CN103571798B - 鸭坦布苏病毒弱毒株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种鸭坦布苏病毒弱毒株，该弱毒株是由鸭坦布苏病毒强毒株FX2010经在鸡胚成纤维细胞(CEF)上连续传代培养后突变获得。本发明还公开了预防或治疗鸭坦布苏病毒病的疫苗，该疫苗是以上述鸭坦布苏病毒弱毒株为种毒的鸭坦布苏病毒病弱毒活疫苗或灭活疫苗。本发明还公开了用于诊断鸭坦布苏病毒病的检测抗原，该检测抗原为上述鸭坦布苏病毒弱毒株的病毒颗粒。本发明的鸭坦布苏病毒弱毒株，无论是作为活疫苗还是灭活疫苗，在免疫雏鸭和产蛋鸭后，对强毒攻击的保护率都达到100％，且该鸭坦布苏病毒弱毒株作为检测抗原，具有良好的特异性，因此，该鸭坦布苏病毒弱毒株在鸭坦布苏病毒病的防治与诊断方面具有非常好的应用前景。

Description

鸭坦布苏病毒弱毒株及其应用

技术领域

本发明涉及病毒技术领域，尤其涉及一种由鸭坦布苏病毒强毒株经传代培养使其致病力减弱的鸭坦布苏病毒弱毒株，以及该弱毒株用作鸭坦布苏病毒病的活疫苗、灭活疫苗及诊断抗原的应用。

背景技术

2010年4月以来，我国上海、浙江、江苏等地发生了以肉鸭生长迟缓和蛋鸭产蛋急剧下降为特征的一种传染病，短短几个月时间里，南方各省几乎所有的蛋鸭场都受到了该病的侵袭，给养鸭业造成了巨大的经济损失。国内的研究者通过病毒分离鉴定，病毒基因组序列分析，动物回归试验等实验证明该传染病是由一种新的黄病毒——鸭坦布苏病毒(Duck Tembusuvirus，DTMUV)所引起，该病毒属于黄病毒属Ntaya病毒群。该病毒自发现以来，在我国迅速传播，广泛流行。2010-2012年，该病毒在上海、浙江、江苏、安徽、河南、山东、湖南、湖北、福建、河北等地鸭群中均被检测到。

鸭坦布苏病毒病为新发传染病，具有高度传染性，且一年四季都可流行，给鸭坦布苏病毒病的防控带来了极大的困难，目前，尚无有效的防控措施，更没有疫苗可用，也没有有效、快速简便的血清学检测方法。

发明内容

本发明要解决目前没有有效的防控鸭坦布苏病毒病的疫苗的技术问题，提供一种鸭坦布苏病毒弱毒株，该弱毒株可用于制备预防鸭坦布苏病毒病的活疫苗或灭活疫苗。

此外，还需要提供一种上述鸭坦布苏病毒弱毒株的应用，用于制备检测鸭坦布苏病毒抗体的诊断抗原，可快速、灵敏地检测出鸭坦布苏病毒。

为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现：

在本发明的一个方面，提供了一种鸭坦布苏病毒弱毒株，该弱毒株是由鸭坦布苏病毒强毒株FX2010经突变获得，所述突变至少包含以下5个氨基酸突变位点：第407位D突变为N、第599位V突变为A、第636位M突变为K、第1050位V突变为A、和第1820位T突变为I。

本发明的鸭坦布苏病毒弱毒株，是由鸭坦布苏病毒强毒株FX2010经鸡胚成纤维细胞(CEF)连续培养传代而获得。当鸭坦布苏病毒强毒株FX2010在CEF上传代培养到第60代病毒(FX2010-60P)时出现上述5个氨基酸突变位点，即包括第407位(D突变为N)、第599位(V突变为A)、第636位(M突变为K)、第1050位(V突变为A)和第1820位(T突变为I)，经试验证明这5个氨基酸位点的突变使鸭坦布苏病毒对鸭的致病力减弱，即FX2010-60P的毒力比其母源毒株FX2010弱。

鸭坦布苏病毒强毒株FX2010在CEF上传代培养到第80代病毒(FX2010-80P)时，与FX2010-60P相比新增1个氨基酸突变位点，即第442位(Y突变为F)。这个位点的突变使鸭坦布苏病毒FX2010-80P对鸭的致病力减弱，即FX2010-80P的毒力比FX2010-60P弱。

鸭坦布苏病毒强毒株FX2010在CEF上传代培养到第100代病毒(FX2010-100P)时，与FX2010-80P相比新增2个氨基酸突变位点，即第376位(E突变为G)和第444位(A突变为V)。这2个位点的突变使鸭坦布苏病毒FX2010-100P对鸭的致病力减弱，即FX2010-100P的毒力比FX2010-80P弱。

鸭坦布苏病毒强毒株FX2010在CEF上传代培养到第130代病毒(FX2010-130P)时，与FX2010-100P相比新增3个氨基酸突变位点，即第993位(K突变为R)、第2227位(V突变为A)和2316位(F突变为Y)。这3个位点的突变使鸭坦布苏病毒FX2010-130P对鸭的致病力减弱，即FX2010-130P的毒力比FX2010-100P弱。

鸭坦布苏病毒强毒株FX2010在CEF上传代培养到第145代病毒(FX2010-145P)时，与FX2010-130P相比新增2个氨基酸突变位点，即第226位(A突变为V)和第2378位(S突变为L)。这2个位点的突变使鸭坦布苏病毒FX2010-145P对鸭的致病力减弱，即FX2010-145P的毒力比FX2010-130P弱。

鸭坦布苏病毒强毒株FX2010在CEF上传代培养到第168代病毒(FX2010-168P)时，与FX2010-145P相比新增2个氨基酸突变位点和在3′NCR(3′非编码区)上的1个核苷酸突变位点，氨基酸突变位点为第453位(R突变为K)和第3313位(V突变为A)，核苷酸突变位点为3′NCR上的第246位(T突变为C)。这3个位点的突变使鸭坦布苏病毒FX2010-168P对鸭的致病力减弱，即FX2010-168P的毒力比FX2010-145P弱。

鸭坦布苏病毒强毒株FX2010在CEF上传代培养到第180代病毒(FX2010-180P)时，与FX2010-168P相比新增4个氨基酸突变位点和在3′NCR(3′非编码区)上的1个核苷酸突变位点，氨基酸突变位点为第980位(R突变为G)、第1435位(V突变为L)、第2171位(F突变为L)和第2793位(R突变为G)，核苷酸突变位点为3′NCR上的第187位(C突变为T)。这5个位点的突变使鸭坦布苏病毒FX2010-180P对鸭的致病力减弱，即FX2010-180P的毒力比FX2010-168P弱。与亲本强毒株FX2010相比，传代毒FX2010-180P共有19个氨基酸的突变以及3′非编码区2个核苷酸的突变，正是这些突变导致了鸭坦布苏病毒致病力的明显减弱，该鸭坦布苏病毒弱毒株FX2010-180P的全基因组核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明的鸭坦布苏病毒弱毒株(FX2010-180P)，已于2012年7月25日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，保藏号为CCTCC NO：V201231，其分类命名为鸭坦布苏病毒弱毒株(FX2010-180P)Duck Tembusu virus(FX2010-180P)。

在本发明的另一方面，还提供了一种预防或治疗鸭坦布苏病毒病的疫苗，该疫苗是以上述鸭坦布苏病毒弱毒株FX2010-180P为种毒的鸭坦布苏病毒病弱毒活疫苗，或是以上述第60代、80代、100代、130代、145代、168代及180代鸭坦布苏病毒弱毒株为种毒的鸭坦布苏病毒病弱毒灭活疫苗。

FX2010-180P弱毒株10^3.0TCID₅₀剂量肌肉注射可诱导雏鸭和产蛋鸭产生高滴度的抗体，对强毒攻击的保护率达100％，该弱毒株可以作为鸭坦布苏病毒病活疫苗的种毒株。

FX2010-180P弱毒株在CEF和DF1细胞上培养的病毒滴度可达10^7.0TCID₅₀/mL，该病毒细胞培养液灭活并与蛋白佐剂混合乳化后，经肌肉注射可诱导雏鸭和产蛋鸭产生有效的免疫应答，对强毒攻击的保护率达100％，该弱毒株可以作为鸭坦布苏病毒病灭活疫苗的种毒株。与强毒株相比，用弱毒株生产灭活疫苗具有生物安全的优势，而且，弱毒株更加适应CEF和DF1细胞，在细胞上培养的病毒毒价更高，使灭活疫苗更容易制备和生产。

在本发明的另一方面，还提供了一种用于诊断鸭坦布苏病毒病的检测抗原，该检测抗原为上述鸭坦布苏病毒弱毒株的病毒颗粒。

鸭坦布苏病毒弱毒株FX2010-180P的细胞培养液经差速离心纯化后的病毒颗粒，可作为检测抗原检测鸭坦布苏病毒特异性抗体。

本发明的鸭坦布苏病毒弱毒株，肌肉注射雏鸭和产蛋鸭7天和14天后，可诱导雏鸭和产蛋鸭产生高滴度的抗体，该鸭坦布苏病毒弱毒株，无论是作为活疫苗还是灭活疫苗，对强毒攻击的保护率都达到100％。此外，该鸭坦布苏病毒弱毒株作为检测抗原，具有良好的特异性。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

图1是本发明鸭坦布苏病毒在CEF上连续传代培养导致的不同代次病毒的氨基酸突变点及3’NCR上的核苷酸突变点列表图；

图2是本发明实施例3的雏鸭免疫FX2010-180P后7天和14天的抗体效价图；

图3是本发明实施例3的产蛋鸭免疫FX2010-180P后7天和14天的抗体效价图；

图4是本发明实施例4的实验鸭免疫灭活疫苗后14天的抗体效价图；

图5是本发明实施例5的FX2010-180P病毒作为间接ELISA包被抗原检测鸭坦布苏病毒抗体的特异性结果柱状图；

图6是本发明实施例5的FX2010-180P病毒作为阻断ELISA包被抗原检测鸭坦布苏病毒抗体的特异性结果柱状图。

本发明的鸭坦布苏病毒弱毒株(FX2010-180P)，已于2012年7月25日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，保藏号为CCTCC NO：V201231，其分类命名为鸭坦布苏病毒弱毒株(FX2010-180P)Duck Tembusu virus(FX2010-180P)。

具体实施方式

下列实施例中，未注明具体条件的实验方法，通常按常规条件，如《精编分子生物学实验指南》(F.M.奥斯伯，R.E.金斯顿，J.G.塞德曼等主编，马学军，舒跃龙的译.北京：科学出版社，2004)中所述的方法进行。

为了研制能有效防控鸭坦布苏病毒病的疫苗，本发明通过将鸭坦布苏病毒强毒株FX2010(本实验室分离获得的鸭坦布苏病毒奉贤2010分离株，参见已发表的文章Yan P，Zhao Y，Zhang X，Xu D，Dai X，Teng Q，Yan L，Zhou J，Ji X，Zhang S，Liu G，Zhou Y，Kawaoka Y，Tong G，Li Z.An infectious disease of ducks caused by a newly emerged Tembusu virus strain in mainlandChina.Virology.2011.417(1)：1-8)经鸡胚成纤维细胞(CEF)连续传代培养并用有限稀释法纯化而获得了新的鸭坦布苏病毒弱毒株，该弱毒株具有连续传代过程中产生的多个氨基酸及核苷酸的突变，这些氨基酸及核苷酸的突变是鸭坦布苏病毒致病力减弱的直接原因，其中第180代病毒即FX2010-180P弱毒株对鸭的致病力最弱，其作为鸭坦布苏病毒病弱毒活疫苗效果最佳；第60代、80代、100代、130代、145代、168代及180代弱毒株，都适于制成有效的鸭坦布苏病毒病灭活疫苗，只是第180代弱毒株由于致病力最弱，用于生产灭活疫苗时相对具有生物安全的优势。

在下面的具体实施例中，第180代病毒(FX2010-180P)高剂量(10^5.5TCID₅₀)接种对雏鸭及产蛋鸭不引起任何不良反应，也没有对鸭造成任何明显的病理损伤。该弱毒株10^3.0TCID₅₀的剂量肌肉注射可诱导雏鸭和产蛋鸭产生高滴度的抗体，对强毒攻击的保护率达100％；该毒株在CEF或DF1细胞上培养的病毒滴度可达10^7.0TCID₅₀/mL，该病毒细胞培养液灭活并与蛋白佐剂混合乳化后，经肌肉注射可诱导雏鸭和产蛋鸭产生有效的免疫应答，对强毒攻击的保护率达100％；该毒株经纯化后的病毒颗粒可以作为检测抗原检测鸭坦布苏病毒特异性抗体。

由此可知，本发明的鸭坦布苏病毒弱毒株可作为预防或治疗鸭坦布苏病毒病的活疫苗或灭活疫苗的生产毒株，也可作为检测鸭坦布苏病毒病特异性抗体的检测抗原，在鸭坦布苏病毒病的防治与诊断方面具有很好的应用前景。

实施例1鸭坦布苏病毒传代培养及序列分析

用分离到的在自然界中引起鸭发病的鸭坦布苏病毒强毒株FX2010，接种鸡胚成纤维细胞(CEF)长成单层的T75细胞培养瓶，每瓶接种1mL病毒液，吸附1-2小时后，弃去病毒液，加入12mL含10％胎牛血清的DMEM培养液，36-72小时后，吸取培养上清液，再接种CEF长成单层的T75细胞培养瓶，连续传代培养173代，然后用有限稀释法纯化5次后，传代至第180代。把第60代、80代、100代、130代、145代、168代及180代病毒进行全基因测序，结果如图1所示(图1中，灰色阴影表示与前面测序的病毒基因相比新增加的突变点；氨基酸位置是指该位点在多聚蛋白上的位置；核苷酸位置是指该位点在3′NCR上的位置)，鸭坦布苏病毒强毒株FX2010在CEF传代至第60代(FX2010-60P)时，发生了5个氨基酸的突变，而第80代(FX2010-80P)、100代(FX2010-100P)、130代(FX2010-130P)和145代(FX2010-145P)病毒分别新增1、2、3和2个氨基酸的突变，第168代(FX2010-168P)和180代(FX2010-180P)分别新增2个和4个氨基酸突变，并在3′NCR分别新增1个核苷酸突变。与亲本强毒株FX2010相比，传代毒FX2010-180P共有19个氨基酸的突变以及3′非编码区2个核苷酸的突变，正是这些突变导致了鸭坦布苏病毒致病力的明显减弱，该鸭坦布苏病毒弱毒株FX2010-180P的全基因组核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。鸭坦布苏病毒FX2010强毒株在传代培养过程中的突变点，第226、376、407、442、444、453、599、636、980、993、1050、1435、1820、2171、2227、2316、2378、2793、3313位氨基酸分别位于M、E、NS1、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、NS5蛋白上，2个核苷酸突变点位于3′NCR上。本发明的鸭坦布苏病毒弱毒株(FX2010-180P)，已于2012年7月25日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，保藏号为CCTCC NO：V201231，其分类命名为鸭坦布苏病毒弱毒株(FX2010-180P)Duck Tembusu virus(FX2010-180P)。

实施例2不同代次病毒对鸭的致病力分析

把上述实施例1中不同代次病毒感染雏鸭和产蛋鸭，通过观察鸭的临床症状，剖检后的病理变化以及病毒在鸭体内的增殖及分布情况，分析不同代次病毒对鸭的致病力。具体方法如下：

(1)雏鸭鼻腔感染试验

60只21日龄健康雏鸭，随机分成6组，每组10只。第1-5组分别鼻腔接种FX2010(剂量为10^3.5TCID₅₀)、FX2010-60P、FX2010-80P、FX2010-100P和FX2010-130P(剂量为10^5.5TCID₅₀)，第6组为空白对照组。接种后第4天，剖检，观察脏器的病理变化，并取脾、肺、肾和脑等组织，每克组织加1mLPBS，研磨后，离心，取上清，用DF-1细胞分离病毒。

(2)产蛋鸭鼻腔感染试验

60只180日龄健康产蛋鸭，随机分成6组，每组10只。第1-5组分别鼻腔接种FX2010(剂量为10^3.5TCID₅₀)、FX2010-60P、FX2010-80P、FX2010-100P和FX2010-130P(剂量为10^5.5TCID₅₀)，第6组为空白对照组。接种后第4天，剖检，观察脏器的病理变化，并取脾、肺、肾、脑和卵巢组织，每克组织加1mLPBS，研磨后，离心，取上清，用DF-1细胞分离病毒。

(3)雏鸭肌肉注射感染试验

70只21日龄健康雏鸭，随机分成7组，每组10只。第1-6组分别肌肉注射FX2010(剂量为10^3.5TCID₅₀)、FX2010-100P、FX2010-130P、FX2010-145P、FX2010-168P和FX2010-180P(剂量为10^5.5TCID₅₀)，第7组为空白对照组。接种后第4天，剖检，观察脏器的病理变化，并取脾、肺、肾和脑等组织，每克组织加1mLPBS，研磨后，离心，取上清，用DF-1细胞分离病毒。其中，FX2010、FX2010-168P和FX2010-180P感染鸭另外取心脏、肝脏、气管、胰脏、法氏囊和小肠等组织分离病毒。

(4)产蛋鸭肌肉注射感染病毒

70只180日龄健康产蛋麻鸭，随机分成7组，每组10只。第1-6组分别肌肉注射FX2010(剂量为10^3.5TCID₅₀)、FX2010-100P、FX2010-130P、FX2010-145P、FX2010-168P和FX2010-180P(剂量为10^5.5TCID₅₀)，第7组为空白对照组。接种后第4天，剖检，观察脏器的病理变化，并取脾、肺、肾、脑和卵巢等组织，每克组织加1mLPBS，研磨后，离心，取上清，用DF-1细胞分离病毒。其中，FX2010、FX2010-168P和FX2010-180P感染鸭另外取心脏、肝脏、气管、胰脏、小肠等组织分离病毒。

上述试验结果如下：

1、不同代次病毒鼻腔感染对雏鸭的致病力(见下表1)

表1雏鸭鼻腔感染不同代次病毒的评价总结

注：临床表现：+表示症状明显；±表示症状轻微；-表示正常。剖检病变：“N/10”表示“被检脏器有明显病变鸭数量/鸭总数量”。病理切片：+表示严重病变；±表示轻微病变；-表示正常。病毒分离：“N/10”表示“分离到病毒鸭数量/鸭总数量”。

(1)临床表现

雏鸭感染后，FX2010感染雏鸭表现为采食减少，精神沉郁，拉绿色稀便。FX2010-60P和FX2010-80P感染雏鸭采食轻微减少，偶尔可见部分雏鸭拉绿色稀便。FX2010-100P和FX2010-130P感染雏鸭在采食、饮水、粪便、精神状态等没有异常变化(表1)。

(2)剖检病变

雏鸭鼻腔感染后4天，剖检，检查病理变化。结果显示，FX2010感染雏鸭全部表现为脾脏严重肿大，肾脏肿大；FX2010-60P感染雏鸭10/10表现为脾脏肿大，4/10表现为肾脏轻微肿大；FX2010-80P感染雏鸭8/10表现为脾脏肿大，1/10表现为肾脏轻微肿大；FX2010-100P感染雏鸭3/10表现为脾脏肿大；FX2010-130P感染雏鸭的脏器均没有异常变化，与对照组没有明显差别(表1)。

(3)病理变化

1)FX2010感染鸭病理变化。

脾：可见多处细胞坏死灶，脾脏内毛细血管可见明显的增生肿胀，血管内充血。

肺：肺脏内支气管、细支气管壁和肺泡壁出现炎性渗出物，肺内血管充血、出血。

肾：肾脏组织坏死，肾小球血管间质细胞增生；肾内毛细血管增生肿胀，肾间质有少量的淋巴细胞和中性白细胞浸润。

脑：脑膜内中性白细胞、淋巴细胞和浆细胞等出现炎性细胞浸润。脑组织内有少量的神经细胞固缩，细胞浆、核浓染，可见小胶质细胞及炎性细胞浸润；脑组织内血管扩张充血，间隙增宽。

2)传代毒感染鸭病理变化。

脾：FX2010-60P、FX2010-80P和FX2010-100P感染部分雏鸭可见少量坏死灶、脾脏内毛细血管增生、充血，FX2010-130P感染雏鸭脾组织均无明显病变。

肺：FX2010-60P和FX2010-80P感染鸭部分可见肺脏内支气管、细支气管壁和肺泡壁出现炎性渗出物，肺内血管充血、出血；FX2010-100P感染鸭部分可见肺脏内支气管、细支气管壁和肺泡壁出现炎性渗出物，肺内血管充血；FX2010-130P感染雏鸭肺组织均无明显病变。

肾：FX2010-60P和FX2010-80P感染鸭部分可见肾小球血管间质细胞增生，肾间质有少量的淋巴细胞和中性白细胞浸润，FX2010-100P和FX2010-130P感染雏鸭肾组织均无明显病变。

脑：FX2010-60P、FX2010-80P、FX2010-100P和FX2010-130P感染雏鸭脑组织均无明显病变。

(4)病毒分离

FX2010感染雏鸭的肺和肾组织均可分离到病毒，8/10感染雏鸭脾脏和7/10感染雏鸭脑中可以分离到病毒；FX2010-60P感染雏鸭，7/10脾脏、5/10肺脏和4/10肾脏可分离到病毒；FX2010-80P感染雏鸭，8/10脾脏、2/10肺脏和1/10肾脏可分离到病毒；FX2010-100P感染雏鸭5/10脾脏和2/10肺脏可分离到病毒；而FX2010-130P感染鸭均分离不到病毒(表1)。

2、不同代次病毒鼻腔感染对产蛋鸭的致病力(见下表2)

表2产蛋鸭鼻腔感染不同代次病毒的评价总结

注：临床表现：+表示症状明显；±表示症状轻微；-表示正常。剖检病变：“N/10”表示“被检脏器有明显病变鸭数量/鸭总数量”。病理切片：+表示严重病变；±表示轻微病变；-表示正常。病毒分离：“N/10”表示“分离到病毒鸭数量/鸭总数量”。

(1)临床表现

FX2010感染产蛋鸭表现为采食减少，精神沉郁，拉绿色稀便，并有1只死亡。FX2010-60P和FX2010-80P感染产蛋鸭采食轻微减少，偶尔可见部分鸭拉绿色稀便。FX2010-100P和FX2010-130P感染鸭在采食、饮水、粪便、精神状态等没有异常变化(表2)。

(2)剖检病变

FX2010感染鸭全部表现为脾脏严重肿大，肾脏肿大，卵泡出血、破裂、变性，病死鸭表现为严重的卵黄性腹膜炎。FX2010-60P感染鸭10/10表现为脾脏肿大，4/10表现为肾脏轻微肿大，10/10表现为卵巢病变；FX2010-80P感染鸭6/10表现为脾脏肿大，4/10表现为肾脏轻微肿大，8/10表现为卵巢病变；FX2010-100P感染鸭4/10表现为脾脏轻微肿大，4/10表现为卵巢病变；FX2010-130P感染鸭的脏器均没有异常变化，与对照组没有明显差别(表2)。

(3)病理变化

1)FX2010感染鸭病理变化

脾：可见多处细胞坏死灶，脾脏内毛细血管可见明显的增生肿胀，血管内充血。

肺：肺脏内支气管、细支气管壁和肺泡壁出现炎性渗出物，肺内血管充血、出血。

肾：肾脏组织坏死，肾小球血管间质细胞增生；肾内毛细血管增生肿胀，肾间质有少量的淋巴细胞和中性白细胞浸润。

脑：脑膜内中性白细胞、淋巴细胞和浆细胞等出现炎性细胞浸润。脑组织内有少量的神经细胞固缩，细胞浆、核浓染，可见小胶质细胞及炎性细胞浸润；脑组织内血管扩张充血，间隙增宽。

卵巢：感染鸭都表现为不同程度的组织变性、炎性浸润、出血、充血。

2)传代毒感染鸭病理变化

脾：FX2010-60P、FX2010-80P和FX2010-100P感染部分鸭可见少量坏死灶、脾脏内毛细血管增生、充血，FX2010-130P感染鸭脾组织均无明显病变。

肺：FX2010-60P和FX2010-80P感染鸭部分可见肺脏内支气管、细支气管壁和肺泡壁出现炎性渗出物，肺内血管充血、出血；FX2010-100P感染鸭部分可见肺脏内支气管、细支气管壁和肺泡壁出现炎性渗出物，肺内血管充血；FX2010-130P感染鸭肺组织均无明显病变。

肾：FX2010-60P和FX2010-80P感染鸭部分可见肾小球血管间质细胞增生，肾间质有少量的淋巴细胞和中性白细胞浸润，FX2010-100P和FX2010-130P感染鸭肾组织均无明显病变。

脑：FX2010-60P、FX2010-80P、FX2010-100P和FX2010-130P感染鸭脑组织均无明显病变。

卵巢：FX2010-60P、FX2010-80P、FX2010-100P感染鸭表现为不同程度的组织变性、坏死、炎性浸润、出血、充血，FX2010-130P感染鸭卵巢组织无明显病变。

(4)病毒分离

FX2010感染鸭的肺、肾和卵巢组织均可分离到病毒，9/10感染鸭脾脏和7/10感染鸭脑中可以分离到病毒；FX2010-60P感染鸭，5/10脾脏、5/10肺脏4/10肾脏和4/10卵巢可分离到病毒；FX2010-80P感染鸭，5/10脾脏、2/10肺脏和4/10卵巢可分离到病毒；FX2010-100P感染鸭5/10脾脏和5/10卵巢可分离到病毒；而FX2010-130P感染鸭各组织均分离不到病毒(表2)。

结论：雏鸭和产蛋鸭经鼻腔接种不同代次的病毒后，第60代、80代、100代和130代病毒对鸭的致病力逐渐下降，第130代病毒已经失去了通过鼻腔感染鸭的能力。

3、不同代次病毒肌肉注射对雏鸭的致病力(见下表3)

表3雏鸭肌肉注射感染不同代次病毒的评价总结

注：临床表现：+表示症状明显；±表示症状轻微；-表示正常。剖检病变：“N/10”表示“被检脏器有明显病变鸭数量/鸭总数量”。病理切片：+表示严重病变；±表示轻微病变；-表示正常。病毒分离：“N/10”表示“分离到病毒鸭数量/鸭总数量”。

(1)临床表现

雏鸭感染后，FX2010感染雏鸭表现为采食减少，精神沉郁，拉绿色稀便。FX2010-100P感染雏鸭有轻微的采食减少，偶尔可见部分鸭拉绿色粪便、FX2010-130P、FX2010-145P、FX2010-168P和FX2010-180P感染雏鸭在采食、饮水、粪便、精神状态等均没有异常变化(表3)。

(2)剖检病变

FX2010感染雏鸭全部表现为脾脏明显肿大，肾脏肿大；FX2010-100P感染雏鸭7/10表现为脾脏肿大、4/10肾脏肿大，FX2010-130P感染鸭6/10表现为脾脏肿大；FX2010-145P、FX2010-168P和FX2010-180P感染雏鸭的脏器均没有异常变化，与对照组没有明显差别(表3)。

(3)病理变化

1)FX2010感染鸭病理变化

脾：可见多处细胞坏死灶，脾脏内毛细血管可见明显的增生肿胀，血管内充血。

肺：肺脏内支气管、细支气管壁和肺泡壁出现炎性渗出物，肺内血管充血、出血。

肾：肾脏组织坏死，肾小球血管间质细胞增生；肾内毛细血管增生肿胀，肾间质有少量的淋巴细胞和中性白细胞浸润。

脑：脑膜内中性白细胞、淋巴细胞和浆细胞等出现炎性细胞浸润。脑组织内有少量的神经细胞固缩，细胞浆、核浓染，可见小胶质细胞及炎性细胞浸润；脑组织内血管扩张充血，间隙增宽。

2)传代毒感染鸭病理变化

脾：FX2010-100P、FX2010-130P感染部分雏鸭可见少量坏死灶、脾脏内毛细血管增生、充血，FX2010-145P、FX2010-168P和FX2010-180P感染雏鸭脾组织均无明显病变。

肺：FX2010-100P感染鸭部分可见肺脏内支气管、细支气管壁和肺泡壁出现炎性渗出物，肺内血管充血；FX2010-130P感染雏鸭肺内血管充血；FX2010-145P、FX2010-168P和FX2010-180P感染雏鸭肺组织均无明显病变。

肾：FX2010-100P感染鸭部分可见肾内毛细血管增生肿胀，肾间质有少量的淋巴细胞和中性白细胞浸润；FX2010-130P、FX2010-145P、FX2010-168P和FX2010-180P感染雏鸭肾组织均无明显病变。

脑：FX2010-100P、FX2010-130P、FX2010-145P、FX2010-168P和FX2010-180P感染雏鸭脑组织均无明显病变。

(4)病毒分离

FX2010感染雏鸭的肺和肾均可分离到病毒，8/10脾和7/10脑可分离到病毒；FX2010-100P感染鸭、10/10脾脏、5/10肺脏和4/10肾脏可分离到病毒；FX2010-130P感染鸭、10/10脾脏和2/10肺脏可分离到病毒；FX2010-145P、FX2010-168P和FX2010-180P感染鸭分别有10/10、6/10和5/10脾脏可分离到病毒(表3)。为了进一步验证高代次病毒感染鸭后是否仅仅能在脾脏中分离到病毒，对FX2010、FX2010-168P和FX2010-180P感染鸭的心脏、肝脏、气管、胰脏、法氏囊、小肠等组织进行了病毒分离，结果显示，FX2010感染鸭在上述组织中均能分离到病毒，而FX2010-168P和FX2010-180P感染鸭则分离不到病毒(表5)。

表5 FX2010、FX2010-168P和FX2010-180P感染雏鸭后病毒分离结果

注：“N/10”表示“分离到病毒鸭数量/鸭总数量”，“-”表示10/10阴性。

4、不同代次病毒肌肉注射对产蛋鸭的致病力(见下表4)

表4产蛋鸭肌肉注射感染不同代次病毒的评价总结

注：临床表现：+表示症状明显；±表示症状轻微；-表示正常。剖检病变：“N/10”表示“被检脏器有明显病变鸭数量/鸭总数量”。病理切片：+表示严重病变；±表示轻微病变；-表示正常。病毒分离：“N/10”表示“分离到病毒鸭数量/鸭总数量”。

(1)临床表现

FX2010感染鸭表现为采食减少，精神沉郁，拉绿色稀便，有2只死亡。FX2010-100P感染鸭有轻微的采食减少，偶尔可见部分鸭拉绿色稀便、FX2010-130P、FX2010-145P、、FX2010-168P和FX2010-180P感染鸭在采食、饮水、粪便、精神状态等均没有异常变化(表4)。

(2)剖检病变

FX2010感染鸭全部表现为脾脏明显肿大，肾脏肿大，卵巢出血、变性、破裂，病死鸭表现为严重的卵黄性腹膜炎。FX2010-100P感染鸭部分表现为脾脏肿大、肾脏肿大和卵巢出血、破裂；FX2010-130P感染部分鸭表现为脾脏肿大；FX2010-145P、FX2010-168P和FX2010-180P感染鸭的脏器均没有异常变化，与对照组没有明显差别(表4)。

(3)病理变化

1)FX2010感染鸭病理变化

脾：可见多处细胞坏死灶，脾脏内毛细血管可见明显的增生肿胀，血管内充血。

肺：肺脏内支气管、细支气管壁和肺泡壁出现炎性渗出物，肺内血管充血、出血。

肾：肾脏组织坏死，肾小球血管间质细胞增生；肾内毛细血管增生肿胀，肾间质有少量的淋巴细胞和中性白细胞浸润。

脑：脑膜内中性白细胞、淋巴细胞和浆细胞等出现炎性细胞浸润。脑组织内有少量的神经细胞固缩，细胞浆、核浓染，可见小胶质细胞及炎性细胞浸润；脑组织内血管扩张充血，间隙增宽。

卵巢：感染鸭都表现为不同程度的组织变性、坏死、炎性浸润、充血、出血。

2)传代毒感染鸭病理变化

脾：FX2010-100P、FX2010-130P感染部分鸭可见少量坏死灶、脾脏内毛细血管增生、充血，FX2010-145P、FX2010-168P和FX2010-180P感染鸭脾组织均无明显病变。

肺：FX2010-100P和FX2010-130P感染鸭部分可见不同程度度的肺脏内支气管、细支气管壁和肺泡壁出现炎性渗出物，肺内血管充血；FX2010-145P、FX2010-168P和FX2010-180P感染鸭肺组织均无明显病变。

肾：FX2010-100P感染鸭部分表现为不同程度的血管增生、肾间质有少量的淋巴细胞和中性白细胞浸润；FX2010-130P、FX2010-145P、FX2010-168P和FX2010-180P感染鸭肾组织均无明显病变。

脑：FX2010-100P、FX2010-130P、FX2010-145P、FX2010-168P和FX2010-180P感染鸭脑组织均无明显病变。

卵巢：FX2010-100P感染部分鸭表现为不同程度的组织变性、炎性浸润、充血，FX2010-130P、FX2010-145P、FX2010-168P和FX2010-180P感染鸭卵巢组织无明显病变。

(4)病毒分离

FX2010感染雏鸭的肺、肾和卵巢均可分离到病毒，9/10脾和8/10脑壳分离到病毒；FX2010-100P感染鸭、10/10脾脏、3/10肺脏、5/10肾脏和4/10卵巢可分离到病毒；FX2010-130P、FX2010-145P、FX2010-168P和FX2010-180P感染鸭分别有10/10、10/10、7/10和6/10脾脏可分离到病毒(表4)。另外，FX2010-168P和FX2010-180P感染鸭的心脏、肝脏、气管、胰脏、小肠等组织均分离不到病毒(表6)。

表6FX2010、FX2010-168P和FX2010-180P感染产蛋鸭后病毒分离结果

注：“N/10”表示“分离到病毒鸭数量/鸭总数量”，“-”表示10/10阴性。

结论：雏鸭和产蛋鸭经肌肉接种不同代次的病毒后，第100代、130代、145代、168代和180代病毒对鸭的致病力逐渐下降。

从不同代次病毒感染雏鸭和产蛋鸭所引起的临床症状、病理变化以及病毒分离结果可以看出，FX2010随着传代次数的增多，致病力逐渐减弱。自第60代毒开始，在感染雏鸭的脑中已经分离不到病毒；自第130代毒开始，在感染雏鸭的肾中已经分离不到病毒；自第145代毒开始，在感染鸭的肺、肾、卵巢和脑组织中都分离不到病毒，仅仅是在部分鸭的脾组织中能够分离到病毒。为了进一步获知FX2010-180P在鸭体内各个脏器的繁殖情况，从FX2010-168P和FX2010-180P感染鸭的心脏、肝脏、气管、胰脏和小肠等脏器分离病毒，结果也为阴性，说明病毒在CEF上经多次传代培养后，感染特性也发生了改变，第168代和180代毒感染鸭仅能在脾脏中检测到病毒。

不同代次病毒对鸭的致病力试验及不同代次病毒的核苷酸和氨基酸突变位点分析的结果说明，随着传代次数的增多，病毒在鸭体内的复制能力以及对鸭的致病力逐渐减弱，而病毒致病力的减弱是由于病毒的基因突变引起的。因此，不同代次病毒新增的这些突变点都与致病力相关。相关的研究已经证明，黄病毒的preM/M、E、NS1、NS3、5′NCR和3′NCR基因突变都可能引起病毒的毒力减弱。鸭坦布苏病毒FX2010强毒株逐渐致弱过程中的突变点分别位于M、E、NS1、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、NS5蛋白上，2个核苷酸突变点位于3′NCR上。随着鸭坦布苏病毒突变位点的增多，病毒的致病力也逐渐减弱。

实施例3第180代毒(FX2010-180P)对鸭的免疫效力

把第180代毒(FX2010-180P)接种鸭进行免疫试验，在免疫后14天用强毒攻击，研究FX2010-180P作为活疫苗对接种鸭的免疫效力。

(1)FX2010-180P对雏鸭的免疫效力试验

20只21日龄健康雏鸭，随机分成2组，每组10只。第1组肌肉接种FX2010-180P，剂量为10^3.0TCID₅₀。第2组为空白对照组。接种后7天和14天分别采血，用阻断ELISA检测抗体滴度，在接种后14天用10^3.5TCID₅₀的FX2010攻击，每日观察临床症状，攻毒4天后，剖检，观察病理变化，并取肺、肾和脑组织，每克组织加1mLPBS，研磨后，离心，取上清，分离病毒。

(2)FX2010-180P对产蛋鸭免疫效力试验

20只180日龄健康产蛋麻鸭，随机分成2组，每组10只。第1组肌肉接种FX2010-180P，剂量为10^3.0TCID₅₀。第2组为空白对照组。接种后7天和14天分别采血，用阻断ELISA检测抗体滴度，在接种后14天用10^3.5TCID₅₀FX2010攻击，每日观察临床症状，攻毒4天后，剖检，观察病理变化，并取肺、肾、脑和卵巢等组织，每克组织加1mLPBS，研磨后，离心，取上清，分离病毒。

上述试验结果如下：

1、FX2010-180P对雏鸭的免疫效力

(1)抗体效价

FX2010-180P接种后7天和14天，用阻断ELISA检测血清抗体，结果显示，接种后7天接种鸭全部转阳，FX2010-180P组每个个体的抗体效价均达到20以上，平均抗体效价为52.0±25.3，接种14天后，平均抗体效价为52.0±19.3(图2)，而对照组全部为阴性。

(2)临床表现

雏鸭接种FX2010-180P 14天后，攻毒，免疫组雏鸭无异常表现，对照组雏鸭表现采食下降，拉绿色稀便。

(3)病理变化

攻毒后4天，剖检，检查鸭的病理变化。结果显示，FX2010-180P接种组没有明显的病理变化，而对照组鸭全部表现为脾脏肿大，肾脏肿大。

(4)病毒分离

攻毒后4天，剖检，采集肺、肾和脑组织，用DF-1细胞分离病毒。结果显示，FX2010-180P接种组攻毒后4天，在肺、肾和脑组织中都没有检测到病毒，而对照组则表现为全身性感染，在10/10肺、10/10肾和6/10脑组织均能分离到病毒。

2、FX2010-180P对产蛋鸭的免疫效力

(1)抗体效价

FX2010-180P接种后7天和14天，用阻断ELISA检测血清抗体，结果显示，接种后7天接种鸭全部转阳，FX2010-180P组每个个体的抗体效价均在20以上，平均抗体效价为54.0±23.2，接种14天后，平均抗体效价达到64.0±38.6(图3)，而对照组全部为阴性。

(2)临床表现

产蛋鸭接种FX2010-180P后14天，攻毒，免疫组鸭无异常表现，对照组鸭表现采食下降，拉绿色稀便，产蛋停止，并有3只在攻毒后死亡。

(3)病理变化

攻毒后4天，剖检，检查鸭的病理变化。结果显示，FX2010-180P接种组没有明显的病理变化，而对照组鸭全部表现为脾脏肿大，肾脏肿大，卵巢出血、破裂、变性，病死鸭有严重的卵黄性腹膜炎。

(4)病毒分离

攻毒后4天，剖检，采集肺、肾、脑和卵巢组织，用DF-1细胞分离病毒。结果显示，FX2010-180P接种组攻毒后4天，在肺、肾、脑和卵巢组织中都没有检测到病毒，而对照组则表现为全身性感染，在10/10肺、10/10肾、8/10脑和10/10卵巢组织均能分离到病毒。

结论：鸭坦布苏病毒第180代细胞毒接种诱导了较高的抗体水平，在用强毒攻击后，对免疫鸭达到了100％保护，说明180代传代毒具有良好的免疫原性。

实施例4FX2010-180P制备的灭活疫苗对鸭的免疫效力

FX2010-180P在CEF和DF1细胞上培养，所得FX2010-180P细胞培养液(病毒滴度达10^7.0TCID₅₀/ml)经甲醛灭活后，与蛋白佐剂Montanide ISA 70VG混合乳化制备成灭活疫苗，免疫5月龄麻鸭10只，肌肉注射0.5ml/只，同时设10只对照鸭免疫PBS，共免疫2次，每次间隔14天，最后一次免疫14天后，采血，分离血清，用阻断ELISA检测抗体效价，同时，用10^3.5TCID₅₀强毒FX2010攻击，每日观察临床症状，攻毒4天后，剖检，观察病理变化，并取肺、肾、脑等组织，每克组织加1mLPBS，研磨后，离心，取上清，分离病毒。

结果显示，由FX2010-180P制备的灭活疫苗两次免疫鸭后，诱导了较高的抗体水平，平均抗体效价达到58.0±23.9(图4)，而对照组抗体效价都小于5。强毒攻击后，免疫组鸭表现正常，对照组鸭表现采食下降，拉绿色稀便，并有1只在攻毒后第四天死亡。攻毒后第4天，剖检，可见，免疫鸭无明显病理变化，而对照组鸭全部表现为脾脏肿大，肾脏肿大。攻毒后4天，免疫组鸭的肺、肾和脑分离不到病毒，而对照组鸭有10/10肺、10/10肾和7/10的脑可以分离到病毒。说明，灭活疫苗对免疫鸭提供了100％的保护。

实施例5FX2010-180P病毒颗粒作为检测抗原检测鸭坦布苏病毒特异性抗体

FX2010-180P细胞培养液(10^7.0TCID₅₀/ml)经差速离心纯化后(7500转/分钟，离心1小时后，吸取上清液3万转/分钟离心5小时，弃上清液，沉淀用PBS稀释后，既为纯化的病毒颗粒，100ml病毒液用0.5mlPBS稀释)，用于间接ELISA和阻断ELISA的检测抗原，检测鸭坦布苏病毒病阳性血清、阴性血清以及I型鸭肝炎病毒、呼肠孤病毒、H9亚型鸭流感病毒阳性血清、鸭瘟病毒阳性血清。间接ELISA结果显示，鸭坦布苏病毒病阳性血清的OD450值可达到1.0以上，而阴性血清及其他病毒阳性血清OD450值在0.213-0.324之间(图5)。阻断ELISA结果显示，鸭坦布苏病毒病阳性血清的效价可达到80，而阴性血清及其他病毒阳性血清效价均在5以下，均为阴性(图6)。上述结果表明FX2010-180P作为检测抗原检测鸭坦布苏病毒抗体具有良好的特异性。下面是具体的检测步骤。

1、间接ELISA方法如下：

(1)抗原包被将抗原用包被液以2ug/孔稀释，混匀后每孔加入0.1mL，4℃放置15-18小时，之后用洗涤液洗涤3次，每次3分钟。

(2)封闭每孔加入新鲜配置的0.2mL封闭液，37℃孵育1小时，洗涤液洗涤3次，每次3分钟。

(3)抗体稀释阴性及阳性对照用抗体稀释液稀释200倍，待测血清以200倍稀释。

(4)抗原与待测血清的作用将稀释好的待测血清和对照血清分别加入酶标板中，每孔0.1mL，37℃孵育1小时。然后洗涤液洗涤3次，每次3分钟。

(5)与二抗作用 加入1∶2000稀释的HRP-羊抗鸭IgG，0.1mL/孔，37℃孵育45min，然后洗涤液洗涤3次，每次3分钟。

(6)显色反应加入TMB显色液(Amresco，Solon，USA)，0.1mL/孔，室温，避光显色10分钟。

(7)终止反应加入终止液，0.05mL/孔，终止反应，酶标仪读取吸光度OD450。

2、阻断ELISA方法如下：

(1)抗原包被将抗原用包被液以3ug/孔稀释，混匀后每孔加入0.1mL，4℃放置15-18小时，之后用洗涤液洗涤3次，每次3分钟。

(2)封闭每孔加入新鲜配置的0.2mL封闭液，37℃孵育1小时，洗涤液洗涤3次，每次3分钟。

(3)抗体稀释阴性及阳性对照用抗体稀释液稀释10倍，待测血清以1∶5稀释后，进行2倍比系列稀释。

(4)抗原与待测血清的作用将稀释好的待测血清和对照血清分别加入酶标板中，每孔0.1mL，37℃孵育1小时。然后洗涤液洗涤3次，每次3分钟。

(5)抗原与单克隆抗体的作用将抗鸭坦布苏病毒的单克隆抗体(中和效价为32)按1∶20稀释，每孔加入0.1mL，37℃孵育1小时，然后洗涤液洗涤3次，每次3分钟。

(6)与HRP-羊抗鼠IgG作用加入1∶2000稀释的HRP-阳抗鼠IgG(0.4mg/mL)，0.1mL/孔，37℃孵育1小时，然后洗涤液洗涤3次，每次3分钟。

(7)显色反应加入TMB显色液(Amresco，Solon，USA)，0.1mL/孔，室温，避光显色15分钟。

(8)终止反应加入终止液，0.05mL/孔，终止反应，酶标仪读取吸光度OD450，按如下方法计算阻断率：

阻断率PI(％)＝(阴性对照的吸光度-待测样品的吸光度)/阴性对照的吸光度×100％。

(9)当阳性质控血清的阻断率≥50％，判定检测结果有效可信。

当血清样本的阻断率值≥18％时，该样本判定为鸭坦布苏抗体阳性；

当血清样本的阻断率值≤13％时，该样本判定为鸭坦布苏抗体阴性；

当血清样本的阻断率值介于二者之间时，判定为可疑，重新检测仍小于18％判为鸭坦布苏抗体阴性。

(10)阻断ELISA抗体滴度的确定

阻断ELISA测定为阳性的最高稀释倍数即为该血清样本的阻断ELISA抗体滴度。

以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110>中国农业科学院上海兽医研究所

<130>鸭坦布苏病毒弱毒株及其应用

<160>1

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>10991

<212>DNA

<213>Duck Tembusu virus

<400>1

agaagttcat ctgtgtgaac ttattccaaa cagctttttg gagtagtgcg tgtgaacgta     60

aacacagttt gaacgttttt tggatagaga caactatgtc taacaaaaaa ccaggaagac    120

ccggctcagg ccgggttgtc aatatgctaa agcgcggaac gtcccgcgga aatccgctag    180

cgcggataaa gaggacgatt gatggggtcc tgagaggagc aggacccata aggtttgtgc    240

tggctctact gactttcttc aagtttacag ccctgaggcc aaccattgga atgctgaaga    300

gatggaagct ggttggagtc aatgaggcga ccaaacatct gaaaagcttc aagcgtgaca    360

ttggacagat gctcgacgga ctgaataagc ggaaggcgaa acgtcggggg gggagttgct    420

cttggatcat tatgttactc ccaatagttg ctgggctgaa gcttggaaac tataatggta    480

gagttttggc cactttaaat aagactgatg tatcagactt gctagtcatt ccaacaacgg    540

ctggcagcaa tggatgcgtc gtacgtgctc tagatgtggg actaatgtgt caggatgaca    600

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gcaatgagac tgagatatac attcattatg ggagatgcac cccttcacgg catggacgga    720

ggtctaggag atcggtgaac gtgcatcacc atggagagag tctacttgag gtcaagaaca    780

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acgtcaagat gatgaacatg gaggctacgg aattagcggt tgtgagatct tactgctatg    1140

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aacatgccgc caagttcgtt ataacgccca aaagtcccgt ctacaccgct gagatggagg    1500

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atgtctttac catgaacaca aaaagctggc ttgttaacag agactggttt catgatctca    1620

acttaccatg gacagggtca tcagcgggga cgtggcaaaa caaagagtca ttgatagaat    1680

ttgaggaggc ccacgccacc aaacaatcag tggtggcttt ggcatcacaa gaaggagccc    1740

tccatgcagc attggcggga gctattccag tgaagtactc tggaagcaaa ttggaaatga    1800

cctcaggtca tcttaaatgc agggttaaaa tgcagggttt gaagctgaaa ggaatgacct    1860

acccgatgtg tagtaataca ttttccctag cgaagaatcc taccgacact gggcatggca    1920

ctgtcgtggt ggaattgtct tatgcaggta ccgatgggcc ctgtagagtt cccatatcca    1980

tgtcggcaga tttgaatgac aagacaccag ttggacgctt gataacagtc aacccatacg    2040

tgtcgacctc ctccacgggc gccaagataa tggtggaagt ggaacctcca ttcggggatt    2100

cattcatctt agtaggaagt ggaaaaggac agatcaggta ccagtggcat agaagtggga    2160

gcacaattgg aaaagctttt acgtcaacac tcaaaggagc acaaaggatg gttgctttgg    2220

gtgacactgc atgggatttt ggctcagttg ggggtgtact cacttccatt gggaaaggca    2280

ttcatcaggt tttcggctca gcatttaaaa gcttatttgg aggaatgtca tggattactc    2340

aaggtatgtt gggggcactg ctattgtgga tggggctgaa tgcaagggac agatccattt    2400

ctatgacttt tctagccgta ggaggaattt tagtcttcct ggcagtaaat gtcaatgccg    2460

acacggggtg ctcaatcgac ttggctagga aagaattgaa atgtggacaa ggcatgtttg    2520

tcttcaacga tgttgaggct tggaaggata attataagta ctatccatcc acaccaagga    2580

gacttgccaa agtcgtggca gaagctcatg aggctggaat ttgtggcata cgatcagtca    2640

gcaggctcga gcacaacatg tgggtaagca tcaaacatga gttgaacgcg atcttggaag    2700

acaacgccat tgacttgact gtggtggttg aagaaaatcc tggaagatac aggaaaacca    2760

atcagaggct gccgaacgtt gatggagagc tcatgtacgg atggaagaaa tgggggaaaa    2820

gtatttttag cagcccgaag atgtcaaata atacatttgt catcgatgga ccaaaaacta    2880

aagagtgccc agatgagaga agagcatgga atagtatgaa gattgaagac tttgggtttg    2940

gagtgttgtc cacaaaggta tggatggaaa tgcgaacaga aaatacaact gattgtgaca    3000

ctgcagtaat gggcacagca attaaaggaa atggagctgt gcacagtgac ctgagctatt    3060

ggatagagag caggaataat ggaagctgga aactggagag agctgtgctg ggcgaggtga    3120

agtcatgcac atggccggaa acccacacac tgtggagtga cagcgttgtg gagagtgaac    3180

tcatcatacc taaaacactg ggaggaccga agagtcatca caacacgagg acaggataca    3240

aggctcagag ttccggaccg tgggatgaga aagagattgt aatagacttc gactactgcc    3300

ctggaacaac tgtcacagta acgagctcgt gccgcgacag agggccttca gctaggacaa    3360

caacagctag tgggaaactg ataacagatt ggtgttgtag gtcttgcacc accccaccac    3420

tgagatttgt tacaaaaagt ggatgctggt atgggatgga aattcggcca actgctcacg    3480

gagacgacat gttgatcaaa tcaaaggtca tggcttttca agggggtggc atggaaccta    3540

tgcaattggg aatgctcgtc atgattgtag cagcccagga gattttgaga aggcgcatga    3600

cggctccaat tgcttggtca gcgctgctgt tgctgatggc tttggtcctg tttggaggaa    3660

tcacgtacag tgatctggtc aagtacgtca ttctagtggc agctgcattt gctgagagca    3720

atacaggtgg tgacattgtg cacttggcca tggtggctgc ttttaacatc cagccaggtt    3780

tactgattgg attcctactg aggaggaagt ggagcaatca ggaaagcaga ttgcttggcg    3840

ttgcgttagc actcataaca gtggctatga gagatttgaa catgagtata ccaacattac    3900

tcaactccgg agccatggcc tggctcttgc tgagagccgt gtttgaaggg acggttagct    3960

cctttgctct gccacttgtt agcttgctgg ctccagggct cagaatagtg gggatagatg    4020

tggtgagaat aggtgtgcta accctgggaa tcctctcact attgaaagag aggagtaatg    4080

caatggcaaa aaagaaggga ggcatgctcc tgggagtggc atgcgccact gctggaatcg    4140

ctagcccttt ggtgtttgct ggtctgcaca tggtgctgaa gccagtgaca cggagagggt    4200

ggccagtcag tgaggctttg actgctgtgg gattgacatt cgcgttggca ggaggaatag    4260

cccagtttga tgacagcagc atggcgattc cattagccgt tggcgggatt atgctggtgg    4320

tggcagtggt aacaggtttc tctacagact tatggctaga gaaagcgagc gacatctcgt    4380

ggagtgagga ggcgaggttg actggagcat cacagagatt tgatgtggaa attgatcagg    4440

acggtaatat gagattactg aacgatcctg gtgtgtcgct cggtgtttgg gcctttcgaa    4500

ctgggcttat tctgttatct tcatacaacc catacttcct gccactgact ctggcaggtt    4560

actggatgac aaccaaggca aaacaacgag gaggagtcat ctgggatgtg ccagctccaa    4620

aggaaaggaa gagagccgaa gtaggcaatg gagttttccg gattatggca agaggactgt    4680

tagggaaata ccaggctgga gtgggagtca tgcatgaggg agtgtttcac accatgtggc    4740

acgtgacgaa tggggccgtt attcaagcag gagaaggaac actggtccca tattgggcga    4800

gtgtacgtaa tgatctaatt tcctatggtg gaccatggaa attggggaag caatggaatg    4860

gcgttgatga agtgcaagtc atcgtcgtgc aaccaggcaa agaggtcata aatgtgcaga    4920

cccaaccagg aatttttaag actcaatatg gtgaagttgg agctgtgtcc ctcgattacc    4980

caacgggaac ctctggatca cctatcattg acaaggaagg acaggtggtt ggcctctatg    5040

gtaatggaat cctggtgggt tcaggcgatt ttgtcagtat gatcactcaa ggggagaaga    5100

aggaagaaga agttcctcag gtgtttgacg aaaacatgct gcggaaaagg caactaacag    5160

tgctggacct acatccaggt tcaggaaaga ccagaaaggt cctccccatg attctgaaga    5220

gcgccattga caaacgatta agaacagctg tcttggctcc gactcgggtg gtggccgctg    5280

aaatagcgga agcactgaaa ggacttccaa tacggtatct gactccggca gtaaagaggg    5340

agcataccgg aacagagata atagatgtga tgtgtcacgc gactttgaca gcgcggctgc    5400

tcacacctca gcgagtgccg aattacaact tgttcattat ggatgaggct cacttcacag    5460

accccgccag tattgctgcc agaggatata tatcaacaaa ggtggaactg ggagaggcag    5520

ctgcaatatt catgacagcc acacctccag gtataactga ggcatttccg gactccaact    5580

cgccaataac agacattgaa gagcaaatcc ctgatagagc ttggaattct gggtatgagt    5640

ggataacaga ctttcaagga aagactgtat ggtttgtccc cagcgtgaag tctggtaatg    5700

agattgccgt gtgcttgaca aaggccggta agaaggtaat tcagctaaat aggaagagtt    5760

ttgactcaga gtatcctaaa tgcaagagtg gagaatggga ttttgtgata accactgaca    5820

tctcagaaat gggagcgaac tttggagcgc aacgggtcat agatagtcgg aagtgcatca    5880

aaccagtgat tattgaggat ggagaaggaa gcgtgcaaat gaatggacca gttcctataa    5940

catcagccag tgcagcccag cgtcgtggac gggttggaag ggatgtaaca caaattggag    6000

atgaatacca ctactcagga ccaaccagcg aggatgatca tgattttgct cattggaaag    6060

aggccaagat actgctggac aacattaaca tgccagatgg gctggttgcc cagttgtacg    6120

gcccagagcg ggacaaggtt gacgcaattg atggggaatt cagactgagg actgagcaga    6180

ggaaacactt tgtggagtat ctgaggacag gagacctccc tgtctggata tcgtacaagg    6240

tcgctgaagc tgggataagt tacaatgacc ggcggtggtg ctttgatgga ccatcatgca    6300

atactgttct ggaagacaat aacccagtgg agttatggac aaagtcaggt gagaagaaaa    6360

tcttgaagcc ccggtggaga gatggaagat tgtgggcaga tcaccaggcc ttaaaaacct    6420

tcaaggattt tgcgagtgga aagagatcag cgatagggat ccttgaggtt ttcagaatgc    6480

ttcctgacca cttcgctcac agaatgacag aatccatgga caacatatac atgctgacta    6540

cagctgagaa agggagcagg gcccacagag aagccctgga ggaactgcct gagacgcttg    6600

aaacactctt actggtgttc atgatgacag tcgcctccat gggggtgttc ttgttctttg    6660

ttcagaggag aggcttaggg aagacaggtc ttggagctat ggtcatggcc acagttacgg    6720

ttttgttatg gatagcagaa gtcccagccc agaagattgc cggtgtgctt ctagcttctc    6780

tattgctgat gattgttttg atcccagaac cagagagaca gagatcgcag acggatagtc    6840

acttggctgt tttcatgatt gttgtcttgt tagtggtggg tgctgtggcg tcaaatgaaa    6900

tgggttggct agagcaaaca aagaaggact tgtcagctct gttcgggagg aaaagtgata    6960

gtcatcaaga aacctggagc atgccttggc cggatttgag accagcgacg gcatgggcgg    7020

cctacgcagg agctacaaca tatctgactc ccttgctaaa acacctcata ataacagagt    7080

atgtgaactt ttcactcatg gcaatgacag cgcaggctgg agcactattt ggactaggga    7140

aaggcatgcc ttttgtcaaa gcagacttgt cagtacccct gctactctta gggtgttggg    7200

gacagttcac aatgacaaca acggtcttgg cagtcatgat ggtcatactg cattatgcat    7260

ttttggtgcc aggctggcaa gcagaagcca tgaggtcggc ccagaggaga actgctgcag    7320

gtgtgatgaa aaatcccgtg gttgatggca tagtggctac agatgttccg gaccttgagg    7380

ccagcactcc tataacagag aagaaattgg gtcaatgtgt gctagtggga atagccttag    7440

tggcggtgtt cctaacacca aatacgctaa ccttgaccga gtttggaatg ttgacctctg    7500

ccgcttcggt gacactaatt gagggagctg caggtcgtat ttggaacgca accacagctg    7560

ttgctatgtg ccatttgttg aggaaaaact ggttggctgg ggcctctcta gcatggacta    7620

taactcggaa cctccaggca gggaccttgc gtcggggagg gggaactggc agaactttgg    7680

gggaggcatg gaaggcccag cttaatcaac tgacccggca agagtttatg gaataccgga    7740

aagacgggat cattgaagta gatagagctg ctgcaaagag agcccgccgt gaagggaatg    7800

tgacaggagg gcacccagtt tcacgaggca cggcaaagtt gaggtggctc gtggagcgtg    7860

ggtttctcaa accaagaggc aaagttgtgg acttaggctg cggcagagga ggctggagtt    7920

actactgtgc aacattaaag caggttcagg aagtgagagg ttacacaaaa ggagggccag    7980

ggcatgagga accagtgatg acccagagct atggctggaa cattgtgaca ttaaagagtg    8040

gggttaatgt tcatttcaag ccgactgaac catctgacac actgctgtgt gacataggtg    8100

aagcctcacc cgtcccagaa attgaatctg ccagaacaat cagggtgctg caaatggccg    8160

aggaatggct agctaggggc gttgaagagt tctgcataaa agtgctttgt ccctacatgc    8220

cagcggtcat aaaagaattg gaaagactgc agctgaaatg ggggggtggt ttggttaggg    8280

tgccactctc gcgtaattca acacatgaga tgtactgggt gagcggctca agtgggaatg    8340

tgacaaatag tatcaataca gtaagccaaa tgctgatcaa caggatgcac aaaaccaacc    8400

gcaatggacc caggtatgaa gaagatgtgg acttgggttc agggaccaga gctgtgagct    8460

gcacaagaca ggggactgac tggggaatgg tcgctgatag ggtgaagaat ttggccagag    8520

aatatgctcc gtcttggcat tatgaccaag acaatcctta caagacttgg aactatcatg    8580

gaagctacga agtgaaagcc acaggctcag ccagctcaat ggttaatggg gtagttagga    8640

tactgtcaaa accttgggac accttgcaaa acgtggtgaa tatggccatg acggacacca    8700

ctccttttgg gcaacagcgc gtttttaaag aaaaggttga tactaaagcc ccagaaccac    8760

ctgcaggaac agctagggtc atgaacatcg tggcaagatg gatgtggaac tttgttggca    8820

gaaacaaaca accgaggatg tgtacaaaag aagagttcat agagaaggtg aatagtaacg    8880

cagccctggg ggccatgttt gaggagcaac acaaatgggc cagcgccagg gaagcggttg    8940

aggatcctga gttttggagt cttgttgaca gagagagaga actgcacctg caagggaagt    9000

gtgagacctg tatttacaac atgatgggaa agcgagaaaa gaagatggga gagttcggga    9060

aagcaaaagg tagtagagct atttggtaca tgtggctcgg ggccagattc ctagagttcg    9120

aagccttggg cttcttgaac gaggatcact ggatgagcag ggaaaacact aaaggaggtg    9180

ttgaaggact tggactccaa aaattggggt atgtgctgcg tgacatctcg gccaaagaag    9240

gaggacttat gtacgcagac gacacggctg gatgggacac tagaataacc aaggctgatt    9300

tggaaaacga agccatcatt ttggaaaaga tggaaccaat gcacagagct gtcgcagaac    9360

cactcattaa atttgcctac atgaacaagg tggtgaaggt aatgcgaccg ggacgtgatg    9420

ggaaaacagt catggatgtc atctcgcggg aagaccagag gggaagtgga caggttgtga    9480

cttatgctct caatactttc acgaacctgt gcgtccagct cattagatgt atggaagggg    9540

aggagttgct gctccccgag gaaacagagc gcctaaagaa aggaaaggaa aagcgcatcc    9600

aagaatggct ccaaaagaat ggagagaaca ggttgtcagc catggcagtc agcggggatg    9660

attgtgtggt gaaaccagca gatgacagat tcgccacagc actgcacttc ctcaacagca    9720

tgtctaaggt gaggaaagat actcaggaat ggaagccctc aaccggttgg agaaactggc    9780

aagaagtacc cttttgctca caccatttcc acgagctgca aatgaaagat ggcagaaaga    9840

ttgtggttcc atgtcgagac caggatgaac taattggaag agccaggctc tctccagggt    9900

ctggctggtc actaacagaa acagcatgcc tgagcaaagc atacgctcag atgtggttat    9960

tgatgtactt ccacaggagg gacctcagac taatggcaaa cgccatctgc tcatctgtcc   10020

ctgtctcatg ggcccccaca ggaaggacaa cgtggtcaat ccatggaaaa ggtgagtgga   10080

tgacttctga agacatgctg gcagtgtgga acagggtgtg gattgaagaa aatgaacaca   10140

tggaagacaa aaccccagtg acttcatgga acgaagtgcc ataccttgga aagagggaag   10200

atggctggtg tggtagtctg attggacatc gagctagatc cacctgggcc gagaacatat   10260

acaccccaat tatgcagatc agagctctca ttggccctga gcactatgta gactacatgc   10320

caactctaaa caggttcaaa cccattgaaa gctggagtga aggtgtcttg tagatacatg   10380

aggtaggtat aaaaatgtat ataaagtagt gttagtttag agcaataaac atataaatta    10440

gcatttgttt gaagagatag gaagaggaag tcaggccagg gaatccctgc caccggatgt    10500

tggatgacgg tgctgtctgc gttccaaccc caggaggact gggttaacaa atctgggtgt    10560

atggaggagc taagcgttca ataccgtctc ggagaactcc ctggctcacg aagtgccccg    10620

gaccagtgtc gggccacagg ttttgtgcca ctagcgtgca gtgcagcccg gacaaaagac    10680

acgccccagg aggactggga aaacaaagcc aaaatggccc ccacggcctg aaatgatgga    10740

gctggtgtga ccatcatgga gggactagag gttagaggag accccgtgga aagaaagcaa    10800

ggcccaacct agagtcaagc tgtaactcta ggggaaggac tagaggttag aggagacccc    10860

ttgcgagtga acaccataag aaacagcata ttgacacctg ggatagacta ggagaccctc    10920

tgtcctaaca acaccagcca cttggcacag atcgccgaaa gtgtggctgg tggtggtaga    10980

acacagagtc t                                                         10991

Claims (4)

1.一种鸭坦布苏病毒弱毒株，其特征在于，该弱毒株是由鸭坦布苏病毒强毒株FX2010经突变获得，所述突变为以下位点突变：氨基酸位点第226位A突变为V、第376位E突变为G、第407位D突变为N、第442位Y突变为F、第444位A突变为V、第453位R突变为K、第599位V突变为A、第636位M突变为K、第980位R突变为G、第993位K突变为R、第1050位V突变为A、第1435位V突变为L、第1820位T突变为I、第2171位F突变为L、第2227位V突变为A、第2316位F突变为Y、第2378位S突变为L、第2793位R突变为G、第3313位V突变为A，以及核苷酸突变位点3'非编码区的第187位C突变为T、第246位T突变为C。

2.根据权利要求1所述的鸭坦布苏病毒弱毒株，其特征在于，该弱毒株的保藏号为CCTCC NO：V201231。

3.一种预防或治疗鸭坦布苏病毒病的疫苗，其特征在于，该疫苗是以权利要求1或2所述的鸭坦布苏病毒弱毒株为种毒的鸭坦布苏病毒病弱毒活疫苗或灭活疫苗。

4.一种用于诊断鸭坦布苏病毒病的检测抗原，其特征在于，该检测抗原为权利要求1或2所述的鸭坦布苏病毒弱毒株的病毒颗粒。