TW201530141A - Ｃｓｆｖ抗體的改良診斷測試 - Google Patents
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Abstract
本發明係關於獸醫診斷學領域，尤其係關於檢測針對CSFV之抗體之測試。具體而言，本發明係關於檢測測試樣品中針對野生型CSFV之抗體之方法，其特徵在於該方法包含與包含CSFV E2蛋白質之突變TAVSPTTLR表位之載體共培育。此外，本發明係關於診斷測試套組，且係關於本發明方法之用途。另外，本發明係關於區分感染野生型CSFV之動物與已針對CSFV用CSFV(標記物)疫苗進行疫苗接種之動物之方法，且係關於在豬類動物群體中控制野生型CSFV感染之方法，其係藉由組合使用CSFV(標記物)疫苗與本發明之該診斷測試套組來實施。
Description
本發明係關於獸醫診斷學領域，尤其係關於檢測針對CSFV之抗體之測試。具體而言，本發明係關於檢測測試樣品中針對野生型CSFV之抗體之方法。此外，本發明係關於診斷測試套組，且係關於檢測針對野生型CSFV之抗體之方法之用途。另外，本發明係關於區分感染野生型CSFV之動物與針對CSFV用CSFV疫苗進行疫苗接種之動物之方法，且係關於在豬類動物群體中控制野生型CSFV感染之方法。
已知用於對微生物感染進行血清診斷，以確定人類或動物對該微生物或對針對該微生物之抗體呈陽性或陰性之不同測試。通常，該等測試包含使用確定抗體提供特異性以檢測可能已形成之免疫複合物之技術。該測試通常亦將具有放大信號強度之步驟，及一或多個洗除未結合、非特異性或不期望組份之步驟。可經多種方式檢測免疫複合物，例如藉由檢測變色、螢光或粒徑變化以光學方式檢測，或者藉由檢測免疫複合物中之經放射性標記之抗原或抗體來檢測。類似地，測試之物理形式可廣泛變化且可採用(例如)微量滴定板、膜、量桿、生物感測器晶片、凝膠基質或包含諸如膠乳、金屬或聚苯乙烯等(微-)載體顆粒之溶液。
此一測試之具體設置之選擇通常係依據輸入樣品之類型、期望測試靈敏度(正確鑑別陽性樣品)及特異性(正確辨別真陽性與真陰性樣
品)來確定；該等性質取決於免疫反應之強度及定時或微生物之存在。此外，對測試經濟之要求(例如其對大規模之適用性及其成本)可決定具體形式之選擇。
熟知診斷測試係：放射免疫分析、免疫擴散、免疫螢光、免疫沈澱、凝集、溶血、中和及「酶聯免疫吸附分析」或ELISA。尤其對於大規模測試，可要求液體處置、結果讀取及處理或二者之自動化。此亦可要求藉由更現代化且小型化之形式(例如在AlphaLISATM(Perkin Elmer)中)代替傳統分析形式。
廣泛使用之診斷測試係酶免疫分析，例如ELISA。該等分析易於調整規模，且可極靈敏。另一優點係其結果之動態範圍，此乃因可以一系列稀釋物測試樣品。結果以吸光度之任一單位表示，通常介於0.1與2.5光學密度(OD)單位之間，端視讀出所用技術設備之性質及設定而定。包括通常適宜之陽性及陰性對照樣品，且多重測試最多次樣品(most-times sample)。藉由包括確定參照樣品(之一系列稀釋物)來獲得標準化，此亦容許匹配某一分數以預設確定陽性或陰性之值，且容許與生物學意義相關聯，例如：抗原量與潛能相關聯，或抗體量與免疫保護程度相關聯。
已知ELISA設置之多種變體，但通常採用將抗原或抗體固定至固相，例如固定至微量滴定板之孔。在固定抗體時，測試稱為「捕獲」或「夾心」ELISA。之後添加測試樣品，容許配體(例如欲檢測抗原或抗體)結合。然後添加檢測劑(抗體、抗原或其他結合組份)，該檢測劑偶聯至可以分光光度方式讀取之標記，例如偶聯至可誘導顏色反應之酶。其他類型之標記可為使用發光、螢光或放射性。經標記檢測劑之使用意欲放大信號強度以提高測試靈敏度，然而，其亦可引入背景信號，降低信號雜訊比。
在ELISA方案之變體中，藉由引入競爭性結合來改良測試特異
性，在此情形中該測試稱為「競爭ELISA」、「抑制ELISA」、「干擾ELISA」或「阻斷ELISA」。在此一分析中，測試樣品中之因子(抗體或抗原)與經標記檢測劑抗體/抗原競爭結合固定至固相之分子(抗原或抗體)。此減小最大顏色信號，其係量測競爭因子之存在或數量之靈敏方式。結果可表示為最大ELISA信號之抑制百分比。
由於其多樣性及靈敏度，ELISA一般用於(例如)流行病學、感染監督計劃或用於驗證疫苗接種活動之效能。ELISA之此用途亦擴展至動物健康方面，例如監測更多相關傳染病之根除及控制措施。在該情況中，關鍵係診斷測試之足夠程度之靈敏度及特異性，此乃因此方面之缺點可以以下中之任一方式造成嚴重後果：偽陽性可引起動物之不必要的檢疫或淘汰，且偽陰性可因運輸未檢測載體-動物跨過邊界而引起病原體之散佈。ELISA之該用途之一實例係控制豬類動物之OIE法定通報疾病，例如經典豬瘟(CSF)。
CSF亦稱作豬霍亂或豬瘟，其通常係在世界各地出現之豬類動物之致死性疾病。其係由高傳染性之經典豬瘟病毒(CSFV，亦稱為豬霍亂病毒)引發。該疾病使動物非常痛苦，且對倚賴商業養豬之地區及其產品造成重大經濟損失。
CSFV屬黃病毒科(Flaviviridea)瘟疫病毒屬(Pestivirus)。其他熟知瘟疫病毒係感染綿羊及豬之邊界病病毒(BDV)，及感染牛、綿羊及豬之牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)。在該等相關病毒之間發生一定程度之交叉保護。CSF病毒體相對較小且有套膜，且包含約12.3kb之正義單鏈RNA病毒基因組。此基因組翻譯為一個約4000個胺基酸之大的多蛋白，其藉由多個非結構性病毒蛋白質自我裂解。此產生主要結構性病毒套膜糖蛋白：Erns、E1及E2。關於病毒及其疾病之評論參見：Moennig(2000,Vet.Microbiol.，第73卷，第93頁)。
檢測針對CSFV之抗體之黃金標準係病毒中和測試。然而，由於該測試費力且困難，使用ELISA型測試進行快速篩選及檢測，且可利用多種商業測試來檢測CSFV抗原或CSFV抗體。該等測試評論於Blome等人(2006,Rev.Sci.Tech.(Int.Off.Epiz.)，第25卷，第1025頁)中。用於CSFV抗原之測試檢測全病毒或特定病毒(套膜)蛋白質，例如Erns或E2。類似地，用於CSFV抗體之測試檢測病毒-、E2-或Erns抗體。目標動物中對抗體之檢測比對抗原或病毒之檢測更靈敏，此乃因抗體在動物中存在時間更長，從而提供更寬檢測時間窗。另外，由於瘟疫病毒之間之交叉反應性，基於檢測Erns抗原或Erns抗體之CSFV診斷測試在BVD及/或BVDV高發地區不可靠。因此，目前CSFV診斷集中於檢測針對CSFV E2蛋白質之抗體。評論參見：Schroeder等人(2012,Rev.Sci.Tech.(Int.Off.Epiz.)，第31卷，第997頁)。
CSFV E2蛋白質(先前稱作糖蛋白E1或gp51-54)係自CSFV多蛋白之胺基酸(aa)位置690編碼。成熟CSFV E2蛋白質長度為約370 aa，此不包括與E1 C-末端重疊之約22 aa之N-末端信號序列，但包括約40 aa之C-末端跨膜區域(Ganges等人，2005，疫苗，第23卷，第3741頁)。在E2上，免疫顯性A結構域位於多蛋白之胺基酸位置766與866之間(van Rijn等人，1993.J.of Gen.Virol.，第74卷，第2053頁)。在該結構域內，已鑑別一個線性B細胞表位，其引發中和病毒之抗體：TAVSPTTLR表位(SEQ ID NO：1)。此表位位於CSFV多蛋白中胺基酸位置829-837處，對應於E2 aa序列之aa 140-148，且在CSFV株系之間相當保守，但不與BVDV抗體或BVD抗體交叉反應(Lin等人，2000,J.of Virol.，第74卷，第11619頁)。
已研發出多種採用此表位之特異性之商業E2抗體測試：PrioCHECK® CSFV Ab 2.0(先前名為Ceditest® CSFV 2.0)(皆來自：
Prionics AG,Schlieren-Zurich，瑞士)及IDEXX CSFV Ab Test®(IDEXX Europe B.V.,Hoofddorp，荷蘭)。該等測試係使用固定CSFV E2蛋白質之競爭ELISA。在測試樣品中存在任何E2抗體時，其結合至固定CSFV E2，且因此與經標記指示劑抗體競爭，該經標記指示劑抗體係對野生型CSFV E2之TAVSPTTLR表位具有特異性之酶偶聯單株抗體；在該等套組中用作指示劑之經標記單株抗體稱為V2(Prionics)或A18(IDEXX)，且具有與Lin等人所用WH303單株抗體(2000，上文文獻)相同之特異性。
針對CSF之疫苗為人所知且在CSFV係地方病之國家常規使用。由於不活化CSFV疫苗不切實際，故減毒活病毒疫苗已使用多年；最有效疫苗係基於所謂中國株系或C株系。其具有多年使用之極可靠記錄，且亦係歐盟批准之唯一減毒活疫苗，但僅用於CSF爆發情形中之緊急疫苗接種。通常，藉由禁止運輸對針對CSFV之抗體呈血清陽性之豬之貿易限制系統來支援用於CSF之政府控制計劃(例如EU Council Directive 2001/89/EC)。
然而，有些國家可能因野生豬及野豬中之天然CSFV儲存庫而頻繁經受再感染。因此，發生CSF偶然爆發，且淘汰許多豬(感染及未感染二者)。此引發許多倫理問題以及顯著成本。同樣，可不再出口經受緊急疫苗接種之豬，此乃因其變為血清陽性。此引發畜舍過度擁擠及進一步經濟損失。
因此，人們主要努力研發容許血清學「區別感染動物與經疫苗接種動物」或DIVA之疫苗。此類辨別測試之基本原理係，可以血清學方式區分用具有陽性或陰性「標記物」功能之疫苗對目標動物進行之疫苗接種與野生型微生物對動物之感染。舉例而言，標記物疫苗可在一或多個存於野生型微生物中之抗原中有缺陷。則經感染目標將變為對該抗原呈血清陽性，而疫苗接種物對該抗原保持血清
陰性。
一類經研發用於抵抗CSF之DIVA疫苗係基於病毒亞單位，例如E2及/或Erns。然而，該等疫苗保護性較低，且免疫之開始慢於全病毒疫苗。
同樣，在無CSFV疫苗接種或滅除CSFV之國家，唯一容許銷售此一CSFV標記物疫苗之方式係與可靠的搭配診斷測試組合。
在將早前強保護以及DIVA能力組合至一種疫苗之努力中，Kortekaas等人用重組DNA技術修飾現有C株系減毒活CSFV疫苗(2010,J.of Virol.Methods，第163卷，第175頁)，其藉此集中於CSFV E2蛋白質之A結構域中之TAVSPTTLR表位。該表位中之一些胺基酸突變或缺失，此後提交突變體CSFV病毒以迫使病毒進化。獲得活突變體病毒，其具有TAVSPTTLR表位之不同突變。
在E2之vFlc-△PT系列之C株系CSFV突變體中，選擇一種用於進一步研究，名為：vFlc-△PTa1。此病毒藉由取代一個胺基酸及缺失兩個胺基酸而具有E2之TAVSPTTLR表位之突變形式，則對應於原始TAVSPTTLR表位之表位變為：TAGSTLRTE(SEQ ID NO：2)。此突變體病毒顯示良好活力，且誘導針對E2之強抗體反應。另外，針對突變E2之兔抗體不再識別親代C株系病毒之野生型E2。因此，此病毒被視為容許DIVA之有效活CSFV標記物疫苗之理想候選者。
然後測試vFlc-△PTa1突變體病毒在目標動物中之疫苗效能(Kortekaas等人，2011,Vet.Microbiol.，第147卷，第11頁)，其中發現可誘導與親代株系接近之程度之保護，且有效防止挑戰病毒剝落。然而，著者失望地發現，無法清晰區分經此突變體病毒進行疫苗接種之豬之血清與經親代C株系病毒進行疫苗接種之豬之血清。此乃因E2突變體病毒在豬中誘導之抗體在E2 ELISA中產生中間強度至滿強度偽陽性分數。因此，此使得由於缺少可靠辨別性CSFV抗體測試，而
無法在市場上引入新DIVA標記物疫苗。
在嘗試克服對經標記物疫苗進行疫苗接種之豬之血清實施之E2ELISA中的偽陽性分數時，Kortekaas等人(2011，上文文獻)考慮對ELISA之若干修正，例如：藉由使用三級結構預測修飾所用肽；使用容許更佳區別之新單株抗體；使用不同阻斷抗體改變ELISA，此乃因已證實此對其他分析有效(Holinka等人，2009,Virology，第384卷，第106頁)；以及：改變讀出之截止值，同時保持可接受之靈敏度。發現所有該等方式皆對克服偽陽性之出現無效。
如所指示，在類似E2 ELISA中，在測試經不同重組CSF標記物進行疫苗接種之豬之血清時，Holinka等人(2009，上文文獻)之結果未顯示偽陽性結果。然而，無法認為其結果顯著：一方面係由於其測試彙集血清而非個別血清，且另一方面係由於其讀數在最低檢測範圍中(介於0.100與0.350OD單位之間；參見Holinka等人，2009，上文文獻；圖3A)，其中信號雜訊比過於不利而無法形成可靠大規模診斷測試之基礎。
更佳實例係Reimann等人之出版物(2010,Vet.Microbiol.，第142卷，第45頁)，其藉由用BVDV E2之相應序列代替CSFV E2之TAVSPTTLR表位來構築與Holinka等人之疫苗非常相似之重組CSF疫苗。與Kortekaas等人(2011，上文文獻)之結果一致，Reimann等人亦在經其突變E2病毒進行疫苗接種之豬之血清中發現結合至未修飾E2表位之交叉反應性抗體。因此在此情形中，亦獲得偽陽性分數，且無法研發出DIVA測試。為解決此問題，Reimann等人建議以靈敏度為代價調整截止值，或修飾突變體病毒主鏈序列以減少偽陽性分數。
因此，發現TAVSPTTLR表位中之不同突變可基於此一突變體表位引起CSFV標記物疫苗之相同問題：在基於vFlc-△PTa1病毒之CSFV
疫苗之情形中，TAVSPTTLR表位中之突變改變該基因座之9個胺基酸中之6個。類似地，Reimann等人(2010，上文文獻)在測試E2蛋白質之相應基因座之9個胺基酸中之5個不同胺基酸時，亦發生此問題。
因此，在自經包含CSFV E2蛋白質之突變TAVSPTTLR表位之CSFV(標記物)疫苗進行疫苗接種之動物獲得之血清中，野生型CSFV E2抗體之ELISA中之偽陽性分數問題因此具有一般性，且直至今日仍未克服。在CSF疫苗候選者之最新評論中，Eblé等人(2013,Vet.Microbiol.，第162卷，第437頁)確認此困境，對於CSFV，尚未獲得CSFV疫苗與相應DIVA測試之最佳組合。
因此，本發明之目標係克服先前技術中之缺點，及在測試經在CSFV E2之TAVSPTTLR表位中具有突變之CSFV疫苗進行疫苗接種之動物之樣品時，藉由減少針對野生型CSFV之抗體之診斷分析中之偽陽性結果來適應業內需求。
令人驚訝地發現，可藉由野生型CSFV抗體之容許DIVA之改良診斷測試滿足此目標，且因此可克服先前技術之缺點。該改良係關於修改野生型CSFV E2抗體之診斷分析之培育步驟，其中將測試樣品與包含CSFV E2之TAVSPTTLR表位之固定載體一起培育，且現在納入與包含CSFV E2之突變TAVSPTTLR表位之載體共培育。發現此修改藉由僅有限修改CSFV E2抗體之現有診斷分析方案完全減少偽陽性結果。
此經修改診斷方法具有以下若干有利效應：主要有利效應係此修改可完全整合至現有測試方案中。因此，不需要額外培育步驟，且改良測試方法所需時間不長於先前測試方法。慮及在一區域中爆發CSF之情況下可能需要在短時間內測試可能極大之測試樣品數，此係顯著優點。
此外，現在不再需要對相應CSFV疫苗或對原始診斷分析作出顯
著改變。相反，現在可能使用用於檢測經CSFV疫苗進行疫苗免疫之動物之樣品中之野生型CSFV E2抗體之現有CSFV E2 ELISA之基礎設置。此使得可信賴已建立CSFV診斷分析，其可靠性已證實且特異性概況及靈敏度概況已為人所公認。
對於此修改，現在可使用CSFV診斷分析有效辨別經感染動物與經疫苗接種動物，且本發明因此提供野生型CSFV之改良診斷測試，其容許DIVA篩選且可用作CSFV(標記物)疫苗之搭配診斷，以控制CSFV在易感動物群體中之存在。
關於該等有利效應之重要步驟係發明者鑑別無法辨別針對CSFV之疫苗接種與野生型CSFV感染或C株系疫苗之原因。
發現此原因在於，包含具有突變TAVSPTTLR表位之E2之CSFV(標記物)疫苗誘導抗體，該等抗體不僅可特異性結合至疫苗之突變E2表位，亦可以相同高親和性特異性結合至野生型CSFV及C株系疫苗中E2之未修飾TAVSPTTLR表位。在測試經疫苗接種動物之血清樣品之野生型CSFV感染時，此產生偽陽性分數。相反，發現野生型CSFV感染或用C株系疫苗接種所產生抗體或針對野生型TAVSPTTLR E2表位之單株抗體(例如：V2(Prionics)、A18(IDEXX)或WH303(Lin等人，2000，上文文獻))對具有CSFV疫苗之突變TAVSPTTLR表位之E2蛋白質不具有任何顯著親和性。此係與包含野生型CSFV E2蛋白質之TAVSPTTLR表位之載體共培育未能解決針對具有突變TAVSPTTLR表位之疫苗之偽陽性分數問題之原因。
目前尚未得知如何或為何發生此現象。然而，不受限於任何可解釋該等觀察結果之理論或模型，發明者推測，CSFV E2之TAVSPTTLR表位之三維形式有影響；此3D形式在其線性胺基酸序列突變後變化。此誘導針對突變體E2表位之抗體，其似乎仍能特異性結合至CSFV E2之野生型TAVSPTTLR表位。該等抗體可在基於野生型
CSFV E2蛋白質之診斷分析中交叉反應，引起高特異性偽陽性分數。
根據對偽陽性測試分數問題之原因之此見解，然後發明者發現解決此問題之驚人方式，且能在已建立E2診斷分析方案之一個步驟中實踐解決方案：該步驟用於將測試樣品與包含CSFV E2蛋白質之TAVSPTTLR表位之固定載體一起培育，且另外：與包含CSFV E2蛋白質之突變TAVSPTTLR表位之載體共培育。此解決偽陽性分數問題。
診斷方法之修改可呈共培育形式之事實令人驚訝，此乃因通常預計此一程序會破壞測試樣品中CSFV E2抗體與包含CSFV E2之TAVSPTTLR表位之固定載體之適當且完整結合，且熟習此項技術者因此通常不考慮此程序。
因此在第一態樣中本發明係關於檢測測試樣品中針對野生型經典豬瘟病毒(CSFV)之抗體之方法，其中該樣品亦可包含針對CSFV E2之突變TAVSPTTLR表位之抗體，該方法包含將該測試樣品與包含CSFV E2之TAVSPTTLR表位之固定載體一起培育之步驟，其特徵在於該方法包含在該步驟中與包含CSFV E2之突變TAVSPTTLR表位之載體共培育。
本發明之「檢測方法」係對測試樣品施用以測定測試樣品之值或性質(通常稱為「生物標記」)之活體外方法，此後可解釋分析結果以給出其結果之確定含義。此解釋係基於使用該方法獲得之測試樣品之結果與參照值或先前量測之比較，且確認所量測值存在或不存在，或已增加或減小。
對於本發明，所量測值係對野生型CSFV E2蛋白質之TAVSPTTLR表位具有特異性之抗體之定性及定量存在。
本發明方法可係呈不同熟知形式中之一者之診斷測試，例如呈以下形式：放射性免疫分析、免疫擴散分析、免疫螢光分析、免疫沈
澱分析、凝集分析、溶血分析、中和分析、「酶聯免疫吸附分析」(ELISA)或AlphaLISATM。
若干教科書闡述多種可用診斷學測試及其特定特徵；例如：J.Huebner：Antibody-antigen interactions and measurements of immunologic reactions(第9章，Pier、Lyczak及Wetzler(編輯)：Immunology,infection,and immunity,ASM Press,Washington D.C.,2004,ISBN：1555812465，第207-232頁)；「Antibodies：A Laboratory Manual」(編輯：Harlow及Lane,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1988,ISBN-10：0879693142)；及「Immunoassays：A Practical Approach」(J.P.Gosling編輯，Oxford University press,2000,ISBN-10：0199637105)。
大量商業公司可提供用於診斷測試之材料及試劑或完整診斷套組，或可提供測試及分析。
熟習此項技術者通常可熟練設計並優化本發明方法之方案、材料及條件。
如業內亦所熟知，「抗體」係免疫球蛋白蛋白質，且一般有5個種類。對於測試樣品，抗體通常將係IgG或IgM型，且係全抗體。然而，可用作本發明方法中之試劑，例如用作第二抗體或用作經標記抗體之其他抗體不需要係全免疫球蛋白(例如單鏈抗體)或免疫球蛋白之一部分；且亦可具有不同形式：該等部分之(合成)構築體，前提係抗體部分仍含有抗原-結合位點。免疫球蛋白之熟知子片段係：Fab、Fv、scFv、dAb或Fd片段、Vh結構域或該等片段或結構域之多聚體。
用作診斷分析中之試劑之抗體一般係藉由以下方式來產生：用靶抗原對供體動物進行(過度)免疫，且自動物血清收穫所產生抗體。熟知供體係兔及山羊。另一實例係雞，其可在蛋黃中產生大量抗體，即所謂IgY。或者，抗體可在活體外經由(例如)熟知單株抗體技術自
永生化B淋巴球培養物(雜交瘤細胞)產生，且已知其工業規模之生產系統。抗體或其片段本身亦可在重組表現系統中經由所選殖Ig重鏈及/或輕鏈基因之表現而表現。所有該等皆為熟習此項技術者所熟知。
對於本發明且在本文全文中，抗體將基於其所針對之靶來提及；例如：針對CSFV之抗體稱作「CSFV抗體」，且「E2抗體」係針對E2蛋白質之抗體，亦稱為抗E2抗體等。
如業內所熟知，「針對」某一靶之抗體係對該靶上之表位具有特異性之抗體，其中該靶係具體分子或實體。若抗體(或其片段)能選擇性結合至表位，則其對該表位具有特異性。
熟習此項技術者可容易地評價抗體與靶之間之相互作用是否具有特異性及/或選擇性。舉例而言，基於抑制之免疫分析之結果之特異性可藉由證實抑制與分析中所用抗原或抗體之濃度相關來確定。使用(例如)競爭結合分析可確定，將抗體與此經包被抗原之結合抑制50%需要多少抗原(Bruderer等人，1990,J.of Imm.Meth.，第133卷，第263頁)。作為本發明情形之實例，使用野生型CSFV E2蛋白質及TAVSPTLLR表位特異性(單株)抗體。
在診斷免疫分析情況下極相關者係抗體顯示偽陽性結合時，此導致診斷分析之偽陽性結果。此可因與除了針對其生成抗體之表位以外之表位之相對強結合而引起，或因與其起源表位之特異性結合，但然後定位於與起源靶不同之靶上而引起。
熟習免疫分析技術領域之技術者瞭解如何區分真陽性結果與偽陽性結果，例如藉由用不同類型之診斷分析確認結果，或用來自不同時間點之測試樣品確認結果來區分。
藉由本發明方法，在測試針對野生型CSFV之E2蛋白質之抗體時可顯著減少偽陽性分數。如本文所概述及例示，偽陽性分數之減少已達到誤認為呈CSFV陽性之動物數之減少最多五分之四(例如自大於50
% ELISA抑制，下降至小於10%抑制)，且最多100%。
在多種使用本發明方法之測試中，基於測試結果，自感染後約3週，所有來自經野生型CSFV感染之豬之血清定性為陽性，而經基於vFlc-△PTa1之疫苗反覆進行疫苗接種之動物之血清在第三次疫苗接種後直至所量測最後時間點皆未變為陽性。
亦對來自中央獸醫研究所(Lelystad，荷蘭)之集合之約900個測試樣品之大組測試本發明方法，該集合包含高、低、陰性或可疑之CSFV抗體以及大量含有BVD-抗體或BVDV-抗體之血清及甚至CSFV、BVD及/或BVDV之一些混合感染。藉由本發明方法，可以優良特異性及靈敏度正確鑑別幾乎所有樣品，參見下文實例。
事實上，在測試900個樣品之集合時，在用本發明方法施用共培育時對於所測試大多數樣品甚至觀察到增強靈敏度。此意指，與施用標準商業CSFV E2抗體阻斷ELISA相比，在施用本發明方法時，對於若干樣品，在野生型CSFV E2抗體之阻斷ELISA中觀察到之抑制百分比較高。此獲得5個先前指示為可疑現在評為陽性之樣品，及兩個先前為陰性現在評為可疑之樣品(參見實例2.3及表2)。
對於本發明，「野生型」經典豬瘟病毒係指如其在自然界中之原樣之CSFV。此並非意指該等野生型CSFV皆相同，此乃因可想像或已知遺傳組成及生物學特徵之多種變異。然而，此術語在本發明中使用時意欲排除彼等因人類介入(例如藉由修飾，或突變，例如藉由反覆傳代或藉由重組DNA技術調整其核酸)產生之CSFV。
對於本發明，「經典豬瘟病毒」或「CSFV」一般係指來自分類學瘟疫病毒屬之具有CSFV之熟知特徵之病毒。此亦包括以任一方式自其細分類之CSFV，例如細分為亞種、株系、分離物、基因型、血清型、血清變型、血清群、變體或亞型及諸如此類。該等CSFV共享其分類學家族-成員之特徵性特徵，例如基因組、物理、電子顯微鏡
及生物化學特徵，以及生物學特徵，例如生理、免疫學或病原性特徵。除了血清學分類，其他測定可係基於核苷酸測序或PCR分析，如業內已知。
熟習此項技術者將瞭解，儘管係本發明標的之病毒物種目前名為CSFV，但此分類學種類在新見解導致重新分類為新的或不同的分類群時可發生變化。然而，由於此不改變所涉及微生物或其特徵性特徵，僅改變其學名或分類，故重新分類之生物體仍在本發明範圍內。
用於本發明方法中之「測試樣品」原則上可為任一類型之含有抗體之樣品，例如自動物全血樣品製備之血漿或血清樣品。熟習此項技術者熟知自動物獲得及製備此一血漿或血清樣品所需之技術及材料。
較佳者係血清樣品，此乃因其較清潔，且可藉由標準實驗室技術來製備，例如包含用於以下之步驟：凝血、離心及補體不活化。
視情況，測試樣品可經進一步處理或純化以(例如)改良信號強度或減小背景信號。舉例而言，可分離出抗體。用於抗體純化之熟知技術係(例如)使用辛酸或硫酸銨沈澱該等抗體，或使用親和層析。
對於本發明，如本文所用術語「包含(comprise)」(以及變化形式，例如「包含(comprising)」、「包含(comprises)」及「包含(comprised)」)係指在正文章節、段落、申請專利範圍等中涵蓋或包括之所有要素且呈對於本發明可想像之任一可能組合，其中即使未明確列舉該等要素或組合，亦使用此術語；且該術語不係指排除該等要素或組合中之任一者。因此，任何該正文章節、段落、申請專利範圍等亦可係指一或多個實施例，其中術語「包含」(或其變化形式)係由諸如「由……組成(consist of)」、「由……組成(consisting of)」或「基本上由……組成」等術語來代替。
「CSFV E2之TAVSPTTLR表位」係指CSFV E2蛋白質之A結構域
中具有該名稱之熟知表位，且係長9個胺基酸之線性表位。熟習此項技術者將瞭解，給予此表位之名稱「TAVSPTTLR」在以標準單字母IUPAC代碼表示該表位時與此表位之胺基酸序列相匹配，其中蘇胺酸稱作T，丙胺酸稱作A等等。
CSFV E2之TAVSPTTLR表位在野生型CSFV中保守(Lin等人，2000，上文文獻)，且其胺基酸序列在本文中表示為SEQ ID NO：1。
對於本發明，CSFV E2之「突變」TAVSPTTLR表位之胺基酸序列在至少一個位置處與SEQ ID NO：1不同。突變可涉及單一或多個變化，且可為胺基酸之插入、缺失或取代或其組合。
用於本發明方法中之CSFV E2之突變TAVSPTTLR表位之一實例係存於突變體CSFV病毒(例如vFlc-△PTa1)之E2蛋白質中之相應表位，其中此表位係：TAGSTLRTE(SEQ ID NO：2)。另一實例係如Reimann等人所述之重組CSFV(2010，上文文獻)，例如病毒pA/CP7_E1E2alf_TLA，其中相應表位係TLANKDTLA(SEQ ID NO：3)。
用於本發明方法中之CSFV E2之突變TAVSPTTLR表位可得自多種來源，係天然或合成表位。最便捷者係藉由人類介入(例如藉由修飾或突變，例如藉由經由重組DNA技術調整編碼核苷酸序列)在CSFV E2之TAVSPTTLR表位中引入突變，之後在活體外重組表現系統中表現包含突變表位之蛋白質(例如CSFV E2蛋白質或其部分)。
對於本發明，「培育」係指容許抗體與其特定表位之間之結合。此將需要有助於形成該等分子相互作用之反應條件，且將包含使用正確緩衝液、溫度及持續時間。用於本發明培育之材料及方法闡述於熟知手冊中，以及商業測試供應商提供之說明書中。
在本發明上下文中之「載體」係指可攜載並呈遞CSFV E2蛋白質之表位之巨分子結構。原則上，任何結構可適宜，前提係表位對於與
抗體結合可及。載體可為生物或礦物來源，天然或合成，大或小，且可為(例如)金屬顆粒、聚合物、蛋白質或碳水化合物。表位可藉由共價鍵或藉由非共價鍵(包括離子、靜電、流體動力學或分子相互作用中之任一種類)連接。表位包含於載體中或載體上，且因此可係其一部分，例如作為蛋白質之內部元件或作為融合蛋白。在包含表位之蛋白質係脂蛋白或糖蛋白或偶聯物等時，載體亦可含有其他分子或基團，例如。將表位連接至載體之方法為業內所熟知，且可包含生物化學技術或重組DNA技術。
對於本發明，蛋白質係胺基酸分子鏈。蛋白質可為天然或成熟蛋白質，前蛋白或蛋白原，或蛋白質之免疫原性片段。蛋白質之定義內尤其包括肽、寡肽及多肽。
本發明載體「經固定」，意指：藉由共價鍵或非共價鍵，例如藉由吸附或塗佈或諸如此類連接至固相。此並非暗示固相本身係固定的。原則上，固相可係任一固體支撐物，前提係其容許實施本發明檢測方法，且可具有不同大小、形狀或形式，例如呈板、顆粒、膜等。
用於將載體固定至固相之方法及材料為業內所熟知，且可涉及(例如)使用碳酸鹽緩衝液及鹼性pH值。或者，例如，可經由引起共價鍵結之化學反應或經由載體之生物素化及與經抗生物素蛋白塗佈之固體支撐物結合來固定。
較佳地，固相係微量滴定板之孔，或用於AlphaLISA分析中之載體珠粒。
對於本發明，「共培育」指示，將包含CSFV E2之突變TAVSPTTLR表位之載體與包含CSFV E2之TAVSPTTLR表位之固定載體及測試樣品一起培育。在實踐中，此將意指，包含CSFV E2之突變TAVSPTTLR表位之載體在用於培育包含CSFV E2之TAVSPTTLR表位之固定載體及測試樣品之步驟中施用之培育混合物中存在該培育所需
時間之至少實質部分。構成「實質部分」之時間長度取決於所用診斷分析之具體方案之詳情。舉例而言，製造商之IDEXX CSFV Ab測試說明書指示，用於培育測試樣品及固定E2蛋白質之步驟之時間段係2小時或過夜(12-18小時)。
對於本發明，「時間之實質部分」係指用於培育包含CSFV E2之TAVSPTTLR表位之固定載體及測試樣品之步驟之時間的至少25%。按該優先順序，較佳係時間之50%，更佳時間之75%、90%、95%、99%或100%。
此共培育使本發明方法與可視為預培育之培育不同，該預培育會採用另一單獨步驟來培育測試樣品及包含突變TAVSPTTLR表位之載體，且該步驟會在與包含CSFV E2之TAVSPTTLR表位之固定載體一起培育之前進行。此一預培育可係熟習此項技術者在優化培育方案時之標準選擇，此乃因其容許減少任何不期望結合反應之良好控制可能性。然而，本發明令人驚訝地發現，該等培育可有利地整合為一個共培育步驟，且對測試之選擇性及特異性無有害效應。
如上所述，一個主要優點係共培育不需要增加欲實施診斷分析之時間。另一優點係可使用標準商業E2 ELISA之基礎方案，而不顯著修正測試組份或其方案。
在本發明方法之實施例中，檢測係藉由酶免疫分析、更佳藉由ELISA(酶聯免疫吸附分析)來進行。
ELISA為人所熟知，且已知其形式及方案之多種類型。一般優點在於，其提供快速且可靠之結果，且可易於放大規模。
在本發明方法之較佳實施例中，ELISA係間接阻斷ELISA。如業內已知，此暗示來自測試樣品之抗體與經標記檢測劑抗體競爭結合至固定表位。在測試樣品中存在之抗體愈多，愈多該等抗體結合至固定表位，且可保留愈少經標記抗體，從而降低(抑制)標記結合之最大
值。
本發明方法之其中檢測係藉由間接阻斷ELISA進行之實例性方案可包含用於以下之連續步驟中之一些或全部：- 將包含CSFV E2之TAVSPTTLR表位之載體塗佈至固相，- 將測試樣品及包含CSFV E2之突變TAVSPTTLR表位之載體與經塗佈載體共培育，之後洗滌，- 與經標記第二抗體一起培育，之後洗滌，- 顯色反應，及- 讀取結果。
一些步驟可單獨實施或由不同方實施。舉例而言，在作為商業測試施用時，商業供應商可提供即用於與測試樣品共培育之預塗佈固相。
視情況，方案可另外含有一或多個步驟用於阻斷偽陽性結合反應。通常，此涉及在用於培育及/或洗滌步驟之緩衝液中與過量非特異性蛋白質(例如脫脂乳或血清白蛋白)一起培育。
ELISA可藉由調整其試劑及方法步驟進一步優化，例如培育步驟之溫度及持續時間；用於固定或檢測之抗體或抗原之特異性及類型；所施用固定之數量及方法；以及所用培育緩衝液及洗滌緩衝液之組成。
酶免疫分析之一般參考文獻存於多個出版物中，尤其存於標準實驗室教科書中，例如：「The Immunoassay Handbook(第4版：Theory and applications of ligand binding,ELISA and related techniques」；D.G.Wild編輯，2013,ISBN-10：0080970370)；及「The ELISA Guidebook」(Methods in Molecular Biology，第149卷，J.R.Crowther,Humana Press,2000,ISBN-10：0896037282)。替代物係來自商業供應商之手冊，例如：「Technical guide for ELISA」,KPL
公司，Gaithersburg,MD,USA,2013；及「Assay guidance manual」，Eli Lilly &Co.，章節：Immunoassay methods,K.Cox等人，2012年5月。
在另一較佳實施例中，本發明ELISA基本上類似於用於CSFV E2抗體之商業ELISA，例如：類似於先前名為Ceditest® CSFV 2.0 ELISA之PrioCHECK® CSFV Ab 2.0 ELISA，二者皆可自Prionics AG(Schlieren-Zurich，瑞士)獲得；或類似於IDEXX CSFV Ab測試，可自IDEXX Europe B.V.(Hoofddorp，荷蘭)獲得。在此方面中，「基本上類似」係指與用於該等商業測試之方案及材料類似。
亦可設計本發明方法之替代方案。舉例而言，本發明方法可基於業內熟知之AlphaLISA測試之方案之特徵來設置。在此一測試中，不需要洗滌步驟且儘管可手動實施分析，但自動化AlphaLISA較佳。
AlphaLISA方案之特徵係，抗原(此處：包含CSFV E2之TAVSPTTLR表位之載體)及抗體(此處：對CSFV E2之TAVSPTTLR表位具有特異性之(單株)抗體)結合至載體珠粒，且其結合可藉由光發射來檢測。
包含CSFV E2之TAVSPTTLR表位之載體可(例如)經生物素化且固定於經抗生物素蛋白塗佈之受體珠粒上，且與偶聯至供體珠粒之抗體一起使用。則此一AlphaLISA測試中之一個步驟可包含將經包含CSFV E2之TAVSPTTLR表位之載體塗佈之受體珠粒與測試樣品及包含CSFV E2之突變TAVSPTTLR表位之載體共培育。相反方式(塗佈包含CSFV E2之突變TAVSPTTLR表位之載體)或中間形式同樣可行，藉此塗佈兩種載體。然後，下一步驟可係與經抗體塗佈之供體珠粒一起培育，且最後讀出結果。
因此，在本發明方法之實施例中，檢測係藉由具有AlphaLISA®特徵之診斷測試進行。
本發明方法最有利於測試源自對CSFV感染易感之動物之樣品。該等動物係豬家族之各種動物。
因此，在本發明方法之實施例中，測試樣品源自豬類動物。
對於本發明，「豬」係指豬科(Suidae)動物，且較佳係指豬屬(Sus)動物，例如：野豬或家豬、豬(swine)、肉豬(hog)、野豬(wild boar)、鹿豬或疣豬。此亦包括藉由涉及其性別或年齡之任一名稱指示之豬，例如：母豬、公豬、肉豬、女豬、斷乳仔豬或仔豬。
本發明方法之另一有利應用係測試已針對CSFV用CSFV標記物疫苗進行疫苗接種之豬類動物之樣品。
如眾所週知及上文所述，標記物疫苗中之抗原之抗原性與野生型抗原不同，其係基於(例如)與野生型形式相比缺少表位或具有不同表位形式。通常，標記物疫苗中之抗原已藉由生物化學或重組DNA技術調整或修飾，且結果係可區分針對標記物疫苗之經修飾抗原之抗體反應與針對未修飾野生型抗原之抗體反應。此將容許血清學「區別經感染動物與經疫苗接種動物」或DIVA。
因此，在本發明方法之實施例中，測試樣品源自已針對CSFV用CSFV標記物疫苗進行疫苗接種之豬類動物。
在CSFV(標記物)疫苗包含因CSFV E2之TAVSPTLLR表位中之突變而偏離野生型E2之CSFV E2蛋白質作為CSFV抗原時，本發明方法之尤其有利之應用變得顯而易見。如上所述，在經此一疫苗進行疫苗接種之動物之樣品中，在使用用於CSFV抗體之現有診斷測試時發現偽陽性分數。然而，本發明方法僅顯示真陽性分數。此對於養豬之獸醫衛生及經濟具有重大意義。
因此，在本發明方法之較佳實施例中，測試樣品得自已針對CSF用包含含有突變TAVSPTTLR表位之CSFV E2蛋白質之CSFV疫苗進行疫苗接種之豬類動物。
如上所述，原則上，可想像多種形式之CSFV E2之突變TAVSPTTLR表位用於本發明方法之共培育。然而，在共培育中採用之CSFV E2之突變TAVSPTTLR表位與標記物CSFV疫苗中之該表位相同之情形中，最有利地施用此方法。
因此，在本發明方法之實施例中，包含在用於本發明方法之共培育之載體中之CSFV E2之突變TAVSPTTLR表位與存於CSFV標記物疫苗之CSFV E2蛋白質中之突變TAVSPTTLR表位相同。
對CSFV標記物疫苗中之CSFV E2之突變TAVSPTTLR表位另外慮及：儘管TAVSPTTLR表位突變，此疫苗必須仍能在目標動物中誘導針對CSFV之有效免疫反應。
對於本發明，在一方面用於對欲在本發明方法中測試之測試樣品源自其之動物進行疫苗接種之CSFV標記物疫苗中之CSFV E2之突變TAVSPTTLR表位與另一方面包含於用於本發明方法之共培育之載體中之CSFV E2之突變TAVSPTTLR表位之間較佳相匹配。
因此，在本發明方法之實施例中，包含於用於共培育之載體中之CSFV E2之突變TAVSPTTLR表位與包含於用於對自其獲得測試樣品之豬類動物進行疫苗接種之CSFV疫苗之CSFV E2蛋白質中之突變TAVSPTTLR表位相同。
熟習此項技術者完全能確定何種突變TAVSPTTLR表位容許包含含有該突變表位之CSFV E2蛋白質之CSFV標記物疫苗係有效免疫原。
舉例而言，藉由監測疫苗接種後或挑戰感染後之免疫反應(例如藉由監測目標之疾病、臨床評分、血清學參數之臨床體徵或藉由重分離病原體)並比較該等結果與在模擬疫苗接種動物中所見之反應來確定。
NB：由於CSFV具有高傳染性，且在多個國家係法定通報疾病，
故可能含有傳染性CSFV(野生型或減毒)之樣品的任何實驗室或畜牧學使用必須以適當生物安全性預警來實施，符合國家或國際導則。
用於本發明方法之共培育之包含可與包含CSFV E2之突變TAVSPTTLR表位之載體相匹配之具有CSFV E2之突變TAVSPTTLR表位之CSFV E2蛋白質之CSFV疫苗之實例為業內已知且如上文所述。舉例而言，根據Kortekaas等人(2010，上文文獻)；一個實例係名為vFlc-△PTa1之突變體CSFV，其具有包含突變TAVSPTTLR表位之CSFV E2蛋白質，該表位具有如SEQ ID NO：2中所呈現之胺基酸序列：TAGSTLRTE。
另一實例係來自Reimann等人(2010，上文文獻)：稱為pA/CP7_E1E2alf_TLA之突變體CSFV，其具有包含突變TAVSPTTLR表位之CSFV E2蛋白質，該表位具有如SEQ ID NO：3中所呈現之胺基酸序列：TLANKDTLA。
因此在本發明方法之實施例中，包含於用於共培育之載體中之CSFV E2之突變TAVSPTTLR表位具有胺基酸序列：TAGSTLRTE(SEQ ID NO：2)。
在本發明方法之替代實施例中，包含於用於共培育之載體中之CSFV E2之突變TAVSPTTLR表位具有胺基酸序列：TLANKDTLA(SEQ ID NO：3)。
在另一實施例中，本發明測試樣品源自已用CSFV疫苗進行疫苗接種之豬類動物，如Kortekaas等人(2011，上文文獻)所述，例如如上文所述基於名為vFlc-△PTa1之突變體CSFV之疫苗。
因此，在本發明方法之另一實施例中，CSFV疫苗係基於vFlc-△PTa1病毒。
所述用於本發明方法中之載體之兩個不同實施例係：用於固定至固相之包含CSFV E2之TAVSPTTLR表位之載體及用於共培育之包
含CSFV E2之突變TAVSPTTLR表位之載體。該等載體可具有不同形式，且用於突變TAVSPTTLR表位及用於野生型TAVSPTTLR表位之載體可為相同或不同類型；其亦可為單獨實體或可為同一實體，例如一個包含兩種類型之TAVSPTTLR表位之載體。
在本發明方法之實施例中，包含CSFV E2之TAVSPTTLR表位之固定載體或包含CSFV E2之突變TAVSPTTLR表位之載體係蛋白質，或兩種載體皆係蛋白質。
該等蛋白質可相同或不同。
在本發明方法之較佳實施例中，包含CSFV E2之TAVSPTTLR表位之固定載體或包含CSFV E2之突變TAVSPTTLR表位之載體係CSFV E2蛋白質，或兩種載體皆係CSFV E2蛋白質。
除了具有野生型或突變TAVSPTTLR表位以外，CSFV E2蛋白質載體之其餘部分亦可具有不同胺基酸序列；文獻中已闡述若干個CSFV E2之實例，且其序列可自諸如基因庫TM等公用數據庫獲得。
在包含CSFV E2之TAVSPTTLR表位之固定載體係CSFV E2蛋白質時，此提供檢測來自測試樣品之針對CSFV之抗體之最佳機會。
類似地，在包含CSFV E2之突變TAVSPTTLR表位之載體係CSFV E2蛋白質時，此提供捕獲可能存於動物測試樣品中且其原本會產生偽陽性結果之任何交叉反應性抗體之最佳機會。此乃因CSFV E2蛋白質將提供CSFV E2之最接近此表位之天然形式之突變TAVSPTTLR表位之3D呈現。
因此，在本發明方法之較佳實施例中，兩種載體皆係完整成熟CSFV E2蛋白質。
然而，如業內已知，E2之C-末端跨膜區域及事實上C-末端一半對於結合抗體較不相關(van Rijn等人，1994,J.of Virology，第68卷，第3934頁；Chang等人，2010,Virus Res.，第149卷，第183頁)。
因此，熟習此項技術者將能熟練研發並優化本發明之檢測野生型CSFV抗體之方法，其中任一載體或無載體係完整成熟E2蛋白質，而係其一部分，前提係(突變)TAVSPTTLR表位本身仍存在，其在本發明方法情況下仍容許良好檢測野生型CSFV抗體且顯著減少偽陽性分數。
CSFV蛋白質或其部分在本發明方法作為包含(突變)CSFV E2之TAVSPTTLR表位之載體之使用可藉由改變共培育之數量及條件進一步優化。舉例而言，發明者已在熟知桿狀病毒表現載體系統中表現具有突變TAVSPTTLR表位之CSFV E2蛋白質，純化該蛋白質，並使用重組表現之E2蛋白質進行共培育分析。
所表現E2蛋白質之純度及數量可藉由(例如)SDS凝膠電泳、蛋白質染色及光密度測定法定量來評價。替代方案係量化在Elisa中使用結合至E2之抗體經由並非TAVSPTTLR之另一表位及已知濃度之參照樣品進行定量。
端視蛋白質之純度，包含(突變)TAVSPTTLR表位之E2蛋白質載體之量經選擇以獲得野生型CSFV抗體之最佳檢測，同時提供偽陽性分數之最大減少。如本文中所例示，在96孔微量滴定板中，通常每孔需要少於2μg E2蛋白質。1μg或甚至0.5μg/孔之量亦有效。
如上所述，野生型CSFV抗體之現有商業診斷測試已基於大量測定其靈敏度概況及特異性概況之測試數據確立其可靠性。此係藉由國際承認之標準陽性及陰性參照樣品組來維持。此分析與參照樣品之組合之可信度係其銷售授權及其在用該等分析測試之動物之政府控制的出口證明中之使用的基礎。
為使本發明方法與該等已確立分析之參照值及先前測試分數達成完全整合，可進一步調整方案。具體而言，分析方案中之培育條件可經調整以適應共培育步驟中之另一組份，其中引入CSFV E2之突變
TAVSPTTLR表位。
發明者已發現，在不調整該步驟之培育條件之情況下，本發明方法仍有功能，且可高度有效地減少偽陰性分數；然而，在使用本發明方法測試已確立標準樣品時，則所獲得之準確OD分數可偏離彼等標準品之先前結果，較高或較低。此乃因增加另一化合物可能需要向培育混合物中添加一定體積之液體，此可稀釋培育緩衝液及其可包括之組份，例如鹽、穩定劑、清潔劑或阻斷劑，從而導致偏離標準分數。
因此，在實施例中，本發明方法包含調整包含與含有CSFV E2之突變TAVSPTTLR表位之載體共培育之步驟之培育條件，以適應該載體之添加。
此「調整」可以若干種方式來實施。最直接的方式係將包含含有CSFV E2之突變TAVSPTTLR表位之載體之溶液吸收至用於本發明方法中之培育緩衝液中，其中培育緩衝液之濃度與其在該方法中使用時之最終濃度相比有所增加。舉例而言，在合併相等體積之包含含有CSFV E2之突變TAVSPTTLR表位之載體之溶液及培育緩衝液時，則可以其最終使用2×濃度之原液形式提供培育緩衝液。亦可針對包含含有CSFV E2之突變TAVSPTTLR表位之載體之溶液中已存在之任何鹽或緩衝液進行校正。此原理易於針對培育緩衝液原液之其他體積比及相應濃度加以調整。
或者，可提供培育緩衝液之已包含含有CSFV E2之突變TAVSPTTLR表位之載體之即用型預混合溶液，其中該培育緩衝液具有其最終使用濃度。
先前實例依賴於在溶液中提供包含CSFV E2之突變TAVSPTTLR表位之載體。然而，由於此對於蛋白質之穩定性可能並非最佳，替代方案係在單獨容器中提供呈冷凍乾燥形式之包含CSFV E2之突變表位
之蛋白質，該容器緊靠具有最終使用濃度之培育緩衝液之容器。在隨後於即將使用前用培育緩衝液重構蛋白質時，此不影響蛋白質之穩定性，且重構不(顯著)改變培育緩衝液之濃度。
熟習此項技術者將能設計並優化其他組合以獲得類似溶液。
如上所述，施用本發明方法之有利方式係藉由使用診斷測試套組，其包含施用該方法所需之各種組份。
因此，本發明之另一態樣係關於用於實踐本發明方法之診斷測試套組。
對於本發明，「診斷測試套組」係指用於實施本發明方法之多個部分之套組。該套組包含用於施用該方法之一或多種組份，具體而言：固定至固相之包含CSFV E2之TAVSPTTLR表位之載體及包含CSFV E2之突變TAVSPTTLR表位之載體。該等組份應具有便捷形式及容器，視情況具有用於樣品稀釋及培育、阻斷或洗滌之緩衝液，以及視情況如何實施該方法及如何讀取並解釋結果之說明書。
在實施例中，套組可包含具有多個孔之容器，例如微量滴定板。容器之孔可經處理以含有一或多種用於本發明方法中之組份。
在本發明之診斷測試套組之較佳實施例中，將具有TAVSPTTLR表位之CSFV E2蛋白質固定至微量滴定板之孔中。
本發明之診斷測試套組視情況包含之說明書可(例如)書寫在含有該套組之成份之盒子上；可存於該盒中之單頁上；或可在套組經銷商之網際網路網站上觀看或下載等。
對於本發明，診斷測試套組亦可在(例如)網際網路網站上提供所提及部分(涉及商業銷售)，用於在包含本發明方法之分析中組合使用。
在實施例中，本發明測試套組可係基於一種用於野生型CSFV E2抗體之已知商業測試套組，即與(例如)PrioCHECK® CSFV Ab 2.0
(Prionics)或IDEXX CSFV Ab Test®(IDEXX)基本上相同，且經修改以適應與另一組份共培育。修改可係指經修正之使用者說明書，以提供共培育說明書。同樣，套組可另外提供包含冷凍乾燥製劑之容器，該製劑包含含有CSFV E2之突變TAVSPTTLR表位之載體，欲將其再懸浮於(例如)培育緩衝液中。或者，測試套組可包含具有濃度高於其最終使用濃度之培育緩衝液原液之容器及具有包含含有CSFV E2之突變TAVSPTTLR表位之載體之溶液之容器，該溶液與培育緩衝液原液一起用於共培育中。熟習此項技術者可想像若干個納入本發明診斷測試套組之組份之其他實施例。因此，該等實施例在本發明之範圍內。
因此，在實施例中，本發明測試套組包含具有包含CSFV E2之突變TAVSPTTLR表位之載體之容器。
在另一態樣中，本發明係關於包含CSFV E2之突變TAVSPTTLR表位之載體之用途，其用於本發明方法之共培育中，或本發明之診斷測試套組中。
此一用途提供對動物測試樣品中之野生型CSFV抗體之檢測，尤其對已針對CSF用包含含有突變TAVSPTTLR表位之CSFV E2蛋白質之CSFV疫苗進行疫苗接種之動物樣品之檢測。此用途提供如上所述對任何偽陽性分數之減少。
在實施例中，本發明用途係關於包含CSFV E2之突變TAVSPTTLR表位之載體之用途。載體較佳係蛋白質，且蛋白質較佳係CSFV E2蛋白質，且CSFV E2蛋白質較佳係完整成熟蛋白質。
本發明檢測方法之另一有利應用係其在用於CSFV疫苗接種及檢測之DIVA方法中之應用。此容許區別針對CSFV進行疫苗接種之動物與經CSFV感染之動物。在藉由使用針對CSF之包含含有突變TAVSPTTLR表位之CSFV E2蛋白質之疫苗進行疫苗接種時，唯有使用本發明方法，及隨後消除偽陽性分數，才有可能以此方式進行血清
學區別。
因此，在另一態樣中，本發明係關於區分感染野生型CSFV之動物與針對CSFV用CSFV疫苗進行疫苗接種之動物之方法，其中該疫苗包含含有突變TAVSPTTLR表位之CSFV E2蛋白質，且該方法包含使用本發明檢測方法，或包含使用本發明之診斷測試套組。
本發明之區分方法係使用如上所述動物測試樣品之活體外診斷方法。熟習此項技術者將認識到，本發明區分方法由此涉及所研究測試樣品之診斷分數之結果。具體而言，依據其存在或不存在、或其絕對含量值、或與對照樣品之值相比之相對值檢測CSFV E2蛋白質抗體。
方法之輸入係來自受試者之測試樣品；受試者較佳係豬類動物；測試樣品較佳係血樣，更佳係血清或血漿樣品。
為在感染動物與疫苗接種動物之間做出最終區別，需將測試分數解釋為陽性或陰性；在實踐中此意指：高於或低於某一臨限值。此可藉由將多個欲與測試樣品一起測試之標準參照樣品納入測試中來便捷地實施。此闡述於實例中。陽性及陰性參照樣品可在動物中製備，或可自若干個研究所及參照實驗室獲得，例如位於獸醫大學(University of veterinary medicine，Hannover,Germany)之CSF之歐盟參照實驗室(Community Reference Laboratory)。
在將測試樣品評為陽性、陰性或可疑後，此可外推以將自其獲得測試樣品之供體動物診斷為關於野生型CSFV感染呈陽性、陰性或可疑。
在將動物診斷為陽性(或可疑)之情形中，則依據政府條例，可藉由疫苗接種處理動物及/或在檢疫中挑出，或以負責任的方式淘汰。
因此，在本發明區分方法之實施例中，該方法亦包含一或多個選自以下之步驟：
- 獲得測試樣品之步驟- 藉由比較陽性參照樣品之結果與陰性參照樣品之結果來解釋所獲得測試結果之步驟，- 比較具有預定截止值之樣品之所獲得測試結果之步驟，- 關於含有針對野生型CSFV之抗體將樣品評為陽性、陰性或可疑之步驟，- 關於野生型CSFV感染將樣品供體診斷為陽性、陰性或可疑之步驟，或- 基於關於經野生型CSFV感染之陽性或可疑診斷結果藉由疫苗接種、檢疫及/或淘汰處理樣品供體之步驟(推薦)。
在一或多個較佳實施例中，樣品係血清樣品，或：測試結果係ELISA抑制百分比之分數。
在較佳實施例中，測試樣品源自已針對CSF用包含含有突變TAVSPTTLR表位之CSFV E2蛋白質之CSFV疫苗進行疫苗接種之豬類動物。
在替代態樣中，本發明係關於診斷CSFV感染之活體外方法，該方法包含使用本發明檢測方法或包含使用本發明之診斷測試套組，且其中針對野生型CSFV之抗體之存在係關於陽性及陰性參照樣品之分數來測定。
在本發明之另一態樣中，採用本發明檢測方法或本發明診斷測試套組作為搭配診斷與用CSFV疫苗疫苗接種一起進行CSFV疾病根除，或用於國家監督計劃。
使用此組合可施用用於CSFV之DIVA方法，其容許區別經感染動物與經疫苗接種之動物。
因此，在另一態樣中，本發明係關於在豬類動物群體中控制野生型CSFV感染之方法，其係藉由組合使用包含含有突變TAVSPTTLR
表位之CSFV E2蛋白質之CSFV疫苗及本發明診斷測試套組來實施。
由於本發明顯著減少偽陽性分數，現可可靠地將來自經疫苗接種動物之(血清)樣品鑑別為關於針對野生型CSFV之抗體呈陰性。僅真陽性動物需要挑出，並在監督、消滅或根除計劃情況下經受適當的控制及檢疫措施。
因此，CSFV疫苗及診斷方法之此組合使用容許藉由基於結構化疫苗之CSFV根除計劃代替不期望且成本極高之消滅政策，從而減少動物之痛苦及經濟成本。
可以「豬類動物群體」作為局部(農場)、地區或甚至國家層面之群組。「組合使用」之詳情及方案將取決於針對欲使用之具體(標記物)CSFV疫苗規定之疫苗接種方案。組合使用之實施亦將取決於篩選之要求及原因，或甚至取決於可能需要遵守之特定政府條例。
一些實例：在常規疫苗接種之情形中，將在幼年針對CSFV進行一次或兩次疫苗接種，並(例如)每年接受加強疫苗接種。可在懷疑發生野生型CSFV感染時隨時測試該等動物。或者：已經疫苗接種之欲用於出口之豬可在其既定出口日期之前不久加以測試。同樣：在懷疑CSFV感染之情形中或在CSFV爆發形勢中，可在短時間間隔(數週，可能甚至數天)內實施疫苗接種及測試。熟習此項技術者可想像之該等及其他實施例皆在本發明之範圍內。
在實踐中，在關於野生型CSFV抗體將樣品評為陽性或陰性時，可藉由再測試來自相同目標但來自不同時間點之樣品或藉由測試來自相同畜群或區域之其他動物來確認。或者，可使用不同技術及不同類型之樣品確認結果，例如藉由用病毒中和分析檢測血液、組織、鼻拭子或糞便中之病毒，或藉由檢測病毒核酸(例如藉由PCR)來確認。
現將藉由以下非限制性實例進一步闡述本發明。
實例1中使用之測試樣品得自中央獸醫研究所(Lelystad，荷蘭)，且闡述於Kortekaas等人，2011(上文文獻)中。簡言之：用基於C株系或基於vFlc-△PTa1病毒之活CSFV疫苗對8週齡血清陰性豬進行疫苗接種。在數週期間取血樣。製備血清用於測試。在疫苗接種後28天用野生型CSFV對動物進行挑戰感染。
如Kortekaas等人，2011(上文文獻)所述，使用商業ELISA測試所獲得豬血清：PrioCHECK® CSFV Ab 2.0(Prionics)。此係根據製造商說明書來實施，簡言之：使用預塗佈微量滴定板，且分配套組之樣品緩衝液。將對照樣品添加至特定孔，且將測試樣品(豬血清)添加至其他孔。之後，對板進行培育，洗滌，並分配偶聯物。再次培育並洗滌板，且最終添加著色劑，培育，之後終止。之後，藉由量測OD來讀板。ELISA抑制百分比係基於陽性標準品來計算。結果繪示於圖1A中，作為比較結果，基本再現Kortekaas等人，2011(上文文獻)之圖4A。對於此ELISA，陽性/陰性分離之臨限值係40%抑制。
如自該等結果可明瞭：經C株系進行疫苗接種之豬之血清樣品(虛線)以及經vFlc-△PTa1病毒標記物疫苗進行疫苗接種之豬之樣品(實線)二者皆隨時間呈陽性反應；即誘導40%或更高抑制。因此，無法明確區別經C株系疫苗或經標記物CSFV疫苗(即vFlc-△PTa1病毒)進行疫苗接種之動物。
然後使用用於CSFV E2抗體之不同商業ELISA根據製造商說明書且用與上述Prionics ELISA基本上相同之方案再測試Kortekaas等人2011(上文文獻)之該等血清樣品：IDEXX CSFV Ab Test®(IDEXX)。
結果呈現於圖1B中，且灰色水平棒指示此分析中陽性/陰性分離之臨限值，其中：陰性係30%或更低抑制；陽性係40%或更高抑制；介於30%抑制與40%抑制之間之分數係可疑樣品。其中抑制值為陰性值之結果代表OD值高於陰性對照之樣品。該等可視為0%抑制值。
如自該圖可明瞭，且類似於Prionics ELISA中之結果，幾乎所有樣品皆隨時間呈陽性反應；僅一種標記物疫苗接種物(豬編號3161)保持完全陰性。來自豬編號3163及3164之兩個樣品在疫苗接種後42或49天產生峰值，此可能與挑戰反應相關；由於缺少材料，無法對樣品進行再測試。
自C株系及vFlc-△PTa1病毒之CSFV病毒之E2基因產生E2蛋白質用於本發明方法之共培育。首先，對其E2基因之核苷酸序列進行密碼子優化以供在桿狀病毒-昆蟲細胞表現系統中表現，同時僅使用沉默突變。之後，根據優化序列化學合成DNA並將其選殖至pFastBac®質體(Life technologies)中，位於多角體蛋白啟動子之後。藉由位點特異性換位將表現盒轉移至重組桿粒DNA中並在DH10Bac大腸桿菌(Escherichia coli)勝任細菌中擴增。之後，分離桿粒DNA並用於轉染Sf9昆蟲細胞。使用得自轉染上清液之重組桿狀病毒來感染新鮮Sf9昆蟲細胞。分離桿狀病毒並用於感染在2L生物反應器中培養之Sf21昆蟲細胞。兩種E2蛋白質皆在該等生物反應器培養物中(主要在上清液中)表現。收穫此培養物，並藉由親和管柱層析在已偶合TAVSPTTLR表位特異性單株抗體之Sepharose管柱上分離E2蛋白質。自管柱收穫純化E2蛋白質並藉由抑制ELISA定量。
使用SDS凝膠電泳表徵所表達並純化之E2蛋白質：觀察到約80kDa之單一條帶，且純度為約80%。然後在Elisa中緊靠重量標準樣品對E2進行定量。具有突變TAVSPTTLR表位之重組表現之CSFV E2蛋
白質可以常規方式以約800μg/ml之純化原液形式獲得。
對上述Kortekaas等人，2011(上文文獻)之樣品施用本發明之檢測測試樣品中針對野生型CSFV之抗體之方法。
該方案主要係基於IDEXX ELISA之方案，另外具有共培育。簡言之：根據製造商說明書採用IDEXX CSF Ab測試套組，有一處例外：藉由2×濃縮形式代替套組之標準樣品稀釋劑。然後將25μl(此係測試套組方案中規定體積之一半)之此2×樣品稀釋劑在經E2塗佈之孔中與50μl血清樣品及25μl表現具有突變TAVSPTTLR表位之CSFV E2蛋白質之桿狀病毒溶液共培育，使得存在約1μg E2/孔。
在該等共培育中使用之具有突變TAVSPTTLR表位之CSFV E2蛋白質係包含於vFlc-△PTa1疫苗病毒中之E2。
所獲得結果呈現於圖1C中，且直接圖解說明與不使用共培育之相同分析(圖1B)之結果的差異；或與不使用共培育之類似分析(圖1A)之差異。所有來自經C株系進行疫苗接種之豬之樣品皆呈陽性反應，而所有來自經標記物進行疫苗接種之豬之樣品皆呈陰性反應。未發現加強疫苗接種之效應，且即使關於豬編號3163及3164觀察到之峰值亦低於臨限值。以此方式，有效DIVA測試最終可能用於減毒活CSFV疫苗！
在使用來自用於共培育之野生型CSFV之E2蛋白質重複此實驗時(此處未呈現)，結果完全不同：所有樣品皆評為陰性，即使樣品來自經C株系進行疫苗接種之豬。因此，此並非有用替代。
亦在PrioCHECK® CSFV Ab 2.0 ELISA(Prionics)之基礎方案中引入共培育。觀察到基本相同之結果：極有效地減少偽陽性結果，僅保留評為陽性(此處：高於40% ELISA抑制)之真陽性樣品。
如上文所述之實驗之結果匯總於表1中。此揭示，在測試關於CSFV抗體係陽性/可疑時，來自Kortekaas 2011(上文文獻)實驗之經疫苗接種動物將接受之分類端視將施用何種E2抗體之檢測方法而各有不同。如所明瞭，僅藉由使用與包含CSFV E2之突變TAVSPTTLR表位之載體共培育，即可明確辨別用包含含有突變TAVSPTTLR表位之CSFV E2蛋白質之CSFV疫苗進行疫苗接種之動物與經野生型CSFV感染或用C株系進行疫苗接種之動物。
為確定本發明方法之特異性及靈敏度至少與標準商業CSFV E2抗體ELISA相當，使用本發明方法中之一者測試大量樣品(約900個)。W.L.Loeffen博士使得可自中央獸醫研究所病毒學分部(Lelystad，荷蘭)之集合獲得該等樣品，且其包括來自荷蘭之超過400個CSFV陰性田間豬血清之群組、超過400個經若干週採樣之來自CSFV實驗性感染豬之樣品之群組，及約80個混合來源之豬血清樣品之群組；此最後一群組含有來自針對CSFV進行疫苗接種之豬或感染CSFV之豬以及感染BVDV或BDV株系之豬以及一些混合感染之陽性及陰性血清。
對於本發明方法之應用，使用IDEXX CSF Ab測試套組之方案及材料，使用預塗佈板、陽性及陰性對照樣品、A18單株抗體偶聯物、顯色反應受質、終止溶液及洗滌溶液測試所有樣品。唯一的不同係藉
由樣品稀釋劑之2×濃縮形式代替該稀釋劑，該濃縮形式係以根據測試方案之體積的一半來使用；體積之另一半係藉由添加包含具有突變TAVSPTTLR表位之CSFV E2蛋白質(即包含於vFlc-△PTa1病毒中之E2蛋白質)之溶液來提供。對照樣品係以一式兩份測試，測試樣品係以單份測試。
ELISA抑制結果之解釋與商業ELISA相同：陰性係30%或更低抑制；陽性係40%或更高抑制；介於30%抑制與40%抑制之間之分數係可疑樣品。
陰性田間血清之群組一般評為介於-20與0% ELISA抑制之間。結果顯示於圖2中。413個樣品之平均分數為-11%±5.2%。此符合預期：所有樣品皆評為遠低於可疑/陽性之臨限值(30% ELISA抑制)，且使用本發明之檢測方法及區分方法二者不自真陰性樣品產生偽陽性分數。
隨時間所取超過400個CSFV陽性樣品之群組之分析證實本發明方法之靈敏度優良。結果呈現於圖3中，且顯示尤其在感染後早期，本發明方法提供容許較商業CSFV E2抗體ELISA將更多樣品分類為陽性且將更少樣品分類為可疑或陰性之結果。此在感染後14天最明顯，且在感染後21天仍略有體現。
因此，此證實，本發明方法正確檢測真陽性之靈敏度至少與商業CSFV E2抗體ELISA同樣良好，或有所不同：正相反，將共培育引入現有CSFV E2抗體ELISA之一個步驟中不會降低測試之靈敏度。
使用本發明方法測試一個約80個各種類型樣品之群組，以比較結果與標準商業ELISA之結果。各種樣品來自稱為「Erns工場」、
「CSFV EU參照組」及CVI Lelystad內部「瘟疫病毒參照組」之組。
樣品及其代碼以及使用本發明方法(指示於「本發明」欄中)或使用商業CSFV E2抗體ELISA(指示於「商業」欄中)檢測針對CSFV之抗體E2之結果列示於表2中。具有樣品編號之欄僅用於參照目的：樣品1-54係來自經不同CSFV株系感染或針對CSFV進行疫苗接種之動物之田間樣品之血清；在不同感染後天數(dpi)或疫苗接種後天數(dpv)取樣；樣品55-60為真陰性；樣品編號61-67係來自BVDV感染之血清；樣品68來自BDV感染；且樣品69-76來自混合感染。
結果呈現為ELISA抑制分數百分比，且根據商業ELISA之評分量表進行分類。
如自表2中之結果可明瞭，對於絕大多數所測試樣品，使用本發明方法獲得之結果產生區別大於商業ELISA之ELISA抑制百分比分數。僅在兩種情形中，使用本發明方法之結果與商業ELISA相比以陰性方式偏離：樣品23及75。尚未得知該兩種情形是否係測試實施中之誤差。因此，本發明方法至少與用於CSFV E2抗體之商業ELISA同樣靈敏。
此可非常重要，此乃因對於若干個樣品，商業ELISA及本發明方法產生不同分類。實例係：樣品編號8、25、28、38及45，關於CSFV E2抗體，其依據商業ELISA分類為「可疑」，但根據本發明方法將需要分類為「陽性」。類似地，樣品編號37之分類將需要自陰性變為可疑。
僅對於兩個樣品編號23及75，本發明方法之結果為陰性，而商業E2抗體ELISA之分數為陽性。原因可能係任一分析中之實驗誤差。
圖1：Kortekaas等人，2011(上文文獻)所述用於樣品中之CSFV E2抗體之阻斷ELISA之分析結果：將其與標準商業分析之分析及本發明方法之分析相比較。
虛線代表用C株系CSFV疫苗進行疫苗接種之豬之樣品(「CS」樣品)的結果；實線繪示用基於vFlc-△PTa1病毒之標記物疫苗進行疫苗接種之豬之樣品(「VS」樣品)的結果。
水平灰色棒指示不同分析中之臨限值分數，將樣品解釋為關於野生型CSFV E2抗體呈陽性、可疑或陰性。
圖1A：比較結果：再現Kortekaas等人，2011(上文文獻)之圖4A。所用E2 ELISA係PrioCHECK® CSFV Ab 2.0(Prionics)。
圖1B：使用不同商業E2 ELISA(即IDEXX CSFV Ab Test®(IDEXX))再測試來自Kortekaas等人，2011(上文文獻)之樣品之結果。
圖1C：使用本發明檢測方法再測試來自Kortekaas等人，2011(上文文獻)之樣品之結果：將共培育引入IDEXX CSFV Ab測試之一個步驟中。
圖2：在超過400個陰性田間樣品中分析CSFV抗體之結果。測試係根據IDEXX CSFV Ab Test®(IDEXX)之方案來實施，且以本發明方法中之共培育作為修改。結果指示為每個微量滴定板檢測之ELISA抑制百分比之平均值，且所有樣品組合為一個結果，且所有板組合為一個結果。最高值及最低值指示為藉由黑色棒連接之黑色鑽石形，且平均值指示為灰色鑽石形。
圖3：分析超過400個來自實驗性感染CSFV之豬且在接種後2、3或4週取樣之樣品之結果。並非每一動物皆可獲得三個樣品。檢測方法係指示為「Inv.」之本發明方法；或係指示為「Comm.」之商業ELISA(IDEXX CSFV Ab測試)。分類：陰性、可疑及陽性係基於所量測ELISA抑制百分比，且根據商業ELISA之評分量表來分配，分別分配
為小於30%、30-40%或大於40% ELISA抑制。
<110> 荷蘭商英特威國際公司
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Claims (12)
- 一種檢測測試樣品中針對野生型經典豬瘟病毒(CSFV)之抗體之方法，其中該樣品亦可包含針對CSFV E2之突變TAVSPTTLR表位之抗體，該方法包含將該測試樣品與包含CSFV E2之TAVSPTTLR表位之固定載體一起培育之步驟，其特徵在於該方法在該步驟中包含與包含CSFV E2之突變TAVSPTTLR表位之載體共培育。
- 如請求項1之方法，其中該檢測係藉由ELISA(酶聯免疫吸附分析)來實施。
- 如請求項1或2之方法，其中該測試樣品得自已針對CSF用包含含有突變TAVSPTTLR表位之CSFV E2蛋白質之CSFV疫苗進行疫苗接種之豬類動物。
- 如請求項1至3中任一項之方法，其中包含於用於共培育之該載體中之CSFV E2之該突變TAVSPTTLR表位與包含於用於對自其獲得該測試樣品之該等豬類動物進行疫苗接種之CSFV疫苗之該CSFV E2蛋白質中之該突變TAVSPTTLR表位相同。
- 如請求項1至4中任一項之方法，其中包含於用於共培育之該載體中之CSFV E2之該突變TAVSPTTLR表位具有胺基酸序列：TAGSTLRTE(SEQ ID NO：2)。
- 如請求項4或5之方法，其中該CSFV疫苗係基於vFlc-△PTa1病毒。
- 如請求項1至6中任一項之方法，其中包含CSFV E2之TAVSPTTLR表位之該固定載體或包含CSFV E2之突變TAVSPTTLR表位之該載體係CSFV E2蛋白質，或其中該兩種載體皆係CSFV E2蛋白質。
- 如請求項1至7中任一項之方法，其包含調整包含與包含CSFV E2之突變TAVSPTTLR表位之載體共培育之該步驟之培育條件，以適應該載體之添加。
- 一種用於實踐如請求項1至8中任一項之方法之診斷測試套組。
- 一種包含CSFV E2之突變TAVSPTTLR表位之載體之用途，其用於如請求項1至8中任一項之方法中之共培育中，或用於如請求項9之診斷測試套組中。
- 一種區分感染野生型CSFV之動物與已針對CSFV用CSFV疫苗進行疫苗接種之動物之方法，其中該疫苗包含含有突變TAVSPTTLR表位之CSFV E2蛋白質，且該方法包含使用如請求項1至8中任一項之檢測方法，或包含使用如請求項9之診斷測試套組。
- 一種在豬類動物群體中控制野生型CSFV感染之方法，其係藉由組合使用包含含有突變TAVSPTTLR表位之CSFV E2蛋白質之CSFV疫苗與如請求項9之診斷測試套組來實施。
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