CN116990526A - 一种用于预测或诊断原发性干燥综合征的生物标志物组合及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于预测或诊断原发性干燥综合征的生物标志物组合及其应用，所述用于预测或诊断原发性干燥综合征的生物标志物组合包括CFB、CLU和NE。本发明所述生物标志物组合可在无创的条件下预测患原发性干燥综合征的风险，预测精确度高。

Description

一种用于预测或诊断原发性干燥综合征的生物标志物组合及 其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种用于预测或诊断原发性干燥综合征的生物标志物组合及其应用。

背景技术

原发性干燥综合征(pSS)是一种全身性慢性自身免疫性疾病，其特征是唾液腺和泪腺的淋巴细胞浸润和自身免疫损伤导致口腔和眼睛干燥。目前pSS的预测或诊断标准通常基于临床干燥症状、血清学自身抗体和唇腺组织病理学检查。在临床应用最为广泛的2016年ACR/EULAR标准中，抗SSA自身抗体和唇腺活检的权重更高，唾液活检中的阳性发现或抗SSA血清阳性是预测或诊断pSS必须的。尽管唇腺活检程序相对简单，但这是一种侵入性方法，会带来出血、疼痛和暂时性感觉缺失等并发症，甚至有组织坏死和持续性感觉缺陷受损。另一方面，pSS作为慢性疾病，目前缺乏病情监测的指标。唇腺活检作为有创检测，不适合用于病情长期监测和用药疗效判断。

唇腺活检会带来出血、疼痛和暂时性感觉缺失等并发症，甚至有组织坏死和持续性感觉缺陷受损。近年来，唾液作为预测或诊断测试的生物样本引起了人们的关注，因为它的收集简单、方便、无痛且安全。目前已有研究报道通过质谱法探索唾液中pSS的生物标志物，但质谱法成本高，需要大型仪器，不易推广及进行大规模验证。目前唾液蛋白对预测或诊断pSS的应用价值仍然不清楚。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种用于预测或诊断原发性干燥综合征的生物标志物组合及其应用。

为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种用于预测或诊断原发性干燥综合征的生物标志物组合，所述生物标志物组合包括CFB、CLU和NE。

补体因子B(CFB)、凝集素(CLU)和中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)在原发性干燥综合征(pSS)的唾液中的表达量升高，可作为预测或诊断原发性干燥综合征的生物标志物。

第二方面，本发明提供一种根据第一方面所述的用于预测或诊断原发性干燥综合征的生物标志物组合或检测第一方面所述的生物标志物组合表达量的试剂在制备用于预测或诊断原发性干燥综合征的产品中的应用。

优选地，所述应用包括构建原发性干燥综合征预测或诊断模型和/或制备原发性干燥综合征预测或诊断装置。

第三方面，本发明提供一种用于预测或诊断原发性干燥综合征的试剂盒，所述试剂盒包括检测第一方面所述的用于预测或诊断原发性干燥综合征的生物标志物组合表达量的试剂。

优选地，所述试剂盒还包括检测泪液分泌的试剂、检测SSA抗体的试剂、检测Ro52抗体的试剂。

唾液中三种标志物(CFB、CLU、NE)的组合，结合现有临床非侵入性检查(抗SSA、抗Ro52和Schirmer试验)在对pSS的预测或诊断中具有较高的准确性，可以避免唇腺活检这一有创性检查带来的出血、疼痛和暂时性感觉缺失等并发症。

第四方面，本发明提供一种原发性干燥综合征预测或诊断模型，所述原发性干燥综合征预测或诊断模型的输入变量包括第一方面所述的用于预测或诊断原发性干燥综合征的生物标志物组合的检测结果、泪液分泌实验结果、SSA抗体的检测结果和Ro52抗体的检测结果。

优选地，所述原发性干燥综合征预测或诊断模型的输出变量包括预测概率，所述预测概率的计算公式为：

预测概率＝-4.511+1.369×CFB检测结果+2.441×CLU检测结果+1.237×NE检测结果+1.194×泪液分泌实验结果+0.709×SSA抗体检测结果+0.481×Ro52抗体检测结果。

优选地，CFB浓度高于173.50ng/mL，CFB检测结果记为1，反之，检测结果记为0；

CLU浓度高于221.40ng/mL，CLU检测结果记为1，反之，检测结果记为0；

NE浓度高于0ng/mL，NE检测结果记为1，反之，检测结果记为0；

泪液分泌实验5分钟内任一侧眼分泌泪液润湿滤纸少于5mm，泪液分泌实验结果记为1，反之，检测结果记为0；

SSA抗体检测结果选自0、1、2、3；

Ro52抗体检测结果选自0、1、2、3。

抗SSA抗体结果选自临床抗核提取物抗体检验报告单，根据“+”的数量记录检测结果，“+”检测结果记为1，“++”检测结果记为2，“+++”检测结果记为3，阴性“-”，检测结果记为0。

抗Ro52抗体结果选自临床抗核提取物抗体检验报告单，根据“+”的数量记录检测结果，“+”检测结果记为1，“++”检测结果记为2，“+++”检测结果记为3，阴性“-”，检测结果记为0。

优选地，原发性干燥综合征阳性的判断标准为：预测概率≥0.6881，例如0.6881、0.7、0.75、0.8、0.85、0.9等，上述数值范围内其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。

第五方面，本发明提供一种原发性干燥综合征预测或诊断装置，所述装置包括检测单元和分析单元；

所述检测单元用于执行包括：检测待测个体样本的用于预测或诊断原发性干燥综合征的生物标志物组合的表达量、泪液分泌、SSA抗体和Ro52抗体的表达水平；

所述分析单元用于执行包括：

将用于预测或诊断原发性干燥综合征的生物标志物的检测结果、泪液分泌实验结果、SSA抗体检测结果和Ro52抗体检测结果输入第四方面所述的原发性干燥综合征预测或诊断模型进行数据分析，输出预测概率，并判断是否为原发性干燥综合征阳性。

相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：

补体因子B(CFB)、凝集素(CLU)和中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)在原发性干燥综合征(pSS)的唾液中的表达量升高，可作为预测或诊断原发性干燥综合征的生物标志物。唾液中三种标志物(CFB、CLU、NE)的组合，结合现有临床非侵入性检查(抗SSA、抗Ro52和Schirmer试验)在对pSS的预测或诊断中具有较高的准确性，可以避免唇腺活检这一有创性检查带来的出血、疼痛和暂时性感觉缺失等并发症。

附图说明

图1是ELISA检测pSS和非pSS患者唾液中CFB、CLU、NE浓度的结果，其中A图是检测pSS和非pSS患者唾液中CFB浓度的结果，B图是检测pSS和非pSS患者唾液中CLU浓度的结果，C图是检测pSS和非pSS患者唾液中NE浓度的结果。

图2是唾液中CFB、CLU、NE区分pSS和非pSS的ROC曲线分析，其中A图是唾液中CFB区分pSS和非pSS的ROC曲线分析，B图是唾液中CLU区分pSS和非pSS的ROC曲线分析，C图是唾液中NE区分pSS和非pSS的ROC曲线分析。

图3是ELISA检测初诊pSS和用药后pSS患者唾液中CFB、CLU、NE的浓度，其中A图是ELISA检测初诊pSS和用药后pSS患者唾液中CFB浓度，B图是ELISA检测初诊pSS和用药后pSS患者唾液中CLU浓度，C图是ELISA检测初诊pSS和用药后pSS患者唾液中NE浓度。

图4是建模队列CFB、CLU、NE、抗SSA、抗Ro52和Schirmer's test组合的模型区分pSS和非pSS的ROC曲线分析。

图5是验证队列CFB、CLU、NE、抗SSA、抗Ro52和Schirmer's test组合的模型区分pSS和非pSS的ROC曲线分析。

具体实施方式

下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。

CFB ELISA试剂盒购自Novus安诺伦(北京)生物科技有限公司，货号为NBP2-60564；

CLU ELISA试剂盒购自R&D安迪生物科技公司，货号为DCLU00；

NE ELISA试剂盒购自R&D安迪生物科技公司，货号为DY9167-05。

实施例1

唾液质谱筛选

通过质谱分析来自非pSS(n＝6)和pSS(n＝6)患者的唾液样品中的蛋白质。与非pSS组相比，我们发现pSS组中有261种上调蛋白和198种下调蛋白。基于早期的文献和我们的预实验结果，选择了3种蛋白质，包括CFB、CLU和NE进行进一步的实验。

实施例2

ELISA检测两组唾液中CFB、CLU、NE的水平

使用ELISA法检测非pSS(n＝65)和pSS(n＝121)患者的唾液样品中的CFB、CLU和NE。

检测方法：

1、样本收集

唾液样本的收集一般选在晚上8点或餐后2小时，并且要求不能刷牙、吸烟、进食等，保证未刺激唾液流率是在没有任何咀嚼或味觉刺激的情况下收集的。嘱患者放松姿势静坐，肘部放在膝盖上，头在两臂之间稍向前倾斜，使唾液从下嘴唇被动地排入无菌痰杯中；避免舌头、脸颊、下巴或嘴唇的任何运动引起的刺激性唾液分泌。

2、样本处理

收集静态唾液进行后续处理和实验。首先在9500g 4℃的条件下将唾液离心10分钟沉淀杂质，然后吸取上清，根据体积每100μL加入5μL的蛋白酶抑制剂后冻于-80℃低温冰箱保存。

3、唾液中NE浓度检测

(1)将所需试剂提前找出并放至室温复温；

(2)用ELISA Coating Buffer稀释NE的包被抗体到工作浓度；

(3)包板：在ELISA专用酶标板中每孔加入100μL包被抗体稀释液，立即用透明封口膜覆盖酶标板，置于4℃摇床缓慢摇匀过夜；

(4)洗涤：次日从4℃摇床拿出酶标板，弃除孔内的包被液，并用洗板机洗板：每孔加入400μL PBST，震荡3秒后吸除孔内液体；重复此洗涤步骤3遍，最后一遍从洗板机拿出并在平铺的干净吸水纸上完全拍干；

(5)封闭：每孔加入300μL Reagent Diluent进行封闭，用封口膜小心覆盖后置于摇床缓慢匀速室温孵育至少1h；

(6)重复步骤4的洗板并拍干，等待加样；

(7)稀释唾液样本：从-80℃冰箱中拿出患者的唾液于冰上缓慢解冻，待唾液完全融化后，离心机9500g 4℃离心10min。吸取适量上清唾液按1:500比例稀释；

(8)加样：每孔加入100μL稀释后的待测唾液样品及标准品。标记好样品的顺序及位置。加样时避免气泡的产生，且注意枪头不要触碰到孔板底部。用封口膜覆盖后置于摇床低速室温孵育2h；

(9)重复步骤4的洗板过程并拍干；

(10)加一抗：用Reagent Diluent将detection antibody稀释到一倍浓度，每孔加入100μL稀释好的detection antibody，用封口膜覆盖后置于摇床低速室温孵育2h；

(11)重复步骤4的洗板并拍干；

(12)加二抗：每孔加入100μL辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗，用封口膜小心覆盖后置于室温摇床低速孵育20min，同时注意避光；

(13)重复步骤4的洗板过程并拍干；

(14)显色：在避光环境中每孔加入100μL底物显色液，用封口膜覆盖后室温孵育20min，孵育过程也要注意避光；

(15)终止反应：密切观察显色情况，当标准品出现颜色梯度或其余孔出现差异性颜色梯度后每孔加入50μL终止液，颜色由蓝变黄，立即放入酶标仪上，摇匀使反应完全终止；

(16)设置酶标仪相关参数，波长为450nm及620nm，5min内读取OD值并计算对应浓度。

4、唾液中CFB浓度检测

(1)将待用试剂提前放至室温；

(2)稀释待测唾液样本：从-80℃冰箱中拿出患者的唾液于冰上缓慢解冻，待唾液完全融化后，离心机9500g 4℃离心10min。吸取适量上清唾液按CFB 1:50比例稀释；每次取样都要更换新枪头，避免唾液样本间相互污染；

(3)加样：拆开CFB的预包板盒，每孔加入50μL稀释后的待测唾液样品及标准品，加样时避免气泡的产生，且注意枪头不要触碰到孔板底部。用封口膜覆盖后置于摇床低速室温孵育2h；

(4)洗板机洗板：每孔加入400μL PBST，震荡3秒后吸除孔内液体；重复该洗涤步骤3遍，最后一遍从洗板机拿出并在吸水纸上完全拍干；

(5)加一抗：用Reagent Diluent将detection antibody稀释到一倍浓度，每孔加入50μL稀释好的detection antibody，用封口膜覆盖后置于摇床低速室温孵育1h；

(6)重复步骤4的洗板过程并拍干；

(7)加二抗：每孔加入50μL HRP标记的二抗，用封口膜覆盖后置于摇床低速室温孵育30min，注意避光；

(8)重复步骤4的洗板并拍干；

(9)显色：每孔加入50μL底物显色液，用封口膜覆盖后室温孵育20min，注意避光；

(10)终止反应：观察显色情况，当标准品出现颜色梯度或其余孔出现差异性颜色梯度后每孔加入50μL终止液，颜色由蓝变黄，立即放入酶标仪上，摇匀使反应完全终止；

(11)设置酶标仪相关参数，波长为450nm及620nm，5min内读取OD值并计算对应浓度。

5、唾液中CLU浓度检测

(1)将所需试剂提前放至室温；

(2)稀释待测唾液样本：从-80℃冰箱中拿出患者的唾液于冰上缓慢解冻，待唾液完全融化后，离心机9500g 4℃离心10min。吸取适量上清唾液按1:50比例稀释；每次取样都要更换新枪头，避免唾液样本间相互污染；

(3)加样：拆开CLU的预包板盒，每孔先加入100μL Assay Diluent，随即加入50μL稀释后的待测唾液样品及标准品。标记好样品的顺序及位置。加样时避免气泡的产生，且注意枪头不要触碰到孔板底部。用封口膜覆盖后置于室温摇床低速孵育2h；

(4)洗板机洗板：每孔加入400μL PBST，震荡3秒后吸除孔内液体；重复该洗涤步骤3遍，最后一遍从洗板机拿出并在吸水纸上完全拍干；

(5)加一抗：每孔加入200μL辣根过氧化物酶标记的一抗，用封口膜覆盖后置于摇床低速室温孵育2h，注意避光；

(6)重复步骤4的洗板并拍干；

(7)显色：每孔加入200μL底物显色液，用封口膜轻轻覆盖后室温孵育30min，注意避光；

(8)终止反应：观察显色情况，当标准品出现颜色梯度或其余孔出现差异性颜色梯度后每孔加入50μL终止液，颜色由蓝变黄，立即放入酶标仪上，摇匀使反应完全终止；

(9)设置酶标仪相关参数，波长为450nm及620nm，5min内读取OD值并计算对应浓度。

6、检测结果：

使用ELISA法检测非pSS(n＝65)和pSS(n＝121)患者的唾液样品中的CFB、CLU和NE，结果如图1所示，结果显示pSS患者唾液中的CFB、CLU和NE显著升高。ROC曲线分析确定了唾液中CFB、CLU和NE具有区分pSS和非pSS的能力，如图2所示。根据ROC曲线分析和约登指数，我们确定了CFB、CLU和NE的浓度的最佳截断值来区分阳性和阴性，如表1所示。

表1

蛋白	截断值	敏感度(％)	特异度(％)	P值
					CFB(ng/mL)	173.50	84.3	44.6	0.003
CLU(ng/mL)	221.40	86.8	69.2	<0.001
					NE(ng/mL)	0.00	67.8	75.4	<0.001

使用ELISA法检测初诊pSS(n＝109)及用药后的pSS(n＝31)唾液样品中CFB、CLU和NE。结果发现用药后pSS患者唾液中CFB、CLU和NE显著降低，结果如图3所示。

实施例3

多因素回归分析构建pSS的非侵入性诊断模型

收集上述非pSS(n＝65)和pSS(n＝121)患者的临床检查数据。CFB、CLU、NE按最佳截断值换算为分类变量，高于截断值的判断为阳性，赋值为1，低于截断值的为阴性，赋值为0。泪液分泌试验(Schirmer's test)结果按临床预测或诊断标准转换为分类变量，临床预测或诊断为阳性则编码为1，阴性编码为0。血清自身抗体检查，如抗SSA、抗Ro52和抗SSB抗体则根据临床检验检查单“+”的数量编码为0、1、2和3。

单因素分析显示CFB、CLU、NE、Schirmer's test结果、抗SSA、抗Ro52、抗SSB、ANA滴度、血沉和IgG均与pSS的预测或诊断有关。为了确定pSS最终的非侵入性预测因素，我们进一步使用逐步Logistic回归模型进行了多因素回归分析。我们将单因素分析中P<0.1的候选参数纳入多因素回归模型，在非侵入性预测或诊断模型中保留的最终变量是CFB、CLU、NE、抗SSA、抗Ro52和Schirmer's test结果。我们基于Logistic回归分析计算了预测或诊断pSS的预测概率(PRE)。

预测pSS的方程为：PRE＝-4.511+1.369×"CFB"+2.441×"CLU"+1.237×"NE"+1.194×Schirmer’s test+0.709×"anti-SSA"+0.481×"anti-Ro52"。基于Logistic回归分析的预测概率，这个联合预测或诊断模型的AUC值为0.930(P<0.001,95％ CI 0.877-0.965)，其敏感度和特异度分别为84.85％和92.45％，如图4所示。

实施例4

通过验证队列对上述诊断模型的诊断效能进行验证

收集另外的49例pSS和23例非pSS患者唾液作为验证队列，ELISA法检测唾液样品中的CFB、CLU和NE。根据预测pSS的方程：PRE＝-4.511+1.369×"CFB"+2.441×"CLU"+1.237×"NE"+1.194×Schirmer’s test+0.709×"anti-SSA"+0.481×"anti-Ro52"计算验证队列中患者诊断pSS的概率。验证队列中PRE的AUC为0.840，敏感度和特异度分别为78.72％和86.36％，结果如图5所示。

结合pSS唾液中的标志物(CFB、CLU、NE)和现有临床非侵入性检查(抗SSA、抗Ro52和Schirmer试验)的组合具有对pSS诊断的效能。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的一种用于预测或诊断原发性干燥综合征的生物标志物组合及其应用，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

Claims (10)

1.一种用于预测或诊断原发性干燥综合征的生物标志物组合，其特征在于，所述生物标志物组合包括CFB、CLU和NE。

2.根据权利要求1所述的用于预测或诊断原发性干燥综合征的生物标志物组合或检测权利要求1所述的生物标志物组合表达量的试剂在制备用于预测或诊断原发性干燥综合征的产品中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述应用包括构建原发性干燥综合征预测或诊断模型和/或制备原发性干燥综合征预测或诊断装置。

4.一种用于预测或诊断原发性干燥综合征的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括检测权利要求1所述的用于预测或诊断原发性干燥综合征的生物标志物组合表达量的试剂。

5.根据权利要求4所述的用于预测或诊断原发性干燥综合征的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括检测泪液分泌的试剂、检测SSA抗体的试剂、检测Ro52抗体的试剂。

6.一种原发性干燥综合征预测或诊断模型，其特征在于，所述原发性干燥综合征预测或诊断模型的输入变量包括权利要求1所述的用于预测或诊断原发性干燥综合征的生物标志物组合的检测结果、泪液分泌实验结果、SSA抗体的检测结果和Ro52抗体的检测结果。

7.根据权利要求6所述的原发性干燥综合征预测或诊断模型，其特征在于，所述原发性干燥综合征预测或诊断模型的输出变量包括预测概率，所述预测概率的计算公式为：

预测概率＝-4.511+1.369×CFB检测结果+2.441×CLU检测结果+1.237×NE检测结果+1.194×泪液分泌实验结果+0.709×SSA抗体检测结果+0.481×Ro52抗体检测结果。

8.根据权利要求7所述的原发性干燥综合征预测或诊断模型，其特征在于，CFB浓度高于173.50ng/mL，CFB检测结果记为1，反之，检测结果记为0；

CLU浓度高于221.40ng/mL，CLU检测结果记为1，反之，检测结果记为0；

NE浓度高于0ng/mL，NE检测结果记为1，反之，检测结果记为0；

泪液分泌实验5分钟内任一侧眼分泌泪液润湿滤纸少于5mm，泪液分泌实验结果记为1，反之，检测结果记为0；

SSA抗体检测结果选自0、1、2、3；

Ro52抗体检测结果选自0、1、2、3。

9.根据权利要求7或8所述的原发性干燥综合征预测或诊断模型，其特征在于，原发性干燥综合征阳性的判断标准为：预测概率≥0.6881。

10.一种原发性干燥综合征预测或诊断装置，其特征在于，所述装置包括检测单元和分析单元；

所述检测单元用于执行包括：检测待测个体样本的用于预测或诊断原发性干燥综合征的生物标志物组合的表达量、泪液分泌、SSA抗体和Ro52抗体的表达水平；

所述分析单元用于执行包括：

将用于预测或诊断原发性干燥综合征的生物标志物的检测结果、泪液分泌实验结果、SSA抗体检测结果和Ro52抗体检测结果输入权利要求6-9中任一项所述的原发性干燥综合征预测或诊断模型进行数据分析，输出预测概率，并判断是否为原发性干燥综合征阳性。