JP2017503165A - Ｃｓｆｖ抗体に関する改善された診断試験 - Google Patents

Abstract

本発明は、獣医学的診断の分野に関し、具体的には、ＣＳＦＶに対する抗体の検出のための試験に関する。特に、本発明は、ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の変異型ＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープを含む担体とともに共インキュベートすることを含むことを特徴とする、試験サンプル中の野生型ＣＳＦＶに対する抗体の検出方法に関する。さらに、本発明は診断試験キット、および本発明による方法の使用に関する。また、本発明は、野生型ＣＳＦＶに感染した動物と、ＣＳＦＶに対してＣＳＦＶ（マーカー）ワクチンをワクチン接種した動物とを識別するための方法、および、ＣＳＦＶ（マーカー）ワクチンと本発明の診断試験キットの併用による、ブタ動物集団において野生型ＣＳＦＶによる感染を防除するための方法に関する。【選択図】なし

Description

本発明は、獣医学的診断の分野に関し、具体的には、ＣＳＦＶに対する抗体の検出のための試験に関する。特に、本発明は、試験サンプル中の野生型ＣＳＦＶに対する抗体の検出方法に関する。さらに、本発明は、診断試験キット、および、野生型ＣＳＦＶに対する抗体を検出するための方法の使用に関する。また、本発明は、野生型ＣＳＦＶに感染した動物と、ＣＳＦＶに対してＣＳＦＶワクチンをワクチン接種した動物とを識別するための方法、および、ブタ動物集団における野生型ＣＳＦＶによる感染を防除する方法に関する。

ヒトまたは動物が微生物または微生物に対する抗体のいずれかについて陽性であるか陰性であるかを調べるための、微生物による感染の血清診断のための種々の試験が知られている。典型的には、かかる試験は、形成されている可能性のある免疫複合体を、特異性を示す規定の抗体を用いて検出するための手法を含むものである。多くの場合、この試験はまた、シグナル強度を増幅させるための工程、および、未結合成分、非特異的な成分または不要な成分を洗い流すための１回以上の工程も有する。免疫複合体の検出はさまざまな様式、例えば、色の変化、蛍光または粒径の変化を光学的に検出すること、あるいは、免疫複合体中の放射性標識された抗原または抗体を検出することによるものであり得る。同様に、試験の物理形態は広くさまざまであり得、例えば、マイクロタイトレーションプレート、膜、ディップスティック、バイオセンサーチップ、ゲルマトリックス、またはラテックス、金属もしくはポリスチレン（ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｅｎ）などの担体（微）粒子を含む溶液などを使用するものであり得る。

かかる試験の具体的なセットアップの選択は、通常、投入されるサンプルの型、所望の試験感度（陽性サンプルが正しく同定される）、および試験特異性（真陽性サンプルと真陰性サンプルが正しく識別される）によって決定され；かかる特性は免疫応答の強度およびタイミングまたは微生物の存在に依存する。さらに、試験の経済性、例えば、大規模での適用可能性およびコストに対する要件も具体的な形式の選択の決め手となり得る。

よく知られた診断試験は：ラジオイムノアッセイ、免疫拡散法、免疫蛍光法、免疫沈降、凝集、溶血、中和、および「酵素結合イムノソルベントアッセイ」あるいはＥＬＩＳＡである。特に大規模試験のためには、液体の取扱いの自動化、結果の読み取りと加工または両方が要件となり得る。これには、従来のアッセイ形式を、ＡｌｐｈａＬＩＳＡ（商標）（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）の場合のようなより現代的で小型化された形式に置き換えることも必要となり得る。

多く使用されている診断試験はＥＬＩＳＡなどの酵素免疫測定法である。これは容易に規模を拡大することができ、非常に感度のよいものであり得る。さらなる利点の１つは、結果のダイナミック・レンジであり、それはサンプルが希釈範囲で試験され得るためである。結果は、吸光の任意単位で示され、読み出しに使用される技術装置の特性および設定にもよるが典型的には０．１〜２．５光学密度（ＯＤ）単位で示される。常套的には、適切な陽性対照サンプルと陰性対照サンプルとが含められ、ほとんどの時間、サンプルは多重に試験される。（ある希釈範囲の）規定の参照サンプルを含めることにより標準化が得られ、これによって、陽性または陰性を判定するために特定のスコアを事前に設定した値とマッチングさせることも可能になり、生物学的意味との相関、例えば：抗原の量と効力または抗体の量と免疫防御レベルとの相関も可能になる。

ＥＬＩＳＡセットアップの多くの変形型が知られているが、典型的には抗原または抗体の固相への固定化、例えば、マイクロタイトレーションプレートのウェルへの固定化が使用される。抗体を固定化させる場合、試験は「捕捉」または「サンドイッチ」ＥＬＩＳＡと称される。次に、試験サンプルを添加し、リガンド（例えば、抗原または検出対象の抗体）と結合させる。次いで、検出体（抗体、抗原、または他の結合成分）を添加する。検出体は、標識、例えば発色反応を誘発し得る酵素とコンジュゲートさせてあり、この発色反応が分光測光により読み取られ得る。他の型の標識は、ルミネッセンス、蛍光または放射能の使用であり得る。標識検出体の使用は、シグナル強度の増幅をもたらして試験感度を高めることが意図されているが、バックグラウンドシグナルも導入され得、信号対ノイズ比が低下し得る。

ＥＬＩＳＡプロトコルの変形型の一例では、試験の特異性を競合的結合の導入によって改善し、この場合、試験は「競合ＥＬＩＳＡ」、「阻害ＥＬＩＳＡ」、「干渉ＥＬＩＳＡ」または「ブロックＥＬＩＳＡ」と称される。かかるアッセイでは、試験サンプル中の要素（抗体または抗原）が、標識検出体である抗体／抗原と、固相に固定化された分子（抗原または抗体）との結合に関して競合する。これにより最大発色シグナルの低減が引き起こされ、これは、競合因子の存在または量を測定するための感度のよい方法である。結果は、最大ＥＬＩＳＡシグナルに対する阻害のパーセンテージとして示され得る。

ＥＬＩＳＡは、その多用途性と感度のため、例えば、疫学、感染サーベイランスプログラムのため、またはワクチン接種キャンペーンの有効性を確認するために一般的に使用されている。また、このＥＬＩＳＡの使用は、例えば、より関連性のある感染性疾患の根絶および防除の尺度をモニタリングするために動物保健分野にも拡張される。この状況において極めて重要なのは、診断試験の充分な感度レベルと特異性であり、それは、この点に関する誤りは、以下のいずれか：偽陽性は動物の不必要な検疫または処分の原因となり得る、および、偽陰性は未検出キャリア動物の国境を越えた輸送による病原体の拡延の原因となり得る、の様式で重大な結果を有し得るためである。ＥＬＩＳＡのかかる使用の一例は、ＯＩＥに届出を行うべき疾患、例えば、ブタ動物における豚コレラ（ＣＳＦ）の防除におけるものである。

ＣＳＦ（Ｃｌａｓｓｉｃａｌ ｓｗｉｎｅ ｆｅｖｅｒ）は、「ｈｏｇ ｃｈｏｌｅｒａ」または「ｓｗｉｎｅ ｆｅｖｅｒ」としても知られており、多くの場合、ブタ動物の致命的な疾患であり、世界中で発生する。これは豚コレラウイルス（ＣＳＦＶ）（「Ｈｏｇ ｃｈｏｌｅｒａ」ウイルスとしても知られている）によって引き起こされ、このウイルスは感染力が高い。この疾患によって多くの動物が苦しめられ、商業的養豚およびその生産品に依存する分野に対して相当の経済的損失をもたらす。

ＣＳＦＶはフラビウイルス科およびペスチウイルス属に属する。よく知られた他のペスチウイルスはボーダー病ウイルス（ＢＤＶ）（ヒツジおよびぶたに感染）ならびにウシウイルス性下痢ウイルス（ＢＶＤＶ）（畜牛、ヒツジおよびぶたに感染）である。これらの関連ウイルス間にはある程度の交差防御が存在する。ＣＳＦビリオンは比較的小さく、エンベロープがあり、約１２．３ｋｂのプラスセンス鎖の一本鎖ＲＮＡウイルスゲノムを含むものである。このゲノムは、約４０００個のアミノ酸の１つの大きなポリプロテインに翻訳され、このポリプロテインはいくつかの非構造ウイルスタンパク質により自己切断される。これにより、主構造体のウイルスエンベロープ糖タンパク質：ＥｒｎｓのＥ１とＥ２がもたらされる。このウイルスおよびその疾患に関する概説は：Ｍｏｅｎｎｉｇ（２０００，Ｖｅｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，ｖｏｌ．７３，ｐ．９３）を参照されたい。

ＣＳＦＶに対する抗体の検出のための判断基準はウイルス中和試験である。しかしながら、これは難儀で困難であるため、迅速なスクリーニングおよび検出のためにはＥＬＩＳＡ型試験が使用され、さまざまな市販の試験がＣＳＦＶ抗原またはＣＳＦＶ抗体の検出に利用可能である。かかる試験は、Ｂｌｏｍｅ ｅｔ ａｌ．（２００６，Ｒｅｖ．Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈ．（Ｉｎｔ．Ｏｆｆ．Ｅｐｉｚ．），ｖｏｌ．２５，ｐ．１０２５）に概説されている。ＣＳＦＶ抗原の試験では、完全体ウイルスまたは特定のウイルス（エンベロープ）タンパク質（ＥｒｎｓもしくはＥ２など）のいずれかが検出される。同様に、ＣＳＦＶ抗体の試験では、ウイルス抗体、Ｅ２抗体またはＥｒｎｓ抗体が検出される。対象動物における抗体の検出は抗原またはウイルスの検出よりも感度がよく、これは、抗体の方が動物内に長期間存在し、より長い検出時間枠がもたらされるためである。また、ペスチウイルス間の交差反応性のため、Ｅｒｎｓ抗原またはＥｒｎｓ抗体の検出に基づいたＣＳＦＶの診断試験は、ＢＶＤの有病率および／またはＢＶＤＶの蔓延が高い地域では信頼性がない。したがって、現在のＣＳＦＶ診断に対する着眼点はＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質に対する抗体の検出である。概説は：Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１２，Ｒｅｖ．Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈ．（Ｉｎｔ．Ｏｆｆ．Ｅｐｉｚ．），ｖｏｌ．３１，ｐ．９９７）。

ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質（以前は糖タンパク質Ｅ１、またはｇｐ５１−５４として知られていた）は、ＣＳＦＶポリプロテインのアミノ酸（ａａ）６９０位からコードされている。成熟ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質は約３７０ａａ長であり、これには、Ｅ１ Ｃ末端と重複する約２２ａａのＮ末端シグナル配列は含まれていないが、約４０ａａのＣ末端膜貫通領域が含まれている（Ｇａｎｇｅｓ ｅｔ ａｌ．，２００５，ｖａｃｃｉｎｅ ｖｏｌ．２３，ｐ．３７４１）。Ｅ２には、免疫優性Ａドメインがポリプロテインのアミノ酸７６６位〜８６６位の間に存在している（ｖａｎ Ｒｉｊｎ ｅｔ ａｌ．，１９９３．Ｊ．ｏｆ Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，ｖｏｌ．７４，ｐ．２０５３）。このドメイン内に、ウイルス中和抗体を誘導する１つの線状Ｂ細胞エピトープ：ＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープ（配列番号：１）が同定されている。このエピトープは、ＣＳＦＶポリプロテイン内のＥ２ ａａ配列のａａ １４０〜１４８に対応するアミノ酸８２９位〜８３７位に存在しており、ＣＳＦＶ株間で良好に保存されているが、ＢＶＤＶ抗体またはＢＶＤ抗体とは交差反応しない（Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｊ．ｏｆ Ｖｉｒｏｌ．，ｖｏｌ．７４，ｐ．１１６１９）。

このエピトープの特異性を使用するいくつかの市販のＥ２抗体試験：ＰｒｉｏＣＨＥＣＫ（登録商標）ＣＳＦＶ Ａｂ ２．０（以前の名称はＣｅｄｉｔｅｓｔ（登録商標）ＣＳＦＶ ２．０）（ともに：Ｐｒｉｏｎｉｃｓ ＡＧ，Ｓｃｈｌｉｅｒｅｎ−Ｚｕｒｉｃｈ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、およびＩＤＥＸＸ ＣＳＦＶ Ａｂ Ｔｅｓｔ（登録商標）（ＩＤＥＸＸ Ｅｕｒｏｐｅ Ｂ．Ｖ．，Ｈｏｏｆｄｄｏｒｐ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）が開発されている。これらの試験は、固定化されたＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質を使用する競合ＥＬＩＳＡである。Ｅ２抗体（あれば）が試験サンプル中に存在する場合、該抗体は固定化されたＣＳＦＶ Ｅ２に結合し、そのため、標識された指標抗体と競合する。指標抗体は、野生型ＣＳＦＶ Ｅ２のＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープに特異的な酵素コンジュゲートモノクローナル抗体であり；このようなキットに指標として使用される標識モノクローナル抗体はＶ２（Ｐｒｉｏｎｉｃｓ）またはＡ１８（ＩＤＥＸＸ）と称され、Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．（２０００，上掲）で使用されたＷＨ３０３モノクローナル抗体と同じ特異性を有する。

ＣＳＦに対するワクチンは既知であり、ＣＳＦＶを風土病とする国では常套的に使用されている。不活化ＣＳＦＶワクチンは実用的でなかったことから、長年、弱毒化ウイルス生ワクチンが使用されており、そのため；最も有効なワクチンは、いわゆる中国株あるいはＣ株をもとにしたものである。これは、長年の使用による非常に信頼性のある追跡記録を有し、また、ＣＳＦ大流行の場合の非常用ワクチン接種のためだけのものではあるが、欧州連合で認められている唯一の弱毒化生ワクチンである。多くの場合、ＣＳＦに対する政府の防除プログラム（例えば、ＥＵ Ｃｏｕｎｃｉｌ Ｄｉｒｅｃｔｉｖｅ ２００１／８９／ＥＣ）は、ＣＳＦＶに対する抗体に血清反応陽性である豚の輸送を禁止する貿易制限のシステムによってバックアップされている。

しかしながら、一部の国では、野豚（ｆｅｒａｌ ｐｉｇ）およびイノシシ（ｗｉｌｄ ｂｏａｒ）におけるＣＳＦＶの天然保菌宿主による頻繁な再感染に苦しめられる場合があり得る。そのため、ＣＳＦの偶発的大流行が起こり、多くの豚、即ち、感染豚と非感染豚の両方、が処分される。これは、大きな倫理的問題および相当なコストを引き起こす。また、非常用ワクチン接種に供された豚は血清反応陽性となるため、もはや輸出され得ない。これは、豚小屋の過密とさらなる経済的損失とを引き起こす。

したがって、血清学的な「感染動物とワクチン接種動物の識別」あるいは：ＤＩＶＡを可能にするワクチンの開発に対する取り組みに重点が置かれている。この型の識別試験の背後にある基本原理は、陽性または陰性の「マーカー」機能を有するワクチンを対象動物にワクチン接種すると、野生型微生物による動物の感染と血清学的に識別することができるというものである。例えば、マーカーワクチンは、野生型微生物に存在している１種類以上の抗原が欠損しているものであり得る。その結果、感染した対象は該抗原に対して血清反応陽性となるが、ワクチン接種体は該抗原に対して血清反応陰性のままである。

ＣＳＦに対する使用のために開発されたＤＩＶＡワクチンの種類の一例は、ウイルスサブユニット、例えばＥ２および／またはＥｒｎｓをもとにしたものである。しかしながら、このワクチンは防御性が低く、完全体ウイルスワクチンよりも免疫の発生が遅い。

また、ＣＳＦＶをワクチン接種なしで根絶する体制下で、かかるＣＳＦＶマーカーワクチンが市場で許容され得る唯一の方法は、信頼性のある随伴的診断試験との併用である。

１つのワクチンが強力で早期の防御ならびにＤＩＶＡ能を兼ね備えるようにする取り組みにおいて、既存のＣ株弱毒化生ＣＳＦＶワクチンがＫｏｒｔｅｋａａｓ ｅｔ ａｌ．（２０１０，Ｊ．ｏｆ Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，ｖｏｌ．１６３，ｐ．１７５）により組換えＤＮＡ手法を用いて修飾されたが、それによって、彼らはＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質のＡドメイン内のＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープに着目した。このエピトープ内のいくつかのアミノ酸を変異または欠失させた後、変異型ＣＳＦＶウイルスを強制ウイルス進化に供した。ＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープの異なる変異を有する種々の変異型ウイルスが得られた。

Ｅ２のＣ株のＣＳＦＶ変異型の一連のｖＦｌｃ−ΔＰＴのうち、１種類がさらなる試験のために選択され：ｖＦｌｃ−ΔＰＴａ１と命名された。このウイルスは、１個のアミノ酸置換と２個のアミノ酸欠失によるＥ２のＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープの変異型バージョンを有し、元のＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープに対応するエピトープは次いで：ＴＡＧＳＴＬＲＴＥ（配列番号：２）となる。この変異型ウイルスは良好なバイアビリティを示し、Ｅ２に対して強力な抗体応答を誘発した。また、変異型Ｅ２に対するウサギ抗体では、もはや親Ｃ株ウイルスの野生型Ｅ２は認識されなかった。そのため、これは、ＤＩＶＡを可能にする有効なＣＳＦＶマーカー生ワクチンの理想的な候補とみなされた。

ｖＦｌｃ−ΔＰＴａ１変異型ウイルスは次いで、ワクチンの有効性について対象動物において試験され（Ｋｏｒｔｅｋａａｓ ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｖｅｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，ｖｏｌ．１４７，ｐ．１１）、この場合、親株のものに近い防御レベルが誘発されることがわかり、チャレンジウイルスの切断が有効に抑制された。しかしながら、著者らは、この変異型ウイルスをワクチン接種した豚由来の血清が、親Ｃ株ウイルスをワクチン接種した豚由来の血清と明白に識別され得ないことが判明し、失望した。これは、Ｅ２変異型ウイルスによって、豚に、Ｅ２ ＥＬＩＳＡにおいて中程度から充分な強度の偽陽性スコアをもたらす抗体が誘導されたためである。その結果、信頼性のある識別的ＣＳＦＶ抗体試験がなかったため、新しいＤＩＶＡマーカーワクチンの市場への導入が認められなかった。

マーカーワクチンによりワクチン接種した豚由来の血清に関するＥ２ ＥＬＩＳＡにおける偽陽性スコアを解決しようとする試みにおいて、Ｋｏｒｔｅｋａａｓ ｅｔ ａｌ．（２０１１，上掲）ではＥＬＩＳＡに対するいくつかの補正、例えば：三次構造の予測を使用することによる使用ペプチドの修飾；より良好な識別が可能となり得る新しいモノクローナル抗体の使用；異なるブロック抗体を用いるＥＬＩＳＡの変更、これは他のもので有効であることが証明されていたため（Ｈｏｌｉｎｋａ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．３８４，ｐ．１０６）；および：許容される感度を維持したまま読み出しのカットオフ値の変更が検討された。これらのアプローチはすべて、偽陽性の発生を解決するのに有効でないことがわかった。

上記のように、Ｈｏｌｉｎｋａ ｅｔ ａｌ．（２００９，上掲）の結果では、異なる組換えＣＳＦマーカーをワクチン接種した豚由来の血清を試験した場合、同様のＥ２ ＥＬＩＳＡにおいて偽陽性結果は示されなかった。しかしながら：一方では、個々の血清ではなくプールされた血清が試験され、他方では、その読み取り値が検出の最下層であるため（０．１００〜０．３５０ＯＤ単位；Ｈｏｌｉｎｋａ ｅｔ ａｌ．，２００９，上掲；図３Ａ参照）、結果は有意であるとはみなされなかった。この場合、信号対ノイズ比があまりに好ましくなく、信頼性のある大規模診断試験の基盤を構成することができない。

より良好な例の１つはＲｅｉｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．による刊行物（２０１０，Ｖｅｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，ｖｏｌ．１４２，ｐ．４５）であり、ＣＳＦＶ Ｅ２のＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープをＢＶＤＶ Ｅ２の対応配列で置き換えることによりＨｏｌｉｎｋａ ｅｔ ａｌ．のものとよく似た組換えＣＳＦワクチンが構築された。Ｋｏｒｔｅｋａａｓ ｅｔ ａｌ．（２０１１，上掲）の結果に照らして、Ｒｅｉｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．はまた、変異型Ｅ２ウイルスをワクチン接種した豚の血清中に、未修飾Ｅ２エピトープに結合する交差反応性抗体も見出した。そのため、この場合も偽陽性スコアが得られ、ＤＩＶＡ試験を開発することができなかった。この問題に対処するため、Ｒｅｉｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．は、感度を犠牲にしてカットオフ値を適合させること、または偽陽性スコアが低減されるように変異型ウイルスの主鎖配列を修飾することを提案した。

そのため、ＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープに対する種々の変異が、かかる変異型エピトープをもとにしたＣＳＦＶマーカーワクチンに同じ問題を引き起すことがわかった：ｖＦｌｃ−ΔＰＴａ１ウイルスをもとにしたＣＳＦＶワクチンの場合、ＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープに対する変異によりその遺伝子座内の９個のアミノ酸のうち６個が変化した。同様に、Ｒｅｉｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（２０１０，上掲）では、Ｅ２タンパク質の対応遺伝子座内の９個のうち５個の異なるアミノ酸を試験すると、同様にこの問題が生じた。

結果として、ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の変異型ＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープを含むＣＳＦＶ（マーカー）ワクチンをワクチン接種した動物から得た血清中の野生型ＣＳＦＶ Ｅ２抗体に関するＥＬＩＳＡにおける偽陽性スコアの問題は、したがって一般に当然のものであり、今日まで依然として解決されていない。Ｅｂｌｅ ｅｔ ａｌ．（２０１３，Ｖｅｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，ｖｏｌ．１６２，ｐ．４３７）は、ＣＳＦワクチン候補の最近の概説において、ＣＳＦＶについて、ＣＳＦＶワクチンと対応するＤＩＶＡ試験の最適な組合せが未だ利用可能でないというこのジレンマを確認している。

Ｍｏｅｎｎｉｇ（２０００，Ｖｅｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，ｖｏｌ．７３，ｐ．９３） Ｂｌｏｍｅ ｅｔ ａｌ．（２００６，Ｒｅｖ．Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈ．（Ｉｎｔ．Ｏｆｆ．Ｅｐｉｚ．），ｖｏｌ．２５，ｐ．１０２５） Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１２，Ｒｅｖ．Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈ．（Ｉｎｔ．Ｏｆｆ．Ｅｐｉｚ．），ｖｏｌ．３１，ｐ．９９７） Ｇａｎｇｅｓ ｅｔ ａｌ．，２００５，ｖａｃｃｉｎｅ ｖｏｌ．２３，ｐ．３７４１ ｖａｎ Ｒｉｊｎ ｅｔ ａｌ．，１９９３．Ｊ．ｏｆ Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，ｖｏｌ．７４，ｐ．２０５３ Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｊ．ｏｆ Ｖｉｒｏｌ．，ｖｏｌ．７４，ｐ．１１６１９ Ｋｏｒｔｅｋａａｓ ｅｔ ａｌ．（２０１０，Ｊ．ｏｆ Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，ｖｏｌ．１６３，ｐ．１７５） Ｋｏｒｔｅｋａａｓ ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｖｅｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，ｖｏｌ．１４７，ｐ．１１ Ｈｏｌｉｎｋａ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．３８４，ｐ．１０６ Ｒｅｉｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（２０１０，Ｖｅｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，ｖｏｌ．１４２，ｐ．４５） Ｅｂｌｅ ｅｔ ａｌ．（２０１３，Ｖｅｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，ｖｏｌ．１６２，ｐ．４３７）

したがって、本発明の目的は、先行技術の不都合を解決すること、およびＣＳＦＶ Ｅ２のＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープ内に変異を有するＣＳＦＶワクチンをワクチン接種した動物由来のサンプルを試験する場合に、野生型ＣＳＦＶに対する抗体に関する診断アッセイにおける偽陽性結果を低減させることにより当該技術分野における必要性に対応することである。

驚くべきことに、ＤＩＶＡを可能にする野生型ＣＳＦＶ抗体に関する改善された診断試験によってこの目的が果たされ得、そのため、先行技術の不都合点が解決され得ることがわかった。この改善は、野生型ＣＳＦＶ Ｅ２抗体に関する診断アッセイのインキュベーション工程の改良と関連しており、この改良では、試験サンプルをＣＳＦＶ Ｅ２のＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープを含む固定化された担体とともにインキュベートし、ここに、ＣＳＦＶ Ｅ２の変異型ＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープを含む担体との共インキュベーションを組み込む。この改良により、ＣＳＦＶ Ｅ２抗体に関する既存の診断アッセイのプロトコルに対して限定的な改良のみによって完全に偽陽性結果が低減されることがわかった。

この改良型診断方法の好都合な効果はいくつかある：主な効果の１つは、この改良を既存の試験プロトコルに完全に一体化できることである。そのため、さらなるインキュベーション工程は必要とされず、改善された当該試験方法では、以前より多くの時間は必要とされない。これは、ある地域でＣＳＦが大流行した場合に短時間で試験する必要があり得る試験サンプルが潜在的に非常に大量数であることを考慮すると、大きな利点である。

さらに、ここでは、もはや、対応するＣＳＦＶワクチンまたはオリジナルの診断アッセイに対して劇的な変更を行う必要はない。それどころか、ここでは、既存のＣＳＦＶ Ｅ２ ＥＬＩＳＡの基本的なセットアップを、ＣＳＦＶワクチンをワクチン接種した動物由来のサンプル中の野生型ＣＳＦＶ Ｅ２抗体の検出のために使用することが可能である。これにより、証明された信頼性または充分に確立された特異性プロフィールおよび感度プロフィールを伴って、確立されたＣＳＦＶ診断アッセイに依存することが可能になる。

この改良により、ＣＳＦＶ診断アッセイが、ここでは、感染動物とワクチン接種動物を有効に区別するために使用され得、したがって、本発明により、ＤＩＶＡスクリーニングを可能にする野生型ＣＳＦＶに関する改善された診断試験が提供され、本発明は、ＣＳＦＶ（マーカー）ワクチンのための随伴的診断法として、易罹患性動物集団におけるＣＳＦＶの発生を防除するために使用され得る。

このような好都合な効果のために重要なステップは、本発明者による、ＣＳＦＶに対するワクチン接種を野生型ＣＳＦＶまたはＣ株ワクチンによる感染と識別できない原因の特定であった。

この原因は、変異型ＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープを有するＥ２を含むＣＳＦＶ（マーカー）ワクチンにより、該ワクチンの変異型Ｅ２エピトープに特異的に結合し得るだけでなく、野生型ＣＳＦＶおよびＣ株ワクチンのＥ２の未修飾ＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープにも等しく高い親和性で特異的に結合し得る抗体が誘導されることであることがわかった。これにより、ワクチン接種動物の血清サンプルを野生型ＣＳＦＶによる感染について試験した場合に偽陽性スコアが引き起こされた。対照的に、野生型ＣＳＦＶによる感染もしくはＣ株ワクチンの接種により得られた抗体、または野生型ＴＡＶＳＰＴＴＬＲ Ｅ２エピトープに対するモノクローナル抗体（例えば：Ｖ２（Ｐｒｉｏｎｉｃｓ）、Ａ１８（ＩＤＥＸＸ）もしくはＷＨ３０３（Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０００，上掲））は、ＣＳＦＶワクチンの変異型ＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープを有するＥ２タンパク質に対してなんら有意な親和性を有しないことがわかった。これが、なぜ、野生型ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質のＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープを含む担体との共インキュベーションによって、変異型ＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープを有するワクチンに対する偽陽性スコアの問題が解決されないかの理由であった。

この現象がどのようにして、またはなぜ起こるかは、現在、わかっていない。しかしながら、このような観察結果が説明され得る理論またはモデル（あれば）に拘束されないが、本発明者は、ＣＳＦＶ Ｅ２のＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープの３次元形態の影響があると推測する；この３Ｄ形態は一次アミノ酸配列が変異すると変化する。これにより変異型Ｅ２エピトープに対する抗体が誘導され、該抗体は、依然として明らかにＣＳＦＶ Ｅ２の野生型ＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープに対する特異的結合能を有する。かかる抗体は、野生型ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質に基づいた診断アッセイにおいて交差反応性であり、高度に特異的な偽陽性スコアを引き起こす。

偽陽性の試験スコアの問題の原因に対するこの見識により、本発明者は次いで、この問題に対処するための驚くべき方法を見出し、確立されたＥ２診断アッセイのプロトコルの一工程に：試験サンプルを、ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質のＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープを有する固定化された担体とともにインキュベートし、加えて：ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の変異型ＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープを含む担体とともに共インキュベートする工程という解決策を施すことができた。これにより偽陽性スコアの問題が解決された。

診断方法の改良が共インキュベーションという形態であり得るという事実は驚くべきことであった。それは、かかる手順が、通常、試験サンプル中のＣＳＦＶ Ｅ２抗体とＣＳＦＶ Ｅ２のＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープを含む固定化された担体との適正で完全な結合に対して破壊性であると予測され得、したがって、通常、当業者によって考慮され得ないためである。

したがって、第１の態様において、本発明は、野生型豚コレラウイルス（ＣＳＦＶ）に対する抗体を試験サンプル中において検出するための方法、ここで、前記サンプルはまたＣＳＦＶ Ｅ２の変異型ＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープに対する抗体も含むものであり得、前記試験サンプルをＣＳＦＶ Ｅ２のＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープを含む固定化された担体とともにインキュベートする工程を含む方法であって、該方法が、前記工程において、ＣＳＦＶ Ｅ２の変異型ＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープを含む担体とともに共インキュベートすることを特徴とする方法に関する。

本発明による「検出するための方法」は、試験サンプルの値または特性（多くの場合、「バイオマーカー」と称される）を調べるために試験サンプルに対して適用されるインビトロ方法であり、該方法の後、その結果に対して特定の意味がもたらされるようにアッセイの結果が解釈され得る。この解釈は、該方法を用いて試験サンプルで得られた結果と参照値または以前の測定値との比較に基づいてなされ、この解釈により、測定値が存在するか存在しないか、または増大したか低下したかが確立される。

本発明では、測定値は、野生型ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質のＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープに特異的な抗体の定性的存在および定量的存在である。

本発明による方法は、例えば：ラジオイムノアッセイ、免疫拡散アッセイ、免疫蛍光アッセイ、免疫沈降アッセイ、凝集アッセイ、溶血アッセイ、中和アッセイ、「酵素結合イムノソルベントアッセイ」（ＥＬＩＳＡ）またはＡｌｐｈａＬＩＳＡ（商標）としてよく知られた種々の形態のうちの１つの診断試験であり得る。

いくつかの教本に、利用可能なさまざまな診断試験およびその具体的な特長が記載されている；例えば：Ｊ．Ｈｕｅｂｎｅｒ：Ａｎｔｉｂｏｄｙ−ａｎｔｉｇｅｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ ｒｅａｃｔｉｏｎｓ（Ｃｈａｐｔｅｒ ９ ｉｎ：Ｐｉｅｒ，Ｌｙｃｚａｋ ａｎｄ Ｗｅｔｚｌｅｒ（編）：Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，ａｎｄ ｉｍｍｕｎｉｔｙ，ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．，２００４，ＩＳＢＮ：１５５５８１２４６５，ｐ．２０７−２３２）；「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」（編集：Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８８，ＩＳＢＮ−１０：０８７９６９３１４２）；および：「Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ」（Ｊ．Ｐ．Ｇｏｓｌｉｎｇ ｅｄｔ．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｐｒｅｓｓ，２０００，ＩＳＢＮ−１０：０１９９６３７１０５）。

数多くの商事会社から、診断試験用の材料および試薬または完全な診断キットを得ることができ、あるいは試験および解析の提供を受けることができる。

本発明による方法のためのプロトコル、材料および条件を考案し、最適化することは、充分に当業者の通常の能力の範囲内である。

また、当該技術分野でよく知られているように、「抗体」は免疫グロブリンタンパク質であり、一般的に５つの種類が存在する。試験サンプルでは、抗体は、典型的にはＩｇＧまたはＩｇＭ型のものであり、完全抗体である。しかしながら、本発明による方法において試薬として、例えば、二次抗体または標識抗体として使用され得るその他の抗体は完全免疫グロブリンである必要はなく（例えば、一本鎖抗体または免疫グロブリンの一部分）；また、異なる形態のもの：かかる一部分の（合成）構築物であってもよいが、該抗体の一部分は依然として抗原結合部位を含んでいるものとする。免疫グロブリンのよく知られた部分断片は：Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄＡｂもしくはＦｄ断片、Ｖｈドメイン、またはかかる断片もしくはドメインの多量体である。

診断アッセイにおける試薬としての使用のための抗体は、一般的に、ドナー動物を標的抗原で（過剰）免疫処置し、生成した抗体を該動物の血清から収集することにより作製される。よく知られたドナーはウサギおよびヤギである。別の例はニワトリであり、卵黄中に高レベルの抗体、いわゆるＩｇＹが生成され得る。あるいはまた、抗体は、例えば、よく知られたモノクローナル抗体技術により不死化Ｂリンパ球培養物（ハイブリドーマ細胞）からインビトロで作製され得、その工業規模での生産システムが知られている。また、抗体またはその断片は、それ自体を組換え発現系内で、クローニングしたＩｇの重鎖および／または軽鎖の遺伝子を発現させることによって発現させてもよい。これらはすべて、当業者によく知られている。

本発明では、および本文書全体を通して、抗体は、指向される標的に基づいて呼称する；例えば：ＣＳＦＶに対する抗体は「ＣＳＦＶ抗体」と呼称し、「Ｅ２抗体」はＥ２タンパク質に対する抗体（別名は抗Ｅ２抗体）である、など。

当該技術分野でよく知られているように、特定の標的に「対して」指向される抗体は、該標的上のエピトープに特異的な抗体であり、ここで、標的は特定の分子または実体である。抗体（またはその断片）は、エピトープに対して選択的に結合し得る場合、該エピトープに特異的である。

抗体と標的間の相互作用が特異的および／または選択的であるか否かは、当業者によって容易にアッセイされ得る。例えば、阻害に基づいた免疫アッセイの結果の特異性は、阻害が、アッセイに使用した抗原または抗体の濃度と相関していることを示すことにより調べることができる。例えば、競合結合アッセイを使用し、このコート抗原に対する抗体結合を５０％阻害するためには、どれだけ多くの抗原が必要とされるかを調べることができる（Ｂｒｕｄｅｒｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｊ．ｏｆ Ｉｍｍ．Ｍｅｔｈ．，ｖｏｌ．１３３，ｐ．２６３）。本発明の場合の一例としては：野生型ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質、およびＴＡＶＳＰＴＬＬＲエピトープ特異的（モノクローナル）抗体の使用。

診断イムノアッセイの状況において非常に重要なのは、抗体が偽陽性結合を示し、診断アッセイの偽陽性結果がもたらされる場合である。これは、該抗体の生成対象エピトープ以外のエピトープに対する比較的強力な結合によって引き起こされ得るか、または該抗体発生のエピトープに対する特異的結合であるが、異なる標的上に存在するため、その発生標的に対する特異的結合によって引き起こされ得る。

イムノアッセイ手法の当業者には、どのようにして真陽性結果と偽陽性結果を識別するが理解されるであろう（例えば、異なる型の診断アッセイでの結果を確認すること、または異なる時点の試験サンプルでの結果を確認すること）。

本発明による方法により、野生型ＣＳＦＶのＥ２タンパク質に対する抗体に関して試験した場合、偽陽性スコアの有意な低減が得られ得る。本明細書において概略を示し、例示しているように、偽陽性スコアは５倍までの低減が達成され（例えば、ＥＬＩＳＡで５０％を超える阻害から１０％未満の阻害まで）、間違ってＣＳＦＶ陽性とみなされた動物の数は１００％までの低減が達成された。

本発明による方法を使用する種々の試験において、野生型ＣＳＦＶに感染している豚由来の血清はすべて、感染から約３週間後、試験結果に基づいて陽性と判定されたが、ｖＦｌｃ−ΔＰＴａ１をもとにしたワクチンを繰り返しワクチン接種した動物由来の血清はいずれも、３回目のワクチン接種後、最後の測定時点まで陽性にならなかった。

また、本発明による方法を、Ｃｅｎｔｒａｌ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｌｅｌｙｓｔａｄ，ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）の収蔵品であり、高濃度、低濃度、陰性であるかまたは疑わしいＣＳＦＶ抗体を含む大量数の一組の約９００例の試験サンプル、ならびにＢＶＤ抗体もしくはＢＶＤＶ抗体、およびさらにはＣＳＦＶ、ＢＶＤおよび／またはＢＶＤＶの数種類の混合感染を含むいくつかの血清においても試験した。本発明による方法により、ほぼすべてのサンプルを、優れた特異性と感度を伴って正しく同定することができた。本明細書における以下の実施例を参照されたい。

実際、９００例の収蔵サンプルを試験すると、本発明による方法での共インキュベートを適用した場合、試験したサンプルのほとんどで、さらに向上した感度が観察された。これは、野生型ＣＳＦＶ Ｅ２抗体に関するブロックＥＬＩＳＡで観察された阻害パーセンテージがいくつかのサンプルで、本発明による方法を適用した場合、標準的な市販のＣＳＦＶ Ｅ２抗体ブロックＥＬＩＳＡの適用と比べて高かったことを意味する。これにより、先では疑わしいと示された５例のサンプルが、ここでは陽性にスコアリングされ、先では陰性であった２例のサンプルが、ここでは疑わしいとスコアリングされた（実施例２．３、および表２参照）。

本発明では、「野生型」豚コレラウイルスは自然状態で存在し得るＣＳＦＶをいう。これは、かかる野生型ＣＳＦＶがすべて同じであることを意味するものではない。それは、遺伝子組成および生物学的特長において多くの差異が考えられ得、または既に知られているからである。しかしながら、この用語は、本発明における使用で、修飾もしくは変異などによるヒトの介入の結果物、例えば、反復継代による、または組換えＤＮＡ手法による核酸の適合によるヒトの介入の結果物であるＣＳＦＶを除外することを意図する。

本発明では、「豚コレラウイルス」または「ＣＳＦＶ」は、一般的には、ＣＳＦＶのよく知られた特徴を有する分類学的にペスチウイルス属のウイルスをいう。これには、任意の様式で例えば亜種、株、単離菌、遺伝子型、血清型、血液型亜型、血清群、バリアントまたは亜型などとして下位分類されるＣＳＦＶも包含される。かかるＣＳＦＶは、分類学的に科の構成員の特徴的特長、例えば、ゲノム的、物理的、電子顕微鏡的および生化学的特徴、ならびに生物学的特徴、例えば、生理学的、免疫学的または病原的挙動を共有している。血清学的分類の次に、他の測定が、当該技術分野で知られているようなヌクレオチドシーケンシングまたはＰＣＲアッセイに基づいてなされ得る。

本発明の主題であるウイルス種では本明細書においてＣＳＦＶと命名しているが、これは、新たな見識によって新たなまたは異なる分類学的な群への再分類に至ったときに変更されるかもしれない分類学的分類であることは、当業者には自明であろう。しかしながら、これによって、関与する微生物またはその特徴的特長は変わらず、その学名または分類のみが変わるため、かかる再分類された生物体は依然として本発明の範囲に含まれる。

本発明による方法における使用のための「試験サンプル」は、原則的には、抗体を含む任意の型のサンプル、例えば、動物の全血のサンプルから調製した血漿サンプルまたは血清サンプルであり得る。当業者は、かかる血漿サンプルまたは血清サンプルを動物から採取して調製するために必要とされる手法および材料を充分に承知している。

好ましいのは血清サンプルであり、それは、より精製されており、例えば：凝固、遠心分離および補足的不活化のための工程を含む標準的な実験手法によって調製できるからである。

試験サンプルを、例えば、シグナル強度を改善するため、またはバックグラウンドシグナルを低減させるために、さらに加工または精製してもよい。例えば、抗体を単離して取り出してもよい。抗体精製のためのよく知られた手法は、例えば、カプリル（Ｃａｐｒｉｌｉｃ）酸もしくは硫酸アンモニウムを用いたかかる抗体の沈降、またはアフィニティクロマトグラフィーの使用である。

本発明では、用語「ｃｏｍｐｒｉｓｅ（〜を含む）」（ならびに「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」、「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」および「ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ」などの語尾変化形）は、本明細書で用いる場合、本文中のセクション、段落、請求項などに包含されている、または含まれているすべての要素および本発明に想定され得る任意の可能な組合せをいい、この場合、この用語は、かかる要素または組合せが明記されていない場合であっても使用され；かかる任意の（１または複数の）要素または組合せを排除することを示すものではない。そのため、任意のかかる本文中のセクション、段落、請求項などはまた、用語「ｃｏｍｐｒｉｓｅ」（またはその語尾変化形）が「ｃｏｎｓｉｓｔ ｏｆ（〜からなる）」、「ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ」または「ｃｏｎｓｉｓｔ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ（本質的に〜からなる）」などの用語で置き換えられた１つ以上の実施形態にも関連し得る。

「ＣＳＦＶ Ｅ２のＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープ」は、ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質のＡドメイン内の該名称を有するよく知られたエピトープをいい、９アミノ酸長の線状エピトープである。当業者には、このエピトープに対して示した名称「ＴＡＶＳＰＴＴＬＲ」が、標準的な一文字ＩＵＰＡＣコード（トレオニンはＴ、アラニンはＡ、などで示される）で示した場合のこのエピトープのアミノ酸配列とマッチしていることが明白であろう。

ＣＳＦＶ Ｅ２のＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープは野生型ＣＳＦＶにおいて保存されており（Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０００，上掲）、そのアミノ酸配列を本明細書において配列番号：１として示す。

本発明では、ＣＳＦＶ Ｅ２の「変異型」ＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープは、そのアミノ酸配列が少なくとも１つの位置において配列番号：１と異なるものである。変異は、１つの変更を伴うものであっても多数の変更を伴うものであってもよく、アミノ酸の挿入、欠失もしくは置換またはその組合せであり得る。

本発明による方法における使用のためのＣＳＦＶ Ｅ２の変異型ＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープの一例は、ｖＦｌｃ−ΔＰＴａ１などの変異型ＣＳＦＶウイルスのＥ２タンパク質に存在する対応エピトープであり、この場合、このエピトープは：ＴＡＧＳＴＬＲＴＥ（配列番号：２）である。別の例は、Ｒｅｉｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（２０１０，上掲）に記載の組換えＣＳＦＶ、例えば、ウイルスｐＡ／ＣＰ７＿Ｅ１Ｅ２ａｌｆ＿ＴＬＡであり、この場合、対応エピトープは：ＴＬＡＮＫＤＴＬＡ（配列番号：３）である。

本発明による方法における使用のためのＣＳＦＶ Ｅ２の変異型ＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープは、天然または合成のいずれかのさまざまな供給源から得られ得る。最も簡便なのは、変異をＣＳＦＶ Ｅ２のＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープ内に修飾または変異などによるヒトの介入によって、例えば、コードヌクレオチド配列を組換えＤＮＡ技術により適合させることによって導入した後、この変異型エピトープを含むタンパク質（例えば、ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質またはその一部分）をインビトロ組換え発現系内で発現させることである。

本発明では、「インキュベートする」とは、抗体とその特異的なエピトープ間で結合を行わせることをいう。これには、かかる分子相互作用の形成に対して補助的であり、適正なバッファー、温度および持続期間の使用を含む反応条件が必要とされる。本発明のためのインキュベートするための材料および方法は、よく知られたハンドブックおよび市販の試験の供給元によって提供された使用説明書に記載されている。

本発明との関連における「担体」は、ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質のエピトープを担持して提示し得る巨大分子構造体をいう。原則的に任意の構造体が適しているが、エピトープが抗体との結合に利用可能であるものとする。担体は、起源が生物系であっても鉱物であってもよく、天然であっても合成であってもよく、大きくても小さくてもよく、例えば、金属粒子、ポリマー、タンパク質または糖質であり得る。エピトープは共有結合によって結合されてもよく、非共有結合、例えば、任意の種類のイオン的、静電的、水力学的または分子的相互作用によって結合されてもよい。エピトープは担体内または担体上に含まれており、したがって、例えば、タンパク質内の内部要素または融合タンパク質として担体の一部であってもよい。担体にはまた、例えば、エピトープを含むタンパク質がリポタンパク質もしくは糖タンパク質またはコンジュゲートなどである場合のように、他の分子または基が含有されていてもよい。エピトープを担体に結合させるための方法は当該技術分野でよく知られており、生化学的手法または組換えＤＮＡ手法を含むものであり得る。

本発明では、タンパク質はアミノ酸の分子鎖である。タンパク質はネイティブもしくは成熟タンパク質、プレ−タンパク質もしくはプロ−タンパク質、またはタンパク質の免疫原性断片であり得る。とりわけ：ペプチド、オリゴペプチドおよびポリペプチドはタンパク質の定義に包含される。

本発明のための担体は、例えば吸着またはコーティングなどにより共有結合または非共有結合によって「固定化」されている：固相に結合されていることを意味する。これは、固相自体が不動であることを示唆するものではない。固相は原則的には任意の固相支持体であり得るが、本発明による検出方法の機能が可能であるものとし、種々のサイズ、形状または形態のもの、例えばプレート、粒子、膜などであり得る。

担体を固相に固定化するための方法および材料は当該技術分野でよく知られており、例えば、炭酸バッファーおよび塩基性ｐＨ値の使用を伴うものであり得る。あるいはまた、固定化は、例えば、共有結合形成を引き起こす化学反応によるもの、または担体のビオチン化とアビジンコート固相支持体への結合によるものであってもよい。

好ましくは、固相は、マイクロタイトレーションプレートのウェル、またはＡｌｐｈａＬＩＳＡアッセイにおける使用のための担体ビーズである。

本発明では、「共インキュベートする」とは、ＣＳＦＶ Ｅ２の変異型ＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープを含む担体を、ＣＳＦＶ Ｅ２のＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープを含む固定化された担体および試験サンプルと一緒にインキュベートすることを示す。実際には、これは、ＣＳＦＶ Ｅ２の変異型ＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープを含む担体を、ＣＳＦＶ Ｅ２のＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープを含む固定化された担体と試験サンプルをインキュベートするための工程に適用されるインキュベーション混合物中に、該インキュベーションに必要とされる時間の少なくとも実質的部分の間、存在させることを意味する。どれだけの時間が「実質的部分」を構成するかは、使用される診断アッセイの具体的なプロトコルの詳細に依存する。例えば、ＩＤＥＸＸ ＣＳＦＶ Ａｂ試験の製造業者の使用説明書には、試験サンプルと固定化されたＥ２タンパク質をインキュベートするための工程の時間は２時間または一晩（１２〜１８時間）のいずれかであると示されている。

本発明では、「時間の実質的部分」は、ＣＳＦＶ Ｅ２のＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープを含む固定化された担体と試験サンプルをインキュベートするための工程の時間の少なくとも２５％をいう。好ましくは該時間の５０％、より好ましくは該時間の７５、９０、９５、９９または１００％（この順に好ましい）。

この共インキュベーションは、本発明による方法において、試験サンプルと変異型ＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープを含む担体をインキュベートするために別個のさらなる工程が使用され得、ＣＳＦＶ Ｅ２のＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープを含む固定化された担体とのインキュベーションの前に行われ得るプレインキュベーションとみなされ得るインキュベーションとは別に設定される。かかるプレインキュベーションは、不要な結合反応（あれば）を低減させる可能性の良好な制御が可能になるため、インキュベーションプロトコルを最適化する場合に当業者にとって標準的な選択肢であり得る。しかしながら、このようなインキュベーションが、試験の選択性と特異性に対して有害な効果を伴うことなく、共インキュベーションとして１つの工程に好都合に一体化できることは、本発明の驚くべき所見である。

記載のように、顕著な利点の１つは、共インキュベーションが、診断アッセイを行うのに追加の時間を必要としないことである。さらなる利点の１つは、標準的な市販のＥ２ ＥＬＩＳＡの基本プロトコルが、試験成分またはプロトコル自体に対して有意な補正を伴うことなく使用できることである。

本発明による方法の一実施形態において、検出は酵素免疫測定法、より好ましくはＥＬＩＳＡ（酵素結合イムノソルベントアッセイ）によるものである。

ＥＬＩＳＡはよく知られており、形式およびプロトコルにおいてさまざまな型が知られている。一般的な利点は、迅速で信頼性のある結果が得られ、容易に規模拡大できることである。

本発明による方法の好ましい一実施形態では、ＥＬＩＳＡは間接ブロックＥＬＩＳＡである。当該技術分野で知られているように、これは、試験サンプル由来の抗体が検出体の標識抗体と、固定化されたエピトープに対する結合に関して競合するものであることを示す。試験サンプル中に存在する抗体が多いほど、その多くが固定化されたエピトープに結合し、保持され得る標識抗体が少ないほど、最大標識結合レベルの低減（阻害）がもたらされる。

検出が間接ブロックＥＬＩＳＡによるものである本発明による方法のための例示的なプロトコルは：
−ＣＳＦＶ Ｅ２のＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープを含む担体を固相にコーティングする、
−試験サンプルとＣＳＦＶ Ｅ２の変異型ＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープを含む担体を、コーティングされた該担体とともに共インキュベートした後、洗浄する、
−標識二次抗体とともにインキュベートした後、洗浄する、
−発色反応、および
−結果の読み取り
のための連続する工程のいくつかまたは全部を含むものであり得る。

該工程のうちいくつかを別途に行ってもよく、第三者が行ってもよい。例えば、市販の試験として適用される場合、試験サンプルとの共インキュベーションにおける使用の準備ができたプレコート固相を市販の供給元から得てもよい。

該プロトコルにさらに、偽陽性結合反応を遮断するための１つ以上の工程を含めてもよい。典型的には、これは、インキュベーション工程および／または洗浄工程に使用するバッファー中で、過剰の特異的タンパク質、例えば、脱脂粉乳または血清アルブミンとのインキュベーションを伴うものである。

ＥＬＩＳＡを、その試薬およびプロセス工程、例えば、インキュベーション工程の温度および持続時間；固定化または検出に使用する抗体または抗原の特異性および型；適用する固定化の量および方法；ならびに使用するインキュベーションバッファーおよび洗浄バッファーの組成を適合させることにより、さらに最適化してもよい。

酵素免疫測定法に関する一般的な論及はさまざまな刊行物、とりわけ標準的な実験教本、例えば：「Ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ（４ｔｈ ｅｄ．：Ｔｈｅｏｒｙ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｌｉｇａｎｄ ｂｉｎｄｉｎｇ，ＥＬＩＳＡ ａｎｄ ｒｅｌａｔｅｄ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）；Ｄ．Ｇ．Ｗｉｌｄ編，２０１３，ＩＳＢＮ−１０：００８０９７０３７０）；および：「Ｔｈｅ ＥＬＩＳＡ Ｇｕｉｄｅｂｏｏｋ」（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１４９，Ｊ．Ｒ．Ｃｒｏｗｔｈｅｒ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，２０００，ＩＳＢＮ−１０：０８９６０３７２８２）にみられる。別の例は、市販の供給元によるマニュアル、例えば：「Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ ＥＬＩＳＡ」，ＫＰＬ Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ，ＵＳＡ，２０１３；および：「Ａｓｓａｙ ｇｕｉｄａｎｃｅ ｍａｎｕａｌ」（Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ＆Ｃｏ．による），ｃｈａｐｔｅｒ：Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｋ．Ｃｏｘ ｅｔ ａｌ．，Ｍａｙ ２０１２である。

さらなる好ましい一実施形態では、本発明のＥＬＩＳＡは、ＣＳＦＶ Ｅ２抗体に関する市販のＥＬＩＳＡと本質的に同様のもの、例えば：ＰｒｉｏＣＨＥＣＫ（登録商標）ＣＳＦＶ Ａｂ ２．０ ＥＬＩＳＡ（以前の名称はＣｅｄｉｔｅｓｔ（登録商標）ＣＳＦＶ ２．０ ＥＬＩＳＡ、ともにＰｒｉｏｎｉｃｓ ＡＧ（Ｓｃｈｌｉｅｒｅｎ−Ｚｕｒｉｃｈ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）から入手可能）、またはＩＤＥＸＸ ＣＳＦＶ Ａｂ Ｔｅｓｔ（ＩＤＥＸＸ Ｅｕｒｏｐｅ Ｂ．Ｖ．（Ｈｏｏｆｄｄｏｒｐ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）から入手可能）と本質的に同様のものである。これに関して「本質的に同様」は、これらの市販の試験で使用されるプロトコルおよび材料に言及している。

本発明による方法のための別のプロトコルを考案することもできる。例えば、本発明による方法を、当該技術分野でよく知られたＡｌｐｈａＬＩＳＡ試験のプロトコルの特徴に基づいてセットアップしてもよい。かかる試験では洗浄工程が必要とされず、アッセイを手作業で行ってもよいが、自動化ＡｌｐｈａＬＩＳＡが好ましい。

ＡｌｐｈａＬＩＳＡプロトコルの特徴は、抗原（本発明では：ＣＳＦＶ Ｅ２のＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープを含む担体）と抗体（本発明では：ＣＳＦＶ Ｅ２のＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープに特異的な（モノクローナル）抗体）を担体ビーズに結合させ、これらの結合が発光によって検出可能であるというものである。

ＣＳＦＶ Ｅ２のＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープを含む担体は、例えば、ビオチン化されてアビジンコートアクセプタービーズ上に固定化され、ドナービーズにコンジュゲートさせた抗体と一緒に使用され得る。そのため、かかるＡｌｐｈａＬＩＳＡ試験の一工程は、ＣＳＦＶ Ｅ２のＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープを含む担体がコーティングされたアクセプタービーズを、試験サンプルおよびＣＳＦＶ Ｅ２の変異型ＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープを含む担体とともに共インキュベートすることを含むものであり得る。逆の様式（ＣＳＦＶ Ｅ２の変異型ＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープを含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ ｔｈｅ ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）担体をコーティングする）、またはどちらの担体もコーティングする中間の形態も等しく実現可能である。次いで、次の工程は抗体コートドナービーズとのインキュベーションであり、最後に結果の読み出しであり得る。

したがって、本発明による方法の一実施形態では、検出は、ＡｌｐｈａＬＩＳＡ（登録商標）の特徴を有する診断試験によるものである。

本発明による方法は、ＣＳＦＶによる感染に易罹患性である動物由来のサンプルを試験するのに最も好都合である。動物は、ブタに分類される種々の動物である。

したがって、本発明による方法の一実施形態では、試験サンプルはブタ動物に由来するものである。

本発明では、「ブタ（ｐｏｒｃｉｎｅ）」は、イノシシ科の動物をいい、好ましくはイノシシ属の動物、例えば：野生または家畜の豚（ｐｉｇ）、ぶた（ｓｗｉｎｅ）、ホッグ（ｈｏｇ）、野生のイノシシ、バビルサまたはイボイノシシをいう。また、これには、性別または年齢に言及した自由裁量の名称によって示されるブタ、例えば：雌豚（ｓｏｗ）、イノシシ、ホッグ、若い雌豚（ｇｉｌｔ）、離乳したばかりの動物の子豚（ｗｅａｎｅｒ）または子豚（ｐｉｇｌｅｔ）も包含される。

本発明による方法のさらなる好都合な適用の一例は、ＣＳＦＶに対してＣＳＦＶマーカーワクチンをワクチン接種したブタ動物のサンプルの試験である。

よく知られているように、また上記のように、マーカーワクチンの抗原は野生型抗原と抗原的に異なり、野生型バージョンと比較すると、例えばエピトープが欠失しているもの、または異なるバージョンのエピトープを有するものをもとにしている。典型的には、マーカーワクチンの抗原は生化学的手法または組換えＤＮＡ手法によって適合または修飾されており、マーカーワクチンの修飾抗原に対する抗体応答が未修飾野生型抗原に対する抗体応答と識別され得るという結果になる。これにより、血清学的「感染動物とワクチン接種動物の識別」あるいは：ＤＩＶＡが可能になる。

したがって、本発明による方法の一実施形態では、試験サンプルは、ＣＳＦＶに対してＣＳＦＶマーカーワクチンをワクチン接種したブタ動物に由来するものである。

本発明による方法の特に都合の良い適用の一例は、ＣＳＦＶ（マーカー）ワクチンが、ＣＳＦＶ抗原として、ＣＳＦＶ Ｅ２のＴＡＶＳＰＴＬＬＲエピトープにおける変異により野生型Ｅ２から外れたＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質を含むものである場合に自明となろう。上記のように、かかるワクチンをワクチン接種した動物のサンプルでは、ＣＳＦＶ抗体に関する既存の診断試験を用いた場合、偽陽性スコアがみられた。しかしながら、本発明による方法では真陽性スコアしか示されなかった。これは、獣医保健および養豚の経済性にとって大きな意味を有する。

したがって、本発明による方法の好ましい一実施形態では、試験サンプルが、ＣＳＦに対して変異型ＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープを含むＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質を含むＣＳＦＶワクチンをワクチン接種したブタ動物から採取したものである。

上記のように、原則的には、ＣＳＦＶ Ｅ２の多くの形態の変異型ＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープが、本発明による方法での共インキュベーションにおける使用に想定され得る。しかしながら、この方法は、共インキュベーションに使用されるＣＳＦＶ Ｅ２の変異型ＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープが、マーカーＣＳＦＶワクチンのものと同じである場合に最も好都合に適用される。

したがって、本発明による方法の一実施形態では、本発明による方法での共インキュベーションにおける使用のための担体に含まれたＣＳＦＶ Ｅ２の変異型ＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープが、ＣＳＦＶマーカーワクチンのＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質に存在する変異型ＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープと同じである。

さらなる考慮事項がＣＳＦＶマーカーワクチンのＣＳＦＶ Ｅ２の変異型ＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープに適用される：このワクチンは、ＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープに対する変異にもかかわらず、なお、対象動物においてＣＳＦＶに対する有効な免疫応答を誘導する能力を有していなければならない。

本発明では、好ましくは、本発明による方法の試験対象の試験サンプルが由来する動物をワクチン接種するために使用されたＣＳＦＶマーカーワクチンのＣＳＦＶ Ｅ２の一方における変異型ＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープと、本発明による方法での共インキュベーションにおける使用のための担体に含まれたＣＳＦＶ Ｅ２の他方における変異型ＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープがマッチしている。

したがって、本発明による方法の一実施形態では、共インキュベーションにおける使用のための担体に含まれたＣＳＦＶ Ｅ２の変異型ＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープが、試験サンプルを採取したブタ動物にワクチン接種するために使用したＣＳＦＶワクチンのＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質に含まれた変異型ＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープと同じである。

当業者は、どの変異型ＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープにより、かかる変異型エピトープを含むＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質を含むＣＳＦＶマーカーワクチンが有効な免疫原となるかを完璧に判断することができよう。

例えば、ワクチン接種後またはチャレンジ感染後の免疫学的応答をモニタリングする（例えば、対象の疾患の臨床徴候、臨床的スコアリング、血清学的パラメータをモニタリングする）か、または病原体を再単離し、この結果を模擬ワクチン接種動物でみられる応答と比較することにより。

注：ＣＳＦＶは感染性が高く、多くの国で届出を行うべき疾患であるため、感染性ＣＳＦＶ（野生型または弱毒化体のいずれか）が含有されている可能性のあるサンプルの実験的使用または畜産学的使用はいずれも、適切なバイオセーフティー対策を伴って国内または国際ガイドラインに沿って行われなければならない。

本発明による方法での共インキュベーションにおける使用のためのＣＳＦＶ Ｅ２の変異型ＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープを含む担体とマッチするものであり得るＣＳＦＶ Ｅ２の変異型ＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープを有するＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質を含むＣＳＦＶワクチンの例は当該技術分野で知られており、上記に記載したものである。例えば、Ｋｏｒｔｅｋａａｓ ｅｔ ａｌ．（２０１０，上掲）より；一例はｖＦｌｃ−ΔＰＴａ１と命名された変異型ＣＳＦＶであり、これは、配列番号：２に示すアミノ酸配列：ＴＡＧＳＴＬＲＴＥを有する変異型ＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープを含むＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質を有するものである。

別の例は、Ｒｅｉｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（２０１０，上掲）より：ｐＡ／ＣＰ７＿Ｅ１Ｅ２ａｌｆ＿ＴＬＡと命名された変異型ＣＳＦＶであり、これは、配列番号：３に示すアミノ酸配列：ＴＬＡＮＫＤＴＬＡを有する変異型ＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープを含むＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質を有するものである。

したがって、本発明による方法の一実施形態では、共インキュベーションにおける使用のための担体に含まれたＣＳＦＶ Ｅ２の変異型ＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープはアミノ酸配列：ＴＡＧＳＴＬＲＴＥ（配列番号：２）を有するものである。

本発明による方法の別の一実施形態では、共インキュベーションにおける使用のための担体に含まれたＣＳＦＶ Ｅ２の変異型ＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープはアミノ酸配列：ＴＬＡＮＫＤＴＬＡ（配列番号：３）を有するものである。

さらなる一実施形態では、本発明のための試験サンプルは、Ｋｏｒｔｅｋａａｓ ｅｔ ａｌ．（２０１１，上掲）に記載のＣＳＦＶワクチン、例えば上記の：ｖＦｌｃ−ΔＰＴａ１と命名された変異型ＣＳＦＶをもとにしたワクチンをワクチン接種したブタ動物に由来するものである。

したがって、本発明による方法のさらなる一実施形態では、ＣＳＦＶワクチンはｖＦｌｃ−ΔＰＴａ１ウイルスをもとにしたものである。

本発明による方法における使用について記載した担体の異なる２つの実施形態は：固相に固定化するために使用されるＣＳＦＶ Ｅ２のＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープを含む担体、および共インキュベートするために使用されるＣＳＦＶ Ｅ２の変異型ＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープを含む担体である。これらの担体は異なる形態を有するものであってもよく、変異型ＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープおよび野生型ＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープのための担体は同じ型であっても異なる型であってもよく；また、これらの担体は別個であってもよく、同じ実体、例えば、両方の型のＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープを含む１つの担体であってもよい。

本発明による方法の一実施形態において、ＣＳＦＶ Ｅ２のＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープを含む固定化された担体またはＣＳＦＶ Ｅ２の変異型ＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープを含む担体のいずれかがタンパク質であるか、または該担体がどちらもタンパク質である。

このタンパク質は同じであっても異なっていてもよい。

本発明による方法の好ましい一実施形態では、ＣＳＦＶ Ｅ２のＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープを含む固定化された担体またはＣＳＦＶ Ｅ２の変異型ＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープを含む担体のいずれかがＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質であるか、または該担体がどちらもＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質である。

野生型ＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープを有するか、または変異型ＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープを有するか以外にＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質担体の残部もまた、アミノ酸配列が異なり得る；ＣＳＦＶ Ｅ２のいくつかの例が文献に記載されており、その配列は、ＧｅｎＢａｎｋ（商標）などの公のデータベースで入手可能である。

ＣＳＦＶ Ｅ２のＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープを含む固定化された担体がＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質である場合、これにより、試験サンプル由来のＣＳＦＶに対する抗体を検出するための最も良好な機会がもたらされる。

同様に、ＣＳＦＶ Ｅ２の変異型ＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープを含む担体がＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質である場合も、これにより、動物の試験サンプル中に存在しているかもしれず、本発明の場合以外では偽陽性結果を引き起こし得る交差反応性抗体（あれば）の捕捉のための最も良好な機会がもたらされる。これは、ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質により、ＣＳＦＶ Ｅ２の変異型ＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープの天然形態に非常に近いこのエピトープの３Ｄ提示が提供されるためである。

したがって、本発明による方法の好ましい一実施形態では、該担体がどちらも完全成熟ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質である。

しかしながら、当該技術分野で知られているように、Ｅ２のＣ末端膜貫通領域、実際にはＣ末端側の半分は、抗体との結合にあまり重要でない（ｖａｎ Ｒｉｊｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｊ．ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．６８，ｐ．３９３４；Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ．，ｖｏｌ．１４９，ｐ．１８３）。そのため、当業者は、本発明による野生型ＣＳＦＶ抗体の検出方法を充分に発展または最適化することができよう。その場合、該担体のいずれか一方または両方が完全成熟Ｅ２タンパク質でないが、本発明による方法との関連における野生型ＣＳＦＶ抗体の良好な検出および偽陽性スコアの良好な低減が依然として可能であるその一部分（ただし、（変異型）ＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープ自体はなお存在しているものとする）である。

ＣＳＦＶ Ｅ２の（変異型）ＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープを含む担体としての本発明による方法におけるＣＳＦＶタンパク質またはその一部分の使用は、共インキュベーションの量および条件を変えることによりさらに最適化され得る。例えば、本発明者は、変異型ＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープを有するＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質を、よく知られたバキュロウイルス発現ベクター系を用いて発現させ、該タンパク質を精製し、この組換え発現Ｅ２タンパク質を共インキュベーションアッセイに使用した。

発現されたＥ２タンパク質の純度および量は、例えば、ＳＤＳ−ゲル−電気泳動、タンパク質染色、および光学密度測定による定量によってアッセイされ得る。択一的な方法は、ＴＡＶＳＰＴＴＬＲとは別のエピトープを介してＥ２に結合する抗体と既知濃度の参照サンプルを使用するＥｌｉｓａでの定量である。

タンパク質の純度にもよるが、（変異型）ＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープを含むＥ２タンパク質担体の量は、野生型ＣＳＦＶ抗体の最適な検出が得られるとともに、偽陽性スコアの最適な低減がもたらされるように選択される。本明細書に例示しているように、典型的には、９６ウェルマイクロタイトレーションプレートのウェル１つあたりに必要とされるＥ２タンパク質は２μｇ未満であった。また、ウェル１つあたり１μｇまたはさらには０．５μｇも有効であった。

記載のように、野生型ＣＳＦＶ抗体に関する既存の市販の診断試験は、その信頼性が、感度プロフィールおよび特異性プロフィールの測定についての非常に多数の試験データに基づいて確立されている。これは、国際的に認められている陽性参照標準サンプルと陰性参照標準サンプルの組によって維持される。このアッセイサンプルと参照サンプルの組合せの信頼性が、市場での是認およびかかるアッセイで試験される政府管轄下の輸出認証動物における使用の根拠となる。

本発明による方法が確立されたかかるアッセイの参照値および以前の試験スコアに充分に統合されるようにするため、試験プロトコルに対してさらなる適合を行ってもよい。特に、アッセイプロトコルにおけるインキュベーション条件は、ＣＳＦＶ Ｅ２の変異型ＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープが導入される共インキュベーション工程のさらなる成分に適応するように適合され得る。

本発明者は、前記工程のインキュベーション条件の適合を行わなくても、本発明による方法が依然として機能的であり、偽陰性スコアの低減に非常に有効であることを見出した；しかしながら、確立された標準サンプルを本発明による方法を用いて試験すると、得られる厳密なＯＤスコアが、該標準の以前の結果から高値側または低値側のいずれかに外れる場合があり得る。これは、さらなる化合物を添加するのにいくらかの容量の液体をインキュベーション混合物に添加することが必要となる場合があり得、これによりインキュベーションバッファーと成分（塩、安定剤、デタージェントまたはブロック剤などが挙げられ得る）の希釈が引き起こされ、標準スコアとの偏差がもたらされ得るためである。

したがって、一実施形態では、本発明による方法は、ＣＳＦＶ Ｅ２の変異型ＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープを含む担体と共インキュベートすることを含む工程のインキュベーション条件を、前記担体の添加に適応するように適合させることを含む。

この「適合」が行われ得る様式はいくつかある。最も直接的なものは、ＣＳＦＶ Ｅ２の変異型ＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープを含む担体を含む溶液を、本発明による方法における使用のためのインキュベーションバッファー中に含めることであり、ここで、インキュベーションバッファーは、該方法で使用される場合の最終濃度と比べて高い濃度にする。例えば、ＣＳＦＶ Ｅ２の変異型ＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープを含む担体を含む溶液とインキュベーションバッファーを等容量で合わせる場合、インキュベーションバッファーをその最終使用濃度の２倍のストック溶液として準備するのがよい。また、ＣＳＦＶ Ｅ２の変異型ＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープを含む担体を含む溶液中に既に存在している塩またはバッファー（あれば）に対して補正を行うことが必要となる場合もあり得る。この原則は、インキュベーションバッファーストック溶液の他の容量比および対応濃度に容易に適合される。

あるいはまた、ＣＳＦＶ Ｅ２の変異型ＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープを含む担体を既に含んでいるインキュベーションバッファーの既製のプレミックス溶液を準備してもよく、この場合、インキュベーションバッファーはその最終使用濃度である。

これまでの例は、ＣＳＦＶ Ｅ２の変異型ＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープを含む担体を溶液中に準備することに依存したものであった。しかしながら、これはタンパク質の安定性に最適でない場合があり得るため、代替法は、ＣＳＦＶ Ｅ２の変異型のエピトープを含むタンパク質を、最終使用濃度のインキュベーションバッファーの容器の隣の別個の容器内に凍結乾燥形態で準備することである。次いで、該タンパク質を使用直前にインキュベーションバッファーで再構成させると、これは該タンパク質の安定性に影響を及ぼさず、再構成によってインキュベーションバッファーの濃度が（目立つほど）変化することはない。

当業者は、同様の溶液を得るための他の組合せを考案し、最適化することができよう。

記載のように、本発明による方法を適用する都合の良い様式は、該方法を適用するために必要な種々の成分を備えた診断試験キットの使用によるものである。

したがって、本発明のさらなる一態様は、本発明による方法を実施するための診断試験キットに関する。

本発明では、「診断試験キット」は、本発明による方法を行うためのパーツのキットに関する。キットは、該方法を適用するための成分のうちの１種類以上、特に：固相に固定化されたＣＳＦＶ Ｅ２のＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープを含む担体、およびＣＳＦＶ Ｅ２の変異型ＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープを含む担体を備えたものである。キットは、簡便な形態の容器で供給されるのがよく、サンプルの希釈およびインキュベーション、ブロックまたは洗浄のためのバッファーを備えていてもよく、該方法をどのようにして行うか、およびどのようにして結果を読み取り、解釈するかの使用説明を備えていてもよい。

一実施形態では、キットは、多数のウェルを有する容器を備えたもの、例えばマイクロタイトレーションプレートを備えたものであり得る。容器のウェルは、本発明による方法における使用のための１種類以上の成分が収容されるように処理され得る。

本発明による診断試験キットの好ましい一実施形態では、ＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープを有するＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質は、マイクロタイトレーションプレートのウェルに固定化される。

本発明による診断試験キットに含められていてもよい使用説明は、例えば、キットの構成要素が収納された箱に書かれたものであってもよく；その箱に小冊子で存在させてもよく；キットの販売業者などのインターネットのウェブサイトで見ることができる形態またはダウンロードできる形態であってもよい。

本発明では、診断試験キットは、本発明による方法を含むアッセイにおける併用のために、例えばインターネットのウェブサイトで、記載のパーツ（商業規模に関連）を申し込めるものであってもよい。

一実施形態では、本発明による試験キットは、野生型ＣＳＦＶ Ｅ２抗体に関する既知の市販の試験キットのうちの１つをベースにしたものであり得る、すなわち、さらなる成分との共インキュベーションに適応するように改良を加えて、例えばＰｒｉｏＣＨＥＣＫ（登録商標）ＣＳＦＶ Ａｂ ２．０（Ｐｒｉｏｎｉｃｓ）またはＩＤＥＸＸ ＣＳＦＶ Ａｂ Ｔｅｓｔ（登録商標）（ＩＤＥＸＸ）と本質的に同じものであり得る。改良は、共インキュベートするための使用説明が提供されるように補正したユーザー使用説明に関するものであり得る。また、キットは、さらに、例えばＣＳＦＶ Ｅ２の変異型ＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープを含む担体を含むものであり、インキュベーションバッファー中に再懸濁させる凍結乾燥調製物を備えた容器を備えたものであってもよい。あるいはまた、試験キットは、最終使用濃度よりも高い濃度のインキュベーションバッファーのストック溶液を入れた容器と、共インキュベーションでインキュベーションバッファーストック溶液と使用するためのＣＳＦＶ Ｅ２の変異型ＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープを含む担体を含む溶液を備えた容器とを備えたものであってもよい。本発明による診断試験キットの成分を組み込むための他のいくつかの実施形態が当業者に想定され得よう。したがって、かかる実施形態は本発明の範囲に含まれる。

したがって、一実施形態では、本発明による試験キットは、ＣＳＦＶ Ｅ２の変異型ＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープを含む担体を備えた容器を備えたものである。

さらなる一態様において、本発明は、本発明による方法または本発明による診断試験キットでの共インキュベートするための、ＣＳＦＶ Ｅ２の変異型ＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープを含む担体の使用に関する。

かかる使用により、動物試験サンプル中、特に、ＣＳＦに対して変異型ＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープを含むＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質を含むＣＳＦＶワクチンをワクチン接種した動物由来のサンプル中の野生型ＣＳＦＶ抗体の検出がもたらされる。この使用により、記載のように、偽陽性スコア（あれば）の低減がもたらされる。

一実施形態では、本発明による使用は、ＣＳＦＶ Ｅ２の変異型ＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープを含む担体の使用に関する。好ましくは、該担体はタンパク質であり、好ましくはタンパク質はＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質であり、好ましくはＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質は完全成熟タンパク質である。

本発明による検出するための方法のさらなる好都合な適用の一例は、ＣＳＦＶのワクチン接種および検出のためのＤＩＶＡアプローチに対する適用におけるものである。これにより、ＣＳＦＶに対してワクチン接種された動物とＣＳＦＶに感染している動物の識別が可能になる。ワクチン接種が変異型ＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープを含むＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質を含むＣＳＦに対するワクチンの使用によるものであった場合、この様式での血清学的識別が可能であるのは、本発明による方法での場合のみであり、その結果、偽陽性スコアが解消される。

したがって、さらなる一態様において、本発明は、野生型ＣＳＦＶに感染した動物と、ＣＳＦＶに対してＣＳＦＶワクチンをワクチン接種した動物を識別するための方法であって、該ワクチンが、変異型ＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープを含むＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質を含む方法に関し、該方法は、本発明による検出方法の使用を含むもの、または本発明による診断試験キットの使用を含むものである。

本発明による識別方法は、上記のような動物試験サンプルが使用されるインビトロ診断のための方法である。当業者には、本発明による識別方法はそれ自体が、検査対象の試験サンプルの診断のスコアの結果を伴うものであることが認識されよう。特に、ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質に対する抗体の検出は、これが存在するか存在しないか、またはその絶対値でのレベル、または対照サンプルの値との比較での相対値のいずれかによるものである。

該方法のための供給物は被験体由来の試験サンプルである；被験体は、好ましくはブタ動物；試験サンプルは、好ましくは血液サンプル、より好ましくは血清または血漿のサンプル。

感染動物とワクチン接種動物の最終識別を行うため、試験スコアが陽性であるか陰性であるかを解釈する必要がある；実際には、これは：特定の閾値より上であるか下かであるかを意味する。これは試験に、試験サンプルとともに試験するいくつかの参照標準サンプルを組み込むことにより簡便に行われ得る。これは本実施例に記載している。陽性参照サンプルおよび陰性参照サンプルは、動物において調製してもよく、いくつかの公共機関および参考検査室、例えば、ドイツのハノーバー獣医科大学のＣｏｍｍｕｎｉｔｙ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｆｏｒ ＣＳＦから入手することもできる。

試験サンプルを陽性、陰性または疑わしいとスコアリングした後、これを外挿すると、試験サンプルを採取したドナー動物が野生型ＣＳＦＶによる感染について陽性、陰性または疑わしいかが診断され得る。

動物が陽性（疑わしい）と診断された場合、管理規則に沿って、動物は、ワクチン接種によって処置され得る、および／または検疫のため隔離され得るか、あるいは責任ある様式で処分され得る。

したがって、本発明による識別方法の一実施形態では、該方法はまた、以下：
−試験サンプルを採取するための工程
−得られた試験結果を、陽性参照サンプルおよび陰性参照サンプルの結果との比較によって解釈するための工程
−サンプルで得られた試験結果を所定のカットオフ値と比較するための工程、
−サンプルを、野生型ＣＳＦＶに対する抗体が含まれているかについて陽性、陰性もしくは疑わしいとスコアリングするための工程、
−サンプルドナーを、野生型ＣＳＦＶによる感染について陽性、陰性または疑わしいと診断するための工程、または
−サンプルドナーを、野生型ＣＳＦＶによる感染についての診断の陽性または疑わしいという結果に基づいて、ワクチン接種、検疫および／または処分によって処置する（ことを推奨する）ための工程から選択される１つ以上の工程も含むものである。

１つ以上の好ましい実施形態では、サンプルは血清サンプルである、または：試験結果はＥＬＩＳＡでの阻害パーセンテージのスコアである。

好ましい一実施形態では、試験サンプルは、ＣＳＦに対して変異型ＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープを含むＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質を含むＣＳＦＶワクチンをワクチン接種したブタ動物に由来するものである。

別の一態様において、本発明は、ＣＳＦＶによる感染を診断するためのインビトロ方法に関し、該方法は、本発明による検出方法の使用を含むもの、または本発明による診断試験キットの使用を含むものであり、野生型ＣＳＦＶに対する抗体の存在を、陽性参照サンプルおよび陰性参照サンプルのスコアとの関連において判定する。

本発明のさらなる一態様では、本発明による検出するための方法または本発明による診断試験キットは、ＣＳＦＶ疾患の根絶のため、または国内のサーベイランスプログラムにおいて、ＣＳＦＶワクチンのワクチン接種として随伴的診断法として使用される。

この組合せにより、ＣＳＦＶに関するＤＩＶＡアプローチが適用でき、これにより感染動物とワクチン接種動物の識別が可能になる。

したがって、さらなる一態様において、本発明は、変異型ＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープを含むＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質を含むＣＳＦＶワクチンと本発明による診断試験キットの併用による、ブタ動物集団において野生型ＣＳＦＶによる感染を防除するための方法に関する。

本発明により、偽陽性スコアの大幅な低減がもたらされるため、ワクチン接種動物由来の（血清）サンプルは、ここでは、野生型ＣＳＦＶに対する抗体について陰性であると確実に同定され得る。サーベイランスプログラム、撲滅プログラムまたは根絶プログラムの状況においては、真陽性の動物のみが選び出されて適切な防除および検疫の措置に供される必要がある。

したがって、ＣＳＦＶワクチンと診断方法のこの併用により、望ましくない非常に費用のかかる撲滅策を構造化されたワクチン系ＣＳＦＶ根絶プログラムで置き換えることが可能になり、苦しむ動物および経済費用が低減される。

「ブタ動物集団」は、限局（飼育場）レベル、地域レベルまたはさらには全国レベルでの群として取り扱われ得る。「併用」のための詳細およびプロトコルは、使用される具体的な（マーカー）ＣＳＦＶワクチンに対して指示されるワクチン接種プロトコルに依存する。また、併用の成果は、スクリーニングの要件および理由またはさらには順守する必要があり得る具体的な政府規制に依存する。

一例は：定期ワクチン接種の場合、豚は、若年期に１回または２回、ＣＳＦＶに対してワクチン接種され、例えば１年間隔でブースターワクチン接種を受ける。このような動物が、野生型ＣＳＦＶ感染の疑いが生じた場合、いつでも試験され得る。択一的に：ワクチン接種されている輸出が意図された豚は、意図された輸出期日の直前に試験され得る。また：ＣＳＦＶ感染が疑われる場合またはＣＳＦＶ大流行の状況では、ワクチン接種および試験は数週間の短期間以内に、さらにはおそらく数日以内に行われ得る。当業者に想定され得るこれらおよび他の実施形態はすべて、本発明の範囲に含まれる。

実際には、サンプルが野生型ＣＳＦＶ抗体について陽性か陰性にスコアリングされ得る場合、確認は、同じ対象由来のものであるが異なる時点のサンプルを再試験すること、または同じ家畜群もしくはエリアの他の動物を試験することにより得られ得る。あるいはまた、結果を、異なる手法および異なる型のサンプルを用いて、例えば、ウイルス中和アッセイによる血液、組織、鼻腔拭い液（ｓｗａｐ）または糞中のウイルスの検出によって、またはウイルス核酸の検出によって（例えば、ＰＣＲによって）確認してもよい。

図１は、Ｋｏｒｔｅｋａａｓ ｅｔ ａｌ．，２０１１（上掲）に記載のサンプル中のＣＳＦＶ Ｅ２抗体に関するブロックＥＬＩＳＡ による解析の結果である：標準的な市販のアッセイによる解析と、本発明による方法による解析とを比較している。

点線はＣ株ＣＳＦＶワクチンをワクチン接種した豚のサンプルである「ＣＳ」サンプルの結果を表し；実線は、ｖＦｌｃ−ΔＰＴａ１ウイルスをもとにしたマーカーワクチンをワクチン接種した豚のサンプルである「ＶＳ」サンプルの結果を示す。

灰色の水平バーは、サンプルを野生型ＣＳＦＶ Ｅ２抗体について陽性、疑わしいまたは陰性であると解釈するための種々のアッセイにおける閾値スコアを示す。

図１Ａは、比較例：Ｋｏｒｔｅｋａａｓ ｅｔ ａｌ．，２０１１（上掲）の図４Ａの再現の結果である。使用したＥ２ ＥＬＩＳＡはＰｒｉｏＣＨＥＣＫ（登録商標）ＣＳＦＶ Ａｂ ２．０（Ｐｒｉｏｎｉｃｓ）であった。
図１は、Ｋｏｒｔｅｋａａｓ ｅｔ ａｌ．，２０１１（上掲）に記載のサンプル中のＣＳＦＶ Ｅ２抗体に関するブロックＥＬＩＳＡ による解析の結果である：標準的な市販のアッセイによる解析と、本発明による方法による解析とを比較している。

点線はＣ株ＣＳＦＶワクチンをワクチン接種した豚のサンプルである「ＣＳ」サンプルの結果を表し；実線は、ｖＦｌｃ−ΔＰＴａ１ウイルスをもとにしたマーカーワクチンをワクチン接種した豚のサンプルである「ＶＳ」サンプルの結果を示す。

灰色の水平バーは、サンプルを野生型ＣＳＦＶ Ｅ２抗体について陽性、疑わしいまたは陰性であると解釈するための種々のアッセイにおける閾値スコアを示す。

図１Ｂは、異なる市販のＥ２ ＥＬＩＳＡであるＩＤＥＸＸ ＣＳＦＶ Ａｂ Ｔｅｓｔ（登録商標）（ＩＤＥＸＸ）を使用した、Ｋｏｒｔｅｋａａｓ ｅｔ ａｌ．，２０１１（上掲）によるサンプルの再試験の結果である。
図１は、Ｋｏｒｔｅｋａａｓ ｅｔ ａｌ．，２０１１（上掲）に記載のサンプル中のＣＳＦＶ Ｅ２抗体に関するブロックＥＬＩＳＡ による解析の結果である：標準的な市販のアッセイによる解析と、本発明による方法による解析とを比較している。

点線はＣ株ＣＳＦＶワクチンをワクチン接種した豚のサンプルである「ＣＳ」サンプルの結果を表し；実線は、ｖＦｌｃ−ΔＰＴａ１ウイルスをもとにしたマーカーワクチンをワクチン接種した豚のサンプルである「ＶＳ」サンプルの結果を示す。

灰色の水平バーは、サンプルを野生型ＣＳＦＶ Ｅ２抗体について陽性、疑わしいまたは陰性であると解釈するための種々のアッセイにおける閾値スコアを示す。

図１Ｃは、本発明による検出するための方法を使用した、Ｋｏｒｔｅｋａａｓ ｅｔ ａｌ．，２０１１（上掲）によるサンプルの再試験の結果である：ＩＤＥＸＸ ＣＳＦＶ Ａｂ Ｔｅｓｔの一工程に共インキュベーションを導入した。
図２は、４００例を超える陰性領域のサンプル中のＣＳＦＶ抗体の解析の結果である。試験は、本発明による方法における共インキュベーションという改良を伴ってＩＤＥＸＸ ＣＳＦＶ Ａｂ Ｔｅｓｔ（登録商標）（ＩＤＥＸＸ）のプロトコルに従って行った。結果を、マイクロタイトレーションプレート毎の検出されたＥＬＩＳＡでの阻害パーセンテージの平均として、すべてのサンプルを合わせたものの結果およびすべてのプレートを合わせたものの結果とともに示す。最高値と最低値を黒色のひし形で示して黒色バーで結び、平均を灰色のひし形で示す。 図３は、実験的にＣＳＦＶに感染させ、接種後２、３または４週間目にサンプル採取した豚由来の４００例を超えるサンプルの解析の結果である。すべての動物からではなく、３例のサンプルを採取した。検出方法は、「本発明」と示した本発明による方法；または「市販品」と示した市販のＥＬＩＳＡ（ＩＤＥＸＸ ＣＳＦＶ Ａｂ Ｔｅｓｔ）のいずれかにした。分類：陰性、疑わしいおよび陽性は、市販のＥＬＩＳＡのスコアリングスケジュールに従ってＥＬＩＳＡでの阻害がそれぞれ３０％未満、３０〜４０％または４０％超に割り当てられるＥＬＩＳＡでの阻害パーセンテージ測定値に基づいて行った。

次に、本発明を以下の非限定的な実施例によってさらに説明する。

［実施例］
［実施例１］：ブタサンプルの試験：
１．１．試験サンプル：
実施例１で使用した試験サンプルはＣｅｎｔｒａｌ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｌｅｌｙｓｔａｄ，ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）から入手し、Ｋｏｒｔｅｋａａｓ ｅｔ ａｌ．，２０１１（上掲）に記載されたものである。要するに：８週齢の血清反応陰性の豚に：Ｃ株またはｖＦｌｃ−ΔＰＴａ１ウイルスのいずれかをもとにした生ＣＳＦＶワクチンをワクチン接種した。数週間にわたって血液サンプルを採取した。血清を試験用に調製した。ワクチン接種後２８日目、動物を野生型ＣＳＦＶにチャレンジ感染させた。

１．２．先行技術のＥＬＩＳＡ試験：
Ｋｏｒｔｅｋａａｓ ｅｔ ａｌ．，２０１１（上掲）に記載のように、取得したブタ血清を、市販のＥＬＩＳＡ：ＰｒｉｏＣＨＥＣＫ（登録商標）ＣＳＦＶ Ａｂ ２．０（Ｐｒｉｏｎｉｃｓ）を用いて試験した。これは製造業者の使用説明書に従って行い、要するに：プレコートされたマイクロタイトレーションプレートを使用し、キットのサンプルバッファーを分注した。対照サンプルを特定のウェルに添加し、試験サンプル（ブタ血清）を他のウェルに添加した。次にプレートをインキュベートし、洗浄し、コンジュゲートを分注した。再度、プレートをインキュベートし、洗浄し、最後に発色試薬を添加し、インキュベートし、次いで停止させた。次に、ＯＤを測定することによりプレートの読み取りを行った。ＥＬＩＳＡでの阻害パーセンテージを陽性標準に基づいて計算した。結果を図１Ａに、Ｋｏｒｔｅｋａａｓ ｅｔ ａｌ．，２０１１（上掲）の図４Ａを本質的に再現した比較結果として示す。このＥＬＩＳＡでは、陽性／陰性を分けるための閾値は４０％阻害である。

この結果から明らかなように：Ｃ株をワクチン接種した豚の血清サンプル（点線）ならびにｖＦｌｃ−ΔＰＴａ１ウイルスマーカーワクチンをワクチン接種した豚由来のサンプル（実線）は、どちらも経時的に陽性応答を示す；すなわち、４０％以上の阻害を誘導する。そのため、Ｃ株ワクチンをワクチン接種した動物またはマーカーＣＳＦＶワクチン（すなわち、ｖＦｌｃ−ΔＰＴａ１ウイルス）をワクチン接種した動物の明白な識別を行うことができなかった。

１．３．先行技術のサンプルの再試験：
Ｋｏｒｔｅｋａａｓ ｅｔ ａｌ．２０１１（上掲）のこれらの血清サンプルを次いで、ＣＳＦＶ Ｅ２抗体に関する異なる市販のＥＬＩＳＡ：ＩＤＥＸＸ ＣＳＦＶ Ａｂ Ｔｅｓｔ（登録商標）（ＩＤＥＸＸ）を用いて製造業者の使用説明書に従って、および上記のＰｒｉｏｎｉｃｓ ＥＬＩＳＡのものと本質的に同じプロトコルで再試験した。

結果を図１Ｂに示す。灰色の水平バーは、このアッセイで陽性／陰性を分けるための閾値を示し、ここで：陰性は３０％以下の阻害であり；陽性は４０％以上の阻害であり；３０と４０の間の阻害％スコアは疑わしいサンプルである。阻害レベルがマイナスの値である結果は、陰性対照のものより高いＯＤ値を有するサンプルを表す。このようなものは阻害％値がゼロとみなされ得る。

このグラフから明らかなように、Ｐｒｉｏｎｉｃｓ ＥＬＩＳＡでの結果と同様、ほぼすべてのサンプルが経時的に陽性反応を示す；１匹のマーカーワクチン接種個体（豚番号３１６１）だけ完全に陰性のままであった。豚番号３１６３および３１６４由来の２例のサンプルではワクチン接種後４２日目または４９日目に急上昇値が示され、これはチャレンジ反応と関連しているかもしれない；材料が不足していたため、サンプルを再試験することができなかった。

１．４．Ｅ２タンパク質
本発明による方法での共インキュベーションにおける使用のためのＥ２タンパク質を、Ｃ株およびｖＦｌｃ−ΔＰＴａ１ウイルスのＣＳＦＶウイルスのＥ２遺伝子から作製した。最初に、これらのＥ２遺伝子のヌクレオチド配列を、バキュロウイルス−昆虫細胞発現系での発現のためにコドン最適化するとともに、サイレント変異のみを使用した。次に、この最適化した配列に従うＤＮＡを化学合成し、ｐＦａｓｔＢａｃ（登録商標）プラスミド（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）内にポリヘドリンプロモーターの後ろにクローニングした。この発現カセットを部位特異的転位によって組換えバクミドＤＮＡ内に移し、ＤＨ１０Ｂａｃ大腸菌コンピテント菌体内で増幅させた。次に、バクミドＤＮＡを単離し、Ｓｆ９昆虫細胞にトランスフェクトするために使用した。トランスフェクション上清みから得られた組換えバキュロウイルスを、新たなＳｆ９昆虫細胞に感染させるために使用した。バキュロウイルスを単離し、２Ｌ容バイオリアクター内で培養するＳｆ２１昆虫細胞に感染させるために使用した。どちらのＥ２タンパク質もこのようなバイオリアクター培養液中に、主に上清み中に発現された。これを収集し、Ｅ２タンパク質をアフィニティカラムクロマトグラフィーにより、ＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープ特異的モノクローナル抗体を結合させておいたＳｅｐｈａｒｏｓｅカラムで単離した。精製Ｅ２タンパク質をカラムから収集し、阻害ＥＬＩＳＡによって定量した。

ＳＤＳ−ゲル電気泳動を使用し、精製した発現Ｅ２タンパク質を特性評価した：約８０％の純度の約８０ｋＤａの単一のバンドが観察された。次いでこのＥ２をＥｌｉｓａで、重量標準サンプルと並べて定量した。変異型ＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープを有する組換え発現ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質を約８００μｇ／ｍｌの精製ストック溶液として常套的に得ることができた。

１．５．本発明による方法による検出：
試験サンプル中の野生型ＣＳＦＶに対する抗体を検出するための本発明による方法を、上記のＫｏｒｔｅｋａａｓ ｅｔ ａｌ．，２０１１（上掲）のサンプルに対して適用した。

プロトコルは、おおむねＩＤＥＸＸ ＥＬＩＳＡに基づいており、共インキュベーションを加えた。要するに：ＩＤＥＸＸ ＣＳＦ Ａｂ Ｔｅｓｔ Ｋｉｔを、１点：キットの標準サンプル希釈液を２倍濃縮型に置き換えたことを除いて製造業者の使用説明書に従って使用した。次いで、２５μｌ（これは試験キットのプロトコルに指示された容量の半分である）のこの２倍サンプル希釈液を、Ｅ２コートウェル内で、５０μｌの血清サンプルおよび変異型ＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープを有するバキュロウイルス発現ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質の溶液２５μｌとともに、約１μｇのＥ２／ウェルが存在するように共インキュベートした。

この共インキュベーションで使用した変異型ＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープを有するＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質は、ｖＦｌｃ−ΔＰＴａ１ワクチンウイルスに含まれているＥ２であった。

得られた結果を図１Ｃに示すが、共インキュベーションなしの同じアッセイの結果（図１Ｂ）；または共インキュベーションなしの同様のアッセイ（図１Ａ）との違いが容易にわかる。Ｃ株をワクチン接種した豚由来のサンプルはすべて陽性反応を示すが、マーカーワクチン接種した豚由来のサンプルはすべて陰性反応を示す。ブースターワクチン接種の影響はみられず、豚番号３１６３および３１６４で観察された急上昇値でさえ、閾値より下であった。このように、弱毒化ＣＳＦＶ生ワクチンに対して有効なＤＩＶＡ試験がついに可能になる。

この実験を、共インキュベーションに野生型ＣＳＦＶ由来のＥ２タンパク質を用いて繰り返した場合（ここには示していない）、結果は全く異なった：サンプルはすべて、Ｃ株をワクチン接種した豚由来のサンプルでさえ、陰性スコアであった。そのため、これは有用な代替法ではない。

また、共インキュベーションの導入を、ＰｒｉｏＣＨＥＣＫ（登録商標）ＣＳＦＶ Ａｂ ２．０ ＥＬＩＳＡ（Ｐｒｉｏｎｉｃｓ）の基本プロトコルにおいても行った。本質的に同じ結果が観察された：偽陽性結果の非常に有効な低減により、陽性（ここでは：ＥＬＩＳＡで４０％より上の阻害）のスコアを有するサンプルは真陽性のみであった。

１．６．先行技術のサンプルの再試験の結果のまとめ：
上記の実験の結果を表１にまとめる。これは、Ｋｏｒｔｅｋａａｓ ２０１１（上掲）の実験でのワクチン接種動物になされ得る分類が、ＣＳＦＶ抗体を陽性／疑わしいについて試験する場合にどのＥ２抗体検出方法が適用され得るかに応じて異なることを明らかに示す。ＣＳＦＶ Ｅ２の変異型ＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープを含む担体との共インキュベーションの使用によってのみ、変異型ＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープを含むＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質を含むＣＳＦＶワクチンをワクチン接種した動物が、野生型ＣＳＦＶ感染動物またはＣ株をワクチン接種した動物と明白に区別され得ることが明らかである。

表１：種々のＣＳＦＶ Ｅ２抗体検出方法を用いてＣＳＦＶ抗体について疑わしいまたは陽性とスコアリングされたＫｏｒｔｅｋａａｓ ２０１１の実験での動物の数

［実施例２］２：試験特異性および試験感度の確立
本発明による方法の特異性および感度が標準的な市販のＣＳＦＶ Ｅ２抗体ＥＬＩＳＡのものと少なくとも同等であることを調べるため、大量数のサンプル（約９００例）を本発明による方法の１つを用いて試験した。サンプルは、Ｗ．Ｌ．Ｌｏｅｆｆｅｎ博士によりＶｉｒｏｌｏｇｙ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ，Ｃｅｎｔｒａｌ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｌｅｌｙｓｔａｄ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）の収蔵品から入手することができ、４００例を超える一群のＣＳＦＶ陰性領域のオランダの豚血清、実験的にＣＳＦＶに感染させた豚由来の４００例を超える一群のサンプル（該サンプルは数週間にわたってサンプル採取した）、および混合起源の約８０例の一群の豚血清サンプルを含めた；この最後の群には、ＣＳＦＶに対してワクチン接種した豚またはＣＳＦＶに感染させた豚由来ならびにＢＶＤＶまたはＢＤＶ株に感染させた豚由来、ならびにいくつかの混合感染豚由来の陽性血清と陰性血清とが含まれていた。

本発明による方法の適用のため、すべてのサンプルを、ＩＤＥＸＸ ＣＳＦ Ａｂ Ｔｅｓｔ Ｋｉｔのプロトコルと材料とを用いて、プレコートプレート、陽性対照サンプルおよび陰性対照サンプル、Ａ１８モノクローナル抗体コンジュゲート、発色反応基質、停止溶液ならびに洗浄溶液を使用して試験した。唯一の相違点は、サンプル希釈液を、元の希釈剤の２倍濃縮型に置き換え、これを試験プロトコルによる容量の半分で使用した；容量の残りの半分は、変異型ＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープを有するＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質、すなわちｖＦｌｃ−ΔＰＴａ１ウイルスに含まれたＥ２タンパク質の溶液の添加によって供給したことであった。対照サンプルは二連で（ｉｎ ｄｕｐｌｏ）、試験サンプルは単独で試験した。

ＥＬＩＳＡでの阻害結果の解釈は市販のＥＬＩＳＡの場合と同じにした：陰性は３０％以下の阻害である；陽性は４０％以上の阻害である；３０〜４０％の間のスコアの阻害は疑わしいサンプルである。

２．１．ＣＳＦＶ陰性領域のサンプル：
この一群の陰性領域の血清は一般的にＥＬＩＳＡで−２０〜０％の間のスコアの阻害であった。結果を図２に示す。４１３例のサンプルの平均スコアは：−１１％±５．２％であった。これは予想どおりであった：サンプルはすべて、疑わしい／陽性の閾値値（ＥＬＩＳＡで３０％の阻害）よりずっと下のスコアであり、本発明による検出方法と識別方法の両方の使用により、真陰性サンプルから偽陽性スコアは全く得られなかった。

２．２．実験的ＣＳＦＶ陽性サンプル：
経時的に採取した４００例を超える一群のＣＳＦＶ陽性サンプルの解析により、本発明による方法の感度が優れていることが示された。結果を図３に示す。結果は、本発明による方法により、特に感染後の早期の時点で、市販のＣＳＦＶ Ｅ２抗体ＥＬＩＳＡよりも多くのサンプルが陽性と分類され、少ないサンプルが疑わしいまたは陰性と分類されることが可能であるという結果がもたらされることを示す。これは、感染後１４日目に最も顕著であり、感染後２１日目でもなお、幾分そうである。

したがって、これにより、本発明による方法の感度は、正しい真陽性の検出において、市販のＣＳＦＶ Ｅ２抗体ＥＬＩＳＡのものと少なくとも同等に良好であり、または換言すると：それどころか、既存のＣＳＦＶ Ｅ２抗体ＥＬＩＳＡの一工程に共インキュベーションを導入することは、試験の感度を害しなかったことが証明される。

２．３．混合サンプル：
種々の型の約８０例の一群のサンプルを、本発明による方法を用いて試験し、結果を標準的な市販のＥＬＩＳＡのものと比較した。これらの種々のサンプルは、「Ｅｒｎｓワークショップ」、「ＣＳＦＶ ＥＵ参照パネル」およびＣＶＩ Ｌｅｌｙｓｔａｄ内部「ペスチウイルス参照パネル」として知られるパネルからのものであった。

サンプルおよびそのコードを、本発明による方法の使用（「本発明」の欄に示す）または市販のＣＳＦＶ Ｅ２抗体ＥＬＩＳＡの使用（「市販品」の欄に示す）のいずれかでのＣＳＦＶ Ｅ２に対する抗体の検出の結果とともに表２に示す。サンプル番号の欄は参照目的のためのものにすぎない：サンプル１〜５４は、異なる株のＣＳＦＶに感染させた動物またはＣＳＦＶに対してワクチン接種した動物の現地サンプル由来の血清である；サンプルは、異なる感染後日数（ｄｐｉ）時またはワクチン接種後日数（ｄｐｖ）時に採取した；サンプル５５〜６０は真陰性である；サンプル番号６１〜６７はＢＶＤＶによる感染体由来；サンプル６８はＢＤＶ感染体由来のもの；サンプル６９〜７６は混合感染体由来の血清である。

結果を、ＥＬＩＳＡでの阻害パーセンテージスコアとして示し、市販のＥＬＩＳＡのスコアリングスケジュールに従って分類する。

表２の結果から明らかなように、試験したサンプルのほとんどで、本発明による方法を用いて得られた結果では、市販のＥＬＩＳＡよりも高い識別性を伴ったＥＬＩＳＡでの阻害パーセンテージスコアが得られた。本発明による方法を用いた結果の２例：サンプル２３と７５のみが、市販のＥＬＩＳＡと比べて陰性方向に外れた。これらが試験遂行におけるエラーであったのかどうかは不明である。そのため、本発明による方法は、ＣＳＦＶ Ｅ２抗体に関する市販のＥＬＩＳＡと少なくとも同等に感度がよい。

これは、いくつかのサンプルで、市販のＥＬＩＳＡと本発明による方法では異なる分類がもたらされたため、大きな重要性を有し得る。例は：サンプル番号：８、２５、２８、３８および４５であり、これらは、ＣＳＦＶ Ｅ２抗体について市販のＥＬＩＳＡで「疑わしい」と分類されたが、本発明の方法によれば「陽性」と分類される必要があり得る。同様に、サンプル番号３７は分類を陰性から疑わしいに変更する必要があり得る。

２例のサンプル番号２３と７５についてのみ、本発明による方法の結果は陰性であったが、市販のＥ２抗体ＥＬＩＳＡによるスコアでは陽性であった。どちらかのアッセイでの実験エラーが原因かもしれない。

表２：ＥＬＩＳＡでの阻害パーセンテージで示した、一組の混合サンプルにおけるＣＳＦＶ Ｅ２抗体の検出の結果

Claims (12)

1. 試験サンプル中における、野生型豚コレラウイルス（ＣＳＦＶ）に対する抗体を検出する方法であって、
   前記サンプルはＣＳＦＶ Ｅ２の変異型ＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープに対する抗体も含むものであってもよく、
   前記試験サンプルをＣＳＦＶ Ｅ２のＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープを含む固定化された担体とともにインキュベートする工程を含み、
   前記工程において、ＣＳＦＶ Ｅ２の変異型ＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープを含む担体とともに共インキュベートすることを特徴とする、方法。
2. 前記検出が、ＥＬＩＳＡ（酵素結合イムノソルベントアッセイ）により行われる、請求項１に記載の方法。
3. 前記試験サンプルが、ＣＳＦに対して変異型ＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープを含むＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質を含むＣＳＦＶワクチンをワクチン接種したブタ動物から得られる、請求項１または２に記載の方法。
4. 共インキュベーション用の担体に含まれるＣＳＦＶ Ｅ２の前記変異型ＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープが、試験サンプルを採取したブタ動物にワクチン接種するのに使用したＣＳＦＶワクチンのＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質に含まれる変異型ＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープと同じである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
5. 共インキュベーション用の担体に含まれるＣＳＦＶ Ｅ２の前記変異型ＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープが、アミノ酸配列：ＴＡＧＳＴＬＲＴＥ（配列番号：２）を有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
6. 前記ＣＳＦＶワクチンが、ｖＦｌｃ−ΔＰＴａ１ウイルスに基づいたものである、請求項４または５に記載の方法。
7. ＣＳＦＶ Ｅ２のＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープを含む固定化担体、または、ＣＳＦＶ Ｅ２の変異型ＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープを含む担体のいずれかが、ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質であるか、または
   前記担体の双方が、ＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
8. ＣＳＦＶ Ｅ２の変異型ＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープを含む担体と共インキュベートすることを含む工程のインキュベーション条件を、前記担体の添加に適応するように適合させることを含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
9. 請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法を実施するための診断試験キット。
10. 請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法または請求項９に記載の診断試験キットにおいて共インキュベートするための、ＣＳＦＶ Ｅ２の変異型ＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープを含む担体の使用。
11. 野生型ＣＳＦＶに感染した動物と、ＣＳＦＶに対してＣＳＦＶワクチンをワクチン接種した動物とを識別するための方法であって、
    該ワクチンが、変異型ＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープを含むＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質を含み、
    請求項１〜８のいずれか１項に記載の検出方法の使用を含むか、または、請求項９に記載の診断試験キットの使用を含む方法。
12. 変異型ＴＡＶＳＰＴＴＬＲエピトープを含むＣＳＦＶ Ｅ２タンパク質を含むＣＳＦＶワクチンと請求項９に記載の診断試験キットの併用による、ブタ動物集団において野生型ＣＳＦＶによる感染を防除する方法。

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