CN105334322B - 一种水泡性口炎病毒重组n蛋白抗原及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于基因工程技术领域，具体地涉及一种水泡性口炎病毒重组N蛋白抗原及其制备方法。一种水泡性口炎病毒重组N蛋白抗原，其氨基酸序列为SEQ ID No.1所示；编码该重组N蛋白抗原的基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。将本发明的水泡性口炎病毒重组N蛋白抗原应用于制备快速检测水泡性口炎病毒抗体的试纸条，特异性好，灵敏度高，具有检测快速、操作简便，检测样品量少，检测成本较低等优点，为水泡性口炎病毒抗体检测和水泡性口炎流行病学调查提供良好的检测手段。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体地涉及一种水泡性口炎病毒重组N蛋白抗原及其制备方法。
背景技术
水泡性口炎(Vesicular stomatitis,VS)是由弹状病毒科水泡病毒属的水泡性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus,VSV)引起的人畜共患的重大动物疫病。世界动物卫生组织(OIE)将VS列为法定报告传染病。目前，VSV分为两个血清型，即印第安纳(Indiana,IN型)和新泽西(New Jersey,NJ型)。VSV的感染谱很广，牛、猪、马、羊和其它多种野生动物可感染,人也可以感染VSV，并出现急性热性类似流感的症状。动物感染VSV发病后，临床症状与口蹄疫(FMD)症状非常相似，很难根据临床症状作鉴别诊断。水泡性口炎严重影响反刍动物养殖业的健康发展及相关动物和动物产品的国际贸易，对疫区造成巨大的经济损失。
VSV为单股负链RNA病毒，基因全长11163bp，共编码5种主要病毒蛋白，包括糖蛋白(G)、基质蛋白(M)、核蛋白(N)、磷酸蛋白(NS)、病毒RNA聚合酶(L)。其中N蛋白由422个氨基酸组成，呈现群特异性，为所有型的VSV所共有，诱导产生非中和抗体，与其它弹状病毒无任何交叉反应，因此VSV N蛋白是作为建立VSV抗体免疫学检测方法的重要抗原。
目前，可用于水泡性口炎病毒抗体检测的方法有琼脂扩散试验(AGID)和竞争ELISA方法。由于琼脂扩散试验特异性较差，需要时间长等因素的制约，该方法在基层兽医部门很少应用。竞争ELISA具有较好的特异性和敏感性，可用于实验室检测。但由于ELISA检测需要专门的仪器设备和技术操作人员，在 条件较好的实验室才可以得到应用。另外，目前国内没有商品化的ELISA试剂盒。
申请号为200910190437.5的发明公开了一种水泡性口炎病毒快速检测试纸条及其制作方法，但其是检测水泡性口炎病毒，即检测抗原，准确性不高。申请号为200410008749.7的发明公开了一种水泡性口炎病毒N基因重组表达质粒载体、表达抗原以及制备方法，该发明使用的是水泡性口炎病毒N蛋白全基因，蛋白表达量并不高。申请号为201010182429.9的发明公开了一种水泡性口炎病毒抗体胶体金检测试纸条及其制备方法，该发明虽是检测水泡性口炎病毒抗体，但使用抗原为VSV全病毒抗原，特异性较差。
发明内容
为了克服现有技术的缺点与不足，本发明公开了一种水泡性口炎病毒重组N蛋白抗原及其制作方法。
本发明的内容包括一种水泡性口炎病毒重组N蛋白抗原，其氨基酸序列为SEQ IDNo.1所示。
进一步地，本发明的内容还包括编码所述水泡性口炎病毒重组N蛋白抗原的基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
进一步地，本发明还包括所述水泡性口炎病毒重组N蛋白抗原的制备方法，包括以下步骤：1)人工合成SEQ ID No.2所示基因序列，并将该序列克隆至载体中，用PCR方法扩增该片段；2)将步骤1)获得的PCR产物与载体连接，构建重组表达载体；3)将重组表达载体导入原核表达体系，进行蛋白表达；4)对表达产物进行纯化后获得所述的水泡性口炎病毒重组N蛋白抗原。
进一步地，所述步骤1)中的PCR方法，其用于该PCR方法的PCR引物组，具体包括以下两条序列：
上游引物P1见序列表中SEQ ID No.3；
下游引物P2见序列表中SEQ ID No.4。
进一步地，本发明的内容还包括所述的水泡性口炎病毒重组N蛋白抗原在制备用于检测水泡性口炎病毒抗体的试剂中的应用。
本发明针对水泡性口炎水泡性口炎病毒N蛋白氨基酸序列，通过抗原表位分析和密码子优化获得截短并优化后的VSV N基因序列，通过人工合成该序列并在原核表达体系表达该基因，获得水泡性口炎病毒重组N蛋白抗原。相对于先有技术，本发明的水泡性口炎病毒重组N蛋白抗原具有更好的抗原特性，且优化后的基因序列在表达体系中蛋白表达量高，效果好。
将本发明的水泡性口炎病毒重组N蛋白抗原应用于制备快速检测水泡性口炎病毒抗体的试纸条，特异性好，灵敏度高，具有检测快速、操作简便，检测样品量少，检测成本较低等优点，为水泡性口炎病毒抗体检测和水泡性口炎流行病学调查提供良好的检测手段。
为了更好地理解和实施，下面结合附图详细说明本发明。
附图说明
图1为SDS-PAGE(左图)和Western-blot(右图)分析基因表达的VSV N蛋白。其中，M：蛋白分子量标准；1：转化pET52/LIC质粒的对照菌；2，4：转化pET52/LIC-mVSV N质粒的阳性菌(含密码子优化后的VSV N基因序列)；3，5：转化pET52/LIC-VSV N质粒的阳性菌(含密码子未优化后的VSV N基因序列)。
图2为水泡性口炎病毒抗体快速检测试纸条结构示意图。其中，
1：背衬，2：硝酸纤维素膜，3：样品垫，4：金标复合物垫，5：吸水垫，6：检测线，7：对照线。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1：截短的VSV N蛋白的表达
1、VSV N蛋白抗原表位分析和密码子优化：通过检索NCBI数据库中VSV N基因序列和对应氨基酸序列(GenBank:J02428.1)，利用在线软件对其主要抗原表位进行分析，确定选择抗原表位位于N蛋白中第88～374位氨基酸，其氨基酸序列为序列表中SEQ ID No.1，其对应的核苷酸序列(GenBank:J02428.1)为第325～1185nt位核苷酸，见序列表SEQ IDNo.5。
2、VSV N基因密码子优化和人工合成：密码子优化，即根据表达系统对氨基酸密码子的偏爱性，对基因序列进行重新设计，将基因序列中利用率低或稀有的密码子修改为表达系统使用频繁的密码子，确保所表达蛋白的氨基酸序列不变。根据大肠杆菌对密码子的偏爱性，对选取的蛋白质片段对应的基因序列密码子进行优化，优化后的基因序列标记为mVSV N，其序列为序列表中SEQ ID No.2，通过人工合成该序列，将该序列克隆至pMD-18T载体中。
3、mVSV N基因引物设计：根据密码子优化后的VSV N基因序列，设计特异性引物，在引物5'端人工添加LIC粘性末端，与商品化线性pET52/LIC末端互补的序列。PCR引物序列如下，下划线部分为LIC粘性末端：
上游引物(P1)：5'-CAGGGACCCGGTTGGTCAAGTTTCGGAATC-3'(SEQ ID No.3)；
下游引物(P2)：5'-GGCACCAGAGCGTT ATCACGACCTTGTGGTGG-3'(SEQ ID No.4)；
4、PCR扩增mVSV N基因：用PCR扩增试剂盒(Takara公司产品)，从pMD-18T-mVSV N质粒中扩增目的基因片段。在PCR管中加入以下组分：
将上述组分混合后置于PCR仪中，进行扩增。反应程序为95℃预变性5min；95℃1min，55℃ 1min，72℃ 1min，35个循环，72℃ 10min。经琼脂糖凝胶电泳分析，PCR扩增产物约为890bp，用DNA快速回收试剂盒回收PCR产物。
5、pET52/LIC-mVSV N重组表达载体的构建：用T4DNA聚合酶处理的上述PCR产物与商品化线性pET52/LIc载体(Invitrogen公司产品)连接，利用T4DNA聚合酶外切酶活性，切去3'端约11～12个碱基，即形成与LIC位点序列互补的粘性末端，处理后的PCR产物可与线性pET52/LIC定向连接。反应体系如下：
将上述反应物混合后，于22℃反应30min，然后于75℃反应20min。在1.5mL离心管中，加入线性pET52/LIC质粒1μL、经T4DNA聚合酶处理的PCR产物2μL和25mmol/L EDTA 1μL，混合后，于22℃反应5min。取上述反应物1μL转化100μL NovaBlue E.coli感受态细胞(Invitrogen公司产品)，冰浴5min，42℃ 热激30s，冰浴2min。加入300μL SOC液体培养基，37℃震荡(200r/min)培养1h后，5,000r/min离心5min，弃去350μL上清，用加样器吹打数次，重悬菌体后涂布含Ampicillin(50μg/mL)的LB平板上，37℃培养16h后，随机挑取6个单菌落，分别接种至3mL含Ampicillin(50μg/mL)的LB培养液中，37℃震荡培养过夜。取1.5mL培养物，用质粒DNA提取试剂盒(TARAKA公司产品)提取质粒DNA，用该DNA作为模板，进行PCR鉴定。PCR反应体系如下：
反应程序为：95℃预变性5min；95℃1min，54℃1min，72℃1min，30个循环，72℃10min。PCR反应结束后，取8μL PCR产物进行电泳分析。同时将pET52/LIC-mVSV N质粒DNA送到TAKARA公司进行DNA序列测定，经测定，其序列为序列表中SEQ ID No.2完全一致。
6、VSV N蛋白在原核细胞中的表达及分析：将上述经鉴定的pET52-VSV N质粒DNA转化(DE3)pLacIE.coli感受态细胞(Invitrogen公司产品)，涂于含Ampicillin(50μg/mL)的LB固体培养基，37℃培养12～16h，挑取阳性单菌落，接种于5mL LB培养基，于37℃震荡培养2h后，加入IPTG(终浓度为1mmol/L)进行诱导表达VSV N蛋白。收集上述菌液，5000r/min离心10min，取上清，加入原体积约1/10的PBS(pH7.2)，用超声波破碎仪对菌体进行破碎处理。经SDS-PAGE分析，表达产物大小约为36Ku(图1)。由图1可看出SDS-PAGE试 验表明经过优化后，VSV N蛋白表达量明显提高。用羊抗VSV阳性血清和HRP标记的兔抗羊IgG(SIGMA公司产品)进行Western blot分析，结果表明表达产物可以和抗VSV阳性血清反应。
7、VSV N蛋白的纯化：使用6×His标签融合蛋白纯化试剂盒对表达VSV N表达产物进行纯化，用核酸/蛋白分析仪检测蛋白浓度，并用50mmol/LPBS(pH7.2)将其蛋白浓度调至1mg/mL。
实施例2：VSV抗体间接ELISA方法的建立及评价
1、间接ELISA评价VSV N蛋白免疫学活性。用基因表达的VSV重组N蛋白包被ELISA板，建立间接ELISA抗体检测方法。具体操作方法如下：
①、用包被液(pH9.6碳酸缓冲液)将纯化的重组蛋白稀释至5μ/mL，包被96孔ELISA板，50μL/孔，于4℃放置过液。
②、弃去包被物，用PBST(20mmol/L PBS+0.5％吐温20)洗3遍。加入浓度为10g/L的BSA溶液，250μL/孔，37℃封闭2h。弃去封闭液，用PBST洗3遍。
③、向ELISA板中加入阳性血清、阴性血清和待检血清，50μL/孔，37℃，反应30min。
④、用PBST洗3遍，加入1：5000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG，50μL/孔，37℃，反应30min。
⑤、用PBST洗3遍，加入底物(TMB+H2O2)50μL/孔，室温避光反应10min。
⑥、加入2mol/L H2SO4溶液，50μL/孔，终止反应。
⑦、于酶标仪读取D450nm值。
⑧、根据检测样品OD450值进行结果判定：如果S/N>2，判定为阳性，S/N≤2，判定为阴性。
2、ELISA特异性和敏感性：用间接ELISA方法检测羊抗VSV、FMDV(O型、A型和亚洲I型)、AKV、CPV阳性血清及健康动物血清，结果检测VSV阳性血清时为阳性，检测其他病毒阳性血清和健康动物血清时均为阴性。表明VSV N蛋白特异性良好。用间接ELISA检测10份系列稀释(1:4至1:512)的VSV阳性血清时，结果表明检测极限为1：64至1：128之间。用ELISA检测VSV高免血清时，检测极限达1:2048。
实施例3：胶体金免疫层析试纸条的制备及评价
1、将实施例1的水泡性口炎病毒重组N蛋白抗原作为检测线试剂，同时将、兔抗SPGIgG作为对照试剂，制作胶体金免疫层析试纸条，检测线和对照线试剂包被量分别为0.175μg/条和0.35μg/条。
2、试纸条的特异性：用实施例2中的试纸条分别检测VSV标准阳性血清样品、其它相关病毒包括O型、A型和亚洲I型口蹄疫病毒(FMDV)、赤羽病病毒(AKV)、、蓝舌病病毒(BTV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)和羊痘病毒(CPV)阳性血清样品及阴性对照样品。结果显示试纸条检测VSV阳性血清样品时为阳性反应，检测其它病毒阳性血清及阴性对照样品时均为阴性，表明试纸条特异性良好。
3、试纸条的敏感性：用试纸条检测10份系列稀释的VSV阳性血清样品(编号为1～10)，同时用ELISA和琼脂扩散试验(AGID)作对照。与ELISA相比，试纸条检测结果有6份与ELISA检测结果一致，有3份比ELISA检测结果低一个滴度，有1份比ELISA检测结果高1个低度。与琼脂扩散试验相比，试纸条检测结果比琼脂扩散试验检测结果高2～3个滴度。详细结果见表1。
表1 三种方法检测抗体效价结果
4、临床样品检测：用试纸条和ELISA同时检测临床血清样品615份，结果如下表。根据检测结果计算得出，与ELISA相比，试纸条特异性为99.43％(525/528)，敏感性为98.85％(86/87)，试纸条和ELISA试剂盒检测结果之间的符合率为99.35％[(86+525)/615]。详细数据见表2：
表2：临床样品检测结果
以上实验结果表明，本发明提供的水泡性口炎病毒重组N蛋白抗原具有良好的特异性，用其制成的胶体金试纸条特异性强，灵敏度高，与现有技术相比，该试纸条具有检测快速、操作简便、不需要专门的仪器设备和专业技术人员。该试纸条易于保存和运输，使用检测样品量少，检测成本较低，该试纸条的研制，为水泡性口炎病毒抗体检测和水泡性口炎流行病学调查提供良好的检测手段，具有广阔的应用前景。
本发明并不局限于上述实施方式，如果对本发明的各种改动或变形不脱离本发明的精神和范围，倘若这些改动和变形属于本发明的权利要求和等同技术范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变形。
Claims (5)
1.一种水泡性口炎病毒重组N蛋白抗原，其氨基酸序列为SEQ ID No.1所示。
2.编码权利要求1所述水泡性口炎病毒重组N蛋白抗原的基因，其核苷酸序列如SEQ IDNo.2所示。
3.权利要求1所述水泡性口炎病毒重组N蛋白抗原的制备方法，包括以下步骤：
1)人工合成SEQ ID No.2所示基因序列，并将该序列克隆至载体中，用PCR方法扩增该片段；
2)将步骤1)获得的PCR产物与载体连接，构建重组表达载体；
3)将重组表达载体导入原核表达体系，进行蛋白表达；
4)对表达产物进行纯化后获得所述的水泡性口炎病毒重组N蛋白抗原。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤1)中的PCR方法，其用于该PCR方法的PCR引物组，具体包括以下两条序列：
上游引物P1见序列表中SEQ ID No.3；
下游引物P2见序列表中SEQ ID No.4。
5.权利要求1所述的水泡性口炎病毒重组N蛋白抗原在制备用于检测水泡性口炎病毒抗体的试剂中的应用。
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