CN116338165A - 同时检测奥马珠和IgE的蛋白芯片试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种用于奥马珠和IgE检测的蛋白芯片及试剂盒，可同时检测血液中奥马珠和IgE的水平。所述蛋白芯片包括抗奥马珠的特异性抗体，抗人IgE的特异性抗体。所述蛋白芯片，还包括阳性对照、阴性对照、空白对照，在基片上均点制4个重复点，共6列。所述阳性对照，是采用HRP标记的抗体，所述阴性对照为鼠IgG，所述空白对照为不含抗体的点样液。所述试剂盒包括上述蛋白芯片，还包括标记有HRP酶或碱性磷酸酶的第二抗体溶液、检测液A和检测液B。所述第二抗体溶液含有抗人IgE抗体及抗奥马珠抗体，所述检测液A含有0.1～1％鲁米诺和0.1～2％Tris，所述检测液B含有0.1～1％过氧化氢。检测方法为：收集样本后，采用全自动芯片分析仪，利用所述蛋白芯片检测试剂盒对样本进行分析，同时给出样本中奥马珠和IgE的水平。
Description
技术领域
本发明涉及一种奥马珠残留检测试剂盒，特别是一种能够将奥马珠残留和血液IgE同时检测的试剂盒和检测方法，属于生物技术领域。
背景技术
随着全球经济水平的快速发展、人们的生活方式及居住环境条件的巨大变化，疾病谱也随之发生变化。2013年由世界卫生组织召开的世界卫生大会上已经明确提出：以过敏性疾病为代表的慢性非传染性疾病（NCD），由于起病早、病情易波动反复、临床表型复杂多样等特点，已成为全球公共卫生关注的热点。
过敏性疾病又称变态反应性疾病，是指机体对接触的某些致敏物质初次应答致敏后，再次接触相同致敏物质刺激时，所出现的一种以生理功能紊乱或组织细胞损伤为主的异常免疫应答的疾病。过敏性疾病从新生儿到老年人的各个年龄阶段都可能发生，往往具有明显的遗传倾向。儿童过敏性疾病主要有过敏性休克、皮肤荨麻疹、湿疹、过敏性鼻炎、过敏性哮喘、过敏性肠炎等。
对于过敏性疾病的诊治，目前公认最为安全有效的过敏疾病治疗方法为注射奥马珠抗体，注射前需要对过敏性患者的血液中IgE含量进行定量测定，同时根据患者体重按照经验确定给药量和给药间隔。由于没有可靠的检测患者血清中IgE的手段，治疗依据不足，患者的治疗效果往往不佳，或者在治疗有效后过早停止用药而复发，或者是用量过度增加患者的经济负担，同时也会造成奥马珠在体内的残留。
奥马珠价格昂贵，如何合理用药治疗且尽可能地减少患者的经济负担，也是必须考虑的，正确检测血液中的抗体IgE是保证患者有效治疗的关键，在检测血液中IgE的同时，也检测奥马珠的含量，是确定治疗合理用药量的关键。本发明提供了一种同时检测血液中奥马珠和IgE的试剂盒和检测方法。
发明内容
本发明所要解决的技术问题之一在于，提供一种同时检测人血液样本中总IgE及奥马珠含量的蛋白芯片。
本发明所要解决的技术问题之二在于，提供上述蛋白芯片的制备方法。
本发明所要解决的技术问题之三在于，提供上述蛋白芯片的试剂盒，包括上述蛋白芯片和配套试剂。
本发明所要解决的技术问题之四在于，提供上述蛋白芯片试剂盒的应用，用于同时检测血液样本中的总IgE和奥马珠含量。
为解决上述技术问题之一，本发明提供的蛋白芯片，包括基片、玻片上固定的特异性捕获抗体：抗奥马珠抗体，抗人IgE抗体。
所述基片包括经过修饰的玻璃片、塑料片等用于蛋白芯片制备的硬质材料。
所述蛋白芯片，还包括阳性对照、阴性对照、空白对照。所述阳性对照，是采用HRP标记的抗体，所述阴性对照为鼠IgG，所述空白对照为不含抗体的点样液。
所述蛋白芯片，是分别将特异性抗体、阳性对照、阴性对照、空白对照采用全自动点样仪点制与所述基片上。
所述特异性抗体、阳性对照、阴性对照、空白对照在芯片上均点制4个重复点。
上述的特异性抗体，是经过多次实验筛选和比对，在保证了检测结果特异性的同时，还保证检测结果的灵敏性，芯片检测的信噪比高、与待检测物的浓度线性关系好。
为解决上述技术问题之二，本发明提供了所述蛋白芯片的制备方法。
所述蛋白芯片的制备，包括基片的预处理。
所述的基片预处理，包括将玻片置于含有NaOH的玻片预处理液中室温孵育16～24h，之后采用纯水清洗2～8次。
所述的基片预处理，还包括将玻片置于质量浓度为0 .05～1wt％的硅烷溶液中室温孵育20～60min；孵育结束后，取出玻片，用氮气吹扫后放入烘箱中，于100～180℃条件下烘烤0 .2～0 .6h。
所述的蛋白芯片制备，点样的方法为点样仪器自动化点样，在玻片上点成4×6的矩阵；每列为同一抗体溶液形成的点。
所述蛋白芯片的排列，为在预处理的玻片上点样阳性质控列、空白列、抗奥马珠抗体列、抗人IgE抗体列、阴性质控列、阳性质控列，每列4个重复，共计6列。
所述的蛋白芯片制备，还包括蛋白芯片的封闭。
所述封闭过程为：将点样好的玻片没入0.1～2%BSA溶液中1～4h，之后取出黑玻片，并离心去除残余封闭液。
所述0.1～2%BSA溶液为含有BSA的缓冲溶液；所述缓冲液为PBS缓冲液、Tris缓冲液、HEPS缓冲液、MOPS缓冲液中的一种或多种。
为解决上述技术问题之三，本发明提供了所述蛋白芯片检测试剂盒。
所述芯片试剂盒，除了以上所述的芯片，还包括辅助试剂。
所述试剂盒的辅助试剂，包括标记有HRP酶或碱性磷酸酶的第二抗体溶液、检测液A和检测液B。
所述第二抗体溶液含有抗人IgE抗体及抗奥马珠抗体。
所述检测液A含有0.1～1％鲁米诺和0.1～2％Tris。
所述检测液B含有0.1～1％过氧化氢。
所述试剂盒的检测基本原理为：
所述试剂盒检测IgE抗体、奥马珠的方法为免疫学方法，检测手段为间接法。在玻璃为载体的芯片基质上固定抗体，这些抗体可以捕获样本中的待测物（总IgE抗体、奥马珠抗体），被捕获的待测物（总IgE抗体、奥马珠抗体）与标记有HRP酶或碱性磷酸酶的第二抗体相结合，然后酶催化化学发光底物，通过化学反应产生光信号。其光信号通过CCD摄像头采集，并进行智能分析，计算光信号的强度，然后根据信号强度--浓度定量曲线，通过采集的光信号的强度计算出被测样本中待测物IgE和奥马珠的浓度。
为解决上述技术问题之四，本发明提供了所述蛋白芯片检测试剂盒检测样本中奥马珠和IgE的检测方法。
本发明所述检测方法为全自动检测方法，采用SLXP-001B型生物芯片分析仪进行；
1.样本准备
取未加抗凝剂的采血管采集血液样本；
将待检测血液样本放入仪器样本盘中；
2.检测试剂盒准备
取本发明所述蛋白芯片检测试剂盒，按照仪器说明，放入仪器中适当位置；
3.检测方法
使用SLXP-001B型生物芯片分析仪，按照仪器操作说明书设置；
仪器自动吸取200ul的待测血清样本至反应杯中；
仪器将所述蛋白芯片自动地放入待测血清中，37℃孵育40分钟；
仪器夹爪将芯片取出，经仪器自动冲洗后投入到标记有HRP酶的第二抗体溶液（200ul，仪器自动提前吸好），再次孵育40分钟；
仪器夹爪将芯片再次取出，经仪器自动冲洗后投入到发光底物溶液中（由100ul的检测液A和100ul的检测液B混合而成，由仪器自动吸取和混合）；
对蛋白芯片进行拍照成像，软件自动分析图片，给出分析结果。
本发明有益的技术效果在于：
本方法及所产生的试剂盒是首次集约式同时检测血液中两个待测物IgE和奥马珠的方法。本技术利用免疫化学发光技术可获得较高的检测灵敏度。本方法可以实现定量测定，根据检测结果给出的IgE、奥马珠的含量，辅助检查患者的病程情况和药物治疗情况。本方法所制备的试剂盒可以利用全自动化的芯片分析仪，实现高速、全自动化的简便操作，减少手工操作带来的检测误差，尤其特别适用于大样本量的检测。通过本发明的检测试剂盒进行检测得到的结果，可以将两个关键参数报告给医师，为临床治疗方式的筛选提供依据。
附图说明
图1为本发明制备方法中IgE、奥马珠特异性抗体点样示意图；
图中，列1：阳性质控列；列2：空白列；列3：抗奥马珠抗体列；列4：抗人IgE抗体列；列5：阴性质控列；列6：阳性质控列；
图2 样本芯片的检测结果。
具体实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明进行具体描述。
实施例一
用于IgE和奥马珠检测的蛋白芯片试剂盒，通过如下步骤制得：
1.玻片预处理；
（1）将玻片置于含有NaOH的玻片预处理液中浸泡16h，之后采用纯水清洗2～8次；
（2）将玻片置于质量浓度为1wt％的硅烷溶液（介质为25％乙醇）中孵育20min；
（3）孵育结束后，取出玻片，用氮气吹扫后放入烘箱中，于180℃条件下烘烤0 .2h；
2.点样
参照图1，采用全自动点样仪器自动化点样，在玻片上点制4×6的矩阵；每列为同一组分溶液形成的4个重复点；所述组分溶液包括阳性质控、空白、抗奥马珠抗体、抗人IgE抗体、阴性质控溶液；
3.蛋白芯片封闭；
将点样好的玻片没入封闭液（含2％牛血清白蛋白的Tris缓冲液）中3h，之后取出黑玻片，并离心去除残余封闭液，制得所述芯片；
4.试剂盒组装制备
将芯片与标记有HRP酶的第二抗体溶液（鼠抗人IgE）、检测液A（含有1％鲁米诺和2％Tris）、检测液B（1％过氧化氢）共同包装成试剂盒。
实施例二
基于实施例一的试剂盒对样本中的IgE和奥马珠进行检测的方法：
本实施例使用SLXP-001B型生物芯片分析仪对血清样本进行检测，SLXP-001B型生物芯片分析仪的工作过程如下：
1.将待检测血液样本放入仪器样本盘中；
2.按照仪器使用说明进行设置；
3.将检测试剂盒放入仪器中适当的位置；
4.仪器自动吸取200ul的待测血清样本至反应杯中，仪器将本发明实施例制得的蛋白芯片自动地放入待测血清中，37℃孵育40分钟；
5.仪器夹爪将芯片取出，经仪器自动冲洗后投入到标记有HRP酶的第二抗体溶液（200ul，仪器自动提前吸好），再次孵育40分钟；
6.仪器夹爪将芯片再次取出，经仪器自动冲洗后投入到发光底物溶液中（由100ul的检测液A和100ul的检测液B混合而成，由仪器自动吸取和混合）；
对蛋白芯片进行拍照成像，软件自动分析图片，给出分析结果。
实施例三
样本检测结果与分析判定：
1.取样本7例，按照实施例二的检测方法进行检测；
2.检测结果及判定如表1所示：
表1
3.判定原则如表2所示：
表2
Claims (11)
1.一种蛋白芯片，其特征在于，包括基片、基片上固定的特异性捕获抗体，所述捕获抗体包括抗奥马珠的特异性抗体，抗人IgE的特异性抗体。
2.根据权利要求1所述的蛋白芯片，其特征在于，所述基片为玻片、塑料片。
3.根据权利要求1所述的蛋白芯片，其特征在于，所述蛋白芯片还包括阳性对照、阴性对照、空白对照；所述阳性对照，是采用HRP标记的抗体，所述阴性对照为鼠IgG，所述空白对照为不含抗体的点样液。
4.根据权利要求1或权利要求3所述的蛋白芯片，其特征在于，所述特异性捕获抗体、阳性对照、阴性对照、空白对照在芯片上均点制4个重复点，共6列。
5.一种权利要求1所述蛋白芯片用于同时检测血液样本中奥马珠和IgE水平的应用。
6.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的蛋白芯片。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括标记有HRP酶或碱性磷酸酶的第二抗体溶液、检测液A和检测液B。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述第二抗体溶液含有抗人IgE抗体及抗奥马珠抗体。
9.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述检测液A含有0.1～1％鲁米诺和0.1～2％Tris。
10.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述检测液B含有0.1～1％过氧化氢。
11.一种同时检测奥马珠和IgE水平的检测方法，其特征在于，所述方法使用权利要求7所述的试剂盒，并包括以下步骤：
（1）样本准备：取未加抗凝剂的采血管采集血液样本；将待检测血液样本放入仪器样本盘中；
（2）检测试剂盒准备：取本发明所述蛋白芯片检测试剂盒，按照仪器说明，放入仪器中适当位置；
（3）检测方法：使用SLXP-001B型生物芯片分析仪，按照仪器操作说明书设置；仪器自动吸取200ul的待测血清样本至反应杯中，仪器将所述蛋白芯片自动地放入待测血清中，37℃孵育40分钟；仪器夹爪将芯片取出，经仪器自动冲洗后投入到标记有HRP酶的第二抗体溶液（200ul，仪器自动提前吸好），再次孵育40分钟；仪器夹爪将芯片再次取出，经仪器自动冲洗后投入到发光底物溶液中（由100ul的检测液A和100ul的检测液B混合而成，由仪器自动吸取和混合）；对蛋白芯片进行拍照成像，软件自动分析图片，给出分析结果；
（4）根据试剂盒检测结果，进行分析判断。
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116626298A (zh) * | 2023-07-19 | 2023-08-22 | 军科正源（北京）药物研究有限责任公司 | 用于检测奥马珠单抗抗药性抗体的试剂 |
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2021
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