CN116953234B - 一种猪博卡病毒g3型的多肽-elisa抗体检测试剂盒 - Google Patents
一种猪博卡病毒g3型的多肽-elisa抗体检测试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种猪博卡病毒G3型的多肽‑ELISA抗体检测试剂盒，属于生物技术检测领域。本发明根据现有的猪博卡病毒G3基因群序列中VP1蛋白的氨基酸保守片段设计，再通过体外人工合成方法获得检测猪博卡病毒G3型的特异性多肽，以其作为包被抗原用于制备检测猪博卡病毒G3型的多肽‑ELISA试剂盒，有效提高了多肽与目标抗体的结合效率，从而显著提高检测灵敏度，同时显著降低非特异背景读值，特异性高。本发明提供的猪博卡病毒G3型的多肽‑ELISA抗体检测试剂盒操作简单、诊断速度快，在进行大规模检测中经济方便，具有广泛的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术检测领域，特别是涉及一种猪博卡病毒G3型的多肽-ELISA抗体检测试剂盒。
背景技术
博卡病毒(bocavirus)属于细小病毒科(Parvoviridae)细小病毒亚科(Parvovirinae)博卡病毒属(Bocavirus)，分为两个亚种：牛细小病毒(bovineparvovirus)与犬微小病毒(Canine minutevirus)。2009年，瑞典科学家首次运用随机多重置换扩增方法在PMWS(断奶仔猪多系统衰竭综合征)的患病猪淋巴结中扩增出了一段长为1879bp的基因序列，并经过高通量测序技术发现其为完整的NP1基因及部分VP基因并将其命名为猪博卡病毒(Blomstrom AL,et al.2009)。猪博卡病毒是单链线性无囊膜DNA病毒，基因组大小为4786～5905bp。基因组编码3个开放阅读框(ORF)，ORF1阅读框在5’末端，编码非结构蛋白NS1，该蛋白在病毒基因组的复制过程中起到重要作用(乔涵等，2015)。ORF3阅读框位于病毒基因组的中间，编码磷酸化的非结构蛋白NP1(SunY,et al.2009)。ORF2阅读框位于3’末端编码2个衣壳蛋白VP1和VP2，他们是病毒主要的抗原蛋白(LupescuA,etal.2006)。
2012年，Yang等基于猪博卡病毒非结构蛋白NS1将所发现的PBoV毒株划分为3个基因群PBoVG1、PBoVG2和PBoVG3，该方法弥补了之前分型方法的不足，可将所有的PBoV毒株划分在内。2013年国际病毒分类委员会(ICTV)将猪博卡病毒分为PBoV2(HM053693、HM053694、HQ291309)、PBoV3(HQ223038)、PBoV4(HQ291308)、PBoV5(JF429834、JF429835、JF429836)4个种群。2015年，国内学者陈如敬等基于VP1基因将猪博卡病毒分为G1、G2和G3共3个基因群。目前将猪博卡病毒划分为3个基因群(G1、G2、G3)的分型研究被国内外学者所认可。研究表明，目前我国流行的猪博卡病毒基因型主要为G3型(PBoV G3)。PBoV在我国广泛流行，且在猪群中的感染率很高。感染猪博卡病毒可引起猪的腹泻、呼吸系统疾病及断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)等，给我国养猪业带来一定困扰。目前猪博卡病毒主要检测方法有病原学检测方法(传统PCR、实时荧光定量PCR、LAMP)，血清学诊断方法(IFA、间接酶联免疫吸附试验)，PCR方法虽然敏感，但是易污染，相对成本较高，检测的条件较高，步骤较复杂，不适合常规化的大批量快速检测，而血清学诊断方法操作简单方便，适合大规模检测，更适合在基层推广和应用。2015年，郑英帅利用河北地区PBoV毒株的VP2以及NP1蛋白为抗原建立了两种间接ELISA检测方法，2016年，Zhang等利用PBoV JY31b毒株的VP2蛋白构建了类病毒颗粒抗原ELISA检测方法，2017年，蔡高峰选取了江苏地区流行的PBoV部分VP2蛋白建立了间接ELISA方法，2017年张晶等利用PBoV NP08株部分VP1蛋白建立了ELISA检测方法，2021年黄二素将PBoV GZJS2018株的VP2蛋白作为抗原表达蛋白建立猪博卡病毒间接ELISA诊断方法。以上间接ELISA方法只针对某一毒株或部分毒株，广谱性较差。本发明通过分析我国目前流行的PBoVG3基因群的VP1氨基酸的部分保守片段，设计合成多肽抗原，开发一种检测PBoVG3基因群的ELISA抗体检测试剂盒。
ELISA血清抗体检测方法操作简单、快速、适用于大量样品的检测，然而国内外目前尚无成熟的PBoV G3基因群ELISA抗体检测试剂盒。因此，对猪博卡病毒进行深入研究，并应用其开发一种对我国流行的猪博卡病毒G3基因型检测更为准确敏感的产品是目前亟待解决的问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种猪博卡病毒G3型的多肽-ELISA抗体检测试剂盒，以解决上述现有技术广谱性差等问题。本发明根据现有的猪博卡病毒G3基因群序列中VP1蛋白的氨基酸特异且保守片段设计，再通过体外人工合成方法获得包被抗原，能够有效提高多肽与目标抗体的结合效率，特异性好，灵敏度高。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种用于检测猪博卡病毒G3型的特异性多肽抗原，所述特异性多肽抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明还提供上述特异性多肽抗原在制备猪博卡病毒G3型的多肽-ELISA抗体检测试剂盒中的应用。
本发明还提供一种猪博卡病毒G3型的多肽-ELISA抗体检测试剂盒，包括上述特异性多肽抗原包被的酶标板、封闭液、洗涤液、辣根过氧化物酶标记的羊抗猪IgG抗体、显色液和终止液。
进一步地，在所述酶标板中，所述特异性多肽抗原的包被浓度为0.5μg/mL。
进一步地，在所述酶标板中，所述特异性多肽抗原由ELISA包被液稀释，所述ELISA包被液的制备方法为将1.59g Na2CO3，2.93gNaHCO3溶于800mL双蒸水中，调节pH至9.6，并定容至1000mL。
进一步地，所述酶标板由所述特异性多肽抗原在4℃过夜包被获得。
进一步地，所述封闭液为含有2.5％(W/V)BSA的磷酸盐缓冲液。
进一步地，所述辣根过氧化物酶标记的羊抗猪IgG抗体的稀释度为1:50000。
进一步地，所述显色液为TMB。
进一步地，所述终止液为2M H2SO4溶液。
本发明公开了以下技术效果：
本发明提供的用于检测猪博卡病毒G3型的特异性多肽抗原是根据现有的猪博卡病毒G3基因群序列中VP1蛋白的氨基酸特异且保守片段设计，再通过体外人工合成方法获得，以其作为包被抗原，能够有效提高多肽与目标抗体的结合效率，从而显著提高检测灵敏度，同时显著降低非特异背景读值，特异性高。
本发明提供的猪博卡病毒G3型的多肽-ELISA抗体检测试剂盒具有操作简单、诊断速度快、在进行大规模检测中经济方便等优点，具有广泛的应用前景。采用本发明的ELISA检测试剂盒检测PBoV抗体，降低了检测成本，有利于推广使用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为DNAstar软件中MegAlign分析的PBoVG3基因群的VP1蛋白的氨基酸保守片段；
图2为在线软件对PBoV-VP1蛋白的抗原表位进行的预测分析。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
发明人经过分析PBoV G3基因群NP1和NS1蛋白的氨基酸序列，发现其突变较大，不具有作为抗原检测抗体的广谱性；通过分析VP1蛋白，发现其N端存在优势保守氨基酸片段，而VP1蛋白其它的氨基酸差异很大，不具有作为抗原检测抗体的广谱性，因此，本发明根据VP1蛋白N端优势保守氨基酸片段体外人工合成多肽，作为包被抗原，构建猪博卡病毒G3型的多肽-ELISA抗体检测试剂盒。
下面以具体实施例对本发明的技术方案作详细介绍。
实施例
一、PBoV-VP1多肽抗原的获取、选择与确定
首先参考GenBank登录的猪博卡病毒G3基因群序列(基因登录号：AE037420、AE037424、AE037428、AER30013、AER30017、AEY68760、AEZ53136、AEX30514、AGJ521194、AHK26968、AHK26977、AHK26980、AHK26998、AHK27001、AGS15041、AGS15056、AGS15060、AGS15072、AGY46256、AIY27461、AIY27464、AMH38322、AWW25131、AWW25134、QHW08447、YP-004869644、YP-004869648、YP-005086951、YP-009010976)，利用DNAstar软件中MegAlign分析所有PBoV G3基因群的VP1蛋白的氨基酸保守片段(图1)，通过在线软件http://www.detaibio.com/tools/epitope-prediction.html等对PBoV-VP1蛋白的抗原表位进行预测(图2)，确定抗原的氨基酸序列，然后寻找该肽段所针对的抗原决定簇，采用体外人工合成方法获得不同的多肽，使用ELISA检测不同多肽与PBoV抗血清的反应，最后选出具有良好反应的PBoV-VP1蛋白特异性多肽抗原，如SEQ ID NO.1所示：
SEQ ID NO.1：
YNKGNYKNKGDDDSSDSSVGGNARAVHKKAANKDTGAKKDRRAGNKRHYARNKG AKK。
二、猪博卡病毒G3型的多肽-ELISA抗体检测方法的建立
操作步骤：
(1)包被：用ELISA包被液将抗原稀释至工作浓度，按100μL/孔包被酶标板，4℃过夜包被，PBST溶液洗涤3次，每次静置5min；
(2)封闭：以300μL/孔的量加入封闭液，37℃封闭2h，PBST洗板3次，每次静置5min；
(3)一抗孵育：以100μL/孔的量加入稀释好的待检血清，37℃孵育2h，PBST洗板3次，每次静置5min；
(4)二抗孵育：以100μL/孔的量加入稀释好的HRP标记的羊抗猪IgG，37℃孵育lh，PBST洗板3次，每次静置5min；
(5)显色：以100μL/孔的量加入TMB底物，室温中避光反应30min；
(6)终止：以l00μL/孔的量加入2M H2SO4终止液终止反应；
(7)读数：使用酶标仪测定各孔在OD450nm处吸光值；
(8)判定结果。
以上述的操作步骤为基础，对猪博卡病毒G3型的多肽-ELISA抗体检测的反应条件进行优化。
(1)抗原最适包被浓度及待检血清最适稀释度的选择
根据PBoV-VP1抗原包被的浓度，依次用ELISA包被液将蛋白稀释为50ng/孔、100ng/孔、200ng/孔、400ng/孔，每孔加入稀释液100μL，4℃过夜包被。用PBST洗液将阴阳性血清按照1:100、1:200、1:400比例稀释，进行间接ELISA基本步骤。计算阳性孔OD450值(P)与阴性孔OD450值(N)之比，当比值(P/N)最大时，为最适抗原包被浓度及待检血清稀释度，结果如表1所示。
表1猪博卡病毒间接ELISA方法不同抗原包被浓度与一抗稀释度下P/N结果
由表1可知，当ELISA抗原包被浓度50ng/孔，血清稀释度为1：200，P/N值最大，为最佳包被浓度与一抗稀释度。
(2)二抗稀释度的选择
根据(1)确定的最适抗原包被浓度及待检血清稀释度，4℃包被过夜下进行，洗板后，拍干液体，加入2％BSA封闭液，37℃封闭2h，之后按照最佳待检血清稀释度，37℃孵育1h，洗板后拍干液体，将HRP标记的山羊抗猪IgG二抗用PBST洗液按照1:5000、1:10000、1:25000、1:50000稀释，孵育1h。其余操作不变，经酶标仪测定吸光值后，当比值(P/N)最大时，为最适二抗稀释度，结果如表2所示。
表2猪博卡病毒间接ELISA方法不同二抗稀释度下P/N结果
由表2可知，当ELISA抗原4℃包被过夜，二抗稀释度为1:50000，P/N值最大，为最佳二抗稀释度。
(3)最适封闭液的选择
根据(1)和(2)探索的各项最优条件，包被蛋白后，分别用含有质量浓度1％、2.5％、5％的BSA的磷酸盐缓冲液以及1％、2.5％、5％的脱脂乳进行封闭，封闭孵育时间分别为1h、1.5h、2h、2.5h。经酶标仪测定吸光值后，当比值(P/N)最大时，为最适封闭液和封闭时间，结果如表3所示。
表3猪博卡病毒间接ELISA方法不同封闭液和孵育时间下P/N结果
由表3可知，当ELISA封闭液为2.5％BSA时，封闭时间为2h时，P/N值最大，为最佳封闭液与封闭时间。
(4)最佳显色时间的选择
根据(1)-(3)探索的各项最优条件进行间接ELISA检测，加入显色液后分别将显色时间设为2.5、5、7.5、10、12.5、15min。经酶标仪测定吸光值，当比值(P/N)最大时，为最佳显色时间，结果如表4所示。
表4猪博卡病毒间接ELISA方法不同显色时间下P/N结果
由表4可知，当ELISA显色时间为5min时，P/N值最大，为最佳显色时间。
(5)阴阳性临界值的确定
选择40份已知猪的阴性血清(未发生腹泻及PCR检测阴性)进行检测，测定OD450值，如表5，从表5可知，40份阴性血清的OD450值的平均值(X)为0.2765，标准差(SD)为0.0470，由统计学原理可知，当OD450值>X+3SD时，99.9％可以断定样品为阳性。因此，阴、阳性血清的临界值＝X+3SD＝0.2765+3×0.0470＝0.4175。所以当血清样品OD450＞0.4175时为阳性，OD450≤0.4175时为阴性。
表540份猪博卡病毒阴性血清间接ELISA方法检测OD450值
根据以上各项优化，获得猪博卡病毒G3型的多肽-ELISA抗体检测最佳方法：
(1)包被：取96孔酶标板，用ELISA包被液(1.59g Na2CO3，2.93g NaHCO3溶于800mL双蒸水中，调节pH至9.6，并定容至1000mL)将SEQ ID NO.1序列所示抗原稀释至0.5ng/μL的浓度对酶标板进行包被，每孔100μL，4℃过夜包被。次日用PBST洗涤液250μL/孔，洗涤2～4次后拍干；
(2)封闭：用含有2.5wt％BSA的磷酸盐缓冲液(磷酸盐缓冲液由1000mL蒸馏水中加入8.0g NaCl、0.2g KH2PO4、2.9gNa2HPO4和0.2g KCl，溶解混匀后调pH至7.4制得)用作封闭液，100μL/孔，37℃封闭2h，洗涤液PBST 250μL/孔，洗涤3次后拍干，4℃保存；
(3)一抗孵育：以100μL/孔的量加入稀释度为1:200的待检血清，37℃孵育2h，PBST洗板3次，每次静置5min；
(4)二抗孵育：以100μL/孔的量加入释度为1:50000的HRP标记的羊抗猪IgG，37℃孵育lh，PBST洗板3次，每次静置5min；
(5)显色：以100μL/孔的量加入TMB底物，室温中避光反应5min；
(6)终止：以l00μL/孔的量加入2M H2SO4溶液终止液终止反应；
(7)读数：使用酶标仪测定各孔在OD450nm处吸光值；
(8)判定结果：当血清样品OD450＞0.4175时为阳性，OD450≤0.4175时为阴性。
三、猪博卡病毒G3型的多肽-ELISA抗体检测方法的特异性交叉检测试验
分别选择非洲猪瘟病毒(ASFV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、口蹄疫病毒O亚型(FMDV-O)、口蹄疫病毒A亚型(FMDV-A)、猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)阳性血清，应用建立的间接ELISA检测方法进行交叉检测，结果表明使用PBoV-VP2合成抗原多肽建立的间接ELISA方法对这些病毒血清均检测为阴性，说明建立的间接ELISA方法特异，只针对猪博卡病毒阳性抗体。如表6所示：
表6猪博卡病毒间接ELISA方法特异性交叉检测试验结果
四、猪博卡病毒G3型的多肽-ELISA抗体检测方法的敏感性检测试验
将PBoV阳性血清按1:200、1:400、1:800、1:1600、1:3200倍比稀释，以最适反应条件进行ELISA试验。结果显示，该方法可以检测到的血清最低稀释倍数为1:1600，表明该ELISA方法敏感性良好，如表7所示：
表7猪博卡病毒间接ELISA方法敏感性检测试验结果
注：“+”代表检测结果为阳性；“－”代表检测结果为阴性。
五、批内及批间重复性试验
批内重复，同一批次的酶标板，重复三次，使用不同批次的酶标板，每一批次重复三组，进行间接ELISA实验，使用优化好的ELISA方法对阴阳性血清进行检测。经OD450值计算得出，多肽抗原包被的酶标板经检测，批内重复变异系数在0.35％-8.03％之间，批间重复变异系数在0.17％-3.87％。说明建立的间接ELISA检测方法具有可重复性。如表8-9所示：
表8批内重复性试验
表9批间重复性试验
六、临床样本检测
将2022年-2023年临床上收集的10省份1216份血清用建立的间接ELISA方法进行检测。结果表明：如表10所示，2022年10省份总计598份血清，其中阳性样本269，总阳性率44.98％；其中河南、贵州、湖南、山西等省份阳性率较高；如表11所示，2023年10省份总计618份
血清，其中阳性样本170，总阳性率27.51％；其中浙江、贵州、山西等省份阳性率较高。
表102022年临床样本检测
表112023年临床样本检测
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (10)
1.一种用于检测猪博卡病毒G3型抗体的特异性多肽抗原，其特征在于，所述特异性多肽抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.如权利要求1所述的特异性多肽抗原在制备猪博卡病毒G3型的多肽-ELISA抗体检测试剂盒中的应用。
3.一种猪博卡病毒G3型的多肽-ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述特异性多肽抗原包被的酶标板、封闭液、洗涤液、辣根过氧化物酶标记的羊抗猪IgG抗体、显色液和终止液。
4.根据权利要求3所述的多肽-ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于，在所述酶标板中，所述特异性多肽抗原的包被浓度为0.5μg/mL。
5.根据权利要求3所述的多肽-ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于，在所述酶标板中，所述特异性多肽抗原由ELISA包被液稀释，所述ELISA包被液的制备方法为将1.59g Na2CO3，2.93g NaHCO3溶于800mL双蒸水中，调节pH至9.6，并定容至1000mL。
6.根据权利要求3所述的多肽-ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于，所述酶标板由所述特异性多肽抗原在4℃过夜包被获得。
7.根据权利要求3所述的多肽-ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于，所述封闭液为含有BSA的磷酸盐缓冲液，所述磷酸盐缓冲液中BSA的质量浓度为2.5％。
8.根据权利要求3所述的多肽-ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于，所述辣根过氧化物酶标记的羊抗猪IgG抗体的稀释度为1:50000。
9.根据权利要求3所述的多肽-ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于，所述显色液中的显色物质为TMB。
10.根据权利要求3所述的多肽-ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于，所述终止液为2MH2SO4溶液。
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