CN110607282A - 牛细小病毒单克隆抗体及其在检测牛细小病毒感染中的应用 - Google Patents

牛细小病毒单克隆抗体及其在检测牛细小病毒感染中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种牛细小病毒单克隆抗体及其在检测牛细小病毒感染中的应用。所述的单克隆抗体由保藏编号为CGMCC NO.18301的杂交瘤细胞株分泌产生。此外本发明还提出了用于检测牛细小病毒感染的间接竞争ELISA试剂盒，并建立了相应的间接竞争ELISA检测方法。实验证明，本发明建立的间接竞争ELISA方法具有良好的敏感性、特异性和重复性，比间接ELISA方法和夹心ELISA方法的检测敏感度高出一个数量级。通过对临床样品检测，与PCR结果一致，表明该方法检测结果准确可靠。因此本发明可用于牛细小病毒感染的临床检测，尤其适用于检测早期感染和隐性感染时病毒含量低的病料，同时，也为牛细小病毒流行病学调查及疫情监控提供了一种可靠的方法。

Description

牛细小病毒单克隆抗体及其在检测牛细小病毒感染中的应用
技术领域
本发明涉及一株单克隆抗体及其应用，特别涉及一株牛细小病毒单克隆抗体及其在检测牛细小病毒感染中的应用。本发明属于医药技术领域。
背景技术
牛细小病毒感染(Bovine parvovirus infection)是由牛细小病毒(Bovineparvovirus,BPV)引起的一种接触性传染病。感染后的主要症状是急性肠胃炎，回肠和空肠粘膜出现不同程度的充血、出血或溃疡，严重者排出血便；怀孕母牛感染BPV后表现为生殖机能障碍、流产，严重可引起死胎；犊牛感染BPV后表现为呼吸道和消化道病症牛细小病毒感染后常表现为隐性感染，不易被发现，影响畜牧业的健康发展。因此，建立有效的检测方法具有重要的实践意义。
目前，牛细小病毒感染的检测方法主要包括病毒分离、血清学诊断、电镜检查和分子生物学检测等。病毒分离是传统的检测方法，鉴定结果准确，但检测周期较长。电镜检查法是一种特异强、灵敏度高的方法，包括直接电镜检查和免疫电镜检查，均可用于检测BPV，但对病毒数量有要求，且需要专业仪器设备和人员进行操作。血清学检测方法是BPV流行病学调查、动物疾病预防和进出口检验检疫中常用的方法。主要包括血凝和血凝抑制试验、血清中和试验、间接免疫荧光试验(IFA)、病毒中和试验(VNT)、酶联免疫吸附试验(ELISA)等。血凝和血凝抑制试验具有操作简便、快速，不需要特殊设备等优点，但该方法的特异性不强、灵敏度低，且待检样品需要进行特殊处理，同时非特异性血凝因子也会影响试验结果的准确性。血清中和试验比血凝抑制试验敏感，但操作复杂，不适合大批量样品的检测，且受病毒感染力、细胞状态和数量等多种因素影响。IFA也称为荧光抗体技术，主要是利用抗原抗体结合原理进行组织或细胞内抗原物质的定位。因此，IFA可检测细胞中BPV增殖特性和规律。此方法简便、快速、检出率高，但检测结果易出现非特异性荧光。ELISA是基于免疫酶技术开发的一种新型免疫测定法，通过抗原、抗体特异性的反应将待测物与酶连接，酶与底物产生颜色反应进行定量测定。测定的对象可以是抗体也可以是抗原，测量时，抗原(抗体)首先与固体支持物结合，但保留其免疫活性，然后通过将抗体(抗原)与酶结合形成缀合物(标记物)，缀合物保留其原始的免疫活性和酶活性，当缀合物与固体支持物上的抗原(抗体)反应时，即催化发生水解或氧化还原反应，形成有色物质。底物颜色深度与待测量的抗原(抗体)含量成比例。可通过肉眼、光学显微镜、电子显微镜或分光光度计(酶标仪)观察，该方法简单、方便、快速。
近年来，分子生物学方法发展迅速，广泛用于生物和医学领域。分子生物学方法灵敏性高、局限性小，可对核酸分子进行操作，提高了灵敏性，使结果精准。目前，分子生物学诊断技术主要包括PCR技术、荧光定量PCR(FQ-PCR)、环介导等温扩增(LAMP)技术等。PCR技术是一种高效、快速的诊断方法，目前已广泛用于临床病原检测，该方法检测速度快，但结果容易出现假阳性等问题。荧光定量PCR(Fluorogenetic Quantitative PCR,FQ-PCR)技术广泛用于基因表达水平分析、病原体的定性和定量检测。该方法是在反应体系中添加了荧光染料，荧光染料可与双链DNA结合。随着模板扩增，荧光染料可以有效地与新合成的双链DNA结合，并且随着PCR的进行，越来越多的染料结合，仪器检测到的荧光信号越来越强，进而达到定量的目的。实时荧光定量PCR简化了定量检测的过程，并真正实现了绝对定量。该方法可进行全自动化反应和分析，且具有灵敏度高和特异性强的优点。但该方法操作技术要求高，需要特殊的仪器设备，且成本较高，限制了其广泛应用。环介导的等温扩增(LAMP)技术是一种新型快速、准确、经济的基因扩增方法。该方法可以自动循环。但该方法最大的缺点是气溶胶污染。如果在同一个空间内重复多次试验，可能影响后续试验结果的准确性。
本发明以牛细小病毒全病毒作为免疫原制备单克隆抗体，筛选针对病毒表面抗原表位的单克隆抗体。利用原核表达并纯化的BPV VP2蛋白作为固相抗原，单抗作为第一抗体，建立间接竞争ELISA检测方法，并优化反应条件，对临床样品进行检测，分析该方法的准确性和特异性，为牛细小病毒感染的检测提供了一种可靠的诊断方法，并为有效防控BPV感染和流行病学调查奠定了基础。
发明内容
本发明的目的在于提供一株抗牛细小病毒的单克隆抗体，并建立了用于检测BPV的间接竞争ELISA方法，为牛细小病毒感染的诊断提供一种检测方法，并为流行病学研究和疫病综合防控提供一种可靠的手段。
为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：
本发明用纯化的BPV免疫BALB/c小鼠制备了多克隆抗体，以其作为一抗，建立用于筛选单克隆抗体的间接免疫荧光方法(IFA)，并优化了IFA方法的各种反应条件，包括病毒感染时间，固定剂的选择，以及一抗和酶标二抗的最佳反应条件。用纯化的BPV免疫BALB/c小鼠，采用体外融合技术，将免疫后小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞(SP2/0细胞)进行融合。然后将BPV作为检测抗原，通过优化的IFA方法筛选融合后的杂交瘤细胞，将阳性细胞株进行4次亚克隆，最后筛选出4株能够稳定分泌抗BPV单克隆抗体(McAb)的杂交瘤细胞，依次命名为BPV-1F2、BPV-4E3、BPV-6G9和BPV-6G7。通过对单克隆抗体亚型进行鉴定，结果显示，BPV-1F2为IgG3亚型，BPV-4E3为IgG2b亚型，BPV-6G7和BPV-6G9均为IgG2a亚型。叠加ELISA结果初步鉴定，BPV-4E3与BPV-1F2、BPV-6G9和BPV-6G7针对的抗原表位相距较远。同时，通过特异性分析，利用4株单克隆抗体分别检测BPV、牛轮状病毒(BRV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、鸡传染性囊病病毒(IBDV)、猪细小病毒(PPV)、猪圆环病毒(PCV)和猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)，结果表明，4株单克隆抗体只与BPV发生特异性反应，表明制备的单克隆抗体具有良好的特异性。通过夹心ELISA检测单克隆抗体的特异性和亲和性，结果显示，4株单克隆抗体均具有良好的亲和性，其中BPV-4E3和BPV-1F2亲和性更好。
通过构建重组菌pET-28a-VP2/Rosetta，诱导表达VP2蛋白，并进行纯化和鉴定。利用BPV细胞培养物和BPV VP2蛋白作为竞争抗原，BPV-1F2和BPV-4E3分别为一抗，建立两种间接竞争ELISA方法。通过优化间接竞争ELISA反应条件，包括抗原包被量、包被时间、封闭液的选择、封闭时间、一抗浓度、竞争反应时间、二抗浓度和孵育时间。最后，对两种间接竞争ELISA方法的检测效果进行评价，结果表明，两种间接竞争ELISA方法均具有良好的特异性和重复性；通过敏感性分析，结果显示，BPV-1F2和BPV-4E3单抗建立的间接竞争ELISA方法对BPV病毒的最低检出量分别为2.5×10-6.06/0.1mL和1.25×10-7.06/0.1mL，表明BPV-4E3单抗建立的间接竞争ELISA方法敏感性更高，且比间接ELISA方法和夹心ELISA方法的检测敏感度高出一个数量级。利用建立的间接竞争ELISA方法对220份临床病料进行检测，其中14份为阳性，与PCR检测结果一致。
本发明筛选得到的一株分泌牛细小病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为4E3，分类命名为分泌牛细小病毒单克隆抗体杂交瘤细胞，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所，保藏编号为CGMCC NO.18301，保藏时间为2019年7月17日。
由所述的杂交瘤细胞株分泌产生的牛细小病毒单克隆抗体也在本发明的保护范围之内。
进一步的，本发明还提出了所述的牛细小病毒单克隆抗体在制备检测牛细小病毒感染试剂中的用途。
更进一步的，本发明还提出了一种用于检测牛细小病毒感染的间接竞争ELISA试剂盒，所述的试剂盒中含有本发明所述的牛细小病毒单克隆抗体。
其中，优选的，所述的试剂盒中还包括牛细小病毒细胞培养物或牛细小病毒VP2蛋白包被的酶标板、HPR标记的山羊抗鼠二抗、洗涤液、抗体稀释液、封闭液、显色液以及终止液。
其中，优选的，所述的洗涤液为PBST缓冲溶液，所述的封闭液为5％w/v脱脂乳溶液，所述的抗体稀释液为0.5％w/v BSA溶液，所述的显色液为TMB底物显色液，所述的终止液为2mo1/L浓H2SO4溶液。
其中，优选的，用于牛细小病毒检测时，所述的试剂盒的使用方法为：
(1)抗原包被：酶标板中加入稀释的VP2蛋白，100μL/孔，37℃孵育2h；
(2)洗板：弃去溶液，每孔加入200μL洗涤液，洗3次，每次5min；
(3)封闭：每孔加入200μL封闭液，37℃作用2h；
(4)洗板：弃去封闭液，每孔加入200μL洗涤液，洗3次，每次5min；
(5)竞争反应：将用抗体稀释液稀释后的权利要求2所述的牛细小病毒单克隆抗体加到含有BPV的样品中，混匀后于37℃孵育1h，将作用后的产物滴加到包被VP2蛋白酶标板中，37℃孵育1h；
(6)洗板：弃去溶液，每孔加入200μL洗涤液，洗3次，每次5min；
(7)孵育二抗：每孔加入100μL用抗体稀释液稀释后的山羊抗鼠IgG-HPR，37℃孵育1h；
(8)洗板：弃去溶液，每孔加入200μL洗涤液，洗3次，每次5min。
(9)显色：每孔加入100μL显色液，37℃孵育10min；
(10)终止显色：每孔加入50μL终止液终止显色，用酶标仪OD450nm读取数值。
其中，优选的，稀释的VP2蛋白的浓度为0.188μg/0.1mL，权利要求2所述的牛细小病毒单克隆抗体的稀释倍数为1:400，山羊抗鼠IgG-HPR的稀释倍数为1:10000。
其中，优选的，用酶标仪OD450nm读取数值，并计算抑制率，抑制率大于或者等于20，判定其阳性结果，抑制率小于20，则判定为阴性结果；
抑制率(％)＝(阴性对照(N)OD450nm值-样品(P)OD450nm值)/阴性对照(N)OD450nm×100％值。
相较于现有技术，本发明的有益效果是：
本发明制备了特异性和亲和性较好的BPV单克隆抗体，并建立了用于检测牛细小病毒的间接竞争ELISA方法，并优化了各种反应条件，经鉴定，建立的间接竞争ELISA方法具有良好的敏感性、特异性和重复性。间接竞争ELISA方法的突出优点是特异性强和敏感性高，微量样品能产生较高效的抗原抗体反应。通过对临床样品检测，与PCR结果一致，表明该方法检测结果准确可靠。因此，本发明可用于牛细小病毒感染的临床检测，尤其适用于检测早期感染和隐性感染时病毒含量低的病料，同时，为牛细小病毒流行病学调查及疫情监控也提供了一种可靠的方法。
附图说明
图1为间接免疫荧光试验筛选单克隆抗体的结果；
A：单克隆抗体BPV-1F2；B：单克隆抗体BPV-4E3；C：单克隆抗体BPV-6G7；D：单克隆抗体BPV-6G9；E：阳性对照；F：阴性对照；
图2为单克隆抗体亚型的鉴定；
图3为间接ELISA鉴定单克隆抗体稳定性结果；
图4为间接免疫荧光鉴定单克隆抗体稳定性；
A：单克隆抗体BPV-1F2；B：单克隆抗体BPV-4E3；C：单克隆抗体BPV-6G7；D：单克隆抗体BPV-6G9；E：阳性对照；F：阴性对照；
图5为SDS-PAGE鉴定纯化腹水结果；
A:SDS-PAGE鉴定纯化BPV-1F2腹水；M：蛋白分子质量；1：纯化BPV-1F2腹水；2：未纯化BPV-1F2腹水；
B:SDS-PAGE鉴定纯化BPV-4E3腹水；M：蛋白分子质量；1：纯化BPV-4E3腹水；2：未纯化BPV-4E3腹水；
图6为间接ELISA方法鉴定纯化抗体效价的结果；
图7为PCR扩增VP2目的基因结果；
M：分子质量标准；1：VP2目的基因；2：阴性对照；
图8为PCR鉴定重组质粒结果；
M：分子质量标准；1：VP2目的基因；2：阴性对照；
图9为酶切鉴定重组质粒结果；
M：分子质量标准；1：重组质粒(pET-28a-VP2/TG1)；2：阳性对照；
图10为SDS-PAGE鉴定VP2蛋白在大肠杆菌E.coli Rosetta中的表达结果
M：蛋白分子质量标准；1：pET-28a/Rosetta空载体诱导后；2：pET-28a/Rosetta空载体诱导前；3：pET-28a-VP2/Rosetta重组菌诱导后；4：pET-28a-VP2/Rosetta重组菌诱导前；
图11为SDS-PAGE鉴定纯化的VP2蛋白结果；
M：蛋白分子质量标准；1：纯化的VP2蛋白；2：阴性对照；
图12为Western-blot鉴定纯化VP2蛋白结果
M：蛋白分子质量标准；1：纯化的VP2蛋白；2：阴性对照；
图13为PCR鉴定的阳性粪样结果
M：DNA分子质量标准；1：黑龙江7810号；2：黑龙江7741号；3：黑龙江8120号；4：黑龙江8339号；5：黑龙江7652号；6：黑龙江8186号；7：黑龙江7695号；8：黑龙江7737号；9：内蒙古1768号；10：内蒙古170910号；11：辽宁40号；12：吉林108号；13：吉林60号；14：阳性对照；15：阴性对照；
图14为间接ELISA确定抗原的浓度；
A：基于BPV-1F2单抗间接竞争ELISA方法；B：基于BPV-4E3单抗间接竞争ELISA方法；
图15为间接竞争ELISA方法确定封闭液；
A：基于BPV-1F2单抗间接竞争ELISA方法；B：基于BPV-4E3单抗间接竞争ELISA方法；
图16为间接竞争ELISA方法确定封闭时间；
A：基于BPV-1F2单抗间接竞争ELISA方法；B：基于BPV-4E3单抗间接竞争ELISA方法；
图17为间接竞争ELISA判定标准的确定；
A：基于BPV-1F2单抗间接竞争ELISA；B：基于BPV-4E3单抗间接竞争ELISA；
图18为间接竞争ELISA的特异性评价结果；
A：基于BPV-1F2单抗间接竞争ELISA；B：基于BPV-4E3单抗间接竞争ELISA；
图19为竞争ELISA方法检测阳性粪样；
1：黑龙江7810号；2：黑龙江7741号；3：黑龙江8120号；4：黑龙江8339号；5：黑龙江7652号；6：黑龙江8186号；7：黑龙江7695号；8：黑龙江7737号；9：内蒙古1768号；10：内蒙古170910号；11：辽宁40号；12：吉林108号；13：吉林60号；14：阳性对照；15：阴性对照。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
本发明实施例所涉及的试验材料：
1病毒、细胞和菌株
牛细小病毒(BPV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪细小病毒(PPV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、猪圆环病毒(PCV)、牛轮状病毒(BRV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和鸡传染性法氏囊病毒(IBDV)均由本实验室保存；骨髓瘤细胞(SP2/0细胞)、牛鼻甲骨细胞(BT细胞)由本实验室保存；菌种pET-28a(+)/Rosetta和BPV VP2多克隆抗体均由本实验室保存。
2试验动物
4～6周龄BALB/c小鼠购自辽宁长生生物技术有限公司，且本实验依据《实验动物管理条例》和《东北农业大学实验动物伦理委员会章程》的要求进行研究。
3主要试剂
表1主要试剂
4主要试剂配制
4.1间接免疫荧光试验相关试剂
(1)固定液(4％多聚甲醛溶液)：称量8g多聚甲醛颗粒溶于200mL PBS缓冲溶液，pH调至7.2，4℃保存。
(2)封闭液(0.3％BSA溶液)：称量0.3g BSA粉末溶于10mL PBS缓冲溶液，10倍稀释后备用，现用现配。
4.2ELISA相关试剂
(1)包被稀释溶液：称量0.75g Na2CO3和1.465g NaHCO3，用去离子水溶解后，定容至1L，pH调至9.6，室温保存。
(2)封闭液(5％脱脂乳溶液)：称量5g脱脂奶粉，用PBS缓冲溶液定容至100mL，溶解后，4℃保存。
(3)洗涤液(PBST缓冲溶液)：称量1mL Tween-20溶液加入到2L PBS缓冲溶液中，混匀，pH调至7.4，室温保存。
(4)抗体稀释液(0.5％w/vBSA溶液)：称量0.5gBSA，PBS缓冲溶液定容至100mL，溶解后，4℃保存；
(5)显色液：量取等体积A溶液(商品化)和B溶液(商品化)，混匀，现用现配。
(6)终止液(2mo1/L浓H2SO4溶液)：量取100mL浓硫酸加到850mL去离子水中，然后定容至1L，室温保存。
4.3抗体纯化试剂
(1)结合缓冲溶液：称量3.802g Na3PO3，溶于490mL超纯水中，pH调至7.0，定容至500mL，过滤后，4℃保存。
(2)洗脱缓冲溶液：称量3.754g Gly，溶于490mL超纯水中，pH调至2.7，定容至500mL，过滤后，4℃保存。
(3)中和溶液：称量6.05g Tris溶于45mL超纯水中，pH调至9.0，定容至50mL，过滤后，4℃保存。
实施例1抗牛细小病毒单克隆抗体的制备
1方法
1.1间接免疫荧光(IFA)方法的建立
1.1.1鼠抗BPV多克隆抗体的制备
纯化的牛细小病毒与等剂量弗氏完全佐剂(FCA)乳化后，腹腔注射免疫小鼠。两周后，用纯化的牛细小病毒与等剂量弗氏不完全佐剂(FIA)乳化，进行第二次免疫。两周后，进行第三次免疫，免疫的剂量和方法同第二次免疫。第三次免疫后的第7天，小鼠尾静脉采血，收集血清。通过间接ELISA方法检测血清抗体效价，同时设置阴性对照。当血清效价达到1:12800以上时，进行眼球采血，并收集血清，-80℃保存。
1.1.2载玻片的处理
试验进行前，将载玻片在清洗液(重铬酸钾终浓度为100mg/L，硫酸浓度为50％)中浸泡24h，用自来水清洗后，浸泡于75％酒精中12h，用自来水清洗6次后，再用三蒸水清洗3次，晾干备用即可。
1.1.3间接免疫荧光方法的反应程序
(1)将BPV接种BT细胞，当CPE达到70％～80％左右时，弃去细胞维持液。
(2)加入2mL PBS缓冲液清洗细胞，弃去PBS缓冲溶液。
(3)加入1mL 0.2％胰酶浸润细胞层，于37℃、5％CO2细胞培养箱中消化细胞15s，弃去胰酶。
(4)加入1mL PBS缓冲溶液重悬细胞，500r/min离心5min，弃去PBS缓冲溶液。
(5)向离心管中加入700μL PBS缓冲溶液重悬细胞沉淀。
(6)将10μL细胞悬液滴加到载玻片上，自然干燥。
(7)向载玻片上滴加细胞固定剂，室温静置10min。
(8)用PBS缓冲溶液清洗载玻片2次，每次5min，晾干。
(9)滴加鼠抗BPV多克隆抗体，37℃孵育1h，同时设置阴性对照组。
(10)用PBS缓冲溶液清洗载玻片3次，每次5min，晾干。
(11)将二抗(山羊抗鼠IgG-FITC，1:1000)滴加到细胞上，37℃避光孵育45min。
(12)用PBS缓冲溶液避光清洗载玻片5次，每次5min，晾干，镜下观察。
1.1.4病毒感染时间的确定
将BPV接种BT细胞，分别于36h、48h、60h和72h收集细胞样品，其他反应条件相同，进行间接免疫荧光试验，选择荧光较强的时间点作为最佳病毒感染时间。
1.1.5固定剂的确定
分别用4％多聚甲醛(预冷)、无水乙醇(预冷)和丙酮(预冷)3种试剂固定细胞，其他反应条件相同，进行间接免疫荧光试验，选择细胞密度大且荧光较强的试剂作为细胞固定剂。
1.1.6固定时间的确定
细胞的固定时间分别为室温5min、10min和15min，其他反应条件相同，进行间接免疫荧光试验，选择细胞密度大且荧光较强的作用时间作为最佳固定时间。
1.1.7一抗孵育时间的确定
一抗孵育时间分别为30min、45min和60min，其他反应条件相同，进行间接免疫荧光试验，选择荧光较强的孵育时间作为一抗的最佳孵育时间。
1.1.8二抗稀释倍数的确定
二抗(FITC-山羊抗鼠IgG)分别进行1:60、1:120和1:180稀释，其他反应条件相同，进行间接免疫荧光试验，选择荧光较强且非特异性荧光较少的稀释倍数作为二抗的最佳稀释倍数。
1.1.9二抗孵育时间的确定
二抗孵育时间分别为30min、45min和60min，其他反应条件相同，进行间接免疫荧光试验，选择荧光较强的孵育时间作为二抗的最佳孵育时间。
1.2杂交瘤细胞株的筛选与建立
1.2.1动物免疫
用纯化后的牛细小病毒免疫4周龄BALB/c小鼠，具体操作同1.1.1。
1.2.2骨髓瘤细胞(SP2/0细胞)的复苏
细胞融合前10天，从-140℃冰箱中取出冻存的SP2/0细胞，进行复苏，细胞培养液为15％的完全1640培养液。
1.2.3SP2/0细胞的培养
(1)从37℃、5％CO2细胞恒温培养箱中取出长满单层的SP2/0细胞，弃去细胞培养液。
(2)加入完全1640培养液，从细胞瓶上吹散细胞，混匀后分装、标记。
(3)将其于37℃、5％CO2细胞恒温培养箱中培养。
1.2.4饲养层细胞的准备
(1)脱颈处死6周龄BALB/c小鼠，并消毒5min。
(2)将小鼠仰卧固定后，用灭菌剪刀和镊子剪开小鼠腹部皮毛，露出腹膜。
(3)将5mL预冷HAT培养液注入小鼠腹腔。
(4)用5mL无菌注射器吸出小鼠腹腔内的液体，用细胞计数仪计数，将细胞稀释至104个/0.1mL，然后加入45mL HAT培养液混匀。
(5)向96孔细胞培养板中加入饲养层细胞悬液(100μL/孔)。
(6)次日观察饲养层细胞的状态。生长状态良好、分布均匀且没有发生污染的饲养层细胞即可用于细胞融合。
1.2.5细胞融合
(1)将免疫后小鼠进行眼球采血，收集血清。然后放入75％酒精中消毒5min。同时对未免疫小鼠眼球采血，收集血清。
(2)将小鼠固定后，用灭菌剪刀和镊子剪开小鼠腹部皮毛，剪开腹膜，取出脾脏。
(3)剥离脾脏周围结缔组织，并清洗干净。
(4)在脾脏钝端扎3～5个孔，然后用基础1640培养液吹洗脾脏，将所获得的脾细胞移入离心管中。
(5)用10mL基础1640培养液吹散SP2/0细胞，并将SP2/0细胞移入离心管中。
(6)将脾细胞和SP2/0细胞500r/min离心10min。
(7)弃去上清液，分别用4mL基础1640培养液重悬脾细胞和SP2/0细胞。细胞计数后，将脾细胞:SP2/0细胞＝8:1比例混匀，500r/min离心10min。
(8)弃去上清液，混匀两种细胞沉淀，放于37℃水浴中。
(9)吸取600μL细胞融合剂，以10μL/s速度滴加到离心管中，边滴边混匀，然后在37℃水浴中静置90s。
(10)加入10mL基础1640培养液重悬细胞，500r/min离心10min，弃上清，重复操作两次。
(11)加入HAT培养液重悬细胞，将融合后的细胞悬液滴加到含有饲养层细胞的96孔细胞培养板中，于37℃、5％CO2细胞恒温培养箱中静置培养。
1.2.6阳性杂交瘤细胞株的筛选与克隆
(1)细胞融合后4～5天，用HAT培养液进行细胞半换液。当细胞长满孔板底部1/3时，用HT培养液进行细胞全换液。
(2)换液48h后，通过间接免疫荧光试验筛选阳性杂交瘤细胞株，步骤同1.1.3。
(3)利用液相有限稀释法亚克隆阳性杂交瘤细胞，向96孔细胞培养板中加入亚克隆细胞悬液(100μL/孔)，继续培养。阳性杂交瘤细胞连续多次亚克隆后，通过间接免疫荧光法检测阳性率为100％时，即获得能分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞。
1.2.7杂交瘤细胞的冻存
(1)调整杂交瘤细胞生长状态，当细胞大小均一、边缘清楚、圆滑时，用基础1640培养液吹散杂交瘤细胞。
(2)将细胞悬液移入离心管中，500r/min离心7min，弃上清。
(3)用细胞冻存液重悬细胞沉淀，调整密度至5×106个/mL，加入到细胞冻存管中，标记细胞名称、时间。
(4)将细胞放入冻存盒，于-80℃过夜，次日将其放到-140℃冰箱或者液氮罐中保存。
1.3单克隆抗体特性的鉴定
1.3.1单克隆抗体亚类的鉴定
用商品化的单抗亚类鉴定试剂盒测定单克隆抗体的亚型，具体操作步骤如下：
(1)用PBS缓冲溶液稀释IgG1、IgG3、IgG2a、IgG2b、IgA和IgM 6种蛋白(1:1000)，滴加到酶标板(100μL/孔)中，37℃孵育1h。
(2)弃液，每孔加入200μL PBS缓冲溶液，洗3次，每次5min。
(3)每孔分别加入100μL 4株杂交瘤细胞(BPV-1F2、BPV-4E3、BPV-6G7和BPV-6G9)上清液，室温静置1h。
(4)弃液，每孔加入200μL PBS缓冲溶液，洗3次，每次5min。
(5)每孔加入100μL山羊抗鼠IgG-HRP(1:3000)，室温静置30min。
(6)弃液，每孔加入200μL PBS缓冲溶液，洗3次，每次5min。
(7)每孔加100μL显色液，37℃孵育10min。
(8)每孔加50μL 2mol/L H2SO4溶液终止显色，用酶标仪OD450nm读取数值。
1.3.2单抗特异性的鉴定
分别将BPV、BRV、BVDV、PEDV、IBDV、PPV、PCV和TGEV滴加到酶标板中，用4株杂交瘤细胞(BPV-1F2、BPV-4E3、BPV-6G7和BPV-6G9)上清液作为一抗，通过间接ELISA方法进行检测。
1.3.3杂交瘤细胞分泌单抗的稳定性测定
将阳性杂交瘤细胞传代培养3个月后，并收集冻存前后的细胞上清液，通过间接ELISA方法检测4株杂交瘤细胞(BPV-1F2、BPV-4E3、BPV-6G7和BPV-6G9)上清液中抗体的效价。另外，通过IFA检测复苏后4株杂交瘤细胞(BPV-1F2、BPV-4E3、BPV-6G7和BPV-6G9)上清液。
1.3.4腹水的制备及纯化
(1)将500μL灭菌石蜡注射到小鼠的腹腔。
(2)致敏7天后，用10mL基础1640培养液吹散杂交瘤细胞，混匀。
(3)取20μL杂交瘤细胞悬液进行细胞计数，保证每只小鼠注射约106个杂交瘤细胞。
(4)将细胞悬液进行500r/min离心10min，再用1mL基础1640培养液重悬细胞沉淀。根据细胞计数的结果，计算出应给小鼠注射杂交瘤细胞的体积。然后逐日观察小鼠腹围的变化。
(5)当小鼠腹围明显增大后，在生物安全柜内抽取腹水。
(6)500r/min离心7min，收集上清，标记，-80℃保存。
(7)用基础1640培养液重悬细胞沉淀，细胞计数后。将其注射到致敏小鼠腹腔，制备第二代腹水。
(8)参照抗体Protein G纯化层析柱的使用说明书，纯化腹水，并对其进行SDS-PAGE鉴定。
1.3.5腹水效价的测定
将BPV-1F2和BPV-4E3腹水纯化后，分别进行10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9、10-10倍梯度稀释，通过间接ELISA方法(同2.2.1.7)对其进行检测，SP2/0细胞上清液作为阴性对照。根据P(检测样品的值)/N(SP2/0细胞上清的值)大于或者等于2原则，确定腹水效价。
2结果
2.1间接免疫荧光(IFA)筛选方法的建立
2.1.1病毒感染时间的确定
BPV感染BT细胞后，收集不同时间(36h、48h、60h和72h)的培养样品，以鼠抗BPV多克隆抗体为一抗，进行IFA试验。当BPV感染细胞60h时，特异性绿色荧光效果最好，因此，确定BPV最佳感染时间为60h。
2.1.2固定剂的确定
BPV感染BT细胞60h后，收集细胞样品，分别用4％多聚甲醛(预冷)、无水乙醇(预冷)和丙酮(预冷)进行固定，其他反应条件相同，进行IFA检测。结果显示，丙酮固定效果最好，细胞数量多，形态较好，且荧光强度最大。
2.1.3固定时间的确定
BPV感染BT细胞60h后，收集细胞，用预冷丙酮分别固定细胞5min、10min和15min，其他反应条件相同，进行IFA试验。结果显示，当固定时间为10min时，荧光效果最好，且细胞数量多，形态好。因此，确定固定时间为10min。
2.1.4一抗孵育时间的确定
BPV感染细胞60h后，收集细胞，用预冷丙酮室温固定10min，以鼠抗BPV多克隆抗体为一抗，分别孵育30min、45min和60min，其他反应条件相同，进行IFA试验。结果显示，孵育时间为45min和60min时的荧光效果较好，为节省时间，将45min作为一抗最佳孵育时间。
2.1.5二抗稀释倍数的确定
BPV感染细胞60h后，收集细胞，用预冷丙酮室温固定细胞10min，以鼠抗BPV多克隆抗体为一抗，并将二抗(山羊抗鼠IgG-FITC)进行1:60、1:120和1:180倍稀释，其他反应条件相同，进行IFA试验。结果显示，当二抗稀释倍数为1:120倍时，非特异性荧光较少，且特异性荧光强度大。因此，选择1:120倍稀释作为二抗的最佳稀释倍数。
2.1.6二抗孵育时间的确定
BPV感染细胞60h后，收集细胞，用预冷丙酮室温固定细胞10min，以鼠抗BPV多克隆抗体为一抗，并将二抗(山羊抗鼠IgG-FITC)进行1:120倍稀释，二抗孵育时间分别为30min、45min和60min，其他反应条件相同，进行IFA试验。结果显示，当二抗孵育45min和60min时，检测的荧光较强。因此，为节省时间，确定二抗孵育时间为45min。
2.2单克隆抗体的制备与筛选结果
利用优化的IFA筛选杂交瘤细胞，并对阳性杂交瘤细胞进行4次亚克隆，获得4株能够稳定分泌BPV特异性抗体的杂交瘤细胞，分别命名为：BPV-1F2、BPV-4E3、BPV-6G7和BPV-6G9，如图1所示。
2.3单克隆抗体特性鉴定
2.3.1单克隆抗体亚型的鉴定
利用商品化单抗亚型试剂盒检测4株杂交瘤细胞(BPV-1F2、BPV-4E3、BPV-6G7和BPV-6G9)上清液，确定单克隆抗体的亚型。结果显示，BPV-1F2为IgG3亚型，BPV-4E3为IgG2b亚型，BPV-6G7和BPV-6G9为IgG2a亚型(图2)。
2.3.2单克隆抗体抗原表位鉴定结果
以BPV为抗原，利用叠加ELISA方法检测4株杂交瘤细胞(BPV-1F2、BPV-4E3、BPV-6G7和BPV-6G9)上清。按照公式AI＝[2A1+2-(A1+A2)]/A1+2处理数据，若AI值>50％，则表明所测两株单抗的抗原表位不同；反之，AI值<50％，则表明所测两株单抗的抗原表位相同。数据处理后初步确定BPV-4E3与BPV-1F2、BPV-6G7、BPV-6G9不是同一抗原表位。
2.3.3单克隆抗体的特异性鉴定结果
以BPV、BRV、BVDV、PEDV、IBDV、PPV、PCV和TGEV为抗原包被酶标板，以4株杂交瘤细胞(BPV-1F2、BPV-4E3、BPV-6G7和BPV-6G9)上清液为一抗，进行间接ELISA检测。结果显示，4株单克隆抗体(BPV-1F2、BPV-4E3、BPV-6G7和BPV-6G9)只与BPV反应，不与其他病毒发生交叉反应，表明4株单克隆抗体(BPV-1F2、BPV-4E3、BPV-6G7和BPV-6G9)具有良好的特异性(表2)。
表2间接ELISA鉴定单抗特异性
2.3.4杂交瘤细胞株稳定性鉴定结果
每间隔1个月复苏一次杂交瘤细胞，并收集杂交瘤细胞上清液。通过间接ELISA方法检测BPV-1F2、BPV-4E3、BPV-6G7和BPV-6G9杂交瘤细胞上清液中抗体效价。试验结果显示，4株杂交瘤细胞效价几乎不变，表明杂交瘤细胞可稳定分泌单克隆抗体(图3)。
通过优化的IFA方法进一步鉴定复苏后的4株杂交瘤细胞(BPV-1F2、BPV-4E3、BPV-6G7和BPV-6G9)培养上清液。结果显示，均检测到较强的特异性荧光(图4)。
2.4纯化后腹水的鉴定及效价的测定
2.4.1纯化后腹水的SDS-PAGE鉴定结果
选取BPV-1F2和BPV-4E3杂交瘤细胞制备腹水，利用Protein G亲和层析柱纯化腹水。通过SDS-PAGE鉴定纯化后的腹水。如图5所示，可见分子量大小约为50KDa和25KDa的重链和轻链，且无其他杂带。
2.4.2纯化后腹水的效价测定结果
以BPV为抗原包被酶标板，将纯化后腹水(BPV-1F2和BPV-4E3)分别进行10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9和10-10倍稀释，通过间接ELISA方法检测，结果显示，BPV-1F2纯化腹水效价为10-6，BPV-4E3纯化腹水效价为10-7(图6)。
将分泌BPV-4E3单克隆抗体的杂交瘤细胞株送交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，其保藏编号为CGMCC NO.18301。
实施例2间接竞争ELISA检测方法的建立与应用
1方法
1.1间接竞争ELISA检测方法的建立
1.1.1VP2基因的扩增
以病毒DNA为模板，PCR扩增VP2基因。获得的PCR产物进行琼脂糖核酸电泳鉴定，将获得的PCR产物连入pMDTM18-T中，得到pMDTM18-T-VP2重组质粒。
1.1.2重组表达载体的鉴定
用EcoR I和Xho I对pMDTM18-T-VP2重组质粒和pET-28a载体质粒进行双酶切鉴定。
将酶切产物进行胶回收，于16℃连接仪中连接12h。连接产物转化E.coli TG1感受态，将获得的pET-28a-VP2/TG1重组质粒进行PCR和酶切鉴定(反应体系和程序同上)，鉴定正确的阳性重组质粒(pET-28a-VP2/TG1)送至测序。测序鉴定正确的重组质粒转化E.coliRosetta感受态，获得重组菌株pET-28a-VP2/Rosetta。
1.1.3VP2蛋白的诱导表达
(1)pET-28a-VP2/Rosetta重组菌以1:50接种LB液体培养基(K+)，于37℃震荡培养。
(2)菌液OD600nm约为0.5时，加入无菌的IPTG溶液，于37℃震荡培养4h。
(3)菌液12000r/min离心6min，弃上清。
(4)用PBS缓冲溶液重悬菌体沉淀，12000r/min离心10min，弃上清。此步骤重复两遍。
(5)用PBS缓冲溶液重悬菌体沉淀，超声波裂解。程序如下：频率为100w，超声4s，停4s，全程60s，保护温度为37℃。
(6)将超声后的菌液与5×SDS缓冲溶液混匀，煮沸15min。
(7)通过SDS-PAGE鉴定蛋白表达。
1.3.4VP2蛋白的纯化
将pET-28a-VP2/Rosetta进行大量诱导，并提取包涵体。通过切胶方式纯化蛋白，经SDS-PAGE和Western blot鉴定纯化的VP2蛋白，Western blot试验中一抗为鼠抗His标签抗体。鉴定正确后，将纯化的VP2蛋白于-40℃冰箱中保存。
1.3.5粪便样品的处理与检测
用PBS缓冲溶液稀释粪便样品，反复冻融3次，10000r/min离心15min，收集上清液。依据DNA提取试剂盒的操作说明书，从粪便上清液中提取BPV DNA。具体操作步骤如下：
(1)将20μL Protein K加到1.5mL EP管中。
(2)加入100μL粪便上清液。
(3)加入200μL BB5溶液(含有Crain RNA)，涡旋震荡15s。
(4)将1.5mL EP管于56℃水浴锅中静置15min。
(5)加入250μL无水乙醇，涡旋震荡15s，然后室温静置5min。
(6)将悬液加到离心吸附柱中，12000r/min离心1min。
(7)弃去上清液，加入500μL洗液，12000r/min离心1min。此步骤重复一次。
(8)弃去上清液，12000r/min离心1min。
(9)将吸附柱置于1.5mL EP管中，然后加入30μL洗脱液，室温静置5min。
(10)12000r/min离心10min，收集上清液。通过紫外分光光度计测量DNA含量，-40℃保存备用。
通过PCR方法检测，确定粪便中是否含有BPV。若结果为阳性，则粪便样品可以作为建立间接竞争ELISA检测方法时的阳性样品；若结果为阴性，则粪便样品可以作为建立间接竞争ELISA检测方法时的阴性样品。
1.3.6间接竞争ELISA反应程序
(1)抗原包被：酶标板中加入稀释的VP2蛋白(100μL/孔)，37℃孵育2h。
(2)洗板：弃去溶液，每孔加入200μL PBST缓冲溶液，洗3次，每次5min。
(3)封闭：每孔加入200μL封闭液，37℃作用2h。
(4)洗板：弃去封闭液，每孔加入200μL PBST缓冲溶液，洗3次，每次5min。
(5)竞争反应：将稀释后的BPV-4E3单克隆抗体加到含有BPV样品中，混匀后于37℃孵育1h。将作用后的产物滴加到包被VP2蛋白酶标板中，37℃孵育1h。
(6)洗板：弃去溶液，每孔加入200μL PBST缓冲溶液，洗3次，每次5min。
(7)孵育二抗：每孔加入100μL二抗(山羊抗鼠IgG-HPR，1:10000)，37℃孵育1h。
(8)洗板：弃去溶液，每孔加入200μL PBST缓冲溶液，洗3次，每次5min。
(9)显色：每孔加入100μL显色液，37℃孵育10min。
(10)终止显色：每孔加入50μL 2mol/L浓H2SO4终止显色，用酶标仪OD450nm读取数值。
1.3.7判断标准的确定
利用1.3.6中竞争ELISA方法，对200份未感染BPV的粪便进行检测，计算样品的抑制率、平均抑制率和标准方差，根据平均抑制率和2倍的标准方差的和确定阴、阳性样品的临界值。抑制率(％)＝(阴性对照(N)OD450nm值-样品(P)OD450nm值)/阴性对照(N)OD450nm×100％值。
1.3.8间接竞争ELISA各工作条件的确定
(1)抗原浓度的确定
用包被稀释液稀释VP2蛋白(浓度依次为1.48μg/0.1mL、0.79μg/0.1mL、0.395μg/0.1mL、0.188μg/0.1mL、0.094μg/0.1mL和0.047μg/0.1mL，100μL/孔)，每列1个稀释度，4℃过夜。纯化抗体分别进行1:150、1:200、1:400、1:800、1:1600、1:3200和1:6400倍稀释，同时设置阴性对照组，每行1个稀释度，37℃孵育1h。通过间接ELISA方法测定各样品的OD450nm值，选择数值接近1.0的抗原浓度作为最佳抗原包被浓度。
(2)抗原包被条件的确定
将抗原包被条件分别设置为4℃过夜，37℃、30min，37℃、1h，37℃、2h，其他反应程序相同，进行间接竞争ELISA试验，选择N/P数值最小的反应条件作为最佳包被条件。
(3)封闭液的确定
分别选择3％牛血清白蛋白溶液、3％脱脂乳和5％脱脂乳作为封闭液，其他反应条件相同，进行间接竞争ELISA试验，将N/P值最大的溶液作为该方法的最佳封闭液。
(4)封闭时间的确定
封闭时间分别设置为37℃封闭60min、90min、120min和150min，其他反应程序相同，进行间接竞争ELISA试验，选择N/P数值最大作为最佳封闭时间。
(5)一抗稀释倍数的确定
BPV-1F2和BPV-4E3抗体进行1:200、1:400、1:800、1:1600和1:3200倍稀释，取100μL抗体溶液分别加到BPV和BT细胞上清液中，37℃孵育1h，其他反应程序相同，进行间接竞争ELISA试验，最终将N/P数值最小时，且一抗最小的稀释倍数作为一抗最佳的稀释倍数。
(6)竞争反应时间的确定
竞争反应的时间分别设置为37℃孵育30min、60min、90min和120min，其他反应程序相同，进行间接竞争ELISA试验，选择N/P数值最大的竞争反应时间作为最佳竞争反应时间。
(7)二抗稀释倍数的确定
二抗(山羊抗鼠IgG-HRP)进行1:2500、1:5000、1:10000、1:15000和1:20000倍稀释，其他反应程序不变，进行间接竞争ELISA试验，N/P值最大时，二抗的最小稀释倍数作为最佳稀释倍数。
(8)二抗孵育时间的确定
将二抗孵育时间分别设置为37℃孵育30min、60min、90min和120min，其他反应程序相同，进行间接竞争ELISA试验，选择N/P数值最小时，最短孵育时间作为二抗最佳孵育时间。
1.3.9间接竞争ELISA方法的特异性评价
用建立的两种间接竞争ELISA方法分别检测牛细小病毒(BPV)、牛轮状病毒(BRV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、鸡传染性法氏囊病毒(IBDV)、猪细小病毒(PPV)、猪圆环病毒(PCV)和猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)。对数据结果进行整理和分析，评价间接竞争ELSA方法的特异性。
1.3.10间接竞争ELISA方法的敏感性评价
将BPV(滴度为10-3.06/0.1mL)细胞培养物分别进行1:5、1:10、1:20、1:40、1:80、1:160和1:320稀释，利用建立的两种间接竞争ELISA方法分别进行检测，整理和分析数据结果，评价间接竞争ELISA方法的检测敏感性，并与间接ELISA和夹心ELISA方法进行比较。
1.3.11间接竞争ELISA方法重复性
分别用3批包被酶标板对已知BPV标准毒株进行间接竞争ELISA方法检测，每次重复3次，记录同一样品不同批次阻断率的平均值。计算变异系数，分析间接竞争ELISA方法的重复性。
1.3.12临床样品的检测
利用建立的间接竞争ELISA方法对220份临床样品进行检测，步骤同1.3.6。并与PCR检测结果进行对比。
2结果
2.1VP2基因的扩增
以BPV DNA为模板，通过PCR获得VP2目的基因。如图7所示，可扩增出约672bp的特异性条带，与目的基因大小相符。
2.2重组表达载体的鉴定
提取重组质粒pET-28a-VP2，通过PCR鉴定，如图8所示，可扩增出约672bp的特异性条带，与目的基因大小相符。通过酶切鉴定，结果正确，如图9所示。经测序鉴定结果正确。
2.3BPV VP2蛋白的表达及纯化
将阳性重组质粒pET-28a-VP2/TG1转化至E.coli Rosetta感受态中，获得重组菌株(pET-28a-VP2/Rosetta)。经IPTG诱导蛋白表达，通过SDS-PAGE鉴定结果显示，表达蛋白大小约为32KDa，与目的蛋白大小相符(图10)。
将重组菌pET-28a-VP2/Rosetta进行扩大培养，切胶纯化后，通过SDS-PAGE鉴定，在32kDa处出现特异性条带，无其他杂带，且与目的蛋白大小相符，如图11所示。
以鼠抗His标签抗体为一抗，对纯化VP2蛋白进行Western-blot鉴定，在32kDa处出现特异性条带，无其他杂带，且与SDS-PAGE鉴定结果一致，如图12所示。
2.4PCR方法检测粪样结果
将220份牛粪样(采自吉林、辽宁、黑龙江和内蒙古)提取DNA后，通过PCR进行检测，共检出阳性样品14份(如图13所示)。
2.5间接竞争ELISA反应条件的优化
2.5.1抗原工作条件的确定
以不同浓度VP2蛋白为抗原包被酶标板，以单克隆抗体为一抗，通过矩阵法，利用间接ELISA方法确定抗原的最佳包被浓度。结果显示，当BPV-1F2单克隆抗体以1:400稀释，且VP2蛋白浓度为0.047μg/0.1mL时，其数值为1.023，最接近1.0。当BPV-4E3单克隆抗体以1:800稀释，且VP2蛋白浓度为0.188μg/0.1mL时，其数值为1.045，最接近1.0(如图14所示)。
将反应条件设置为4℃过夜，37℃、30min，37℃、1h，37℃、2h。其他反应条件相同，进行间接竞争ELISA试验。结果显示，抗原的最佳包被条件为37℃、2h。
2.5.2封闭条件的确定
以最佳VP2蛋白浓度包被酶标板，以BPV为待检抗原，单克隆抗体为一抗，分别选择3％牛血清蛋白溶液、3％脱脂乳和5％脱脂乳作为封闭液，其他反应条件相同，进行间接竞争ELISA试验。结果显示，5％脱脂乳的平均N/P值最大，故选择5％w/v脱脂乳作为封闭液(如图15所示)。
以最佳VP2蛋白浓度包被酶标板，以BPV为待检抗原，单克隆抗体为一抗，用5％脱脂乳作为封闭液，封闭时间分别为60min、90min、120min和150min，其他反应条件相同，进行间接竞争ELISA试验。结果显示，当封闭时间为120min时，样品的平均N/P值最大，故确定120min作为最佳封闭时间(如图16所示)。
2.5.3一抗工作条件的确定
以最佳VP2蛋白浓度包被酶标板，用5％脱脂乳37℃封闭2h，以BPV为待检抗原，单克隆抗体分别稀释不同倍数(1:200、1:400、1:800、1:1600和1:3200)为一抗，取100μL稀释后的抗体与待检抗原混匀后，37℃孵育1h。竞争反应时间分别为30min、60min、90min和120min，进行间接竞争ELISA试验。根据试验结果，确定一抗最佳工作条件见表3。
表3间接竞争ELISA方法确定一抗的工作条件
2.5.4二抗工作条件的确定
以最佳VP2蛋白浓度包被酶标板，用5％脱脂乳37℃封闭2h，以BPV为待检抗原，且最佳稀释倍数的单克隆抗体为一抗，二抗(山羊抗鼠IgG-HRP)分别稀释不同倍数(1:2500、1:5000、1:10000、1:15000和1:20000)，反应时间分别为30min、60min、90min和120min，其他反应条件相同，进行间接竞争ELISA试验。根据试验结果，确定二抗最佳工作条件见表4。
表4间接竞争ELISA方法确定二抗最佳工作条件
2.5.5竞争ELISA方法判断标准的确定
通过优化的两种竞争ELISA(BPV-1F2和BPV-4E3)分别对200份未感染BPV的粪便进行检测，抑制率和粪便份数见图17。根据测定OD450nm值，计算出平均抑制率和标准差。基于BPV-1F2单抗的间接竞争ELISA方法的平均抑制率和标准差分别约为14.89和1.14，临界值约为19，即抑制率大于或者等于19，判定为阳性结果，抑制率小于19，则判定为阴性性结果。基于BPV-4E3单抗的间接竞争ELISA方法平均抑制率和标准差分别为15.29和1.29，临界值约为20，即抑制率大于或者等于20，判定其阳性结果，抑制率小于20，则判定为阴性性结果。
2.5.6间接竞争ELISA的特异性评价
通过优化的间接竞争ELISA分别检测BPV、BRV、BVDV、PEDV、IBDV、PPV、PCV和TGEV。结果显示，两种间接竞争ELISA中BPV抑制率最高，其他组的抑制率均小于临界值。表明建立的两种间接竞争ELISA特异性良好。同时，基于BPV-4E3单抗间接竞争ELISA方法中BPV抑制率值略高于基于BPV-1F2单抗间接竞争ELISA方法(如图18所示)。
2.5.7间接竞争ELISA的敏感性评价
通过优化的两种间接竞争ELISA分别检测1:5、1:10、1:20、1:40、1:80、1:160和1:320稀释的BPV细胞培养物(TCID50值为10-3.06/0.1mL)。结果显示，基于BPV-1F2单抗间接竞争ELISA最低检测量为2.5×10-3个TCID50(1:40倍稀释)，基于BPV-1F2单抗间接竞争ELISA的最低检测量为1.25×10-4个TCID50(1:80倍稀释)。所以，基于BPV-4E3单抗间接竞争ELISA方法的敏感性优于基于BPV-1F2单抗间接竞争ELISA方法。
此外，通过间接ELISA和夹心ELISA方法分别检测1:5、1:10、1:20、1:40、1:80、1:160和1:320稀释的BPV细胞培养物(TCID50值为10-3.06/0.1mL)。结果显示，间接ELISA和夹心ELISA方法最低检测量为2.5×10-3个TCID50(1:40倍稀释)，表明建立的基于BPV-4E3单抗间接竞争ELISA的敏感性比间接ELISA和夹心ELISA方法高出一个数量级。
2.5.8间接竞争ELISA的重复性评价
通过优化后的两种间接竞争ELISA方法检测不同批次BPV细胞培养物。对试验数据进行统计学分析，变异系数在3％～6％之间，差异不显著，表明建立的两种间接竞争ELISA方法具有良好的重复性。
2.5.9临床样品的检测结果
通过BPV-4E3单抗建立的间接竞争ELISA方法检测220份临床粪便样品。试验结果显示，阳性样品为14份，与PCR检测结果一致(如图19所示)。
实施例3试剂盒的制备及组装
所述的试剂盒包括以下组分：
1、牛细小病毒单克隆抗体：由保藏编号为CGMCC NO.183011的杂交瘤细胞株分泌产生；
2、牛细小病毒细胞培养物或牛细小病毒VP2蛋白包被的酶标板；
3、HPR标记的山羊抗鼠二抗；
4、封闭液(5％w/v脱脂乳溶液)：称量5g脱脂奶粉，用PBS缓冲溶液定容至100mL，溶解后，4℃保存；
5、洗涤液(PBST缓冲溶液)：称量1mL Tween-20溶液加入到2L PBS缓冲溶液中，混匀，pH调至7.4，室温保存。
6、抗体稀释液(0.5％w/v BSA溶液)：称量0.5gBSA，PBS缓冲溶液定容至100mL，溶解后，4℃保存；
7、TMB显色液：量取等体积A溶液(商品化)和B溶液(商品化)，混匀，现用现配。
8、终止液(2mo1/L浓H2SO4溶液)：量取100mL浓硫酸加到850mL去离子水中，然后定容至1L，室温保存。

Claims (9)

1.分泌牛细小病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其特征在于，所述的杂交瘤细胞株命名为4E3，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNO.18301。
2.由权利要求1所述的杂交瘤细胞株分泌产生的牛细小病毒单克隆抗体。
3.权利要求2所述的牛细小病毒单克隆抗体在制备检测牛细小病毒感染试剂中的用途。
4.一种用于检测牛细小病毒感染的间接竞争ELISA试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中含有权利要求2所述的牛细小病毒单克隆抗体。
5.如权利要求1所述的间接竞争ELISA试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中还包括牛细小病毒细胞培养物或牛细小病毒VP2蛋白包被的酶标板、HPR标记的山羊抗鼠二抗、洗涤液、封闭液、抗体稀释液、显色液以及终止液。
6.如权利要求5所述的间接竞争ELISA试剂盒，其特征在于，所述的洗涤液为PBST缓冲溶液，所述的封闭液为5％w/v脱脂乳溶液，所述的抗体稀释液为0.5％w/v BSA溶液，所述的显色液为TMB底物显色液，所述的终止液为2mo1/L浓H2SO4溶液。
7.如权利要求4-6任一项所述的间接竞争ELISA试剂盒，其特征在于，用于牛细小病毒检测时，所述的试剂盒的使用方法为：
(1)抗原包被：酶标板中加入稀释的VP2蛋白，100μL/孔，37℃孵育2h；
(2)洗板：弃去溶液，每孔加入200μL洗涤液，洗3次，每次5min；
(3)封闭：每孔加入200μL封闭液，37℃作用2h；
(4)洗板：弃去封闭液，每孔加入200μL洗涤液，洗3次，每次5min；
(5)竞争反应：将用抗体稀释液稀释后的权利要求2所述的牛细小病毒单克隆抗体加到含有BPV的样品中，混匀后于37℃孵育1h，将作用后的产物滴加到包被VP2蛋白酶标板中，37℃孵育1h；
(6)洗板：弃去溶液，每孔加入200μL洗涤液，洗3次，每次5min；
(7)孵育二抗：每孔加入100μL用抗体稀释液稀释后的山羊抗鼠IgG-HPR，37℃孵育1h；
(8)洗板：弃去溶液，每孔加入200μL洗涤液，洗3次，每次5min。
(9)显色：每孔加入100μL显色液，37℃孵育10min；
(10)终止显色：每孔加入50μL终止液终止显色，用酶标仪OD450nm读取数值。
8.如权利要求7所述的间接竞争ELISA试剂盒，其特征在于，稀释的VP2蛋白的浓度为0.188μg/0.1mL，权利要求2所述的牛细小病毒单克隆抗体的稀释倍数为1:400，山羊抗鼠IgG-HPR的稀释倍数为1:10000。
9.如权利要求7所述的间接竞争ELISA试剂盒，其特征在于，用酶标仪OD450nm读取数值，并计算抑制率，抑制率大于或者等于20，判定其阳性结果，抑制率小于20，则判定为阴性结果；
抑制率(％)＝(阴性对照(N)OD450nm值-样品(P)OD450nm值)/阴性对照(N)OD450nm×100％值。
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