CN117510623A - 一种CSFV E0蛋白的纳米抗体CSFV-E0-Nb1及编码基因和应用 - Google Patents

一种CSFV E0蛋白的纳米抗体CSFV-E0-Nb1及编码基因和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种CSFV E0蛋白的纳米抗体CSFV‑E0‑Nb1及编码基因和应用，属于生物检测技术领域。本发明所述纳米抗体CSFV‑E0‑Nb1的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，可以利用表达系统进行表达。本发明将纳米抗体与量子点技术结合，制备现场区分CSFV E2亚单位疫苗株和野毒株感染抗体的免疫层析试纸条，生产工艺简单。利用本发明所述免疫层析试纸条即可鉴别诊断CSFV E2亚单位疫苗株和野毒株抗体，快速、便捷、即时的检测，为猪瘟净化工作的检测提供新方式。

Description

一种CSFV E0蛋白的纳米抗体CSFV-E0-Nb1及编码基因和应用
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种CSFV E0蛋白的纳米抗体CSFV-E0-Nb1及编码基因和应用。
背景技术
猪瘟(Classical Swine Fever，CSF)是由猪瘟病毒(Classical Swine FeverVirus，CSFV)引起的猪的高度传染性和致命性传染病，对动物健康和养猪业有较大的影响；CSF是世界动物卫生组织(World Organization forAnimal Health，WOAH)规定的一种强制性报告疾病。CSFV已在世界各地传播，造成了严重的养猪业损失，并对各国的经济造成了一定的影响。虽然一些国家通过使用疫苗等手段净化了CSF，但包括中国在内，全球仍有多个国家和地区存在CSF流行。一些以前宣布已经根除CSF的国家或地区再次报道CSF感染。CSF的成熟诊断方法，如病毒分离、荧光抗体检测、抗原捕获抗体酶联免疫吸附测定、反转录聚合酶链反应、病毒中和试验和抗体ELISA已被广泛使用。但是现在想要做到CSFV E2亚单位疫苗株和野毒株的鉴别诊断，还需借助多个或多种检测方法，不便于猪场大规模监测以及现场应用。
典型的纳米抗体具有纳摩到皮摩范围的亲和力(平衡解离常数)，所以它们非常适合用于配体结合测定。低生产成本：小体积的纳米抗体使得在中等体积的细菌培养中更容易生产和高产量。易于编辑以满足应用需求(即，提高特异性和亲和力，扩大检测可能性)：编码纳米抗体的基因可以很容易地重新设计，以选择改变的结合特性或表位标记。坚固耐用，保质期长：与Igs和ScFv片段相比，纳米抗体具有较强的热稳定性，因此可以很容易地在大多数环境温度下运输。针对靶向隐蔽的抗原决定簇：纳米抗体的小尺寸允许它进入隐蔽的抗原结合位点。免疫原性低，血液清除率快：小尺寸的纳米抗体允许其在肾小球中自由过滤，促进排泄。纳米抗体已被用于多种抗原抗体检测中，作为检测探针抗体表现出优异的特性，但对于纳米抗体与量子点连用还鲜少有报道，纳米抗体的稳定性可以保证定量检测的稳定性。
量子点具有一系列独特而优良的光学特性，包括：①量子点比有机荧光分子稳定，不易发生光漂白；②荧光吸收谱宽，单光子和双光子均可吸收；③发射谱窄(通常半峰宽低于40nm)而对称，无长波段拖尾现象；④荧光强度大，量子产率高(＞20％)，生物相容性好；⑤具有独特的量子效应和较大的斯托克斯位移；⑥与普通有机染料相比，量子点荧光命较长(20ns～40ns)，有利于提高检测结果的对比度和准确性。
综上所述，现在缺乏一种快速、便捷的鉴别CSFV E2亚单位疫苗株和野毒株感染的检测方法。传统的胶体金等免疫层析技术检测灵敏度较低，传统的ELISA检测方法需要实验室相关仪器和操作，RT-PCR等核酸检测方法无法评估疫苗免疫效果等。
发明内容
本发明的目的在于提供一种CSFV E0蛋白的纳米抗体CSFV-E0-Nb1，基于纳米抗体和量子点免疫层析技术构建CSFV E2亚单位疫苗株和野毒株抗体的免疫层析试纸条，可以及时、高效、快速的现场区分CSFV E2亚单位疫苗株和野毒株感染，并且生产工艺简单，降低生产成本，具有很好的市场转化前景。
本发明提供了一种CSFV E0蛋白的纳米抗体CSFV-E0-Nb1，所述纳米抗体CSFV-E0-Nb1的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
本发明还提供了一种编码上述纳米抗体CSFV-E0-Nb1的核苷酸分子。
优选的，所述核苷酸分子的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
本发明还提供了一种表达上述纳米抗体CSFV-E0-Nb1的方法，包括将上述核苷酸分子与表达载体连接，构建重组表达载体，转化入表达宿主细胞中，诱导表达并纯化，得所述纳米抗体CSFV-E0-Nb1。
优选的，所述表达载体的类型包括原核表达载体。
本发明提供了一种CSFV E2亚单位疫苗株和野毒株抗体的免疫层析试纸条，包括金标垫、检测线和质控线；
所述金标垫包被量子点耦联的CSFV E0蛋白和量子点耦联的CSFV E2蛋白；
以CSFV E0蛋白和CSFV E2蛋白分别为检测线T1和T2，以上述纳米抗体CSFV-E0-Nb1和CSFV E2蛋白特异性纳米抗体分别为质控线C1和C2。
优选的，所述量子点耦联的方法包括：将水溶性量子点与EDC·HCl溶液和NHS溶液避光孵育；孵育完成后，与β-巯基乙醇和蛋白混合孵育；孵育完成后封闭，将产物离心，沉淀复溶，得到量子点耦联的蛋白。
优选的，所述蛋白和量子点耦联的pH值为6～8；
量子点和活化剂的质量比为1:2～1:8；
所述蛋白和量子点的耦联质量比为1:1～1:15。
优选的，所述检测线上标记的蛋白量为50～150μg/线；
所述质控线上标记的纳米抗体的量为75～175μg/线。
优选的，当检测线T1标记CSFV E0蛋白，检测线T2标记CSFV E2蛋白；质控线C1标记CSFV-E0-Nb1蛋白，质控线C2标记CSFV E2蛋白特异性纳米抗体时；
如检测线T1、检测线T2、质控线C1和质控线C2均无条带，说明检测不成功，需重新检测；
如质控线C1或质控线C2有一条或都没有条带，说明检测不成功，需要重新检测；
如检测线T1、质控线C1和质控线C2均有条带，检测线T2无条带，则说明检测不成功，需重新检测；
如检测线T1、检测线T2、质控线C1和质控线C2均有条带，则说明为野毒株产生的抗体；
如检测线T2、质控线C1和质控线C2均有条带，检测线T1无条带，则说明为CSFV E2亚单位疫苗株产生的抗体；
如质控线C1和质控线C2均有条带，检测线T1和检测线T2均无条带，则说明为阴性，无CSFV抗体。
有益效果：本发明通过CSFV E0纳米抗体噬菌体展示文库技术筛选得到一种CSFVE0特异性纳米抗体CSFV-E0-Nb1，所述CSFV-E0-Nb1可以利用表达系统进行表达。本发明还将纳米抗体与量子点技术结合，制备了可以及时、高效、快速的现场区分CSFV E2亚单位疫苗株和野毒株感染抗体的免疫层析试纸条，所述纳米抗体可降低获得质控抗体的成本，提高检测试纸条的稳定性，高稳定性更便于定量检测，无需ELISA即可评估疫苗免疫效果，相比传统的单克隆抗体，获取途径更简单、体积更小、灵敏度及特异性更好；量子点的应用，直接提高了免疫层析试纸条的灵敏度以及特异性，相比传统的胶体金试纸条灵敏度更高，更有利于早检测到是否发生感染。本发明所述免疫层析试纸条生产工艺简单，降低生产成本，具有很好的市场转化前景。
利用本发明所述免疫层析试纸条即可鉴别诊断CSFV E2亚单位疫苗株和野毒株抗体，快速、便捷、即时的检测，为猪瘟净化工作的检测提供新方式，相比传统的分别利用CSFVE2和CSFV E0蛋白的两个免疫层析试纸条更简便快捷。本发明基于纳米抗体和量子点免疫层析试纸条，可以低成本、便捷、高效、快速的现场区分CSFV E2亚单位疫苗株和野毒株感染，为猪瘟净化工作提供新的检测手段。
附图说明
图1为检测试纸条模式图，1为样品垫，2为标记垫，3为层析垫，4为塑料底壳，5为NC膜；
图2为检测试纸条检测CSFV E2亚单位疫苗抗体时各组分结合图；
图3为检测CSFV野毒株感染时各组分结合图；
图4为羊驼血清CSFV E0抗体效价测定；
图5为第一轮PCR扩增结果图；
图6为第二轮PCR扩增结果图；
图7为电转化后阳性率鉴定结果图；
图8为固相淘选时富集度测定结果图；
图9为间接ELISA测定阳性克隆结果图；
图10为单克隆测序结果分析结果图；
图11为四株纳米抗体结合力的测定结果图；
图12为表达CSFV-E0-Nb1蛋白SDS-PAGE验证结果图，1、3、5泳道为破碎后沉淀，2、4、6泳道为破碎后上清；
图13为CSFV-E0-Nb1蛋白纯化后SDS-PAGE验证结果图，1泳道为穿流液，2-9泳道为洗脱液；
图14为CSFV-E0-Nb1蛋白特异性验证结果图。
具体实施方式
本发明提供了一种CSFV E0蛋白的纳米抗体CSFV-E0-Nb1，所述纳米抗体CSFV-E0-Nb1的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示:ESGGGLVQPGGSLRLSCAGSGIIFSSVTMAWYRQAPGKQREVVARFSSGGRATYADSVEGRFTISRDNVKNMVYLQMNSLAPEDTAVYYCNANWWYERNYDYWGQGTQVTVSS。
本发明所述纳米抗体CSFV-E0-Nb1优选根据噬菌体展示文库技术构建得到，更优选包括：构建CSFV E0纳米抗体噬菌体展示文库，免疫羊驼，分离淋巴细胞，扩增目的片段，构建重组载体，转化TG1感受态；筛选CSFV E0特异性纳米抗体，固相淘选三次，单克隆粗表达鉴定，测序分析，结合力测定；最优选包括：通过表达的CSFV E0蛋白，免疫羊驼，收集淋巴细胞，提取总RNA，扩增纳米抗体片段，并与噬菌体展示载体pCANTAB-5E相连接，转化至宿主TG1感受态，构建噬菌体展示初级文库；通过M13KO7噬菌体救援初级文库，得到CSFV特异性纳米抗体噬菌体展示文库，经过三轮固相淘选，以及间接ELISA检测，得到阳性单克隆菌株，对菌株测序得到CSFV E0蛋白特异性纳米抗体的序列。
本发明还提供了一种编码上述纳米抗体CSFV-E0-Nb1的核苷酸分子。
本发明所述核苷酸分子的核苷酸序列优选如SEQ ID No.2所示：GAGTCTGGGGGAGGCTTGGTGCAGCCTGGGGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTGCAGGCTCAGGAATAATCTTCAGTAGCGTTACCATGGCCTGGTACCGCCAGGCTCCAGGGAAGCAGCGCGAAGTGGTCGCTCGTTTTAGTAGTGGTGGTCGCGCGACCTACGCAGACTCCGTGGAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGTCAAGAATATGGTCTATCTACAAATGAACAGCCTGGCACCTGAGGACACGGCCGTCTATTACTGTAATGCGAACTGGTGGTACGAGAGGAATTATGATTACTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCAGC。
本发明还提供了一种表达上述纳米抗体CSFV-E0-Nb1的方法，包括将上述核苷酸分子与表达载体连接，构建重组表达载体，转化入表达宿主细胞中，诱导表达并纯化，得所述纳米抗体CSFV-E0-Nb1。
本发明所述表达载体的类型优选包括原核表达载体，实施例中以pET-28a为例进行说明，但是不能仅将其认定为本发明的全部保护范围。本发明优选将上述SEQ ID No.2所示序列与pET-28a载体载体相连接，构建重组表达载体，转化BL21(DE3)感受态，诱导表达，纯化蛋白，即得本发明所述纳米抗体CSFV-E0-Nb1。
本发明提供了一种CSFV E2亚单位疫苗株和野毒株抗体的免疫层析试纸条，包括金标垫、检测线和质控线；
所述金标垫包被量子点耦联的CSFV E0蛋白和量子点耦联的CSFV E2蛋白；
以CSFV E0蛋白和CSFV E2蛋白分别为检测线T1和T2，以上述纳米抗体CSFV-E0-Nb1和CSFV E2蛋白特异性纳米抗体分别为质控线C1和C2。
本发明所述量子点耦联的方法，优选包括：将水溶性量子点(CdSe)与EDC·HCl溶液和NHS溶液避光孵育；孵育完成后，与β-巯基乙醇和蛋白混合孵育；孵育完成后封闭，将产物离心，沉淀复溶，得到量子点耦联的蛋白。本发明所述免疫层析试纸条标记物为水溶性的量子点，且蛋白和量子点耦联条件优选为：pH＝6～8；量子点和活化剂质量之比为1:2～1:8；蛋白和量子点的耦联量为1:1～1：15μg，更优选为pH＝7；量子点和活化剂质量之比为1:4；蛋白和量子点的耦联量为1:15μg。
本发明所述免疫层析试纸条的检测线分别为CSFV E0和E2蛋白，如T1检测线为CSFV E0蛋白，T2检测线为CSFV E2蛋白，标记量均为50～150μg，更优选为100μg。
本发明所述免疫层析试纸条的检测线分别为CSFV E0和E2蛋白的纳米抗体，如C1检测线为CSFV-E0-Nb1，C2检测线为CSFV-E2-Nb1，标记量均为75～175μg，更优选为125μg。本发明所述CSFV-E2-Nb1的序列及制备方法已经公开在中国专利CN114957454A中，在此不再赘述。
本发明所述免疫层析试纸条的特异性、灵敏性及重复性均与商品化试纸条相当或更强，当检测线T1标记CSFV E0蛋白，检测线T2标记CSFV E2蛋白；质控线C1标记CSFV-E0-Nb1蛋白，质控线C2标记CSFV E2蛋白特异性纳米抗体时；
如检测线T1、检测线T2、质控线C1和质控线C2均无条带，说明检测不成功，需重新检测；
如质控线C1或质控线C2有一条或都没有条带，说明检测不成功，需要重新检测；
如检测线T1、质控线C1和质控线C2均有条带，检测线T2无条带，则说明检测不成功，需重新检测；
如检测线T1、检测线T2、质控线C1和质控线C2均有条带，则说明为野毒株产生的抗体；
如检测线T2、质控线C1和质控线C2均有条带，检测线T1无条带，则说明为CSFV E2亚单位疫苗株产生的抗体；
如质控线C1和质控线C2均有条带，检测线T1和检测线T2均无条带，则说明为阴性，无CSFV抗体。
本发明所述免疫层析试纸条搭配金标免疫分析仪扫描，读取T1/C1和T2/C2的比值，建立标准曲线，即可做到对CSFV抗体进行定量检测。
为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的一种CSFV E0蛋白的纳米抗体CSFV-E0-Nb1及编码基因和应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如《分子克隆：实验室手册》(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件或厂商提供的条件进行。
实施例1
CSFV E0蛋白纳米抗体初级噬菌体展示文库构建
1.1羊驼免疫
免疫成年雄性健康羊驼，每次5mg CSFV E0蛋白(GenBank：KY816734.1)，共免疫5次，间隔2周，每次免疫后，采集血清，由间接ELISA测定CSFV E0抗体效价，当血清抗体效价≥105时，认为达到建库要求。结果如图4显示，第五次免疫后，血清抗体效价已达到1.28×105，免疫效果良好。由颈动脉采集20mL抗凝血，用于分离总淋巴细胞。
1.2分离总淋巴细胞
为得到纳米抗体序列，先对采集的抗凝血分离总淋巴细胞，利用梯度离心法，分离血清、血浆、红细胞和总淋巴细胞，收集总淋巴细胞，并清洗两次，对提取的淋巴细胞计数。
1.3纳米抗体片段扩增
对提取的总淋巴细胞，提取总RNA，该过程应注意防止污染，提高总RNA得率，提取总RNA完成后，立即逆转录为cDNA，便于保存及使用。通过羊驼特有的纳米抗体想保守序列设计两对引物，便于得到纯度更高，数量更多的纳米抗体目的序列。首先利用第一对引物扩增传统IgG的重链和轻链保守区，以及纳米抗体的重链和保守区；凝胶电泳分析可观察到700bp和900bp处有目标条带，回收700bp处纳米抗体目标条带(图5)；以胶回收产物为模版，利用第二对引物扩增纳米抗体重链，引物上分别有PstI和NotI酶切位点，凝胶电泳分析可得，在400bp处有纳米抗体基因条带，回收该部分(图6)。
第一对引物：
F1(SEQ ID No.3):GTCCTGGCTGCTCTTCTACAAGG；
R1(SEQ ID No.4):GGTACGTGCTGTTGAACTGTTCC；
第二对引物：
F2(SEQ ID No.5)：CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGGGGAGR；
R2(SEQ ID No.6)：CTAGTGCGGCCGCTGAGGAGACGGTGACCTGGGT。
1.3纳米抗体噬菌体展示载体的构建
分别对噬菌体展示载体pCANTAB 5E和胶回收产物利用Pst I和Not I限制性内切酶进行双酶切，并纯化酶切产物。将酶切产物按载体和目的基因的摩尔比1:7，利用T4连接酶，4℃过夜孵育连接，孵育完成后，利用纯化试剂盒纯化连接产物，测定浓度。
1.4TG1电转感受态制备
将TG1菌液与LB液体培养基按体积比1:50接种于锥形瓶中，37℃培养至OD600值为0.5；收集菌液，冰上孵育30min，4500rpm离心10min；弃上清，沉淀菌用等体积的10％的甘油重悬，并再次离心；弃上清，沉淀菌用1/2体积的10％的甘油重悬，并再次离心；弃上清，沉淀菌用1/4体积的10％的甘油重悬，并再次离心；弃上清，沉淀菌用适量10％的甘油轻轻重悬后电转化使用。
1.5连接纯化产物电转至TG1感受态细胞
将纯化后的连接产物与制备的TG1电转感受态细胞混合，设置电转仪参数：C＝25μF，PC＝200Ω，V＝1.8kV；电转完成后，将所有产物置于37℃，孵育60min；孵育完成后涂布于平板培养基，并对文库进行测定；待12h后收集文库，将菌体用细胞刮刀收集，并加入等体积的60％的甘油进行保存。
1.6噬菌体展示文库鉴定
从文库鉴定的平板随机挑选21个单克隆，通过菌落PCR对其鉴定(鉴定引物为F4和R2)，计算库容阳性率；结果显示(图7)，共挑选了21个单克隆(22泳道为阴性对照)，其中阴性2个阳性19个，所以库容阳性率为90.48％。
引物F4(SEQ ID No.7)：AATACGCAAACCGCCTCTCC，位于pCANTAB 5E载体多克隆酶切位点上游约335bp处。
实施例2
CSFV E0特异性纳米抗体的淘选
2.1噬菌体展示文库救援
利用辅助噬菌体M13KO7对构建的噬菌体展示文库救援。将构建的噬菌体展示文库接种于培养基，培养至OD600值为0.6，计算并加入20MOI的M13KO7噬菌体；孵育30min后，3000rpm离心10min，弃上清，菌沉淀用培养基重悬，并过夜培养。此时M13KO7噬菌体会特异性对TG1菌进行识别和侵染，并将噬菌体展示载体pCANTAB-5E吸附于噬菌体尾端，形成重组噬菌体；利用PEG6000/NaCl溶液对其沉淀浓缩，具体操作为：将菌液6000rpm离心15min，收集上清，加入等体积的PEG6000/NaCl溶液，并在冰上孵育4h；孵育完成后，再次离心，弃上清，沉淀用适量PBS重悬；将产物置于4℃孵育12h，再次离心，收集上清，得到CSFV E0纳米抗体噬菌体展示文库。
2.2噬菌体滴度测定方法
将噬菌体用液体培养基或PBS溶液10倍比稀释至10-12，分别取10-6、10-8、10-10、10-12稀释度的100μL，加入等体积对数生长期的TG1菌液，静置侵染30min。再将孵育产物涂布与平板培养基，过夜培养，计算每个平板菌落数，并计算噬菌体滴度。
按次方法计算救援后噬菌体展示文库的重组噬菌体滴度。
2.3CSFV E0特异性纳米抗体固相淘选
将CSFV E0蛋白包被于酶标板，每孔10μg；包被孵育完成后，用2.5％的脱脂奶粉封闭2h；封闭清洗完成后，孵育重组噬菌体，孵育2h；孵育完成后，清洗2次，利用新鲜配制的0.1M的三乙胺洗脱与CSFV E0结合的重组噬菌体，并迅速加入等体积的1M Tris-HCl中和三乙胺。将洗脱的重组噬菌体进行滴度测定，并计算包被CSFV E0蛋白孔和未包被蛋白孔的比值；若未达到103以上，则对洗脱重组噬菌体进行扩增；扩增完成后，再次进行固相淘选步骤；一般认为比值达到103以上即认为固相淘选完成；结果显示(图8)，当第三轮淘选时富集度已经为1088，说明富集效果良好。
2.4重组噬菌体单克隆粗表达
为了更好的鉴定CSFV E0特异性纳米抗体重组噬菌体，对最后一次重组噬菌体滴度测定时平板上的单菌落，随机挑选48个单菌落，对其单独培养，利用TB培养基和IPTG进行诱导表达重组噬菌体上的重组纳米抗体载体。步骤如下：当单克隆培养至OD600至0.6时，加入终浓度为1mM的IPTG溶液进行诱导过夜表达；分别离心，菌沉淀-80℃反复冻融3次，最后一次用PBS重悬后，6000rpm离心10min，收集上清，即为重组纳米抗体粗提物。
2.5间接ELISA鉴定
为确定CSFV E0特异性纳米抗体，利用抗原抗体相特异性结合的原理，通过间接ELISA测定粗表达的单克隆。步骤如下：将CSFV E0蛋白包被于酶标板每孔4μg，包被完成后，利用2.5％的脱脂奶粉封闭2h；孵育粗提物，并每组粗提物加1个平行的孔孵育PBS溶液做阴性对照；一抗使用兔抗E-Tag标签单克隆抗体；二抗使用HRP标记山羊抗兔IgG抗体；加入TMB显色液后，使用终止液终止显色反应，利用酶标仪使用测得OD450数值，当粗提物孔大于阴性对照孔数值的3倍，则认为其为阳性，反之为阴性；结果显示(图9)，挑选的48株单克隆均为阳性。
2.6阳性单克隆测序分析
将间接ELISA阳性的菌液送至生工公司测序。对测序结果进行氨基酸比对，分析结果。结果如图10显示，共筛选到有4株氨基酸序列不同的纳米抗体。
2.7CSFV E0蛋白纳米抗体结合力验证
测序结果进行氨基酸对比后，对不同纳米抗体进行结合力验证。将不同株纳米抗体粗提物稀释至相同浓度，其余操作步骤同间接ELISA测定阳性克隆；结果如图11显示，4株纳米抗体的结合力均较高，1号的结合力最高(命名为CSFV-E0-Nb1)。
实施例3
CSFV E0特异性纳米抗体的表达
3.1CSFV-E0-Nb1表达载体构建
对测序的Nb1序列进行依据pET-28a表达载体进偏好密码子优化(SEQ IDNo.2)，由生物公司合成pET-28a-Nb1重组表达质粒。
3.2pET-28a-Nb1诱导表达
将公司合成重组表达质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)表达感受态细胞，孵育完成后，涂布于平板培养基；过夜培养后，挑取单克隆3个，接种到液体培养基中，待菌液培养至OD600为0.6时，加入终浓度为1mM的IPTG诱导表达；诱导培养4h后，6000rpm离心15min，沉淀利用PBS重悬；利用超声破碎仪对菌体破碎，再次离心，分别收集上清与沉淀；通过SDS-PAGE验证蛋白表达情况，以及是否为可溶性表达；结果显示(图12)，3株均为可溶性表达，且第2株表达量最高。
3.3CSFV-E0-Nb1蛋白的纯化
利用Ni-NTA柱进行纯化，实验步骤同试剂盒说明书；纯化完成后对蛋白进行SDS-PAGE验证纯度；结果显示(图13)，纯化效果良好，无其他杂蛋白条带。
3.4CSFV-E0-Nb1蛋白特异性验证
利用间接ELISA原理验证表达的蛋白的特异性。将CSFV E2蛋白和E0分别等量包被于酶标板；用2.5％脱脂奶粉封闭2h；清洗后，孵育CSFV-E0-Nb1蛋白；孵育完成后，孵育兔抗His标签抗体；再孵育HRP标记的山羊抗兔IgG抗体；通过TMB显色，和终止液终止后；酶标仪读取OD450数值；结果显示(图14)，CSFV-E0-Nb1不与CSFV E2结合，特异性结合CSFV E0蛋白。
实施例4
量子点免疫层析鉴别诊断方法的建立
4.1量子点耦联CSFV E0和E2蛋白
分别取适量水溶性量子点(CdSe)，加入EDC·HCl溶液和NHS溶液避光孵育2h；孵育完成后，加入β-巯基乙醇；将CSFV E0和E2蛋白分别加入，孵育12h；孵育完成后，加入7.5％甘氨酸(Gly)溶液+1％BSA溶液，封闭2h；将产物12000rpm离心15min，弃上清，沉淀复溶，即得到量子点耦联的CSFV E0和E2蛋白。
4.2量子点耦联条件的筛选
最佳pH值筛选：分别设置pH值为6、7、8、9、10观察耦联结果是否发生蛋白聚集或沉淀；结果发现随着pH值升高，CSFV E0和E2蛋白均发生耦联出现聚集或沉淀现象，即最佳pH值为7。
活化剂用量的选择：活化剂EDC具有羧化量子点表面-COOH的作用，从而促进与目标蛋白的耦联。在最适pH值下，量子点与EDC质量之比从1:1二倍比稀释至1:16，观察耦联结果；结果显示当EDC的质量是量子点1:4时，就不会出现聚集现象，为降低成本设置活化剂用量为量子点的4倍。
最佳CSFV E0和E2蛋白包被量的筛选：首先分别将E0和E2蛋白稀释至1mg/mL；在最优pH和活化剂用量的条件下，分为5组，每组分别加入5μL、10μL、15μL、20μL、25μL；结果显示，加入量越少，耦联产物会出现聚集和沉淀现象，随着加入量的增加，荧光强度也随之增加，但15μL、20μL、25μL三组之间差别不大，即选择蛋白添加量为15μg时最优。
4.3检测线制备及最优浓度筛选
将CSFV E0和E2蛋白分别稀释至1mg/mL，按1:5、1:10、1:20、1:40、1:80再次稀释后，标记于NC膜上；依次对阳性血清和阴性血清进行检测，观察不同浓度下的结果。结果显示随着稀释度的增加，荧光强度逐渐减弱，在1:5和1:10时荧光强度相似，即选择1:10为最优浓度。
4.4质控线制备及最优浓度筛选
质控线用到的CSFV E2蛋白纳米抗体为专利CN114957454A中所述纳米抗体，CSFVE0蛋白纳米抗体为本发明筛选制备的。将纯化好的CSFV-E0-Nb1和CSFV-E2-Nb1浓度分别稀释至1mg/mL，按1:2、1:4、1:8、1:16倍数稀释后，标记于NC膜；依次对PBS缓冲液、阳性血清、阴性血清检测，观察不同浓度下的结果。结果显示随着稀释倍数的增加，荧光强度逐渐降低，但1:2时强度太强，1:8较为适中，即选择1:8为最优浓度。
4.5鉴别诊断试纸条的组装
金标垫上喷涂量子点标记的CSFV E0和E2蛋白，用量为分别包被15μg；检测线T1标记CSFV E0蛋白，标记量为100μg；检测线T2标记CSFV E2蛋白，标记量为100μg；质控线C1标记CSFV-E0-Nb1蛋白，标记量为125μg；质控线C2标记CSFV-E2-Nb1蛋白，标记量为125μg；其他条件均为最优条件。检测试纸条组装示意图如图1所示。
4.6结果判定标准
T1、T2、C1、C2均无条带，说明检测不成功，需重新检测；C1或C2有一条或都没有条带，说明检测不成功，需要重新检测；T1、C1、C2均有条带，T2无条带，则说明检测不成功，需重新检测；T1、T2、C1、C2均有条带，则说明为野毒株产生的抗体(图3)；T2、C1、C2均有条带，T1无条带，则说明为CSFV E2亚单位疫苗株产生的抗体(图2)；C1、C2均有条带，T1、T2均无条带，则说明为阴性，无CSFV抗体。
4.7特异性验证
用制备的试纸条分别对CSFV弱毒苗免疫后采集的血清样本、CSFV E2亚单位疫苗免疫后采集的血清、标准CSFV阴性血清、标准猪伪狂犬病毒阳性血清、标准猪细小病毒阳性血清进行检测；结果显示CSFV弱毒株疫苗免疫制备的血清为T1、T2均显色，CSFV E2亚单位疫苗免疫制备的血清为T1不显色、T2显色，标准CSFV阴性血清、标准猪伪狂犬病毒阳性血清、标准猪细小病毒阳性血清T1、T2均不显色，结果说明建立的免疫层析检测方法可鉴别诊断CSFV E2亚单位疫苗和野毒株感染，并且特异性良好。
4.8灵敏性验证
将同一份CSFV弱毒苗免疫后采集的血清样本和CSFV E2亚单位疫苗免疫后采集的血清按五倍比稀释至1:3125倍；分别用制备的免疫层析试纸条和购买的商品化的CSFV抗体胶体金检测试纸条进行检测；结果显示，制备的免疫层析试纸条在1:625时仍能准确鉴别出感染类型，商品化胶体金检测试纸条在1:25倍时结果已不清晰；结果说明建立的免疫层析试纸条灵敏度更高，准确性更强。
4.9重复性验证
用不同批次制备的免疫层析试纸条对同一份血清检测结果显示一样；用同一批次制备的免疫层析试纸条，由不同操作者对同一份血清进行检测，结果同样显示一样；结果说明制备的免疫层析试纸条的批间重复性和批内重复性均较好。
综上所述，本发明制备的基于量子点和纳米抗体的免疫层析试纸条可以稳定、高灵敏的鉴别诊断CSFV E2亚单位疫苗和野毒株感染，可为猪瘟净化工作中的CSFV检测提供便捷、低成本、快速、高效的检测方法；值得说明的时本发明制备的免疫层析试纸条搭配金标免疫分析仪扫描，读取T1/C1和T2/C2的比值，建立标准曲线，即可做到对CSFV抗体进行定量检测，更便于疫苗效果和抗体效价的评估。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (10)

1.一种CSFV E0蛋白的纳米抗体CSFV-E0-Nb1，其特征在于，所述纳米抗体CSFV-E0-Nb1的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
2.一种编码权利要求1所述纳米抗体CSFV-E0-Nb1的核苷酸分子。
3.根据权利要求2所述核苷酸分子，其特征在于，所述核苷酸分子的核苷酸序列如SEQID No.2所示。
4.一种表达权利要求1所述纳米抗体CSFV-E0-Nb1的方法，其特征在于，包括将权利要求2或3所述核苷酸分子与表达载体连接，构建重组表达载体，转化入表达宿主细胞中，诱导表达并纯化，得所述纳米抗体CSFV-E0-Nb1。
5.根据权利要求4所述方法，其特征在于，所述表达载体的类型包括原核表达载体。
6.一种CSFV E2亚单位疫苗株和野毒株抗体的免疫层析试纸条，其特征在于，包括金标垫、检测线和质控线；
所述金标垫包被量子点耦联的CSFV E0蛋白和量子点耦联的CSFV E2蛋白；
以CSFV E0蛋白和CSFV E2蛋白分别为检测线T1和T2，以权利要求1所述纳米抗体CSFV-E0-Nb1和CSFV E2蛋白特异性纳米抗体分别为质控线C1和C2。
7.根据权利要求6所述免疫层析试纸条，其特征在于，所述量子点耦联的方法包括：将水溶性量子点与EDC·HCl溶液和NHS溶液避光孵育；孵育完成后，与β-巯基乙醇和蛋白混合孵育；孵育完成后封闭，将产物离心，沉淀复溶，得到量子点耦联的蛋白。
8.根据权利要求7所述免疫层析试纸条，其特征在于，所述蛋白和量子点耦联的pH值为6～8；
量子点和活化剂的质量比为1:2～1:8；
所述蛋白和量子点的耦联质量比为1:1～1:15。
9.根据权利要求6所述免疫层析试纸条，其特征在于，所述检测线上标记的蛋白量为50～150μg/线；
所述质控线上标记的纳米抗体的量为75～175μg/线。
10.根据权利要求6所述免疫层析试纸条，其特征在于，当检测线T1标记CSFV E0蛋白，检测线T2标记CSFV E2蛋白；质控线C1标记CSFV-E0-Nb1蛋白，质控线C2标记CSFV E2蛋白特异性纳米抗体时；
如检测线T1、检测线T2、质控线C1和质控线C2均无条带，说明检测不成功，需重新检测；
如质控线C1或质控线C2有一条或都没有条带，说明检测不成功，需要重新检测；
如检测线T1、质控线C1和质控线C2均有条带，检测线T2无条带，则说明检测不成功，需重新检测；
如检测线T1、检测线T2、质控线C1和质控线C2均有条带，则说明为野毒株产生的抗体；
如检测线T2、质控线C1和质控线C2均有条带，检测线T1无条带，则说明为CSFV E2亚单位疫苗株产生的抗体；
如质控线C1和质控线C2均有条带，检测线T1和检测线T2均无条带，则说明为阴性，无CSFV抗体。
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