.

11 ) Anticorps selon la revendication 9 ou la revendication 10 ou mélange desdits anticorps, comme réactif de diagnostic et/ou de dépistage d'une infection clinique ou asymptomatique par un flavivirus appartenant au groupe encéphalitique et en particulier le virus du Nil occidental, chez l'Homme ou l'animal.

12 ) Anticorps selon la revendication 9 ou mélange desdits anticorps, comme médicament pour la prévention et/ou le traitement d'une infection par un flavivirus appartenant au groupe encéphalitique et en particulier le virus du Nil occidental, chez l'Homme ou l'animal.