CN101405033A

CN101405033A - 增强感染性细小病毒载体在昆虫细胞中的生产

Info

Publication number: CN101405033A
Application number: CNA2007800088985A
Authority: CN
Inventors: 理查德·J·萨姆尔斯基; 海峰·E·陈
Original assignee: University of North Carolina System
Current assignee: University of North Carolina System
Priority date: 2006-01-20
Filing date: 2007-01-22
Publication date: 2009-04-08

Abstract

生产包装的细小病毒载体的方法，该方法包括：(a)提供昆虫细胞；(b)将含有核苷酸序列的一个或多种载体导入昆虫细胞，所述核苷酸序列编码：(i)两侧含有TR的转基因；以及(ii)含有Rep组分和Cap组分、足以导致感染性细小病毒粒子包装的杆状病毒包装功能，其中相对于VP2和VP3补充了足以增加感染性病毒粒子的生产的VP1；以及(c)将编码杆状病毒辅助功能的核酸导入细胞以便在昆虫细胞中进行表达；(d)在足以产生包装的感染性细小病毒载体的条件下培养细胞。

Description

增强感染性细小病毒载体在昆虫细胞中的生产

与相关申请的交叉参考

本申请要求2006年1月20日提交的美国临时专利申请No.60/760,812、2006年2月6日提交的美国临时专利申请No.60/765,665、和2006年6月14日提交的美国临时专利申请No.60/804,772的优先权，这些都名为“增强感染性细小病毒载体在昆虫细胞中的生产”，其内容合并在此引为参考。

发明背景

发明领域

本发明涉及细小病毒载体的生产，更具体来说，涉及重组腺相关病毒(rAAV)在昆虫细胞中的生产及其应用。

现有技术的说明

细小病毒(Parvoviridae)科的病毒是小DNA病毒，其特征特别在于它们感染特定宿主的能力。细小病毒科包括两个亚科：感染脊椎动物的细小病毒亚科和感染昆虫的浓核病毒亚科。细小病毒亚科(被称为细小病毒)包括依赖病毒属，其成员的独特性在于，在大多数情况下，这些病毒需要与辅助病毒例如腺病毒或疱疹病毒共感染以造成有效感染。依赖病毒属包括腺相关病毒(AAV)，它们通常感染人类(例如血清型2、3A、3B、5和6)或灵长类(例如血清型1和4)，以及感染其它温血动物的相关病毒(例如牛、犬、马和羊的腺相关病毒)。细小病毒和细小病毒科的其它成员在《费氏病毒学》(FIELDSVIROLOGY，第三版，1996)的第69章，Kenneth I.Bems的“细小病毒科：病毒及其复制(Parvoviridae：The Viruses and Their Replication)”中有一般性的描述。

近年中，由于其有效感染不分裂细胞和分裂细胞的能力、整合到人类基因组中单一染色体位点的能力、以及对人类来说引起相对低的致病风险的能力，AAV作为用于基因治疗的优选病毒载体而出现。鉴于这些优点，重组的腺相关病毒(rAAV)目前正用于B型血友病、恶性黑色素瘤、囊性纤维变性和其它疾病的基因治疗临床试验。

在使用目前的哺乳动物细胞生产系统进行大规模rAAV生产以用于临床试验和商业化中所涉及的困难，即便不是完全令人却步的，也是巨大的。例如，对于某些临床研究来说，可能需要超过10¹⁵个rAAV的粒子。为了生产该数量的rAAV粒子，将需要转染和培养大约10¹¹个培养的人类293细胞，相当于5000个175cm²的摇瓶的细胞。在本技术领域中已经意识到了与使用现有的哺乳动物细胞系生产AAV有关的相关困难。还有一种可能性就是，在哺乳动物细胞培养物中生产的预定用于临床使用的载体会被哺乳动物细胞中存在的不想要的、可能是致病的物质所污染。给使用细小病毒或AAV作为载体进一步增加困难的是，工程化新的载体以及在稳定转染的细胞系中表达所需多肽的整个过程是非常耗时耗力的。此外，最近在使用昆虫细胞生产AAV中的进展导致了生产基本上无感染性的病毒粒子。

因此，对于生产细小病毒载体的改进的方法和工具仍然有着需求。本发明的载体生产系统提高了生产细小病毒载体的过程的简便性和效能。在本技术领域中也存在着对在感染性AAV粒子的生产中使用昆虫细胞的改进的方法的需求。

发明简述

本发明提供了新的方法、宿主细胞和载体构建物，它们通过增加VP1结构组分的表达同时将VP2和VP3结构组分的表达保留在基本正常的水平上，使得感染性rAAV有效地生产。

本发明的一个方面是提供了生产包装的细小病毒载体的方法。总的来说，本发明的方法包括：

(a)提供宿主细胞；

(b)将含有核苷酸序列的一个或多种载体导入宿主细胞，所述核苷酸序列编码：

(i)两侧含有TR的转基因；以及

(ii)病毒包装功能，含有足以导致感染性细小病毒粒子被包装的细小病毒Rep组分和细小病毒Cap组分，其中相对于VP2和VP3补充了足以增加感染性病毒粒子的生产的VP1并处于在宿主细胞中指导表达的调控序列的控制之下；以及

(c)将病毒辅助功能的编码核酸导入昆虫细胞以便在昆虫细胞中进行表达；

(d)在足以产生包装的感染性细小病毒载体的条件下培养宿主细胞。

另一方面，本发明提供了在昆虫细胞中生产rAAV的方法，该方法包括：

(a)提供昆虫细胞；

(b)将含有核苷酸序列的一个或多个细小病毒载体导入昆虫细胞，所述核苷酸序列编码：

(i)两侧含有AAV TR的转基因；以及

(ii)杆状病毒包装功能，含有足以导致感染性细小病毒粒子被包装的AAV Rep组分和AAV Cap组分，其中相对于VP2和VP3补充了足以增加感染性病毒粒子的生产的VP1；以及

(c)将杆状病毒辅助功能的编码核酸导入昆虫细胞以便在昆虫细胞中进行表达；

(d)在足以产生包装的感染性细小病毒载体的条件下培养昆虫细胞。

优选病毒包装功能来自于杆状病毒表达系统。在一个实施方案中，杆状病毒包装系统或载体可以被构建成带有AAV Rep和Cap编码区，这可以通过将这些基因工程化到杆状病毒载体的多角体编码区中并通过转染到宿主细胞中生产病毒重组体来进行。优选宿主细胞是杆状病毒感染的细胞，或其中导入了附加的编码杆状病毒辅助功能的核酸，或其中包含了这些杆状病毒辅助功能。这些杆状病毒可以表达AAV组分，从而促进了病毒壳体的产生。宿主细胞可以包括Sf9和Sf21。

在优选实施方案中，可以对AAV的rep蛋白进行密码子优化，以改变同源性，减少由于同源核苷酸之间的重组事件而产生的不利的或未预料到的基因组变化。因此，当宿主是昆虫细胞时，AAV Rep、AAVCap、VP1、VP2和/或VP3编码区的编码序列可以优选密码子优化，以便在特定的昆虫宿主细胞中表达。因此，例如图12中显示的AAV2Rep52的序列(SEQ ID NO.1)为了在昆虫细胞中表达可以被优化成图13所示(SEQ ID NO.2)；图14中显示的AAV2Rep78的序列(SEQID NO.3)为了在昆虫细胞中表达可以被优化成图15中所示(SEQ IDNO.4)；图16中显示的AAV2壳体2.5的序列(SEQ ID NO.5)为了在昆虫细胞中表达可以被优化成图17中所示(SEQ ID NO.6)；图18中显示的AAV8 VP1的序列(SEQ ID NO.7)为了在昆虫细胞中表达可以被优化成图19中所示(SEQ ID NO.8)；图20中显示的AAV9 VP1的序列(SEQ ID NO.9)为了在昆虫细胞中表达可以被优化成图21中所示(SEQ ID NO.10)；图22中显示的AAV2 VP1的核苷酸序列(SEQID NO.11)可以被突变以优化成图16中所示(SEQ ID NO.5)；图23中显示的AAV2 VP1的氨基酸序列(SEQ ID NO.12)可以被突变以优化成图24中所示(SEQ ID NO.13)。这样，密码子将被优化以用于昆虫细胞。被优化的序列还包括基本上同源的核苷酸序列。

本发明还提供了将用于表达的转基因投送到细胞中的方法，包括给细胞施用含有核苷酸序列的一个或多种载体，所述核苷酸序列编码：

(i)两侧含有TR的转基因；以及

(ii)用于复制Rep组分与Cap组分和包装感染性细小病毒粒子的杆状病毒的辅助功能，其中相对于VP2和VP3补充了足以增加感染性病毒粒子的生产的VP1。

VP1的补充可以通过例如下面所述来实现：

(a)在昆虫细胞中导入含有表达VP1、VP2和VP3的核苷酸序列的Cap载体，并在昆虫细胞中导入含有表达VP1的核苷酸序列的VP1载体；或

(b)在昆虫细胞中导入含有Cap组分的核苷酸序列(用于表达VP1、VP2和VP3)和VP1组分的核苷酸序列的单一载体。

另一方面，本发明提供了将用于表达的转基因投送到细胞中的方法，包括给细胞施用含有核苷酸序列的一个或多个杆状病毒载体，所述核苷酸序列编码：

(i)两侧含有TR的转基因；以及

(ii)用于复制包含在载体中的AAV的Rep组分和AAV的Cap组分的杆状病毒辅助功能，其中相对于VP2和VP3补充了足以增加感染性病毒粒子的生产的VP1。

AAV rep组分可以插入到与Cap组分不同的载体中。或者，附加的VP1组分可以插入到Rep组分或Cap组分的相同载体中。Rep组分可以被包含在单独的载体中。

Cap载体和VP1载体一般可以感染复数(moi)至少为1导入到昆虫细胞中。载体可以同时或顺序导入到细胞中，优选以引起感染性病毒的生产增加的足够量同时导入。

在一个实施方案中，VP1载体的表达控制序列与Cap载体的表达控制序列相比提供的表达相对较弱。例如，合适的VP1载体表达是Cap载体的表达的大约1％到大约75％、Cap载体表达的大约1％到大约50％、或Cap载体的表达的大约1％到大约25％。较弱的表达可以通过例如使用突变的多角体启动子来提供。理想的是，补充VP1导致产生了大约10∶10∶80 VP1∶VP2∶VP3的分子比率。补充VP1可以导致产生的包装的感染性细小病毒载体的量比没有进行补充的相应方法高出了大约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、15、160、170、180、190或200倍。

用于本方法的昆虫细胞优选来自鳞翅目(lepidoptera)或从该目的细胞衍生而来。优选昆虫细胞来自夜蛾(Spodoptera)或夜蛾(Trichopulsia)属，例如草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)或粉纹夜蛾(Trichopulsia ni)。优选的细胞系包括源自于上述任何昆虫的SF9、SF21、High Five^TM细胞(BRI-TN-5B1-4)、Mimic-SF9细胞。

在另一方面，本发明提供了含有至少一种载体的重组宿主细胞，其中至少一种载体含有的核苷酸序列编码：

两侧含有细小病毒TR的转基因；以及

足以导致感染性细小病毒粒子包装的杆状病毒包装功能和细小病毒Rep和Cap组分，其中相对于VP2和VP3来说补充了足以增加感染性病毒粒子生产的VP1。

在还一方面，本发明提供了用于表达病毒粒子的试剂盒，其中所述试剂盒含有至少两种载体，其中所述载体含有的核苷酸序列编码：

两侧含有细小病毒TR的转基因；以及

足以导致感染性细小病毒粒子包装的杆状病毒包装功能，含有细小病毒Rep组分和Cap组分，其中相对于VP2和VP3来说补充了足以增加感染性病毒粒子生产的VP1。

该试剂盒还可以含有昆虫细胞和用于在昆虫细胞中进行表达的编码杆状病毒辅助功能的核酸。

附图简述

图1显示了可以用于AAV生产的四种重组杆状病毒。

图2显示了在昆虫细胞中产生的载体的较低VP1/VP3比率。

图3显示了通过用表达VP1的杆状病毒进行共感染而产生的细胞裂解液中增加的VP1水平。

图4显示了用表达VP1的杆状病毒感染的细胞产生的病毒粒子中增加的VP1水平。

图5显示了用在Sf9和293细胞中产生的AAV2.5-GFP载体转导HepG2细胞的结果。

图6显示了通过加入额外的2.5VP1导致的AAV-2.5GFP感染性的增加。

图7显示了另外四种可以用于AAV生产的重组杆状病毒，其中的载体显示出包含了末端重复(ITR)和启动子。

图8显示了用于生产感染性AAV的系统，其中所述系统只包含三种载体，其中编码VP1、VP2和VP3的基因与AAV复制组分一起包含在同样的载体中。

图9显示了用于生产感染性AAV的系统，其中所述系统只包含两种载体，其中编码VP1、VP2和VP3的基因与AAV复制组分一起包含在同样的载体中，而第二种载体包含了GFP的基因和其它用于增加VP1表达的基因。

图10显示了生产感染性AAV的系统，其中所述系统只包含两种载体，其中复制组分包含在每种载体上。

图11显示了用于生产感染性AAV的系统，其中所述系统包含两种载体，其中复制组分包含在单种载体中，而编码VP1、VP2和VP3的基因与其它用于增加VP1表达水平的基因包含在同样的载体中。

图12显示了编码AAV2Rep52蛋白的核苷酸序列(SEQ ID NO.1)。

图13显示了为编码AAV2 Rep52蛋白在昆虫细胞中表达而优化的核苷酸序列(SEQ ID NO.2)。

图14显示了编码AAV2 Rep78蛋白的核苷酸序列(SEQ ID NO.3)。

图15显示了为编码AAV2 Rep78蛋白在昆虫细胞中表达而优化的核苷酸序列(SEQ ID NO.4)。

图16显示了编码AAV病毒壳体2.5的核苷酸序列(SEQ ID NO.5)。

图17显示了为编码AAV病毒壳体2.5在昆虫细胞中表达而优化的核苷酸序列(SEQ ID NO.6)。

图18显示了编码AAV8 VP1蛋白的核苷酸序列(SEQ ID NO.7)。

图19显示了为编码AAV8 VP1蛋白在昆虫细胞中表达而优化的核苷酸序列(SEQ ID NO.8)。

图20显示了编码AAV9 VP1蛋白的核苷酸序列(SEQ ID NO.9)。

图21显示了为编码AAV9 VP1蛋白在昆虫细胞中表达而优化的核苷酸序列(SEQ ID NO.10)。

图22显示了编码AAV2 VP1 Cap蛋白的核苷酸序列(SEQ ID NO.11)。

图23显示了AAV2 VP1 Cap蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO.12)。

图24显示了昆虫细胞中AAV2.5 VP1 Cap蛋白的氨基酸序列(SEQID NO.13)。

发明具体内容

定义

除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语与本发明所属领域中的普通技术人员所通常理解的意义相同。用于本发明的描述中的术语仅仅是出于描述具体实施方案的目的，并不打算对本发明进行限制。当用于本发明的说明书和随附的权利要求中时，单数形式的″a″、″an″和″the″意在也包含了复数的形式，除非文中另有明确指示。所有在本文中提及的出版物、专利申请、专利和其它的参考文献以其全文引为参考。

″AAV Cap″是指AAV Cap蛋白VP1、VP2和VP3及其类似物。

″AAV Rep″是指AAV Rep蛋白及其类似物。

″AAV TR″是指回文序列，包含基本上互补的、对称排列的序列，包括天然的AAV TR的类似物及其类似物。

“生物学有效的”对于病毒载体的量来说，是指足以导致感染(或转导)和转基因在靶细胞中表达的量。

“嵌合的”对于病毒壳体或粒子来说，是指壳体或粒子包含来自不同细小病毒、优选不同AAV血清型的序列，如同Rabinowitz等在2002年12月10日授权的美国专利6,491,907、标题为“重组细小病毒载体以及制造方法(Recombinant parvovirus vectors and method ofmaking)”中所描述的那样，其公开内容在此以其全文引为参考。

“依赖病毒”是指众所周知的包含腺相关病毒(AAV)的属，包括但不限于1型AAV、2型AAV、3型AAV、4型AAV、5型AAV、6型AAV、鸟AAV、牛AAV、犬AAV、马AAV和羊AAV。参见例如Bernard N.Fields等的《病毒学》(Virology)第二卷第69章(第三版，Lippincott-Raven Publishers)，其全部内容在此引为参考。

“双链体载体”在本文中可以与“二聚的”或“自身互补的”载体交换使用。双链体细小病毒粒子可以包含，例如，含有病毒粒子DNA(vDNA)的细小病毒壳体。该vDNA是自身互补的，因此当从病毒壳体中释放时它可以形成发夹结构。双链体vDNA表现出为宿主细胞提供不需要常规的细小病毒载体所需的第二链合成就可以被宿主细胞表达(即转录和任选翻译)的双链DNA。适合用于本发明的双链体载体的例子在以Samulski等的名义于2004年2月12日出版的美国专利公布No.2004/0029106、题目为“双链体细小病毒载体(Duplexedparvovirus vectors)”中有描述，其全部公开内容在此合并引为参考。双链体载体基因组优选含有足够的包装序列，以便包入选定的细小病毒壳体(例如AAV壳体)中。本领域的专业技术人员将会认识到，双链体vDNA可以不是在所有条件下都以双链形式存在，但是在有利于互补的核苷酸碱基退火的条件下有此能力。“双链体细小病毒粒子”包括杂交的、嵌合的和定向的病毒粒子。优选双链体细小病毒粒子具有AAV壳体，如上所述，它还可以是嵌合的或定向的壳体。

“表达控制序列”是指调节与其可操作连接的核苷酸序列的表达的一个或多个核酸序列。当表达控制序列控制和/或调节核苷酸序列的转录和/或翻译时，该表达控制序列与该核苷酸序列是“可操作连接的”。表达控制序列的元件可以包括例如启动子、增强子、内部核糖体进入位点(IRES)、转录终止子、起始密码子、内含子剪接信号和终止密码子。术语“表达控制序列”意在至少包含被设计用于影响表达的序列，也可以包含其它与转录、翻译、易位、分泌、分离等有关的元件，例如前导序列和融合配偶序列。表达控制序列优选被设计用于最小化或消除不需要的框架内和外的潜在起始密码子以及不需要的潜在剪接位点。可以包含序列例如多聚腺苷化序列(pA)以提供添加的polyA尾巴，mRNA 3’末端的腺嘌呤残基链，该序列被称为polyA序列。表达控制序列可以被设计成增加mRNA的稳定性。在昆虫细胞中影响转录和翻译稳定性的表达控制序列例如启动子、以及影响翻译的序列例如Kozak序列，是已知的。表达控制序列可以被设计成通过按需增加或降低表达水平来调节与它们可操作连接的核苷酸序列的表达。

“带侧翼的”对于侧翼有其它的元件的序列来说，是指相对于序列来说，在上游和/或下游、即5’和/或3’存在一个或多个侧翼元件。术语“带侧翼的”不是为了表示序列必需是连续的。例如，在编码转入基因和侧翼元件的核酸之间可以有间插序列。“侧翼”带有两个其它元件(例如TR)的序列(例如转基因)，是指一个元件位于序列的5′端，另一个位于序列的3’端；但是，其间可以有间插序列。

“杂交体”对于病毒粒子来说，是指病毒TR和病毒壳体来自不同细小病毒的病毒粒子。优选病毒TR和壳体来自AAV的不同血清型(例如，在国际专利公布WO 00/28004以及Chao等，(2000)MolecularTherapy 2：619中描述的；其公开内容在此以其全文合并。

“与昆虫细胞相容的”对于病毒载体、辅助功能或包装功能来说，是指促进昆虫细胞被核酸转化或转染和/或在该昆虫细胞中表达异源核酸的任何核酸序列。

“包装的病毒载体”等是指其功能是作为核酸序列的投送载体的病毒粒子、例如细小病毒粒子，例如含有转基因和侧翼带有TR的相关表达控制序列、包装在病毒壳体中的重组病毒载体。

“细小病毒”是指细小病毒科，包括但不限于自主复制的细小病毒和依赖病毒。自主细小病毒包括细小病毒属、红病毒(Erythrovirus)属、浓核病毒(Densovirus)属、重复病毒(Iteravirus)属和Contravirus属的成员。示例的自主细小病毒包括但不限于小鼠细小病毒、牛细小病毒、犬细小病毒、鸡细小病毒、猫泛白细胞减少症病毒、猫细小病毒、鹅细小病毒和B19病毒。其它的自主细小病毒对于本领域的专业技术人员来说是熟知的。参见例如Bernard N.Fields等的《病毒学》(Virology)第二卷第69章(第三版，Lippincott-Raven Publishers)；S.J.Flint等的《病毒学原理》(Principles of Virology)(第二版，ASMPress，2004)中关于细小病毒科特征的叙述。各种不同的自主细小病毒以及AAV的不同血清型的基因组序列(和相应的氨基酸序列)、以及TR与Cap和Rep多肽的序列在本技术领域中是已知的。这样的序列可以在文献或公共数据库例如GenBank中发现。参见例如GenBank登记号NC 002077、NC 001863、NC 001862、NC 001829、NC 001729、NC 001701、NC 001510、NC 001401、AF063497、U89790、AF043303、AF028705、AF028704、J02275、J01901、J02275、X01457、AF288061、AH009962、AY028226、AY028223、NC 001358、NC 001540，其公开内容在此以其全文引为参考。也参见例如Chiorini等，(1999)J.Virology 73：1309；Xiao等，(1999)J.Virology 73：3994；Muramatsu等，(1996)Virology 221：208；国际专利公布WO 00/28061、WO 99/61601、WO 98/11244；以及美国专利No.6,156,303，它们的公开内容在此以其全文引为参考。关于AAV1、AAV2和AAV3 TR序列的早期描述由匹兹堡大学(University of Pittsburgh)的Xiao，X.在其1996年的PhD论文“腺相关病毒(AAV)DNA复制和整合的性质(Characterization ofAdeno-associated virus(AAV)DNA replication and integration)”中提供，其公开内容在此以其全文引为参考。在后面的部分中将对病毒载体和病毒壳体进行更详细的描述。

除非特别指明，“多肽”包括肽和蛋白。

“重组体”是指与自然界中通常发现的不同的遗传实体。当用于多聚核苷酸或基因时，它是指多聚核苷酸是克隆、限制和/或连接步骤与其它导致产生与自然界中发现的多聚核苷酸不同的构建物的程序的各种组合的产物。

“重组病毒载体”是指含有一个或多个异源序列(即不是病毒来源的多聚核苷酸序列)的重组多聚核苷酸载体。在重组细小病毒载体的情况下，重组多聚核苷酸侧翼具有至少一个、优选两个反向末端重复序列(ITR)。

“基本同源性”或“基本相似性”当用于核酸或其片段时，是指适当的核苷酸插入片段或删除片段与另一个核酸(或其互补链)进行最适比对时，序列中至少大约95％到99％的核苷酸序列是一致的。

“定向的”对于病毒壳体或粒子来说，是指具有趋向性的壳体或粒子，例如在国际专利公布No.WO 00/28004中描述的那样，该专利的全部公开内容在此引为参考。

“治疗性多肽”或“治疗性产物”是指可以缓解、减轻或延迟由于在细胞或对象中多肽缺少或缺陷而产生的症状发作的多肽。或者，“治疗性多肽”指以其他方式给予对象益处的多肽，例如抗癌症效果或改进移植存活性。

细胞被病毒“转导”或“感染”是指病毒进入细胞建立起潜伏的或活性的(即裂解)感染。

细胞的“转染”是指遗传物质被导入细胞以对细胞进行遗传修饰。转染可以通过本技术领域已知的各种方法来完成，例如转导或电穿孔。

“转基因”在广义上用于指任何整合到病毒载体中以在靶细胞中表达的异源核苷酸序列和相关的表达控制序列，例如启动子。本领域的专业技术人员会认识到可以根据在靶细胞中促进转基因表达的能力来选择表达控制序列。转基因的例子是编码治疗性多肽的核酸。

“载体”是指含有准备投送到宿主细胞中的多聚核苷酸的重组质粒或病毒，既可以是体外的也可以是体内的。

本文描述的发明总的来说涉及了用于生产包装的细小病毒载体的细胞、遗传构建物、方法和策略。细小病毒载体作为研究基因和多肽表达的研究工具是高度有用的，在基因治疗领域中也显示出了良好的前途。但是，使用细小病毒载体进行工作在技术上具有挑战性，并且耗费时间，此使得它们的使用比理想的效率和成本效益要低。使用细小病毒载体的一个具体障碍是生产感染性细小病毒粒子所需的耗时耗力的过程。本发明的生产策略总的来说涉及培养本发明的包装细胞以产生被包装的病毒载体。本发明的包装细胞总的来说包括具有下面的包装细胞功能的细胞：(1)病毒载体功能，(2)包装功能，以及(3)辅助功能。AAV的生产方法总的来说包括(1)提供组分功能，(2)将组分功能导入相容的细胞，以及(3)将细胞维持在足以产生AAV的条件下。每个包装细胞功能将在后面的部分中讨论。本发明的方法可用于生产包装的病毒载体。总的来说，包装的病毒载体包括包装在壳体例如细小病毒壳体、定向的AAV壳体、或嵌合的AAV壳体中的病毒载体。病毒载体和病毒壳体以及包装的病毒载体的组分将在下面的部分中更全面地讨论。

包装细胞

如上所述，本发明的包装细胞一般来说包括具有下列包装细胞功能的细胞：(1)病毒载体功能，(2)包装功能，(3)辅助功能，以及(4)相关的表达控制序列。在生产过程中，包装细胞一般包括一种或多种病毒载体功能以及包装功能和辅助功能，足以导致病毒载体的表达和包装。这些不同的功能可以使用遗传构建物例如质粒或扩增子，一起或分别提供给包装细胞，它们在细胞系中可以存在于染色体外，或整合到细胞的染色体中。细胞系可以提供有任何一种或多种已经掺入的所述功能，例如细胞系具有一种或多种掺入到染色体外或整合到细胞染色体DNA中的载体功能，细胞系具有一种或多种掺入到染色体外或整合到细胞染色体DNA中的包装功能，或细胞系具有掺入到染色体外或整合到细胞染色体DNA中的辅助功能。编码包装细胞功能例如转座蛋白的核苷酸序列与至少一个用于在昆虫细胞中表达的表达控制序列可操作地连接。

任何将一个或多个带有包装细胞功能的核苷酸序列导入用于复制和包装的细胞宿主的方法都可以使用，包括但不限于电穿孔、磷酸钙沉淀、微注射、阳离子或阴离子脂质体、以及脂质体与核定位信号相结合。在使用病毒载体通过转染提供包装功能的实施方案中，可以使用用于产生病毒感染的标准方法。

本发明的核苷酸序列可以稳定地导入昆虫染色体中。可以通过例如使用含有与昆虫基因组的区域高度同源的核苷酸序列的载体来帮助将本发明的核苷酸序列掺入到基因组中。使用特异的序列，例如转座子，是将核苷酸序列导入基因组的另一种方法。通常，通过通常由加入到细胞中的核酸序列编码的标记物基因的表达来选择或鉴定经历了这种“转化”、即将核酸序列加入到细胞中的细胞。然后可以通过例如Southern印迹或聚合酶链反应(PCR)方法来确定核酸序列掺入到基因组中。

病毒载体功能

本发明的包装病毒载体的病毒载体组分一般包括至少一个转基因和用于控制转基因表达的相关表达控制序列。病毒载体可以包括足以确保转基因整合到靶细胞的基因组中的顺式作用功能。一般来说，病毒载体包含一部分细小病毒基因组，例如缺失了rep和cap并用转基因及其相关表达控制序列代替的AAV基因组。转基因一般侧翼有两个AAV TR，代替了缺失的病毒rep和cap的ORF。包含了适当的表达控制序列，例如组织特异性启动子和其它适合用于促进转基因在靶细胞中组织特异性表达的调控序列。转基因一般是可以表达以产生治疗性多肽或标记物多肽的核酸序列。病毒载体可以是任何适合的核酸构建物，例如DNA或RNA构建物，可以是单链的、双链的或双链体。

病毒载体功能可以被适合地提供为双链体载体模板，正如在Samulski等的美国专利公布No.2004/0029106中描述的那样(全部公开内容在此引为关于其教导的双链体载体的参考)。双链体载体是二聚体自身互补的(sc)多聚核苷酸(一般为DNA)。例如，可以选择双链体载体的DNA以便由于链内碱基配对形成双链发夹结构。双链体DNA载体的双链可以包装在病毒壳体内。双链体载体提供了可以与双链DNA病毒载体相比较的功能，可以减少对靶细胞合成通常由病毒包壳的单链基因组的互补DNA的需要。

被选择用于病毒载体的TR(可分解的和不可分解的)优选为AAV序列，优选具有血清型1、2、3、4、5和6。可分解的AAV TR不需要有野生型TR序列(例如，野生型序列可以通过插入、缺失、截短或错义突变来改变)，只要TR介导所需的功能例如病毒包装、整合和/或原病毒拯救等就行。TR可以是作为AAV反向末端重复序列起作用的合成序列，例如在Samulski等的美国专利No.5,478,745中描述的“双D序列”，该专利的全部公开内容以其全文引为参考。典型情况下、但不是必需的，TR来自同样的细小病毒，例如，两个TR序列都来自AAV2。

包装功能

包装功能包括用于病毒载体的复制和包装的基因，例如AAV rep和cap。包装功能可以包括例如对于病毒基因表达、病毒载体复制、病毒载体从整合状态的拯救、病毒基因表达以及病毒载体包装到病毒粒子中来说必需或有用的功能。包装功能可以使用遗传构建物，例如质粒或扩增子，一起或分开提供给包装细胞。包装功能可以存在于包装细胞中染色体之外，但是优选整合到细胞的染色体DNA中。

杆状病毒包装功能可以包括产生重组杆状病毒所需的功能，例如在

表达系统(Invitrogen)中发现的和Luckow等，1993，J.Virol.67，4566中描述的，包括含有Gus和/或CAT基因、表达β-葡糖苷酸酶和/或氯霉素乙酰转移酶的控制表达质粒，用于生产重组杆状病毒。

来自一种以上AAV血清型的序列可以被合并用于生产AAV。例如，AAV TR核苷酸序列可以来自一种血清型，例如AAV2，而任何其它的核苷酸序列可以包括来自一种或多种其它血清型例如血清型3的开放阅读框架或编码序列。AAV血清型1、2、3、4和5是用于本发明情况下AAV核苷酸序列的合适来源的例子。

壳体组分

包装功能包括壳体组分。壳体组分优选来自细小病毒壳体，例如AAV壳体或嵌合的AAV壳体功能。适合的细小病毒壳体组分的例子是来自细小病毒科例如自主细小病毒或依赖性病毒的壳体组分。例如，壳体组分可以选自AAV壳体，例如AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5和/或AAV6壳体。壳体组分可以包括来自两种或多种AAV壳体的组分。

此外，本发明人吃惊地发现相对于VP2和VP3补充VP1导致产生更高百分率的感染性粒子。在一个实施方案中，细胞中补充的VP1感染复数为培养物中至少100％的细胞提供了大约1、2或3的额外VP1载体。无论VP1补充是怎样完成的，该方法比不补充的情况产生了高出至少大约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、15、160、170、180、190或200倍的感染性病毒粒子。

应该认识到这种VP1补充可以以各种方式完成。例如，本发明的方法可以包括(a)提供昆虫细胞；(b)将含有下列的编码核苷酸序列的一种或多种载体导入昆虫细胞：(i)侧翼有TR的转基因；以及(ii)包括的Rep组分和Cap组分足以导致感染性细小病毒粒子包装的杆状病毒包装功能，其中相对于VP2和VP3补充VP1，足以增加感染性病毒粒子的生产；(c)将用于在昆虫细胞中表达的杆状病毒辅助功能的编码核酸导入细胞；以及(d)将细胞在足以产生包装的感染性细小病毒载体的条件下培养。在下面实施例阐述的一种方法中，一个Cap载体提供VP1/VP2/VP3，第二个VP1载体补充由Cap载体产生的VP1。因此，在该方法中，补充可以如下实现：(a)在昆虫细胞中导入含有一种或多种表达VP1、VP2和VP3的核苷酸序列的Cap载体；以及(b)在昆虫细胞中导入含有表达VP1的核苷酸序列的VP1载体。Cap载体和VP1载体一般以至少1的感染复数导入到昆虫细胞中。

本发明人发现，VP1的过表达可以导致高水平的粒子降解。因此，在本发明的一个实施方案中，VP1载体的表达控制序列与Cap载体的表达控制序列相比，提供了相对较弱的表达。例如，合适的VP1载体表达是Cap载体表达的大约1％到大约75％、Cap载体表达大约1％到大约50％、或Cap载体表达的大约1％到大约25％。较弱的表达可以使用例如所提供的突变的多角体启动子来提供。理想情况下，VP1的补充导致产生了大约10∶10∶80 VP1∶VP2∶VP3的分子比率。VP1的补充可以导致产生的包装的感染性细小病毒载体的量比不进行补充的相应方法高出大约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、15、160、170、180、190或200倍。

壳体组分的选择一般是根据例如靶细胞类型、所需的表达水平、所表达的异源核苷酸序列的性质、与病毒生产有关的问题等考虑因素。例如，使用AAV1壳体对于靶向骨骼肌、肝脏和中枢神经系统(例如脑)的细胞可能是有利的；AAV5用于靶向气道和肺的细胞；AAV3用于靶向骨髓细胞；AAV4用于脑的特定细胞(例如可增补的细胞)。一整套AAV VP壳体蛋白包括VP1、VP2和VP3。含有编码AAV VP壳体蛋白的核苷酸序列的ORF可以含有少于整套的VP蛋白。但是，在优选实施方案中提供了整套的VP蛋白。VP壳体蛋白可以提供在同样载体和/或在不同载体上的不同ORFs中。

在更优选的实施方案中，一种或多种VP壳体蛋白是嵌合的蛋白，含有来自两种或多种病毒、优选为两种或多种AAV的氨基酸序列，正如在Rabinowitz等2002年12月10日被授权的标题为“重组细小病毒载体和制造方法(Recombinant parvovirus and method of making)”的美国专利6,491,907中描述的那样，该专利的全部公开内容在此以其全文引为参考。

例如，嵌合病毒壳体可以包括来自腺相关病毒(AAV)的壳体区域和来自B19病毒的至少一个壳体区域。嵌合的壳体可以包括例如具有一个或多个B19壳体亚基的AAV壳体，例如AAV壳体亚基可以被B19壳体亚基所取代。例如，在优选实施方案中，AAV的VP1、VP2或VP3亚基可以被B19的VP1、VP2或VP3亚基所取代。作为另一个例子，嵌合的壳体可以包含2型AAV壳体，其中的2型VP1亚基被来自1、3、4、5或6型AAV壳体、优选为3、4或5型壳体的VP1亚基所取代。或者，嵌合的细小病毒具有2型AAV壳体，其中的2型VP2亚基已经被来自1、3、4、5或6型AAV壳体、优选为3、4或5型壳体的VP2亚基所取代。同样的，其中来自1、3、4、5或6型(更优选为3、4或5型)AAV的VP3亚基取代了2型AAV壳体的VP3亚基的嵌合细小病毒是优选的。作为另一种替代方案，其中两个2型AAV亚基被来自不同血清型AAV(例如1、3、4、5或6型AAV)的亚基所取代的嵌合细小病毒是优选的。在本实施方案的示例的嵌合细小病毒中，2型AAV的VP1和VP2、或VP1和VP3、或VP2和VP3亚基被不同血清型的AAV(例如1、3、4、5或6型AAV)的相应亚基所取代。同样地，在其它的优选实施方案中，嵌合细小病毒具有1、3、4、5或6型AAV壳体(优选为2、3或5型壳体)，其中的一个或两个亚基已经被来自不同血清型者所取代，正如前面对2型AAV所描述的那样。

在其它实施方案中，一个细小病毒的次要亚基可以用其它细小病毒的任何次要亚基所取代(例如，2型AAV的VP2可以用3型AAV的VP1取代；B19的VP1可以取代AAV的VP1和/或VP2)。同样的，一个细小病毒的主要壳体亚基可以用其他细小病毒的主要壳体亚基所取代。本发明还提供了含有AAV壳体的嵌合细小病毒，其中在主要VP3亚基中的环状区被自主细小病毒的主要亚基的环状区(优选为相应的环状区)所取代。具体来说，来自1、2、3、4、5或6型AAV的VP3亚基的环状区1、2、3和/或4被自主细小病毒的主要亚基的环状区所取代。

特别优选的嵌合病毒壳体包括AAV2.5壳体，它含有编码AAV2.5VP1壳体蛋白的核苷酸序列，其中所表达的蛋白具有下列的突变：263Q→A；265插入T；705N→A；708V→A；以及716T→N(SEQ ID NO.13)。

复制组分

包装功能也包括复制组分。例如，复制组分可以包括Rep78、Rep68、Rep52、Rep40和/或其各种类似物。使用少于4种Rep酶是可能的，例如只有Rep78/Rep68酶之一和只有Rep52/Rep40酶之一。优选情况下，在昆虫细胞中表达的Rep序列是Rep78和Rep52。

辅助功能

包装细胞功能也包括辅助功能。辅助功能包括建立包装细胞的活性感染所需的辅助病毒元件。辅助功能的存在对于启动病毒载体的包装来说是需要的。例子包括来自腺病毒、杆状病毒和/或疱疹病毒的足以导致病毒载体包装的功能。例如，腺病毒辅助病毒功能一般包括腺病毒组分E1a、E1b、E2a、E4和VA RNA。包装功能可以通过用所需的病毒感染包装细胞来提供。包装功能可以使用遗传构建物例如质粒或扩增子，一起或分别提供给包装细胞。包装功能可以存在于包装细胞中染色体之外，但是优选整合到细胞的染色体DNA中。

感染复数(MOI)和感染时间将依赖于使用的病毒类型和使用的包装细胞系。可以使用任何适合的辅助载体。该载体可以通过本领域已知的任何适合的方法导入到包装细胞中。在昆虫细胞用作包装细胞的优选方法中，杆状病毒可以用作辅助病毒。

适合的提供辅助功能的方法使用了带有有效生产AAV所需的所有辅助基因的非感染性腺病毒小质粒(Ferrari等，(1997)Nature Med.3：1295；Xiao等，(1998)J.Virology 72：2224)。使用腺病毒小质粒获得的rAAV滴度比使用野生型腺病毒感染的常规方法获得的滴度高40倍(Xiao等，(1998)J.Virology 72：2224)。这种方法避免了需要用腺病毒进行共转染(Holscher等，(1994)，J.Virology 68：7169；Clark等，(1995)Hum.Gene Ther.6：1329；Trempe和Yang，(1993)，在第5次细小病毒专题讨论会中，Crystal River，Fla.)。

在AAV包装方法中疱疹病毒也可以用作辅助病毒。编码AAV Rep蛋白的杂交体疱疹病毒可以有利地促进可更加放大的AAV载体生产计划。已经描述了表达AAV-2 rep和cap基因的I型杂交单纯性疱疹病毒(HSV-I)载体(Conway等，(1999)Gene Therapy 6：986和WO 00/17377，其公开内容在此以其全文引入)。

将带有辅助功能的核苷酸序列导入用于复制和包装的细胞宿主的任何方法都可以使用，包括但不限于电穿孔、磷酸钙沉淀、微注射、阳离子或阴离子脂质体、以及脂质体与核定位信号的组合。在通过使用病毒载体转染或使用辅助病毒感染而提供辅助功能的实施方案中，可以使用标准的产生病毒感染的方法。

表达控制序列

病毒载体功能、包装功能和辅助功能每个都与一个或多个相关的表达控制序列、例如一个或多个启动子序列、翻译起始序列和终止密码子可操作地连接。为了在昆虫细胞中进行生产，可以使用与昆虫细胞基因表达相容的转录启动子。对表达控制序列进行选择以最大化感染性病毒粒子的生产。

细胞系

用作包装细胞的优选细胞系是昆虫细胞系，优选来自鳞翅目的细胞或从该目细胞衍生的细胞。任何允许AAV复制并可以在培养中维持的昆虫细胞都可以用于本发明中。优选昆虫细胞来自夜蛾(Spodoptera或Trichopulsia)属。例子包括草地贪夜蛾，例如Si9或Sf21细胞系、果蝇(Drosophila)属的细胞系、或蚊子细胞系，例如白纹伊蚊(Aedesalbopictus)衍生的细胞系。优选的细胞系是草地贪夜蛾Sf9细胞系。其它的例子包括High Five^TM细胞(BRI-TN-5B1-4)和Mimic-SF9细胞。从任何本文列出的细胞衍生的细胞也可以用于本发明的实践中。

下面的参考文献在此因它们关于使用昆虫细胞进行异源多肽表达、将核酸导入这样的细胞的方法以及在培养中维持这样的细胞的方法而引为参考：《分子生物学方法》(Methods in Molecular Biology)，Richard主编，Humana Press，NJ(1995)；O′Reilly等，《杆状病毒表达载体：实验室手册》(Baculovirus Expression Vectors：A LaboratoryManual)，Oxford Univ.Press(1994)；Samulski等，J.Vir.63：3822-8(1989)；Kajigaya等，Proc.Nat′l.Acad.Sci.USA 88：4646-50(1991)；Ruffing等，J.Vir.66：6922-30(1992)；Kimbauer等，Vir.219：37-44(1996)；Zhao等，Vir.272：382-93(2000)；以及Samulski等，美国专利No.6,204,059。

生长细胞

昆虫细胞在培养物中的生长条件以及在培养中异源产物在昆虫细胞中的生产描述在Richard(1995)，同上；O′Reilly等，(1994)同上；Samulski等，(1989)同上；Kajigaya等，(1991)同上；Ruffing等，(1992)同上；Kirnbauer等，(1996)同上；Zhao等，(2000)同上；以及Samulski等，美国专利No.6,204,059。

生产策略

本发明提供了制造包装的病毒载体的方法。该方法一般包括将下列的包装细胞功能导入昆虫细胞：(1)病毒载体功能，(2)包装功能，(3)辅助功能，以及(4)相关的表达控制序列。这些功能应该足以导致有被囊的病毒载体的产生。在本发明的范围内，提供这些功能的各种构造是可能的。在每种情况下，获得的包装细胞然后被孵育以产生被包装的病毒载体，然后使用在本技术领域中已知的分离技术分离包装的病毒载体。

将带有病毒载体功能、包装功能和辅助功能的核苷酸序列导入用于复制和包装的细胞宿主的任何方法都可以使用，包括但不限于电穿孔、磷酸钙沉淀、微注射、阳离子或阴离子脂质体、以及脂质体与核定位信号的组合。在通过使用病毒载体转染提供病毒载体功能的实施方案中，可以使用标准的产生病毒感染的方法。

获得的包装细胞本身是本发明的一个方面。本发明也包含了制造感染性AAV粒子的方法，其中包装细胞被维持在足以产生感染性粒子的条件下。

包装的病毒载体的纯化

不含有污染性辅助病毒的载体保存物可以通过本技术领域任何已知的方法来获得。例如，双链体病毒和辅助病毒可以易根据大小区分开。也可以根据对肝素底物的亲和性将双链体病毒与辅助病毒分开(Zolotukhin等(1999)Gene Therapy 6：973)。优选使用缺失的复制缺陷性辅助病毒，以便任何污染性辅助病毒不是复制成分。另一种替代方法是可以使用缺少晚期基因表达的腺病毒辅助病毒，因为介导双链体病毒的包装只需要腺病毒早期基因表达。晚期基因表达缺陷的腺病毒突变体在本技术领域中是已知的(例如ts100K和ts149腺病毒突变体)。

目的产物

一般来说，目的产物是基因产物，它可以是多肽、RNA分子或其它希望在哺乳动物细胞或昆虫细胞中表达的基因产物。目的产物可以包括例如用作标记物多肽以评估细胞的转化和表达的多肽、融合蛋白、具有所需生物活性的多肽、可以弥补遗传缺陷的基因产物、RNA分子、转录因子、以及其它在调控和/或表达中有影响的基因产物。例如，目的基因产物包括了提供所需效果或调控功能的核苷酸序列(例如转座子、转录因子)。目的基因产物的例子包括但不限于：激素受体(例如盐皮质激素、糖皮质激素和甲状腺激素受体)；膜内蛋白(例如TM-1和TM-7)；细胞内受体(例如孤儿受体、类视黄醇受体、维生素D3和维生素A受体)；信号分子(例如激酶、转录因子或分子例如信号转导蛋白和细胞因子超家族(例如红细胞生成素、生长激素、干扰素、和白细胞介素、和集落刺激因子)的转录受体的激活剂)；G-蛋白偶联受体，例如激素、降钙素、肾上腺素、胃泌素以及旁分泌或自分泌介质，例如生长抑素(stomatostatin)或前列腺素；神经递质受体(去甲肾上腺素、多巴胺、5-羟色胺或乙酰胆碱)；病原性抗原，可以是病毒、细菌、过敏原或癌性来源的抗原；以及酪氨酸激酶受体(例如胰岛素生长因子和神经生长因子)。目前在AAV介导的基因治疗试验中使用的基因产物也是重要的基因产物(例如CFTR和因子IX)。

目的基因产物可以是治疗性基因产物。治疗性基因产物是当在靶细胞中表达时提供所需治疗效果的多肽、RNA分子或其它基因产物，这些治疗效果例如除去被感染的细胞、表达具有所需生物活性的多肽、和/或表达用于反义治疗的RNA分子(例如调控靶细胞基因组中的内源或异源基因的表达)。例如Goldsmith等的WO 90/07936描述了一种在组织中除去特定细胞的系统，这是通过使用只能在该组织中被激活的启动子以仅在所需细胞中表达治疗性基因产物来进行的。例如，在将要接受异源移植(heterologous transplant)或移植(graft)的患者中，可以施用针对靶向移植物的T细胞的毒素的编码多核苷酸。

AAV蛋白可以是目的基因产物。例如，Rep蛋白序列，例如Rep78或Rep68或其功能性片段，可以是在哺乳动物细胞或昆虫细胞中表达的目的基因产物。编码Rep78和/或Rep68的核酸序列，如果存在于病毒载体中并在用本发明产生的rAAV转导的哺乳动物细胞或昆虫细胞中表达的话，可以将rAAV整合到被转导的哺乳动物细胞或昆虫细胞的基因组中。通过使任何其它的用rAAV导入到细胞中的目的基因产物长期或永久表达，Rep78和/或Rep68在rAAV转导或感染的哺乳动物细胞或昆虫细胞中的表达可以对rAAV的某些应用提供优势。

选择性标记物是一种类型的目的基因产物。选择性标记物是基因序列或由该基因序列编码的多肽。选择性标记物编码的多肽的表达使得被含有选择性标记物的表达载体转染的宿主细胞能够容易地与不含有编码选择性标记物的表达载体的宿主细胞区分开来。实例是这样的宿主细胞，其可以使用选择性标记物，以便在否则将杀死宿主细胞的选择性过程中存活下来，例如用抗生素处理。这样的选择性标记物可以是一种或多种抗生素抗性因子，例如新霉素抗性(例如neo)、潮霉素抗性和嘌呤霉素抗性。选择性标记物也可以是细胞表面标记物，例如神经生长因子受体或其截短的版本。然后可以使用针对细胞表面标记物的抗体来筛选表达细胞表面标记物的细胞。针对细胞表面标记物的抗体可以被直接标记(例如用荧光底物)，或者可以使用第二个标记的抗体或底物与针对细胞表面标记物的抗体的结合来检测。或者，细胞可以使用酶、例如将前毒素(更昔洛韦)转化为毒素的单纯性疱疹病毒胸腺嘧啶激酶(HSVTK)或将前毒素5’-氟胞嘧啶(5′-FC)转化成毒素5’-氟尿嘧啶(5′-FU)的细菌胞嘧啶脱氨酶(CD)、来进行负筛选。或者，任何编码多肽的核酸序列，只要多肽易于被抗体识别，都可以用作选择性标记物。

编码选择性标记物的核酸可以编码例如β-内酰胺酶、荧光素酶、绿色荧光蛋白(GFP)、β-半乳糖苷酶或其它在本技术领域中情况被了解的报告基因，包括细胞表面标记物，例如CD4或截短的神经生长因子(NGFR)(对于GFP，参见WO 96/23810；Heim等，Current Biology2：178-182(1996)；Heim等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1995)；或Heim等，Science 373：663-664(1995)；对于β-内酰胺酶，参见WO 96/30540)。在优选实施方案中，选择性标记物是β-内酰胺酶。编码选择性标记物的核酸可以编码例如荧光多肽。荧光多肽可以通过测定任何定量性荧光特征的量例如特定波长下荧光的量、或在发射光谱范围内荧光的积分来检测。最适情况下，选择具有容易检测的荧光特征的荧光多肽。测量荧光的技术对于本技术领域的专业人员来说是众所周知的。

编码哺乳动物细胞中表达的目的基因产物的至少一个核苷酸序列中，核苷酸序列与至少一个哺乳动物细胞相容的表达控制序列例如启动子可操作地连接。在本技术领域中已知有许多这样的启动子。本领域的专业技术人员将会理解，优选的启动子包括可诱导的、组织特异性的或细胞周期特异性的启动子。例如，已经报道E2F启动子可以在体内介导肿瘤选择性的、特别是神经细胞肿瘤选择性的表达，而它们原本在这些细胞是体内抑制的(Parr等，Nat.Med.3：1145-9(1997))。

本发明的应用

本发明的另一个方面是使用本文描述的病毒载体、包装功能和辅助病毒功能将核苷酸序列投送到细胞中的方法。病毒载体可以通过本领域任何适合的已知方法体外投送到细胞中或体内投送到对象中。或者，病毒载体也可以象本技术领域中已知的那样，离体(ex vivo)投送到细胞中，然后给对象施用该细胞。

本发明的方法和病毒载体也可以有利地用于治疗具有代谢病症(例如鸟氨酸(omithine)氨甲酰基转移酶缺陷)的个体。在这样的应用中双链体载体是优选的。这样的病症一般需要被包装的病毒载体相对快速地启动治疗性多肽的表达。作为另一个可选方案，可以施用病毒载体以提供能够增加移植存活能力的药剂(例如超氧化物歧化酶)或对抗败血症的药剂。

此外，对wtAAV载体具有不应性的树突状细胞(DC)(Jooss等，(1998)72：4212)对于本文公开的病毒载体来说是可感染的。因此，作为另一方面，病毒载体提供了将核苷酸序列投送到DC的方法，例如诱导针对所述核苷酸序列编码的多肽的免疫反应。优选核苷酸序列编码来自感染性因子的抗原或癌症抗原。

作为另一方面，病毒载体可以用于在需要调控转基因(例如编码激素或生长因子的转基因，如下所述)表达水平的情况下投送异源核苷酸序列。与rAAV载体相比，本文公开的病毒载体更快速地表达转基因，使得这些基因投送介质更适合治疗方案。

任何异源的核苷酸序列(如上文定义的)都可以通过病毒载体投送。目的核酸包括编码多肽、优选为治疗性(例如用于医学或兽医应用)或免疫原性(例如用于疫苗)的多肽的核酸。

优选异源核苷酸序列的长度将少于大约2.5kb(更优选长度少于大约2.4kb、更优选少于大约2.2kb、更优选少于大约2.0kb)，以利于双链体模板被细小病毒(例如AAV)壳体的包装。示例的核苷酸序列编码因子IX、因子X、溶酶体酶(例如与泰-萨氏(Tay-Sachs)病有关的氨基己糖苷酶A或与亨特(Hunter)综合征/MPS II有关的艾杜糖醛酸硫酸酯酶)、红细胞生成素、血管生成抑制素、内皮抑制素、超氧化物歧化酶、球蛋白、瘦蛋白、过氧化氢酶、酪氨酸羟化酶以及细胞因子(例如α-干扰素、β-干扰素、γ-干扰素、白介素-2、白介素-4、白介素-12、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、淋巴细胞毒素等)、肽生长因子和激素(例如生长激素、胰岛素、胰岛素类生长因子1和2、血小板源性生长因子、表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、神经生长因子、神经营养因子-3或-4、脑源性神经营养因子、胶质细胞源性生长因子、转化生长因子-α和-β等)、受体(例如肿瘤坏死因子受体)。在另一个示例的实施方案中，异源核苷酸序列编码单克隆抗体、优选单链单克隆抗体或针对癌症或肿瘤抗原(例如HER2/neu，和下文描述者)的单克隆抗体。其它说明性的异源核苷酸序列编码自杀基因产物(胸腺嘧啶激酶、胞嘧啶脱氨酶、白喉毒素、细胞色素P450、脱氧胞苷激酶以及肿瘤坏死因子)、对癌症治疗中使用的药物赋予抗性的蛋白、以及肿瘤抑制剂基因产物。

作为另一种选择方案，转基因可以编码报告多肽(例如酶例如绿色荧光蛋白、碱性磷酸酶)。

或者，在本发明的特定实施方案中，目的核酸可以编码反义核酸、核酶(例如在美国专利No.5,877,022中描述的那些)、影响剪接体介导的反式剪接的RNA(参见Puttaraju等，(1999)Nature Biotech.17：246；美国专利No.6,013,487；美国专利No.6,083,702)、介导基因沉默的干扰RNA(RNAi)(参见Sharp等，(2000)Science 287：2431)或其它非翻译的RNA，例如“指导”RNA(Gorman等，(1998)Proc.Nat.Acad.Sci.USA 95：4929；Yuan等的美国专利No.5,869,248)等。

病毒载体也可以编码与宿主染色体上的基因座享有同源性并与其重组的异源核苷酸序列。该方法可以用于校正宿主细胞中的遗传缺陷。

本发明也可以用于在对象中表达免疫原性多肽，例如用于免疫接种。核酸可以编码本技术领域中已知的任何目的免疫原，包括但不限于来自人类免疫缺陷病毒、流感病毒、gag蛋白、肿瘤抗原、癌症抗原、细菌抗原、病毒抗原等的免疫原。

细小病毒用作疫苗在本技术领域中是已知的(参见例如Miyamura等，(1994)Proc.Nat.Acad.Sci USA 91：8507；Young等的美国专利Nos.5,916,563，Mazzara等的美国专利5,905,040，Samulski等的美国专利No.5,882,652、美国专利No.5,863,541；其公开内容在此以其全文引为参考)。抗原可以存在于细小病毒的壳体中。或者，抗原可以从导入到重组载体基因组中的异源核酸表达。任何目的免疫原都可以由细小病毒载体提供。本技术领域中熟知的目的免疫原包括但不限于来自人类免疫缺陷病毒、流感病毒、gag蛋白、肿瘤抗原、癌症抗原、细菌抗原、病毒抗原等的免疫原。

免疫原性多肽或免疫原可以是适合保护对象免于疾病的任何多肽，所述基本包括但不限于微生物、细菌、原生动物、寄生虫和病毒性疾病。例如，免疫原可以是正粘病毒免疫原(例如流感病毒免疫原，如流感病毒血细胞凝集素(HA)表面蛋白或流感病毒核蛋白基因，或马流感病毒免疫原)、或慢病毒免疫原(例如马传染性贫血病毒免疫原、猿免疫缺陷病毒(SIV)免疫原、或人类免疫缺陷病毒(HIV)免疫原，如HIV或SIV包膜GP160蛋白、HIV或SIV基质/壳体蛋白、以及HIV或SIV的gag、pol和env基因产物)。免疫原也可以是砂粒病毒免疫原(例如拉沙热病毒免疫原，如拉沙热病毒核壳体蛋白基因和拉沙热包膜糖蛋白基因)、痘病毒免疫原(例如牛痘，如牛痘L1或L8基因)、黄病毒免疫原(例如黄热病病毒免疫原或日本脑炎病毒免疫原)、线状病毒免疫原(例如埃博拉病毒免疫原，或马堡病毒免疫原、例如NP和GP基因)、布尼亚病毒免疫原(例如RVFV、CCHF和SFS病毒)、或冠状病毒免疫原(例如传染性人类冠状病毒免疫原，如人类冠状病毒包膜糖蛋白基因，或猪传染性胃肠炎病毒免疫原，或禽传染性支气管炎病毒免疫原)。免疫原还可以是脊髓灰质炎(polio)免疫原、疱疹抗原(例如CMV、EBV、HSV免疫原)、腮腺炎免疫原、麻疹免疫原、风疹免疫原、白喉毒素或其它白喉免疫原、百日咳抗原、肝炎(例如甲肝或乙肝)免疫原，或任何在本技术领域已知的其它疫苗免疫原。

或者，免疫原可以是任何肿瘤或癌症细胞抗原。优选肿瘤或癌症抗原表达在癌细胞表面上。示例的癌症和肿瘤细胞抗原描述在S.A.Rosenberg，(1999)Immunity 10：281中。其它说明性的癌症和肿瘤抗原包括但不限于：BRCA1基因产物、BRCA2基因产物、gp100、酪氨酸酶、GAGE-1/2、BAGE、RAGE、NY-ESO-1、CDK4、β-联蛋白、MUM-1、Caspase胱天蛋白酶-8、KIAA0205、HPVE、SART-1、PRAME、p15、黑素瘤肿瘤抗原(Kawakami等，(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA91：3515)；Kawakami等，(1994)J.Exp.Med.，180：347；Kawakami等，(1994)Cancer Res.54：3124)，包括MART-1(Coulie等，(1991)J.Exp.Med.180：35)、gp100(Wick等，(1988)J.Cutan.Pathol.4：201)和MAGE抗原MAGE-1、MAGE-2和MAGE-3(Van der Bruggen等，(1991)Science，254：1643)；CEA、TRP-1、TRP-2、P-15和酪氨酸酶(Brichard等，(1993)J.Exp.Med.178：489)；HER-2/neu基因产物(美国专利No.4,968,603)、CA125、LK26、FB5(内皮唾液酸蛋白)、TAG72、AFP、CA19-9、NSE、DU-PAN-2、CA50、SPan-1、CA72-4、HCG、STN(sialyl Tn抗原)、c-erbB-2蛋白、PSA、L-CanAg、雌激素受体、乳脂球蛋白、p53肿瘤抑制蛋白(Levine，(1993)Ann.Rev.Biochem.62：623)、粘蛋白抗原(国际专利公布WO 90/05142)、端粒酶；核基质蛋白；前列腺酸磷酸酶；乳头状瘤病毒抗原；以及与下列癌症有关的抗原：黑素瘤、转移瘤、腺癌、胸腺瘤、淋巴瘤、肉瘤、肺癌、肝癌、结肠癌、非何杰金氏淋巴瘤、何杰金氏淋巴瘤、白血病、子宫癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、膀胱癌、肾癌、胰腺癌等(参见例如Rosenberg，(1996)Ann.Rev.Med.47：481-91)。

异源性核苷酸序列可以编码任何希望在体外、离体或体内细胞中产生的多肽。例如，病毒载体可以被导入到培养的细胞中，并从其分离表达的基因产物。

本领域的专业技术人员将会理解，目的异源核苷酸序列可以与适当的控制序列可操作地连接。例如，异源核酸可以与表达控制元件可操作地连接，例如转录/翻译控制信号、复制起点、多聚腺苷化信号、以及内部核糖体进入位点(IRES)、启动子、增强子等。

本领域的专业技术人员将会认识到，可以根据所需的水平和组织特异性表达来使用各种不同的启动子/增强子元件。启动子/增强子可以是组成型的或诱导型的，这依赖于所需的表达模式。启动子/增强子可以是固有的或外来的，可以是天然的或合成的序列。所谓外来的，其意在指转录起始区域在导入转录起始区域的野生型宿主中没有被发现。

最优选启动子/增强子对于被处理的靶细胞或对象是固有的。也优选启动子/增强子元件对于转基因来说是固有的。选择启动子/增强子使得它可以在目的靶细胞中发挥作用。哺乳动物或昆虫的启动子/增强子也是优选的。启动子/增强子元件可以是组成型或诱导型。

在希望对转基因的表达提供调控的那些应用中，诱导型表达控制元件是优选的。用于基因投送的诱导型启动子/增强子元件优选为组织特异性启动子/增强子元件，包括肌肉特异性(包括心肌、骨骼肌和/或平滑肌)、神经组织特异性(包括脑特异性)、肝特异性、骨髓特异性、胰腺特异性、脾脏特异性、视网膜特异性和肺特异性的启动子/增强子元件。其它的诱导型启动子/增强子元件包括激素诱导的和金属诱导的元件。示例的诱导型启动子/增强子元件包括但不限于Tet开/关元件、RU486诱导型启动子、蜕皮激素诱导型启动子、雷帕霉素诱导型启动子以及金属硫蛋白启动子。

在本发明的转基因在靶细胞中被转录然后翻译的实施方案中，为了有效地翻译插入的编码蛋白的序列，一般需要特定的起始信号。这些外源的翻译控制序列可以包括ATG起始密码子和相邻序列，它们可以是各种不同来源的，包括天然的和合成的。

本发明的方法也提供了将异源核苷酸序列投送到广范围的细胞、包括分裂的和不分裂的细胞中的方法。本发明可以用于将目的核苷酸序列在体外投送到细胞中，用于例如在体外产生多肽或用于离体(exvivo)基因治疗。本发明的细胞、药物制剂和方法也可以用于将核苷酸序列投送到需要它的对象中用于例如表达免疫原性的或治疗性多肽的方法。通过这种方式，可以在对象中体内生产多肽。对象可能因为对象具有该多肽的缺陷、或者因为在对象中产生该多肽作为治疗或其他方法可以给予某些治疗效果、和象下面进一步解释的那样而需要这种多肽。

总的来说，本发明可以用于投送对治疗或缓解与涉及基因表达的任何病症有关的症状具有生物学效应的任何外源核酸。说明性的疾病状态包括但不限于：囊性纤维变性(以及其它的肺部疾病)、A型血友病、B型血友病、地中海贫血、贫血症和其它血液疾病、AID、阿茨海默氏病、帕金森氏症、亨廷顿氏病、肌萎缩性侧索硬化、癫痫、以及其它的神经性疾病、癌症、糖尿病、肌营养不良(例如杜氏(Duchenne)肌营养不良症、贝克(Becker)肌肌营养不良症)、高雪(Gauchers)病、胡尔勒氏(Hurler’s)病、腺嘌呤脱氨酶缺乏症、糖原储积病和其它的代谢缺陷、视网膜退化病(以及其它的眼病)、实体器官(例如脑、肝、肾、心)的疾病等。

基因转移对于理解疾病状态和为疾病状态提供治疗方法具有显著的潜在应用。有许多遗传疾病，其中缺陷的基因已经知道并被克隆。总的来说，上述的疾病状态分为两类：缺陷状态，通常为酶，它们一般以隐性方式遗传；以及不平衡状态，可以包括调控或结构蛋白，它们一般以显性方式遗传。对于缺陷状态的疾病来说，基因转移可以用于将正常的基因带入受影响的组织中进行替代疗法，以及使用反义突变为疾病创建动物模型。对于不平衡的疾病状态来说，基因转移可以用于在模型系统中产生疾病状态，然后可以被用于消除该疾病状态的尝试中。因此，本发明的方法可以用于治疗遗传疾病。当用于本发明时，疾病状态通过部分或完全地治疗了引起疾病或使疾病更加严重的缺陷或不平衡而得以治疗。使用核酸序列的位点特异性重组来引起突变或校正缺陷也是可能的。

本发明也可以用于为体外或体内细胞提供反义核酸。反义核酸在靶细胞中的表达减少细胞表达特定蛋白。因此，可以使用反义核酸来降低需要它的对象中特定蛋白的表达。反义核酸也可以施用于给体外细胞，以调节细胞生理，例如优化细胞或组织培养系统。

最后，本发明还在诊断和筛选方法中发现了应用，通过它使转基因在细胞培养系统或转基因动物模型中短暂地或稳定地表达。

总的来说，本发明可以用于将任何异源核酸投送到体外、离体或体内细胞中。

对象、药物制剂、疫苗及给药模式

本发明可以用于兽医和医学应用。上面描述的离体基因投送方法的适合对象包括鸟类(例如鸡、鸭、鹅、鹌鹑、火鸡和雉)和哺乳动物(例如人类、牛、羊、山羊、马、猫、狗和兔)，其中优选为哺乳动物。人类对象是最优选的。人类对象包括新生儿、婴幼儿、青少年和成人。

在特定的实施方案中，本发明提供了药物组合物，其在可药用的载体和/或其它医用剂、药剂、载体、佐剂、稀释剂等中含有本发明的病毒粒子。对于注射来说，载体一般为液体。对于其它给药方法来说，载体可以是固体或液体。对于吸入给药来说，载体应该是可吸入的，优选为固体或液体颗粒形式。对于注射介质来说，优选使用含有通常用于注射溶液的添加剂例如稳定剂、盐或盐水、和/或缓冲液的水。

示例的可药用载体包括无菌无热原的水和无菌无热原的磷酸盐缓冲盐水。生理可接受的载体包括可药用的载体。可药用的载体是指不是生物或者其他上不需要的载体，即物质可以给对象施用而不会引起超过物质的有利生物学效应的不需要的生物学效应。

药物组合物可以被用于例如细胞的离体转染，或给对象直接施用病毒粒子或细胞。

可以施用本发明的细小病毒，以引发免疫原性反应(例如作为疫苗)。典型情况下，本发明的疫苗含有免疫原性量的本发明公开的感染性病毒粒子与可药用载体的组合。“免疫原性量”是指足以在要给药药物制剂的对象中唤起免疫反应的感染性病毒粒子的量。一般来说，每剂的量大约10³到大约10¹⁵个病毒粒子、优选大约10⁴到大约10¹⁰个病毒粒子、更优选大约10⁴到10⁶个病毒粒子是适合的，这依赖于被治疗的对象的年龄和种类以及免疫反应所需要针对的免疫原。对象和免疫原如上所述。

本发明还提供了将核酸投送到细胞的方法。典型情况下，对于体外方法来说，病毒可以通过本技术领域已知的标准的病毒转导方法导入到细胞中。优选病毒粒子根据适合具体靶细胞的标准转导方法，以适合的感染复数加入到细胞中。施用的病毒滴度可以根据靶细胞类型和具体的病毒载体而变化，可以由本领域的专业技术人员不用过多的实验就可以确定。

重组病毒载体优选以生物学有效量施用于细胞。如果病毒施用于体内细胞(例如病毒按照下面的描述施用于对象)，则病毒载体的生物学有效量是足以导致转基因在靶细胞中的转导和的表达的量。

施用了本发明病毒载体的细胞可以是任何类型的，包括但不限于神经细胞(包括外周和中枢神经系统的细胞，特别是脑细胞)、肺细胞、视网膜细胞、上皮细胞(例如肠道和呼吸道上皮细胞)、肌肉细胞、树突状细胞、胰腺细胞(包括胰岛细胞)、肝细胞、心肌细胞、骨细胞(例如骨髓干细胞)、造血干细胞、脾细胞、角质细胞、成纤维细胞、内皮细胞、前列腺细胞、生殖细胞等。或者，细胞也可以是任何祖细胞。另外可选地，细胞可以是干细胞(例如神经干细胞、肝脏干细胞)。还可选细胞可以是癌症或肿瘤细胞。此外，细胞可以来自上面指明的任何物种来源。

在本发明的特定实施方案中，细胞从对象中取出，将细小病毒载体导入其中，然后将细胞放回到对象中。从对象取出用于离体治疗的细胞，然后导入并送回到对象中的方法在本技术领域中是已知的(参见，例如，美国专利No.5,399,346；其公开内容在此以其全文引为参考)。或者，rAAV载体也可以被导入到来自另一个对象的细胞中、培养的细胞中、或来自任何其它适合来源的细胞中，并将细胞给需要它的对象施用。

用病毒载体转导的细胞优选以“治疗有效量”与药物载体一起施用于对象。本技术领域的专业人员将会认识到，治疗效果不必需是完全的或治愈性的，只要给对象提供某些益处即可。

在另一个实施方案中，已经转导有本发明的载体的细胞可以被施用，以引发针对被投送的多肽的免疫原性反应。典型情况下，表达免疫原性量的多肽的细胞量与可药用载体组合在一起使用。“免疫原性量”是指足以在施用药物制剂的对象中唤起主动免疫反应的表达多肽的量。主动免疫反应提供的保护程度不必需是完全的或永久的，只要施用的免疫原性多肽的好处超过了它的任何不利之处就行。

给对象施用的细胞剂量根据对象的年龄、状态和种类、细胞的类型、细胞所表达的核酸、给药的方式等而变化。典型情况下，每剂施用至少大约10²到大约10⁸、优选大约10³到大约10⁸个细胞。优选细胞以治疗有效量施用。

本发明的另一个方面是用病毒粒子体内治疗对象的方法。给需要的人类对象或动物施用本发明的细小病毒粒子可以通过本技术领域中任何已知的施用病毒载体的方法来进行。

给药方式的例子包括口服、直肠、经粘膜、局部、经皮、吸入、肠胃外(例如静脉内、皮下、真皮内、肌内和动脉内)给药等，以及直接的组织或器官注射，或鞘内、直接肌内、心室内、静脉内、腹膜内、鼻内或眼内注射。注射剂可以制备成常规的形式，作为液体溶液或悬浮液、适合于在注射前制备成溶液或液体悬浮液的固体形式、或作为乳液。或者，病毒可以局部而不是全身方式施用，例如长效或缓释制剂。

给对象施用的细小病毒载体可以转导任何可感染的细胞或组织。适合被本发明的细小病毒载体转导的细胞如前所述。

在本发明的特别优选的实施方案中，目的核苷酸序列被投送到对象的肝脏。给药肝脏可以通过本技术领域任何已知的方法来进行，包括但不限于静脉内给药、门静脉内给药、胆内给药、动脉内给药、以及直接注射到肝实质中。

在另一个优选实施方案中，本发明的细小病毒粒子被肌肉内给药，更有选通过肌肉内注射或通过局部给药(如上所定义的)。投送到脑也是优选的。在另一个优选实施方案中，本发明的细小病毒粒子被给药到肺脏。

本文公开的细小病毒载体可以通过任何适合的方法给药到对象的肺脏，但是优选通过使对象吸入含有本发明细小病毒载体的可吸入颗粒的气溶胶悬浮剂进行给药。可吸入颗粒可以是液体或固体。含有本发明细小病毒载体的液体颗粒的气溶胶可以通过任何适合的方法来产生，例如本技术领域的专业人员所熟知的压力驱动的气溶胶喷雾器或超声喷雾器。参见例如美国专利No.4,501,729。含有本发明的病毒载体的固体颗粒的气溶胶同样可以通过在制药领域中已知的技术，使用任何固体颗粒药物气溶胶发生器来产生。

本发明细小病毒粒子的剂量依赖于给药方式、要治疗的疾病或病症、对象的个体情况、具体的病毒载体以及被投送的基因，可以按照常规方式来确定。示例的达到治疗效果的剂量是病毒滴度为至少大约10⁵、10⁶、10⁷、10⁸、10⁹、10¹⁰、10¹¹、10¹²、10¹³、10¹⁴、10¹⁵转导单位以上、优选大约10⁸-10¹³转导单位、更优选10¹²转导单位。

在特定的实施方案中，细小病毒粒子通过施用抗癌剂(例如细胞因子)或癌症或肿瘤抗原而作为治疗癌症或肿瘤的方法的一部分施用。细小病毒粒子可以体外施用于细胞或通过使用离体方法体内施用于对象，正如本文描述的和本技术领域中已知的那样。

术语“癌症”具有在其技术领域中被理解的含义，例如组织不受控制的生长，具有扩展到身体的远处位点的能力(即转移)。癌症的例子包括但不限于白血病、淋巴瘤、结肠癌、直肠癌、肝癌、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、卵巢癌、黑素瘤等。优选的是治疗和预防形成肿瘤的癌症的方法。术语“肿瘤”在其技术领域中也被理解为例如多细胞生物体中未分化的细胞的异常肿块。肿瘤可以是恶性或良性的。优选本文公开的本发明方法被用于预防和治疗恶性肿瘤。

癌症和肿瘤抗原已经在本文的前面描述了。术语“治疗癌症”或“癌症的治疗”意指降低了癌症的严重性或至少部分消除了癌症。优选这些术语表明减少了或至少被部分消除了癌症的转移。另外优选这些术语表明降低了或至少部分消除了转移瘤的生长(例如在外科切除原发肿瘤之后)。术语“癌症的预防”或“预防癌症”意指本发明的方法至少部分消除或减少了癌症的发病率或发生。另一种表述方法是本发明的方法减缓、控制、减少了对象中癌症发生的可能性或概率，或延缓了癌症的发生。

同样地，术语“治疗肿瘤”或“肿瘤的治疗”是指降低了肿瘤的严重性或至少部分消除了肿瘤。优选这些术语是为了表明减少或至少部分消除肿瘤的转移。还优选这些术语表明降低了或至少部分被消除了转移瘤的生长(例如在外科切除原发肿瘤之后)。术语“肿瘤的预防”或“预防肿瘤”是指本发明的方法至少部分消除或减少了肿瘤的发病率或发生。另一种表述方法是本发明的方法减缓、控制、减少了对象中肿瘤发生的可能性或概率，或延缓了癌症的发生。

在其它的实施方案中，可以从患有癌症或肿瘤的对象取出细胞并与本发明的细小病毒粒子相接触。然后将修饰过的细胞施用于对象，从而引发针对癌症或肿瘤抗原的免疫反应。该方法用于不能在体内建立起充分免疫反应(即不能产生足够量的增强抗体)的免疫受损对象是特别有利的。

在本技术领域中已经知道免疫反应可以被免疫调节细胞因子所增强(例如α干扰素、β-干扰素、γ干扰素、o-干扰素、τ干扰素、白介素-1α、白介素-1β、白介素-2、白介素-3、白介素-4、白介素-5、白介素-6、白介素-7、白介素-8、白介素-9、白介素-10、白介素-11、白介素-12、白介素-13、白介素-14、白介素-18、B细胞生长因子、CD40配体、肿瘤坏死因子-β、肿瘤坏死因子-α、单核细胞化学吸引蛋白-1、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子和淋巴毒素)。因此，在本发明的特定实施方案中，免疫调节细胞因子(优选为CTL诱导型细胞因子)结合本文描述的方法给对象施用，以产生免疫反应或提供免疫治疗。

细胞因子可以通过本技术领域已知的任何方法来给药。外源细胞因子可以给药对象，或者可以施用适当的载体将编码细胞因子的核苷酸序列投送给对象，并在体内产生细胞因子。

现在已经对本发明进行了描述，本发明将参考一些实施例进行说明，本文中包含这些实施例仅仅是为了说明的目的，并不打算用它们对本发明进行限制

实施例：材料与方法

杆状病毒穿梭质粒的构建

杆状病毒穿梭质粒LSR(表达Rep 78/52)、VPm11(表达VP1、VP2和VP3)和GFPR(侧翼带有报告基因GFP的AAV ITR)由NIH的Robert Kotin博士好意提供(参见Kotin等的美国专利公布No.2004/0197895，其全文在此引为参考)。杆状病毒穿梭质粒pFB-2.5Cap通过将来自pXR2.5的2.5Cap基因的EcoNI-NotI片段克隆到VPm11的EcoNI-NotI位点中而构建。质粒pFB-2.5VP1通过将来自pxr2.5的SwaI-NotI片段克隆到VPm11的NotI和Klenow平端BamHI位点中而构建。

重组杆状病毒的产生

按照Invitrogen的Bac-to-bac修改方案，产生了重组杆状病毒。简单来说，将2ng穿梭质粒转化到20μl DH10Bac感受态细胞中，经过48小时孵育后挑取几个白色菌落，制备小量制备的杆粒DNA。然后施用CellFectine在6孔板中将小量制备的DNA转染到Sf9细胞中，产生重组的杆状病毒。在经过3天转染期和扩增后，收获重组杆状病毒。扩增的杆状病毒被用于滴定和随后的AAV生产。本研究中使用的重组杆状病毒图示在图1中。

细胞培养

293细胞被维持在补充了10％FBS和100单位/ml青霉素和100μg/ml链霉素的DMEM培养基中。细胞每星期传代2次。HepG2细胞被维持在补充了10％FBS和100单位/ml青霉素和100μg/ml链霉素的MEME培养基(ATCC)中。细胞每星期传代1次。Sf9细胞被维持在补充了100单位/ml青霉素和100μg/ml链霉素的SF900II或ExCell420培养基中，在摇瓶中悬浮培养。细胞每星期传代2次。

杆状病毒的滴定

使用快速滴定试剂盒，按照制造商(BD BIOSCIENCES)的说明对重组杆状病毒进行滴定。简单来说，将Sf9细胞以6.5⁺⁴细胞/孔接种到96孔板中1小时，并加入连续稀释的杆状病毒溶液感染细胞1小时。然后移除杆状病毒溶液，加入含有甲基纤维素的培养基。培养48小时后，感染的基因座通过用gp64抗体探测以颜色基质反应进行检测。

AAV载体的生产、纯化和滴定

为了使用摇瓶或Wave生物反应器在Sf9细胞中生产AAV载体，首先将细胞在补充了100单位/ml青霉素和100μg/ml链霉素的SF900II或ExCell420培养基中生长到大约5E+6个细胞/ml。在感染之前即刻，在细胞培养物中加入另一半混合有所需量重组杆状病毒的新鲜培养基，使细胞数量为大约2.5E+6个细胞/ml。感染进行3天，通过在3,000rpm离心10分钟来收获细胞沉淀。将细胞沉淀在Sf9裂解缓冲液(1％DOC，0.5％CHAPS，50mM NaCl，2mM MgCl₂，50mM Tris-HCl，pH8.0)中进行裂解。加入125单位/ml的Benzonase，在37℃孵育1小时消化基因组DNA。在孵育后将盐浓度调整到400mM，通过在8,000rpm离心30分钟除去细胞碎片。将澄清的裂解液上样到步长CsCl梯度，进行两轮超速离心。收获AAV载体，用100倍体积的含有5％山梨糖醇的PBS进行透析，并用于后面的实验。

AAV滴度的斑点印迹分析

首先将纯化的AAV载体用DNase(10mM Tris pH7.5，10mMMgCl₂，50单位/ml DNase I)在37℃消化1小时，除去任何污染的DNA，然后通过加入EDTA到20mM来终止消化。通过用等体积的蛋白酶K(1M NaCl，100μg/ml蛋白酶K，1％N-肌氨酰)在50℃消化2小时并通过苯酚/氯仿抽提除去蛋白来释放病毒DNA。然后将病毒DNA沉淀，并重新悬浮在TE缓冲液中。通过使用斑点印迹装置用放射性标记的DNA探针进行杂交来确定病毒的拷贝数。

考马斯亮蓝染色

将纯化的AAV载体在样品缓冲液中煮沸5分钟，将壳体蛋白通过SDS-PAGE进行分离。然后将凝胶在含有25％异丙醇、10％乙酸和65％milli-Q水的固定溶液中固定20分钟，在含有0.01％考马斯亮蓝R-250(BioRad)和10％乙酸的染色溶液中轻摇染色过夜。将凝胶在含有10％乙酸的脱色溶液中脱色，更换几次溶液直到背景透明。

Western印迹和银染

细胞裂解液或AAV载体在1X SDS样品缓冲液中煮沸5分钟，将煮沸过的样品进行SDS-PAGE。对于Western印迹来说，在凝胶上分离的蛋白被转移到硝酸纤维素膜上。将膜用5％脱脂奶封闭，用抗AAV VP单克隆抗体(B1克隆)然后用HRP偶联的抗小鼠单克隆抗体进行探测。使用SuperSignal West Femto最大灵敏度底物(PIERCE)将信号捕获在胶片上。对于银染来说，凝胶使用SilverXpress试剂盒(Invitrogen)按照制造商说明书进行染色。

293和HepG2细胞的转导

在转导前一天，将细胞以1.5×10⁵个细胞/孔接种到24孔板中。将AAV载体在1ml含有1.5μM(对于293细胞)或20μM(对于HepG2细胞)表鬼臼毒素吡喃葡糖苷的培养基中稀释到10^-1、10^-2、10^-3和10^-4倍。将旧的培养基从细胞中去除，加入0.5ml稀释的AAV。将细胞培养48小时，在荧光显微镜下对表达GFP的细胞进行计数。

实施例：结果

Sf9细胞产生的AAV2.5-GFP载体比293细胞产生的具有较低的VP1/VP3比率。

通过yinji分析，将在Sf9细胞中产生的AAV2.5-GFP载体与其293的对应物进行了比较，以检查壳体的组成。图2显示了Sf9细胞包装的病毒粒子与293细胞中包装的病毒粒子相比具有较低的VP1/VP3比率，这表明Sf9细胞可以包装一些VP1病毒粒子。该结果也被考马斯亮蓝染色和银染分析所证实(数据未显示)。

Sf9细胞产生的AAV2.5-GFP载体比293细胞产生的具有低得多的感染性

为了比较Sf9和293细胞产生的AAV2.5-GFP载体的感染性，用载体转导HepG2细胞48小时，并对绿色的细胞数量进行计数。表1中的结果显示了在Sf9细胞中产生的AAV2.5-GFP载体与它们的293对应体相比具有低得多的感染性。当施用293细胞进行转导时也观察到了类似的结果(数据未显示)。

添加额外的2.5VP1增加了Sf9细胞中产生的AAV载体的VP1/VP3比率

通过以0.1、0.5和1.0感染复数的表达2.5VP1的杆状病毒(Bac-2.5VP1)与1感染复数的其它三种用于AAV包装的杆状病毒(Bac-Rep、Bac-2.5Cap和Bac-GFP)的每一种一起共感染Sf9细胞，导入了不同量的2.5VP1。感染3天后收获细胞。将小部分细胞用于制备细胞裂解液，大部分的细胞沉淀被用于AAV纯化。裂解液和纯化的AAV载体都进行SDS-PAGE，并通过Western印迹方法检测壳体蛋白。下面的表1中显示的结果表明VP1表达水平增加了，并与VP1杆状病毒的增加量相关。

同时，观察到了当VP1的表达越多时，降解的壳体蛋白越多。当使用更多的Bac-2.5VP1时，纯化的AAV粒子也含有更多的VP1(图3)。

VP1/VP3比率的增加提高了Sf9细胞中产生的AAV载体的感染性

VP1/VP3比率的增加提高了Sf9细胞中产生的AAV载体的感染性。因为VP1含有AAV感染所需的磷脂酶结构域，我们试验了在载体生产过程中加入额外的VP1是否能够提高在Sf9细胞中产生的AAV载体的感染性。使用AAV载体转导HepG2细胞48小时，对绿色的细胞进行计数和照相。图4-6中的结果表明，通过加入额外的VP1，AAV2.5-GFP载体的感染性急剧增加了。

可选的重组杆状病毒载体

图7-11显示了用于生产感染性AAV病毒的可选Bac载体。例如，复制组分可以组合在单种载体中或包含在分别的载体中。此外，表达VP1、VP2和VP3的基因可以包含在Cap载体中，含有或不含有额外的用于增加VP1病毒粒子表达量的VP1基因。此外，侧翼带有TR的转基因可以专门包含在单个Bac载体中，或与其它的组分例如表达VP1的基因、复制组分和/或表达VP1、VP2和VP3的基因相组合。

图7显示了其它四种可以一起用于产生感染性病毒粒子的重组杆状病毒，其中的载体含有在细胞肥大病毒(CMV)立即早期启动子/增强子控制之下的GFP或转基因，以及一般插入在转入因序列之后和3′AAV ITR序列之前的poly-A序列。分开的Bac载体提供了额外的和必需的基因，包括使用带有polh启动子的原始的ATG起始密码子的VP1基因，带有Cap基因的载体和另一个含有Rep78和52基因的载体。值得注意的是，所有的载体都含有至少一个多聚腺苷化序列(pA)。图8显示了使用三个Bac载体的系统，其中一个Bac载体含有编码VP1、VP2和VP3的2.5Cap基因以及AAV复制组分。其它载体包括一个用于表达2.5VP1和另一个由于表达转基因的载体。图9显示了仅仅使用两种载体，其中编码VP1、VP2和VP3的2.5Cap基因与AAV复制组分包含在同一种载体中，第二种载体含有GFP的基因(转基因)和用于表达额外量VP1的2.5VP1基因。图10也包含了仅仅使用两种载体的系统，其中单个复制组分被包含在每个Bac载体中，有利的是，Rep78与转入基因位于不同的载体上，从而增加了载体和随后表达的稳定性。此外，在一种载体中，转基因和2.5VP1基因与Rep基因相组合。图11也显示了两种载体，其中两个复制组分包含在单个Bac载体中，编码VP1、VP2和VP3的2.5Cap基因与其它的2.5VP1基因和转基因包含在相同的载体中。

尽管已经通过目的是为了阐明和理解的说明和实施例对上述的发明进行了较为详细的描述，但是显然可以在随附的权利要求及其等同体的范围内进行改变和修改。

序列表

<110>北卡罗来纳大学教堂山分校

<120>增强感染性细小病毒载体在昆虫细胞中的生产

<130>SCT083165-00

<150>60/760,812

<151>2006-01-20

<150>60/765,665

<151>2006-02-06

<150>60/804,772

<151>2006-06-14

<160>13

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>1194

<212>DNA

<213>adeno-associated virus 2

<400>1

atggagctgg tcgggtggct cgtggacaag gggattacct cggagaagca gtggatccag 60

gaggaccagg cctcatacat ctccttcaat gcggcctcca actcgcggtc ccaaatcaag 120

gctgccttgg acaatgcggg aaagattatg agcctgacta aaaccgcccc cgactacctg 180

gtgggccagc agcccgtgga ggacatttcc agcaatcgga tttataaaat tttggaacta 240

aacgggtacg atccccaata tgcggcttcc gtctttctgg gatgggccac gaaaaagttc 300

ggcaagagga acaccatctg gctgtttggg cctgcaacta ccgggaagac caacatcgcg 360

gaggccatag cccacactgt gcccttctac gggtgcgtaa actggaccaa tgagaacttt 420

cccttcaacg actgtgtcga caagatggtg atctggtggg aggaggggaa gatgaccgcc 480

aaggtcgtgg agtcggccaa agccattctc ggaggaagca aggtgcgcgt ggaccagaaa 540

tgcaagtcct cggcccagat agacccgact cccgtgatcg tcacctccaa caccaacatg 600

tgcgccgtga ttgacgggaa ctcaacgacc ttcgaacacc agcagccgtt gcaagaccgg 660

atgttcaaat ttgaactcac ccgccgtctg gatcatgact ttgggaaggt caccaagcag 720

gaagtcaaag actttttccg gtgggcaaag gatcacgtgg ttgaggtgga gcatgaattc 780

tacgtcaaaa agggtggagc caagaaaaga cccgccccca gtgacgcaga tataagtgag 840

cccaaacggg tgcgcgagtc agttgcgcag ccatcgacgt cagacgcgga agcttcgatc 900

aactacgcag acaggtacca aaacaaatgt tctcgtcacg tgggcatgaa tctgatgctg 960

tttccctgca gacaatgcga gagaatgaat cagaattcaa atatctgctt cactcacgga 1020

cagaaagact gtttagagtg ctttcccgtg tcagaatctc aacccgtttc tgtcgtcaaa 1080

aaggcgtatc agaaactgtg ctacattcat catatcatgg gaaaggtgcc agacgcttgc 1140

actgcctgcg atctggtcaa tgtggatttg gatgactgca tctttgaaca ataa 1194

<210>2

<211>1243

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>Synthetic Construct

<400>2

gggcgaattg ggtaccatcg atatggaact ggtcggttgg ctggtcgaca agggtatcac 60

ctccgagaag cagtggatcc aggaagatca ggcttcctac atctccttca acgctgcttc 120

caactcccgt tcccagatca aggctgctct ggacaacgct ggcaagatca tgtccctgac 180

caagaccgct cccgactacc tggtcggcca gcagcccgtg gaggacatct cctccaaccg 240

catctacaag atcctcgagc tgaacggtta cgacccccag tacgctgcct ccgtgttcct 300

gggttgggct accaagaagt tcggcaagcg taacaccatc tggctgttcg gtcccgctac 360

caccggcaag accaacatcg ctgaggctat cgctcacacc gtgcccttct acggttgcgt 420

gaactggacc aacgagaact tccccttcaa cgactgcgtg gacaagatgg tgatttggtg 480

ggaggaaggc aagatgaccg ctaaggtggt cgagtccgct aaggctatcc tgggcggttc 540

caaggtccgc gtggaccaga agtgcaagtc ctccgctcag atcgacccca cccccgtgat 600

cgtgacctcc aacaccaaca tgtgcgctgt gatcgacggt aactccacca ctttcgagca 660

ccagcagcct ctgcaggacc gtatgttcaa gttcgagctg acccgtcgtc tggaccacga 720

cttcggcaag gtgaccaagc aggaagtgaa ggacttcttc cgttgggcta aggaccacgt 780

ggtggaggtg gagcacgagt tctacgtgaa gaagggtggc gctaagaagc gtcccgctcc 840

ctccgacgct gacatctccg agcccaagcg tgtgcgcgag tccgtggccc agccctccac 900

ctccgacgcc gaggcttcca tcaactacgc tgaccgctac cagaacaagt gctcccgtca 960

cgtgggcatg aacctgatgc tgttcccttg ccgtcagtgc gagcgtatga accagaactc 1020

caacatctgc ttcacccacg gccagaagga ctgcctcgag tgcttccccg tgtccgagtc 1080

ccagcccgtg tccgtggtga agaaggctta ccagaagctg tgctacatcc accacatcat 1140

gggcaaggtg cccgacgctt gcaccgcttg cgacctggtg aacgtggacc tggacgactg 1200

catcttcgag cagtaataat ctagagctcc agcttttgtt ccc 1243

<210>3

<211>1932

<212>DNA

<213>adeno-associated virus 2

<400>3

atgccggggt tttacgagat tgtgattaag gtccccagcg accttgacga gcatctgccc 60

ggcatttctg acagctttgt gaactgggtg gccgagaagg aatgggagtt gccgccagat 120

tctgacatgg atctgaatct gattgagcag gcacccctga ccgtggccga gaagctgcag 180

cgcgactttc tgacggaatg gcgccgtgtg agtaaggccc cggaggccct tttctttgtg 240

caatttgaga agggagagag ctacttccac atgcacgtgc tcgtggaaac caccggggtg 300

aaatccatgg ttttgggacg tttcctgagt cagattcgcg aaaaactgat tcagagaatt 360

taccgcggga tcgagccgac tttgccaaac tggttcgcgg tcacaaagac cagaaatggc 420

gccggaggcg ggaacaaggt ggtggatgag tgctacatcc ccaattactt gctccccaaa 480

acccagcctg agctccagtg ggcgtggact aatatggaac agtatttaag cgcctgtttg 540

aatctcacgg agcgtaaacg gttggtggcg cagcatctga cgcacgtgtc gcagacgcag 600

gagcagaaca aagagaatca gaatcccaat tctgatgcgc cggtgatcag atcaaaaact 660

tcagccaggt acatggagct ggtcgggtgg ctcgtggaca aggggattac ctcggagaag 720

cagtggatcc aggaggacca ggcctcatac atctccttca atgcggcctc caactcgcgg 780

tcccaaatca aggctgcctt ggacaatgcg ggaaagatta tgagcctgac taaaaccgcc 840

cccgactacc tggtgggcca gcagcccgtg gaggacattt ccagcaatcg gatttataaa 900

attttggaac taaacgggta cgatccccaa tatgcggctt ccgtctttct gggatgggcc 960

acgaaaaagt tcggcaagag gaacaccatc tggctgtttg ggcctgcaac taccgggaag 1020

accaacatcg cggaggccat agcccacact gtgcccttct acgggtgcgt aaactggacc 1080

aatgagaact ttcccttcaa cgactgtgtc gacaagatgg tgatctggtg ggaggagggg 1140

aagatgaccg ccaaggtcgt ggagtcggcc aaagccattc tcggaggaag caaggtgcgc 1200

gtggaccaga aatgcaagtc ctcggcccag atagacccga ctcccgtgat cgtcacctcc 1260

aacaccaaca tgtgcgccgt gattgacggg aactcaacga ccttcgaaca ccagcagccg 1320

ttgcaagacc ggatgttcaa atttgaactc acccgccgtc tggatcatga ctttgggaag 1380

gtcaccaagc aggaagtcaa agactttttc cggtgggcaa aggatcacgt ggttgaggtg 1440

gagcatgaat tctacgtcaa aaagggtgga gccaagaaaa gacccgcccc cagtgacgca 1500

gatataagtg agcccaaacg ggtgcgcgag tcagttgcgc agccatcgac gtcagacgcg 1560

gaagcttcga tcaactacgc agacaggtac caaaacaaat gttctcgtca cgtgggcatg 1620

aatctgatgc tgtttccctg cagacaatgc gagagaatga atcagaattc aaatatctgc 1680

ttcactcacg gacagaaaga ctgtttagag tgctttcccg tgtcagaatc tcaacccgtt 1740

tctgtcgtca aaaaggcgta tcagaaactg tgctacattc atcatatcat gggaaaggtg 1800

ccagacgctt gcactgcctg cgatctggtc aatgtggatt tggatgactg catctttgaa 1860

caataaatga tttaaatcag gtatggctgc cgatggttat cttccagatt ggctcgagga 1920

cactctctct ga 1932

<210>4

<211>1915

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>Synthetic construct

<400>4

gggcgaattg ggtaccatcg atatgcccgg tttctacgag atcgtgatca aggtgccctc 60

cgacctggac gagcacctgc ccggtatctc cgactccttc gtgaactggg tggccgagaa 120

ggagtgggag ctgcctcccg actccgacat ggacctgaac ctgatcgagc aggctcccct 180

gaccgtggct gagaagctgc agcgtgactt cctgaccgag tggcgtcgtg tgtccaaggc 240

tcccgaggct ctgttcttcg tgcagttcga gaagggcgag tcctacttcc acatgcacgt 300

gctggtcgag accaccggtg tcaagtccat ggtgctgggc cgtttcctca gccagatccg 360

tgagaagctg atccagcgta tctaccgtgg tatcgagccc accctgccca actggttcgc 420

tgtgaccaag acccgtaacg gtgctggcgg tggtaacaag gtggtggacg agtgctacat 480

ccccaactac ctgctgccca agacccagcc cgagctgcag tgggcttgga ccaacatgga 540

acagtacctg tccgcttgcc tgaacctcac cgagcgtaag cgtctggtgg cccagcacct 600

gacccacgtg tctcagaccc aggaacagaa caaggagaac cagaacccca actccgacgc 660

tcccgtgatc cgttccaaga cctccgctcg ttacatggaa ctggtcggtt ggctggtcga 720

caagggtatc acctccgaga agcagtggat ccaggaagat caggcttcct acatctcctt 780

caacgctgct tccaactccc gttcccagat caaggctgct ctggacaacg ctggcaagat 840

catgtccctg accaagactg ctcccgacta cctggtcggc cagcagcccg tggaggacat 900

ctcctccaac cgcatctaca agatcctcga gctgaacggt tacgaccccc agtacgctgc 960

ctccgttttc ctgggttggg ctaccaagaa gttcggcaag cgtaacacca tctggctgtt 1020

cggtcccgct accaccggca agaccaacat cgctgaggct atcgctcaca ccgtgccctt 1080

ctacggttgc gtgaactgga ccaacgagaa cttccccttc aacgactgcg tggacaagat 1140

ggtgatttgg tgggaggaag gcaagatgac cgctaaggtg gtcgagtccg ctaaggctat 1200

cctgggcggt tccaaggtcc gcgtggacca gaagtgcaag tcctccgctc agatcgaccc 1260

cacccccgtg atcgtgacct ccaacaccaa catgtgcgct gtgatcgacg gtaactccac 1320

caccttcgag caccagcagc ctctgcagga ccgtatgttc aagttcgagc tgacccgtcg 1380

tctggaccac gacttcggca aggtgaccaa gcaggaagtg aaggacttct tccgttgggc 1440

taaggaccac gtggtggagg tggagcacga gttctacgtg aagaagggtg gcgctaagaa 1500

gcgtcccgct ccctccgacg ctgacatctc cgagcccaag cgtgtgcgcg agtccgtggc 1560

ccagccctcc acctccgacg ccgaggcttc catcaactac gctgaccgct accagaacaa 1620

gtgctcccgt cacgtgggca tgaacctgat gctgttccct tgccgtcagt gcgagcgtat 1680

gaaccagaac agcaacatct gcttcaccca cggccagaag gactgcctcg agtgcttccc 1740

cgtgtccgag tcccagcccg tgtccgtggt gaagaaggct taccagaagc tctgctacat 1800

ccaccacatc atgggcaagg tgcccgacgc ttgcaccgct tgcgacctgg tgaacgtgga 1860

cctcgacgac tgcatcttcg agcagtaata atctagagct ccagcttttg ttccc 1915

<210>5

<211>2211

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>Synthetic Construct

<400>5

atggctgccg atggttatct tccagattgg ctcgaggaca ctctctctga aggaataaga 60

cagtggtgga agctcaaacc tggcccacca ccaccaaagc ccgcagagcg gcataaggac 120

gacagcaggg gtcttgtgct tcctgggtac aagtacctcg gacccttcaa cggactcgac 180

aagggagagc cggtcaacga ggcagacgcc gcggccctcg agcacgacaa agcctacgac 240

cggcagctcg acagcggaga caacccgtac ctcaagtaca accacgccga cgcggagttt 300

caggagcgcc ttaaagaaga tacgtctttt gggggcaacc tcggacgagc agtcttccag 360

gcgaaaaaga gggttcttga acctctgggc ctggttgagg aacctgttaa gacggctccg 420

ggaaaaaaga ggccggtaga gcactctcct gtggagccag actcctcctc gggaaccgga 480

aaggcgggcc agcagcctgc aagaaaaaga ttgaattttg gtcagactgg agacgcagac 540

tcagtacctg acccccagcc tctcggacag ccaccagcag ccccctctgg tctgggaact 600

aatacgatgg ctacaggcag tggcgcacca atggcagaca ataacgaggg cgccgacgga 660

gtgggtaatt cctcgggaaa ttggcattgc gattccacat ggatgggcga cagagtcatc 720

accaccagca cccgaacctg ggccctgccc acctacaaca accacctcta caaacaaatt 780

tccagcgctt caacgggagc ctcgaacgac aatcactact ttggctacag caccccttgg 840

gggtattttg acttcaacag attccactgc cacttttcac cacgtgactg gcaaagactc 900

atcaacaaca actggggatt ccgacccaag agactcaact tcaagctctt taacattcaa 960

gtcaaagagg tcacgcagaa tgacggtacg acgacgattg ccaataacct taccagcacg 1020

gttcaggtgt ttactgactc ggagtaccag ctcccgtacg tcctcggctc ggcgcatcaa 1080

ggatgcctcc cgccgttccc agcagacgtc ttcatggtgc cacagtatgg atacctcacc 1140

ctgaacaacg ggagtcaggc agtaggacgc tcttcatttt actgcctgga gtactttcct 1200

tctcagatgc tgcgtaccgg aaacaacttt accttcagct acacttttga ggacgttcct 1260

ttccacagca gctacgctca cagccagagt ctggaccgtc tcatgaatcc tctcatcgac 1320

cagtacctgt attacttgag cagaacaaac actccaagtg gaaccaccac gcagtcaagg 1380

cttcagtttt ctcaggccgg agcgagtgac attcgggacc agtctaggaa ctggcttcct 1440

ggaccctgtt accgccagca gcgagtatca aagacatctg cggataacaa caacagtgaa 1500

tactcgtgga ctggagctac caagtaccac ctcaatggca gagactctct ggtgaatccg 1560

ggcccggcca tggcaagcca caaggacgat gaagaaaagt tttttcctca gagcggggtt 1620

ctcatctttg ggaagcaagg ctcagagaaa acaaatgtgg acattgaaaa ggtcatgatt 1680

acagacgaag aggaaatcag gacaaccaat cccgtggcta cggagcagta tggttctgta 1740

tctaccaacc tccagagagg caacagacaa gcagctaccg cagatgtcaa cacacaaggc 1800

gttcttccag gcatggtctg gcaggacaga gatgtgtacc ttcaggggcc catctgggca 1860

aagattccac acacggacgg acattttcac ccctctcccc tcatgggtgg attcggactt 1920

aaacaccctc ctccacagat tctcatcaag aacaccccgg tacctgcgaa tccttcgacc 1980

accttcagtg cggcaaagtt tgcttccttc atcacacagt actccacggg acaggtcagc 2040

gtggagatcg agtgggagct gcagaaggaa aacagcaaac gctggaatcc cgaaattcag 2100

tacacttcca actacgccaa gtctgtcaat gtggacttta ctgtggacaa taatggcgtg 2160

tattcagagc ctcgccccat tggcaccaga tacctgactc gtaatctgta a 2211

<210>6

<211>2260

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>Synthetic construct

<400>6

gggcgaattg ggtaccatcg atatggctgc tgatggttac ctgcccgact ggctcgagga 60

taccctgtcc gagggtatcc gtcagtggtg gaagctgaag cccggtcccc cccctcccaa 120

gcccgctgag aggcacaagg acgattcccg tggtctggtg ctgcccggtt acaagtacct 180

gggccccttc aacggtctgg acaagggcga gcccgtgaac gaggctgacg ctgctgctct 240

cgagcacgac aaggcttacg accgtcagct ggactccggt gacaacccct acctgaagta 300

caaccacgct gacgctgagt tccaggaacg tctgaaggag gacacctcct tcggcggtaa 360

cctgggtcgt gctgtgttcc aggctaagaa gcgtgttctc gagcccctgg gtctggtgga 420

ggaacccgtc aagaccgctc ccggcaagaa gcgtcccgtc gagcactccc ccgtggagcc 480

cgactcctcc tccggcaccg gcaaggctgg ccagcagccc gctcgtaagc gtctgaactt 540

cggccagacc ggtgacgctg actccgtgcc cgacccccag cccctgggcc agcctcccgc 600

tgctccctcc ggtctgggca ccaacaccat ggctaccggt tccggtgctc ccatggctga 660

caacaacgag ggtgctgacg gtgtcggtaa ctcctccggt aactggcact gcgactccac 720

ctggatgggt gaccgtgtga tcaccacctc cacccgtacc tgggctctgc ctacctacaa 780

caaccacctg tacaagcaga tctcctccgc ttccaccggt gcttccaacg acaaccacta 840

cttcggttac tccaccccct ggggctactt cgacttcaac cgtttccact gccacttctc 900

cccccgtgac tggcagcgtc tgatcaacaa caactggggt ttccgtccca agaggctgaa 960

cttcaagctg ttcaacatcc aagtcaagga ggtcacccag aacgacggca ccaccaccat 1020

cgccaacaac ctgacctcca ccgtgcaggt gttcaccgac tccgagtacc agctgcccta 1080

cgtgctgggt tccgctcacc agggttgcct gccccccttc cccgctgacg tgttcatggt 1140

gccccagtac ggctacctga ccctgaacaa cggttcccag gctgtgggcc gttcctcctt 1200

ctactgcctc gagtacttcc catcccagat gctgcgtacc ggtaacaact tcaccttctc 1260

ctacaccttc gaggacgtgc ccttccactc ctcctacgct cactcccagt ccctggaccg 1320

tctgatgaac cccctgatcg accagtacct gtactacctg tcccgtacca acaccccttc 1380

cggaaccacc acccagtccc gtctgcagtt ctcccaggct ggtgcttccg acatccgtga 1440

ccagtcccgt aactggctgc ccggtccctg ctaccgtcag caacgcgtgt ccaagacctc 1500

cgccgacaac aacaacagcg agtactcctg gaccggtgct accaagtacc acctgaacgg 1560

tcgtgactcc ctggtgaacc ccggtcccgc tatggcttcc cacaaggacg acgaggaaaa 1620

gttcttcccc cagtccggtg tcctgatctt cggcaagcag ggttccgaaa agaccaacgt 1680

ggacatcgag aaggtcatga tcaccgacga ggaagagatc cgtaccacca accctgtggc 1740

taccgagcag tacggttccg tgtccaccaa cctgcagcgt ggtaaccgtc aagctgctac 1800

cgctgacgtc aacacccagg gtgtcctgcc cggcatggtc tggcaggacc gtgacgtgta 1860

cctgcagggt cccatctggg ctaagatccc ccacaccgac ggtcacttcc acccctcccc 1920

cctgatgggc ggtttcggtc tgaagcaccc ccctccccag atcctgatca agaacacccc 1980

cgtgcccgct aacccctcca ccaccttctc cgctgctaag ttcgcttcct tcatcaccca 2040

gtactccacc ggccaggtgt ccgtggagat cgagtgggag ctgcagaagg agaactccaa 2100

gcgttggaac cccgagatcc agtacacctc caactacgct aagtccgtga acgtggactt 2160

caccgtggac aacaacggtg tctactccga gccccgtccc atcggcaccc gttacctgac 2220

ccgcaacctg taataatcta gagctccagc ttttgttccc 2260

<210>7

<211>2217

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>Synthetic construct

<400>7

atggctgccg atggttatct tccagattgg ctcgaggaca acctctctga gggcattcgc 60

gagtggtggg cgctgaaacc tggagccccg aagcccaaag ccaaccagca aaagcaggac 120

gacggccggg gtctggtgct tcctggctac aagtacctcg gacccttcaa cggactcgac 180

aagggggagc ccgtcaacgc ggcggacgca gcggccctcg agcacgacaa ggcctacgac 240

cagcagctgc aggcgggtga caatccgtac ctgcggtata accacgccga cgccgagttt 300

caggagcgtc tgcaagaaga tacgtctttt gggggcaacc tcgggcgagc agtcttccag 360

gccaagaagc gggttctcga acctctcggt ctggttgagg aaggcgctaa gacggctcct 420

ggaaagaaga gaccggtaga gccatcaccc cagcgttctc cagactcctc tacgggcatc 480

ggcaagaaag gccaacagcc cgccagaaaa agactcaatt ttggtcagac tggcgactca 540

gagtcagttc cagaccctca acctctcgga gaacctccag cagcgccctc tggtgtggga 600

cctaatacaa tggctgcagg cggtggcgca ccaatggcag acaataacga aggcgccgac 660

ggagtgggta gttcctcggg aaattggcat tgcgattcca catggctggg cgacagagtc 720

atcaccacca gcacccgaac ctgggccctg cccacctaca acaaccacct ctacaagcaa 780

atctccaacg ggacatcggg aggagccacc aacgacaaca cctacttcgg ctacagcacc 840

ccctgggggt attttgactt taacagattc cactgccact tttcaccacg tgactggcag 900

cgactcatca acaacaactg gggattccgg cccaagagac tcagcttcaa gctcttcaac 960

atccaggtca aggaggtcac gcagaatgaa ggcaccaaga ccatcgccaa taacctcacc 1020

agcaccatcc aggtgtttac ggactcggag taccagctgc cgtacgttct cggctctgcc 1080

caccagggct gcctgcctcc gttcccggcg gacgtgttca tgattcccca gtacggctac 1140

ctaacactca acaacggtag tcaggccgtg ggacgctcct ccttctactg cctggaatac 1200

tttccttcgc agatgctgag aaccggcaac aacttccagt ttacttacac cttcgaggac 1260

gtgcctttcc acagcagcta cgcccacagc cagagcttgg accggctgat gaatcctctg 1320

attgaccagt acctgtacta cttgtctcgg actcaaacaa caggaggcac ggcaaatacg 1380

cagactctgg gcttcagcca aggtgggcct aatacaatgg ccaatcaggc aaagaactgg 1440

ctgccaggac cctgttaccg ccaacaacgc gtctcaacga caaccgggca aaacaacaat 1500

agcaactttg cctggactgc tgggaccaaa taccatctga atggaagaaa ttcattggct 1560

aatcctggca tcgctatggc aacacacaaa gacgacgagg agcgtttttt tcccagtaac 1620

gggatcctga tttttggcaa acaaaatgct gccagagaca atgcggatta cagcgatgtc 1680

atgctcacca gcgaggaaga aatcaaaacc actaaccctg tggctacaga ggaatacggt 1740

atcgtggcag ataacttgca gcagcaaaac acggctcctc aaattggaac tgtcaacagc 1800

cagggggcct tacccggtat ggtctggcag aaccgggacg tgtacctgca gggtcccatc 1860

tgggccaaga ttcctcacac ggacggcaac ttccacccgt ctccgctgat gggcggcttt 1920

ggcctgaaac atcctccgcc tcagatcctg atcaagaaca cgcctgtacc tgcggatcct 1980

ccgaccacct tcaaccagtc aaagctgaac tctttcatca cgcaatacag caccggacag 2040

gtcagcgtgg aaattgaatg ggagctgcag aaggaaaaca gcaagcgctg gaaccccgag 2100

atccagtaca cctccaacta ctacaaatct acaagtgtgg actttgctgt taatacagaa 2160

ggcgtgtact ctgaaccccg ccccattggc acccgttacc tcacccgtaa tctgtaa 2217

<210>8

<211>2266

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>Synthetic construct

<400>8

gggcgaattg ggtaccatcg atatggctgc tgacggttac ctgcccgact ggctcgagga 60

taacctgtcc gagggtatcc gtgagtggtg ggctctgaag cccggtgctc ccaagcccaa 120

ggctaaccag cagaagcagg acgacggtcg cggtctggtg ctgcccggtt acaagtacct 180

gggccccttc aacggtctgg acaagggcga gcccgtgaac gctgctgacg ctgccgctct 240

cgagcacgac aaggcttacg accagcagct gcaggctggt gacaacccct acctgcgtta 300

caaccacgct gacgctgagt tccaggaacg tctgcaggaa gatacctcct tcggcggtaa 360

cctgggtcgt gctgtgttcc aggctaagaa gcgtgtcctc gaacccctgg gtctggtgga 420

ggaaggtgct aagaccgctc ccggcaagaa gcgtcccgtc gagccctccc cccagcgttc 480

ccccgactcc tccaccggta tcggcaagaa gggccagcag cccgctcgta agcgtctgaa 540

cttcggccag accggtgact ccgagtccgt gcccgacccc cagcccctgg gcgagcctcc 600

cgctgctccc tccggtgtcg gtcccaacac catggccgct ggcggtggtg ctcccatggc 660

tgacaacaac gagggtgctg acggtgtcgg ttcctcctcc ggtaactggc actgcgactc 720

cacctggctg ggtgaccgtg tgatcaccac ctccacccgt acctgggctc tgcctaccta 780

caacaaccac ctgtacaagc agatctccaa cggcacctct ggtggtgcta ccaacgacaa 840

cacctacttc ggttactcca ccccctgggg ctacttcgac ttcaaccgtt tccactgcca 900

cttctccccc cgtgactggc agcgtctgat caacaacaac tggggtttcc gtcccaagcg 960

cctgtccttc aagctgttca acatccaagt caaggaggtc acccagaacg agggcaccaa 1020

gaccatcgct aacaacctga cctccactat ccaggtgttc accgactccg agtaccagct 1080

gccctacgtg ctgggttccg ctcaccaggg ttgcctgccc cccttccccg ctgacgtgtt 1140

catgatcccc cagtacggct acctgaccct gaacaacggt tcccaggctg tgggccgttc 1200

ctccttctac tgcctcgagt acttcccatc ccagatgctg cgtaccggta acaacttcca 1260

gttcacctac accttcgagg acgtgccctt ccactcctcc tacgctcact cccagtccct 1320

ggaccgtctg atgaaccccc tgatcgacca gtacctgtac tacctgtccc gtacccagac 1380

caccggtggc accgctaaca cccagaccct gggtttcagc cagggtggcc ccaacactat 1440

ggctaaccag gccaagaact ggctgcccgg tccctgctac cgtcagcaac gcgtgtccac 1500

caccaccggc cagaacaaca actccaactt cgcttggacc gctggcacca agtaccacct 1560

gaacggtcgt aactccctgg ctaaccccgg tatcgctatg gctacccaca aggacgacga 1620

ggaacgtttc ttcccctcca acggtatcct gatcttcggc aagcagaacg ctgctcgtga 1680

caacgctgac tactccgacg tgatgctgac ctccgaggaa gagatcaaga ccaccaaccc 1740

cgtggctacc gaggaatacg gtatcgtcgc tgacaacctg cagcagcaga acaccgctcc 1800

ccagatcggc accgtgaact cccagggtgc tctgcccggc atggtctggc agaaccgtga 1860

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cacccagtac tccaccggac aggtgtccgt cgagatcgag tgggagctgc agaaggagaa 2100

ctccaagcgt tggaaccccg agatccagta cacctccaac tactacaagt ccacctccgt 2160

ggacttcgct gtgaacaccg agggcgtgta ctccgagccc cgtcccatcg gcacccgtta 2220

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<210>9

<211>2211

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>Synthetic Construct

<400>9

atggctgccg atggttatct tccagattgg ctcgaggaca accttagtga aggaattcgc 60

gagtggtggg ctttgaaacc tggagcccct caacccaagg caaatcaaca acatcaagac 120

aacgctcgag gtcttgtgct tccgggttac aaataccttg gacccggcaa cggactcgac 180

aagggggagc cggtcaacgc agcagacgcg gcggccctcg agcacgacaa ggcctacgac 240

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acggtccagg tcttcacgga ctcagactat cagctcccgt acgtgctcgg gtcggctcac 1080

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acgcttaatg atggaagcca ggccgtgggt cgttcgtcct tttactgcct ggaatatttc 1200

ccgtcgcaaa tgctaagaac gggtaacaac ttccagttca gctacgagtt tgagaacgta 1260

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gaccaatact tgtactatct ctcaaagact attaacggtt ctggacagaa tcaacaaacg 1380

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ggacccagct accgacaaca acgtgtctca accactgtga ctcaaaacaa caacagcgaa 1500

tttgcttggc ctggagcttc ttcttgggct ctcaatggac gtaatagctt gatgaatcct 1560

ggacctgcta tggccagcca caaagaagga gaggaccgtt tctttccttt gtctggatct 1620

ttaatttttg gcaaacaagg aactggaaga gacaacgtgg atgcggacaa agtcatgata 1680

accaacgaag aagaaattaa aactactaac ccggtagcaa cggagtccta tggacaagtg 1740

gccacaaacc accagagtgc ccaagcacag gcgcagaccg gctgggttca aaaccaagga 1800

atacttccgg gtatggtttg gcaggacaga gatgtgtacc tgcaaggacc catttgggcc 1860

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aagcacccgc ctcctcagat cctcatcaaa aacacacctg tacctgcgga tcctccaacg 1980

gccttcaaca aggacaagct gaactctttc atcacccagt attctactgg ccaagtcagc 2040

gtggagatcg agtgggagct gcagaaggaa aacagcaagc gctggaaccc ggagatccag 2100

tacacttcca actattacaa gtctaataat gttgaatttg ctgttaatac tgaaggtgta 2160

tatagtgaac cccgccccat tggcaccaga tacctgactc gtaatctgta a 2211

<210>10

<211>2260

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>Synthetic Construct

<400>10

gggcgaattg ggtaccatcg atatggctgc tgatggttac ctgcccgact ggctcgagga 60

caacctgtcc gagggtatcc gtgagtggtg ggctctgaag cccggtgctc cccagcccaa 120

ggctaaccag cagcaccagg acaacgctcg tggtctggtc ctgcccggtt acaagtacct 180

gggtcccggt aacggtctgg acaagggcga gcccgtgaac gctgctgacg ctgccgctct 240

cgagcacgac aaggcttacg accagcagct gaaggctggt gacaacccct acctgaagta 300

caaccacgct gacgctgagt tccaggaacg tctgaaggag gacacctcct tcggcggtaa 360

cctgggtcgt gctgtgttcc aggctaagaa gcgtctgctc gagcccctgg gtctggtgga 420

ggaagctgct aagaccgctc ccggcaagaa gcgtcccgtc gagcagtccc cccaggaacc 480

cgactcctcc gctggtatcg gcaagtccgg tgcccagccc gctaagaaga ggctgaactt 540

cggccagacc ggtgacaccg agtccgtgcc cgacccccag cccatcggcg agccccctgc 600

tgctccctcc ggtgtcggtt ccctgaccat ggcttccggt ggtggtgctc ccgtggctga 660

caacaacgag ggtgctgacg gtgtcggctc ctcctccggt aactggcact gcgactccca 720

gtggctgggt gaccgtgtga tcaccacctc cacccgtacc tgggctctgc ctacctacaa 780

caaccacctg tacaagcaga tctccaactc cacctccggt ggttcctcca acgacaacgc 840

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gaacttcaag ctgttcaaca tccaagtcaa ggaggtcacc gacaacaacg gtgtcaagac 1020

catcgctaac aacctgacct ccaccgtgca ggtgttcacc gactccgact accagctgcc 1080

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cttctactgc ctcgagtact tcccatccca gatgctgcgt accggtaaca acttccagtt 1260

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gacccagaac aacaactccg agttcgcttg gcccggtgct tcctcctggg ccctgaacgg 1560

tcgtaactcc ctcatgaacc ccggtcccgc tatggcttcc cacaaggagg gcgaggaccg 1620

tttcttcccc ctgtccggct ccctgatctt cggcaagcag ggcaccggtc gtgacaacgt 1680

ggacgctgac aaggtcatga tcaccaacga ggaagagatc aagaccacca accccgtggc 1740

taccgagtcc tacggccagg tggccaccaa ccaccagtcc gctcaggctc aggcccagac 1800

cggttgggtg cagaaccagg gtatcctgcc cggcatggtc tggcaggacc gtgacgtgta 1860

cctgcagggt cccatctggg ctaagatccc ccacaccgac ggtaacttcc acccctcccc 1920

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cgtgcccgct gaccccccca ccgctttcaa caaggacaag ctgaactcct tcatcaccca 2040

gtactccacc ggccaggtgt ccgtggagat cgagtgggag ctgcagaagg agaactccaa 2100

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<210>11

<211>2208

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>Synthetic construct

<400>11

atggctgccg atggttatct tccagattgg ctcgaggaca ctctctctga aggaataaga 60

cagtggtgga agctcaaacc tggcccacca ccaccaaagc ccgcagagcg gcataaggac 120

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<210>12

<211>735

<212>PRT

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>Synthetic Construct

<400>12

Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Thr Leu Ser

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Glu Gly Ile Arg Gln Trp Trp Lys Leu Lys Pro Gly Pro Pro Pro Pro

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Lys Pro Ala Glu Arg His Lys Asp Asp Ser Arg Gly Leu Val Leu Pro

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Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro

50 55 60

Val Asn Glu Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp

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Arg Gln Leu Asp Ser Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala

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Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly

100 105 110

Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro

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Leu Gly Leu Val Glu Glu Pro Val Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg

130 135 140

Pro Val Glu His Ser Pro Val Glu Pro Asp Ser Ser Ser Gly Thr Gly

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Lys Ala Gly Gln Gln Pro Ala Arg Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr

165 170 175

Gly Asp Ala Asp Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Leu Gly Gln Pro Pro

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Ala Ala Pro Ser Gly Leu Gly Thr Asn Thr Met Ala Thr Gly Ser Gly

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Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Asn Ser

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Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Thr Trp Met Gly Asp Arg Val Ile

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Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu

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Tyr Lys Gln Ile Ser Ser Gln Ser Gly Ala Ser Asn Asp Asn His Tyr

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Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg Phe His

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Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn Trp

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Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn Ile Gln Val

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Lys Glu Val Thr Gln Asn Asp Gly Thr Thr Thr Ile Ala Asn Asn Leu

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Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp Ser Glu Tyr Gln Leu Pro Tyr

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Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly cys Leu Pro Pro Phe Pro Ala Asp

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Val Phe Met Val Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asn Gly Ser

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Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser

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Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Thr Phe Ser Tyr Thr Phe Glu

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Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp Arg

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Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Ser Arg Thr

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Asn Thr Pro Ser Gly Thr Thr Thr Gln Ser Arg Leu Gln Phe Ser Gln

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Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Lys Thr Ser Ala Asp Asn Asn

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Asn Ser Glu Tyr Ser Trp Thr Gly Ala Thr Lys Tyr His Leu Asn Gly

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Arg Asp Ser Leu Val Asn Pro Gly Pro Ala Met Ala Ser His Lys Asp

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Asp Glu Glu Lys Phe Phe Pro Gln Ser Gly Val LeuIle Phe Gly Lys

530 535 540

Gln Gly Ser Glu Lys Thr Asn Val Asp Ile Glu Lys Val Met Ile Thr

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Asp Glu Glu Glu Ile Arg Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Gln Tyr

565 570 575

Gly Ser Val Ser Thr Asn Leu Gln Arg Gly Asn Arg Gln Ala Ala Thr

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Ala Asp Val Asn Thr Gln Gly Val Leu Pro Gly Met Val Trp Gln Asp

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Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His Thr

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His Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala Asn

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Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln Lys

675 680 685

Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Ser Asn Tyr

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Asn Lys Ser Val Asn Val Asp Phe Thr Val Asp Thr Asn Gly Val Tyr

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<212>PRT

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<220>

<223>Synthetic Construct

<400>13

Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Thr Leu Ser

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Glu Gly Ile Arg Gln Trp Trp Lys Leu Lys Pro Gly Pro Pro Pro Pro

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Lys Pro Ala Glu Arg His Lys Asp Asp Ser Arg Gly Leu Val Leu Pro

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Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro

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Val Asn Glu Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp

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Arg Gln Leu Asp Ser Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala

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Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly

100 105 110

Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro

115 120 125

Leu Gly Leu Val Glu Glu Pro Val Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg

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Pro Val Glu His Ser Pro Val Glu Pro Asp Ser Ser Ser Gly Thr Gly

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Lys Ala Gly Gln Gln Pro Ala Arg Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr

165 170 175

Gly Asp Ala Asp Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Leu Gly Gln Pro Pro

180 185 190

Ala Ala Pro Ser Gly Leu Gly Thr Asn Thr Met Ala Thr Gly Ser Gly

195 200 205

Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Asn Ser

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Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Thr Trp Met Gly Asp Arg Val Ile

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Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu

245 250 255

Tyr Lys Gln Ile Ser Ser Ala Ser Thr Gly Ala Ser Asn Asp Asn His

260 265 270

Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg Phe

275 280 285

His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn

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Trp Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn Ile Gln

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Val Lys Glu Val Thr Gln Asn Asp Gly Thr Thr Thr Ile Ala Asn Asn

325 330 335

Leu Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp Ser Glu Tyr Gln Leu Pro

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Tyr Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro Ala

355 360 365

Asp Val Phe Met Val Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asn Gly

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Ser Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro

385 390 395 400

Ser Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Thr Phe Ser Tyr Thr Phe

405 410 415

Glu Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp

420 425 430

Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Ser Arg

435 440 445

Thr Asn Thr Pro Ser Gly Thr Thr Thr Gln Ser Arg Leu Gln Phe Ser

450 455 460

Gln Ala Gly Ala Ser Asp Ile Arg Asp Gln Ser Arg Asn Trp Leu Pro

465 470 475 480

Gly Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Lys Thr Ser Ala Asp Asn

485 490 495

Asn Asn Ser Glu Tyr Ser Trp Thr Gly Ala Thr Lys Tyr His Leu Asn

500 505 510

Gly Arg Asp Ser Leu Val Asn Pro Gly Pro Ala Met Ala Ser His Lys

515 520 525

Asp Asp Glu Glu Lys Phe Phe Pro Gln Ser Gly Val Leu Ile Phe Gly

530 535 540

Lys Gln Gly Ser Glu Lys Thr Asn Val Asp Ile Glu Lys Val Met Ile

545 550 555 560

Thr Asp Glu Glu Glu Ile Arg Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Gln

565 570 575

Tyr Gly Ser Val Ser Thr Asn Leu Gln Arg Gly Asn Arg Gln Ala Ala

580 585 590

Thr Ala Asp Val Asn Thr Gln Gly Val Leu Pro Gly Met Val Trp Gln

595 600 605

Asp Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His

610 615 620

Thr Asp Gly His Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Leu

625 630 635 640

Lys His Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala

645 650 655

Asn Pro Ser Thr Thr Phe Ser Ala Ala Lys Phe Ala Ser Phe Ile Thr

660 665 670

Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln

675 680 685

Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Ser Asn

690 695 700

Tyr Ala Lys Ser Val Asn Val Asp Phe Thr Val Asp Asn Asn Gly Val

705 710 715 720

Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Asn Leu

725 730 735

Claims

1.生产包装的细小病毒载体的方法，该方法包括：

(a)提供昆虫细胞；

(b)将一个或多个包含核苷酸序列的杆状病毒载体导入昆虫细胞，所述核苷酸序列编码：

(i)侧翼带有TR的转基因；以及

(ii)足以导致感染性细小病毒粒子包装的杆状病毒包装功能和细小病毒Rep和Cap组分，其中相对于VP2和VP3补充了足以提高感染性病毒粒子生产的VP1；以及

(c)在昆虫细胞中导入用于在昆虫细胞中表达的杆状病毒辅助功能的编码核酸；以及

(d)将昆虫细胞在足以产生包装的感染性细小病毒载体的条件下进行培养。

2.权利要求1中的方法，其中所述补充通过下述来实现：

(a)将包含表达VP1、VP2和VP3的核苷酸序列的Cap载体和包含表达VP1的核苷酸序列的VP1载体导入昆虫细胞；或

(b)单一载体，包含表达VP1、VP2和VP3的核苷酸序列以及表达VP1的其他核苷酸序列。

3.权利要求1中的方法，其中所述细小病毒是腺相关病毒(AAV)。

4.权利要求2中的方法，其中VP1载体的表达控制序列与细小病毒Cap载体的表达控制序列相比提供了相对较弱的表达。

5.权利要求3中的方法，其中VP1载体的表达为细小病毒Cap载体表达的大约1％到大约75％。

6.权利要求4中的方法，其中VP1载体的表达为细小病毒Cap载体表达的大约1％到大约50％。

7.权利要求1中的方法，其中所述补充通过下述来实现：

(a)将包含用于在昆虫细胞中表达VP1、VP2和/或VP3的优化核苷酸序列的细小病毒Cap载体导入昆虫细胞；和/或

(b)将包含用于在昆虫细胞中表达VP1的优化核苷酸序列的VP1载体导入昆虫细胞。

8.权利要求4中的方法，其中VP1载体的表达来自突变的多角体启动子，提供了细小病毒Cap载体表达的大约1％到大约75％。

9.权利要求4中的方法，其中VP1载体的表达来自突变的多角体启动子，提供了细小病毒Cap载体表达的大约1％到大约50％。

10.权利要求4中的方法，其中VP1载体的表达来自突变的多角体启动子，提供了细小病毒Cap载体表达的大约1％到大约25％。

11.权利要求1中的方法，其中补充VP1导致产生大约10∶10∶80VP1∶VP2∶VP3的分子比例。

12.权利要求1中的方法，其中补充VP1导致产生的包装的感染性细小病毒载体的量比不进行所述补充的相应方法高大约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、15、160、170、180、190或200倍。

13.权利要求3中的方法，其中补充VP1导致产生的包装的感染性细小病毒载体的量比不进行所述补充的相应方法高大约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、15、160、170、180、190或200倍。

14.权利要求1中的方法，其中所述核苷酸序列包含双链体载体、扩增子和/或质粒。

15.权利要求2中的方法，其中所述双链体载体、扩增子和/或质粒包含侧翼具有TR的转基因。

16.权利要求2中的方法，其中所述双链体载体、扩增子和/或质粒包含一个或多个Rep组分和一个或多个细小病毒Cap组分。

17.权利要求1中的方法，其中一个或多个细小病毒Rep功能和细小病毒Cap功能被插入到同一种载体中。

18.权利要求1中的方法，其中所述昆虫细胞是鳞翅目昆虫(Lepidopteran)细胞或衍生自鳞翅目昆虫细胞。

19.权利要求1中的方法，其中所述昆虫细胞是选自草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)和粉纹夜蛾(Trichopulsia ni)的物种。

20.权利要求1中的方法，其中所述昆虫细胞选自SF9、SF21、High Five^TM细胞(BRI-TN-5B1-4)、Mimic-SF9以及从上述任何一种衍生的细胞。

21.权利要求2中的方法，其中所述细小病毒Cap载体和细小病毒VP1载体各以至少为1的感染复数导入到昆虫细胞中。

22.权利要求1中的方法，其中所述细小病毒Cap功能是包含下列突变的AAV-2 Cap功能：263 Q→A；；265插入T；705 N→A；708V→A；以及716 T→N (SEQ ID NO：13)。

23.权利要求1中的方法，其中所述转基因编码治疗性产物。

24.权利要求1中的方法，其中第一种载体包含与启动子可操作地连接的侧翼具有TR的转基因和编码AAV-VP1的基因。

25.权利要求24中的方法，其中所述第一种载体还包含编码AAVVP1、VP2和VP3的基因。

26.权利要求24中的方法，其中所述第一种载体还包含复制组分。

27.权利要求1中的方法，其中第二种载体包含至少一个复制组分。

28.权利要求27中的方法，其中所述第二种载体包含另外的复制组分和编码AAV-VP1、VP2和VP3的基因。

29.权利要求3中的方法，其中所述AAV Cap组分包含用于在昆虫细胞中表达的优化核苷酸序列，选自：SEQ BD NO：5、SEQ ED NO：6、SEQ ID NO：8和SEQ ED NO：10。

30.权利要求3中的方法，其中所述AAV Rep组分包含用于在昆虫细胞中表达的优化核苷酸序列，选自：SEQ ED NO：2和SEQ ED NO：4。

31.权利要求3中的方法，包含用于在昆虫细胞中表达的优化核苷酸序列，选自：SEQ ED NO：5、SEQ ED NO：6、SEQ ED NO：8、SEQED NO：10、SEQ ED NO：2和SEQ ID NO：4。

32.权利要求3中的方法，其中所述AAV是AAV2、AAV 2.5、AAV 8或AAV 9。

33.权利要求32中的方法，其中所述AAV包含选自下列的核苷酸序列：SEQ ED NO：1、SEQ ED NO：3、SEQ ED NO：5、SEQ ED NO：11、SEQ ED NO：7和SEQ ED NO：9。

34.生产包装的细小病毒载体的方法，该方法包括：

(a)提供昆虫细胞；

(b)将包含核苷酸序列的载体导入昆虫细胞，所述核苷酸序列编码：

(i)侧翼带有TR的转基因；以及

(ii)包含Rep组分和Cap组分、足以导致感染性细小病毒粒子包装的杆状病毒包装功能，其中相对于VP2和VP3补充了足以提高感染性病毒粒子生产的VP1，并且其中的核苷酸序列分布在三种载体中；以及

(c)将细胞在足以产生包装的感染性细小病毒载体的条件下进行培养。

35.权利要求34中的方法，其中第一种载体包含编码VP1、VP2和VP3的基因以及至少一个复制组分，第二种载体包含侧翼带有TR的转基因，以及第三种载体包含编码VP1的基因。

36.权利要求34中的方法，还包含用于在昆虫细胞中表达的杆状病毒辅助功能的编码核酸。

37.用于生产包装的细小病毒载体的试剂盒，该试剂盒至少包含第一种和第二种载体，其中所述载体包含的核苷酸序列编码：

(i)侧翼带有TR的转基因；以及

(ii)包括细小病毒Rep组分和细小病毒Cap组分、足以导致感染性细小病毒粒子包装的杆状病毒包装功能，其中相对于VP2和VP3补充了足以提高感染性病毒粒子生产的VP1。

38.权利要求37中的试剂盒，其中所述第一种载体包含与启动子可操作地连接的侧翼带有TR的转基因和编码VP1的基因。

39.权利要求38中的试剂盒，其中所述第一种载体还包含编码VP1、VP2和VP3的基因。

40.权利要求37中的试剂盒，其中所述第一种载体还包含复制组分。

41.权利要求39中的试剂盒，其中所述第二种载体包含至少一个复制组分。

42.权利要求40中的试剂盒，其中所述第二种载体包含另外的复制组分和编码VP1、VP2和VP3的基因。

43.权利要求38中的试剂盒，其中所述第二种载体包含两个分开的复制组分和编码VP1、VP2和VP3的基因。

44.权利要求37中的试剂盒，还包含用于在昆虫细胞中表达的杆状病毒辅助功能的编码核酸。

45.权利要求37中的试剂盒，还包含第三种载体，其中第一种载体包含编码VP1、VP2和VP3的基因以及至少一个复制组分，第二种载体包含侧翼带有TR的转基因，和第三种载体包含编码VP1的基因。

46.权利要求37中的试剂盒，还包含至少一种昆虫细胞。

47.权利要求46中的试剂盒，其中所述昆虫细胞是鳞翅目昆虫细胞或衍生自鳞翅目昆虫细胞。

48.权利要求46中的试剂盒，其中所述昆虫细胞是选自草地贪夜蛾和粉纹夜蛾的物种。

49.包含一种或多种载体的宿主细胞，所述载体包含的核苷酸序列编码：

(i)侧翼带有TR的转基因；以及

(ii)用于复制AAV Rep组分和AAV Cap组分以及包装感染性细小病毒粒子的杆状病毒辅助功能，其中相对于VP2和VP3补充了足以提高感染性病毒粒子生产的VP1。

50.权利要求49中的宿主细胞，其中第一种载体包含表达VP1、VP2和VP3的核苷酸序列，以及第二种载体包含表达VP的核苷酸序列。

51.权利要求49中的宿主细胞，其中单一载体包含AAV Cap组分的核苷酸序列，还包含VP1组分的核苷酸序列。